抗TNF/抗IL-23双特异性抗体
阅读：1018发布：2020-05-20
专利汇可以提供抗TNF/抗IL-23双特异性抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了结合 肿瘤 坏死 因子α(TNFα)和白介素23的p19亚基(IL-23p19)并且表征为对TNFα和IL-23均具有高亲和 力 和强的同时中和特性的双特异性 抗体 。本 发明 的双特异性抗体用于 治疗 各种自身免疫性 疾病 ，包括炎性肠病，如节段性回肠炎和溃疡性结肠炎、 中轴 型脊椎关节病、类 风 湿性关节炎和 银 屑病关节炎。，下面是抗TNF/抗IL-23双特异性抗体专利的具体信息内容。
1.双特异性抗体，其包含缀合至结合IL-23的p19亚基(IL23p19)的两个单链可变片段(scFv)的结合肿瘤坏死因子α(TNFα)的免疫球蛋白G抗体(IgG)，其中
a.)所述IgG包含两条重链(HC)和两条轻链(LC)，每个HC包含了包含重链CDR(HCDR)1-3的重链可变区(HCVR1)并且每个LC包含了包含轻链CDR(LCDR)1-3的轻链可变区(LCVR1)，其中HCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:9，HCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10，HCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:11，LCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:15，LCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:16，并且LCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:17；并且
b.)每个scFv包含重链可变区(HCVR2)和轻链可变区(LCVR2)，HCVR2包含HCDR4-6并且LCVR2包含LCDR4-6，其中HCDR4的氨基酸序列是SEQ ID NO:12，HCDR5的氨基酸序列是SEQ ID NO:13，HCDR6的氨基酸序列是SEQ ID NO:14，LCDR4的氨基酸序列是SEQ ID NO:18，LCDR5的氨基酸序列是SEQ ID NO:19，并且LCDR6的氨基酸序列是SEQ ID NO:20，其中每个scFv通过多肽接头(L1)独立地缀合至所述IgG抗体，其中所述多肽接头(L1)与每个IgG HC的C末端和每个scFv的HCVR2的N末端共价连接，并且每个scFv的HCVR2通过第二多肽接头(L2)与相同scFv的LCVR2共价连接，其中所述第二多肽接头(L2)与相同scFv的HCVR2的C末端和LCVR2的N末端共价连接。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中每个HC的HCVR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:5，每个LC的LCVR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:7，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:6，并且每个scFv的LCVR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:8。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中每个HC的氨基酸序列是SEQ ID NO:
23，每个LC的氨基酸序列是SEQ ID NO:2，每个scFv的HCVR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:6，每个scFv的LCVR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:8，L1的氨基酸序列是SEQ ID NO:21，并且L2的氨基酸序列是SEQ ID NO:22。
4.DNA分子，其包含编码多肽链的多核苷酸序列，所述多肽链包含权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体的一个HC、一个scFv、一个多肽接头和一个第二多肽接头。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其中所编码的多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。
6.DNA分子，其包含编码多肽链的多核苷酸序列，所述多肽链包含权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体的一个LC。
7.根据权利要求6所述的DNA分子，其中所编码的多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
8.DNA分子，其包含：
(i)编码多肽链的多核苷酸序列，所述多肽链包含权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体的一个HC、一个scFv、一个多肽接头和一个第二多肽接头；和
(ii)编码多肽链的多核苷酸序列，所述多肽链包含权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体的一个LC。
9.根据权利要求8所述的DNA分子，其中包含一个HC、一个scFv、一个多肽接头和一个第二多肽接头的所编码多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:1，并且包含一个LC的所编码多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
10.哺乳动物细胞，其包含权利要求4-9中任一项所述的DNA分子。
11.根据权利要求10所述的哺乳动物细胞，其中细胞能够表达权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体。
12.用于产生权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体的方法，包括：
a.)在如此条件下培养权利要求10所述的哺乳动物细胞，从而表达双特异性抗体；和b.)回收表达的双特异性抗体。
13.双特异性抗体，其通过权利要求12所述的方法产生。
14.治疗溃疡性结肠炎或类风湿性关节炎的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体。
15.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
16.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体的用途，用于制造治疗溃疡性结肠炎的药物。
17.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体的用途，用于制造治疗类风湿性关节炎的药物。
18.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，用于疗法中。
19.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，用于治疗溃疡性结肠炎。
20.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，用于治疗类风湿性关节炎。
抗TNF/抗IL-23双特异性抗体
[0001] 本发明属于医学领域，特别地属于针对肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素-23(IL-23)的双特异性抗体的新领域。本发明的双特异性抗体预计可用于治疗自身免疫性疾病，包括炎性肠病(IBD)、如节段性回肠炎(CD)和溃疡性结肠炎(UC)、中轴型脊椎关节病(Axial Spondyloarthropathy，AxSpA)、类风湿性关节炎(RA)和银屑病关节炎(PsA)。
[0002] 自身免疫性疾病因身体产生针对其自身组织的免疫应答所致。自身免疫性疾病经常是慢性的并且可以是衰竭性的并且甚至危及生命。IBD，类属地表示一组病症如CD和UC，是病理学上以肠道炎症和上皮损伤为特征的常见慢性复发性自身免疫疾病。其他形式的慢性自身免疫性疾病，如RA、AxSpA和PsA，可能影响中轴和/或外周骨骼。
[0003] 白介素23(IL-23)是据信在引起慢性炎症所需要的一系列炎性细胞的活化中重要的异二聚细胞因子。IL-23，作为IL-6、IL-17、GM-CSF和IL-22分泌的上游调节物，由p19亚基(IL23p19)共价配对于p40亚基(p40亚基与细胞因子IL-12共有)的组成。另外，IL-23已经牵涉在记忆T细胞/致病性T细胞炎症反应中发挥重要作用以及在调节先天淋巴样细胞炎性活动中发挥作用。存在IL-23对细胞因子IL-6、IL-17、GM-CSF和IL-22的调节与炎性疾病(包括IBD、RA和其他自身免疫性疾病)相关的证据。
[0004] 肿瘤坏死因子α(TNFα)是多效性同三聚体细胞因子，所述细胞因子主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，还已知由CD4+及CD8+外周血T淋巴细胞产生。TNFα以可溶性形式和跨膜形式表达(膜结合的前体形式可以由金属蛋白酶TNFα转化酶(TACE))以蛋白酶解方式切割成可溶型同三聚体)。认为TNFα在免疫细胞的调节中发挥作用并且在全身性炎症、尤其急性期炎症反应方面重要。过量的TNFα与多种形式的自身免疫性疾病(包括RA、CD和银屑病)相关。
[0005] FDA批准的自身免疫性疾病(如IBD)现行治疗包括经常用来治疗急性炎症的皮质类固醇类和生物制品，其中许多(如 和 )尝试靶向并中和身体内的TNFα。另一种经批准用于治疗PsA的生物制品包括 其尝
试靶向细胞因子IL-12和IL-23的共有p40亚基。现行治疗已经展示在患者亚群中减少某些自身免疫性疾病的症状并延缓其进展的功效。然而，大百分数的患者对目前可用的治疗无反应(例如，在仅30-50％用TNFα中和治疗的CD患者中引起缓解，并且在12个月治疗后23％和46％的患者中丧失对TNFα中和的反应)。因此，仍需要治疗自身免疫性疾病(包括IBD(如CD和UC)、RA、AxSpA和PsA)的备选疗法。优选地，这类备选疗法将能够在对目前可用治疗无反应的大百分数的患者中显示功效。
试靶向细胞因子IL-12和IL-23的共有p40亚基。现行治疗已经展示在患者亚群中减少某些自身免疫性疾病的症状并延缓其进展的功效。然而，大百分数的患者对目前可用的治疗无反应(例如，在仅30-50％用TNFα中和治疗的CD患者中引起缓解，并且在12个月治疗后23％和46％的患者中丧失对TNFα中和的反应)。因此，仍需要治疗自身免疫性疾病(包括IBD(如CD和UC)、RA、AxSpA和PsA)的备选疗法。优选地，这类备选疗法将能够在对目前可用治疗无反应的大百分数的患者中显示功效。
[0006] 这类备选疗法的一个方案可以包括共施用两种不同的生物制品(例如，抗体)。共施用需要注射两个独立的产品或单次注射两种不同抗体的联合制剂。尽管两次注射允许给药量和时程的灵活性，它造成患者不便依从及疼痛。另外，尽管联合制剂可能提供给药量的某种灵活性，但它经常很难以或不可能找到在溶液中(在相对高的浓度)具有可接受粘度并允许两种抗体的化学和物理稳定性的配制条件，原因在于两种抗体的分子特征不同。另外，共施用和联合制剂涉及了可以增加患者和/或付款人费用的两个不同药物疗法的新增花费。因此，仍需要治疗自身免疫性疾病的备选疗法，并且优选地这类备选疗法将包含双特异性抗体。
[0007] 美国专利公开号2012/0251541 A1公开了具有跨接双重可变(cross-over dual variable，“CODV”)构型的抗体样结合蛋白，所述构型具有针对TNFα靶的抗原结合位点和针对IL23/IL12靶(例如，共有的p40亚基)的抗原结合位点。美国专利号7,872,102公开了可用于治疗自身免疫性疾病如多发性硬化的针对IL-23的p19亚基的抗体。美国专利号6,090,382公开了针对人TNFα的人抗体。WO2011/070339公开了针对CD、RA、PsA、AxSpA和银屑病共施用抗TNFα抗体和抗IL-23p40抗体的方法及前述抗体的联合制剂。尽管存在这些公开，这些申请的任一者中未描述特异性结合并且中和TNFα和IL-23的p19亚基的高亲和力中和性双特异性抗体。
[0008] 另外，当构建本发明的双特异性抗体时遇到了与化学和物理稳定性相关的突出问题。在起始的双特异性抗体中需要许多改变以充分克服无数问题，如表达物理稳定的分子、使单链片段可变区(scFv)的VH/VL界面稳定、增加热稳定性和盐依赖的稳定性、减少聚集、在高浓度时增加溶解度、和再平衡双特异性抗体结合面中的静电分布，与此同时分别维持对两种靶向的抗原即TNFα和IL-23的p19亚基的结合亲和力。
[0009] 因此，仍需要中和人TNFα和人IL-23的单一双特异性抗体，其中双特异性抗体特异性靶向人IL-23的p19亚基并且不特异性中和IL-12(其与IL-23分享共同的p40亚基)。需要提供具有热稳定性、物理稳定性、显示低聚集作用并中和人TNFα和人IL23p19的双特异性抗体。还需要提供包含单一双特异性抗体的药物组合物，所述单一双特异性抗体中和人TNFα和人IL23p19两者，因而避免了以下挑战：难以找到必须满足两种不同的独立抗体的不同分子特征的配制条件。本发明因此寻求解决上文提到的一个或多个问题。
[0010] 本发明提供一种双特异性抗体，其具有缀合至结合IL-23的p19亚基(IL23p19)的两个单链可变片段(scFv)的、结合肿瘤坏死因子α(TNFα)的免疫球蛋白G抗体(IgG)。根据本发明的双特异性抗体，所述IgG具有两条重链(HC)和两条轻链(LC)，每个HC具有含重链互补决定区(HCDR)1-3的重链可变区(HCVR1)并且每个LC具有含轻链互补决定区(LCDR)1-3的轻链可变区(LCVR1)。根据本发明的双特异性抗体，HCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:9，HCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10，HCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:11，LCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:15，LCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:16，并且LCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:17。本发明双特异性抗体的scFv具有含HCDR4-6的重链可变区(HCVR2)和含LCDR4-6的轻链可变区(LCVR2)。根据本发明的双特异性抗体，HCDR4的氨基酸序列是SEQ ID NO:12，HCDR5的氨基酸序列是SEQ ID NO:13，HCDR6的氨基酸序列是SEQ ID NO:14，LCDR4的氨基酸序列是SEQ ID NO:18，LCDR5的氨基酸序列是SEQ ID NO:19，并且LCDR6的氨基酸序列是SEQ ID NO:20。另外，本发明的双特异性抗体使得每个scFv借助多肽接头(接头1(L1))独立地与IgG抗体缀合，所述多肽接头与每个IgG HC的C末端和每个scFv的HCVR2的N末端共价连接。另外，本发明的双特异性抗体使得每个scFv的HCVR2借助第二多肽接头(接头2(L2))与相同scFv的LCVR2共价连接，所述第二多肽接头与相同scFv的HCVR2的C末端和LCVR2的N末端共价连接。根据本发明的双特异性抗体，L1的氨基酸序列是SEQ ID NO:21并且L2的氨基酸序列是SEQ ID NO:22。
[0011] 本发明还提供了一种双特异性抗体，其具有缀合至结合IL23p19的两个scFv的、结合TNFα的IgG，其中所述IgG具有两条重链和两条轻链，每条重链具有重链可变区(HCVR1)并且每条轻链具有轻链可变区(LCVR1)。根据本发明的双特异性抗体，HCVR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:5并且LCVR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:7。另外，每个scFv具有重链可变区(HCVR2)和轻链可变区(LCVR2)。根据本发明的双特异性抗体，HCVR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:6和LCVR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:8。另外，每个scFv借助多肽接头(L1)独立地与IgG抗体缀合，所述多肽接头与每个IgG HC的C末端和每个scFv的HCVR2的N末端共价连接。另外，每个scFv的HCVR2借助第二多肽接头(L2)与相同scFv的LCVR2共价连接，所述第二多肽接头与相同scFv的HCVR2的C末端和LCVR2的N末端共价连接。
[0012] 本发明还提供了一种双特异性抗体，其具有缀合至结合IL23p19的两个scFv的、结合TNFα的IgG，其中所述IgG具有两个HC和两个LC。根据本发明的双特异性抗体，HC的氨基酸序列是SEQ ID NO:23和LC的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。另外，每个scFv具有重链可变区(HCVR2)和轻链可变区(LCVR2)。根据本发明的双特异性抗体，HCVR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:6和LCVR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:8。另外，每个scFv借助多肽接头(L1)独立地与IgG抗体缀合，所述多肽接头与每个IgG HC的C末端和每个scFv的HCVR2的N末端共价连接。另外，每个scFv的HCVR2借助第二多肽接头(L2)与相同scFv的LCVR2共价连接，所述第二多肽接头与相同scFv的HCVR2的C末端和LCVR2的N末端共价连接。根据本发明的双特异性抗体，L1的氨基酸序列是SEQ ID NO:21并且L2的氨基酸序列是SEQ ID NO:22。
[0013] 本发明的例示双特异性抗体的多个区域和接头的关系如下(氨基酸编号采用线性编号；氨基酸对可变结构域的归属基于www.imgt.org可获得的国际免疫遗传学信息系统 ；氨基酸对CDR结构域的归属基于如表1中反映的熟知Kabat编号惯例和North编号惯例)：
[0014] 表1：本发明的例示双特异性抗体的氨基酸区域
[0015]
[0016]
[0017] 本发明还提供一种双特异性抗体，其中每一个HC与每一个LC形成链间二硫键；其中每一个HC与另一个HC形成链间二硫键：并且其中每一个scFv在HCVR2和LCVR2之间形成链内二硫键。根据表1中展示的本发明例示双特异性抗体，每一个HC和每一个LC的链间二硫键在HC(SEQ ID NO:1)的半胱氨酸残基148和LC(SEQ ID NO:2)的半胱氨酸残基214之间形成；至少两个链间二硫键在两个HC之间形成，第一链间二硫键在HC(SEQ ID NO:1)的半胱氨酸残基230和另一个HC(SEQ ID NO:1)的半胱氨酸残基230之间形成，第二链间二硫键在HC(SEQ ID NO:1)的半胱氨酸残基233和另一个HC(SEQ ID NO:1)的半胱氨酸残基233之间形成；并且scFv的链内二硫键在HCVR2(SEQ ID NO:1)的半胱氨酸残基508和LCVR2(SEQ ID NO:1)的半胱氨酸残基699之间形成。
[0018] 根据本发明的一些实施方案，提供包含HC糖基化的双特异性抗体。根据表1中展示的本发明例示双特异性抗体，HC的糖基化在SEQ ID NO:1的天冬酰胺残基301处发生。
[0019] 本发明还提供DNA分子，所述DNA分子包含编码多肽链的多核苷酸序列，所述多肽链包含本发明双特异性抗体的HC、scFv、L1和L2。根据本发明的一个实施方案，所编码的多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。
[0020] 本发明还提供DNA分子，所述DNA分子包含编码第二多肽链的多核苷酸序列，所述第二多肽链包含本发明双特异性抗体的LC。根据本发明的一个实施方案，所编码的第二多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
[0021] 本发明还提供DNA分子，所述DNA分子包含编码多肽链的多核苷酸序列，所述多肽链包含本发明双特异性抗体的HC、scFv、L1和L2，并且包含编码第二多肽链的第二多核苷酸序列，所述第二多肽链包含本发明双特异性抗体的LC。根据本发明的一个实施方案，所编码的包含HC、scFv、L1和L2的多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:1，并且含有SEQ ID NO:3的DNA序列的表达载体编码该多肽链。另外，根据本发明的一个实施方案，所编码的第二多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:2，并且含有SEQ ID NO:4的DNA序列的表达载体编码第二多肽链。
[0023] 本发明还提供用本发明DNA分子转化的哺乳动物细胞，其中细胞能够表达本发明的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与结合IL23p19的两个scFv缀合的结合TNFα的IgG。
[0024] 本发明还提供一种产生本发明的双特异性抗体的方法，所述方法包括在如此条件下培养本发明的哺乳动物细胞，从而双特异性抗体表达，及回收表达的双特异性抗体。本发明还提供通过所述方法产生的本发明双特异性抗体。
[0025] 本发明还提供一种治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的本发明双特异性抗体。
[0026] 本发明还提供一种治疗IBD(如CD和UC)的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明双特异性抗体。
[0027] 本发明还提供一种治疗RA、AxSpA和PsA的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明双特异性抗体。
[0028] 本发明还提供用于治疗中的本发明双特异性抗体。
[0029] 本发明还提供用于治疗自身免疫性疾病(包括IBD如CD和UC)的本发明双特异性抗体。
[0030] 本发明还提供用于治疗自身免疫性疾病(包括RA，AxSpA和PsA)的本发明双特异性抗体。
[0031] 本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的双特异性抗体和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
[0032] 本发明的另一个实施方案包括本发明的双特异性抗体在制造用于治疗溃疡性结肠炎和节段性回肠炎的药物中的用途。
[0033] 本发明的额外实施方案包括本发明的双特异性抗体在制造用于治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎和中轴型脊椎关节病的药物中的用途。
[0034] 定义
[0035] 在本文中使用时，术语“双特异性抗体”指包含与两个单链可变片段(scFv)缀合的免疫球蛋白G抗体(IgG)的分子。如本文提到，本发明的双特异性抗体包含通过多肽接头(L1)与IgG的一个HC的羧基端共价连接的一个scFv和通过多肽接头(L1)与IgG的另一个HC的羧基端共价连接的另一个scFv。本发明双特异性抗体的IgG和scFv特异性结合不同的抗原(分别是TNFα和IL-23的p19亚基)。
[0036] 在本文中使用时，术语“免疫球蛋白G抗体”(IgG)指包含四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重链(HC)和两条轻链(LC))的免疫球蛋白分子。四条多肽链中每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。四条多肽链中每条链的羧基端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。每条重链的羧基端部分借助多肽接头(L1)与单链可变片段(scFv)之一共价连接。
[0037] 本发明双特异性抗体的IgG的轻链(LC)分类为κ或λ并且以本领域已知的特定恒定区为特征。本发明的IgG的重链(HC)分类为γ，其定义同种型(例如，定义为IgG)。同种型可以进一步划分成亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)。每个HC类型以本领域已知的特定恒定区为特征。每个HC包含N末端重链可变区(“HCVR”)和重链恒定区(CH)。根据本发明，IgG的CH包含三个结构域(CH1、CH2和CH3)。IgG的每条轻链包含轻链可变区(LCVR)和轻链恒定区(CL)。HCVR区和LCVR区可以进一步再划分为超变区，名为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域，名为构架区(FR)。本发明IgG的每个HCVR和LCVR包含氨基端至羧基端按以下顺序布置的3个CDR和4个FR：FR1-1、CDR1、FR1-2、CDR2、FR1-3、CDR3、FR1-4。本文的3个HC CDR称作“HCDR1、HCDR2和HCDR3”和3个LC CDR称作“LCDR1、LCDR2和LCDR3”。CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。抗体结合特定抗原的功能性能力主要受六个CDR影响。
[0038] 如本文提到，术语“单链可变片段”(scFv)指包含借助多肽接头(L2)连接的重链可变区(HCVR2)和轻链可变区(LCVR2)的多肽链。另外，如本文提到(和如以下示意图中所示)，每个scFv的HCVR2：a.)在其N末端借助多肽接头(L1)共价连接至IgG的一个HC的C末端；并且b.)在其C末端借助第二多肽接头(L2)共价连接至相同scFv的LCVR2的N末端。另外，本发明的每个scFv包括在相同多肽链的HCVR2的半胱氨酸残基和LCVR2的半胱氨酸残基之间形成的二硫键(如以下示意图中所示)：
[0039]
[0040] scFv的HCVR2和LCVR2可以进一步再划分为超变区，名为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域，名为构架区(FR)。本发明IgG的每个HCVR2和LCVR2各自包含氨基端至羧基端按以下顺序布置的3个CDR和4个FR：FR2-1、CDR4、FR2-2、CDR5、FR2-3、CDR6、FR2-4。本文中，scFv的HCVR2的3个CDR称作“HCDR4、HCDR5和HCDR6”并且scFv的LCVR2的3个CDR称作“LCDR4、LCDR5和LCDR6”。CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。scFv结合特定抗原的功能性能力主要受六个CDR影响。
[0041] 根据本发明，IgG和scFv的每个轻链/重链对的可变区分别形成双特异性抗体的抗原结合位点。根据本发明，IgG具有相同的两个抗原结合位点(但是与scFv的抗原结合位点不同)并且每个scFv具有一个抗原结合位点(其与另一个scFv的抗原结合位点相同)。如本文所用，“抗原结合部分”或“抗原结合位点”或“抗原结合区”或“抗原结合片段”可互换地指可变区内部IgG或scFv分子的这个部分，其含有与抗原相互作用并赋予双特异性抗体针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。这种抗体部分包括为维持结合抗原的残基的正确构象必需的构架氨基酸残基。优选地，本发明双特异性抗体的构架区是人源的或基本上人源的。
[0042] 如本文中可互换使用的“亲本抗体”或“母抗体”是由(例如通过氨基酸置换和结构改变来)制备双特异性抗体的IgG和scFv之一中所使用的氨基酸序列编码的抗体。亲本抗体可以是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[0043] 术语“Kabat编号”或“Kabat标记”在本文中互换地使用。本领域公认的这些术语指将在抗体的重链可变区和轻链可变区中比其他氨基酸残基更为可变(即，高变)的氨基酸残基编号的体系(Kabat等人,Ann.NY Acad.Sci.190:382-93(1971)；和Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,美国卫生和公众服务部,NIH出版编号91-3242(1991))。
[0044] 术语“North编号”或“North标记”在本文中互换地使用。本领域公认的这些术语指将氨基酸残基编号的体系，所述氨基酸残基在抗体的重链可变区和轻链可变区中比其他氨基酸残基更为可变(即，高变的)并且至少部分地基于采用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)，如(North等人,A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology,406:228-256(2011)中所述。
[0045] 本文中互换使用的术语“患者”、“受试者”、和“个体”指动物，优选地，该术语指人。在某些实施方案中，受试者，优选地人，以将从IL-23和TNFα水平减少或其生物活性降低获益的疾病或病症或病状(例如，自身免疫疾病)为特征。在另一个实施方案中，受试者，优选地人，以面临形成下述病症、疾病或病状为特征，所述的病症、疾病或病状将从IL-23和TNFα水平减少或其生物活性降低获益。
[0046] 双特异性抗体工程化
[0047] 当构建本发明的双特异性抗体时遇到了与化学和物理稳定性相关的突出问题。遭遇的问题包括表达不良至不表达、纯化回收不良、热稳定性低、高盐依赖性聚集、双体抗体(diabody)形成(和难以通过纯化减少双体抗体)、高溶液粘度、结合亲和力低和交叉反应性。
[0048] 例如，构建本发明双特异性抗体的初始尝试包括这样的构建体，其中亲本IL-23抗体(美国专利号7,872,102中描述的IL-23抗体)构成双特异性抗体的IgG抗体部分并且亲本TNFα抗体(阿达木单抗，参见例如美国专利号6,090,382)构成双特异性抗体的scFv部分。其他最初尝试的构建体包括构成双特异性抗体的scFv部分的亲本IL-23抗体，同时包括构成双特异性抗体的IgG部分的TNFα抗体。另外，初始构建体包括以多种构型(包括分别在重链和轻链的氨基端或羧基端)与IgG部分缀合的scFv部分。另外，初始构建体包含在HCVR2和LCVR2排列方面不同的scFv部分(例如，IgG部分(C或N末端)–接头1–LCVR2或HCVR2–接头2–其他LCVR2或HCVR2)。进一步地，亲本IL-23抗体构建体包含重链种系构架VH 5-51和1-69和轻链种系构架VK 02、VK 12和VK B3的组合。亲本TNFα抗体构建体(当包含IgG部分时)包括恒定区(CH)内部具有三个氨基酸突变(来自天然IgG4)的IgG4亚类结构。将初始构建体克隆入人IgG4-Fc哺乳动物表达载体。然而，起初产生的双特异性构建体(如上文所述)显示出上文描述的一种或多种化学问题和/或物理问题。
[0049] 计算双特异性抗体的静电表面并且确定及破坏带电荷的小区域。进行充分的蛋白质稳定性研究并且对构建的双特异性抗体筛选热稳定性特性以及TNFα结合特性和IL-23结合特性(相对于相应的亲本抗体)。
[0050] 因此进行化学修饰和物理修饰以改善本发明双特异性抗体的化学和物理稳定性。在HCDR4、HCDR5、LCDR4、LCDR5和LCDR6中修饰scFv样式的亲本IL-23抗体以改善化学和物理稳定性。将构建的HCVR和LCVR根据以下式组合成IL-23scFv样式：TNFαIgG(C末端)–L1–HCVR2–L2–LCVR2。在IL-23scFv的HCVR2(G508C)和LCVR2(G699C)(氨基酸的编号利用以表1中展示的例示双特异性抗体为基础的线性编号法)之间工程化用于稳定IL-23scFv的二硫键。另外在双特异性抗体的IgG部分中，将亲本TNFα抗体工程化成IgG1亚类以改善生物化学行为，包括溶解性和减少聚集。将工程化的IL-23scFv构建体和TNFαIgG构建体(包含这些化学修饰和物理修饰)插入IgG1表达载体中。
[0051] 将含有作为IgG1亚类的TNFαIgG和具有六个CDR突变的IL-23scFv(相对于亲本IL-23抗体：具有K28P和T54V的HCVR；和具有L30G、L53K、E54L和M90Q的LCVR，氨基酸编号的赋予基于熟知的Kabat编号惯例)(如表1中反映的例示双特异性抗体中所示：具有K492P和T522V的HCVR；和具有L629G、L653K、E654L和M689Q的LCVR，氨基酸的编号基于线性编号法)的双特异性抗体鉴定为改善初始构建体中所展示的表达问题、亲和力问题(对于IL-23，相对于亲本分子)和热稳定性问题。另外，这些突变导致食蟹猴中显著降低的清除率。上述修饰无一在单个亲本抗体的初始表征中鉴定到。
[0052] 双特异性抗体结合
[0053] 本发明的双特异性抗体结合人TNFα和人IL23p19并且在体外或体内中和至少一种人TNFα生物活性及至少一种人IL-23生物活性。在体外存在和不存在TNFα时，本发明的双特异性抗体是IL-23的强力抑制剂。在体外存在和不存在IL-23时，本发明的双特异性抗体是可溶性和膜结合型TNFα的强力抑制剂。
[0054] 本发明的双特异性抗体进一步表征作在37℃对人TNFα具有96±3.5pM范围内的结合亲和力(KD)和对人IL23p19具有121±8.5pM范围内的结合亲和力(KD)。双特异性抗体有效地中和可溶性及膜结合型TNFα并且这种中和作用不受存在饱和量的人IL-23影响。双特异性抗体有效地中和人IL-23并且这种中和不受存在饱和量的人TNFα影响。
[0055] 双特异性抗体表达
[0056] 能够指导与之有效连接的基因表达的表达载体是本领域熟知的。表达载体可以编码促进多肽从宿主细胞分泌的信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。第一多肽链(包含HC、scFv、L1和L2)和第二多肽链(包含LC)可以在一个载体中从与它们有效连接的不同启动子独立表达、或者备选地，第一和第二多肽链可以在两个载体中从与之有效连接的不同启动子表达－一个载体表达第一多肽链并且一个载体表达第二多肽链。
[0057] 宿主细胞包括用表达本发明第一多肽链、第二多肽链或同时表达第一和第二多肽链的一个或多个表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。可以使用本领域已知的标准技术实现产生本发明双特异性抗体的宿主细胞系的创建和分离。哺乳动物细胞是表达双特异性抗体的优选宿主细胞。具体的哺乳动物细胞是HEK293、NS0、DG-44和CHO。优选地，双特异性抗体分泌入培养宿主细胞的培养基，可以从所述培养基回收或纯化双特异性抗体。
[0058] 本领域熟知，抗体的哺乳动物表达导致糖基化。一般地，糖基化出现在抗体的Fc区内高度保守的N-糖基化位点处。N-聚糖一般接合至天冬酰胺。以举例方式，表1中展示的例示双特异性抗体的每个HC在SEQ ID NO:1的天冬酰胺残基301处糖基化。
[0059] 编码第一多肽链(包含本发明HC、scFv、L1和L2并且具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列)的具体DNA多核苷酸序列是：
[0060]atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggctccactggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttgatgactatgccatgcactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtgtcagctattacttggaatagtggtcacatagactacgcagactccgtggagggccggttcaccatctccagagacaatgccaagaactccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagtgagctacctgagtactgcctccagcctggactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggacgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggcggaggctccgggggagggggtagcggaggagggggatcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatatccattcactcgctatgttatgcactgggtgcgacaggcccctggacaatgccttgagtggatgggatatattaatccttacaatgatggtgtgaactacaatgagaagttcaaaggcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaaactgggacacaggcctctgggggcaagggaccacggtcaccgtctcctcaggcggcggaggctctggcggaggtggtagtggtggcggtggatcagggggaggcggatctgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcaaggcaagtgaccacattggcaaatttttaacttggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatggtgcaaccagcaagctgactggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagtattggagtactccgttcacgttcggatgcgggaccaaggtggaaataaaa(SEQ ID NO:3).
[0061] 编码第二多肽链(包含本发明LC并且具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列)的具体DNA多核苷酸序列是：
[0062]atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggatccactggcgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcagggcattcgcaattatttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcaacgctataaccgtgccccttacacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacggactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc(SEQ ID NO:4).
[0063] 可以通过常规技术纯化其中已经分泌有双特异性抗体的培养基。例如，可以将培养基使用常规方法施加至蛋白A柱或蛋白G柱并从其洗脱。可以通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析有效地移除可溶性聚集物和多聚体。可以将产物立即冷冻(例如在-70℃)或可以冻干。
[0064] 在一些情况下，用于产生本发明双特异性抗体的方法可以导致双体抗体形成。双体抗体是scFv的双价形成，其中HCVR2区和LCVR2区在单条多肽链上表达，但是作为可变结构域与相同多肽链的互补结构域配对的替代，可变结构域与另一条多肽链或不同分子的互补结构域配对。例如，如果双特异性抗体包含两条第一多肽(出于方便，1A和1B，其中1A和1B各自包含HC、scFv、L1和L2)和两条第二多肽(出于方便，2A和2B，其中2A和2B各自包含LC)，则1A的HCVR2与1B的LCVR2的互补结构域配对，而不是与1A的LCVR2配对。如本文所述，从上文描述的双特异性抗体纯化出双体抗体可能有益。双体抗体含量可以在细胞表达后大于10％并且可以在纯化后降低至小于3％。
[0065] 治疗性用途
[0066] 如本文所用，“治疗”和/或“治疗着”意在指以下全部过程，其中可以延缓、暂停、中止、控制或阻止本文所述疾病的进展，但不必然地表示完全消除全部疾病症状。治疗包括施用本发明的双特异性抗体以治疗将从降低的TNFα和/或IL-23水平或降低的TNFα和/或IL-23生物活性获益的哺乳动物中、尤其人类中的疾病或病状，并且包括：(a)抑制疾病进一步进展，即，中止其发展；和(b)减轻疾病，即，引起疾病或病症消退或缓和其症状或并发症。
[0067] 预计本发明的双特异性抗体治疗自身免疫性疾病，包括IBD(如CD和UC)、AxSpA、RA和PsA。
[0068] 药物组合物
[0069] 本发明的双特异性抗体可以并入适于施用至患者的药物组合物中。本发明的双特异性抗体可以单独或连同可药用载体和/或稀释剂一起按单剂量或多剂量施用至患者。这类药物组合物设计成适于所选择的施用模式，并且根据需要，使用可药用的稀释剂、载体和/或赋形剂如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。所述组合物可以根据例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy,第22版,Loyd V编著,Pharmaceutical Press,2012中公开的常规技术设计，所述文献提供如执业者通常已知的配制技术纲要。药物组合物的合适载体包括下述任何材料，与本发明的双特异性抗体组合时，所述材料保留该分子的活性并且与患者的免疫系统无反应。本发明的药物组合物包含双特异性抗体和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
[0070] 可以使用标准施用技术，将包含本发明双特异性抗体的药物组合物施用至面临如本文所述的疾病或病症的风险或显示这类疾病或病症的患者。
[0071] 本发明的药物组合物含有“有效量”或“治疗有效量”(本文中可互换使用)的本发明双特异性抗体。“有效量”指为预期治疗结果而(在剂量和持续时间和施用手段方面)必需的量。双特异性抗体的有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发预期反应的能力而变动。有效量也是这样的量，其中双特异性抗体的治疗有益作用超过任何有毒或有害作用。实施例
[0072] 除非另外注明，否则，在实施例部分至始至终提到的例示双特异性抗体指上表1中所述的本发明例示双特异性抗体。
[0073] 双特异性抗体表达和纯化
[0074] 例示的双特异性抗体基本上如下表达和纯化。通过电穿孔法，使用谷氨酰胺合成酶(GS)表达载体转染中国仓鼠细胞系CHO(GS敲除，克隆1D3)，所述表达载体含有SEQ ID NO:3(编码多肽链，其包含IgG HC、scFv HCVR2及LCVR2和接头L1及L2，并且具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列)和SEQ ID NO:4(编码第二多肽链，其包含IgG LC并且具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列)的DNA。该表达载体编码SV早期(猿猴病毒40E)启动子和GS基因。GS的表达允许谷氨酰胺(CHO细胞需要的氨基酸)的生物化学合成。转染后，细胞接受50μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的混合选择。利用MSX抑制GS增加选择的严格性。可以比照表达内源水平GS的CHO野生型细胞选出表达载体cDNA整合入宿主细胞基因组转录活跃区的细胞。将转染的汇集物以低密度铺种以允许稳定表达型细胞的近乎克隆性长出。对主孔筛选双特异性抗体表达并且随后以无血清悬浮培养方式放大以用于生产。将澄清的培养基(其中已经分泌有例示双特异性抗体)施加至蛋白A亲和柱，其中所述蛋白A亲和柱已经用相容性缓冲液如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)平衡。所述柱经洗涤以除去非特异性结合组分。将结合的双特异性抗体洗脱，例如，借助pH梯度(如0.1M磷酸钠缓冲液pH 6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5)洗脱，并且用Tris pH 8缓冲液中和。检测双特异性抗体级分，如通过SDS-PAGE或分析性大小排阻法，并且随后汇集。可以通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析有效地移除可溶性聚集物和多聚体。使用常见技术，将双特异性抗体浓缩和/或无菌过滤。这些色谱步骤后例示双特异性抗体的纯度大于98.6％(单体)。可以将双特异性抗体立即冷冻在-70℃或在4℃贮存几个月。
[0075] 双特异性抗体溶解性和稳定性分析
[0076] 例示的双特异性抗体配制于10mM柠檬酸盐pH 6.0中。将双特异性抗体浓缩至1mg/mL、50mg/mL和100mg/mL(使用Amicon U.C.滤器，Millipore，目录号UFC903024)。将浓缩至1mg/mL的样品在4℃和25℃之一温育4周时间并且将浓缩至50mg/mL和100mg/mL的样品与
25mM或150mM NaCl在4℃和25℃之一温育4周时间。
25mM或150mM NaCl在4℃和25℃之一温育4周时间。
[0077] 在温育后，使用TSKgel Super SW3000(Tosoh Bioscience产品号18675)柱，用大小排阻色谱法(SEC)分析样品的高分子量百分数(HMW％)。使用50mM磷酸钠+350mM NaCl，pH 7.0作为流动相，以0.4mL/分钟运行15分钟。将体积5μL(5μg)的浓缩抗体注入柱并且在
214nm测量进行检测。对于高浓度样品，将1μL(50μg或100μg)体积注入柱并且在280nm测量进行检测。使用ChemStation分析色谱图，并且使用单体峰之前洗脱的峰的AUC对总AUC的比率，计算高分子量(HMW)％。表2中汇总结果。
214nm测量进行检测。对于高浓度样品，将1μL(50μg或100μg)体积注入柱并且在280nm测量进行检测。使用ChemStation分析色谱图，并且使用单体峰之前洗脱的峰的AUC对总AUC的比率，计算高分子量(HMW)％。表2中汇总结果。
[0078] 表2：4周期间通过SE-HPLC测量的高分子量种类百分数距起始对照的变化的总结。
[0079]样品浓度 温育温度 依据SE-HPLC的HMW％变化
1mg/mL 4℃ 0
1mg/mL 25℃ 0.5
50mg/mL 4℃ 0.2
50mg/mL 25℃ 0.7
100mg/mL 4℃ 0.1
100mg/mL 25℃ 0.7
1mg/mL 4℃ 0
1mg/mL 25℃ 0.5
50mg/mL 4℃ 0.2
50mg/mL 25℃ 0.7
100mg/mL 4℃ 0.1
100mg/mL 25℃ 0.7
[0081] 表3：4周期间通过cIEF测量的样品降解变化的总结。
[0082]样品浓度 温育温度 样品降解％
1mg/mL 4℃ 0.7
1mg/mL 25℃ 1.7
1mg/mL 4℃ 0.7
1mg/mL 25℃ 1.7
[0083] 使用Thermo Scientific Ion Trap LC-MS系统，根据生产商说明书，还用液相色谱-质谱(LC-MS)分析法分析浓缩至1mg/mL并贮存在40℃的样品以鉴定肽键切割。双特异性抗体的区域未展示大于2％的肽键切割。仅编码的第一多肽链(例示双特异性抗体的SEQ ID NO:1)的铰链区(1.8％)和接头L1(1.1％)展示大于1％的肽键切割。
[0084] 在1周温育期间后在4℃、-5℃和-10℃分析例示双特异性抗体的溶解性。用浓缩至100mg/mL和150mg/mL之间(使用Amicon U.C.滤器，Millipore，目录号UFC903024)并配制于包含150mM NaCl的10mM pH 6.0柠檬酸盐中的双特异性抗体评估溶解性。在温育期间后，例示的双特异性抗体显示出良好溶解性并且缺少相分离。
[0085] 在室温分析例示双特异性抗体的粘度。用浓缩至100mg/mL(使用AmiconU.C.滤器，Millipore，目录号UFC903024)并配制于包含150mM NaCl的10mMpH 6.0柠檬酸盐中的双特异性抗体评估粘度。例示的双特异性抗体显示出良好的粘度，在100mg/mL时4.2cp，而其他尝试的初始构建体展示高得不可接受的粘度(>9cP)。
[0086] 不可能采用包含亲本TNFα抗体和亲本IL-23的双特异性抗体进行初步研究，原因在于双特异性抗体表达不良、双特异性抗体降解/修剪、在相对高的浓度溶液粘度高得不可接受及亲和力低(相对于亲本抗体)。然而，采用本发明例示双特异性抗体的初步研究展示出乎意料的有益特性，包括双特异性抗体的表达和出乎意料的有益化学及物理稳定性和溶解性特性。如通过初步数据展示，本发明的双特异性抗体显示HMW聚集少、溶解性良好、在溶液中粘度良好、物理稳定性增加(包括低的降解水平和低的肽键切割)，并且维持针对TNFα和IL-23的p19亚基的亲和力。
[0087] 双特异性抗体对IL-23和TNFα的结合亲和力
[0088] 使用表面等离子体共振测定法在Biacore T100仪器上测定例示双特异性抗体对人IL-23和人TNFα的结合亲和力和结合化学计量，该仪器用HBS-EP+(10mM Hepes pH7.4+150mM NaCl+3mM EDTA+0.05％(w/v)表面活性剂P20)运行缓冲液和设定在37℃的分析温度准备。使用在全部四个流动小室(Fc)上含有固定化蛋白A的CM5芯片(Biacore P/N BR-
100530)(使用标准NHS-EDC胺偶联生成)用来利用捕获方法。通过稀释入运行缓冲液，配制抗体样品为10μg/mL，通过稀释入运行缓冲液，将人IL-23以终浓度20.0nM、10.0nM、5.0nM、
2.5nM、1.25nM、0.62nM和0nM(空白)配制。通过稀释入运行缓冲液，将人TNFα以终浓度
50.0nM、25.0nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM、0.78nM、0.39nM、0.19nM和0nM(空白)配制。
100530)(使用标准NHS-EDC胺偶联生成)用来利用捕获方法。通过稀释入运行缓冲液，配制抗体样品为10μg/mL，通过稀释入运行缓冲液，将人IL-23以终浓度20.0nM、10.0nM、5.0nM、
2.5nM、1.25nM、0.62nM和0nM(空白)配制。通过稀释入运行缓冲液，将人TNFα以终浓度
50.0nM、25.0nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM、0.78nM、0.39nM、0.19nM和0nM(空白)配制。
[0089] 每个分析循环由以下组成：(1)在独立的流动小室(Fc2和Fc3)上捕获抗体样品，(2)在全部Fc上以80μL/分钟注射人IL-23每个浓度持续200秒，随后返回缓冲液流持续1800秒以监测解离相；(3)在全部Fc上以50μL/分钟注射人TNFα每个浓度持续250秒，随后返回缓冲液流持续1200秒以监测解离相；(4)在全部小室上以80μL/分钟注射pH 1.5 10mM甘氨酸持续60秒，使芯片表面再生；和(5)注射10μL(60秒)HBS-EP+平衡芯片表面。将数据使用标准双参照法处理并使用Biacore T100评价软件2.0.3版针对1:1结合模型拟合，以确定结合速率(kon，M-1s-1单位)、解离速率(koff，s-1单位)和Rmax(RU单位)。从关系KD＝koff/kon计算平衡解离常数(KD)并以摩尔单位计。
[0090] 表4：例示的双特异性抗体在37℃对人IL-23和人TNFα的结合亲和力。
[0091]
[0092] 这些结果显示，本发明的例示双特异性抗体在37℃以高亲和力结合人IL-23和人TNFα。
[0093] 同时结合IL-23和TNFα
[0094] BIAcore T100仪用来确定人IL-23和人TNFα是否可以与双特异性抗体同时结合。除非另外注明，全部试剂和材料均购自BIAcore AB(Upsala,瑞典)。全部测量均在37℃进行。使用HBS-EP+缓冲液(150mM氯化钠，3mM EDTA，0.05％(w/v)表面活性剂P-20，和10mM HEPES，pH 7.4)作为运行缓冲液和样品缓冲液。使用胺偶联试剂盒，在CM5传感芯片的流动小室1和2上固定蛋白A。例示的双特异性抗体(稀释至1μg/ml)首先捕获于流动小室2上(按
80μl/分钟注射4秒，产生95.3响应单位(ΔRU)的双特异性抗体捕获)，随后注射100nM的人TNFα持续5分钟以饱和TNFα结合位点(观察到32.4ΔRU的结合信号)。流动小室1是仅蛋白A对照。在TNFα结合(流动小室2)后，随后注射100nM的人IL-23持续5分钟并且观察到额外的结合信号(57.3ΔRU)。随后使用pH 1.510mM甘氨酸再生芯片表面。重复相同的过程，除了顺序颠倒外，即，人IL-23为先，随后是人TNFα。这些结果显示，本发明的例示双特异性抗体可以同时结合人IL-23和人TNFα，如通过来自两种配体与双特异性抗体结合的响应单位(来自TNFα的初始32.4RU并且随后是来自IL-23的额外57.3RU)增加所示。
80μl/分钟注射4秒，产生95.3响应单位(ΔRU)的双特异性抗体捕获)，随后注射100nM的人TNFα持续5分钟以饱和TNFα结合位点(观察到32.4ΔRU的结合信号)。流动小室1是仅蛋白A对照。在TNFα结合(流动小室2)后，随后注射100nM的人IL-23持续5分钟并且观察到额外的结合信号(57.3ΔRU)。随后使用pH 1.510mM甘氨酸再生芯片表面。重复相同的过程，除了顺序颠倒外，即，人IL-23为先，随后是人TNFα。这些结果显示，本发明的例示双特异性抗体可以同时结合人IL-23和人TNFα，如通过来自两种配体与双特异性抗体结合的响应单位(来自TNFα的初始32.4RU并且随后是来自IL-23的额外57.3RU)增加所示。
[0096] Kit225细胞是天然表达IL-23受体的人T细胞淋巴细胞白血病细胞系。Kit225细胞与人IL-23的温育导致IL-23R/JAK激酶介导的Stat3磷酸化快速增加，这可以使用市售ELISA测量。
[0097] 在分析培养基(含有10％FBS，10ng/ml人IL-2，和1x青霉素加嘌呤霉素的RPMI 1640)中常规地培养Kit225细胞。在分析当日，将细胞收获，用大体积无血清RPMI 1640培养
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基洗涤，随后按5x 10 /ml重悬于无血清RPMI 1640中。添加500,000个Kit225细胞/孔(在
100μL中)至U型底96孔培养平板的各孔。将96孔平板置于培养箱中并且令细胞在37℃饥饿3小时。
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基洗涤，随后按5x 10 /ml重悬于无血清RPMI 1640中。添加500,000个Kit225细胞/孔(在
100μL中)至U型底96孔培养平板的各孔。将96孔平板置于培养箱中并且令细胞在37℃饥饿3小时。
[0098] 评价例示双特异性抗体100nM至0.5pM的剂量范围，稀释度1:3(双特异性抗体的MW是200kDa)。将每个测试浓度的例示双特异性抗体与(2ng/ml)重组人IL-23在37℃预温育30分钟。分析培养基用于“单一培养基”和“含2ng/ml IL-23的培养基”对照。使用靶向IL-23的p19亚基的IL-23中和抗体(美国专利号7,872,102中描述的亲本IL-23抗体)作为分析中的阳性对照并且按照与双特异性抗体相同的摩尔范围测试。也将对照抗体与(2ng/ml)重组人IL-23在37℃预温育30分钟。在预温育后，将抗体/IL-23混合物转移至Kit225细胞并在37℃温育15分钟。
[0099] 在分析结束时，将平板离心(在4℃，3000转/分钟持续2分钟)并且随后弃去上清液。添加裂解缓冲液(100μL，含有磷酸盐/蛋白酶抑制剂)至细胞并且随后在冰上温育5分钟。在温育后，将细胞离心(在4℃，3000转/分钟持续5分钟)。在离心后，将100μL上清液转移至96孔平板(用抗Stat3抗体预包被)以温育过夜(4℃)。在通过ELISA测量Stat3磷酸化的当天，将96孔平板在室温加温并且根据生产商说明书实施测定Stat3磷酸化水平的ELISA(Cell Signaling Inc.，目录号7146)。在ELISA反应后，在微量平板读数仪(Molecular Devises SpectraMax 190)上在450nm读取96孔平板。结果表示为双特异性抗体或阳性对照抑制IL-23诱导的Stat3磷酸化50％(IC50)并且使用数据4参数S形曲线拟合(GraphPad Prism)计算的浓度。
[0100] 这些结果显示，本发明的例示双特异性抗体以浓度依赖性方式抑制Kit225细胞中人IL-23诱导的Stat3磷酸化。这种抑制与用阳性对照IL-23p19抗体观察到的结果可比较(双特异性抗体的IC50为158±26pM而阳性对照IL-23p19抗体的IC50为75±7pM(来自三次独立实验的平均IC50±SEM))。阴性对照抗体在测试的任何浓度不抑制Kit225细胞中的Stat3磷酸化。本发明的例示双特异性抗体有效中和IL-23。
[0101] 抑制L929细胞中可溶性TNFα诱导的体外细胞毒性
[0102] L929细胞是天然表达TNF受体的小鼠纤维肉瘤细胞。L929细胞与人TNFα的温育导致细胞快速死亡，原因在于过量形成活性氧中间物。可以使用MTT细胞毒性测定法测量细胞死亡，其中活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶令四唑 盐还原成甲臜产物，该产物可以用微量平板读数仪(Molecular Devices SpectriMax 190)检出。
[0103] 评价从20nM至10pM的剂量范围(双特异性抗体的MW是200kDa)。将每种测试浓度的例示双特异性抗体(100μL)添加至含有200pg/mL重组人TNFα和6.25μg/mL放线菌素D的孔。每个处理一式两份实施测试。使用TNFα抗体即IgG1同种型的阿达木单抗(亲本TNFα抗体，参见例如美国专利号6,090,382)作为分析中的阳性对照。使用人IgG1同种型对照抗体作为阴性对照。对照抗体按照与例示双特异性抗体相同的摩尔剂量范围测试。将含有抗体混合物的平板在室温温育60分钟。
[0104] 在分析培养基(1x DMEM Cellgro，10％FBS，1％Pen-Strep，1％MEM必需氨基酸，1％L-谷氨酰胺，1％丙酮酸钠)中常规培养L929细胞。在分析当日，用1x PBS(无Ca++或Mg++)淋洗细胞并用0.25％胰蛋白酶+EDTA使其从培养瓶脱离。用分析培养基灭活胰蛋白酶。将L929细胞以215x g在室温离心5分钟。将细胞沉淀物重悬于分析培养基中。用血细胞计数板测量细胞密度，并将10,000个L929细胞(在100μL中)添加至96孔板并置于组织培养箱(37℃，95％相对湿度，5％CO2)中过夜。将抗体/TNFα/放线菌素D混合物转移至具有L929贴壁细胞的96孔平板并温育(37℃，95％相对湿度，5％CO2)18小时。移除分析培养基并添加MTT底物混合物至各孔(120μL)。将平板置于37℃，95％相对湿度，5％CO2 3小时。通过在微量平板读数仪(Molecular Devices SpectraMax 190)上在490nm读取平板测定细胞死亡。结果表示为双特异性抗体或阳性对照抗体抑制TNFα诱导的反应50％(IC50)(三次独立实验平均数±SEM)的浓度，所述浓度是使用数据4参数S形曲线拟合(GraphPad Prism)计算出的。
[0105] 这些结果显示，本发明的例示双特异性抗体以浓度依赖性方式抑制人TNFα诱导的L929细胞杀伤，IC50为233±20pM。这种抑制与用阳性对照抗体阿达木单抗(IC50＝250±24pM)观察到的抑制可比较，而阴性对照抗体不抑制人TNFα。本发明的例示双特异性抗体有效中和人TNFα。
[0106] 抑制L929细胞中膜结合型人TNFα诱导的体外细胞毒性
[0107] 为了研究双特异性抗体抑制膜结合型TNFα的能力，使用一组突变，使TNFα的已知剪切位点失活，其中所述突变先前证实在缺乏剪切TNFα的情况下，允许在细胞表面表达生物活性TNFα(Mueller等人,1999)。将不可剪切的TNFα构建体稳定转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。这些细胞表达膜结合型TNFα，如通过流式细胞术所示。L929细胞与表达不可剪切的结合型人TNFα的CHO细胞温育导致L929细胞快速死亡。
[0108] 将表达膜结合型人TNFα的CHO细胞常规维持在选择培养基中(AM2001培养基，一种无MSX、具有8mM谷氨酰胺、GS补充物、含500μg/mL G418的HT补充物的内部CHO生长培养基)。在分析当日，将细胞计数，用1x PBS(无Ca++或Mg++)淋洗，以215x g离心5分钟并且以50,000个细胞/mL重悬于含放线菌素D(6.25μg/mL终浓度)的L929分析培养基中。添加含500个细胞(在10μL中)的细胞悬液至每种浓度的抗体混合物，所述混合物在37℃，95％相对湿度，5％CO2温育60分钟。将含有抗体、膜结合型人TNFαCHO细胞、放线菌素D的混合物转移至具有L929贴壁细胞的96孔平板并且在37℃，95％相对湿度，5％CO2温育18小时。如上文对可溶性TNFαL929测定法所述那样，使用MTT细胞毒性测定法测量细胞死亡。结果表示为双特异性抗体或阳性对照抗体抑制TNFα诱导的反应50％(IC50)(3次独立实验平均数±SEM)的浓度。
[0109] 这些结果显示，本发明的例示双特异性抗体以浓度依赖性方式抑制不可切割的膜结合型人TNFαCHO细胞杀伤L929细胞，IC50为755±297pM。这种抑制与用阳性对照抗体(IgG1同种型的阿达木单抗，IC50＝581±201pM)观察到的抑制可比较，而阴性对照抗体不抑制人TNFα。本发明的例示双特异性抗体有效中和膜结合型人TNFα。
[0110] 抑制人IL-23诱导的mIL-22体内产生
[0111] 施用人IL-23在体内诱导正常Balb C小鼠中小鼠IL-22(mIL-22)的表达。人IL-23诱导的这种mIL-22体内表达被本发明的双特异性抗体(其不与小鼠IL-23或小鼠TNFα交叉反应)阻断。
[0112] 正常Balb C小鼠(N＝8)用50nmole/kg例示双特异性抗体(分子量200kDa)或阴性对照抗体(人IgG1同种型抗体，50nmole/kg，分子量150kDa)腹膜内注射。注射后三天，通过腹膜内注射50nmol/kg的人IL-23攻击小鼠。IL-23攻击后五小时，处死小鼠并收集血浆。通过商业ELISA(eBioscience，目录号88-7422-86)，根据制造商的说明书，对收集的血浆分析小鼠IL-22表达。
[0113] 表5：抑制人IL-23诱导的mIL-22体内产生(相对于阴性对照抗体)。
[0114]
[0115] 这些结果显示，本发明的例示双特异性抗体阻断人IL-23诱导的mIL-22表达增加。这种抑制作用与原初小鼠中观察到的小鼠IL-22水平可比较(p<0.0001，ANOV，随后Turkey多重比较检验)，而阴性对照抗体不抑制人IL-23诱导的mIL-22表达增加。本发明的双特异性抗体有效中和人IL-23。
[0116] 抑制人TNFα诱导的CXCL1体内产生
[0117] 施用人TNFα体内诱导常规Balb C小鼠的血浆中小鼠CXCL1水平快速和一过性升高。人TNFα诱导的这种小鼠CXCL1水平体内增加被本发明的例示双特异性抗体(其不与小鼠IL-23或小鼠TNFα交叉反应)阻断。
[0118] 常规Balb C小鼠(N＝8)用(a)18nmole/kg双特异性抗体；(b)18nmole/kg阳性对照抗TNFα抗体(IgG1同种型的阿达木单抗)；或(c)18nmole/kg阴性对照抗体(人IgG1同种型抗体)腹膜内注射。注射后三天，通过腹膜内注射18nmol/kg的人TNFα攻击小鼠。TNFα攻击后两小时，处死小鼠并收集血浆。通过商业MSD测定法(Masol Scale Discovery，目录号K152QTG-1)，根据制造商的说明书，对收集的血浆分析小鼠CXCL1水平。
[0119] 表6：抑制人TNFα诱导的CXCL1体内产生(相对于阴性对照抗体)。
[0120]
[0121] 这些结果显示，相对于接受阴性对照抗体的动物，本发明的例示双特异性抗体显著抑制人TNFα诱导的CXCL1产生(p<0.0001，ANOV，随后Turkey多重比较检验)。采用双特异性抗体时CXCL1产生减少与用阳性对照抗体观察到的CXCL1产生减少可比较。因此，本发明的例示双特异性抗体有效中和小鼠中人TNFα诱导的生物学作用。
[0122] 与亲本IL-23抗体比较抗体清除率
[0123] 为了比较双特异性抗体血清药代动力学与亲本IL-23抗体的血清药代动力学(美国专利号7,872,102中描述的IL-23抗体)，向雄性食蟹猴施用5mg/kg例示双特异性抗体(静脉内(N＝2)；或皮下(N＝2))或5mg/kg亲本IL-23抗体(静脉内(N＝3))。例示的双特异性抗体配制于10mM柠檬酸盐(pH 6.0)、150mM NaCl、0.02％吐温80的溶液中。将亲本IL-23抗体配制于磷酸盐缓冲盐水溶液(pH约7.4)中。
[0124] 在施用之前，从每只食蟹猴收集大约1.5mL血液。施用后，在施用后1小时(仅静脉内)、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时、240小时、336小时、432小时、504小时、600小时和672小时收集血液(大约1.5mL)。将血液样品从股静脉以静脉内方式收集入血清分离管(例如，不含抗凝血药)并加工成血清。
[0125] 利用包被在ELISA平板(Thermo ScientificTM 4HBX)上作为捕获试剂的山羊抗人IgG AffiniPure F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)，通过人总IgG ELISA分析血清样品。将血清样品(100μL)添加至ELISA平板的各个孔并在25℃温育60分钟。在温育后，将100μL(10,000倍稀释)小鼠抗人IgG Fc-HRP(Southern Biotech)添加至ELISA平板的各孔以检测例示双特异性抗体，并且将100μL(10,000倍稀释)小鼠抗人IgG4Fc-HRP(Southern Biotech)添加至ELISA平板的各孔以检测亲本IL-23抗体。
通过洗涤移除未结合的酶并且将100μL TMB微孔过氧化物酶底物系统(KPL)添加至ELISA平板的各个孔。通过添加100μL TMB终止溶液(KPL)终止显色并且在波长校正设定至630nm时在450nm测量孔的光密度。
通过洗涤移除未结合的酶并且将100μL TMB微孔过氧化物酶底物系统(KPL)添加至ELISA平板的各个孔。通过添加100μL TMB终止溶液(KPL)终止显色并且在波长校正设定至630nm时在450nm测量孔的光密度。
[0126] 通过将已知量的例示双特异性抗体和亲本IL-23抗体分别稀释入100％食蟹猴血清(BioreclamationIVT)中，随后在PBS中的酪蛋白封闭剂(Thermo ScientificTMPierceTM)中5倍稀释，分别产生例示双特异性抗体和亲本IL-23抗体的标准曲线。亲本IL-23抗体的标准曲线范围是1.95-125ng/mL(其中定量上限和下限分别是50ng/mL和5ng/mL)；例示双特异性抗体的标准曲线范围是15.63-1000ng/mL(其中定量上限和下限分别是450ng/mL和50ng/mL)。
[0127] 使用免疫反应性对时间零(施用抗体)至施用后168小时(例示双特异性抗体)或施用后672小时(亲本IL-23抗体)的时间特征，计算药代动力学参数(清除率值)并且使用Phoenix(WinNonLin 6.3,Connect 1.3)，借助非房室分析测定之。表8中汇总结果。
[0128] 表8.食蟹猴中单次静脉内或皮下施用后例示双特异性抗体和亲本IL-23抗体的抗体清除率。
[0129]
[0130] 这些结果显示在食蟹猴中与亲本IL-23抗体相比，例示双特异性抗体的抗体清除率降低大约5倍。
[0131] 抗CD40抗体诱导的鼠结肠炎模型中双重中和鼠IL-23和鼠TNFα
[0132] 本发明的双特异性抗体不结合鼠IL-23(mIL23)或鼠TNFα(mTNFα)。因此，为了在啮齿类模型中测试双靶向性TNFα和IL-23的治疗潜力，产生代用双特异性抗体(代用双特异的)。代用双特异性抗体由一种工程化嵌合抗TNFαmIgG2a抗体(阿达木单抗的工程化嵌合代用抗体，靶向小鼠中与如人类中本发明双特异性抗体的IgG所靶向等同的mTNFα表位)构成，所述抗体在抗TNFαIgG2a抗体的两条重链C末端融合工程化抗IL-23p19scFv(从代用鼠抗体工程化，所述代用鼠抗体靶向小鼠中与如人类中本发明双特异性抗体的scFv所靶向等同的IL23p19表位)。使用表面等离子体共振法，测量代用双特异性抗体对mIL23和mTNFα的结合亲和力，分别是1.51nM和0.08nM。
[0133] 在抗CD40抗体诱导的鼠结肠炎模型中通过比较代用双特异性抗体的治疗作用(结肠重量对长度)与单独的抗TNFα单一抗体和单独的抗IL-23单一抗体的治疗作用，测试双靶向TNFα和IL-23针对结肠炎的治疗潜力。当注射鼠抗CD40抗体时，Rag1敲除小鼠形成在注射后4天内部导致消耗性病情、胃肠道症状(包括腹泻和肛门炎症)和体重减轻直至10-20％的重度急性结肠炎。
[0134] 为了确定双靶向TNFα和IL-23的治疗潜力，在注射抗CD40抗体之前三天，向Rag1敲除小鼠施用以下之一：(a)代用双特异性抗体(1.4mg/kg)；(b)抗TNFα抗体(1mg/kg)；(c)抗IL-23抗体(0.3mg/kg)；或(d)对照IgG抗体(1mg/kg)(这些剂量的抗体注射导致相似水平的体内抗体暴露)。在注射后三天，向小鼠施用每只小鼠200μg鼠抗CD40抗体。在施用抗CD40抗体后四天，处死小鼠并且测量结肠重量和长度(确定结肠重量对长度的比率为大于未施用抗CD40抗体的小鼠的结肠炎症量值)。
[0135] 表9：比率的变化(结肠重量:长度)。
[0136]
[0137] 结果显示，与单独的抗IL-23抗体治疗和抗TNFα抗体治疗相比，对于抑制结肠炎，代用双特异性抗体对TNFα和IL-23的双重阻断作用优越(与单独的抗IL-23抗体相比p<0.0001；与单独的抗TNF抗体相比p<0.0004，ABOV，随后使用Dunett方法与对照比较)。代用双特异性抗体的结肠炎抑制作用与用对照小鼠(不施用抗CD40抗体)观察到的情况可比较。
因此，代用双特异性抗体对TNFα和IL-23的双重阻断作用有效地抑制小鼠中的结肠炎。
因此，代用双特异性抗体对TNFα和IL-23的双重阻断作用有效地抑制小鼠中的结肠炎。
[0138] 鼠GPI诱导的类风湿性关节炎模型中双重中和鼠IL-23和鼠TNFα
[0139] 当施用葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)时，DBA/1小鼠形成以爪快速肿胀为特征的类风湿性关节炎。GPI是糖酵解途径中的蛋白质并且已经在人类风湿性关节炎患者以及鼠模型中展示针对GPI的自身抗体。单独靶向TNFα途径或Th17途径的治疗药具有所显示的在鼠模型中减少关节肿胀的效力(Matsumoto 2008,Iwanami 2008)。
[0140] 为了展示在早期治疗模型中施用时(上文描述的代用双特异性抗体)双重中和鼠IL-23和鼠TNFα的效力，向DBA/1小鼠注射400μg重组人GPI和弗氏完全佐剂(CFA)(1:1v/v，尾根处2个皮下注射部位)。施用GPI后8天，向小鼠(通过每周二次腹内注射)施用以下之一：(a)鼠IgG2a对照抗体(90μg)；(b)代用双特异性抗体(4.2μg)+鼠IgG2a对照抗体(87μg)；(c)代用双特异性抗体(12.6μg)+鼠IgG2a对照抗体(81μg)；或(d)代用双特异性抗体(42μg)+鼠IgG2a对照抗体(60μg)。在施用GPI后三周(第21天)，使小鼠安乐死。
[0141] 在施用GPI当天(第0日)开始和此后第2、4、7、8、9、10、11、12、14、16、18和21天，基于0-3评分系统对每只爪评定关节肿胀的严重程度(0＝正常；1＝红斑和主关节轻度肿胀；2＝主关节中度至重度肿胀；和3＝整只爪重度肿胀)。临床评分代表全部4只爪的总分(最大评分为12)。随时间推移通过临床评分梯形法计算从第1天至第21天(研究结束)的曲线下面积(AUC)。将临床评分AUC数据(表10中显示为均值±SEM)用单因素ANOVA模型对治疗组拟合。从基于模型的t检验导出有意义比较的检验p值。
[0142] 表10：用代用双特异性抗体(按各种剂量)或对照抗体治疗GPI诱导的关节炎小鼠的临床评分。(p<0.05，来自基于模型的t检验)
[0143]
[0144] 结果显示代用双特异性抗体对TNFα和IL-23的双重阻断作用以浓度依赖性方式减少类风湿性关节炎的关节肿胀。在第9天(用对照抗体或代用双特异性抗体之一开始治疗后当日)，用代用双特异性Ab治疗的小鼠的平均临床评分低于对照抗体治疗的小鼠。代用双特异性抗体以剂量依赖性方式减弱最大临床评分，其中全部三个剂量的代用双特异性抗体治疗的小鼠的临床评分AUC显著低于对照抗体治疗的小鼠(代用双特异性抗体浓度12.6μg和42μg实现了最大减轻百分数)。
[0145] 鼠GPI诱导的类风湿性关节炎模型中鼠IL-23和鼠TNFα的双重中和作用与单独的鼠IL-23和单独的鼠TNFα的中和作用比较
[0146] 为了将早期治疗模型中施用时(通过代用双特异性抗体)双重中和鼠IL-23和鼠TNFα的效力与单一鼠IL-23治疗和单一鼠TNFα治疗比较，向DBA/1小鼠注射400μg重组人GPI和CFA(1:1v/v，尾根处2个皮下注射部位)。施用GPI后八天，(通过每周二次腹内注射)向小鼠施用以下之一：(a)鼠IgG2a对照抗体(30μg)；(b)鼠抗IL-23抗体(30μg，工程化代用鼠抗体，靶向小鼠中与本发明双特异性抗体的scFv等同的IL23p19表位)；(c)鼠抗TNFα抗体(30μg，阿达木单抗的工程化嵌合代用抗体，靶向小鼠中与人类中本发明双特异性抗体的IgG所靶向等同的mTNFα表位)；或(d)代用双特异性抗体(42μg，上文描述)。在施用GPI后12天(第12天)，使小鼠安乐死。
[0147] 在施用GPI当天(第0日)开始和此后第2、4、7、8、9、10、11和12天，基于0-3评分系统对每只爪评定关节肿胀的严重程度(0＝正常；1＝红斑和主关节轻度肿胀；2＝主关节中度至重度肿胀；和3＝整只爪重度肿胀)。临床评分代表全部4只爪的总分(最大评分为12)。随时间推移通过临床评分梯形法计算从第8天(用抗体免疫接种)至第12天(研究结束)的曲线下面积(AUC)。将临床评分AUC数据(表11中显示为均值±SEM)用单因素ANOVA模型对治疗组拟合。从基于模型的T检验导出有意义比较的检验p值。用重复测量模型拟合每只独立小鼠第8天至第12天的临床评分，因素为是否为治疗组、测量天数和它们的相互作用。还应用了自回归结构建模(以解释数天之间反复测量的相同动物的相关性)。通过针对Bliss检验构建相互作用对照，评定各自的协同。
[0148] 表11：用代用双特异性抗体、鼠抗IL-23Ab、鼠抗TNFαAb或对照抗体治疗GPI诱导的关节炎小鼠的临床评分。(p<0.05，来自基于模型的t检验)。
[0149] 对照mIgG2a Ab 抗IL-23Ab 抗TNFαAb 代用双特异性抗体
临床评分AUC 19.7±3.6 18.4±2.1 19.6±4.1 6.1±3.2
临床评分AUC 19.7±3.6 18.4±2.1 19.6±4.1 6.1±3.2
[0150] 结果显示，与单独的抗IL-23抗体疗法和抗TNFα抗体疗法相比，对于减少类风湿性关节炎的关节肿胀，代用双特异性抗体对TNFα和IL-23的双重阻断作用优异。在第9天(用代用双特异性抗体、抗IL-23抗体、抗TNFα抗体或对照抗体之一开始治疗后当日)，代用双特异性抗体治疗的小鼠的平均临床评分低于另一个治疗组。因此，代用双特异性抗体对TNFα和IL-23的双重阻断作用有效地减少小鼠中类风湿性关节炎的关节肿胀。
[0151] 序列
[0152] 例示的第一编码多肽；IgG HC,L1,scFv HCVR2,L2,和scFv LCVR2(SEQ ID NO:1)[0153] EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY[0154] ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTASSLDY WGQGTLVTVS[0155] SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS[0156] SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG[0157] GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY[0158] NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD[0159] ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR[0160] WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG GGGSGGGGSG GGGSQVQLVQ SGAEVKKPGS[0161] SVKVSCKASG YPFTRYVMHW VRQAPGQCLE WMGYINPYND GVNYNEKFKG RVTITADEST[0162] STAYMELSSL RSEDTAVYYC ARNWDTGLWG QGTTVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSD[0163] IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCKASDHIGK FLTWYQQKPG KAPKLLIYGA TSKLTGVPSR[0164] FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQY WSTPFTFGCG TKVEIK
[0165] 例示的第二编码多肽；IgG LC(SEQ ID NO:2)
[0166] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS[0167] RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP[0168] SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT[0169] LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
[0170] 编码例示的第一多肽的DNA序列(SEQ ID NO:3)
[0171]atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggctccactggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttgatgactatgccatgcactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtgtcagctattacttggaatagtggtcacatagactacgcagactccgtggagggccggttcaccatctccagagacaatgccaagaactccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagtgagctacctgagtactgcctccagcctggactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggacgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggcggaggctccgggggagggggtagcggaggagggggatcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatatccattcactcgctatgttatgcactgggtgcgacaggcccctggacaatgccttgagtggatgggatatattaatccttacaatgatggtgtgaactacaatgagaagttcaaaggcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaaactgggacacaggcctctgggggcaagggaccacggtcaccgtctcctcaggcggcggaggctctggcggaggtggtagtggtggcggtggatcagggggaggcggatctgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcaaggcaagtgaccacattggcaaatttttaacttggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatggtgcaaccagcaagctgactggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagtattggagtactccgttcacgttcggatgcgggaccaaggtggaaataaaa
[0172] 编码例示的第二多肽的DNA序列(SEQ ID NO:4)
[0173]atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggatccactggcgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcagggcattcgcaattatttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcaacgctataaccgtgccccttacacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacggactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc
[0174] 例示的IgG重链可变区1(SEQ ID NO:5)
[0175]
[0176] 例示的scFv重链可变区2(SEQ ID NO:6)
[0177]
[0178] 例示的IgG轻链可变区1(SEQ ID NO:7)
[0179]
[0180] 例示的scFv轻链可变区2(SEQ ID NO:8)
[0181]
[0182] 例示的HCDR1(SEQ ID NO:9)
[0183] AASGFTFDDYAMH
[0184] 例示的HCDR2(SEQ ID NO:10)
[0185] AITWNSGHIDYADSVEG
[0186] 例示的HCDR3(SEQ ID NO:11)
[0187] AKVSYLSTASSLDY
[0188] 例示的HCDR4(SEQ ID NO:12)
[0189] KASGYPFTRYVMH
[0190] 例示的HCDR5(SEQ ID NO:13)
[0191] YINPYNDGVNYNEKFKG
[0192] 例示的HCDR6(SEQ ID NO:14)
[0193] ARNWDTGL
[0194] 例示的LCDR1(SEQ ID NO:15)
[0195] RASQGIRNYLA
[0196] 例示的LCDR2(SEQ ID NO:16)
[0197] YAASTLQS
[0198] 例示的LCDR3(SEQ ID NO:17)
[0199] QRYNRAPYT
[0200] 例示的LCDR4(SEQ ID NO:18)
[0201] KASDHIGKFLT
[0202] 例示的LCDR5(SEQ ID NO:19)
[0203] YGATSKLT
[0204] 例示的LCDR6(SEQ ID NO:20)
[0205] QQYWSTPFT
[0206] 例示的多肽接头1(SEQ ID NO:21)
[0207] GGGGSGGGGSGGGGS
[0208] 例示的多肽接头2(SEQ ID NO:22)
[0209] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
[0210] 例示的IgG重链(SEQ ID NO:23)
[0211] EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
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