PP-折叠肽家族-NPY(神经肽Y)(人序列-SEQ ID.No：1)、PYY(肽YY)(人 序列-SEQ ID.No：2)和PP(胰腺多肽)(人序列-SEQ ID.No：3)是天然分泌的同源 性、36个氨基酸的C-末端酰胺化的肽，这些肽的特征是含有共同的三维结构 -PP-折叠，该结构即使在稀释的水溶液中也出人意料地稳定并且对这些肽的受 体识别至关重要。
NPY是在中枢和外周神经系统各部分中具有多种作用的分布极广的神经肽， 通过人体中许多不同的受体亚型Y1、Y2、Y4和Y5起作用。主要的NPY受体是 Y1受体和Y2受体，Y1受体一般是能传输NPY神经元“冲动”的突触后受体， Y2受体一般是突触前抑制性受体。该情况也见于下丘脑，下丘脑中也表达黑皮素 受体拮抗剂/反向激动剂AgRP(野灰相关肽)的NPY神经元在弓形核的刺激(传入) 支中起基础“传感”神经元作用。因此，在该控制食欲和能量消耗的“传感核”中， NPY/AgRP神经元与抑制性POMC/CART神经元一起监控机体的激素和营养状 态，因为这些神经元是长期调节剂如瘦蛋白和胰岛素，和短期调节剂如生长素 释放肽和PYY(见下文)的靶点。刺激性NPY/AgRP神经元也凸入例如下丘脑的 室旁核中，认为该处其突触后靶受体是Y1和Y5受体。就增进食物摄入而言， NPY是已知的最强效化合物，因为啮齿类动物经脑室内(ICV)注射NPY后将不 断进食直至饱撑。NPY/AgRP神经元的AgRP作用主要是作为4型黑皮素受体 (MC-4)的拮抗剂，能阻断POMC衍生肽(主要是aMSH)对该受体的作用。由于 MC4受体信号起到进食抑制剂作用，AgRP的作用与NPY一样是一种进食刺激 信号(即，对抑制作用的抑制)。在NPY/AGRP神经元上发现了抑制性突触前 Y2受体，该受体是局部释放的NPY以及肠激素PYY(另一种PP-折叠肽)二者 的靶点。
PYY在进食期间从小肠远端和结肠部位的肠道-内分泌细胞释放(与食物中的 卡路里含量成比例)，作用于胃肠道的外周(神经)功能和中枢(神经)，是一种饱食信 号。就外周(神经)而言，认为PYY的功能是上胃肠道蠕动、胃酸和胰腺外分泌的 抑制剂(回肠中断(illeal break))。就中枢(神经)而言，认为PYY主要作用于弓形核 NPY/AgRP神经元的突触前抑制性Y2受体，认为其可通过血液接近该受体 (Batterham等，2002 Nature 418：650-4)。该肽释放为PYY1-36时，但其进入血 循环的部分(约50％)为PYY3-36，PYY3-36是二肽基肽酶-IV的降解产物，该酶能 切除此肽的N-末端二肽，前提是如所有三种PP-折叠肽-PP、PYY和NPY那样， 在二位为Pro或Ala(Eberlein等，1989 Peptides 10：797-803)。因此，血循环中的 PYY是作用于Y1和Y2受体的PYY1-36和对Y1、Y4和Y5受体的亲和力低于 Y2受体的PYY3-36的混合物。
PP是一种胰岛内分泌细胞释放的激素，几乎完全受(特别是)食物摄入引起的 迷走神经胆碱能刺激的控制(Schwartz 1983 Gastroenterology 85：1411-25)。PP对 胃肠道有各种作用，但在大多数分离的细胞和器官中未观察到PP的作用，其作用 似乎依赖于完整的迷走神经供应(supply)(Schwartz 1983 Gastroenterology 85：1411-25)。鉴于此，称为Y4受体的PP受体位于脑干中，在迷走神经运动神经 元(vagal motor neurones)(其激活导致PP的外周作用)和单生核束(NTS)(其激活导 致PP作为饱食激素的作用)中有强烈表达(Whitecomb等，1990Am.J.Physiol.259： G687-91，Larsen & Kristensen 1997 Brain Res.Mol.Brain Res 48：1-6)。应理解， 由于血脑屏障的此区域对外周感觉性(神经)产生的各种激素是“可渗入的”，故血 液中的PP可进入大脑的该区域。近年来，有争论说PP对食物摄入的作用部分是 通过对神经元，特别是弓形核中POMC/CRAT神经元的作用所介导的(Batterham 等，“Coimbra国际NPY研讨会2004摘要3.3”(2004 Abstract 3.3 International NPY Symposium in Coimbra)，葡萄牙)。PP通过Y4受体起作用，PYY和NPY 对Y4受体的亲和力为纳摩尔(nanomolar)级，PP对该受体的亲和力为亚纳摩尔 (subnanomolar)级(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50：143-150)。PP对Y5受体 也具有相应的亲和力，但由于无法接近CNS中专门表达该受体的细胞和(该受体) 对PP的亲和力较低，PP的生理学重要性不可能与循环PP相关。
PP-折叠肽受体
熟知人体中存在四种类型以相似亲和力识别NPY1-36和PYY1-36的PP-折叠 肽受体：Y1、Y2、Y4和Y5。曾提出过对NPY的亲和力优于PYY的Y3受体类 型，但现在不接受其为真正的受体亚型(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50： 143-150)。Y6受体亚型已得到克隆，然而它在人体内表达为缺乏TM-VII以及受体 尾部的截短形式，因此看来至少其本身不能形成功能性受体分子。
Y1受体-亲和力研究提示Y1能同样良好地结合NPY和PYY，但基本上不结 合PP。
Y2受体-亲和力研究提示Y2受体能同样良好地结合NPY和PYY，但基本上 不结合PP。
Y4受体-亲和力研究提示对应于血浆中发现的浓度，Y4以亚纳摩尔亲和力结 合PP，而以低得多的亲和力结合NPY和PYY。
Y5受体-亲和力研究提示Y5能同样良好地结合NPY和PYY，也以较低的亲 和力结合PP，然而亲和力低于该激素的正常血循环水平。Y5受体也能良好地识别 PYY3-36，然而该受体在CNS中也有很大程度的表达，当将PYY3-36施用于外周 (神经)中时，不能接近CNS中的此受体。
根据这些肽中的某些在动物模型和人体中所显示的作用和肥胖人的PYY和 PP基础水平低以及对这些肽的进食反应较低，已提出PP-折叠肽及其类似物可用 于治疗肥胖和相关疾病，包括例如普-韦综合征(Holst JJ等，1983 Int.J.Obes.7： 529-38；Batterham等，1990 Nature)。自17世纪中叶以来已知PP可以影响啮齿 类动物中的食物摄入。在1993年，有报道说给普-韦综合征的病态肥胖患者输注 PP降低了食物摄入(Berntson等，1993 Peptide 14：497-503)。近来，PP的此种作 用通过给正常人输注PP而得到证实，在24小时期间观察到持久的食欲抑制和食 物摄入降低(Batterham等，2003 Clin.Endocrinol.Metab.88：3989-92)。
为治疗对Y4受体调节起反应的疾病，例如肥胖和肠液分泌过多，需要采用 PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，这些肽或模拟物对选作靶点的Y4受体应具有特异 性并稳定地保留了对受体结合至关重要的PP-折叠结构元件。特别是更需要采用对 Y4受体的选择性超过Y1和Y2受体的这类药物。由于预计Y1受体活化可能导致 有害的心血管和肾脏副作用，例如血管收缩和尿钠排泄，这特别重要。此外，激活 Y2受体也可导致副作用。虽然还不清楚真正有效的血管生成Y受体情况是什么， 但Y2激动剂，例如NPY3-36显然可在例如局部缺血后肢模型中诱导血管再生， 即，当以高剂量持续接触给药时，例如从引入的药丸中释放时(Zukowska Z等， Trends Cardiovasc Med.2003，13：86-92)。Y2受体敲除动物中NPY的血管生成应 答降低；然而，事实上对该广谱Y2受体激动剂NPY的应答未消除，Y2和Y5受 体在局部缺血血管中得到上调(Lee等，J.Clin.Invest.2003，111：1853-62)。但是， PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物可通过激活Y2受体在例如糖尿病患者中引起副作 用，例如加重视网膜病变，并且可能有助于某些肿瘤生长相关的新血管生成。因此， 使用对Y4受体有效且选择性超过Y1和Y2受体的激动剂在治疗对Y4受体激活敏 感的疾病和病症中特别有用。
我们共同待批的国际专利申请PCT/EP2005/002983(其内容结合于此作为参考) 涉及一类对Y4受体的选择性优于Y1和Y2受体的Y受体激动剂，并涉及该类物 质中的一些成员。
本发明涉及对Y4受体的选择性大大超过Y1和Y2受体的特定肽。
发明详述
本发明提供了选自下组的肽：
(i)[Ala30]PP2-36(SEQ ID No：4)和[Ala30]PP(SEQ ID No：5)
(ii)[Thr30]PP2-36(SEQ ID No：6)和[Thr30]PP(SEQ ID No：7)
(iii)[Asn30]PP2-36(SEQ ID No：8)和[Asn30]PP(SEQ ID No：9)
(iv)[Gln30]PP2-36(SEQ ID No：10)和[Gln30]PP(SEQ ID No：11)
(v)[Glu10]PP2-36(SEQ ID No：12)和[Glu10]PP(SEQ ID No：13)
(vi)[Glu10，Leu17，Thr30]PP2-36(SEQ ID No：14)和[Glu10，Leu17，Thr30]PP (SEQ ID No：15)
(vii)[Nle17，Nle30]PP2-36(SEQ ID No：16)[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID No：17)
(viii)[Glu10，Nle17，Nle30]PP2-36(SEQ ID No：18)和[Glu10，Nle17，Nle30]PP (SEQ ID No：19)
以及它们的类似物，其中
(a)对于(i)-(iv)，在除30位外的一个或多个位置上有保守性取代；或对于(vi) 是10位；或对于(vii)是17和30位；或对于(vi)和(viii)是10、17和30位；和/或
(b)N-末端酰化、PEG化或共价结合于血清白蛋白结合基序、糖胺聚糖结合基 序或螺旋诱导基序，所述共价结合在肽残基上或提供这种共价结合官能团的肽的取 代残基上。
本文所用术语PP是指PP序列(SEQ ID No：3)。因此，肽[Ala30]PP(SEQ ID No： 5)具有人PP序列(SEQ ID No：3)但在其30位丙氨酸取代亮氨酸。
本文所用术语PP2-36是指PP序列(SEQ ID No：3)，但删除了第一N-末端氨 基酸(Ala)。然而，PP2-36的位置编号是指全长PP(SEQ ID No：3)。因此，肽 [Ala30]PP2-36(SEQ ID No：4)具有人PP序列SEQ ID No：3，但删除了Ala1，并 且在SEQ ID No：3的30位丙氨酸取代亮氨酸。
本发明的八对肽及其类似物是Y受体激动剂，当用本文所述的效力分析测 定时，它们对Y4受体的选择性大大超过Y1和Y2受体。本发明肽组成肽对，因 为在截短的PP2-36骨架中所限定的取代基对Y1和Y2受体、对Y4受体的选择 性与全长PP骨架中具有相同取代基的基本相同。
在PP序列中，Asp 10尤其易在溶液中环化形成环状酰亚胺酯(imidate)， 开环形成伴随着立体化学结构混乱的α和β-天冬氨酸的混合物。在本发明的肽 对(v)、(vi)和(viii)中，该残基被Glu取代。取代基在肽内保留了特殊的静电势 分布，因而保留了肽的总体稳定性和溶解性。由于10位上的Glu不经历类似 的环化/开环而形成γ-Glu，与Asp 10的对应物相比，有利于作为药剂的肽的整 体和溶液稳定性的改善。改善的溶液稳定性提高了合成产率，减少了所需产物 从紧密相关的β-Asp杂质中分离的麻烦和所需的昂贵且产生废物的纯化步骤。
正常PP序列中的Met 17和Met 30残基以溶液形式储存时可能发生氧化。 在所有上述肽中，Met 30已被不易发生上述改变的残基所取代。在本发明的肽 对(vii)和(viii)中，Met17已被能防止该位置氧化的Nle所取代，同时保留了脂 族侧链结构，因为Nle是Met的生物电子等排体。
正常PP序列中Ala1-Pro2基序的存在赋予该肽对β-酮哌嗪降解途径固有的 不稳定性，此途径中，末端氨基官能团通过6元过渡态“咬回(bite back)”产生 Pro，在脯氨酸羧酰胺官能团处发生分子内转酰胺化，导致形成β-酮哌嗪和 PP3-36。该途径导致低压冻干物质在储存时形成降解产物，含Ala1-Pro2序列 的肽在溶液中降解显著。因此，在本发明优选的实施方式中，通过除去PP序 列中的Ala1，即所有上述PP2-36的类似物，以防止降解。这可改善这些肽在 溶液中和作为低压冻干物质的稳定性，从而改善其作为药剂的性质。
单独或联合使用的上述各种改善稳定性的改进方法代表了这些肽的药学 性质的显著进步。合成期间稳定性改善导致的产率提高和纯化步骤减少)以及这 些肽的冻干物和溶液长期储存稳定性的改善，由于减少了所用的粗品原料、溶 剂、设备，因而也减少了废弃物的产生，从而显著降低了本发明肽生产过程的 环境负担(降低了再生产的需要)。
在本说明书中，提及氨基酸时可用其通用名或缩写，例如缬氨酸(Val)、亮 氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、天冬酰胺(Asn)、 谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、 天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、 酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)。当用通用名或 缩写提到氨基酸而未明确说明其立体异构形式时，应理解所述氨基酸是L-型。
本文所用的术语“保守取代”表示一个或多个氨基酸被另一个生物学类似的 残基取代。例子包括用性质相似的氨基酸残基，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性 氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸取代。适用于本发明的保守氨 基酸取代的非限制性例子包括用下表中性质相似的非天然α氨基酸的原来残基进 行类似取代。例如，在本发明优选的实施方案中，Met残基可用正亮氨酸(Nle)取代， 正亮氨酸是Met的生物电子等排体但(与Met相反)不易氧化。用通常在哺乳动物内 源性肽和蛋白质中未发现的残基进行保守性取代的另一例子是用例如鸟氨酸、刀豆 氨酸、氨基乙基半胱氨酸或其它碱性氨基酸保守性取代Arg或Lys。关于肽和蛋白 质中表型沉默取代的其它信息可参见，例如Bowie等，Science 247，1306-1310， 1990。
  原来残基   保守取代   Ala   Gly   Arg   Lys   Asn   Gln、His、Thr   Asp   Glu   Gln   Asn、His   Glu   Asp
  His   Asn、Gln   Ile   Leu、Val   Leu   Ile、Val   Lys   Arg   Met   Leu、Ile   Phe   Tyr、Trp、His   Ser   Thr、Asn   Thr   Ser、Asn、Gln   Trp   Tyr、Phe、His   Tyr   Trp、Phe、His   Val   Ile、Leu
本发明的保守取代类似物(例如)可具有多达10个保守取代基，或者在另一实 施方式中最多5个，或在另一实施方式中最多3个或更少的保守性取代基。
N-酰化类似物
在本发明各种PP2-36类似物中均除去了PP序列中的Ala1，由于取代残基 为新的N-末端脯氨酸残基而消除了对二肽基肽酶IV(DPP-IV)，以及对其它氨 基肽酶，尤其是氨肽酶P的敏感性。此外，本发明考虑的所有八对Y4选择性 激动剂其N-末端可酰化而赋予对其它氨肽酶的耐受性。例如，可用2-24个碳 原子的碳链酰化，具体的例子是N-末端乙酰化。
含共价结合功能基序的类似物
对本发明8对激动剂进行了各种修饰，以改善其药代动力学、药效学和代谢 性能。这种修饰可涉及将该激动剂与肽或蛋白质药物领域本身已知的功能基团(也 称为基序)相连。在本发明考虑的激动剂的情况下，尤其有益的三种特定修饰是与 血清白蛋白结合基序或糖胺聚糖(GAG)结合基序相连，或PEG化。
血清白蛋白结合基序
血清白蛋白结合基序一般是亲脂性基团，将其引入能延长给药后(药物)在体内 的驻留时间，或出于其它原因可用各种已知的方法将其与肽或蛋白质分子偶联，例 如i)通过共价键，例如侧链氨基酸残上的功能基团，ii)通过插入该肽中的或适当衍 生肽中的功能基团，iii)作为该肽的一个整合部分。例如，WO 96/29344(Novo Nordisk A/S)、P.Kurtzhals等，1995 Biochemical J.312：725-31描述了许多可用 于本发明激动剂的合适亲脂性修饰。
合适的亲脂性基团包括任选取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的10-24 个碳原子的烃基团。这种基团可形成该激动剂骨架的侧链或其一部分，例如通过醚、 硫醚、氨基、酯或酰胺键与骨架中某氨基酸残基的侧链相连，或与PP-折叠模拟激 动剂骨架中的非肽接头基团的骨架碳或骨架碳的支链相连。连接亲脂性基团的化学 方法不是关键性的，但包含亲脂性基团的以下侧链是可与该激动剂的骨架碳相连的 例子，或是其合适的支链：
CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-，其中n是9-15的一个整数，
CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-，其中r是9-15的一个整数，
CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-，其中s是9-15的一个整数，
CH3(CH2)mCONH-，其中m是8-18的一个整数，
-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16之间的一个整 数，
-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一个整数，
CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-，其中n是9-15的一个整数，
CH3(CH2)pNHCO-，其中p是10-18的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3，其中m是8-18的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中 p是10-16的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中 q是10-16的一个整数，和
部分或完全氢化的环戊菲(cyclopentanophenanthrene)骨架。
在一个化学合成方案中，含亲脂性基团的侧链是酰化存在于激动剂骨架残 基侧链中的氨基的C12、C14、C16或C18酰基，例如十四烷酰基。
如上所述，利用激动剂的修饰来改善其血清结合特性是一种通用方案，特 别适用于以上列出的具体激动剂。因此，经适当修饰的激动剂包括[N-(N’-十四 烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Ala30]PP2-36和[Glu10，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰 基-Lys13，Leu17，Thr30]PP2-36以及它们的保守取代类似物。
GAG结合
在上述亲脂性血清结合基序例子中，可通过加入GAG结合基序作为该激 动剂骨架侧链(或其一部分)来修饰本发明考虑的激动剂。已知可以该方式加入 的GAG-结合基序包括氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱 性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基。可将多条，例如3条这种序列以串联体(直 链)或枝状体(支链)的方式加入。具体的串联体GAG基序包括 Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，和 Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-A rg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，二者可以通过，例如串联体GAG-结合基序的C-末端 与激动剂骨架氨基酸侧链的氨基之间形成酰胺键相偶联，所述氨基例如激动剂 [Lys13，Ala30]PP2-36或[Glu10，Lys13，Leu17，Thr30]PP2-36中Lys13的ε氨基。
GAG基序可直接或经接头基团与激动剂的C-或N-末端(优选)共价连接，而不 是与激动剂相连或作为骨架残基侧链的一部分。GAG结合基序也可含有氨基酸序 列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸 残基，例如序列[XBBBXXBX]n，其中n是1-5，B是碱性氨基酸残基，X是任 何氨基酸残基。当这些串联体重复序列结合GAG时，它们倾向于形成α螺旋， 因此当它们与C-末端六肽/最后的α螺旋转角融合时，可稳定该转角从而以最佳 方式提供Y4受体识别的组合结构。该型激动剂的具体例子是[XBBBXXBX- XBBBXXBX]PP或[XBBBXXBX-XBBBXXBX-XBBBXXBX]PP，其中，B是碱 性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基，具体是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala- Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-[Ala30]PP 2-36。
本发明考虑的Y4选择性激动剂可用于需要延长接触时间的适应症。就该具体 适应症而言，激动剂优选包含上述糖胺聚糖(GAG)结合基序。这种基序能确保该激 动剂在胞外基质中与GAG结合，从而确保Y4受体在该组织中的局部接触时间延 长。生长因子，趋化因子等可通过能与GAG的酸性糖相互作用的碱性氨基酸斑点 (patch)与GAG结合。生长因子上这些带正电荷表位(斑点)通常由碱性残基的侧链 构成，这些残基不一定是该序列中的毗连残基而是往往通过二级结构元件，例如 a-螺旋或转角或通过该蛋白质的整个三维结构存在于毗连邻区域。某些上述GAG- 结合性线形序列已有描述，例如XBBXBX和XBBBXXBX，其中B代表碱性残 基(Hileman等，Bioassays 1998，20：156-67)。圆二色性分析显示这些区段与 GAG结合后可形成α-螺旋。当存在例如三条这样的序列(例如每条是 ARRRAARA序列)时，如果使这种序列位于例如串联体或枝状体构建物中，可 产生24-聚肽，例如ARRRAARA-ARRRAARA-ARRRAARA而确保其在胞外基 质中的保留(时间)类似于高分子量聚赖氨酸，即在4小时输注期间不会被洗掉 (Sakharov等，FEBS Lett 2003，27：6-10)。
因此天然构建的生长因子和趋化因子含有两类结合基序：一类受体的结合基 序，通过它实现信号转导，一类是GAG的结合基序，通过它实现结合与持久的局 部活性。诸如PYY和NPY等肽是神经肽和神经激素，它们可从组织中相当快速地 洗掉，这对持久的局部作用而言不是最佳的。将GAG-结合基序与本发明的Y4选 择性激动剂连接，构建了一种具有PP-折叠肽部分的受体结合表位和GAG-结合基 序的类似于生长因子和趋化因子的双功能分子。这种激动剂的一个例子是 [N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，Ala30]PP2-36。
PEG化
在PEG化过程中，将一个或多个聚环氧烷基团共价偶联于肽或蛋白质药物以 提高给药后在体内的有效半衰期。该术语得自该方法所用的优选聚环氧烷，即得自 乙二醇-聚乙二醇或“PEG”。
合适的PEG基团可通过任何方便的化学方法与激动剂相连，例如通过该激动 剂的骨架氨基酸残基。例如，就PEG样的分子而言，常用的连接基团是赖氨酸的 ε-氨基或N-末端氨基。其它连接基团包括游离羧基(例如，C-末端氨基酸残基或天 冬氨酸或谷氨酸残基的羧基)、适当活化的羰基、巯基(例如，半胱氨酸的巯基)、芳 香族氨基酸残基(例如，Phe、Tyr、Trp)、羟基(例如，Ser、Thr或OH-Lys的羟基)、 胍基(例如，Arg)、咪唑基(例如，His)和氧化的糖基部分。
当该激动剂PEG化后，它通常包含1-5个聚乙二醇(PEG)分子，例如1、2或 3个PEG分子。每个PEG分子的分子量可以是约5kDa(千道尔顿)-100kDa，例如 约10kDa-40kDa的分子量，如约12kDa或优选不超过约20kDa。在本发明一个 具体的实施方式中，采用PEG 40kDa(也称为PEG40000)作为PEG化试剂。
合适的PEG分子可购自SP公司(Shearwater Polymers，Inc.)和恩佐公司 (Enzon，Inc.)并且可选自SS-PEG、NPC-PEG、醛-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、 mPEG-BTC、SC-PEG、分枝mPEG(US 5,880,255)，或氧基羰基-氧基-N-二羧基 酰亚胺-PEG(US 5,122,614)。
本发明PEG化激动剂的具体例子是[N-PEG5000-Lys13，Ala30]PP2-36和 [Glu10，N-PEG5000-Lys13，Leu17，Thr30]PP2-36和[N-PEG20000Lys13]PP2-36， [N-PEG2000Lys13]PP2-36和[N-PEG40000Lys13]PP2-36。
血清白蛋白、GAG和PEG
无论对该激动剂的修饰是与某基团连接以促进血清结合、GAG结合还是通过 PEG化提高其稳定性，血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基团可以是 激动剂碳骨架的侧链或者可形成该激动剂碳骨架侧链的一部分，所述碳骨架对应于 以下任一位置：1、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、17、18、19、21、 22、23、25、26、28、29、30和32，虽然对于肽[Glu10]PP2-36和 [Glu10，Leu17，Thr30]PP2-36来说，不可用10位。
与生物大分子的偶联
该选择性Y4受体激动剂可作为与例如白蛋白或另一种蛋白质或运载体分子 相连的融合蛋白使用，从而提供有益的药代动力学或其它类型性能，例如减少肾排 除。如同可采用多种蛋白质或运载体那样，本领域已知这种共价结合可采用多种化 学修饰基团和接头。特别优选将选择性Y4肽激动剂与白蛋白共价结合于PP-折叠 结构中某一位置，本文其它地方已指出的可用各种基序修饰的有关位置。这种融合 蛋白可以通过各种半合成技术产生，其中肽可通过本文所述的肽合成技术制备，和 通过重组技术制备生物分子。该融合蛋白也可整体作为表达的重组分子来制备，例 如含有延伸序列Gly-Lys-Arg的前体分子，当该分子在真核细胞中表达为分泌型蛋 白时将被生物合成酶切割，C-末端Y4受体识别序列的C末端Tyr残基上的Gly转 变为羧酰胺。
螺旋诱导肽
已提及本发明考虑该激动剂N-末端的酰化可作为稳定该激动剂抵抗氨肽 酶作用的一种方法。另一种稳定性修饰包括将4-20个氨基酸残基的稳定性肽序 列共价连接于其N-和/或C-末端，优选N-末端。此稳定性肽中的氨基酸残基选 自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met等。 在一令人感兴趣的实施方案中，N-末端肽连接包含4、5或6个Lys残基，例 如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[Ala30]PP2-36。它们可连接于PP-折叠肽激动剂的 N-末端。这种稳定性肽延伸序列的一般描述参见WO 99/46283(Zealand Pharmaceuticals)，其内容纳入本文作为参考。
本发明考虑的受体激动剂可通过熟知的方法制备，例如合成、半合成和/ 或重组方法。这些方法包括标准肽制备技术，例如溶液合成和固相合成。本领 域技术人员根据本领域的教材和通用知识知晓如何获得激动剂和它们的衍生 物或修饰物。
临床适应症
本发明考虑的Y4-特异性激动剂可用于治疗对Y4受体激活起反应的疾病。这 种疾病包括显示需要调节能量摄入或能量代谢的疾病。就这种用途而言，该激动剂 可包含能赋予对肽酶的稳定性、血清蛋白质结合性能、PEG化或GAG-结合基序以 延长血清和/或组织半衰期的修饰或基序。
显示需要调节能量摄入或能量代谢的疾病或病症包括肥胖和超重，与认为肥 胖和超重是致病因素的疾病，例如食欲过度旺盛、神经性贪食、X综合征(代谢综 合征)、糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛 素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉病、 心肌梗塞、外周血管病、中风、血栓栓塞性疾病、高胆固醇血症、高脂血症、 胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病如多囊性卵巢综合征，或乳 腺癌、前列腺癌或结肠癌。
Y4选择性激动剂在治疗腹泻或肠造口术的过度分泌(hyper-secretion from intestinal stomia)、治疗恶心或呕吐、或作为抗恶心或止吐药或与易于导致恶心和/ 或呕吐的药物共同治疗中也有价值。
1.肥胖和超重
在17世纪已有人提出，PP可能参与对食物摄入的控制。近来，啮齿类动物研 究积累的许多证据非常清楚地显示事实上当PP外围给药时，是强有力的有效食欲 减退肽(Askawa等，Peptides 1999，20；Gastroenterology 2003，124：1325-36)。由 于PP对Y4敲除动物的食欲、食物摄入等无影响，PP很可能是通过Y4受体起作 用而降低食欲和食物摄入(Batterham等，“Coimbra国际NPY研讨会2004摘要 S3.3”(2004 abstract S3.3 from International NPY symposium in Coimbra，葡萄 牙)。PP对饮食导致的肥胖动物的食物摄入也有作用。尤其是在血脑屏障无效的脑 干postreama区中和迷走神经运动神经元上发现了PP受体，而循环激素例如PP可 接近这些神经元。因此，脑干中NTS的Y4受体很可能是PP抑制食欲和食物摄入 作用的主要靶位。然而，近来的证据也指出PP也可能通过POMC上想象的弓形核， 也许还有NPY/AgRP神经元中的Y受体起作用(Batterham等，“Coimbra NPY大 会摘要S3.3”(Coimbra NPY meeting abstract S3.3))。发现肥胖者，特别是普-韦 综合征患者PP水平低(Zipe等，J.C.E.M.1981，52：1264-6；Holst等，1983， INT.J.OBES.7：529-38；Glaser等，Horm.Metab.1988，20：288-92)，发现神经性 厌食患者PP水平高。重要的是，人输注PP可降低食欲和食物摄入达24小时 (Batterham等，JCEM 2003，88：3989-92)。因此，循环(血液)中PP回复正常水平 后仍观察到PP对食物摄入的作用。也熟知其它化合物，例如ICV注射AgRP对食 欲有这种持久的作用。重要的是，已证明输注PP可降低普-韦综合征的病态肥胖患 者的食物摄入(Berntson等，1993 Peptides 14：497-503)。
因此，为调节能量摄入，本发明考虑的Y4选择性激动剂适用于包括人的哺乳 动物对象。所以，本发明涉及调节能量摄入、食物摄入、食欲和能量消耗的方法。 本文公开了给予对象美容或治疗有效量的这种激动剂来减少能量或食物摄入的方 法。在一个实施方案中，给予该受体激动剂导致(摄入的)食物总量或总体积或卡路 里含量减少。在另一实施方案中，(给予受体激动剂)可导致食物成分的摄入减少， 例如脂质、碳水化合物、胆固醇或蛋白质的消化降低。在本文公开的任何方法中， 可以给予本文详述的优选化合物。在其它实施方案中，本文公开了给予治疗有效量 的这种激动剂来降低食欲的方法。可用本领域技术人员已知的任何方法测定食欲。
例如，可通过心理学评估来评价食欲降低。在这种实施方案中，给予该受体 激动剂可导致饥饿感觉、过饱感觉和/或饱胀感的变化。可用本领域技术人员已知 的任何方法来评估饥饿。在一个实施方案中，用心理学试验评估饥饿，例如利用调 查表来评估饥饿感和感官感知。
在另一实施方案中，本文公开了降低上胃肠(GI)道蠕动，例如降低胃排空的方 法。已知PP(原型Y4激动剂)可降低胃排空。该方法包括给予对象治疗有效量的 Y4选择性激动剂，从而降低胃肠道蠕动。也熟知降低胃排空的化合物在降低食物 摄入中具有有益作用，因为可使对象感觉过饱或饱胀感。
在其它实施方案中，本文公开了改变对象能量代谢的方法。该方法包括给予 对象治疗有效量的这种激动剂来改变能量消耗。所有生理活动均消耗能量。机体可 通过直接调节那些活动的效率或者改变正发生活动的数量和性质来改变能量消耗 率。例如，在消化期间，机体消耗能量使食物在肠道内移动并消化食物，在细胞中， 细胞代谢效率的改变会产生或多或少的热量。在其它实施方案中，本文公开了本申 请所述对弓形核回路(arcuate circuitry)的所有调节方法，该方法协同改变了食物摄 入并回应性改变能量消耗。能量消耗是细胞代谢、蛋白质合成、代谢速率和利用卡 路里的结果。因此，在该实施方案中，外周给药导致能量消耗增加和卡路里利用率 降低。在一个实施方案中，给予对象治疗有效量的本发明受体激动剂从而增加了能 量消耗。
在治疗应用和美容应用相关的几个实施方案中，可用本发明的Y4选择性激动 剂控制体重和治疗、减轻或预防肥胖，具体是以下一种或多种用途：预防和减轻体 重增加；诱导和促进体重降低；减轻体重指数所测定的肥胖症。如上所述，本发明 还涉及Y4选择性激动剂在控制食欲、饱胀和饥饿中的应用，具体是以下一种或多 种应用：降低、压制和抑制食欲；诱导、增加、提高或促进饱胀和饱胀感；降低、 抑制和压制饥饿和饥饿感。该内容还涉及Y4选择性激动剂的以下一种或多种应用： 维持所需体重、所需体重指数、所需外貌和良好的健康状况。
在另一方面，本发明涉及治疗和/或预防能量代谢降低、进食障碍(feeding disorder)、食欲紊乱、超重、肥胖、食欲过度旺盛、神经性贪食、X综合征(代谢 综合征)或与它们相关的并发症或风险，包括糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依 赖型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、 高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、心肌梗塞、血栓栓塞性疾病、 高胆固醇血症、高脂血症、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病 如多囊性卵巢综合征，乳腺癌、前列腺癌或结肠癌的方法，该方法包括给予对 象，例如包括人的哺乳动物有效剂量的一种或多种本文所述Y4选择性激动剂。
2.肠液分泌过多
已知PP对小肠和大肠具有强烈的抗分泌作用，该作用看来是通过位于上皮细 胞中的Y4受体所介导(Cox和Tough，2001 Br.J.Pharmacol.135：1505-12)。外周 给予PYY(另一种激活Y1和Y2受体的PP-折叠肽)在体内显示持久降低经回肠造 口术的患者中各种肠血管活性多肽诱导的肠分泌(Playford等，1990 Lancet 335： 1555-57)。结论是，PYY可能是抗腹泻的治疗性药物。然而，例如联用Y1和Y2 激动剂，NPY和PYY的利尿钠和高血压作用阻止了这种作用。这种副作用与本 发明的选择性Y4受体激动剂无关。因此，本发明的选择性Y4激动剂特别可用 于治疗或保护防止胃肠道过度分泌，包括各种形式的腹泻，而无论它们是否直 接由过度分泌导致，因为抑制肠液过度分泌既消除了腹泻的诱因又消除了症 状。一种特别感兴趣的适应症是在常造成大量液体丧失的回肠造口术的患者中见 到的过度分泌。本发明的选择性Y4激动剂特别可用于治疗或保护防止小肠回肠造 口术相关的过度分泌。
3.呕吐与恶心
已提出可用许多肽和其它类型的化合物作为药物来控制食欲，例如已知PYY 和CB1拮抗剂会引起呕吐。例如，事实上1989年发现肠提取物中的PYY(“第二 次”)作为生物活性物质可导致狗呕吐(Harding和McDonald，1989 Peptides 10： 21-24)。结论是，PYY是鉴定到的最强的循环催吐肽，其作用是通过已知的血脑屏 障可渗透的最后(postreama)区域所介导。也有报道说，当将PYY3-36外周给予患 者时可导致恶心(Nastech press release 29th of June 2004)。令人感兴趣的是，注意到 以相似剂量给药的PP不导致这些狗呕吐(Harding和McDonald，1989)。因此，通 过也位于脑干的最后区的Y4受体起作用的PP不会导致呕吐。重要的是，给予动 物例如食蟹猴(cyno monkey)大剂量的组合Y2-Y4激动剂肽(对Y2受体具有与PYY 相似的体外效力)，达到12-13.000nM的极高血浆水平而未观察到动物有任何呕吐 或出现胃肠道副作用。由于对引起呕吐的Y2受体具有相似效力的PPY3-36以低得 多的剂量给予时不引起人和可能的动物呕吐，这是出乎意料的。因此，该组合的 Y2-Y4选择性激动剂不引起呕吐的这种情况出乎意料地与选择性Y2激动剂 (PYY3-36化合物)相同。显然，Y4受体激活(可能发生在血脑屏障最后区)阻止了 Y2激活的催吐作用(在该情况中是作用于Y2受体的同一化合物导致的作用)。因此， 本发明的Y4选择性化合物特别可用于治疗或保护防止呕吐与恶心。这可以是与例 如另一种经常引起呕吐与恶心的食欲抑制药物如Y2激动剂、CB1拮抗剂/反向拮 抗剂型或其它类型的食欲抑制药物治疗有关的呕吐与恶心。应注意的是，Y4选择 性化合物的食欲抑制作用很可能同时具有叠加作用或者甚至协同作用。因此，共同 给予本发明的Y4选择性激动剂和另一种食欲抑制或其它类型的抗肥胖药物可达到 两个目的：1)获得全面或部分的叠加抗肥胖效果的有益作用，2)Y4选择性化合物 具有消除或降低其它抗肥胖药物催吐效应的有益作用。
本发明的Y4选择性化合物也特别可用于治疗或保护防止妊娠相关的呕吐和 恶心。就该具体适应症而言，重要的是Y4选择性化合物是天然PP-折叠肽的相近 类似物，通常期望它们具有可忽略的副作用。这些肽在胎盘中不会透过母体血循环 (系统)进入胎儿循环(系统)的事实尤其重要，因为这最大程度地减少了它们与胎儿 的接触而使发生发育性副作用的风险降至很低。
本发明的Y4选择性化合物和PP本身也可用于治疗或保护防止酒精不耐受相 关的呕吐和恶心。
4.应激性肠病
Y4受体的天然配体，PP的分泌和功能与自主神经系统的活动高度相关 (Schwartz，1983，Gastroenterology 85：1411-25)。因此，例如PP血浆水平的波动与 胃肠道蠕动和分泌的波动以及激素/神经递质促胃动素的分泌密切相关。已知PP通 过副交感神经系统和中枢迷走神经控制中心，例如脑干中的迷走神经运动神经元起 作用，从而控制通向胃肠道的传出迷走神经纤维的活动。由于认为应激性肠病与(特 别是)胃肠道蠕动和导致疼痛等的功能失常和自主神经系统控制该活动的功能失常 有关，故用选择性Y4激动剂治疗应激性肠病是本发明的优选实施方案。
给予Y4激动剂治疗或防止肥胖和相关疾病的其它评价
在进食过程中，各种胃肠道激素和神经递质系统以精细协调、依次和重叠的 方式激活。此外，食物成分在吸收后不仅直接影响胃肠道激素的分泌和各种途径传 入神经元的激活，而且这些食物成分也影响各种激素和CNS中心。因此，调节食 物摄入和能量消耗是一种高度复杂和多层面的过程。鉴于此，令人惊奇的是，当某 些激素，例如PP给药剂量在进食期间只达到血浆水平的3-4倍时，事实上就可极 大地影响到该系统。
如果这种化合物-Y4选择性激动剂-在禁食期间以上述有效剂量给药，则这 种给药显然会达到预期的主要作用。如果在各种激素和神经元系统因在胃肠道中存 在食物成分或期望进食而激活的情况下给予Y4激动剂，不会观察到这种作用或较 低。因此，在本发明优选的实施方案中，可在禁食状态下以有效剂量通过皮下、鼻 部或通过本文其它地方所述的其它方式给予选择性Y4激动剂。本文的术语“禁食 的状态”指对象在给予Y2受体激动剂前至少最近2小时内不吃任何食物或饮水， 例如给药前至少最近3小时内、至少最近4小时内、至少最近5小时内、至少最近 6小时内、至少最近7小时内、至少最近8小时内、至少最近9小时内、至少最近 10小时内、至少最近11小时内或至少最近12小时内。
在该激动剂群体的一个亚组中，Y4激动剂因遗传变异，例如Y4基因中的多 态性而可能不具有所期望的作用。这些受体中丧失功能的突变可能与肥胖相关。因 此，在本发明一优选实施方案中，为检测这些基因中的多态性/突变和鉴定这种多 态性，对待治疗对象的Y4基因进行分析。根据这种分析可得到这些对象的最佳治 疗方案。例如，只有具有不影响Y4激动剂功能的正常基因型或多态性的对象应该 用这种激动剂治疗。为确保药物的最佳效果，另一种可能性是提高表达受损伤受体 对象的Y4激动剂用量。在Y4受体功能受损导致对象肥胖的情况中，例如在杂合 子患者(前提是至少保留了一些相关受体功能)中用替代疗法形式的Y4激动剂(例如 大剂量)治疗可能有争议。
在本发明的一个实施方案中，在长期治疗开始前可进行给予Y4激动剂的急性 测试以确保这些化合物在待治疗对象中具有所期望作用。通过这些方法确保了只有 对用Y4激动剂治疗敏感的对象才可用这些化合物治疗。
剂量
本发明Y4受体激动剂的治疗有效量取决于所用的具体激动剂、所治疗对象的 年龄、体重和状况、所治疗病症或疾病的严重性和类型、给药方式和所用组合物的 强度。
例如，Y4受体激动剂的治疗有效量可在约0.01微克/公斤体重到约1克/公斤 体重范围内变动，例如约1微克到约5毫克/公斤体重，或约5微克到约1毫克/公 斤体重。在另一实施方案中，给予对象0.5-135皮摩尔(皮摩尔)/公斤体重，或约72 皮摩尔/公斤体重的受体激动剂。
在一具体的非限制性例子中，皮下注射给予约5到约50nmol，例如约2到约 20nmol，或者皮下注射给予约1.0nmol。本领域技术人员根据所用具体化合物(如 该受体激动剂)的效力、对象的年龄、体重、性别和生理情况不难确定精确的剂量。 激动剂的剂量可以是治疗有效剂量PYY3-36的等摩尔当量。
这些用量可分为一次或数次剂量，以每日、每两日、每周、每两周、每月或 以任何其它适当的频率给药。给药一般是每日一次或每日两次。
给药方法
本发明的Y4激动剂及其美容或药物组合物可经任何途径给予，包括肠内(例 如，口服给药)或胃肠外途径。在一具体实施方案中，优选胃肠外途径，包括：静 脉内、关节内、腹膜内、皮下、肌肉内、胸骨内注射和输液，以及通过舌下、透皮、 局部、经粘膜(包括鼻部途径)给药，或者通过吸入，例如肺部吸入给药。在具体实 施方案中，优选皮下和/或鼻部给药。
与脑室内给药的NPY和PYY一样，当天然Y4选择性肽PP中枢给药时，可 以诱导进食(可能是因为循环激素或外周给药的肽化合物一般达不到的中枢受体激 活作用)。因此，为避免增加进食，本发明的Y4选择性激动剂优选外周给药。
可将这些受体激动剂分散在合适的运载体中给药，或者可以合适的药物或化 妆品组合物形式给药。这种组合物也属于本发明的范围内。下文描述了合适的药物 组合物。本领域技术人员熟知这种组合物也适用于美容用途，或者知道通过利用合 适的美容上可接受的赋形剂将这些组合物调整为化妆品组合物。
药物组合物
用于药品或化妆品中的本发明受体激动剂(也称为“化合物”)通常以药物组合 物形式存在，所述药物组合物含有特定的化合物或其衍生物和一种或多种生理学或 药学上可接受的赋形剂。
这些化合物可通过任何常规给药途径，例如口服、颊部、鼻部、眼部、肺部、 局部经皮、阴道、直肠、眼部、胃肠外(包括上述皮下、肌肉内和静脉内等)途径以 各个体有效的剂量给予动物，包括哺乳动物，例如人。本领域技术人员知道如何选 择合适的给药途径。如上所述，优选胃肠外给药途径。在一具体实施方案中，这些 受体激动剂皮下给药和/或鼻部给药。本领域熟知皮下注射易于自行实施。
医生不难为每位患者单独确定适合具体给药途径的组合物。标准制剂的专题 论文描述了各种药学上可接受的运载体及它们的制剂，例如E.W.Martin的《雷明 顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)。
含有本发明化合物的药物组合物可以是固体、半固体或液体组合物形式。就 胃肠外应用而言，这些组合物通常是液体组合物形式或是用于植入的半固体或固体 形式。
可通过静脉内、肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内或皮下注射或输液给予作为 无菌溶液或分散体的液体组合物。可将这些化合物制备成无菌固体组合物，在给药 前或给药时用无菌水、盐水或其它合适的无菌可注射介质溶解或分散。
组合物的液体形式可以是溶液、乳液(包括纳米乳液)、悬液、分散液、脂质体 组合物、混合物、喷雾剂或气溶胶(后两种类型特别适用于鼻部给药)。
溶液或分散液的合适的介质通常是水或药学上可接受的溶剂，例如油(如芝麻 油或花生油)或有机溶剂，例如丙醇或异丙醇。本发明的组合物可含有其它药学上 可接受的赋形剂，例如pH调节剂、渗透压活性物质(例如为了将组合物的等渗性 调节到生理上可接受的水平)、粘度调节剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、 抗氧化剂等。优选的介质是水。
鼻部给药的组合物也可含有本领域技术人员熟知的合适的无刺激性运载体， 例如聚乙二醇、乙氧基化四氢糠醇(glycofurol)等以及吸收增强剂(例如参见《雷明 顿药物科学》)。
就胃肠外给药而言，在一个实施方案中，一般通过将所需纯度、单位剂量可 注射形式(溶液、悬液或乳液)的受体激动剂与药学上可接受的赋形剂或运载体混 合，即与所用剂量和浓度的对接受者无毒并且与组合物的其它成分相容的物质相混 合来配制。
总体上，通过使受体激动剂与液体运载体或精细分级的固体运载体或二者均 匀紧密地接触来制备制剂。然后视需要将产品做成所需剂型。运载体优选胃肠外运 载体，更优选与接受者血液等渗的溶液。这种运载体的例子包括水、盐水、林格溶 液和葡萄糖溶液。非水性运载体，例如非挥发油和油酸乙酯以及脂质体也可用于本 发明。由于本文所述肽具有两亲性质，合适的剂型也包括胶束制剂、脂质体和包含 一种或多种合适脂质如磷脂的其它类型制剂。
优选将这些受体激动剂悬浮在水性运载体中，例如pH约3.0到约8.0、优选 pH约3.5到约7.4、3.5到6.0或3.5到约5的等渗缓冲溶液。有用的缓冲物质包括 乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐，例如柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。
这些组合物也可设计为能在给药后受控递送或持续递送所述受体激动剂以获 得频率更低的给药方案。通常认为每日1-2次的剂量方案可接受，但是本发明也包 括例如频率较高或较低的其它给药方案。为实现持续递送该受体激动剂，可用含有 例如脂质或油的合适运载体以在给药部位形成贮存而将该受体激动剂缓慢释放入 循环系统，或者可采用植入物。该方面合适的组合物包括掺入了该受体激动剂的脂 质体和生物可降解颗粒。
在需要固体组合物的情况中，该固体组合物可以是片剂形式，例如常规药片、 泡腾片、包衣片、融解片或舌下片、药丸、粉末、粒剂、颗粒、颗粒材料、固体分 散体或固体溶液。
该组合物的半固体形式可以是咀嚼胶、软膏、乳膏、涂抹剂、糊剂、凝胶或 水凝胶。
本发明的药物组合物的其它合适剂型可以是阴道栓(vagitories)、栓剂、膏剂、 贴片、片剂、胶囊、小囊、锭剂、装置等。
剂型可设计为能以自由或受控方式释放该化合物，例如带有合适包衣的片剂。
该药物组合物可含有治疗有效量的本发明化合物。
本发明组合物中本发明化合物的含量是，例如占该药物组合物的约 0.1-100％w/w。
药物制剂配制的技术人员可用熟知的方法制备这些药物组合物。
在这些药物组合物中，所述化合物通常与药学赋形剂，即治疗上惰性物质或 运载体相混合。
所述运载体根据所需剂型和给药途径可采取各种形式。
药学上可接受的赋形剂可以是，例如填充剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、润 滑剂、溶剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、增强剂、调味剂、色素、pH调节剂、滞 留剂、润湿剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等。详见药物手册，例如《雷明顿 药物科学》或《药物赋形剂手册》(Pharmaceutical Excipient Handbook)。
以下实施例描述了本发明一些具体激动剂的制备方法与活性。
合成
可通过固相肽合成采用自动化肽合成仪或传统的分批合成(bench synthesis)来 合成本发明的肽激动剂。固体支持物可以是，例如氯三苯甲基(Cl)或Wang(OH)树 脂，二者均不难购得。这些树脂的活性基团易于和N-Fmoc氨基酸的羧基反应，从 而使其与聚合物共价结合。可通过与哌啶接触使结合在树脂上的胺基去保护。然后 将第二种N-保护的氨基酸偶联于树脂-氨基酸。重复这些步骤直至获得所需序列。 合成结束时，可去保护结合在树脂上的受保护肽并用三氟乙酸(TFA)从树脂上切 下。有助于将新的氨基酸偶联于结合在树脂上的氨基酸链的试剂例子有：四甲基脲 六氟磷酸(HATU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)， O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、1H-羟基苯并三唑 (HOBt)。
除固相化学方法外，通过液相化学方法合成肽也是可行的。
本文所称的肽可用Fmoc化学方法用超过5倍量的试剂在PAL Peg-PS树脂(酰 胺树脂(amide resin Applied Bioscience，Warrington，UK GEN913401)上进行固 相合成来制备。整个过程通过HCTU连接，溶剂为DMF。用DMF配制的20％哌 啶处理10-15分钟以除去Fmoc。然而，这些肽也可用各种其它标准的肽合成方法 来合成，例如除固相方法以外的tBOC化学合成法和液相化学合成法。下文说明了 这种合成方法，但本发明考虑的其它肽可用类似方法制备：
合成[Ala30]PP2-36(SEQ ID No：4)
一般地，侧链保护基团是标准的Fmoc(方法)，除了：
Arg＝Fmoc Arg(Pbf)-OH
Asn，Gln＝Fmoc Asn(Trt)-OH
Thr，Ser，Asp，Glu，Tyr＝叔丁基
Ala-Ser 22-23＝Fmoc AlaSer拟脯氨酸(pseudoproline)
采用Fmoc化学合成方法用超过5倍摩尔量的试剂在PAL Peg-PS树脂(切割 后可产生生物学上重要的羧酰胺基团的树脂)上进行肽的固相合成。整个过程通 过HCTU连接，溶剂为DMF。每步偶联后，用DMF配制的20％哌啶处理10-15 分钟以除去Fmoc。每步后用定量茚三酮试验核查偶联情况。在某些例子中可进行 双重偶联。
然后将树脂分为数部分而产生了不同的批次的肽。
用TFA∶硅烷∶水(93∶3∶3)将肽从树脂上切下。通氮气流除去溶剂，用醚洗涤残 留物，空气干燥，溶解在10％的乙酸中，冻干。
在一个纯化方法的例子中，采用典型的250mm×10mm的ACE 300A C18 柱，流速2毫升/分钟，215nm处检测，通过反相HPLC来纯化粗品。
缓冲液A＝0.05％TFA的水溶液
缓冲液B＝60％MeCN+0.05％TFA和水
用于本文所述序列的典型梯度液为20分钟内20％-90％梯度的缓冲液B， 收集主峰。采用例如MALDI TOF电离技术质谱法鉴别肽的身份(也可用电喷射 或大气压化学电离技术或其它电离技术)。例如用分析型HPLC方法A检查纯 度。将含产物的流分合并并冻干，得到肽产物的三氟乙酸盐。
如上所述，根据上述方法，或肽合成领域公知方法稍微改进制备本发明考虑 的其它肽。例如：
合成[Thr30]PP2-36(SEQ ID No：6)
一般地，侧链保护基团是标准的Fmoc(方法)，除了：
Arg＝Fmoc Arg(Pbf)-OH
Asn，Gln＝Fmoc Asn(Trt)-OH
Thr，Ser，Asp，Glu，Tyr＝叔丁基
Ala-Ser 22-23＝Fmoc AlaSer拟脯氨酸
基于PP2-36的肽的分析数据小结
                                                                    Rt
SEQ ID 
                                                       测量值              纯度
No：      结构             分子式            Mw                     分              分析方法
                                                       m/z                 ％
                                                                    钟
4                          C181 H278                                14.
          [Ala30]-PP2-36                     4078.6    4053.7              96.9     A
                           N52 O54 S                                0
6                          C182 H280                                13.
          [Thr30]-PP2-36                     4108.6    4084.6              93.8     A
                           N52 O55 S                                9
8                          C182H279                                 14.
          [Asn30]-PP2-36                     4121.6    4098.6              90.1     A
                           N53 O55 S                                0
10                         C183 H281                                13.
          [Gln30]-PP2-36                     4135.6    4113.0              85.0     A
                           N53 O55 S                                9
14        [Glu10，Leu17，  C184 H284                                14.
                                             4104.6    4084.5              92.0     A
          Thr30]-PP2-36    N52 O55                                  4
12                         C184 H284                                14.
          [Glu10]-PP2-36                     4152.7    4132.2              93.7     A
                           N52 O54 S                                23
16        [Nle17，Nle30]-  C185 H285                                14.
                                             4101.6    4081.6              96.0     A
          PP2-36           N52 O54                                  8
18        [Glu10，Nle17，  C186 H287                   44094.       14.
                                             4115.6                        98.8     A
          Nle30]-PP2-36    N52 O545                                 8
分析型HPLC方法A
柱＝Vydac C18肽-蛋白质柱，250×4.6mm
缓冲液A＝水配制的0.05％TFA
缓冲液B＝100％MeCN配制的0.05％TFA
梯度＝20分钟内从0％B到60％B
流速＝1.00毫升/分钟
波长＝215nm
质谱＝用龙胆酸或α氰基羟基肉桂酸作为基质的MALDI-TOF 也可用其它HPLC分析方法，例如：
分析型HPLC方法B
柱＝Phenomenix Jupiter C18，250x4.6mm & 预柱(Guard cartridge)
缓冲液A＝水配制的0.05％TFA
缓冲液B＝100％MeCN配制的0.05％TFA
梯度＝30分钟内从0％B到100％B
流速＝1.00毫升/分钟
波长＝220nm
生物学试验和结果
I.测定肽效力的体外试验
人Y2受体效力试验
在COS-7细胞中进行剂量-反应实验以测定测试化合物对人Y2受体的效力， 用人Y2受体以及能确保Y2受体经导致磷酸肌醇酯转化增加Gq途径偶联的混杂G 蛋白Gqi5瞬时转染COS-7细胞。
磷脂酰肌醇转化-转染一天后，将COS-7细胞与5μCi的[3H]-肌醇 (Amersham，PT6-271)在补加了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和0.01mg/ml庆 大霉素/孔的1ml培养基中培育24小时。细胞用补加了140mM NaCl、5mM KCl、 1mM MgSO4、1mM CaCl2、10mM葡萄糖、0.05％(w/v)牛血清的20mM HEPES，pH7.4的缓冲液洗涤两次；用补加了10mM LiCl的0.5ml缓冲液37℃ 培育30分钟。在37℃用各种浓度的肽刺激45分钟后，用10％冰冷却的高氯酸 提取细胞，然后在冰上培育30分钟。用HEPES缓冲液配制的KOH中和得到 的上清液，在Bio-Rad AG 1-X8阴离子交换树脂上纯化产生的[3H]-磷酸肌醇酯 并用β计数器计数。测定按一式两份进行。利用标准的药理学数据处理软件，Prism 3.0(graphPad Sofware，圣地亚哥，美国)计算EC50值。
人Y4受体效力试验
除了采用人Y4-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
人Y1受体效力试验
除了采用人Y1-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
人Y5受体效力试验
除了采用人Y5-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
在以上效力试验中NPY、PYY、PYY3-36、PP、PP2-36和本发明八种激动 剂的测定结果见表2：
表2
肽                          hY2                hY4              hY1
                            EC50   S.E.M n     EC50   S.E.M n   EC50   S.E.M n
                            nM                 nM               nM
NPY                         1.5    0.5   11    167    56    7   1.7    0.3   15
PYY                         0.23   0.06  8     34     5     6   0.6    0.1   5
PYY(3-36)                   0.33   0.05  21    ＞1000 --    8   74     5     7
PP                          ＞1000 --    8     0.80   0.18  23  83     13    5
PP(2-36)                    ＞1000 --    8     0.74   0.08  9   296    23    7
[Ala-30]-PP(2-36)           ＞1000       3     1.04   0.15  3   ＞1000 --    3
[Thr-30]-PP(2-36)           ＞1000       3     1.07   0.14  3   ＞1000 --    3
[Asn-30]-PP(2-36)           ＞1000       3     3.05   0.28  3   ＞1000 --    3
[Gln-30]-PP(2-36)           ＞1000       3     0.99   0.06  3   ＞1000 --    3
[Glu10；Leu17；Thr-30]-     ＞1000       3     1.07   0.05  3   ＞1000 --    3
PP(2-36)
[Glu-10]-PP(2-36)           ＞1000       3     0.91   0.05  3   564    91    3
[Nle17，Nle30]-PP(2-36)     ＞1000       2     0.95   0.13  2   256    34    2
[Glu10，Nle17，Nle30]-      ＞1000       2     0.79   0.14  2   263    33    2
PP(2-36)
测定糖胺聚糖(GAG)结合的体外试验
在体外试验中利用固定的肝素，即肝素琼脂糖作为亲和基质，使用HiTrap 肝素-琼脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)或肝素HPLC 柱监测测试化合物结合GAG的能力，用含2mM DTT和1mM MgEDTA的50 mM磷酸钠(pH 7.3)液配制的0-0.5M NaCl线性梯度液洗脱50分钟，流速1毫 升/分钟。用缓冲液A配制的1M NaCl洗涤此柱51-55分钟以再生。
序列表
NPY(SEQ ID No：1)
H2N-Tyr--Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Ar
g-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
PYY(SEQ ID No：2)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-
Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
PP(SEQ ID No：3)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln
-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Ala30]PP2-36(SEQ ID No：4)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr
-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Ala-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Ala30]PP(SEQ ID No：5)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln
-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Ala-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Thr30]PP2-36(SEQ ID No：6)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr
-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Thr-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Thr30]PP(SEQ ID No：7)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln
-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Thr-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Asn30]PP2-36(SEQ ID No：8)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr
-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Asn-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Asn30]PP(SEQ ID No：9)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln
-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Asn-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Gln30]PP2-36(SEQ ID No：10)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr
-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Gln-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Glu30]PP(SEQ ID No：11)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln
-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Glu-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Glu10]PP2-36(SEQ ID No：12)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Glu-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-
Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Glu10]PP(SEQ ID No：13)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Glu-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-
Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Glu10，Leu17，Thr30]PP2-36(SEQ ID No：14)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Glu-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Tyr-
Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Thr-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Glu10，Leu17，Thr30]PP(SEQ ID No：15)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Glu-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-
Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Thr-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Nle17，Nle30]PP2-36(SEQ ID No：16)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-
Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID No：17)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-
Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Glu10，Nle17，Nle30]PP2-36(SEQ ID No：18)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Glu-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-
Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Glu10，Nle17，Nle30]PP(SEQ ID No：19)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Glu-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-
Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2