本申请是1993年11月30日登记的美国专利申请159, 674的部分续申请，其中所述的美国专利申请本身又是申请 号为076,239和076,250号美国专利申请的部分续申请，这 两年专利申请于1993年6月11号登记，并且它们本身又是 1991年6月18日登记的美国专利申请717,084号和716, 899号申请的部分续申请，其中所述的717,084号和716, 899号美国专利申请本身则是1990年8月20日登记的美 国专利申请569,828号的部分续申请，而569,828号美国专 利申请本身则是1989年12月22日登记的455,707号美国 专利申请的部分续申请。

本申请还是下列三件美国申请的部分续申请，其中第一 件于1994年9月16日提出申请，申请号307,305；第二件及 第三件均于1993所11月30日提出申请，申请号为159,687 和160,232；其中所述的后两件申请本身各自又是1993年6 月11日提出申请，申请号为076,239和076,250号美国专 利申请的部分续申请。

这些申请的各自优先权申请内容特此也要求保护，且它 们各自的公开内容由此也全部并入本文用于参考。

               发明背景

本发明涉及向患者的选定组织，尤其是皮肤上局部给用 活性成分，尤其是药物和美容剂的方法及组合物。尽管局部 给药通常主要是给药到患者的皮肤上，但在本发明的说明书 中，术语“局部”并不仅限于此，它包括给药到患者的任何及 所有组织的表面，无论是外部给药还是内部给药。因此，除患 者皮肤外，局部给药的其它部位包括各种粘膜，如眼，鼻，直 肠及鞘的粘膜。本发明的范围还包括对肺局部给药，即单独 或共同地对支气管，细支气管及肺泡部给药。

当局部给药到所需组织表面时(即局部或直接给药到组 织表面时)，可以发生吸收和从给药的局部地区向患者的其 它地区或区域转移，尤其是通过血液的系统转移。因此，当局 部给药为局部性时(例如，直接给药到肺或其部分)，根据需 要，药物可以系统转移，结果药物可传递至患者身体的各种 不同的其它区域。然而，在某些情形下，系统转移可能是不必 要的或不期望的，如对于治疗支气管炎或哮喘的药物，则需 要将它们全部局部给药肺的粘膜上。

在术语“局部的”含义的范围之内，本发明还包括施加下 文进一步描述的组合物到患者的特异性组织上，尽管这些组 织在常规情形下为全内组织且不能进行局部给药，但通过如 外科手术或创伤，这些组织可能外露。因此，在本发明范围之 内，可以在开胸外科手术过程中将下述组合物施加到心脏的 外露组织上。

本发明的目的还在于通过注射皮下给用活性成分，即在 低于患者组织的表面，尤其是皮肤下给用活性成分。皮下注 射允许活性成分的储存形式(表面以下贮藏)，以便持续释放 活性成分到患者系统内。尽管皮下给药通常主要是通过在患 者皮肤之下注射进行，但在本发明的说明书中，所用术语“皮 下”并不仅限于此，而包括患者的任何及所有组织表面之下 的注射给药，无论是外部组织还是内部组织。因此，除患者皮 肤之外，其它皮下给药的部位包括患者眼睛或心脏外膜表面 下部。

由于局部和皮下传递活性成分，尤其是治疗剂到所希望 的定位作用部位上比可能的系统给药常常以能得到更高的 浓度且不发生不希望的副作用，因此本领域内不断需要改进 的方法和组合物，并且人们还深知大多数药物和美容剂很难 被吸收，甚至仍保留在第一部位(局部或皮下给药的部位)的 皮表面。关于药物，皮肤表面或皮肤表面下的吸收一般是缓 慢的，因此，通常是不起作用的。至于美容剂，特别是维生素 及其衍生物类，以及防晒剂，很难阻止这些化合物从皮肤上 洗去，同样也难以使这些合物渗透到皮肤之内。

局部和皮下传送治疗剂还能有目的地将所述药剂系统 给药于患者，即增加受药患者体内包含药物的血浆水平。因 此，本发明的领域还包括施加活性成分到皮肤上或皮肤之下 的方法和组合物，以便实现经皮或系统传递活性成分，即以 吸收形式通过皮肤和在皮肤之下将活性成分供应到血流内。 同样在本发明范围之内还可以将所述组合物给药到上述粘 膜或其它组织中，以便实现经皮或系统所含活性成分。

现有技术中已研制开发了多种局部和皮下传递系统，用 于传递活性成分如药物和美容剂到患者的各种组织上，特别 是通过局部施用传送到皮肤上和通过皮肤。为了改进药物和 美容剂进入到皮肤中的渗透性，过去已尝试了种种技术和材 料。这些包括离子电渗疗法和超声波技术，以改进药物渗透 到皮肤中的能力，以及使用了含有增强渗透性的化合物，表 面活性剂，类脂以及其它脂族化合物，脂质体以及niosomes 的制剂。尽管所有这些试剂在某些程度上显示出能增加药物 的吸收，并在某些情形下能增加美容剂的功效，但仍没有开 发出具有所希望的最佳性能的制剂。迄今适合药物和美容剂 皮肤传递的最优越的制剂可能是脂质体或niosomes，但这些 制剂也具有若干缺陷。例如，使用它们很难形成稳定的，药学 上可接受的制剂，包含在它们之中的活性成分，以及制备它 们的类脂或脂族化合物在贮存过程中可能会氧化或水解或 在它们被施用到皮肤之后甚至会降解。

到现在为止，主要是使用充水脂质体来传递药物到皮肤 上。脂质体为一或多层用心磷脂层构成的囊体，它们通常被 称作单，寡和多片层脂质体，并且典型的是当它们中充有活 性成分的水溶液的脂质体，脂质体的内部空间与脂质体外部 上的气体相平衡，以便存在穿过脂质体膜进行的氧交换。这 导致密封在其中的活性成分发生氧化性降解。对氧敏感的药 物的实例包括脂溶性维生素A，E，D和K，水溶性维生素如 维生素C，二价铁基盐，青霉烷(penam)，头孢烷(cepham)以 及通过水解形成的单菌(monobactam)抗生素，化学治疗剂等 等。

本领域还没认识到将有可能制备充有气体和充有气体 前体的脂质体和泡沫体，而这些脂质体和泡沫体可按照本发 明的特殊步骤制备，并且还未认识到相对于局部传递各种药 物于皮肤上，这些微球体和泡沫体具有显著的优点。在现有 技术制备脂质体和其它微泡过程也伴随存在有发泡；然而， 本领域人员仍认识到将有可能，甚至最好去制备象本发明这 样的充有/气体和充有气体前体的脂质体和泡沫体，将它们 作为载体用于局部或皮下传送各种活性成分。

例如，Ryan等人在发明名称为“Lipisomes(sic)Containing Gas for Ultrasound Dection”的4900540号美国专利中提出，对 于含有气体和气体的脂质体，仅当它们悬浮在生理上可接受 的液体中如生理盐水中并通过静脉给药和其它途径给药时 它们可被用作超声波诊断对比剂，然而，此专利丝毫未提及 可包括如局部给药到皮肤上的施用。

Tickner等人的发明名称为“Ultrasonic Image Enhance- ment”的WO80/02365，提供了通过向其中流入大量具有表 面膜如明胶且包裹有气体的微泡增强患者血流超声波/成像 的方法。然而，微泡最好是在具有与膜基本相同的化学组成 的介质中形成和分散，并且是可胶凝的。这类组成估计可能 不会用作泡沫体，该专利也没有清楚说明在任何局部或皮下 施用中使用这类组成。

在Szoka和Papahadjopoulos的标题为“Procedure for preparation of liposomes with a Large aqueous space and high cap- ture by reverse-phase evaporation”的论文中(Proc.Natl.Acad. Sci.USA，75(1978)4194-4198)他们描述了声波处理两相体 系，继之在观察到所述体系发泡的过程中蒸发溶剂。然而，在 非包裹材料和残余的有机溶剂被移动之后，随后形成粘胶， 然后再形成含水悬浮液。所产生的脂质体未充有气体和气体 前体，并且也没有揭示形成局部施用的微球体或泡沫体。类 似地，Hug和Sleight在Biochimica et Bio-Physica Acta，1097 (1991)1-17中描述了反相蒸发密封法，其中他们建议用快 速涡流处理替代声处理。但是，如上所述，充有气体和气体前 体的脂质体不能被制得，所涉及的中间步骤只不过是短暂 的，并且最终产物不是稳定的泡沫体。

Cerny等人在发明名称为“Contimous Sonication Method for Preparing Protein Encapsulated Mioro-bubbles”的美国专利 4,957,656中公开了一种超声波成像剂，通过在气体，优选 空气加到溶液过程中连续声处理热变性生物相容性蛋白质 的水溶液而制得。声处理过程中，使含空气溶液发泡以增强 微气泡的形成和浓度，但这种泡沫在最终产物中不能被认为 是所希望的，这是因为已知一旦产物从超声处理器中移出， 泡沫很容易散失。

现有技术中已考虑了种种方法来克服限制脂质体用作 生物活性化合物实用载体的种种因素，如脂质体水分散体的 有限的物理稳定性。例如，Payne等在美国专利4,830,858 中描述了制备稳定脂质体前体的方法，所述气体为喷雾干燥 脂质体组分的混合物形式，它们可以干燥物形式贮存并在使 用之前直接与水重新配制形成脂质体制品。但是，迄今仍没 有本发明这样的发现的报道，即定义如下的类脂类和其它化 合物可被用于制剂成稳定的具有必时性能的充有气体和气 体前体的微球体和泡沫体，它们用于传递药物和其它活性成 分到如皮肤这样的部位。

D′Arrigo在美国专利4,684,479和5,215,680中分别 公开了液包气乳化液和类脂涂层微气泡，它们是稳定的并且 据称可在多种领域中使用，包括超声心动描记术用的对比 剂，并且对局部血流的超声监测是十分有用的。然而，该专利 没有揭示这些组合物可用于活性成分的局部或皮下传递。

Vanderipe在公开的PCT申请WO93/06869中也公开了 气体和气体混合物，包括全氟代烃的气泡作为超声波成像增 强剂的应用。然而，这些气泡未被包裹并且该文献也未揭示 这些气泡用于活性成分的局部或皮下传递。

Lanza等人在公开的PCT申请WO93/20802中公开了 用于增强超声波成像的声反射寡片层脂质体，该脂质体为双 层间具有增大的水相空间的多片层类脂或含有嵌套在双层 间的非向心开头的脂质体，并因此含有内分离的双层。该文 献也描述了它们在监测脂质体给于患者的药物的传递方面 的应用。但是，该文献没有教示本发明这样的稳定的充有气 体和气体前体的微球体或泡沫体，或它们在如活性成分的局 部传递这亲的施用中的应用。

Widder等人在公开的欧州专利申请EP-A-0 324 938 中公开了由热变性生物相容性蛋白质如白蛋白，血红蛋白， 和胶原蛋白产生的稳定的微气泡型超声波成像剂。然而仍未 描述这种组合物在如活性成分的局部传递这样的施用中的 应用。

还可提及的是Moseley等人于1991年在San Francisco， California的一次磁共振协会的医学会议上作过一次报告， 该报告概括成一摘要形式，标题为“Microbubbles：A Novel MP Subceptibility Contrast Agent”。所利用的微气泡包括涂布 有人白蛋白壳的空气。但是，该文献未揭示本发明这样的稳 定充有气体和气体前体的微球体和泡沫体以及它们如活性 成分的局部传递这样的施用的应用。

Tei等人在未审专利申请公开昭63-60943中公开了超 声波诊断对比剂，它包括1-10μm乳胶粒度的全氟代烃乳 剂，其中全氟代烃优选含有9-11个碳原子且乳化剂可以是 如磷脂或非离子聚合表面活性剂如聚(氧乙烯)-聚(氧丙 烯)共聚物。乳剂可利用混合器而制得。然而，该文献没有揭 示这些全氟代烃乳剂将适于如活性成分的局部传递这样的 施用。

Knight等人在美国专利5,049,388中公开了供医学应 用的气溶胶脂质体和脂质体-药物结合物，这些应用如通过 吸入将药物传递到呼吸道内。然而此文献也未揭示这些脂质 体可以是充有气体或气体前体的，因而它们不同于本发明的 稳定的充有气体和气体前体的微球体和泡沫体。

               发明概述

本发明提供了组合物，该组合物包含充气和/或气体前 体的微球体，其中所述微球体进一步包含有效量可局部或皮 下施用到病人的选定组织上的活性成分。活性成分包括药 物，尤其是肽类和其它(生物)活性化合物，以及美容剂。包裹 在所述微球体内的气体可用于防止不稳定药物，活性化合物 和美容剂的氧化和其它形式的降解。气体可以是如氮气或全 氟丙烷，但也可由气体前体如全氟辛基溴产生，并且微球体 可由如生物相容性类脂或聚合物构成。类脂可以是单层或双 层形式，并且这些单一或双层类脂可用于构成一系列向心单 一或双层。例如，类脂可用于构成单层脂质体(由一层单层或 双层类脂组成)，寡层脂质体(由两或三个单层或双层类脂组 成)或多层脂质体(由多于三层的单层或双层类脂组成)。优 选的生物相容性类脂为磷脂。所得到的充气或气体气体的微 球体(通常为泡沫形式)对活性成分如药物和美容剂的局部 或皮下传递提供了完全奶油状的结构和增强的皮肤渗透性。

本发明还涉及制备充气和/或气体前体类脂基微球体的 方法，所述微球体包含局部或皮下施加到病人选定组织上的 活性成分，该方法包括在气体和/或气体前体存在下搅拌生 物相容性类脂(即类脂稳定化合物)的水悬浮液的步骤，结果 产生充气和/或气体前体微球体。搅拌步骤最好在低于类脂 的凝胶态至液晶态的相变温度下进行，以获得优选的最终产 物。活性成分可以在搅拌之前加到水悬浮液内，或者也可在 搅拌后加入；在这两种情形下，活性成分将与充气和气体前 体微球体结合。

使用气体前体时，在对病人给用之前，充气体前体微球 体保持在其中气体前体为液体的温度下。如果需要，在给药 时可将温度升度，激活气体前体形成气体，然后将形成的充 气微球体局部或皮下施加给病人。另一方面，如果需要，充气 体前体微球体可以不经升高温度而直接施用，借助病人的组 织表面(如病人的皮肤)的温度使气体前体形成气体。如果必 要，给用前组合物可以被搅拌。

本发明进一步提供了局部或皮下传递活性成分至病人 选定组织上的方法，包括对所述病人的所述组织局部或皮下 施加充气和/或气体前体微球体步骤，其中所述微球体进一 步包含有效量所述活性成分。活性成分包括药物，特别是肽 和其它生物活性化合物，以及美容剂。

               附图的简要说明

附图1图示说明了本发明充气微球体和活性成分皮下 传递到病人皮肤上。附图1B为附图1A中圈出部分的放大 图。

附图2图示了与多种常规微球体的传递相比，通过吸入 本发明充气微球体和活性成分向肺部的局部传递情况。

               发明的详细描述

本发明涉及充有气体和/或气体前体的微球体作为局部 和皮下给药用载体的应用。微球体由生物相容性类脂和/或 聚合物组成，它们构成表皮或膜(即形成空腔或环绕空隙)， 这些表皮或膜可包裹或包围气体或气体前体。类脂和/或聚 合物对微球体提供了结构完整性，并使微球体对有用的时间 周期具有官能持续性。更具体地讲本发明涉及充气和气体前 体微球体，其中所述微球体进一步包含有效量活性化合物， 这些化合物可局部或皮下施加到施用有所述微球体的人或 动物患者的选组织上。所产生的微球体组合物通常为可见泡 沫形式，为微球体在液体介质中的母组织(聚集或凝聚)，且 它们在本文中被称作泡沫体或稳定泡沫体。如果需要，利用 任一本领域技术人员所公知的各种方法，分散或分离微球 体，包括泡沫体。然而，优选微球体以泡沫体形式给用。

在制备微球体壁中使用的典型的、最有用的稳定化合物 为那些具有疏水/亲水特性的化合物，这些疏水/亲水性使得 它们在水基介质存在下形式双层，从而构成微球体。因此下 文中通常称作稀释剂的水，生理盐水或其它水基介质可构成 /本发明充气和气体微球体的一个方面，其中这种形成双层 组合物被用作稳定化合物。

所产生的本发明微球体和泡沫体的稳定性至少部分可 归因于制造它们的材料。事实上，稳定(化合物可以是将各种 所希望的特性贡献给微球体和泡沫体的化合物的混合物。例 如，已发现能协助基本稳定化合物溶解或分散的化合物是有 利的。没必要使用辅助稳定添加剂，尽管可任选如此做，但是 一旦本发明说明书中指示含有它们，这些辅助稳定添加剂可 在本领域技术人员所熟知的范围内选择。构造成本发明微球 体和泡沫体的材料在本文中一般称作稳定化合物，它们可以 是如生物相容性类脂和聚合物材料，不过下文中详细描述的 其它材料也可使用，这些可以是一些可起基本稳定化合物的 作用，或起辅助稳定化合物作用的材料。

正如所指出的那样，本发明微球体可包裹气体，如氮气 或全氟丙烷，它们在远远高于或远远低于环境室温的温度下 均为气态。或者本发明微球体可包裹气体前体，如全氟辛基 溴，该化合物在环境室温下的液体，但在已给用它们的患者 的体温下膨胀形成气体。

此外，有可能同时使用气体和气体前体。实际上本发明 的独特方案基于下述发现：全氟代烃气体前体当与气体结合 制备本发明稳定微球体时，可以给予比单独使用气体另外得 不到的附加程度稳定性。也可使用各种气体结合物和气体前 体结合物来给予附加程度的稳定性。

这些由气体前体制成的微球体和泡沫体具有若干优点。 首先，由于由对温度敏感的气体前体产生的气体趋向为不溶 性和相对不扩散性，故这些气体用作局部或皮下传递载体更 容易被稳定。由于这些气体是相对稳定的，故与较易溶解和 扩散的气体如氮气或空气相比，则需要较少量稳定化合物。 通常，厚壁且气体渗散性或扩散性较差的稳定化合物的表层 或膜，即厚壁微球体需要稳定气体如空气或氮气。尽管填充 有空气，氮气或其它气体的厚壁微球体可用作局部或皮下传 递各种活性成分的载体，但这种微球体的厚壁可能限制微球 体和泡沫体组合物的效力。对本发明中所用的气体而言，(最 优越的为全氟化碳气体前体)，尽管所需稳定化合物的刚性 较低且所生成的微球体具有较薄球壁且更容易施用，但仍需 足够稳定化合物来稳定气体。

本发明提供了用于局部或皮下传递一种或多种各类活 性成分至患者选定组织上的微球体和泡沫体，以及使用这些 微球体和泡沫体的方法。然而，本发明还打算使微球体和泡 沫体它们自己本身能够履行活性成分的作用，特别是有关美 容剂及其特性。因此，例如，有可能使用充有气体和气体前体 的微球体和泡沫体本身来向选定组织给予润滑或润湿特性， 当然，其条件是要选择类脂组合物，以便在最终产物中得到 这些特性。对于既熟悉所希望特性又熟悉可用于制备本发明 充气体和气体前体的微球体的化合物本身已有的各种特性 的本领域专业技术人员而言，为实现选择目的很容易选择稳 定化合物。

本发明微球体包裹气体和/或气体前体。本文中所用术 语“充气和/或充气体前体”意指本发明所指的具有内腔的微 球体，该内腔至少含10％气体和气体前体，优选至少有约 25％气体和气体前体，较优选有至少约50％气体和气体前 体，更优选至少有约75％气体和气体前体，最优选至少有约 90％气体和气体前体。

各种生物可容性气体均可用于本发明的充气和气体前 体微球体内。这类气体包括空气，氮气，二氧化碳，氧气，氩 气，氟，氙气，氖气，氦气，或任何或所有这些气体的组合。同 样在制备充气微球体和微球体基泡沫时可使用各种氟化气 体化合物，如各种全氟化碳，氢氟化烃，以及六氟化硫气体。

不管由稳定化合物所制备的充气和气体前体的微球体 的要求，最好同样使用具有相当高稳定性的气体。高稳定性 气体是指那些选自在含水介质中具有低溶解性和扩散性的 气体。气体如全氟化碳具有较低的扩散性和相对不溶性，因 此在含水介质中更易稳定成气泡形式。

使用气体前体是一种任选的本发明方案。特别是已发现 全氟化碳适合用作气体前体。正如专业人员所认识到的，当 本发明中所用的微球体被首先形成时，已知的全氟化碳可被 用作气体前体，即为液态，或可直接被用作气体，即为气态， 以构成充气和气体前体微球体。当然，这样一种全氟化碳是 气体还是液体依赖于其液/气相变温度，或沸点。例如，较优 选的全氟化碳之一是全氟戊烷，其液/气相变温度或沸点为 27℃，这意味着在普通室温下此化合物为液体形式，但在人 体的环境下将变成气体，这是由于人体温度高于其液/气相 变温度或沸点。因此，在正常情况下，全氟戊烷为气体前体。 至于另外的实施例，有全氟丁烷和全氟己烷，它们为全氟戊 烷的最靠近的同系物。全氟丁烷的相变温度为4℃且全氟己 烷为57℃，使前者成为有效的气体前体，但可能作为气体更 有用，然而后者却不得不作为气体前体，但这是在独特情况 下，并且因为其高沸点的缘故。

本发明的另一方面是使用全氟化碳增加或增强所述充 气和气体前体微球体的稳定性，所述全氟化碳在本发明微球 体的使用温度下为液态。这种作为附加稳定剂有用的全氟化 碳包括全氟辛基溴(PFOB)，全氟萘烷，perfluorodo-decalin， 全氟辛基碘，全氟三丙胺，全氟三丁胺。通常，长度超过六个 碳原子的全氟化碳在正常人体温度下将不是气体，即非气 态，而是液体，即为液态。然而，这些化合物又可在制备本发 明中使用的稳定的/充气和气体前体微球体中使用。最好这 种全氟化碳是全氟己烷，其在室温下为液态。存在的气体可 以是如空气或氮气，或可由气体前体衍生得到，此气体前体 也可以是全氟化碳，如全氟戊烷。假使那样的话，本发明微球 体将由全氟化碳混合物制备，可给出的全氟化碳实例有全氟 戊烷和全氟己烷。据推理液体全氟化碳位于气体和微球体膜 表面间的界面上。从而在用于形成微球体的生物可容性类脂 的表面上形成全氟化碳稳定层，此全氟化碳层也可用于防止 气体扩散通过微球体膜。本发明范围之内的气体前体在制备 和/或贮藏的温度下为液体，但至少在使用时或使用期间变 成气体。

例如，已发现液体全氟化碳当与通常用于制备本发明的 微球体的气体结合时可以给予比单独使用气体另外得不到 的附加和程序稳定性。因此，在本发明范围内可以将全氟化 碳气体前体，如全氟戊烷与患者给用后仍保持液体的全氟化 碳一同使用，即与其液体至气体的相变温度高于患者体温的 全氟化碳一同使用。

任何生物溶性气体或气体前体均可用于形成稳定的充 气和气体前体微球体。“生物可容性”是指气体或气体前体导 入病人的组织内时将不会产生任何程度的不可接受的毒性， 包括变应原应答和疾病状态，并且最好为隋性。这样的一种 气体或气体前体也应当适于制备可用作本文中所述的局部 或皮下传递剂的充气和气体前体微球体和泡沫体。优选的生 物可容性气体是空气，氩气，氦气，氮气，氙气和氖气。最优选 的气体为空气，也可使用顺磁性气体或如17o的气体。

使用本文中所述的稳定化合物，充有气体和气体前体的 微球体变得更加稳定，然后可以调整微球体大小以适应特定 预期的局部或皮下施用的最后应用，不过在这一方面常常无 临界状态。在任何情况下，如果需要，充有气体和气体前体的 微球体的大小可通过一系列措施加以调节，这些措施包括微 乳化，涡旋，挤压，过滤，超声处理，均化，重复凝固和融化循 环，通过给定大小的微孔加压挤出，以及类似方法。

如上所述，相对于它们的制备，形成和用途，本发明的实 施方案还可包括被温度激活的气体前体。下面进一步列出了 一表，在该表中列出一系列液态至气态相变温度接近正常体 温(37℃)的气体前体和形成10微米最大尺寸的微气泡所需 乳化液滴的大小。

                               表1

                     气体前体的物理性质和形成

                    10μm微球体的乳化液滴的直径* 化合物 分子量  沸点  (℃)   密度 形成10微米微球体的 乳化液滴的直径(μm) 全氟戊烷 288.04   27.73  1.7326     2.9 1-氟丁烷 76.11   32.5  6.7789     1.2 2-甲基丁烷(异戊烷) 72.15   27.8  0.6201     2.6 2-甲基-1-丁烯 70.13   31.2  0.6504     2.5 2-甲基-2-丁烯 70.13   38.6  0.6623     2.5 2-甲基-1-丁烯-3-炔 66.10   34.0  0.6801     2.4 3-甲基-1-丁炔 68.12   29.5  0.6660     2.5 八氟环丁烷 200.04   -5.8  1.48     2.8 十氟丁烷 238.04   -2  1.517     3.0 六氟乙烷 138.01   -78.1  1.607     2.7 *来源：Chemical Rubber Company Handbook of Chemistry and Physics Robert C.Weast and David R.Lide，eds.CRC Press，Inc. Boca Raton，Florida(1989-1990).

下文列出了可能的气体前体目录，这些气体前体可用于 形成规定大小的微球体。然而，此目录并非限制性，因为有可 能使用其它气体前体实现此目的。其实，针对于各种不同施 用，实际上可使用任何液体来制备气体前体，只要它们处在 适当温度时能够发生向气相的相转移。在本发明中使用的适 用气体前体包括下述：六氟丙酮，异丙基乙炔，丙二烯，四氟 丙二烯，三氟化硼，异丁烷，1，2-丁二烯，2，3-丁二烯，1，3 -丁二烯，1，2，3-三氟-2-氯-1，3-丁二烯，2-甲基- 1，3-丁二烯，六氟代-1，3-丁二烯，丁二炔，1-氟-丁烷， 2-甲基丁烷，十氟代丁烷，1-丁烯，2-丁烯，2-甲基-1- 丁烯，3-甲基-1-丁烯，全氟代-1-丁烯，全氟代-2-丁 烯，4-苯基-3-丁烯-2-酮，2-甲基-1-丁烯-3-炔， 硝酸丁酯，1-丁炔，2-丁炔，2-氯-1，1，1，4，4，4-六氯丁 炔，3-甲基-1-丁炔，全氟代-2-丁炔，2-溴丁醛，羰基 硫化物，丁烯腈；环丁烷；甲基环丁烷；八氯环丁烷；全氟环丁 烯；3-氯环戊烯，八氟环戊烯，环丙烷，1，2-二甲基环丙烷， 1，1-二甲基环丙烷，乙基环丙烷；甲基环丙烷；联乙炔；3- 乙基-3-甲基二吖丙啶；1，1，1-三氟重氮乙烷；二甲胺；六 氟代二甲胺；二甲基乙基胺；二(二甲膦)胺；全氟己烷，2，3- 二甲基降冰片烷；全氟代二甲基胺；二甲基氧鎓氯化物；1，2 -二氧戊环-2-酮；4-甲基-1，1，1，2-四氟代乙烷；1，1， 1-三氟乙烷，1，1，2，2-四氟乙烷，1，1，2-三氯-1，2，2- 三氟乙烷，1，1-二氯乙烷；1，1-二氯-1，2，2，2-四氟乙 烷；1，2-二氟乙烷；1-氯-1，1，2，2，2-五氟乙烷；2氯- 1，1-二氟乙烷；1，1-二氯-2-氟乙烷，1-氯-1，1，2，2- 四氯乙烷；2-氯-1，1-二氟乙烷；氯乙烷；氯代五氟乙烷； 二氯三氟乙烷；氟乙烷；六氟乙烷；硝基-五氟乙烷；亚硝基 五氟乙烷；全氟代乙胺；乙基乙烯基醚；1，1-二氯乙烷；1，1 -二氯-1，2-二氟乙烷；1，2-二氟乙烷；甲烷；三氟化甲磺 酰氯；三氟化甲磺酰氟；溴化二氟化亚硝基甲烷；溴氟甲烷， 溴氯氟甲烷；三氟溴甲烷；硝基二氟氯甲烷；二硝基氯甲烷； 氟氯甲烷；三氟氯甲烷；二氟氯甲烷；二氟二溴甲烷；二氟二 氯甲烷；氟二氯甲烷；二氟甲烷；碘二氟甲烷；二硅烷醇甲烷； 氟甲烷；碘甲烷；三氟碘甲烷；三氟硝基甲烷；三氟亚硝基甲 烷；四氟甲烷；氟三氯甲烷；三氟甲烷；2-甲基丁烷；甲醚；甲 基异丙基醚；乳酸甲酯；亚硝酸甲酯；甲基硫化物；甲基乙烯 基醚；氖；新戊烷；氮气(N2)；一氧化二氮；1，2，3-十九碳烷 三羧酸-2-羟基三甲基酯；1-壬烯-3-炔；氧气(O2)；1，4 -戊二烯；正戊烷；全氟戊烷；4-氨基-4-甲基-2-戊酮； 1-戊烯，2-戊烯(顺)；2-戊烯(反)；3-溴代-1-戊烯；全 氟化-1-戊烯；四氯代邻苯二甲酸；2，3，6-三甲基哌啶；丙 烷，1，1，1，2，2，3-六氟代丙烷；1，2-环氧丙烷；2，2-二氟 丙烷；2-氨基丙烷；2-氯丙烷；1-硝基七氟丙烷；1-亚硝 基七氟代丙烷；全氟丙烷，丙烯，六氟丙烷；2，3-二氯-1，1， 1，2，3，3-六氟丙烷；1-氯丙烯；氯代丙烯(反)；2-氯代丙 烷；3-氟代丙烷；丙炔，3，3，3-三氟代丙炔；3-氟苯乙烯； 六氟化硫；十氟化二硫(S2F10)；2，4-二氨基甲苯；三氟乙腈； 三氟甲基过氧化物；三氟甲基硫化物；六氟化钨；乙烯基乙 炔；乙烯基醚；氩气。

正如前面早已指出那样，全氟化碳是用作气体前体以及 附加稳定组分的优选成分。这类全氟化碳成分包括饱和全氟 化碳，不饱和全氟化碳，以及环状全氟化碳。通常优选饱和全 氟化碳，它具有CnF2n+2分子式，其中n为1至12，优选2至 10，较优选4至8，且最优选5。适宜的饱和全氟化碳的实例 包括：四氟甲烷，六氟乙烷，八氟丙烷，十氟丁烷，十二氟戊 烷，全氟己烷，以及全氟庚烷。还优选具有CnF2n分子式的环 状全氟化碳，其中n为3至8，优选3至6，并且包括如六氟 环丙烷，八氟环丁烷和十氟环戊烷。

使用极限溶解性气体使微球体的功效最佳也是本发明 的一部分。术语“极限溶解性”是指气体在四周含水介质中凭 借其溶解性从微球体中扩散出的能力。在含水介质中的较高 的溶解性对微球体中的气体赋于了气压梯度，这样使得气体 具有从所述微球体中扩散出来的趋势。另一方面，在含水介 质中较低的溶解性会降低或削减微球体和界面之间的梯度， 这样使得气体从微球体中扩散出来将会受阻。优选包裹在微 球体中的气体具有比氧低的溶解度，即1份气体溶于32份 水中。参见Matheson Gas Data Book，1996，Matheson Company Inc.较优选包裹在微球体中的气体具有比空气要低的水中 溶解度；甚至更优选包裹中微球体中的气体包含具有比氮气 要低的水中溶解度的气体。

稳定化合物

使用一种或多种稳定化合物构成微球体，并确保后续的 气体或气体前体的包裹。甚至对于相对不溶性，不扩散性气 体，如全氟丙烷或六氟化硫，当在形成充有气体和气体前体 的微球体和任何形成的泡沫体过程中使用一种或多种稳定 化合物，可得到在各种活性剂的局部和皮下传递中使用的改 进微球体制品。相对于微球体的大小，形状和/或其它特性， 这些稳定化合物保持其稳定性和完整性。

本文中所用的术语“稳定”或“稳定的”意指在有用的时 间周期内由此所形成的微球体和/或泡沫体基本上是抗降解 的，即抗微球体结构或包裹的气体或气体前体损失。一般本 发明微球体和/或泡沫体具有良好的贮存期限，在正常环境 条件下在至少约二或三周期间内，常常能保持至少约90％ 原泡沫结构的体积。不过优选该期间为至少一个月，较优选 至少二个月，甚至更优选至少6个月，更进一步优选18个 月，且最优选三年。因此，充有气体和气体前体的微球体和泡 沫体一般具有令人满意的贮存期限，有时甚至在不利条件 下，如高于或低于那些在正常环境条件下所得到实践温度和 压力下也如此。

在本发明中使用的微球体和泡沫体的稳定性至少部分 可归于制备所述微球体和泡沫体的材料，并且常常没必要使 用附加稳定添加剂，尽管这种使用是任选的并且常常优选如 此使用，这类附加稳定剂及其特性下文中将给予更详尽描 述。构成本发明微球体的材料优选为生物可容性类脂或聚合 物材料，其中特别优选生物可容性类脂。此外，由于在给用之 前配制，即产生微球体或泡沫体能力的简单性，这些微球体 和泡沫体可以很方便地当场制备。

在制备本发明微球体中所用的类脂和聚合物是生物相 容的。“生物相容的”是在指类脂或聚合物导入到病人组织里 时，它们将不会产生任何程度的不可接受的毒性，包括变应 原应答和疾病状态。优选上述类脂或聚合物为隋性。

生物相容性类脂

对于生物相容性类脂材料，优选这类在自然界中常常被 称作“两亲的”类脂材料(即极性类脂)，它们是指一方面具有 亲脂性，即疏水性，而另一方面同时又具有亲水性的材料的 任一组分。

亲水基团可以是带电部分或其它对水具有亲合性的基 团。对制备本发明的稳定微球体有用的类脂的实例包括天然 和合成磷脂。它们包含带电磷酸盐“头部”基团，该基团是亲 水的，连接在疏水长碳链尾端。这种结构容许磷脂实现单双 层(单片层)排列，其中所有水不溶性烃端相互接触，留出多 电荷磷酸盐头部区自由与极性含水环境相互作用。容易认识 到一系列向心双层是可能的，即寡层和多层，并且这种排布 也构成了本发明的一个方面。形成这种双层排布的能力是本 发明中有用的类脂材料的一个特征。

另一方面类脂也可为单层形式，并且这种单层类脂可用 于形成单单层(单层)排列。另一方面，单层类脂也可用于形 成一系列向心单层，即寡层或多层，并且这种排列也被认为 是包括在本发明范围之内。

我们还发现获得在制备本发明的局部或皮下传递剂中 使用的稳定微球体的重要性，这些微球体可以在低于用作稳 定化合物的类脂的凝胶态至液晶态相变温度下制备。这种相 变温度是指类脂双层从凝胶态转变成液晶态的温度。例如参 见Chapman等人，J.Biol.Chem.1974，249，2512-2512。

一般认为，凝胶态至液晶态的相变温度越高，在给定温 度下则充气和气体前体微球体的气体不透性越好。参见 Derek Marsh，CRC Handbook of Lipid Bilayers(CRC Press，Boca Raton，FL 1990)，第139页，给出了饱和二酰基-Sn-甘油 基-3-胆碱磷酸的主链熔点转变。各种类脂的凝胶态至液 晶态的相变温度对本专业人员而言显然是显而易见的，例 如，见Gregoriadis，编辑的Liposome Technology，Vol.I1-18 (CRC Press，1984)中所列。下表中列出了某些代表性类脂和 其相变温度：

                     表2

           饱和二酰基-Sn-甘油基(3)

            胆碱磷酸主链相变温度*     酰基链中的碳原子     主要相变温度℃     1，2-(12：00)     1，2-(13：00)     1，2-(14：00)     1，2-(15：00)     1，2-(16：00)     1，2-(17：00)     1，2-(18：00)     1，2-(19：00)     1，2-(20：00)     1，2-(21：00)     1，2-(22：00)     1，2-(23：00)     1，2-(24：00)        -1.0        13.7        23.5        34.5        41.4        48.2        55.1        61.8        64.5        71.1        74.0        79.5        80.1 *Derek Marsh″CRC Handbook of Lipid Bilayers″CRC Press，Bo- ca Raton，Florida 1990 page 139.

己发现通过向用于形成充气和气体前体微球体的类脂 中掺入至少少量带负电荷的类脂，有可能提高本发明所用微 球体的稳定性，“至少少量”是指总类脂量的约1至10摩尔 百分比。适宜的负电类脂包括如磷脂酰丝氨酸，磷脂酸和脂 肪酸。这类负电类脂通过阻碍微球体一起融合而破裂的趋 势，可以提供附加稳定性，即负电类脂有助于在微球体外表 面上构成一均匀负电荷层，它将被其它微球体上类似的带电 外层所排斥。这样，可防止微球体彼此之间近距离接触，这种 接触常常导致有关微球体的膜或皮层破裂并且导致接触微 球体合并成单一较大的微球体。当然，这种合并过程的持续 将导致微球体和泡沫体显著降解。

用于构成微球体的类脂材料或其它稳定化合物还优选 为挠性的，在本申请中充有气体和气体前体的微球体的挠性 是指结构改变其形状以通过尺寸小于微球体的孔洞的能力。

在选择适合制备本发明稳定微球体的类脂时，发现各种 类脂均适于微球体的建造。任何本专业人员已知的适合脂质 体制备的材料或其组合均特别有用。所用的类脂可以是天然 的，合成的或半合成的。

可用于制备本发明所用的充气和气体前体微球体的类 脂包括但不限于：类脂如脂肪酸，溶血类脂类，具有饱和和不 饱和类脂的磷脂酰胆碱，它包括二油酰磷脂酰胆碱；二肉豆 蔻酰磷脂酰胆碱；二(十五烷酰)磷脂酰胆碱；二月桂酰磷脂 磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；二硬脂酰磷脂酰 胆碱(DSPC)；磷脂酰乙醇胺如二油酰磷脂酰乙醇胺和二棕 榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油；磷 脂酰肌醇；神经鞘脂类如神经鞘磷脂；糖基类脂如神经节苷 脂CM1和CM2；糖脂；硫苷脂；糖神经鞘脂；磷脂酸如二棕榈 酰磷脂酸；棕榈酸；硬脂酸；花生四烯酸；油酸；载有聚合物的 类脂，所述聚合物如聚乙二醇即PEGY化类脂，几丁质，透明 质酸或聚乙烯吡咯烷酮；载有磺化的单-，二-，寡-或聚糖 的类脂，胆甾醇；胆甾醇硫酸酯以及胆甾醇半琥珀酸酯；维生 素E半琥珀酸酯，含有通过醚和酯连结的脂肪酸的类脂，聚 合类脂本领域技术人员所公知的各种类脂，二乙酰基磷酸 酯，二鲸蜡基磷酸酯，十八烷胺(stearylamine)，心磷脂，含有 链长为6-8个碳原子的短链脂肪酸的磷脂，具有不对称酰 基链的合成磷脂(如一条为6碳原子酰基链而另一条为12 碳原子酰基链的合成磷脂)，神经酰胺，非离子类脂包括nio- somes如聚氧乙烯脂肪酸酯，聚氧乙烯脂肪醇，聚氧乙烯脂肪 醇醚，聚氧乙烯化脱水山梨醇脂肪酸酯，聚羟基硬脂酸乙二 醇甘油酯(glycerol polyethyene glycol oxystearate)，聚蓖麻油 酸乙二醇甘油酯，乙氧化大豆甾醇，乙氧化蓖麻油，聚氧乙烯 聚氧丙烯聚合物以及聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯；甾醇脂肪酸 酯包括硫酸胆甾醇酯，丁酸胆甾醇酯，异丁酸胆甾醇酯，棕榈 酸胆甾醇酯，硬脂酸胆甾醇酯，乙酸羊毛甾醇酯，棕榈酸麦角 甾醇酯，以及正丁酸植物甾醇酯；甾醇的糖酸酯包括葡糖苷 酸胆甾醇酯，葡糖苷酸羊毛甾醇酯，葡糖苷酸7-脱氢胆甾 醇酯，葡糖苷酸麦角甾醇酯，葡糖酸胆甾醇酯，葡糖酸羊毛甾 醇酯，和葡糖酸麦角甾醇酯；糖酸和醇形成的酯包括葡糖苷 酸月桂酯，葡糖苷酸硬脂基酯(stearoyl glucuronide)，葡糖苷 酸十四烷酯((stearoyl glucuronide)，葡糖酸月桂酯，葡糖酸十 四烷酯，以及葡糖酸十八烷酯；糖与脂肪酸形成的酯包括蔗 糖月桂酸酯，果糖月桂酸酯，蔗糖棕榈酸酯，蔗糖硬脂酸酯， 葡糖醛酸，葡糖酸，accharic acid，以及多糖醛酸；皂草苷包括 萨洒皂草配基，菝葜配基，常春配基，石竹素，和毛地黄毒苷 配基；甘油二月桂酸酯，甘油三月桂酸酯，甘油二棕榈酸酯， 甘油和甘油酯包括甘油三棕榈酸酯，甘油二硬脂酸酯，甘油 三硬脂酸酯，甘油二肉豆蔻酸酯，甘油三肉豆蔻酸酯，长链醇 包括正癸醇，月桂醇，肉豆蔻醇，鲸蜡醇，以及十八烷醇；6- (5-胆甾烯-3β-基氧基)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖 苷；二半乳糖二甘油酯；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)-6- 氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；6-(5胆 甾烯-3β-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-α -D-吡喃甘露糖苷，12-(((7′-二乙基氨基香豆素-3- 基)羰基)甲氨基)十八烷酸；N-[12-(((7′-二乙基氨基香 豆素-3-基)羰基)甲氨基)十八酰基]-2-氨基棕榈酸；4′ -三甲铵基丁酸胆甾烯酯；N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇 胺；1，2-二油酰-Sn-甘油；1，2-二棕榈酰-Sn-3-琥珀 酰甘油；1，3-二棕榈酰-2-琥珀酰甘油；1-十六烷基-2 -棕榈酰甘油磷酰乙醇胺以及棕榈酰高半胱氨酸，和/或它 们的结合。

如果需要，可使用各种阳离子类脂如DOTMA，N-[1- (2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵； DOTAP，1，2-二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷；和DOTB， 1，2-二油酰基-3-(4′-三甲基铵基)丁酰基-Sn-甘油。 一般而言，脂质体中阳离子类脂与非阳离子类脂的摩尔比可 以是如1∶1000，1∶100，优选在2∶1至1∶10之间，较优 选在1∶1至1∶2.5之间，且最优选为1∶1(阳离子类脂的 摩尔量与非阳离子类脂摩尔量之比，例如DPPC)。当阳离子 类脂用于构成微球体时，各种脂类可由非阳离子类脂组成。 这种非阳离子类脂优选为二棕榈酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷 脂酰乙醇胺或二油酰磷脂酰乙醇胺。代替上述阳离子脂类， 带有阳离子聚合物如多熔素或聚精氨酸的脂类，以及膦酸烷 基酯，次磷酸烷基酯，和亚磷酸烷基酯也可被用于构成微球 体。

最优选的脂类为磷脂，优选DPPC，DPPE，DPPA和 DSPC，且最优选DPPC。

此外，可用于制造本发明中使用的稳定微球体(为充有 气体和气体前体的混合微泡形式)的饱和和不饱和脂肪酸的 实例可包括最好含有12至22个碳原子的直链或支链形式 的分子。也可使用由类异戊二烯单元组成和/或含异戊二烯 基的烃基。适宜的饱和脂肪酸实例包括(但不限于)月桂酸， 肉豆蔻酸，棕榈酸，以及硬脂酸；可使用的不饱和脂肪酸的实 例包括(但不限于)月桂烯酸，抹香鲸酸，肉豆蔻脑酸，棕榈油 酸，6-十八烯酸，以及油酸；可用的支链脂肪酸的实例包括 (但不限于)异月桂酸，异肉豆蔻酸，异棕榈酸，以及异硬脂 酸。除饱和和不饱和基团外，充有气体和气体前体的混合球 泡也可由5碳类异二烯和含异戊二烯的基团构成。 生物相容性聚合物

用作制备本发明充气和气体前体微球体的稳定化合物 的生物相容性聚合物可以是天然的，半合成的或合成的。此 处术语“聚合物”表示由两个或多个重复单体单元，优选10 个或更多个重复单体单元组成的化合物。此处术语“半合成 聚合物”是指在某些方面被化学改性的天然聚合物。适于本 发明使用的典型天然聚合物包括天然存在的多糖。这类多糖 包括如阿聚糖，果聚糖，呋喃聚糖(fucans)，半乳聚糖，聚半乳 糖醛酸，葡聚糖，甘露聚糖，木聚糖(如葡糖)，左聚糖，岩藻依 聚糖，角叉菜胶，galatocarolose，果胶酸，果胶酶，直链淀粉，茁 霉多糖，糖原，支链淀粉，纤维素，右旋糖酐，石脐素，几丁质， 琼脂糖，角质素，软骨素，皮肤素，透明质酸，藻酸，吨胶， 淀粉和各种不同的天然均聚物或杂聚物如那些含有一种或 多种下述醛糖，酮糖，酸或胺的聚合物：赤藓糖，苏糖，核糖， 阿糖，木糖，来苏糖，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛 糖，艾杜糖，半乳糖，塔罗糖，赤藓酮糖，核酮糖，木酮糖，阿洛 酮糖，果糖，山梨糖，塔洛糖，甘露醇，山梨糖醇，乳糖，蔗糖， 海藻糖，麦芽糖，纤维二糖，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨 酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精 氨酸，组氨酸，葡萄糖醛酸，葡萄糖酸，葡萄糖二酸，半乳糖醛 酸，甘露糖醛酸，葡萄糖胺，氨基半乳糖，和神经氨酸，以及它 们天然存在的衍生物。典型的半合成聚合物包括羧甲基纤维 素，羟甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，甲基纤维素，和甲氧 基纤维素。典型的适合在本发明中使用的合成聚合物包括聚 乙烯类(如聚乙二醇，聚氧乙烯，及聚对笨第二甲酸乙酯)，聚 丙烯类(如聚丙二醇)，聚亚胺酯(如聚乙烯醇(PVA)，聚氯乙 烯和聚乙烯吡咯烷酮)，包括尼龙的聚酰胺，聚苯乙烯，聚乳 酸，氟代烃，氟化碳(如聚四氟乙烯)，和聚甲基丙烯酸甲酯， 以及它们的衍生物。本专业人员一旦掌握了本申请内容，结 合本申请和本专业公知的资料，如见Unger的美国专利5, 205,290中所述内容(此文献内容可全部并入本文用作参 考)，制备这种聚合物基微球体的方法就变得十分显然。 其它和辅助稳定化合物

使用除上面所述的生物相容性类脂和聚合物之外的物 质成分制备稳定的充气和气体前体微球体也是本发明的一 部分，其条件是如此制备的微球体满足本文所述的稳定性和 其它要求。这些成分可以是基础和基本的，即形成产生制备 充气和气体前体微球体的主要基料。另一方面，它们可以是 辅助性的，即作为辅助或增补剂，它们能增强基本稳定化合 物的作用，或者能另外提供一些除基本稳定化合物所提供的 特性之外的所需性质。

然而，很难确定所给定的化合物是基本化合物还是辅助 剂，这是由于所述化合物的作用是由根据生成稳定微球体所 产生的结果来实验确定。作为这些基本和辅助化合物怎样起 作用的实例，已观察到摇动生物相容性类脂和水或生理盐水 进行简单结合常常得到混浊溶液，随后高压灭菌。这种混浊 溶液可以起局部或皮下传递剂的作用，但美学上是令人讨厌 的并且具有呈不溶或不扩散类脂颗粒形式的不稳定性。因 此，可加入丙二醇通过促进类脂颗粒的溶解或扩散来除去混 浊。丙二醇也起着增稠剂的作用，通过增加微球体膜或表层 的表面张力，可以改进微球体的形成及稳定作用。有可能丙 二醇进一步起着附加层的作用，该层包衣微球体的膜或表 层，因此提供了附加稳定性。

有关其它这类基本或辅助稳定化合物的实例，可使用常 规表面活性剂；参见D′Arrigo的美国专利4,684,479和5, 215,680。

另外的辅助和基本稳定化合物包括这类物质如花生油， Canola oil，橄榄油，红花油，玉米油，或任何其它通常已知的 并且按照本说明书中所列出的要求及说明，适宜用作稳定化 合物的食用油(ingestible oil)。

此外，用于制备混合胶束体系的化合物也适于用作基本 或辅助稳定化合物，这些包括(但不限于)：月桂基三甲基溴 化铵(十二烷基-)，鲸蜡基三甲基溴化铵(十六烷基-)，肉 豆蔻基三甲基溴化铵(十四烷基-)，烷基二甲基苄基氯化铵 (烷基＝C12，C14，C16)，苄基二甲基十二烷基溴/氯化铵，苄基 二甲基十六烷基溴/氯化铵苄基二甲基十四烷基溴/氯化铵， 鲸蜡基二甲基乙基溴/氯化铵，或鲸蜡基溴/氯化吡啶鎓。

已发现通过选择不同的本申请中所述的附加或辅助稳 定剂，可以控制本发明中所用的充气和气体气体微球体的大 小，溶解性和热稳定性。这些稳定剂不仅通过它们与类脂涂 层的物理作用，而且也通过它们改进充有气体和气体前体的 微球体的粘性和表面张力的能力来影响微球体的这些参数。 因此，本发明所用的充气和气体前体微球体可通过加入一或 多种下述种种成分被适当改进并且被时一步稳定：(a)粘度 调节剂，包括(但不限于)碳水化合物及其磷酸化和磺酸化衍 生物；以及聚醚类，优选分子量在400和100,000之间的聚 醚；二-和三-羟基烷烃及其聚合物，优选具有200和50, 000之间分子量的；(b)乳化剂和/或加溶剂也可与类脂结合 使用，此得到理想的改良和进一步的稳定作用；这类物质包 括(但不限于)阿拉伯胶，胆甾醇，二乙醇胺，甘油单硬脂酸 酯，羊毛脂醇，卵磷脂，单-和二-甘油酯，单乙醇胺，油酸， 油醇，Poloxamer(如，Poloxamer 188，Poloxamer 184和Polox- amer 181)，硬脂酸聚氧乙烯50，聚烃氧基35蓖麻油，聚烃氧 基10油醚，聚烃氧基20cetosteary(醚，聚烃氧40硬脂酸酯， 聚山梨酸酯20，聚山梨酸酯40，聚山梨酸酯60，聚山梨酸酯 80，丙二醇二乙酸酯，丙二醇单硬脂酸酯，十二烷基硫酸钠， 硬脂酸钠，脱水山梨醇单月桂酯，脱水山梨醇单油酸酯，脱水 山梨醇单棕榈酸酯，脱水山梨醇单硬脂酸酯，硬脂酸，三乙醇 胺(trolamine)和乳化蜡；(c)可以与类脂一同使用的悬浮剂 和/或粘度增加剂包括(但不限于)阿拉伯胶，琼脂，藻酸，单 硬脂酸铝，膨润土，岩浆，聚羧乙烯制剂934P，羧甲基纤维 素，钙及钠和钠12，角叉菜胶，纤维素，糊精，明胶，瓜耳树 胶，刺槐豆胶，硅酸镁铝，羟乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素， 硅酸铝镁，甲基纤维素，果胶，聚环氧乙烷，聚烯吡酮，丙二醇 藻酸酯，二氧化硅，藻酸钠，黄蓍胶和黄原胶，α-d-葡萄酸内 酯，甘油，甘露糖醇，(d)还可被使用的合成悬浮剂，如聚乙二 醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，聚丙二 醇，以及多乙氧基醚；以及(e)还可包括，张力提高剂；这些试 剂包括(但不限制)山梨糖醇，丙二醇及甘油。

本发明的优选方案包括微球体和泡沫体，其中形成稳定 充气和气体前体微球体的稳定化合物包括三种组分；(1)天 然(如非离子或两性离子)类脂，(2)负电类脂，及(3)载有亲 水聚合物的类脂。优选所述负电类脂的量大于所存在的总类 脂量的百分之一摩尔，且载有亲水聚合物的类脂的量大于所 存在的总类脂量的百分之一摩尔。同样优选的是所述负电类 脂为磷脂酸，载有亲水聚合物的类脂最好与所述聚合物共价 结合，且所述聚合物优选具有约400至100,00平均分子量。 上述亲水聚合物优选选自：聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯醇， 和聚乙烯吡咯烷酮以及它们的共聚物。当亲水聚合物为聚乙 二醇时，载有这种聚合物的类脂被称为“PEG化”类脂，此处 涉及聚乙二醇的缩写：“PEG”。上述载有亲水聚合物的类脂 优选为二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(即具有约 5000平均分子量的聚乙二醇)；或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇5000。

本发明所设计的微球体和泡沫体基局部和皮下传递剂 的优选产品包含约77.5摩尔百分比二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)，12.5摩尔百分比二棕榈酰磷脂酸(DPPA)，和10摩 尔百分比二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-5000(DPPE/ PEG5000)，即具有5000平均分子量的聚乙二醇。同样也优 选相应地以82/10/8摩尔百分比率存在的这些组合。DPPC 组分实际上是中性的，因为磷脂酰部分为负电性的而胆碱部 分则为正电性的。因此，按照上述有关负电性类脂作为附加 剂的机理，可加入带负电荷的DPPA组分提高稳定性。第三 种组分DPPE/PEG提供了DPPE部分连结在类脂膜上或微 球体表层上且PEG部分不受约束地围绕着微球体膜或表层 的PEG化材料，因此这种材料对体内的各种酶促剂和其它 内生剂构成了物理屏障，这些酶促和其它内生剂在体内的作 用是降解这类外来物质。由于PEG化材料的结构类似于水， 还推测它能使人免疫系统巨噬细胞的作用失效，否则人免疫 系统的巨噬细胞将趋于包围和除去外来物质。结果使稳定微 球体起着泡沫局部和皮下传递剂作用的时间增加。

含水稀释剂

如上早已描述的那样，当微球体为天然，特别是双层类 脂时，稳定微球体的基本组成为某些种类含水环境，这种环 境诱导类脂(由于其疏水/亲水性质)形成微球体(这种环境 中可得到的最稳定构型)。可用于产生这种含水环境的稀释 剂包括(但不限于)水，可以是脱离子的或含有任何数量的溶 解盐，它们将不会干扰稳定微球体的产生和保持或影响它们 作为局部和皮下传递剂的应用；以及常规盐水和生理盐水。

活性成分

本发明提供了充有气体和气体前体的微球体以及利用 这些微球体向患者的选定组织局部或皮下传递任何一种或 多种各类活性成份的方法。这里使用一般术语“活性成分”是 为了包括各种可使用的功能不同的物质种类。正如此处所用 的那样，对于术语“活性成分”，意指能提供治疗或化妆效果 的化合物或组合物。例如，除各种治疗剂(如药物)可被使用 外，还包括大量被认为是美容剂的治疗剂，利用本发明的微 球体或泡沫体，上述美容剂可被局部经皮下施用。这些包括 (但对本发明无任何有目的的限制)各种维生素和其它具有 皮肤滋补和抗皱性能的物质，防晒和驱虫剂。本专业人员不 难认识到本发明组合物中所用活性成分的有效量将根据下 列因素而变化，如给用本发明组合物患者的年龄，体重及性 别，进行给用的方式(局部，皮下；有/无贮藏)，所计划的特殊 疗法，化妆法或其它用法，以及所企图得到的理想治疗效果， 化妆效果或其它效果。一旦了解掌握了前述内容，本专业技 术人员很容易确定欲使用的活性成分的有效量。

也可以设计微球体以使活性成分分布在微球体的内部 和/或外部。这种分布既可以在内部又可以在外部，并且可以 是平衡的或不平衡的。

选择或修饰活性成分的特殊化学结构以得到理想的溶 解性，这样活性成分可以包裹在微球体的充有气体和气体前 体的内部空间内，连结在微球体的外部(共价连结或相反)啮 合在微球体的壁上，或简单与微球体结合(即非包裹或连 接)。例如，表面键连的活性成分可载有一个或多个酰基链， 当通过局部施用，加热，或经通过施用超声波，微波，光，或磁 感应能所产生的气蚀使微球体破裂时(见下面更详尽的描 述)，酰化活性成分然后脱离表面和/或活性成分可从如其所 键合的化学基团的酰基链上裂去。类似地，其它活性成分可 与疏水基团如芳香结构或甾醇结构的基团结合以使它们插 入到微球体的外表层或膜中。

美容剂

适用于本发明充气和气体前体且最好适合它们的各种 类型化妆组合物，其中包括美容膏，软膏，皮肤柔软剂，凝胶， 胭脂(blush)，睫毛膏，染眉毛油，痤疮药，冷霜，清洁霜，和润 滑泡沫剂(oleaginous foam)，可结合到本发明微球体和泡沫 体内的美容剂包括(但不限于)：维生素A，维生素C，维生素 D，维生素E，维生素K，β-胡萝卜素，胶原，弹性蛋白，视黄 酸，棕榈酸视黄醇酯，芦荟(aloe vera)，羊毛脂，透明质酸，及 核苷。

充有气体和气体前体的微球体十分适于传递防晒剂至 选定组织上。这类防晒剂包括(但不限于)：4％水杨酸苄酯和 肉桂酸苄酯(各2％)；5％对氨苯甲酸异丁酯；5％二烯丙基 三油酸酯；2.5％对-氨基苯甲酸单甘油酯；4％丙二醇对氨基 苯甲酸酯；以及其它光吸收化合物。

治疗剂

利用本发明微球体可被局部或皮下施用到患者选定组 织的治疗剂包括抗真菌剂，如酮哌噁咪唑，刺霉菌素，灰黄霉 素，氟胞嘧啶(5-fc)，双氯苯咪唑，和两性霉素B；激素，如生 长激素，促黑激素，雌二醇，二丙酸氯地米松，倍他米松，醋酸 倍他米松和倍他米松磷酸酯钠，维他米松(vetamethasone)磷 酸酯二钠，维他米松磷酸酯钠，醋酸可的松，地塞米松，醋酸 地塞米松，磷酸钠地塞米松，9-去氟肤轻松，氢化可的松，醋 酸氢化可的松，氢化可的松环戊丙酸酯，氢可松磷酯钠，琥钠 氢可松，甲强龙，醋酸甲强龙，琥钠甲强龙，醋酸对氟米松，强 的松龙，强的松龙乙酸酯，强的松龙磷酸酯钠，强的松龙叔丁 乙酯，强的松，去炎松，丙炎松，双醋去炎松，己酸丙炎松和乙 酸氟氢可的松；维生素如维生素B12，视黄酸类和如棕榈酸维 生素A的衍生物，以及α-生育酚；肽，如二氧化锰歧化酶；酶 如碱性磷酸酶；抗过敏剂如amelexanox；阻凝剂如苯丙香豆 素和肝素；抗结核药如对-氨水杨酸，异烟肼，卷曲霉素硫酸 环丝氨素，乙酸乙胺丁醇乙硫异烟胺，吡嗪酰胺，利福平和硫 酸链霉素；抗病毒剂如无环鸟苷，金刚烷胺，叠氮胸苷(AZT 或Zidovudine)，三唑核苷和阿糖腺苷水合物(阿糖腺苷，ara- A)；抗生素，如氨苯砜，氯霉素，新霉素，头孢氯，头孢羟氨 苄，头孢氨苄，头孢环己烯红霉素，氯林可霉素，林可霉素，羟 氨苄青霉素，氨苄青霉素，氨苄青霉素碳醋，羧苄青霉素，双 氯青霉素，环青霉素，氯苯唑青霉素(picloxacillin)，缩酮氨苄 青霉素，甲氧苯青霉素，乙氧萘青霉素，苯唑青霉素，青霉素 G，青霉素V，羧噻酚青霉素利福平和四环素；消炎药，如二 氟苯水杨酸，异丁苯丙酸，消炎痛，甲氮灭酸酯，甲灭酸，甲氧 萘丙酸，羟基保泰松，保泰松，吡氧噻嗪，苏灵大，甲苯酰吡 酸，阿司匹林和水杨酸盐；抗原生动物剂如氯喹，羟氯喹，甲 硝哒唑，奎宁和锑酸葡胺；局部麻醉药如盐酸丁哌卡因，盐酸 氯普鲁卡因，盐酸衣铁卡因，盐酸利多卡因，盐酸甲哌卡因， 盐酸普鲁卡因和盐酸丁卡因；生长因子，如表层生长因子 (EGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，碱性成纤维细胞 生长(bFGF)，胰岛素样生长因子(IGF)I型和II型，神经生 长因子(NGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，干细胞因子 (SCF)和α-族系或β-族系转化生长因子(TFG)；心血管药如 氯压定，萘心，利多卡因，硝吡胺甲酯和硝酸甘油；利尿剂如 甘露醇和脲；以及放射性颗粒或离子如锶，碘，铼和镱；以及 其它药物如东茛菪碱，烟碱，烟酸甲酯，mechlorisone dibu- tyrate，烯丙羟吗啡酮，甲醇，咖啡因，水杨酸和4-氰基苯酚。

另外，这些微球体特别适于将肽类传递到选定的组织。 作为不欲限制本发明范围的例子，下述肽类可被掺入微球体 和泡沫中以供局部或皮下施用和传递：黑色素浓缩激素、黑 色素刺激激素、胰蛋白酶抑制剂、Bowman Burk抑制剂、黄体 化激素释放激素(LHRH)、韩蛙皮素、缩胆囊素、胰岛素、促 胃液素、内啡肽、脑啡肽、生长激素、催乳素、后叶催产素、滤 泡刺激激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激 素、β和促脂素、降钙素、胰高血糖素、促甲状腺激素、弹性硬 蛋白、环胞酶素和胶原。另外也可使用上述肽类的所有可用 的拮抗剂，而且可使用如透明质酸、肝素和硫酸肝素的因子。

在某些优选的实施方案中，治疗剂为单克隆抗体，如能 与黑瘤抗原结合的单克隆抗体。这种单克隆抗体也可被用于 击靶其它治疗剂，它们相互结合以形成加合物或复合物。使 用单克隆抗体很精确的公认特性有利于将其结合的治疗剂 运送剂治疗剂将发挥作用的特殊位点。例如这种击靶在恶性 肿瘤的化学疗法中十分有用，该疗法中化学治疗剂的毒性使 其不能以高浓度在全身使用。

其它优选的治疗剂包括天然或合成来源的基因物质，如 核酸，RNA和DNA，包括重组RNA和DNA以及反义RNA 和DNA。可以使用的基因物质的种类包括，例如表达载体 (如质粒、噬菌粒、粘粒、酵母人工染色体(YACs)以及缺损或 辅助病毒)上携带的基因、反基因核酸，单链及双链RNA和 DNA以及它们的同系物，如硫代磷酸、氨基磷酸和二硫代磷 酸寡脱氧核苷酸。另外，基因物质也可与例如蛋白质或其它 多聚体组合。

使用本发明微球体和泡沫体所施用基因治疗剂的分子 包括编码至少一部分HLA基因的DNA、编码至少一部分肌 营养不良蛋白的DNA、编码至少一部分CFTR的DNA、编码 至少一部分IL-2的DNA、编码至少一部分TNF的DNA、能 与编码至少一部分Ras的DNA结合的反义寡核苷酸。

可使用编码某些蛋白质的DNA来治疗多种不同类型的 疾病。例如，提供腺苷脱氨酶可治疗ADA缺损；提供肿瘤坏 死因子和/或白细胞介素-2可治疗晚期癌症；提供HDL受体 可治疗肝脏疾病；提供胸苷激酶可治疗卵巢癌、脑肿瘤或 HIV感染；提供HLA-B7可治疗性黑素瘤；提供白细胞介素- 2可治疗成神经细胞瘤、恶性黑素瘤或肾癌；提供白细胞介 素-4可治疗癌症；提供HIV env可治疗HIV感染；提供反义 ras/p53可治疗肺癌；提供因子VIII可治疗血友病B。例见 Thompson、L.，Science，1992，258，744-746。

可使用反义肽类和反义寡核苷酸以局部或皮下施用并 传递到选定的组织。例如，使用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的反义序列可治疗选定组织中的瘢痕疙瘩。可灭活、 即关闭炎症反应所涉及内源细胞因子之串联反应的反义肽 类是本发明范围内局部或皮下药物传递的另一个例子。局部 和皮下施用充满气体和气体前体的微球体和泡沫的其它应 用包括，例如编码黑素细胞刺激激素活性的基因可处理包括 色素过低症(如白斑或白化病)的皮肤病。另外，局部或皮下 施用编码黑色素浓缩激素活性的基因可治疗包括色素过高 症(如“Cafe Aulait”斑点)的疾病，或者也能从选定组织中除 去色素过高的区域，例如“痣”或“美人斑”。

另外，具有膜跨越能力的肽类似物或者如环孢菌素和新 霉素的成孔肽可被掺入充满气体和气体前体的微球体中以 作为抗生素软膏和免疫抑制剂局部或皮下施用。还可使用 N-末端为脂肪链或环酰基链的肽类以增强其它肽类或活性 成分的释放。而且，侧链酰基化类似物或N-甲基氨基酸类似 物也可被掺入这些肽类中以使它们更具亲脂性，从而便于药 物的释放。

局部或皮下施用充满了气体和气体前体的微球体的其 它应用包括局部或皮下释放螯合剂和可螯合的试剂以治疗 对螯合剂处理敏感的多种疾病，例如牛皮癣和牛皮癣损害以 及Wilson氏病。适当的螯合剂和螯合的试剂包括，但不局限 于：青霉胺；柠檬酸盐；抗坏血酸；二亚乙基三胺五乙酸(DT- PA)及其衍生物和盐类；二羟基丙基亚乙基二胺(DPEA)及 其衍生物和盐类；环己二胺四乙酸(CHTA)及其衍生物和盐 类；亚乙基二胺四乙酸(EDTA)及其衍生物和盐类；乙二醇双 乙胺醚-N，N′-四乙酸(EGTA)及其衍生物和盐类；EHDP (etidronic acid)及其衍生物和盐类；二甲基亚砜(DMSO)及其 衍生物和盐类；二吡啶氧基亚乙基二胺二乙酸二磷酸 (DPDP)及其衍生物和盐类；N，N′-(1，2-乙烷二乙烯基二(氧 基-2，1-亚苯基))二(N-(羧甲基))(BAPTA)及其衍生物和盐 类；氨基苯酚-三乙酸(APTRA)及其衍生物和盐类；四(2-吡 啶甲基)亚乙基二胺(TPEN)及其衍生物和盐类；1，4，7，10- 四氮杂环癸烷及其衍生物和盐类；花青苷及其衍生物。

另外，免疫抑制剂或抗炎症制剂可被掺入本发明充满气 体和气体前体的微球体中并在骨关节附近被局部或皮下施 用以治疗由大量炎症和自身免疫疾病(例如如风湿性关节炎 或变性关节病的关节疾病)中的任何一种所引起的疼痛、炎 症和其它症状。

如有必要，可利用使用本发明微球体或泡沫的一种以上 的治疗剂。例如，单个微球体可含有一种以上的治疗剂，或者 可同时施用含有不同治疗剂的微球体。作为例子，可同时施 用能与黑素瘤抗原结合的单克隆抗体以及编码至少一部分 IL-2的寡核苷酸，本文所用的短语“至少一部分”是指寡核苷 酸无需表示完整的基因，只要所表示的那部分基因对基因表 达提供有效片断即可。

前药

类似地，前药可被包裹在微球体中，它也在本文所用术 语“治疗剂”所包括的范围中。前药是本技术领域中熟知的， 它包括无活性的药物前体，当氧气或其它气体存在时，将前 药暴露于高温或不同pH，代谢化酶、空腔化作用和/或压力 下，或者当前药从微球体中释放时会形成活性药物。在本发 明方法中，通过对含有前药的微球体施用超声或放射频率的 微波能量，结果产生了空腔化作用，被加热、加压和/或从微 球体中释放出来，从而使这种前药从充气的微球体中被活化 或被释放。合适的前药对于本技术领域熟练人员而言是显而 易见的，例见Sinkula等人的描述(J.Pharm.Sci.1975，64， 181-210)，此文献已全文列入本文的参考文献中。

例如，前药可包含活性治疗剂的无活性形成，其中化学 基团出现在前药上使其变得无活性和/或赋予药物可溶解性 或其它一些特性。但是一旦通过加热，pH变化，空腔化作用， 压力和/或通过周围环境中的酶或其它使化学基团从前药上 裂解下来，即可产生活性药物。这种前药在本技术领域中已 被详细描述，并包括很多通过化学键如短、中或长链脂族碳 酸的酯，有机磷酸，焦磷酸，硫酸的半酶，酰胺，氨基酸，偶氮 键，氨基甲酸酯，磷酰胺，葡糖苷酸酯，N-乙酰基葡糖胺和β- 葡糖苷连接到化学基团上的药物。

带母体分子和可逆变或键的治疗剂的分子如下：带缩酮 的铃兰毒，带烷基酯的海因，带甘氨酸或丙氨酸酯的chlor- phenesin，带咖啡因配合物的醋氨酚(acetaminophen)，带 THAM盐的乙酰基水杨酸，带乙酰氨基苯基酯的乙酰基水杨 酸，带硫酸酯的纳洛酮，带甲基酯的15-甲基前列腺素F2α，带 聚乙二醇的普鲁卡因、带烷基酯的红霉素，带烷基酯或磷酸 酯的氯林肯霉素，带甜苯碱盐的四环素，带环取代的酰氧苄 基酯的7-酰氨基头孢菌素，带菜基丙酸癸酸酯的诺龙，带烯 醇醚乙缩醛的雌甾二醇，带乙酸酯的甲基脱氢皮质甾醇，带 n-乙酰基氨基葡糖苷葡糖苷酸(三甲基甲硅烷基)醚的睾酮， 带21-磷酸酯的可的松或脱氢皮质甾醇或地塞米松。

前药也可设计成可逆的药物衍生物并用作修饰体以促 进药物输送到特定位置的组织。母体分子带影响输送到特定 位置的组织和促进治疗效果的可逆变体或键例子包括带卤 代烷基硝基脲的异氰酸酯，带丙酸酯的睾酮，带二烷基酯的 氨甲蝶呤(3-5′-二氯氨甲蝶呤)，带5′-酰化的胞嘧啶阿拉伯 糖苷，氮芥子气(2，2′-二氯-N-甲基二乙胺)，带氨甲基四环 素的氮芥子气，带胆甾醇或雌甾二醇或脱氢表雄甾酮酯的氮 芥子气和带偶氮苯的氮芥子气。

如本专业技术人员认识到的，修饰给定的治疗剂的特定 化学基团可被选定以影响治疗剂分配到微球体的外皮或膜 内，或微球体的内部空间或空腔内。选作将化学基团键连到 治疗剂上的化学键可选择具有所需代谢速率，例如，在脂键 的情况下，在从气体和气体前体填充的微球体释放后，在血 清酯酶存在下水解。另外，特定的化学基团可选择影响用于 气体和气体前体填充的，带治疗剂的本发明微球体中的治疗 剂，例如，用于卵巢腺癌的带环状磷酰胺的N，N-二(2-氯乙 基)-二氨基磷酸的生物分布。

另外，用于气体和气体前体填充的微球体内的前药可被 设计成含有被用作活性延续时间接修饰体的可逆衍生物以 延长或积存作用效果。例如，烟酸可用葡聚糖和羧甲基葡聚 糖酯修饰，链霉素用藻酸盐，二氢链霉素用pamoate盐，cy- tarabine(ara-c)用5′-金刚烷酸酯，ara-腺苷(ara-A)用5′-棕 榈酸和5′-苯甲酸酯，两性霉素B用甲基酯类，睾酮用17-β -烷基酯类，雌甾二醇用甲酸酯，前列腺素用2-(4-咪唑 基)乙胺盐，多巴胺用氨基酸酰胺，氯霉素用一和二(三甲基 甲硅烷基)醚类，而cycloguanil用pamoate盐修饰。在此形式 中，长效药的积存或储存可以从气体和气体前体填充的带前 药的微球体中体内释放。

另外，一般性热不稳定的化合物可被用作产生毒性自由 基可用于，例如，化疗的化合物。带有高温分解的偶氮键，过 氧化物和二硫键的化合物是优选的。对于这种形式的前药， 含偶氮，过氧化物或二硫键的化合物通过空化和/或由高解 声波与气体和气体前体填充的微球体的相互作用产生的热 量增加而活化，从捕集在里面的这些前药产生自由基串。很 多药物或化学药品可组成这些前药，如偶氮化合物，这类化 合物一般结构是R-N＝N-R，其中R是烃链，其中两个氮 原子间的双键可在体内反应产生自由基产物。

可被用于产生自由基产物的例子性药物或化合物包括 含偶氮的化合物如偶氮苯，2，2′-偶氮双异丁腈，偶氮二碳 酰胺，石蕊精，氮霉素，azosemide，偶氮磺酰胺，氧化偶氮苯， azrteonam，苏丹III，sulfachrysoidine，sulfamidochrysoidine和sul- fasalazine，含二硫键的化合物如sulbentine，硫胺素二硫化物， 硫藤黄菌素，二硫化四甲秋兰姆，含过氧化物的化合物如过 氧化氢和过氧化苯甲酰，2，2′-偶氮双异丁腈，2，2′-偶氮 双(2-氨基丙烷)二盐酸盐，和2，2′-偶氮双(2，4-二甲基 戊腈)。

用氧气填充的气体和气体前体填充的微球体将通过空 化产生广泛的自由基。而且，过渡系列，尤其是锰，铁和铜金 属离子可增加从氧形成反应活性氧中间体的速度。通过将金 属离子囊括在微球体内，体内自由基的形成可被增加。这些 金属离子可以游离的盐，与例如EDTA，DTPA，DOTA或des- ferrioxamine的配合物，或以金属离子的氧化物掺入微球体 内。另外，金属离子衍生的配合物可以键连到类脂首基上，或 离子的亲酯配合物可被掺入类脂双层中，例如，当暴露于热 刺激例如空化时，这些金属离子将增加反应活性氧中间体的 形成速率。而且，放射致敏剂如2-甲基-5-硝基-1-咪 唑基乙醇和misonidazole可被掺入气体和气体前体填充的微 球体中在热刺激下产生自由基。

作为前药应用的例子，酰化的化学基因可以通过在体内 由血清中的酶催化作用容易裂解的酯键连接到药物上。酰化 的前药被掺入本发明的气体和气体前体填充的微球体中。除 烃和取代的烃烷基之外的衍生物也可构成卤代和全卤代基， 如全氟烷基。全氟烷基具有稳定衍生微球体和泡沫的乳剂的 能力。当气体和气体前体填充的微球体用超声波的声波脉冲 击破时，如后面进一步详述的，由微球体包裹的前药将暴露 于血清。然后酯键被血清中的酯酶裂解，产生治疗剂。 其它添加剂

除活性成份，例如，治疗剂和美容剂之外，可以加到本发 明气体和气体前体填充的微球体中，用于局部或皮下输送到 患者的选定组织，有一种或多种有利影响微球体或其所含活 性成份的行为的附加组合物。这些组合物可促进活性成份的 吸收，保护稳定的微球体和泡沫体，或加入所需的颜色或气 味。许多这类添加剂在下面详细描述。其它未提到的，很容 易被熟练的专业技术人员想到的其内含物因而被期望为本 发明的一部分。

制菌剂可以包括在微球体内防止储时细菌降解。合适的 制菌剂包括但不限于氯化苯甲烃铵，氯化苄甲乙氧铵，苯甲 酸，苄醇，butylparaben，氯化十六烷基吡啶鎓，氯丁醇，氯代儿 茶酚，methylparaben，苯酚，苯甲酸钾，山梨酸钾，苯甲酸钠和 山梨酸。一种或多种抗氧化剂或氧清除剂可进一步地包括在 气体和气体前体填充的微球体内防止类脂的氧化。合适的抗 氧化剂包括生育酚，抗坏血酸(维生素C)和棕榈酸抗坏血酸 基酯。合适的氧清除剂包括葡萄糖氧化酶。

一种或多种防腐剂也可包括在气体和气体前体填充的 微球体制剂中。这类防腐剂包括但不限于：parabens和季铵 化合物，各种醇类如乙基和异丙基醇，酚类如p-氯-m-儿 茶酚，和香精油如柑桔油或薄荷醇。

前面的制菌剂，抗氧化剂，氧清除剂和防腐剂帮助延长 本发明微球体或泡沫体的自身寿命，否则将被细菌降解，氧 化作用或其它降解现象影响。

酸，碱，缓冲剂和中和剂也可包括在制剂中。这些包括但 不限于这类化合物：柠檬酸，碳酸铵，碳酸氢铵，碳酸钙和酒 石酸。一般气体和气体前体填充的微球体制剂在pH3.0和 pH10.0之间稳定化。理想的pH范围是pH4至pH9，更理想 或优选的在pH5至pH8之间。最优选的pH为pH6.0至 pH7.0。

水汽含量控制剂或湿润剂也可被包括防止气体或气体 前体填充的微球体干掉。另外，软膏基可以与气体和气体前 体填充的微球体一起使用。这些软膏基包括，但不限于羊毛 脂，无水羊毛脂，亲水软膏，自软膏，黄软膏，聚乙二醇软膏， 凡士林，亲水凡士林，白凡士林，玫瑰水软膏，和角鲨烯。悬浮 和/粘度增加剂可与气体和气体前体填充的微球体连用，这 些可包括但不在任何意义上限于阿拉伯树胶，琼脂，藻酸- 硬脂酸铝，膨润土，纯化膨润土，稠液膨润土，carbomer 934P， 羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠12、羧甲基纤维素钠、角 叉菜胶、微晶纤维素、糊精、明胶、瓜耳胶、羟乙基纤维素、羟 丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅铝酸镁、甲基纤维素、果 胶、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚吡酮、丙二醇藻酸酯、二氧化 硅、胶态二氧化硅、氧化锌、藻酸钠黄蓍胶，和黄原胶。其它有 用的试剂包括但不限于：甘油，己二醇，山梨糖醇，和丙二醇。 另外，在一些情况下，它可被用于防止在气体和气体前体填 充的微球体双层中过量水汽的形成。在此情况下，将加入硅 酸钙。其它基质和硬化剂也可被应用。这些可包括可可脂， 硬脂，氢化的蓖麻油，鲸蜡硬脂基醇，鲸蜡基醇，鲸蜡基酯蜡， 硬脂，石蜡，聚乙烯赋形剂，硬脂基醇，乳化蜡，白石腊，和黄 石脂。另外，气体和气体前体填充的微球体也可与含油的载 体如杏仁油，玉米油，棉籽油，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，棕 榈酸异丙酯，矿物油，轻矿物油，肉豆蔻醇，辛基十二烷醇，橄 榄油，花生油，桃仁油，芝麻油，大豆油，和角鲨烯。

对于美容应用和较轻程度的治疗剂，尤其是局部应用， 着色剂可被使用。有用的着色剂包括：紫1，FD&C蓝#1， FD&C绿#33及FD&C红#44。天然着色剂也可用于气体 和气体前体填充的微球体的美容制剂，这些包括但不限于： 紫草根，胭脂树橙，叶红素，叶绿素，胭脂虫红，藏红花和 tumeric。

加工助剂可被掺入气体和气体前体填充的微球体制剂 以影响制剂的光滑，体积和均匀性。有用的试剂包括，例如， 月桂基硫酸钠和氧化铝胶，磺酸钠，阿拉伯胶和发泡剂如十 二烷基苯磺酸。

皮肤吸收促进剂也可被掺入气体和气体前体填充的微 球体或水介质包围的气体和气体前体填充的微球体结构中。 这类皮肤吸收促进剂包括但不限于如下：吡咯烷酮类如2- 吡咯烷酮，N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，1-甲基-2-吡 咯烷酮，5-甲基-2-吡咯烷酮，1-乙基-2-吡咯烷酮，2 -吡咯烷酮-5-甲酸，N-羟乙基吡咯烷酮(HEP)，N-环 己基吡咯烷酮(CHP)，N-二甲基氨基丙基吡咯烷酮 (DAPP)，N-cocalyklpy rrolidone(CAP)，N-牛脂烷基吡咯烷 酮(TAP)，1-月桂基-2-吡咯烷酮(LP)，和1-hyxyl-2- 吡咯烷酮(HP)；脂肪酸类如油酸，亚油酸，庚酸，己酸，月桂 酸，硬脂酸，十八烯酸，棕榈油酸，肉豆蔻酸和palmitelaidic acid；亚砜类如二甲亚砜(DMSO)，二甲基乙酰胺(DMAC)，二 甲基甲酰胺(DMF)，N-甲基甲酰胺(NMF)和癸基甲基亚砜 (DCMS)；胺类和衍生物如N，N-二乙基-m-甲苯甲酰胺， 十二烷基胺，乙氧基化胺，N，N-二(2-羟乙基)油酰胺，十 二烷基-N，N-二甲基-氨基乙酸酯，焦谷氨酸钠和N-羟 基十六烷醇乙酰胺；萜烯类和萜类化合物如α-蒎烯，δ-苎 烯，3-蒈烯，α-萜品醇，萜品烯-4-醇，蒈醇，abisabollel，香 芹酮，长叶薄荷酮，薄荷酮，酮，葑酮，环已烯氧化物，苎烯 氧化物，蒎烯氧化物，环戊烯氧化物，驱蛔萜，7-氧杂双环 (2.2.1)庚烷，1.8-桉树脑，黄樟脑，1-香芹酮，萜类环己酮 衍生物，非环萜烯烃链，烃萜烯，环醚萜烯，小豆蔻籽提取物， 单萜萜品醇和乙酰基萜品醇；桉树香精油，藜属和衣兰油；表 面活性剂，阴离子型-月桂基硫酸钠(SLS)，苯基硫酸盐CA， 十二烷基苯磺酸钙，empicol，ML26/F和月桂基硫酸镁；阳离 子型-鲸蜡基三甲基铵溴化物；非离子型-synperonic NP系 列和PE系列和多乙氧基醚；或两性离子-N-十二烷基- N，N-二甲基甜菜碱；醇类如乙醇，月桂基醇，亚麻醇，1-辛 醇，1-丙醇和1-丁醇；尿素，环状不饱和脲类，甘醇类，a- zone，正烷醇，正烷，orgelase，alphaderm乳油和水。这些可以在 或不在可由多种物质组成的基质中，这些物质包括但不限 于：甘油，丙二醇(PG)；肉豆蔻酸异丙酯(IPM)；尿素在丙二 醇，乙醇和水中；和聚乙二醇(PEG)。

包含活性成份或任何各种添加剂和其它用于本发明的 材料的各种材料在涡旋，气体注入，或制备气体和气体前体 填充的微球体的其它工艺期间被掺入气体或气体前体填充 的微球体的内部气体和气体前体填充的空间，尤其是脂质体 或掺入形成微球体的类脂或聚合物化合物的内表面或外表 面的壁中。掺到微球体的外表面是优选的。例如，具有很高 的辛醇/水分隔协同效应的活性成份可被直接掺入包围气体 的类脂层、但掺到气体和气体前体填充的类脂微球体的外表 面是优选的。为了完成它，可以连接活性成份的基团一般被 掺入类脂层中，然后将在连接这些材料。这可通过用被掺到 干燥的类脂原料中的阳离子类脂或阳离子聚合物而容易地 完成。掺入活性成份或其它添加剂或围绕微球体的环境物质 也是期望的。

给药方法和应用

本发明提供局部和皮下输送活性成份，尤其是药物和美 容剂，到患者的选定组织，尤其是皮肤。

局部给药通常和主要是患者的皮肤，不限于，但包括施 用到患者任何和所有组织表面，无论是内部还是外部。这样， 除了患者的皮肤，其它局部给药部经包括各种粘膜，如眼， 鼻，直肠和阴道的粘膜。输送到组织表面位置是局部的(即， 到施用的位置)，但作为吸收和转移的结果被进一步输送到 其它组织，尤其是通过血液从局部给药的局部位置全身输 送。

类似地，皮下给药通过注射等通常和主要被输送到患者 的皮下。然而，也不限于、但包括在患者的任何和所有组织表 面之下，不管是内面还是外面。这样，除在患者的皮下给药 外，皮下给药的其它位置包括在各种粘膜，如眼，鼻，直肠和 阴道粘膜之下。输送到这些位置是局部的(即，所施用的位 置)，但作为吸收和转移的结果，也被进一步输送到其它组 织，尤其是从皮下给药的局部位置通过血液全身输送。特别 应注意治疗剂和美容剂吸收和转移到其它组织可通过用皮 下贮存注射更长周期实现。一般皮下注射，注射典型地就在 组织表面之下，一般不超过约3.0cm深。优选地皮下注射在 约0.05mm深至约1.0cm深，更优选地在约0.1mm深至约 1mm深，再更优选地在约0.1至0.5mm深，最优选地约 0.2mm深。

本发明的微球体被典型地，最方便地以泡沫体形式给 药。

本发明微球体局部和皮下给药的具体重要方案是微球 体在经皮输送系统如经皮斑中微球体的应用，和通过吸收形 成或另外通过皮下积存的皮下注射。许多治疗剂在口服给药 时，很难从胃肠道吸收，因而很难提供足够的系统浓度。当经 皮的斑在传递某些治疗剂，例如，尼古丁时有效，并可被用于 用本发明的微球体，此方法对输送较大分子，例如肽时效果 小得多。根据现有技术，对于肽类如促黄体激素释放激素 (LHRH)拮抗药，和bombesin，治疗剂必须每天给药，它不可 避免地需要患者忍受由肌内注射的很大疼痛和不适。

这样，本发明的明显优点是实现给药的另一给药途径， 它减少剂量的频率至一月一次或更少。如附图1所示，描绘 出外侧和患者皮肤的底表面，显示气体填充的微球体(1)包 含治疗剂(2)，用针(3)注射而皮下给药，靠近血管(4)产生一 皮下积存，一些治疗剂进入血流。在附图1中，治疗剂(2)被 分隔在微球体之间的间隙空间，但如果需要也可在单个微球 体的内面或附于微球体。治疗剂可以在包围微球体的膜内， 例如，在类脂单或双层内，通过共价键或范德瓦尔斯力或静 电相互作用连接或吸附在微球体的表面，或在包围微球体的 薄含水空间内发现，它构成稳定化的泡沫体。在任何情况下， 微球体本身和泡沫体可集中地包含作为治疗剂自由扩散的 障碍。如此，微球体和泡沫体表现为药物皮下给药的常规输 送载体。

在常规持久释放治疗剂传递系统中，治疗剂通常被网捕 在聚合的基质如聚乳酸或聚丁烯酸酯中。参见，例如，Kost， J.，Leong，K.和Langer，R.，“Ultrasonic Modulated Drug Deliv- ery Systems”，Polymers in Medicine II，Plenum Press，New York and London，pp.387-396；和Brown，L.，和Langer，R.“Trans- dermal Delivery of Drugs，Ann Rev.Med.，1988，39：221-29。 在实际进展达到发展持久释放制剂的同时，保留了明显的障 碍。要实现所需的释放动力学是困难的，例如，在超过30天 的时间间隔释放给定的治疗剂。第二，治疗剂受在正常储存 期间降解的困扰。也许最重要地是，很难发展无毒的，例如， 不引起局部肉牙瘤形成或其它组织损害的持久释放传递系 统。本专业很久的一个目标是实现生物降解性和缓释之间的 平衡。本发明提供了对这些问题的满意解决方案。本发明的 微球体允许专业人员使用相当可降解的和生物共容的化合 物，如磷脂和聚合物，它作为微球体的气体或气体前体的稳 定化化合物，作为缓释积存。特别是，用全氟烃制备的微球体 和泡沫体相当稳定并可用作这类传递系统。

在普通持久传递储库中，治疗剂的释放动力学主要归结 于持久的聚合物基质的组合物，以及治疗剂对聚合物基质的 亲和力。在本发明中，不仅稳定化化合物的组成影响治疗剂 释放，而且被定包裹在微球体内的气体组合物也扮演重要角 色。已经发现相对溶解的气体可被用于使泡沫稳定化对于快 速治疗剂输送。然而，高度不溶的气体对于持久的治疗剂输 送，例如，几周，是优选的。一般地，给出一个比较稳定的化合 物，例如，用二棕榈酰基磷脂基胆碱(DPPC)，从空气，氮气， 全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷和全氟戊烷制备的 微球体和泡沫将分别显示增加的稳定性，包括在其中或被包 裹的治疗剂将从更稳定的微球体和泡沫中更慢地释放。

本发明因而增加了从现有技术的输送系统不能得到的 唯一的能力。在现有技术中，通过改变释放活性剂的稳定化 基质的组合物可以只影响治疗剂或美容剂的释放。在本发明 中，可以不仅选择被用于微球体中的类脂和/或聚合物，也可 选择气体，因而一起产生微球体和泡沫体的所需稳定性，结 果，设计合适的药物释放动力学。由于稳定化的微球体和泡 沫体随时间逐步逸出，气体被释放和扩散掉，并主要通过肺 最终从患者体内驱散。气体优选地是惰性的，而各种稳定化 合物，例如，磷脂，被容易地代谢。本发明因而能够提供稳定 的，安全持久释放皮下储积(包括肌内或骨内，即骨髓内)，当 现有技术的系统被应用时没有毒性问题存在。

本发明的微球体和泡沫体可被用作皮下给药的持久释 放储存载体，并根据本文的详细描述容易实施。感兴趣的治 疗剂，例如生物活性的肽，被加到无菌的小瓶中制备微球体 和泡沫体，它含有稳定化化合物和气体首空。混合物例如通 过Wig-L-BugTM机械振摇器搅拌所需时间，典型地30秒 至2分钟的范围。混合物用注射器抽出然后注射到患者体内 (到皮下组织中)。通过改变稳定化化合物，例如，生物共容性 类脂的浓度，和通过改变用于制造微球体的气体或气体前体 的类型，具有不同释放动力学的持久释放制剂可以产生。本 发明具有额外的优点，即超声波或其它能量可被施于患者的 皮肤以活化或从皮下的储库或储库所在的其它组织中的储 库中释放治疗剂。此技术被认为对糖尿病患者特别有前途、 其中含有胰岛素的微球体和泡沫体可用透皮超声波活化，接 着根据患者的血糖浓度进食。通过以此方或使用本发明的微 球体和泡沫体，胰岛素或其它治疗剂的皮下注射可以避免， 而储库可被用于胰岛素或其它治疗剂的持久释放和声波的 增音释放。

同样具体包括在本发明范围内的是对肺部，即，支气管， 细支气管，和肺泡局部给药。对于通过吸入患者气道的这类 给药，本发明的气体和气体前体填充的微球体和泡沫体通过 用小粒含水气雾剂发生器，例如，形成小的含水颗粒的冲撞 喷雾器，由完全或富氧空气推进。参见，例如，Knight等人美 国专利5049388。如本文进一步描述的，本发明的气体和气 体前体填充的微球体和泡沫体通过搅拌产生。这一搅拌可在 将所说的微球体或泡沫体放进气雾剂发生器之前进行，或气 雾剂发生器可被用作搅伴的第一或唯一的来源。经喷雾器通 过将形成理想的减小大小的气体和气体前体填充的微球体， 适合进入肺泡，肺的最小部分。

这样，本发明的微球体可用于根据下述肺部传递而传递 活性药剂如治疗剂到肺部。如附图2中所示，普通微球体 (2)和其它气雾剂组合物输送治疗剂主要到中心支气管和气 道，而不达到细支气管或肺泡。充气的微球体和活性剂(1)可 一般被进一步输送到肺，达到末端细支气管或肺泡。由于普 通脂质体和气雾剂组合物基本上用水填充，作为主要的水 沫，它们比空气重，它们进入肺被限于中心气道。当然，需要 治疗剂达到末梢气道在肺中治疗疾病，而且实现药物活性化 合物例如通过胰岛互肺的途径全身输送。肺泡首先提供这类 给药途径，因为肺泡的总表面大大大于中心气道，因此治疗 剂扩散到血流的机会大大增加。然而，所需要的是治疗剂被 输送到这些微小的气囊。肺泡被薄沫围绕并密切相对毛细 管。然而，本发明的微球体和泡沫体由于它们是充气的，因而 更轻、漂浮，被吸入到肺的更幽深处。另外，比空气更轻的气 体，如氮，可被选择用于制造在吸入肺中时在空气中漂浮更 远的微球体和泡沫体。含有治疗剂的本发明微球体和泡沫体 很容易通过喷雾器输送，事实上，微球体倾向于被喷雾过程 进一步减小大小，这样，非常微小，亚微观大小的微球体可被 实现，输送更有效。由于吸入器和其它输送体系需要延长储 存，全氟烃之类的气体可被使用。对于大多数应用，其中稳定 化的化合物和治疗剂仅在给药之前搅拌以产生微球体或泡 沫体，作为充入微球体的气体的空气或氮气将被是足够的。

含在本发明微球体内的气体前体可由于温度，光，或 pH，或被给药患者的组织的其它性质活化，从网集在微球体 中的液体相转移为气态，膨胀产生用于本发明的充气微球 体。因此，此气体前体填充的微球体不仅是气体前体，而且在 感觉上是“泡沫前体”，并可通过施于患者的选定组织，一旦 活化用作起泡剂，其中如温度或pH之类的因素可被用于产 生气体。因此，包括在本发明这方面的原理将在肥皂，面乳， 皮肤清洁剂，含油的泡沫，和许多其它美容载体和局部施用 的制剂的制备方面找到特殊用途。这些起泡因子提供必须帮 助清洗选定组织和毛孔的起泡。

这样，根据本发明的特定方案，提供了在患者的选定组 织就地制备含有活性成分的充气微球体的方法，所说方法包 含步骤(a)制备气体前体填充的微球体，通过搅动在一种或 多种从液体相变为气态的气体前体存在下，任意地在气体存 在下的类脂水悬浮液，而形成用液相气体前体填充的微球 体，其中所说的活性成份在搅动步骤之前或之后加入；和(b) 将上步制备的所说的气体前体填充的微球体施用于患者的 选定组织，其中所说的气体前体被所说的组织活化而变为气 相。微球体成为建立泡沫体的基质。当此方法在气体存在下 进行时，该气体优选地是氮气。进一步优选的是本方法是其 中气体前体在或接近所说患者的正常体温从液体相变为气 态，由患者皮肤的温度活化以变为气相。更为优选地，此法其 中患者组织是具有约37℃正常温度的人皮肤，其中气体前 体在接近37℃从液体相变为气态。

上述方法也形成本发明另一方面的组成部分，将活性成 分局部输送到患者选定部分的方法包含步骤(a)给所说患者 的所说的组织施用通过在一种或多种从液体相变为气态的 气体前体存在下，任意地在气体存在下，搅动类脂的水悬浮 液，由此形成用液相气体前体填充的微球体，而制备气体前 体填充的微球体，其中所说的活性成份在所说的搅动之前或 之后被加入；和(b)使所说的气体前体被所说的患者组织活 化而变为气相，产生的膨胀提供含所说的活性成份的气体和 气体前体填充的微球体；和(c)将所说的含所说的活性成份 的气体和气体前体填充的微球体移入所说的患者组织(例 如，通过毛孔或其它)。微球体或活性成份移入所说的患者组 织通过将微球体或活性成份通过摩擦或相似的机械力加到 所说的组织中。然而，简单地使微球体在长时间保留在选定 的组织上，该组织然后吸收活性成份(选自治疗剂和美容 剂)，也是本发明的范围。

如上面已经提到的，免除需要活性成份，利用类脂的固 有性质，为了给施用所说的微球体和泡沫体的选定的患者组 织授予所需的性质，该类脂用于制备微球体和泡沫，这也在 本发明的范围内。因而，本发明也涉及改进选定的患者组织 的调理性质的方法，包含对所说的组织局部施用气体和气体 前体填充的微球体，其中所说的类脂具有皮肤调理(皮肤改 进)性质，尤其是湿润，光洁，和整体健康。

如上面进一步描述的，本发明的这一方面也对用气体前 体制备的微球体具有实用性。因而，本发明包括改进患者的 选定组织如皮肤的调理性质的方法，包含(a)给所说的组织 局部施用在从液体相变为气态的一种或多种气体前体存在 下，任意地在气体存在下，搅动类脂的水悬浮液，形成用液相 气体前体填充的微球体而制备的气体前体填充的微球体； (b)使所说的气体前体被所说的患者组织活化而变为气相， 产生的膨胀提供气体和气体前体填充的微球体；和(c)将所 说的微球体移入所说的患者的所说的组织中；其中所说的类 脂具有组织调理改进性质，尤其是湿润和润滑性。其它需要 正而影响调理性质的是感觉和去除粘性。

将其组合物施用于暴露的内部组织，如在开心手术过程 中心脏的外面，也在本发明的范围内。而且，通过暴露内部组 织或吸收微球体到组织中应用的持久输送储库的给药途径 也在本发明的范围内。所有这些期待的应用被归纳在本文所 用的术语“局部给药”内。

超声波可用于本发明既用于爆裂气体和气体前体填充 的微球体，也用于引起增加化学裂解和活性治疗剂从前药释 放的热效应。本发明微球体的爆裂和前药的裂解以出乎意料 简单的方式，通过对患者需要治疗的部位在本发明的微球体 被给药或另外到达部位后，施用一定频率的超声波而进行。 当超声波在对应于含有气体和气体前体填充的微球体的治 疗剂的峰共振频率的频率使用时，微球体将爆裂并释放其成 份，而前药将裂解从中释放活性治疗剂。

峰共振频率可体内或体外测定，但优选地是体内，通过 用普通手段，将微球体暴露于超声波，接收反射的共振频率 信号并分析接收的信号谱以测定峰。这样测定的峰对应于峰 共振频率，或基频(第一谐波)，如其某些时候表述的。第二谐 波(或基频的2×多重峰)也可被测定。

优选地，本发明的微球体具有约0.5mHz至约10mHz之 间的峰共振频率。当然，本发明气体和气体前体填充的微球 体的峰共振频率将随外径，在某种程度上，微球体的弹性或 柔韧性而变化，较大和更有弹性或柔韧性的微球体具有比较 小和较小弹性或柔韧性的微球体更低的共振频率。

含气体和气体前体填充的微球体的治疗剂当以更高的 密度(瓦数)和期限(时间)暴露于非-峰共振频率的超声波 时也会爆裂且前药将裂解。然而，此更高的能量导致大大增 加的热量，而热量是不希望有的。通过调节能量的频率以匹 配峰共振频率，爆裂和治疗剂释放的效率被改进，可以感觉 到的组织发热一般不产生(一般不增加高于约2℃的温度)， 并需要更小的所有能量。这样，在峰共振频率使用超声波，不 需要，是最优选的。

任何类型的诊断超声波成像仪都可用于实施本发明，特 定类型或型号的仪器对用本发明的方法使用并不关键。同样 合适的是设计用于给药超声波高温治疗的仪器，这类仪器被 描述于美国专利4620546；4658828；和4586512中，这些文 献全部引作本文的参考。优选地，仪器应用共振频率(RF)谱 分析仪。传感器控针可以外用或被植入。超声波一般以较低 密度和期限开始，然后密度，时间，和/或共振频率被增加直 到微球体爆裂。

尽管应用上述各种原理对本专业技术人员是显而易见 的，根据本说明书，通过一般性引导被注意到，对于平均外经 约1.5至10微米的气体和气体前体填充的微球体，共振谱 率将一般在约1至10mHz的范围。通过调焦到目标组织的 中央，气体和气体前体填充的微球体作为其在组织中的积 累，在实时超声波下可视化。作为一个例子，用7.5mHz曲向 传感器，调节输送至传感器的能量为最大，并调焦至目标组 织中，空间峰时间平均(SPTA)能量将变为在水中最大约 5.31mW/cm2。此能量将引起某些治疗剂从气体和气体前体 填充的微球体释放，但更大的释放可通过用更高能量完成。

通过将传感器切换到多普勒型，高达2.5瓦/cm2的更 高能量输出可从同样的传感器得到。机器在多普勒型操作， 能量可被输送到目标组织内的选定焦点，可使气体和气体前 体填充的微球体释放其治疗剂，选择传感器以匹配气体和气 体前体填充的微球体的共振频率将使这一治疗剂释放方法 更有效。

对于较大外径的气体和气体前体填充的微球体，例如， 大于3微米的平均外径，较低频率的传感器对于完成治疗剂 释放将更有效。例如，3.5mHz，例如，20mm曲向型较低频率 传感器，可被选择对应于气体和气体前体填充的微球体的共 振频率。用此传感器，101.6mW/cm2可被输送到焦点，而切 换到多普勒型将增加能量输出(SPTA)到1.02瓦/cm2。

为了用空化现象释放和/或活化在气体和气体前体填充 的微球体内的治疗剂/前药，较低频率能量可被使用，空化在 较低频率更有效地进行。用0.757mHz由更高电压(高达 300V)驱动的传感器，气体和气体前体填充的微球体的溶液 将在约5.2大气压的临界值空化。

表3显示了从常用诊断超声波仪传送到组织的能量范 围，仪器如Piconics Inc.(Tyngsboro，MA)带接收脉冲装置 1966型661的一般目的扫描器Portascan；Picker(Cleveland， OH)Echoview 8L Scanner包括80C系统或Medisonics(Moun- tain View，CA)Model D-9Versation Bidirectional Doppler。一 般地，这些用于脉冲重复的能量范围可用于监测气体和气体 前体填充的微球体，但不足以爆裂本发明的微球体。

                    表3

           由诊断仪产生的动力和强度*   脉冲重复率     (Hz)     总超声波   动力输出P(mw)    在传感器面上的    平均强度IID(W/m2)     520     4.2      32     676     9.4      71     806     6.8      24     1000     14.4      51     1538     2.4      8.5

*由Carson等人，Ultrasound in Med.& Biol.1978，3，341 -350得到的值，此文献全文引作本文参考。

更高能量的超声波如常用于治疗超声波仪的对于活化 含气体和气体前体填充的微球体的治疗剂是优选的。一般， 治疗性超声波机根据被超声波加热的组织面积应用高达 50％至100％的工作循环。具有较大肌内块(即，背部，大腿) 的部位和高度脉管化的组织如心脏将需要更大的工作循环， 例如，100％。

对于诊断超声波，一或多脉冲的声音被使用，而机器在 脉冲与反射的声波信号的接收之间暂停。用于诊断性超声波 的有限数的脉冲限制被输送到被成像组织的有效能量。

在治疗性超声波中，连续波超声波被用于输送更高能量 水平。在应用本发明的微球体时，声能可被脉冲，但连续波超 声波是优选的。如果脉冲被应用，声波列将优选地以回波列 长度每次至少约8和优选地至少约20脉冲被脉冲。

无论固定频还是调频的超声波都可使用。固定频被定义 为声波频率在一定时间为常数。调频是波频在整个时间内改 变，例如，从高到低(PRICH)或从低到高(CHIRP)。例如，具 有起始频率10MHz的声能脉冲用1至5W的增加的动力扫 至1MHz。聚焦，调频的高能声波可增加微球体内局部气体 膨胀并爆裂提供治疗剂的局部输送。

所用声波的频率可从0.025至约100兆赫变化。在约 0.75至约3兆赫之间的频率是优选的，而在约1至约2兆 赫之间的频率最优选。约0.75至约1.5兆赫之间的常用治 疗频率可以使用。约3至约7.5兆赫的常用诊断频率也可使 用。对于非常小的微球体，例如，平均外径低于0.5微米，更 高的声频是优选的，因为这些更小的微球体将在较高的声频 更有效地吸收声能。当很高的频率被使用，例如，超过10兆 赫，声能一般具有穿透到流体和组织的有限深度。对皮肤和 其它表面组织的外用将是优选的。

尽管超声波用作爆裂或其它破坏本发明微球体和泡沫 体的手段，以引起其中所含活性成份的释放，尤其是治疗剂 的释放是一优选的方案，但对于专业技术人员显而易见的 是，根据本说明书，其它手段和能量形式可被用于完成同样 目的。例如，微波和其它形式的射频能量，磁诱导的振动能， 和光能，以各种形式，可被用于诱导活性成份从本发明的微 球体和泡沫体中释放。

当气体和气体前体填充的微球体被用于活性剂的输送， 被输送的活性剂可被埋入微球体的壁内，根据需要，包裹在     微球体内和/或系列微球体的内壁或外壁上。活性剂也可在 微球体的周围发现。短语“系列”或其变通形式，如本文与活 性剂的位置连用的，意指活性剂以某些方式被键连到微球体 的内壁和/或外壁，诸如通过共价键或离子键或其它手段的 化学或电化学键或相互作用。与活性剂的位置连用的短语 “包裹在其变体中”指活性剂定点在内部微球体空间。与活性 剂位置连用的短语“包埋在其中”或其变通形式或表示活性 剂的位置在微球体壁内。与活性剂共用的短语“与……混 合”指活性剂被定在微球体的周围，但不系在上面。短语“包 含活性的”指所有各种类型的与微球体位置有关的活性剂。 这样，活性剂可以各种位置，诸如，例如，捕集在气体和气体 前体填充的微球体的内部定向，位于气体或气体前体和气体 和气体前体填充的微球体的内壁之间，掺到气体和气体前体 填充的微球体的外表面和/或网捕在微球体本身的结构内。 它也可在周围发现。

如果需要，用本发明的微球体和泡沫，多于一种活性剂 可被使用。例如，单个微球体可含有多于一种活性剂，或含有 不同活性剂的微球体可共同给药。类似地，前药可被包裹在 微球体内，并被包括如本文所用的短语活性剂或治疗剂的范 围。

除上面提出的那些外，任何种类的活性剂都可包裹在本 发明的气体和气体前体填充的微球体内。

本发明的微球体和泡沫可对患者局部或皮下给药。患者 可以是任何类型的动物，优选地是脊椎动物，更优选哺乳动 物，最优选人类。本专业技术人员应该认识到，给药的有用剂 量将随被给药本发明组合物的患者的年龄，体重，和类型，其 中给药是有效的方法(局部，皮下；有/没有积存)，特定的治 疗，美容或其它倾向的应用，和所需的治疗，美容或其它追求 的效果之类的因素而变化。一旦用前面的信息武装，本专业 技术人员将很容易开出剂量水平。典型地，剂量以较低的，甚 至顺势疗法的水平开始，并增加直到所需的治疗，美容或其 它效果被达到。

本发明稳定的，气体和气体前体填充的微球体和泡沫具 有许多用于皮肤护理产品的理想品质。首先，它们是气体和 气体前体填充的，它们可用于保护治疗剂，美容和其它材料。 尽管现有技术的微球体在氮气下储存，但开瓶后它们一般会 暴露于气体如氧气中。如果在所说的微球体内的治疗或其它 药剂容易被氧化，将导致产物降解并失去效力。由于本发明 的微球体和泡沫体用气体填充，特定的气体可被选用于将产 品的降解最小化。例如，用氮气填充的微球体一般对于局部 或皮下输送在其它情况容易被氧化的化合物是优选的。用氩 气填充的微球体和泡沫也代表一优选方案，由于氩气比空气 重，并防止空气迁移到微球体内，具有已描述的伴随优点。使 用全氟碳气体同样有利在于用它们生产的微球体更耐久得 多，并只需要明显更少的稳定化化合物，例如，生物共容的类 脂以稳定化充气的微球体。另外，微球体和泡沫可用从用于 制备微球体和泡沫的水溶剂中除去痕量浓度的氧的脱气水 制备。

制备方法

用于本发明的稳定化气体和气体前体填充的微球体可 用多种合适方法制备。这些被分开对于微球体是充气的，是 气体前体填充的情况在下面描述，尽管具有气体和气体前体 的微球体是本发明的部分。

应用气体

一个优选的方案包含在低于类脂的凝胶向液晶的相变 温度的温度下，在气体存在下，搅动含有稳定化化合物，优选 类脂的水溶液以形成气体和气体前体填充的微球体。本文所 用的术语搅动，和其变通形式，意指摇动水溶液使气体从周 围环境被导入水溶液中的任何运动。摇动必须有足够的力度 以导致微球体，特别是稳定化的微球体的形成。摇动可以是 涡旋，一侧至另一侧，或上下运动。不同形式的运动可以结 合。而且，摇动可通过摇动盛类脂水溶液的容器，或通过摇动 容器内的水溶液而不摇容器本身而进行。

而且，摇动可以手动或机动。可用的机械摇动器包括，例 如，摇动器平台如VWR Scientific(Cerritos，CA)摇动器平台， 或已被发现给出优秀结果的从Crescent Dental Mfg.Ltd.， Lyons，Ill.得到的Wig-L-Bug摇动器。本发明的一个优选 方案是某些类型的摇动或涡旋被用于制造在优选大小范围 的稳定微球体。摇动是优选的，而优选地此摇动用Wig-L- Bug机械摇动器。根据优选的方法，摆动运动被用于产生气 体和气体前体填充的微球体是优选的。更优选的是运动以弧 形摆动。还更优选的是运动以约2°至20°之间的弧形摆动， 进一步优选的是弧度在约5°至约8°之间。最优选的是运动 在约6°至约7°之间摆动，最特定地约6.5°。可以期望的是， 摆动率，及其弧度，对于确定形成的气体和气体前体填充的 微球体的量和大小是关键的。本发明的一个优选方案是摆动 数值，即全循环振动的数值在约每分钟1000和约20000的 范围内。更优选地，摆动或振动的数值将在2500至8000之 间。上述Wig-L-BugR是一提供每10秒2000捣击，即每分 钟6000次振动。当然，振动数取决于被搅动的内容的质量， 质量越大，振动数越小。

产生摇动的其它手段包括在高速或高压下散发的气体 的作用。也应该明白的是，优选地，水溶液体积越大，力量的 总量也相应增加。剧烈摇动被定义为每分钟至少约60次摇 动运动，并且是优选的。每分钟至少60-300转的涡旋更优 选。每分钟300-1800的涡旋是最优选的。基于摇动的气体 和气体前体填充的微球体的形成可被视测。需用于形成所需 稳定化的微球体水平的类脂的浓度将随所用类脂的类型而 变化。并可容易地通过常规实验测定。例如，在优选的方案 中，根据本发明的方法用于形成稳定化的微球体的1，2-二 棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)的浓度为约0.1mg/ml至约 30mg/ml的食盐水溶液，更优选地约0.5mg/ml至约20mg/ ml食盐水溶液，最优选地约1mg/ml至约10mg/ml食盐水溶 液。用于优选方案中的二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)的浓 度为约0.1mg/ml至约30mg/ml的食盐水溶液，更优选地约 0.5mg/ml至约20mg/ml的食盐水溶液，最优选地约1mg/ml 至约10mg/ml的食盐水溶液。

除了上述的简单摇动法外，更复杂但由于该原因而不太 优选的方法也可被应用，例如，液晶摇动气体滴注法，和真空 干燥气体滴注法，如在1993年6月11日提交的美国申请序 号076250中所述的，该文献全文被引作本文的参考。当这类 方法被使用时，将要被气体和气体前体填充的稳定化的微球 体可在气体注入之前用本专业技术人员显而易见的任何一 种常规脂质体预备技术制备。这些技术包括冻-熔，以及诸 如声处理，螯合透析，均化，溶剂扩散，微乳化，自发形成，溶 剂蒸发化，French压力胞技术，洗涤剂透析，和其它，每种包 括以各种方式在含有所需的活性成份的溶液中制备微球体 以使治疗，美容或其它药剂被包裹，网捕，或系于产生的极性 类脂基的微球体内。参见，例如，Madden等人，Chemistry and Physics of Lipids，1990，53，37-46，该文献全文被引作本文的 参考。

另外，活性成分用本专业技术人员将认识到的特别适用 于在特定pH蛋白的或脱蛋白的治疗或美容的pH梯度技术 载入微球体内。

根据上述方法制备的气体和气体前体填充的微球体的 范围在低于1微米至高于100μ的大小。另外，应该注意到， 在挤压和灭菌工艺后，搅动或摇动步骤产生气体和气体前体 填充的微球体，很少或没有残留的无水类脂相(Bangham，A. D.，Standish，M.M，and Watkins，J.C.(1965)J.Mol.Biol. 13，238-252)存在于溶液的保留物中。产生的气体或气体前 体填充的微球体在室温保存时稳定一年或甚至更长。

如果需要、气体和气体前体填充的微球体的大小可通过 微乳化，涡旋，挤压，过滤，声化，均化，重复冷冻和熔融循环， 加压挤过固定大小的孔，和类似的方法而调节。然而，一般 地，最理想地是以如更后面所述形成的状态使用本发明的微 球体和泡沫，而不作任何企图以修改其大小。

气体和气体前体填充的微球体可用挤过过滤器的简单 方法确定大小；过滤器的孔径大小控制产生的气体和气体前 体填充的微球体的大小分布。通过用两个或更多串联的，即 迭加的过滤器，例如10μ接着是8μ，气体和气体前体填充的 微球体具有集中在2-9μm左右的极窄的大小分布。过滤 后，这些稳定化的气体和气体前体填充的微球体保持稳定超 过24小时。

在优选的方案中，稳定化的化合物溶液或悬浮液被挤过 过滤器，而所说的溶液或悬浮液在摇动前被加热灭菌。气体 和气态前全填充的微球体一旦形成，它们将被过滤以如前述 大小化。形成气体和气体前体填充的微球体之前的这些步骤 提供优点，例如，减少非水化的稳定化合物的是，因而提供明 显更高产率的气体和气体前体填充的微球体，以及提供直接 用于对患者给药的无菌气体和气体前体填充的微球体。例 如，小瓶或注射器之类的混合容器可用过滤后的稳定化化合 物填充，尤其是类脂悬浮液，然后悬浮液在混合容器内，例 如，通过高压灭菌而灭菌。气体可通过摇动无菌容器被注入 类脂悬浮液内形成气体和气体前体填充的微球体。优选地， 无菌容器装有过滤器以使气体和气体前体填充的微球体在 接触患者前通过过滤器。

这一优选方法的第一步，将稳定化的，尤其是类脂，溶液 挤过过滤器，通过破碎干燥的化合物并暴露更大的表面积水 化而减少非水化化合物的量。优选地，过滤器具有孔大小约 0.1至约5μm，更优选地，约0.1至约4μm，再更优选地，约 0.1至约2μm，最优选地，约1μm。非水化的化合物，尤其是类 脂，表现为非统一大小的无定形块，并且是不理想的。

第二步，灭菌化，提供可直接对患者给药的组合物。优选 地，灭菌化通过热灭菌化完成，优选地，通过在至少约100℃ 高压灭菌，在约100℃至约130℃高压灭菌，还更优选地，约 110℃至约130℃，再更优选地，约120℃至约130℃，最优选 地，约130℃。优选地，加热约至少约1分钟，更优选地，约1 至约30分钟，再更优选地，约10至约20分钟，最优选地，约 15分钟。

如果需要，上面概括的第一和第二步可以逆转，或者只 有两个步骤中的一个被应用。    

当灭菌用不是热灭菌的方法在引起气体和气体前体填 充的微球体爆裂的温度下进行时，灭菌可以紧接着气体和气 体前体填充的微球体的形成而进行，并且是优选的。例如，伽 玛射线可在气体和气体前体填充的微球体形成之前和/或之 后被使用。

气体和气体前体填充的微球体基于摇动的形成可通过 水溶液顶部的泡沫的存在而检测。这伴随着由于泡沫形成的 水溶液体积的减少。优选地，泡沫的最终体积至少是水溶液 初始体积的至少约4倍；最优选地，所有的类脂溶液转化为 泡沫。

所需的摇动时间期限可通过检测泡沫的形成而测定。例 如，在50ml离心管中的10ml类脂溶液可被涡旋约15-20 分钟。此时，泡沫可引起含气体和气体前体填充的微球体的 溶液升至30至35ml的水平。

需要形成优选的泡沫水平的类脂的浓度将依所用类脂 的类型而变化，并可容易地通过常规实验测定。例如，在优选 的方案中，根据本发明的方法用于形成稳定的泡沫的1，2- 二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)的浓度为约20mg/ml至约 30mg/ml的食盐水溶液，更优选地约10mg/ml至约20mg/ml 食盐水溶液，最优选地约1mg/ml至约10mg/ml食盐水溶 液。用于优选方案中的二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)的浓 度约20mg/ml至约30mg/ml的食盐水溶液。

具体地，以20mg/ml至30mg/ml浓度的DPPC，靠用或 在空气中摇动，产生总的悬浮液和捕集的气体体积4倍大于 单独悬浮液的体积。DSPC以10mg/ml的浓度，靠摇动，产生 总体积完全没有任何液体悬浮液体积并含有完全稳定化的 泡沫。全氟碳(PFC′S)也可被用于产生大体积的稳定化的泡 沫，优点是用少得多的稳定化化合物，例如，生物共容的类脂 以稳定化泡沫。例如，在某些情况下，需要的类脂的量被估计 为一(1)至二(2)，大大小于不是这种情况的。 应用气体前体

除前述方案外，也可用含于微球体内的气体前体，它可 由被给药的患者组织的温度，光，或pH，或其它性质活化，从 捕集在微球体内的液体相变为气态，膨胀产生用于本发明的 稳定的，充气的微球体。此技术详细描述于1993年11月30 日提出的共同未决专利申请序号160232和159687中，它们 都被全文引作本文的参考。

活化气体前体的优选方法是温度。活化或转变温度，和 类似术语，指气体前体的沸点，在该温度下，气体前体从液体 向气相的相变发生。有用的气体前体是那些具有在约- 100℃至70℃范围的沸点的气体。活化温度对于各个气体前 体是特定的。约37℃，或人类体温的活化温度对于本发明的 气体前体是优选的。这样，液体气体前体在37℃被活化变为 气体。然而，气体前体可以液体或气相用于本发明的方法。制 备局部或皮下输送用于本发明的药剂的微球体或泡沫体的 方法可在低于气体前体沸点进行，以使液体被掺入微球体 内。另外，所说的方法可在气体前体的沸点进行以使气体被 掺入微球体内。对于具有低沸点温度的气体前体，液体前体 可用冷至低温的微流态剂装置乳化。沸点也可用液体介质中 的溶济降低以便以液体形成应用前体。进一步地，该方法也 可以在整个过程中温度被增加而进行，使工艺以气体的气体 前体开始，以气体结束。

气体前体可被选择以在目标组织或流体中就地形成气 体，即当其进入患者或动物体，使用前，储存期间，和制造期 间。生产温度活化的气体和气体前体填充的微球体的方法可 在低于气体前体沸点的温度下进行。在此方案中，气体前体 被捕集到微球体内使相变在生产期间不发生。实际上，气体 和气体前体填充的微球体以气体前体的液相生产。相变的活 化可在温度被允许超过前体的沸点的温度的任何时候进行。 而且，在液体气体前体的微滴内液体的量，达到气相后微球 体的大小可被测定。

另外，气体前体可被用于产生在用前预先形成的稳定的 充气微球体。在此方案中，气体前体在低于各个气体前体的 液-气相变温度的温度下被加到装有悬浮的和/或稳定化的 介质的容器中。如果温度超出，一个乳液在气体前体和液体 溶液之间形成，气体前体从液体向气态相变。作为加热和气 体形成的结果，气体置换液体悬浮液上部空间内的空气以形 成捕集气体前体的气体，周围气体(例如空气)，或共同捕集 气相气体前体的周围空气的充气类脂球。这一相变可称用于 最佳混合和稳定化以微球体为基础的泡沫。例如，气体前体， 全氟丁烷，可被捕集在生物共容的类脂或其它稳定化化合物 内，随着温度升高超过40℃(全氟丁烷的沸点)，稳定化化合 物捕集的全氟丁烷气体产生。作为附加的例子，气体前体氟 丁烷，可被悬浮于含有乳化剂和稳定化剂如甘油或丙二醇的 水悬浮液中，并用商品涡旋机涡旋。涡旋在足够低的使气体 前体为液体的温度开始，并继续，样品的温度上升走过从液 体向气态的相变温度。在这类操作中，在微乳化过程中，前体 转化为气态。在适当的稳定化剂存在下，出乎意料地，产生稳 定的充气微球体。

相应地，气体前体可被选择以在体内形成充气的微球体 或被设计成在生产过程中，或储存时，或使用之前的某时间 就地产生充气微球体。

作为本发明的另一方案，通过预先形成气体前体的液相 进入水乳液中并保持已知大小，微泡的最大体积可用理想气 体定律，一旦实现相变为气态，估算。为了从气体前体制造充 气的微球体，气相被假设瞬间形成，并且没有新形成的微球 体的气体由于扩散到液体(通常是天然含水的)中而消耗。因 而，从乳液中已知液体的体积可以预测充气微球体的大小上 限。

根据本发明，稳定化化合物如类脂的乳液，气体前体，含 固定大小液体的微滴可被配制，以达到特定的温度，气体前 体的沸点，微滴将膨胀成定义的大小的充气微球体。定义的 大小代表上限至实际大小，因为诸如气体扩散到溶液中，失 去气体到大气中，和增加压力的作用之类的因素是理想气体 定律不能解决的因素。

理想气体定律和用于计算从液体至气态相变时气泡体 积的增加方程如下：

                 PV＝nRT 其中 P＝以大气压为单位的压力 V＝以升为单位的体积 n＝气体摩尔数 T＝以°K为单位的温度 R＝理想气体常数＝22.4L大气压deg-1mol-1

由液体乳液中液体的体积，密度，和温度等资料，液体前 体的量(例如摩尔数)以及液体前体的体积，a priori，可被计 算。当转化为气体时，将膨胀为已知体积的微球体。计算的 体积将反映充气微球体的大小的上限，假设瞬间膨胀为充气 的微球体并且在膨胀的时间内可忽略气体的扩散。

这样，对于在乳液中处于液态的前体的稳定化，其中前 体微滴是球形的，前体微滴的体积由如下方程测定：

              体积(球)＝4/3πr3 其中

r＝球的半径

这样，一旦体积被预定，并知道液体在所需温度的密度， 微滴中液体(气体前体)的量可被测定。以更说明性的术语， 下面的可被应用：

             V气＝4/3π(r气)3 由理想气体定律，

               PV＝nRT 代入，

               V气＝nRT/P气 或， (A)             n＝4/3[πr气3]P/RT    

数量n＝4/3[πr气3p/RT]*MWn 变回为液体体积 (B)             V液＝[4/3[πr气3]P/RT]*MWn/D 其中D＝前体的密度 解液体微滴的直径， (C)直径/2＝[3/4π[4/3*[πr气3]P/RT]*MWn/D]1/3 简化为

      直径＝2[[r气3]P/RT[MWn/D]]1/3

作为制备用于稳定化的泡沫局部或皮下输送药剂的所 需大小的微球体的另外的手段，用稳定化化合物/前体液体 微滴的体积和特定的半经的资料，可以用适当大小的过滤器 以确定气体前体微滴的大小为适当半径的球体。

特定大小的乳液可以通过用合适大小的过滤器容易地 实现。另外，如可见的，必须用于形成定义的大小的气体前体 微滴的过滤器的大小，该规格的过滤器也足以除去任何可能 的细菌污染，因而，也可用作灭菌过滤。

在本发明的方法中用于制备局部或皮下输送剂的充气 微球体的此方案可以被用于由温度活化的所有气体前体。实 际上，降低溶剂系统的凝固点允许使用在低于0℃的温度进 行液-气相变的气体前体。溶剂系统可被选择以提供用于悬 浮气体前体。溶剂系统可被选择以提供用于悬浮气体前体的 介质。例如，可混溶于缓冲的食盐水中的20％丙二醇显示的 显低于单独水的凝固点的降低的凝固点。通过增加丙二醇的 量或加入诸如氯化物的物质，凝固点可以进一步降低。

适当溶剂系统的选择可通过物理方法等确定。当物质， 固体或液体，本文称作溶质，被溶于溶剂、诸如水基缓冲液、 凝固点被降低，其量取决于溶液组成。这样，如Wall定义的， 可以由下列方程表达溶剂的凝固点降低：

     InXa＝In(1-Xb)＝ΔH熔/R(1/T0-1/T) 其中： Xa＝溶剂的摩尔分数 Xb＝溶质的摩尔分数 ΔH熔＝溶剂的熔化热 T0＝溶剂的正常凝固点

通过解方程产生溶剂的正常凝固点。如果Xb相对小于 Xa，上述方程可被写作：

     Xb＝ΔH熔/R[T-To/ToT]≈ΔH熔ΔT/RTo2

上面的方程假设温度的变化ΔT小于T2。上面的方程可 以进一步简化，假设溶质的浓度(以每千克溶剂中的摩尔数) 可以重量摩尔浓度m表示，则，

     Xb＝m/[m+1000/ma]≈mMa/1000 其中：

Ma＝溶剂的分子量，和 m＝以每1000克摩尔为单位的溶质的重量摩尔浓度。

代入分数Xb：

      ΔT＝[MaRTo2/1000ΔH熔]m

           或ΔT＝Kfm，其中

        Kf＝MaRTo2/1000ΔH熔

Kf指摩尔凝固点并对于水在1大气压下等于每单位摩 尔浓度1.86度。上述方程可被用于精确测量用于本发明的 气体前体填充的微球体的摩尔凝固点。

因此，上述方程可被用于估算凝固点降低并测定将溶剂 的凝固温度降到适当值所需的液体或固体溶质的适当浓度。

制备温度活化的气体和气体前体填充的微球体的方法 包括：

(a)涡旋用于本发明的气体前体填充的微球体的水悬浮 液；此方法的可变因素包括摇动前任意地高压灭菌，非强性 地加热气体前体和类脂的水悬浮液，任意地给装悬浮液的容 器开口，任意地摇动或使气体前体微球体自发形成并冷却气 体前体填充的微球体悬浮液，任意地将气体前体和类脂的水 悬浮液挤过约0.22μ的过滤器，另外，过滤可在产生的微球 体的体内给药期间进行，约0.22μ的过滤器被应用；  

(b)一个微乳化方法，其中本发明的气体和气体前体填 充的微球体的水悬浮通过在给患者给药前搅动和加热以形 成微球体被乳化；和

(c)通过加热，和/或搅动形成气体前体在类脂中的悬浮 液，其中低密底气体和气体前体填充的微球体通过膨胀和转 换容器内的其它微球体而漂浮到溶液的顶部，并将容器开口 以释放空气；和

(d)在任一上述方法中，用密闭的容器盛气体前体和稳 定化化合物如生物共容的类脂的水悬浮液，所说的悬浮液被 保留在气体前体的相变温度之下，接着高温灭菌将温度移到 高于相变温度，任意地摇动，或使气体前体微球体自发形成， 其中在密闭的容器中气体前体膨胀增加所说的容器中的压 力，冷却充气的微球体悬浮液，然后也可摇动。

在摇动气体注入法之前，冻干可用于从稳定化化合物中 除去水和有机物。干燥-气体注入法可被用于从微球体中除 去水。通过在干燥的微球体中预捕集气体前体(即干燥前)， 温热后，气体前体将膨胀而填充微球体。气体前体也可在其 进行具空后被用于填充干燥的微球体。如干燥的微球体被保 持在低于其凝胶态至液晶温度的温度下，干燥的空腔可用处 于气态的气体前体缓慢地填充，例如，全氟丁烷可被用于填 充由二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)组成的干燥球在4℃ (全氟丁烷的沸点)和低于4℃，生物共容的类脂的相变温度 之间。在此情况下，在约40℃至约5℃的温度填充微球体将 是最优选的。

用于制备温度活化的气体前体填充的微球体的优选方 法包括在低于类脂的凝胶态向液晶态相变的温度，且低于气 体前体的液态向气态相变的温度，在气体前体存在下摇动具 有诸如生物相容类脂的稳定化化合物的水溶液。加热混合物 至温度高于气体前体由液态向气态相变的温度然后引起前 体膨胀。然后间断加热，混合物的温度降到气体前体从液态 到气态的相变温度。混合物的摇动可在加热步骤中进行，或 紧接着混合物被冷却之后。

本发明也期望制备气体前体填充的微球体的制备方法 的应用，包括在气体前体存在下摇动包含稳定化化合物如生 物相容性类脂的水溶液，并分离出用于活性剂局部或皮下输 送的产生的气体和气体前体填充的微球体。通过上述方法制 备的微球体这里被归于通过凝胶态摇动气体前体注入法制 备的气体前体填充的微球体。

普通地，现有技术的充水脂质体常规地在用于制造它们 的类脂的相变温度之上的温度形成，因为它们更有弹性，因 而可以液晶态用于生物体系。参见，例如，Szoka和Papahad- jopoalos，Proc.Natl.Acad.Sci.1978，75，4194-4198。相对 地，根据本文描述的优选方案制造的微球体是气体前体填充 的，它具有更大的弹性，因为气体前体在气体形成后比水溶 液更有压缩性和曲折性。因此，气体前体填充的微球体在低 于类脂的相变温度的温度形成时可被用于生物体系，尽管凝 胶相更有刚性。

由本发明期望的方法提供在温度活化的气体前体存在 下搅动含有稳定化化合物，如生物相容性类脂的水溶液。本 文所用的摇动被定义为搅动水溶液使气体前体从周围环境 被导入水溶液中的运动。任何类型的，搅动水溶液并导致导 入气体前体的运动都可被用于摇动。摇动必须是足够有力的 以在一个时期后形成泡沫。优选地，摇动是足够有力的，使泡 沫在短的时期，如30分钟，优选地20分钟内，更优选地，在 10分钟内形成。摇动可以通过微乳化，通过微流化，例如，打 漩，如涡旋，一侧至另一侧，或上-下运动。在加入处于液态 的气体前体的情况下，除上面提出的摇动法之外，声化可被 应用。而且，不同类型的运动可以组合。而且，摇动可通过摇 动装类脂水溶液的容器，或通过摇动容器内的水溶液而不摇 动容器本身而进行。进一步地，摇动可以手动或机动。可被 应用的机械摇动器包括，例如，摇动器平台，如VWR Scientif- ic(Crritos，CA)摇动器平台，微流化器，Wig-L-BugTM(Cres- cent Dental Manufacturing，lnc.，Lyons，IL)，后者已被发现给 出特别好的结果，和机械涂料混合器，以及其它已知机器。产 生摇动的其它手段包括在高速或高压下散发的气体前体的 作用。也应该懂得、优选地，对于较大体积的水溶液，总力量 也相应地增加。剧烈摇动被定义为每分钟至少约60次摇动 运动，并且是优选的。剧烈摇动的一个例子，以每分钟至少 1000转涡旋是更优选的。以每分钟1800转涡旋是最优选 的。

靠摇动的气体前体填充的微球体的形成可通过在水溶 液顶部的泡沫的存在检测。这样伴随由于泡沫的形成而产生 的水溶液体积的减小。优选地，泡沫的最终体积为类脂水溶 液初始体积的至少约两倍；更优选地，泡沫的最终体积为水 溶液初始体积的至少约三倍；再更优选地，泡沫的最终体积 为水溶液初始体积的至少约四倍；最优选地，所有的类脂水 溶液都转化为泡沫。

所需的摇动时间期限可通过检测泡沫的形成而测定。例 如，10ml类脂溶液在50ml离心管中被涡旋约15-20分钟 直至气体和气体前体填充的微球体的粘度变得足够稠使其 在打漩时不再粘在侧壁上。此时，泡沫将引起含气体和气体 前体填充的微球体的溶液升至30至35ml的水平。

所需形成优选的泡沫水平的稳定化化合物，尤其是类脂 的浓度将随所用稳定化化合物如生物相溶的类脂的类型而 变化，并且一旦用本文武装，将很容易被专业技术人员测定。 例如，在优选的方案中，用于形成根据由本发明期望的方法 的气体和气体前体填充的微球体的1，2-二棕榈酰基磷脂 酰胆碱(DPPC)的浓度为约0.1mg/ml至约30mg/ml食盐水 溶液。用于优选方案中的二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)的 浓度为约0.1mg/ml至约10mg/ml食盐水溶液。

具体地，DPPC以浓度20mg/ml至30mg/ml，靠摇动，产 生总的悬浮液和捕集的气体前体体积四倍大于单独的悬浮 液体积。DSPC以浓度10mg/ml，靠摇动，产生完全没有任何 液体悬浮液体积并含全部泡沫的总体积。

本专业技术人员应该懂得，一旦受本文的指导，用作原 料的类脂和其它稳定化化合物，或微球体最终产物，可在进 行本发明整出的方法之前或之后操作。例如，稳定化化合物 如生物共容的类脂可被水化然后冻干，进行冷冻和熔融循 环，或简单水化。在优选的方案中，在形成气体和气体前体填 充的微球体之前，类脂被水化，然后冻干。根据本发明期望的 方法，诸如但不限于空气的气体的存在，也可由周围气氛提 供。周围气氛可以是密闭容器内的气氛，或在非密闭容器内， 可以是外部环境。另外，例如，气体可被注入或其它方式或加 入具有类脂水溶液的容器内或类脂水溶液自身内以提供非 空气的气体。不比空气重的气体被加到密闭的容器内而比空 气重的气体被加到密闭或非密闭的容器内。因此，本发明包 括空气和/或其它与气体前体一起的共捕集。

如已在上面与稳定化化合物有关的段落中所述的，由本 发明期望的优选方法在低于所用类脂的凝胶态向液晶态相 变温度的温度进行。对“凝胶态向液晶态相变温度”，意思是 指类脂双层将从凝胶态向液晶态转化的温度。参见，例如， Chapman等人，J.Biol.Chem.1974，249，2512-2521。

因此，上述稳定化的微球体前体可以与用于本发明其它 稳定化微球体相同的方式被使用，一旦通过施用于患者组织 而活化，其中诸如温度或pH等因素可被用于引起气体的产 生。优选地是本方案其中气体前体在接近所说的患者正常体 温从液体向气态进行相变，并由所说的患者组织的温度活化 以相变为气相。更优选地，本方法中患者组织是具有约37℃ 正常温度的人体组织，并且其中气体前体在接近37℃正常 温度的人体组织，并且其中气体前体在接近37℃进行从液 体到气态的相变。

所有包括制备用于本发明的稳定化气体和气体前体填 充的微球体的上述方案，可被高压灭菌或灭菌过滤，如果这 些过程在气体注入步骤之前或先于温度介导的悬浮液中温 度敏感的气体前体的气体转化。另外，一种或多种抗菌剂和 /或防腐剂可被包括在稳定化泡沫的制剂中，如苯甲酸钠，所 有的季铵盐，叠氮化钠，methyl paraben，propyl paraben，山梨 酸，抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化的羟基茴香醚，丁基化的羟基 甲苯，氯丁醇，脱氢乙酸，乙二胺，一硫代甘油，苯甲酸钾，偏 亚硫酸氢钾，山梨酸钾，亚硫酸氢钠，二氧化硫，和有机汞盐。 这类灭菌，也可由其它常规手段如辐射实现，对于微球体的 稳定化泡沫被用于特征为侵略性环境的局部输送将是必须 的。合适的灭菌手段对于被稳定化气体和气体前体填充的微 球体和其应用的本说明指导的专业人员将是显而易见的。稳 定化的泡沫一般以水悬浮液储存，但在干燥的微球体或干燥 的类脂球的情况下，稳定化的泡沫可以用前预备好重组的干 粉储存。

含有本发明微球体的稳定化泡沫从尽可能不可渗透的 材料制备，给出其它如本文提出的需要。不渗透物是在典型 的存储条件或在诱导释放发生前的使用中不允许基本量的 微球体内容物通过，通常压力和在摩擦泡沫进入他或她的皮 肤的伴随患者行为的湿擦。与不渗透性连用的基本上被定义 为大于约50％的内容物，内容物是气体和活性剂两者。优选 地，不大于约25％，更优选地不大于约10％，最优选地不大 于约1％的气体和活性剂被释放。储存的温度优选地低于形 成微球体的物质的相变温度。

本发明气体和气体前体填充的微球体的稳定性具有明 显的实际重要性；它们倾向于具有比用已知工艺如加压或其 它技术生产的其它气体和气体前体填充的微球体在储存期 间具有更大稳定性。例如，形成72小时之后，常规制备的含 定微球体经常实质上缺乏气体，气体已经从微球体扩散掉和 /或微球体已爆裂和/或熔合。相比之下，含活性成份的本发 明的气体和气体前体填充的，极性微球体一般具有大于约3 周的货架寿命稳定性，经常大于3个月或更长，如超过12个 月或甚至两年。

根据上述方法，从材料制备的本发明稳定化的泡沫，具 有对涂模选定的组织很理想的非常奶性粘稠性。稳定化的泡 沫具有光滑的感觉。而且，本发明的稳定化泡沫具有不一般 的性质，使它们能作为更有效的载体以推进活性成份如治疗 剂和美容剂用于选定的组织，并促进那些活性成份被选定的 组织吸收。

本发明在下列实施例进一步说明，实施例举例说明包含 气体和气体前体填充的微球体的稳定化泡沫的制备和试验。 在下列实施例中，实施例1-6，11，13，14，17，18，26-30，32 和33被实际进行。剩余的实施例是预言的。这些实施例不 在任何意义上限制本发明的范围。 优选实施方案的实施例

实施例1

气体和气体前体填充的微球体的制备

在一离心管内，50mg1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰 胆碱(MW：734.05，粉末，Lot No.160pc-183)(Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被称重并用5.0ml食盐水溶液(0. 9％NaCl)或磷酸缓冲食盐水溶液(0.8％氯化钠，0.02％氯化 钾，0.115％二碱性磷酸钠和0.2％一碱性磷酸钾，pH调节 至7.4)水化。水化的悬浮液在仪器被设定为6.5时在涡旋 机(Scientific Industries，Bohemia，NY)上摇动10分钟。总体 积12ml将被观察到。食盐水溶液将从5.0ml减少至4ml。

由上述方法制造的气体和气体前体填充的微球体然后 用光学显微镜确定大小。将测定的是微球体的最大的规格范 围为约50至约60μm而检测的最小规格将为约15至20μm。

气体和气体前体填充的微球体然后用Swin-Lok Filter Holder，(Nuclepore Filtration Products，Costar Corp.，Cam- bridge，MA)和20cc注射器(Becton Dickinson & Co.，Ruther- ford，NJ)滤过8，10或12μm“NUCLEPORE”膜。该膜是10或 12μm“NUCLEPORE”膜(Nuclepore Filtration Products，Costar Corp.，Cambridge，MA)。10.0μm过滤器被放入Swin-Lod Fil- ter Holder且盖子被往下旋紧。类脂-基的微球体溶液被摇动 并通过18规格的针被转移到20cc注射器内。大约12ml的 气体和气体前体填充的微球体被放入注射器内，该注射器被 旋到Swin-Lok Filter Holder上。注射器和过滤器托的装配被 倒转使较大的气体和气体前体填充的微球体可升到顶部。然 后注射器被轻推，气体和气体前体填充的微球体以此方式被 过滤。

挤过10.0μm过滤器之后气体和气体前体填充的微球 体的残存率(在挤压过程之后和气体前体填充的微球体被保 留的量)为约83-92％。挤压之前，泡沫的体积为约12ml而水 溶液约4ml。挤压之后，泡沫的体积为约10-11ml，而水溶液 的体积为约4ml。

光学显微镜再次被用于测定挤压过的气体和气体前体 填充的微球体的大小分布。被测定的是最大的微球体范围为 约25至30μm，而被检测的最小的约5μm。平均大小范围约8 至15μm。

已被发现，过滤后，大于90％的气体和气体前体填充的 微球体小于15μm。

实施例2

掺杂冻干的气体和气体前体填充的微球体的制备

50mg1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱(MW： 734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被称重 并放入一离心管内，类脂然后用5.0ml食盐水溶液(0.9％ NaCl)水化。类脂悬浮液在仪器被设定为6.5时被涡旋10分 钟。涡旋后，整个溶液在液氮中冷冻。然后样品被放在冻干 机上冻干；样品保持在冻干机上18小时。冻干的类脂从冻干 机中取出，在5.0ml食盐水溶液中再水化并在设定6.5时涡 旋10分钟，此溶液的小样品被移到载玻片上，溶液在显微镜 下观察。气体和气体前体填充的微球体的大小然后被确定。 将被测定的是微球体的最大的规格为约60μm而检测的最 小规格为约20μm。平均大小范围约30至40μm。

实施例3

在大于类脂的相变温度下制备气体和气体前体填充的微球 体的不可能的例子

50mg1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱(MW： 734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被称重 并放入一离心管内。大约两英尺的乳胶管(0.25英寸内径) 以线圈形缠绕在圆锥形离心管上。该乳胶管然后用电绝缘胶 布扎牢到离心管上。该乳胶管然后被连接到恒温的循环浴 (VWR Scientific Model 1131)上。浴温被设定为60℃而水循 环被设定为通过管子高速循环。将一温度计放入类脂溶液并 发现在42℃和50℃之间。    

类脂悬浮液在仪器被设定为6.5时被涡旋10分钟。已 注意到很少类脂(相变温度＝41℃)泡沫发生，因而不适于形 成气体和气体前体填充的微球体。光学显微镜显示大的类脂 颗粒在溶液中。在此温度下形成的气体和气体前体填充的微 球体的量小于在低于相变温度形成的量的3％。悬浮液被放 置15分钟直到悬浮液温度均衡至室温(25℃)。该悬浮液然 后被涡旋10分钟。10分钟之后，发现气体和气体前体填充 的微球体形成。

上面说明在凝胶态对类脂涡旋以制造稳定的泡沫的必 要必性。

实施例4

掺杂冻-熔工艺的气体和气体前体填充的微球体的制备

50mg1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱(MW： 734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被放入 一离心管内。类脂然后用加入的5.0ml0.9％NaCl水化。类脂 水悬浮液在仪器被设定为6.5时被涡旋10分钟。涡旋后，整 个溶液在温度约45℃的水浴中加热接着冷冻。然后加热和 冷冻(冻-熔)过程被重复8次。在仪器被设定为6.5时水化 的悬浮液然后被涡旋10分钟。然后如实施例1所述检测气 体和气体前体填充的微球体。

实施例5

应用水缓冲液和丙二醇混合溶剂的气体和气体前体填充的 微球体的制备

10mg1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱(MW： 734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被放入 一离心管内。类脂然后用0.9％NaCl和丙二醇(9∶1或7∶ 1，V∶V)(Spectrum Chemical Mfg.Corp.，Gardena，Calif.)的 混合物水化。类脂水悬浮液在仪器被设定为6.5时被涡旋 10分钟。这样形成的气体和气体前体填充的微球体在Accu- sizer Model 770光学测大器(颗粒测大系统，Santa Barbara， Calif.)上测大小，其中等大小为＜10μm。

用其它丙二醇悬浮液制备气体和气体前体填充的微球 体的实验将显示出泡沫具有较小的平均直径并表现得比没 有丙二醇时更稳定。每毫克类脂泡沫高度(泡沫体积)比没有 丙二醇的大。用丙二醇的额外优点是可改进用于美容剂和皮 肤药输送目的的类脂基泡沫的选定组织渗透促进性质。

实施例6

维生素E包裹的气体和气体前体填充的微球体的制备

如实施例1相同的制备被进行，只是在涡旋之前， 100mg维生素E乙酸盐，U.S.P./N.F.(212μmol，Spectrum Chemical Mfg.Corp.，Gardena，Calif.)被加入，接着剧烈涡 旋。这样产生同一体积的泡沫；然而，现在含有维生素E。

实施例7

维生素D2或D3包裹的气体和气体前体填充的微球体的制 备

如实施例1相同的制备被进行，只是在涡旋之前， 100mg维生素D2(麦角钙化甾醇)，U.S.P./N.F.(252μmol， Spectrum Chemical Mfg.Corp.，Gardena，Calif.)或100mg维 生素D3(胆钙化甾醇)，U.S.P./N.F.(260μmol，Spectrum Chemical Mfg.Corp.，Gardena，Calif.)被加入，接着剧烈涡 旋。这样产生同一体积的泡沫；然而，现在分别含有维生素 D2或D3。

实施例8 维生素A包裹的气体和气体前体填充的微球体的制备

如实施例1相同的制备被进行，只是在涡旋之前， 100mg维生素A(乙酸视黄酯)，U.S.P./N.F.(304μmol， Spectrum Chemical Mfg.Corp.，Gardena，Calif.)被加入，接 着剧烈涡旋。这样产生同一体积的泡沫；然则，现在含有维生 素A。

实施例9 用于局部输送的气体和气体前体填充的微球体乳膏的制备

气体和气体前体填充的微球体根据描述于1991年6月 18提交的共同未决申请U.S诒717084和717899的方法制 备。

往一小的混合碗中加入60ml气体和气体前体填充的微 球体和10ml甘油。该混合物然后与2克羊毛脂轻轻调在一 起。此混合物被放在一边。在一分开的容器内然后加入2克 鲸蜡醇和1克胆甾醇基质。然后往其中加入2克sodium car- bomer 941，混合物再次调在一起。再往此混合物中加入预先 溶于1ml乙醇的50mg methylparaben，50mg propylparaben， 50mg Quternium 15。第二种混合物然后水磨成均匀体，两种 混合物被加在一起并再次调和。然后往此混合物中加入120 克亲水软膏，整个内容被调在一起产生光滑的，奶状的，润肤 剂。

实施例10

在混合的载体中的气体和气体前体填充的微球体的制备

10mg1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱(MW： 734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被放入 一离心管内。此类脂然后用0.9％氯化钠水溶液，甘油，和丙 二醇(8∶1∶1，V∶V∶V)(Spectrum Chemical Mfg.Corp.， Gardena，Calif.)的混合物水化。悬浮液在仪器被设定为6.5 时被涡旋10分钟。这样形成的气体和气体前体填充的类脂 双层然后在Accusizer Model 770光学测大器(颗粒测大系 统，Santa Barbara，Calif.)上测大小，其中等大小大约为 35mLs。

实施例11

基本没有水残留体积的气体和气体前体填充的微球体的制 备

与实施例10相同的工艺被应用，只是25mg ml-1至 50mg ml-1的类脂被使用。依靠涡旋，形成约45ml至50ml的 泡沫体积，并且明显地，制剂不含残留液体。

实施例12 带有胆甾醇硫酸酯的气体和气体前体填充的微球体的制备

如实施例10所述的制剂被应用，只是1-5MOL％的胆甾 醇硫酸酯(Sigma，St.Louis，Mo.)被加入。悬浮液然后被涡 旋产生类似于实施例10中所述的泡沫。

实施例13 带有PEG化类脂的气体和气体前体填充的微球体的制备

根据实施例10中的制备的制剂被应用，只是1-5MOL％ 的1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺-N-[聚(乙二 醇)5000](纯度99％，Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被 加入。悬浮液然后如实施例10中所述被涡旋产生类似于实 施例10中所述的泡沫。

实施例14

带有磷脂酸的气体和气体前体填充的微球体的制备

如实施例10中制备的制剂被应用，只是1-5MOL％的磷 脂酸(纯度99％，Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被包括 在制剂内。悬浮液然后如实施例10中所述被涡被产生类似 于实施例10中所述的泡沫。

实施例15

带有1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基甘油(DPPG)的 气体和气体前体填充的微球体的制备

如实施例10中制备的制剂被应用，只是1-10MOL％1， 2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基甘油(DPPG)(纯度 99％，Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)被包括在制剂内。 悬浮液然后如实施例10中所述被涡旋产生类似于实施例 10中所述的泡沫。

实施例16 带有1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基甘油(DPPG)和 磷脂酸的气体和气体前体填充的微球体的制备

如实施例10中所述制备的制剂被应用，只是1- 10MOL％的1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基甘油 (DPPG)(纯度99％，Avanti-Polar Lipids，Alabaster，Ala.)和 15MOL％的磷脂酸(纯度99％，Avanti-Polar Lipids，Al- abaster，Ala.)被包括在制剂内。悬浮液然后如实施例10中 所述被涡旋产生类似于实施例10中所述的泡沫。

实施例17

带有水溶性维生素(抗坏血酸)的气体和气体前体填充的微 球体的制备

如实施例10中所述制备的制剂被应用，只是0.5-5. 0MOL％的抗坏血酸(USP-FCC Roche Vitamins and Fine Chemi- cals，Nutley，New Jersey)被包括在制剂内。悬浮液然后如实 施例10中所述被涡旋产生类似于实施例10中所述的相当 奶油化的泡沫。相似的制剂用氩气，氮气和氖气制造，具有相 似的结果。

实施例18

带有水溶性维生素(抗坏血酸)的气体和气体前体填充的微 球体的制备

如实施例10中所述制备的制剂被应用，只是5.0- 50MOL％的抗坏血酸(USP-FCC Roche Vitamins and Fine Chemicals，Nutley，New Jersey)被包括在制剂内。悬浮液然后 如实施例10中所述被涡旋产生类似于实施例10中所述的 相当奶油化的泡沫。相似的制剂用氩气，氮气，和氖气制造， 具有相似的结果。

实施例19

从pH敏感的气体前体制备气体和气体前体填充的微球体

卵磷脂酰胆碱1克，在室温下被悬浮在100cc生理盐水 中以形成一多层微球体的分散体。微球体然后被放入容器 内，往其中加入碳酸氢钠(Mallinckrodt，St.Louis Mo)和一离 子载体(A231 87)导致碳酸氢盐包裹的微球体接触离子载 体。酸被加到外层水相以降低囊内的pH。捕集在囊内的碳酸 氢盐被发现形成CO2和水。

实施例20

从温度敏感的气体前体制备气体和气体前体填充的微球体

气体和气体前体填充的微球体被如实施例1制备，只是 气体前体2-甲基-2-丁烯被加入。随后乳液/悬浮液然后在室 温(20℃)被滤过一Nuclepore(Costar，Pleasanton，Calif.)0. 22μm膜。依靠升温至大约39℃，注意到气泡形成，产生气体 和气体前体填充的微球体。

实施例21

被光活化气体和气体前体填充的微球体的制备

气体和气体前体填充的微球体被如实施例1制备，只是 加入了光敏的重氮化合物。样品在室温(20℃)被滤过一Nu- clepore(Costar，Pleasanton，Calif.)0.22μm膜。依靠光照样 品，注意到气泡形成开始，产生气体和气体前体填充的微球 体。

实施例22

掺杂螯合物用于治疗牛皮癣的气体和气体前体填充的微球 体的制备

气体和气体前体填充的微球体被如实施例1制备，只是 250mg青霉胺(Bachem，Gardena，Calif.)被加入类脂悬浮液 中。悬浮液然后如实施例1微流化产生包裹了青霉胺的气体 和气体前体填充的微球体。此混合物被用于选定的组织以吸 收过量铜离子，因而治疗牛皮癣。

实施例23

掺杂螯合物用于治疗Wilson′s病的气体和气体前体填充的 微球体的制备

气体和气体前体填充的微球体被如实施例1制备，只是 250mg亲油螯合物EDTA-EOEA-DP被加入类脂悬浮液 中。悬浮液然后如实施例1微流体产生包裹了青霉胺的气体 和气体前体填充的微球体。此混合物被用于选定的组织以吸 收过量铜离子，因而控制过量和引起不适的铜离子。

实施例24

掺杂脂溶性化合物用于治疗Wilson′s病的气体和气体前体 填充的微球体的制备

气体和气体前体填充的微球体被如实施例1制备，只是 250mg青霉胺(Bachem，Gardena，Calif.)被加入类脂悬浮液 中。悬浮液然后如实施例1微流化产生包裹了青霉胺的气体 和气体前体填充的微球体。此混合物被用于选定的组织以吸 收过量铜离子，因而控制过量和引起不适的铜离子。

实施例25

掺杂脂溶性化合物用于治疗Wilson′s病的气体和气体前体 填充的微球体的制备

气体和气体前体填充的微球体被如实施例1制备，只是 250mg去铁胺(Aldrich Chemical Co，Milwaukee，Wis.)被加 入类脂悬浮液中。悬浮液然后如实施例1微流化产生包裹了 青霉胺的气体和气体前体填充的微球体。此混合物被用于选 定的组织以吸收过量铜离子，因而控制过量和引起不适的铜 离子。

实施例26

含基本没有水残留体积的气体和气体前体填充的微球体的 肥皂的制备

与实施例10相同的工艺被应用，只是25mg ml-1至 50mg ml-1的类脂被使用。往制剂中加入250mg至1g之间的 黄原胶(Kelco，San Diego，Cal.)和250mg至2g之间的 Duponol C(十二烷基磺酸钠，Witco，Houston，Tex.)。混合物 被涡旋10至20秒产生乳状泡沫，依靠用于选定的组织，给 出柔软和奶油样的感觉，但将其用于水中容易形成肥皂泡。

实施例27

具有类脂双层的全氟丙烷气体填充的微球体的形成

包含充气的类脂双层的微球体在两个20ml小瓶中用 6ml含普通(生理)食盐水∶丙二醇∶甘油(8∶1∶1，V∶V ∶V)的稀释剂中制备。往其中加入最终浓度从0.25mg ml-1 至最大50mg ml-1之间变化的类脂，重量比为82∶10∶8， (W∶W∶W)的二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)∶磷脂酸∶ 二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-PEG 5000的混合物。样品然后用 不漏气的和保持压力的隔膜盖密封。它们然后用全氟丙烷气 (99.99％，Scott Medical Gases，Plumbsteadville，Pa)清洗和排 泄至少3次。样品既可以在121℃在Barnstead Model c57853 Steam Sterlizer(Barnstead/Thermolyne Corporation，Dubuque， Iowa)中高压灭菌15分钟，也可从Nuclepore0.22μm过滤器 (Costar，Pleasanton，Calif.)过滤1至3次而灭菌。样品然后 从高压灭菌器内取出并被冷至大约40℃。该样品然后在 Wig-L-Bug涡旋器(Crescent dental Mfg.Co.，Lyons，Ill.)上 涡旋两分钟。产生的混合物明显地形成类似于泡沫的充气微 球体。包含充气的类脂双层的微球体然后用3种方法在Par- ticle Sizing Systems Model 770遮光检测器(Particle Sizing Sys- tems，Santa Barbara，Calif.)；配有刻度眼镜片的Reichert- Jung Model 150(Cambridge Instruments，Buffalo，New York)； 和Coulter Model(Coulter Industries，Luton Beds，England)上确 定大小。样品显示平均重量的大小约5-7μ，至少95％的颗粒 小于10μ。

实施例28

具有类脂双层的全氟丁烷气体填充的微球体的形成

与实施例27相同的工艺被应用，只是全氟丙烷被全氟 丁烷(97+％纯度，Flura Corporation，Nashville Tenn.)置换。 产生基本上相同尺度的全氟丁烷气体填充的微球体。

实施例29

含有全氟戊烷气体填充的类脂双层的微球体的形成

与实施例27相同的工艺被应用，只是全氟丙烷被大约 100μl的全氟戊烷(Flura Corp.，Nashville Tenn.)的空气置 换。类似于实施例27中所述的泡沫被观察到。

实施例30

含有全氟乙烷气体填充的类脂双层的微球体的形成

与实施例27相同的工艺被应用，只是全氟丙烷被相同 体积的全氟乙烷(Canadian Liquid Air，Ltd.，Montreal，Carna- da)置换。类似于实施例27中所述的泡沫被观察到。

实施例31

包裹孕甾酮的全氟丙烷气体填充的微球体的制备

与实施例27相同的工艺被应用，是4mg孕甾酮被加到 制剂中。类似于实施例27中所述的泡沫被观察到。二(2)ml 混合物，在抽到注射器中之前摇动，然后抽入并皮下注射到 人类(女性)自愿者的前臂手掌。皮下给药每两至六个月重复 一次。

实施例32

具有抗氧化剂和氧清除剂的充气微球体的制备

往50ml涡旋小瓶中加入4.4ml 27.2重量％抗坏血酸 (维生素C，Spectrum Pharmaceutical，Gardena，CA)(一种抗 氧化剂)的水混合物。往其中加入100μl含55000单位葡萄 糖氧化酶(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)(一种氧清除剂) 和4125单位过氧化氢酶(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的 溶液。然后往此溶液中加入500μL 5％(W∶V)的右旋糖 (Spectrum Pharmaceutical，Gardena，CA)溶液。产生的混合物 用氮气清洗并加入500mg干燥的二硬脂酰基磷脂酰胆碱(A- vanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama)。在1ml 1％鲸蜡醇溶 液被加入后，再用氮气清洗，最后在涡旋混合器(VWR Scien- tific，Cerritos，CA)上涡旋15分钟产生稠的，奶白色，充气微 球体的泡沫。

实施例33

往50ml涡旋小瓶中加入4.4ml 22.5重量％抗坏血酸 (维生素C，Spectrum Pharmaceutical，Gardena，CA)(一种抗 氧化剂)的水混合物。往其中加入100μL含55000单位葡萄 糖氧化酶(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)(一种氧清除剂) 和4125单位过氧化氢酶(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的 溶液。然后往此溶液中加入500μL 5％(W∶V)的右旋糖 (Spectrum Pharmaceutical，Gardena，CA)溶液。产生的混合物 用氮气清洗并加入500mg干燥的二硬脂酰基磷脂酰胆碱(A- vanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama)。产生的制剂再用全氟 丁烷层(Flura Corporation，Newport，TN)清洗，并在涡旋混合 器(VWR Scientific，Cerritos，CA)上涡旋15分钟产生稠的， 奶白色，充气微球体的泡沫。

在此文件中引用或描述的各个专利，专利申请和公开都 全文引作本文的参考。

除本文所描述的之外，本发明的各种变化形式从前面的 描述都将对于熟练的专业技术人员显而易见。这类变化形式 也被认为落在本申请的权利要求范围内。