发明的技术领域

本发明涉及四氢生物喋呤(BH4)或其衍生物在治疗COPD中的新 用途。

现有技术

内皮组织依赖性血管扩张的减少主要是由内皮组织依赖性血管扩 张因子一氧化氮(NO)生物利用度的降低和作为血管收缩因子的毒性氧 自由基例如超氧负离子活性的提高所引起的。

现有技术中已知的是一氧化氮合酶(NOS:nNOS(NOS1)，iNOS (NOS2)和eNOS(NOS3))能够产生NO和超氧负离子。NOS产生NO过程中的关键似乎是四氢生物喋呤(BH4)的存在。

BH4是NOS的重要辅助因子，能够影响NOS对于NO和超氧化 物的产率[Werner-Felmayer G et al.(2002)Current Drug Metabolism 3： 159]。当BH4减少时，NOS产生的是超氧负离子而不是NO[Vasquez-Vivar et al.(1998)PNAS 95：9220]。超氧负离子可以使NO快 速失效，形成血管毒性过亚硝酸盐(ONOO-)。在存在毒性氧基团即超氧 负离子和ONOO-情况下，BH4降解为BH2。BH2不能作为NOS的辅 助因子，并且对于NOS的活性具有负性影响[Landmesser et al.J Clin Invest(2003)111：1201]。另外，ONOO-与NOS解偶联以使NOS产生 的是超氧负离子而不是NO。在内皮组织内，NO在血管扩张中具有中 枢性作用，然而过氧化物导致血管收缩。BH4的降解、NOS的解偶联 以及产生的内皮组织中NO浓度的降低导致血管收缩并最终血压过 高。

现有技术中已知的是BH4在很多生物学进程、伴随神经递质形 成、血管扩张和免疫应答中具有关键性作用[VVerner-Felmayer G et al.(2002)Current Drug Metabolism 3：159]。例如“非典型”苯丙酮尿 症中BH4的产生不足[Werner-Felmayer G et al.(2002)Current Drug Metabo-lism 3：159]，这就造成动脉粥样硬化、糖尿病、血胆固醇过多 和抽烟中的内皮机能障碍[Tiefenbacher et al.(2000)Circulation 102： 2172，Shinozaki et al(2003)J Pharmacol Sci 91：187，Fukuda et al(2002) Heart 87：264，Heitzer et al(2000)Circulation 86：e36]。

现有技术中已知的是BH4能够改善内皮机能障碍，因此增加NO的利用度并减少存在的毒性基团。BH4对于由其对NOS的辅助因子作 用造成的内皮机能具有有益作用[Werner-Felmayer G et al.(2002) Current Drug Metabo-lism 3：159]。

如现有技术中已知的，BH4及其作为药物的用途与某些疾病相关 联。根据Ueda et al.[Ueda S et al.(2000)J.Am.Coll.Cardiol.35：71]， BH4能够改善长期吸烟者的内皮依赖性血管扩张。根据Mayer W.etal. [Mayer W.et al.(2000)J.Cardiovasc.Pharmacol.35：173]，使用BH4 能够显著改善人体内冠状血流量反应。W09532203披露了NOS抑制性 蝶啶衍生物(“抗蝶呤”)在治疗由于NO水平提高引起的疾病中的用途。 特别是，W09532203公开了抑制性蝶啶衍生物用于预防和治疗病理学 血压降低、溃疡性结肠炎、心肌梗塞、移植排斥、Morbus Alzheimer、 癫痫和偏头痛。EP0908182指出包括BH4或其衍生物的药物组合物可 用于预防和/或治疗与NOS异常相关的疾病。EP0209689公开了四氢生 物喋呤在制备用于治疗小儿孤独症的药物中的用途。

现有技术从未披露过BH4或其衍生物在预防或治疗COPD方面的 用途。

发明简述

本发明涉及BH4或其衍生物在预防和/或治疗呼吸系统疾病中的 用途。特别而言，本发明涉及BH4或其衍生物在预防和/或治疗COPD 中的用途。令人惊奇的是，已经发现BH4或其衍生物能有利的用于预 防和/或治疗呼吸衰竭中的灌注-通气失谐和特别有利的用于预防和/或 治疗COPD。

第一个实施方案中提供了BH4或其衍生物在制备预防和/或治疗 呼吸系统疾病的药物中的用途。

本发明的另一个实施方案中提供了BH4或其衍生物在制备预防和 /或治疗选自COPD、支气管哮喘、肺纤维化、肺气肿、肺间质性病变 和肺炎疾病的药物中的用途。

本发明的另一个实施方案中提供了BH4或其衍生物在制备预防和 /或治疗COPD的药物中的用途。

本发明的另一个实施方案中提供了BH4或其衍生物在制备预防和 /或治疗COPD患者中肌功能障碍的药物中的用途。

本发明的另一个实施方案中提供了含BH4或其衍生物的药物制剂 在预防和/或治疗COPD中的用途。

本发明的另一个实施方案中提供了一种预防和/或治疗所需患者 COPD的方法，包括给药BH4或其衍生物的步骤。

本发明的另一个实施方案中提供了一种商业化产品，包括常规的 附属包装，含有BH4或其衍生物的药物制剂的基本包装，和如果需要 的话，还包括使药物制剂适于所需患者COPD的预防和/或治疗的包装 植入物。

发明详述

本发明的目的是BH4或其衍生物在治疗伴有潜在性肺和肺外改变 的呼吸系统疾病中的新的药物用途。本发明还涉及BH4或其衍生物在 制备预防和/或治疗呼吸系统疾病，尤其是预防和/或治疗COPD的药物 中的用途。

术语″BH4″(四氢生物喋呤)是指具有下式的四氢生物喋呤的所有 天然和非天然的立体异构形式或其药学上可接受的盐：

其中R1和R2分别代表氢原子，或互相共同取用，代表单键，同时R3 代表-CH(OH)CH(OH)CH3、-CH(OCOCH3)CH(OCOCH3)、-CH3、 -CH2OH，或当R1和R2分别代表氢原子时R3为苯基，或当R1和R2 共同代表单键时R3为-COCH(OH)CH3。

有利的用于本发明中的“BH4或其衍生物”包括在EP0908182和 EP0079574中披露的化合物。

特别提及的是如下化合物和这些化合物药学上可接受的盐：

[(6R)-L-红-5，6，7，8-四氢生物喋呤(BH4)]，

(6R，S)-5，6，7，8-四氢生物喋呤，

[1′，2′-二乙酰基-5，6，7，8-四氢生物喋呤]，

[墨蝶蛉]，

[6-甲基-5，6，7，8-四氢生物喋呤]，

[6-羟甲基-5，6，7，8-四氢生物喋呤]，

[6-苯基-5，6，7，8-四氢生物喋呤]，

术语″药学上可接受的盐″中所涵盖的盐是指通过游离碱和适宜的 有机或无机酸反应或酸和适宜的有机或无机碱反应通常制得的化合物 的无毒盐。特别需要提及的是在药学上通常使用的药学上可接受的无 机和有机酸。适当的盐特别是水溶性和水不溶性酸加成盐，所述酸例 如是盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、醋酸、枸橼酸、D-葡萄糖酸、 苯甲酸、2-(4-羟苯甲酰基)-苯甲酸、丁酸、磺基水杨酸、马来酸、月 桂酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、双羟萘酸、硬脂酸、 甲苯磺酸、甲磺酸或1-羟基-2-萘酸，在盐的制备中使用的酸根据下述 标准选择：其是单元酸还是多元酸，哪种盐在等摩尔量比例时是理想 的或者与其他盐有所区别。

举例的的碱盐是锂、钠、钾、钙、铝、镁、钛、铵、葡甲胺或胍 盐，在盐的制备中使用的碱是等摩尔量比例的或不等比例的。

可以理解的是，本文中提及的活性化合物及其药物可接受的盐也 可以以其他形式存在，例如药物可接受的溶剂化物形式，特别是水合 物形式。

术语“呼吸系统疾病”指的是局部或总体呼吸障碍的肺部疾病， 即肺部氧摄取或二氧化碳释放有所损害。

无论是休息还是运动状态，人类健康的肺中总是同时存在好的和 差的或者完全不通气的区域(通气不均一性)。一种尚未可知的机理 确保了仅有少许或者没有灌注的毛细血管对于邻近的海马槽进行少量 通气或者不通气。这是为了将不包括在气交换中的肺部区域的无效灌 注量减少到最小。在机体运动的过程中，换气分布进行变化(补充新 的肺泡)，并且相关的毛细血管床灌注有所增加。相反，当由于生理 或病理学过程(气道阻塞)导致通气减少时，毛细管流通过血管收缩 也有所减少。这一过程被称作低含氧量血管收缩(Euler-Liljestrand机 理)。

当通气和灌注的这一适应性机理受到损伤时(配合不当)，尽管 肺部充分换气并且灌注正常，仍有可能出现或多或少的显著性换气功 能缺陷，尽管通气或灌注会有进一步的增加，这一缺陷也只是得到了 不适当性补偿。在这些情况下，会出现不通气但灌注良好(分路)的 区域和通气良好但不灌注(无效腔通气)的区域。“通气/灌注配合不 当”的结果是血氧不足(气交换衰退并且患者血氧浓度降低)、无效 灌注(不通气区域的浪费性灌注)和无效通气(差的灌注区域浪费性 通气)。

“局部或总体呼吸障碍”的原因是肺内灌注状况对于多种不同通 气分布情况的不恰当适应。产生的配合不当来自于作用于血管的(炎 症)介质的作用，这种作用强于生理性适应机理。这种作用在运动过 程中和需氧量有所增加时尤其显著，这已经通过呼吸困难(缺氧)和 人体机能受限得到了证明。

本发明所述的“局部呼吸障碍”指的是在上述摄氧量或二氧化碳 释放损伤时以血中O2分压力的降低为表征。

在本发明中，“总体性呼吸障碍”指的是上述摄氧量或二氧化碳 释放损伤时以血中O2分压力的降低和CO2分压力的升高为表征。

在患有炎症和变性肺疾病例如慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管 哮喘、肺纤维化、肺气肿、肺间质性炎病变和肺炎的患者中，可以观 察到局部或总体性呼吸障碍。因此，本发明的术语“有此需要的患者” 指的是具有至少一种下述临床症状的患者：COPD、支气管哮喘、肺纤 维化、肺气肿、肺间质性炎病变或肺炎。

术语“COPD”是慢性阻塞性肺病的缩写。患有COPD的患者症 状是肺变化以及肺外变化例如人体机能受限。肺变化是由于炎症、粘 液分泌过多和肺气管变化造成的气道梗阻改变。造成的气道限制和呼 吸上皮损失致使氧合作用受损。另外，血管重构[Santos S et al. Eur Respir J 2002 19：632-8]和强于生理性适应机理的作用于血管性(炎 症)介质的作用所引起的通气/灌注配合不当造成肺部血液循环受到损 伤，这种损伤还有一部分原因是在疾病的发展过程中肺部毛细血管生 长而造成的结构改变。在运动期间或需氧量有所增加时这种作用尤其 明显，并且这已经通过呼吸困难(缺氧)和人体机能受限得到了证明。

现已令人惊奇地发现，BH4适于治疗具有局部或总体性呼吸障碍 的患者。根据本发明，在内皮组织中，NOS的失调和ONOO-浓度的升 高都能够导致BH4氧化，因而降低肺和骨骼肌中BH4的浓度。BH4 浓度的降低造成了NOS(iNOS和eNOS)的解偶联以及超氧化物浓度的 升高，最终产生ONOO-。超氧负离子浓度的升高产生了更多的 ONOO-，而ONOO-的增多则减少了肺部和骨骼肌中的BH4。这种超氧 化物、ONOO-产物和BH4失活的循环最终导致内皮机能障碍和通气/ 灌注配合不当。施用BH4能够重新和NOS(即NOS产生NO而不是超 氧负离子)偶联，减少超氧负离子和ONOO-的产生，并增加尤其是能够 造成血管扩张的NO。

术语“预防和/或治疗呼吸系统疾病”和“预防和/或治疗局部或总 体性呼吸障碍”以及术语“预防和/或治疗COPD”指的是下述这样一 种状况，施用BH4以扩大肺循环中的血管，同时在肺中重新分配血流 以支持良好的通气区域。下文中作为重新分配的这一原则能够改善患 者在休息和体育锻炼时肺的换气功能，所述患者患有局部或总体性呼 吸障碍，例如COPD患者。重新分配不仅能够改善肺中的换气，还能 够改善在骨骼肌中的换气，因此能够改善身体的机能。准确地说，术 语“预防和/或治疗COPD患者的肌肉机能异常”是指对于COPD患者 施用BH4产生的正性作用。

BH4或其衍生物可以根据本领域技术人员已知的任何适当路线进 行给药。药物制剂包括适于口服、胃肠外给药(包括皮下、皮内、肌 内、静脉内和关节内)、鼻内给药、吸入(包括可以通过定量加压气 溶胶、喷雾或吸入器等各种类型的方法产生的细小颗粒粉剂或雾剂)、 直肠给药和局部给药(包括真皮、口腔、舌下和眼内给药)，虽然最 适合的给药路线需要根据例如受试者的状况和病症决定。

本发明的药物可利用本领域已知的多种方法进行给药，尽管对于 很多治疗应用较为优选的给药路线是口服。另一种优选的给药路线是 吸入BH4或其衍生物。

对于要口服使用的药物组合物，可以根据本领域技术人员已知的 和熟悉的方法配制成治疗药物。治疗药物作为药品使用，优选与适当 的药物载体以片剂、包衣片剂、胶囊、乳剂、混悬液、糖浆剂或溶液 形式共同使用，治疗药物的重量含量为0.1-95％，对于选择适当的载 体，其可能制成针对治疗药物和/或预期目的药物给药形式(例如缓释 制剂和肠道给药制剂)。

本领域技术人员根据其专业知识很熟悉哪些载体或辅料适于预期 的药物制剂。除了溶剂、凝胶试剂、片剂辅料和其他活性化合物载体 之外，还可以使用例如抗氧化剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、矫味剂、 防腐剂、增溶剂、着色剂或渗透促进剂和络合剂(例如环糊精)。

吸入制剂包括粉末组合物，其优选包括乳糖，和喷雾组合物例如 可制备成使用适当的推进剂通过压力传送药物的水溶液、混悬液或气 溶胶，推进剂例如是1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-六氟丙烷、二氧 化碳或其他适当的气体。与常规含氯氟烷相比，认为具有最少的臭氧 排除作用的推进剂类型包括氢氟烃类，很多使用这种推进剂系统的药 物气溶胶制剂在例如EP 0372777、WO91/04011、WO91/11173、 WO91/11495、WO91/14422、WO93/11743和EP 0553298中进行了描 述。这些申请均与使用药物的加压型气溶胶的制备相关，并试图克服 与使用这种新型的推进剂相伴随的问题，特别是与药物制剂制备相关 的稳定性问题。这些申请提出例如加入一种或多种辅料，如极性潜溶 剂(例如醇类如乙醇)、烃类、二甲醚、表面活性剂(包括氟化的和 非氟化的表面活性剂、羧酸例如油酸和聚乙氧基化物等等)或填充剂 例如糖(例如参见WO02/30394)。对于混悬型气雾剂而言，活性成分 应当微粒化以达到通过使用气溶胶制剂将基本上所有的活性成分吸入 至肺中，因此活性成分的颗粒大小应当小于100mm，优选小于20mm， 优选1-10mm，例如1-5mm。

虽然最终是由临床医生决定给药剂量，但本领域技术人员知道以 下述顺序程序确定给药剂量：需要治疗的患者的常规数量级、给药途 径、治疗的症状和患者状况。

如果以口服方式施用BH4制剂的话，已证实每天服用1-3片药物 是有益的，其中每片药物含有10-500mg的BH4或其衍生物。优选地， 对患者使用的本发明制剂中BH4或其衍生物的用量为每天0.5- 50mg/kg体重。通常在慢性呼吸系统疾病例如COPD的长期治疗过程 中，数年中BH4或其衍生物的给药量为10-100mg的剂量每天1-3次。 在治疗慢性疾病的急性发作时，可将剂量上升至500mg。

还可以通过吸入或静脉、皮下注射给药BH4或其衍生物进行慢性 疾病的连续性治疗。

如果以吸入方式使用BH4或其衍生物，可以制备成本领域技术人 员已知的药物剂型，剂量为需要治疗患者的常规量。已证明通过下述 方案以吸入方式使用BH4或其衍生物是有益的：优选地，将10-1000mg 的BH4或其衍生物溶于含有1％抗坏血酸的无菌水中。使用一种吸入 装置每天施用此溶液1-3次，达到的BH4最终量为0.5-50mg/kg体重/ 天。已证明通过连续吸入10-500mg的BH4给药1-3次是有益的。在治 疗慢性疾病的急性发作时，可根据主治医师的经验增加给药剂量。

包含药物制剂和本领域技术人员常规知识范围内的患者包装规格 的“附属包装”、“基本包装”被视为这类药物制剂的标准商业产品。 适当的“基本包装”例如是发疱药。如果是吸入给药的话，术语“适 当的基本包装”是指包括BH4或其衍生物的管形瓶、包括无菌水和适 当吸入装置的管形瓶。适当的“附属包装”例如是折叠箱。

在本发明优选实施方案中，BH4或其衍生物与精氨酸或其衍生物 联合应用用于预防和/或治疗呼吸系统疾病，特别是用于生产预防和/ 或治疗呼吸系统疾病的药物，优选预防和/或治疗COPD。

BH4或其衍生物和精氨酸或其衍生物的组合无论是在一个制剂中 (同时结合)还是在分有几个部分的药盒中，所述药盒的各个部分可 以通过相同或不同的途径(分离的组合)给药也可以通过相同或不同 的途径(相继的组合)在不同的时间点给药，在给定剂量下组合物与 仅使用其中一种药物相比有可能取得更显著的预防或治疗呼吸系统疾 病效果。

术语“精氨酸或其衍生物”指的是精氨酸，优选L-精氨酸(任意 的)；精氨酸前体，优选L-精氨酸的前体；精氨酸的生理学耐受性酸 药物可接受盐，优选L-精氨酸的生理学耐受性酸药物可接受盐；和精 氨酸药物可接受的衍生物，优选L-精氨酸药物可接受的衍生物。

优选的L-精氨酸药物可接受盐是L-精氨酸盐酸盐(L-Arg HCI)、L- 精氨酸acetylaspariginate、L-精氨酸天冬氨酸盐、L-精氨酸柠檬酸盐、 L-精氨酸谷氨酸盐、L-精氨酸戊邻酮二酸盐、L-精氨酸tidiacicate和 L-精氨酸timonacicate。

精氨酸及其衍生物可以通过常规的口服或胃肠道外(皮下、静脉 注射、肌内、腹膜内、直肠给药)方式进行给药。还可以使用蒸汽或 喷雾剂通过鼻咽通道给药。优选的是口服给药。

给药剂量取决于年龄、病况、患者体重和给药方式。可以施用多 个单个的剂量(例如2-4)或者每天给药一次或两次进行给药。

如果口服施用精氨酸或其衍生物的话，已证明对于成年人每天使 用至少2g-30g是有益的，优选6g-24g，最优选每天约10g。

优选地，本发明药物制剂的给药剂量为精氨酸或其衍生物的用量 为50mg-1200mg/kg体重/天。，优选200mg-800mg/kg体重/天。

如上文所述，BH4或其衍生物和精氨酸或其衍生物可以在药物组 合物中同时给药、通过不同途径同时给药、各个部分可以通过相同或 不同的途径(分离的组合)给药也可以通过相同或不同的途径(相继 的组合)在不同的时间点给药的多部分药盒给药。

因此，本发明还涉及同时、分开或相继给药用于预防和/或治疗呼 吸系统疾病的包含BH4或其衍生物和精氨酸或其衍生物的药物组合物 制剂。术语“制剂”优选是指“具有多个部分的药盒”。

在一个优选的实施方案中，BH4或其衍生物和精氨酸或其衍生物 在两个不同的口服药物组合五中同时施用。

在另一个优选的实施方案中，BH4或其衍生物和精氨酸或其衍生 物同时但通过不同的途径分开给药。在这个优选的实施方案中，如上 文所述通过吸入方式施用BH4或其衍生物，而精氨酸或其衍生物则口 服使用。

在另一个优选实施方案中，BH4或其衍生物和精氨酸或其衍生物 在一个口服药物组合物中同时施用。

因此，本发明还涉及包含BH4或其衍生物和精氨酸或其衍生物的 药物组合物。在一个优选的实施方案中，药物组合物还包括药物可接 受的载体。在另一个优选实施方案中，该药物组合物被用做药品，优 选用于预防和/或治疗呼吸系统疾病。

各化合物可以以常规的固体或液体药物形式分开或同时使用，例 如不包衣或(薄膜)包衣片剂、胶囊、粉末、颗粒、栓剂、溶液、软 膏、乳剂或喷雾剂。这些制剂均以常规方法进行制备。其中，活性物 质可以使用常规的制药辅料进行处理，所述辅料例如是片剂粘合剂、 填充剂、防腐剂、片剂崩解剂、流量调节剂、增塑剂、润湿剂、分散 剂、乳化剂、溶剂、缓释剂、抗氧化剂和/或推进剂(cf.H.Sucker et al. Phar-maceutische Technologie，Thieme Verlag，Stuttgart，1978)。由这 种方法得到的药物形式中通常包括0.1-99％重量的活性物质。

本发明的主题还有药物制剂，其中包括根据上述给药方式应用的 在适当容器中的BH4或其衍生物和分开的容器中的精氨酸或其衍生 物。

本发明制备的药物包装单位由包括BH4或其衍生物的适当给药形 式和包括精氨酸或其衍生物的适当包装单位组成。两种活性化合物优 选在两个不同容器的包装单位中，例如多个片剂或片剂和吸入装置。 另外，药物包装单位还包括说明书，例如在包装说明书中建议使用共 同使用治疗有效量的BH4或其衍生物和精氨酸或其衍生物是有益的。

如果分开给药，则BH4或其衍生物在使用精氨酸或其衍生物之 前、同时或之后使用。

本发明还涉及一种商业包装，其中包括药物BH4或其衍生物和/ 或精氨酸或其衍生物，以及用于说明同时、分开或相继使用药物用于 预防和/或治疗呼吸系统疾病的说明书。

工业实用性

迄今为止，市场上只有噻托溴铵作为支气管扩张药用于治疗COPD 症状。因此，目前尚未出现治愈性治疗。本发明的有益效果涉及使用 已知化合物即BH4或其衍生物对于COPD进行治愈性治疗，所述已知 化合物的性质(已知的副作用、吸收、分布、代谢和排泄)也是已知 的。BH4或其衍生物对于COPD的治疗找到了COPD患者由于重新分 配作用和COPD炎性成分通过其对于NOS的偶联作用产生的受损伤氧 合作用，因此改善了氧合作用和COPD患者的身体机能。

实施例

实施例1：

可注射BH4制剂的制备

将1.5g BH4二氢盐酸盐、1.5g抗坏血酸、0.5gL-孕尿翳盐酸盐和 6.5g甘露醇溶于无菌纯水中，加至100ml，制得同质溶液，然后进行杀 菌，每1ml溶液装入一个管形瓶或安瓿中，低压冻干，密封。

实施例2：

可注射BH4制剂的制备

在缺氧的大气条件下，将2.0gBH4二氢盐酸盐溶于无菌去离子水 中，加至100ml，低压冻干，密封。

实施例3：

片剂的制备

将10份抗坏血酸和5份L-半胱氨酸盐酸盐加入到1份溶于无菌去 离子水尚未形成同质溶液的聚乙烯吡咯酮中，然后加入10份BH4二氢 盐酸盐制得同质溶液。该溶液与58份乳糖、15份微晶纤维素和1份硬 脂酸镁相混合，然后制备成片剂。

实施例4：

通过内皮细胞将BH4衍生物转变为BH4

在适当的培养基中培养内皮细胞(HUVEC和EA.hy926)，然后分 别使用墨蝶呤和BH4(每个100μM)进行处理一定时间。使用PBS充分 洗涤后，细胞溶解，然后在碘还原和在道威克斯树脂上进行半提纯之 后使用反相高压液相层析HPLC对生物蝶呤内容物进行荧光检测分析 (刺激点：350nm，放射点：450nm)，具体操作详见Hesslinger etal.， J.Biol.Chem.273，21616-21622，1998。

图1显示了EA.hy926内皮细胞在数分钟内将外源性墨蝶呤有效地 转变为细胞内生物蝶呤，因此证明了内皮细胞具有将外源性BH4衍生 物转变为细胞内BH4的能力，所述BH4在细胞内可作为NOS的辅助 因子。

实施例5：

BH4及其衍生物墨蝶呤在体外对于NO合成的促进作用

使用10mMDAHP(二氨基羟基吡啶)，一种GTP还水解酶(Xie etal.， J.Biol.Chem.273，21091-21098，1998)抑制剂，处理HEK293细胞以阻 断四氢生物蝶呤的内源性产物，所述HEK293细胞在PonA-诱导性启 动因子的转录控制下使用人类iNOS进行稳定转染。使用5mM PonA 对iNOS表达刺激24小时，然后使用10mM能够增加BH4或墨蝶呤 浓度的DAHP进行处理，采用Griess测定法计算NO产物以分析稳定 的NO产物亚硝酸盐和硝酸盐。硝酸盐通过硝酸还原酶还原为亚硝酸 盐，在544nm处使用Wallac分光光度计测定其吸收。

图2显示了HEK293iNOS细胞处理的BH4或墨蝶呤对于NO的浓 度依赖性产物的作用，其清楚地表明可以转变为细胞内BH4的外源性 BH4及其衍生物通过BH4-减少性iNOS增加了NO产物。

在图2a中，BH4通过iNOS促进了NO的合成，所述iNOS在使 用DAHP进行预处理以抑制内源性四氢生物喋呤产物的HEK293iNOS 细胞中。

AHP进行预处理以抑制内源性四氢生物喋呤产物的HEK293iNOS 细胞中。

实施例6：

加入外源性BH4和精氨酸利用人类iNOS阻断超氧化物产生

人类iNOS重组体在E.coli中过分表达并使用ADP琼脂糖柱进行 纯化，然后利用Superdex柱获得BH4游离型和精氨酸游离型iNOS。1 μg人类iNOS和200μM NADPH、1mMCPH共同孵化。在37℃下孵 化60分钟以后，利用电子自旋共振波谱法(ESR)在Bruker e-scan装置 中测量超氧化物产物作为稳定的CPH自由基。

加入1或10μMBH4并不能显著地改变超氧化物信号，但是其和 1mM精氨酸共同使用时则超氧化物信号减至基线水平(图3a)。另外， 使用精氨酸进行孵化则仅能减少超氧化物产物50％(图3b)。因此，BH4 和精氨酸共同应用才能够重偶联人类iNOS，达到预防有害超氧化物和 过亚硝酸盐产物的目的。

实施例7：

进行分离和灌注的经LPS-刺激的家兔肺体外COPD肺模型中BH4 对于超氧化物产生的阻断

根据Weissmann etal.，Am.J.Physio.280，L638-645，2001的记载， 分离、灌注和对肺进行通气。使用LPS刺激120分钟以后，加入spintrap CPH(1mM)再保持180分钟，使用Magnetech装置对超氧化物进行 ESR-介导性检测。采用敏感性化学发光检测器在通气的肺中测量呼出 的NO。LPS刺激引起呼出的NO水平呈时间依赖性降低，NO水平是 由家兔eNOS产生的。BH4的共同处理(100μM)显著减弱了这种降低， 因此可以预防eNOS的解耦联(图4a)。另外，BH4的处理(100μM)明 显减少了SOD-可抑制性ESR信号，表明BH4能够减少经促炎症反应 刺激物处理的肺中超氧化物的产生(图4b)。

实施例8：

进行分离和灌注的经LPS-刺激的家兔肺体外COPD肺模型中BH4 和精氨酸组合对于超氧化物产生的阻断

使用BH4和精氨酸的组合物代替单独的BH4重复进行实施方案7 所述的试验。结果表明BH4和精氨酸的组合能够以协同作用方式减少 经促炎症反应刺激物处理的肺中超氧化物的产生。