技术领域
[0001] 本
发明涉及一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法，属于肿瘤组织培养方法领域。
背景技术
[0002] DC是由美国学者Steinman于1973年发现的，具有典型树突状形态，膜表面高表达MHCII类分子，是
机体内功能最强的
抗原提呈细胞，并具有下列优点：①是能够显著地刺激原始T
细胞增殖，是机体免疫应答的始动者；②并诱导持久而强有
力的抗肿瘤免疫反应；③取材简易，符合伦理学原则。因此DC树突细胞成为细胞
治疗理想的细胞，具有广阔的临床应用前景。然而呼吸系统的支气管部肿瘤组织不易获取保存，而且单纯的肿瘤抗原的免疫原性低并且易变。
[0003] 尽管研究人员尝试了很多获取组织的方法，试图取得新鲜组织，但组织在相关外科手术中，获取难度较大，给患者增加了额外的痛苦。并且组织活性的很难得到保证。目前广泛应用的DC培养体系多采用反复冻融，这样增加了工作难度，而且很难保证活性。另外，在组织反复冻融中，损失了大量细胞，使得获取目的细胞量难以得到保证。另外，组织在大量操作中，容易受到其他细菌或支原体等污染，不同组织操作差异大，以及难以达到统一的操作标准且组织进一步DC处理需要更多的操作，需要更多繁琐的步骤，使得其应用受到一定的限制。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法，克服
现有技术中新鲜组织获取难度大，给患者增加了额外的痛苦且组织活性难以保证及在DC培养体系工作难度大，细胞量难以得到保证的
缺陷。
[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤1)，在支气管镜引导，获取肿瘤组织并去除脂肪组织和
坏死组织；采用支气管镜下获取肿瘤组织，在体外培养自体肿瘤抗原冲击致敏的DC，以提高患者免疫系统对肿瘤抗原的提呈能力，诱导生成持久有效的特异性抗肿瘤免疫功能，可以尽量避免其他相应外科手术的各种弊端。可以保证获取组织的新鲜度、准确度,满足临床治疗和研究方面的需求。
[0007] 步骤(2)，将步骤(1)获取的肿瘤组织在gent leMACS全自动组织温和处理器中分离出肿瘤组织单细胞悬液；
[0008] 步骤(3)单细胞悬液通过过滤离心，制备成肿瘤抗原，灭菌冻存；
[0009] 步骤(4)制备树突细胞的第0小时，将
外周血单个核细胞置于OKM100培养基中、36.5-37.5℃CO2孵箱中培养；培养结束后，轻轻摇晃培养瓶，将细胞悬液转移至新的培养瓶；向剩余贴培养瓶壁的外周血单个核细胞中加由OKM100培养基、IL-4(白细胞介素4)及GM-CSF(粒细胞巨噬细胞刺激因子)构成的第一体系,置于36.5-37.5℃的CO2孵箱中开始计算培养时间；
[0010] 步骤(5)第65-75小时后，将步骤(4)中的OKM100培养基部分换成新鲜的OKM100培养基，继续置于36.5-37.5℃的CO2孵箱中培养；优选地，第3天，将步骤(4)中的OKM100培养基的1/2换成新鲜的OKM100培养基。
[0011] 步骤(6)第140-150小时后，将步骤(5)中的OKM100培养基部分换成新鲜的OKM100培养基，加入TNFα构成第二体系，继续置于36.5-37.5℃的CO2孵箱中培养；优选地，第6天，将步骤(5)中的OKM100培养基的1/2换成新鲜的OKM100培养基。
[0012] 步骤(7)第185-195小时后，优选地，第8天，加步骤(3)制备的的肿瘤抗原构成第三体系，使得第三体系中的肿瘤抗原浓度为1-100μg/ml，继续置于36.5-37.5℃的CO2孵箱中培养，4～8小时后
收获DC细胞。
[0013] 本发明的有益效果是：在支气管镜下获取组织通过在gentleMACS全自动组织温和处理器制备成单细胞悬液，制备成肿瘤抗原，从而成功诱导DC细胞。从简化组织获取及处理操作方面达到了与常规机械碾磨操作相同效果，在获取单细胞活率方面优于常规机械碾磨操作。在制备肿瘤抗原方面大大提高了效率，有利于临床应用。由于采用了简化组织获取及处理操作，大大避免了常规机械碾磨所存在的操作不稳定，易损失，活率低等缺陷，为诱导DC的
基础研究和临床治疗提供了很好的工具。同时，由于采取支气管镜获取组织，只需在手术过程中，在不影响病理诊断的前提下，切下肿瘤组织，满足扩增需要，极大减少了患者的痛苦。
[0014] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0015] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进3
一步，步骤(1)获取肿瘤组织。大小为1～5CM。
[0016] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进3
一步，步骤(1)获取肿瘤组织大小为1～3.5CM。
[0017] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进3
一步，步骤(1)获取肿瘤组织大小为2CM。由于采取支气管镜获取组织，只需在手术过程中
3
且在不影响病理诊断的前提下，切下肿瘤组织2cm，就可以满足扩增需要，极大减少了患者的痛苦。
[0018] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进一步，步骤(4)中IL-4及GM-CSF在第一体系中的浓度均为1-2000U/ml。优选地，所述IL-4及GM-CSF在第一体系中的浓度1-1500U/ml，更优选地所述IL-4及GM-CSF在第一体系中的浓度1000U/ml。
[0019] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进一步，步骤(6)中所述TNFα在第二体系中的浓度为1-30ng/ml。优选地，所述TNFα在第二体系中的浓度为1-20ng/ml；更优选的所述TNFα在第二体系中的浓度为10ng/ml。
[0020] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进一步，步骤(4)至(7)中CO2孵箱中
温度为37℃，CO2浓度为5％。
[0021] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进一步，步骤(2)单细胞悬液的具体制备过程为：将RPMI 1640或者DMEM、Enzyme H、Enzyme R及Enzyme A混合于gentleMACS全自动组织温和处理器配套设备C管中处理，其中所述RPMI 1640或者DMEM为1-8.7mL，Enzyme H为1-400μL，Enzyme R为1-400μL，Enzyme A为1-100μL。
[0022] 优选地，所述RPMI 1640或者DMEM为1-6.7mL，Enzyme H为1-200μL，Enzyme R为1-200μL，Enzyme A为1-50μL。更优选地，所述RPMI 1640或者DMEM为4.7mL，Enzyme H为200μL，Enzyme R为100μL，Enzyme A为250μL。
[0023] 上述
试剂可以采用如下方法配制：1、用3mL的RPMI 1640或DMEM溶解Enzyme H冻干粉，无菌操作。2、用2.7mL RPMI 1640或DMEM溶解Enzyme R冻干粉，完全溶解。3、用1mL的Buffer A溶解Enzyme A，不要涡旋振荡。
[0024] 步骤(3)所述过滤离心为：将单细胞悬液经过200目一次性尼龙筛网，进行过滤；再经过4℃，10000rpm/min，30min离心，取上清，留样检测蛋白含量及细菌、
真菌和支原体，制成制备成肿瘤抗原，灭菌冻存于-80℃；
[0025] 步骤(7)加入肿瘤抗原前，将肿瘤抗原用0.22μ滤器过滤除菌。
[0026] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进一步，步骤(7)的第三体系中的肿瘤抗原浓度为1-50μg/ml。
[0027] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进7
一步，步骤(7)收获DC细胞量为1*10。
[0028] 本发明如上所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,进一步，步骤(4)所述的外周血单个核细胞(PBMC)通过以下方法采集与分离：
[0029] 401，
真空抗凝无菌管采静脉
全血40ml；
[0030] 402，吸20～30ml血进入淋巴细胞分离管(含分离液15ml)分离，2500rpm/15min；剩余10～20ml血同时分离
血浆，2500rpm/15min；
[0031] 403，分离后吸出最上层的血浆放入50ml离心管→56℃，30min→离心，3000rpm/15min，4℃保存；同时细胞混悬液层，放入15ml离心管，加PBS至管满，离心，
2500rpm/15min；
[0032] 404，弃细胞上清，加RBC溶解液5～10ml，混匀后，至37℃ 5～10min，离心，2000rpm/5min；
[0033] 405，弃上清，PBS洗掉红细胞(RBC)碎片，用10ml PBS混匀细胞悬液，吸管剩余液
体细胞计数(数5格数×5×10000×10＝n×107，把此数÷25或÷50ml，即25或50ml中的细胞数/ml)；此外，10ml
磷酸盐缓冲液(PBS)混匀细胞悬液离心，2000rpm/5min，弃上清后加入75cm2培养瓶中，
[0034] 406，加自然杀伤细胞(NK)细胞培养所需的淋巴细胞培养基(OKM100)培基，加5ml自体血浆至75cm2培养瓶，放置37℃ 5％CO2孵箱中培养；获得处理的外周血单个核细胞(PBMC)。
附图说明
[0035] 图1为本发明
显微镜下观察培养2d的DC细胞的形态特征示意图；
[0036] 图2为本发明显微镜下观察培养5d的DC细胞的形态特征示意图；
[0037] 图3为本发明显微镜下观察培养8d的DC细胞的形态特征示意图；
[0038] 图4为DC细胞细胞生长曲线图；
[0039] 图5-图11为空白对照、CD1a，CD83，CD86，CD80，CD40，HLA-DR阳性表达率。
具体实施方式
[0040] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0041] 本发明一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,具体包括以下步骤
[0042] 1、通过支气管镜引导，获取肿瘤组织并去除脂肪组织和坏死组织；具体操作如下：
[0043] 101，术前：无菌操作下一次性灭菌50ml离心管内加入8万单位庆大霉素、两性霉素B10mg/10ml注射用生理盐
水用于患者手术标本的保存；
[0044] 102，术中:在支气管镜引导，在不影响病理诊断的前提下，切下肿瘤组织获取肿3
瘤组织大小为2CM，装入上述离心管；
[0045] 103，含8万单位庆大霉素/10ml注射用生理盐水洗涤肿瘤组织
块2次，剔除脂肪组织和坏死组织后，重复洗涤2次。
[0046] 2、将步骤(1)获取的肿瘤组织在gentleMACS全自动组织温和处理器中分离出单细胞悬液；具体操作步骤如下：
[0047] 201，将以下已经处理好的各种缓冲液和培养基混合于C管中
[0048] RPMI 1640or DMEM,4.7mL
[0049] Enzyme H,200μL
[0050] Enzyme R,100μL
[0051] Enzyme A,25μL
[0052] 加入至德国美天旎
生物技术公司生产的gentleMACS全自动组织温和处理器的C管中
[0053] 上述的缓冲液和培养基可以采用gentleMACS全自动组织温和处理器中
试剂盒的缓冲液和培养基代号。
[0054] 202，将步骤(1)获取的肿瘤组织加入C管；(gentleMACS全自动组织温和处理器配套的离心管，带有内置
转子和
定子系统，用于解离组织)
[0055] 204，拧紧管盖，头向下安装在解离器的套筒上，拧紧。安装后，组织位于定子和转子的部位。
[0056] 205，运行程序h_tumor_01,转速1000rpm,时间60s；
[0057] 206，程序终止后，取下C管；
[0058] 207，37℃孵育30分钟，孵育过程注意混匀；
[0059] 208，把C管头向下安装在解离器的套筒上。安装后，组织位于定子和转子的部位；
[0060] 209，运行程序h_tumor_01，转速2000rpm,时间180s；程序终止后，取下C管；
[0061] 210，37℃孵育30分钟，孵育过程注意混匀。
[0062] 211，把C管头向下安装在解离器的套筒上。安装后，组织位于定子和转子的部位。
[0063] 212，运行程序h_tumor_02，转速2000rpm,时间180s；
[0064] 213，把样品吸出，加到70μm滤器上，用50mL离心管收集。
[0065] 214，使用20mL的RPMI 1640或DMEM冲洗滤器。
[0066] 215，离心转速2000rpm,时间180s，7分钟，弃上清。
[0067] 216，重悬细胞，用于后续实验。
[0068] 217，将细胞悬液经过200目一次性尼龙筛网，进行过滤。
[0069] 218，离心，4℃，10000rpm/min，30min，取上清，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体，灭菌冻存管数管-80℃保存。
[0070] 步骤(3)单细胞悬液通过过滤离心，制备成自体肿瘤抗原，灭菌冻存；
[0071] 3、DC细胞制备流程：
[0072] 301，第0天，PBMC采集与分离，75％的PBMC进行冻存。人NK细胞培养用OKM100培基悬浮余下PBMC。
[0073] 在37℃5％CO2孵箱中培养4小时。轻轻摇晃培养瓶，将细胞悬液转移至新的培养瓶继续培养。剩余贴壁细胞加人NK细胞培养用OKM100培基10ml，每毫升培养基中含有IL-4及GM-CSF各1000U，37℃5％CO2培养，结果如图1。
[0074] 302，第3天，将细胞培养基轻轻吸出5ML,并添加新鲜的人NK细胞培养用OKM100培基5ml，37℃5％CO2孵箱培养，结果如图1。
[0075] 303，第6天，将细胞培养基轻轻吸出5ml,并添加新鲜的人NK细胞培养用OKM100培养基5ml，加入肿瘤坏死因子α，每毫升培养基中含TNFα10ng，37℃5％CO2孵箱培养，结果如图2。
[0076] 304，第8天，加用0.22μ滤器过滤除菌的自体肿瘤抗原30μg/ml，37℃5％CO2培养。结果如图3，4～8小时后收获DC细胞。
[0077] 如果临床有需要，可以每7天为一周期，先后分三次复苏冻存的PBMC，按上述流程制备DC。
[0079] 细胞生长性能检测
[0080] (1)细胞生长曲线
[0081] 每天取培养的DC细胞100ul，计数，以时间(d)为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。
[0082] 如图4所示,DC细胞在0天，2天数量没有明显的变化，从第3天起，细胞大量增加，至第6天细胞量达到高峰，以后细胞增长速度减慢。
[0083] (2)表型检测
[0084] 取第8天DC细胞600UL,(5×106细胞/ml)，在每一管中分别加入2m1PBS洗液，并充分混匀，室温中静置5min。1000转/min离心5min，用PBS缓冲液冲洗重悬。加入连接有
荧光素的单克隆
抗体及其同型对照进行免疫标记反应，暗箱室温下孵育30min。1000转/min离心10min。用PBS缓冲液冲洗重悬，重复冲洗一次，通过流式检测PE标记的CD1a，CD83，CD86，CD80，CD40，HLA-DR阳性表达率，结果如图5-11，对照、CD1a，CD83，CD86，CD80，CD40，HLA-DR阳性表达率符合DC细胞表面抗原特征。
[0085] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
