[0001] 本
发明是在政府支持下，根据NIH授予的P50GM085764和R01E5014811的授权号及NEI/NIH授予的EY014428、EY018660、EY019270和EY021374的授权号进行的。政府对本发明拥有一定权利。
[0002] 贯穿本
申请中引用了各种公开文件。这些公开文件全部的公开内容通过引用并入本申请中，以便更充分地描述本发明涉及的本领域的状态。
[0003] 发明背景
[0004] 并不是每个人以同样的方式衰老。众所周知，女人往往比男人更长寿，及生活方式的选择如吸烟和体能可
加速或者延缓衰老过程(Steven N.，2006；Blair et al.，1989)。这些观察资料已导致寻找可用于预测、监测以及提供使人深入了解年龄相关的生理性下降和
疾病的年龄分子标记。一种此类的标记是端粒长度，与年龄密切相关的分子特征(Harley et al.，1990)，其已经表明衰变在环境压
力下具有加速的速率(Epel et al.，2004；Valdes et al.)。另一个标记为基因表达，尤其是在新陈代谢和DNA修复途径中起作用的基因，其通过可跨不同的组织类型和有
机体的范围预测年龄(Fraser et al.，2005；Zahn et al.，2007；de et al.，2009)。
[0005] 愈来愈多的研究已报道了年龄与表观基因组状态之间的关联-除了主要核苷酸序列变化的DNA
修改的设置(Fraga and Esteller，2007)。尤其是，DNA甲基化与长时间范围内的实足年龄相关联(Alisch et al.，2012；Christensen et al.，2009；Bollati et al.，2009；Boks et al.， 2009；Rakyan et al.，2010；Bocklandt et al.，2011；Bell et al.，
2012)及甲基化的改变已与复杂的年龄相关性疾病如
代谢性疾病(Barres and Zierath，
2011)和癌症(Jones and Laird，1999；Esteller，2008)相关联。研究也发现一个被称为“表观遗传学漂移”的现象，由此在同卵双胞胎中的DNA甲基化标记作为年龄的函数差别越来越大(Fraga et al.，2005；Boks et al.，2009)。因此，作为固定标记的表观基因组的想法让位于作为动态展望反映各种实龄变化的表观基因组模型。目前的挑战是确定这些变化是否可被系统地描述和模拟以监测人体衰老的不同速率，及将其与相关的临床或者环境变量联系在一起。
[0006] 尽管其归因为至少两个基本因素，但是驱使衰老甲基化的变化机理尚未很好被理解(Vijg and Campisi，2008；Fraga et al.，2005)。首先，环境暴露会随着时间的推移激活与表观基因组一致及可预测变化相关的细胞程序。例如，
应力已表明可通过在DNA甲基化中的特定变化以改变基因表达模式(Murgatroyd et al.，2009)。此外，自发的表观遗传变化可在环境应力或无环境应力下发生，从而导致衰老个体之间表观基因组根本不可预测的差异。自发变化可以通过化学试剂破坏DNA甲基引起或者通过DNA复制过程中复制甲基化状态的错误引起。这两种机理导致衰老个体之间的甲基化组的不同，这表明甲基化状态的定量测量可以鉴别涉及衰老速率减缓或加速的因素。
[0007] 为了更好地了解甲基组如何变老及确定人类衰老速率是否可以量化和比较，我们发起了一个项目，以执行跨越广泛年龄范围的大型个体行列的全基因组甲基化分析。基于这些调查结果，我们构建了一个可预测衰老速率的模式，我们表明的衰老速率受性别和特定基因变异的影响。这些数据帮助解释表观遗传漂移，及表明在甲基化中与年龄相关的变化随着时间的推移导致转录模式的变化。这些调查结果在第二大型行列中被重复。
[0008] 从分子谱中测量人体衰老的能力在许多领域具有实际意义，包括疾病
预防和
治疗、取证和延长生命。尽管实足年龄与DNA甲基化中的 变化有关联，但甲基化组还没用于测量和比较人体衰老速率。在此，我们创建了一种衰老的定量模型，用于从656个年龄从19岁到101岁的人体个体的
全血中测量超过45万个CpG标记。这种模型测量个体甲基化衰老的速率。进一步地，我们发现，衰老速率的差异可解释表观遗传漂移及在转录中得到反映。我们的发现强调了衰老过程的特定组成，及提供了取证方法、试剂减缓或加速衰老的筛选方法及预防和治疗疾病的方法。发明概要
[0009] 本发明提供了基于受试者表观基因组预测受试者年龄的方法。一个
实施例中，该方法包括(a)获得受试者的
生物样品；(b)确定如图9、表S3、S4和/或S5任一所示的在受试者表观基因组中与年龄相关的一套表观遗传标记的甲基化状态；及(c)对比受试者与年龄相关的一套表观遗传标记的甲基化状态和年龄相关的参考人群的相同标记的甲基化状态，以获得用于预测受试者年龄的一个值或者一个值的范围，从而基于受试者的表观基因组预测受试者的年龄。
[0010] 本发明还提供了用于鉴别来自已知实足年龄受试者的生物样品的组织类型的方法。一个实施例中，该方法包括(a)确定受试者的实足年龄；(b)通过将受试者的预测年龄与受试者的实足年龄分开，从生物样品中确定受试者的AMAR；(c)对比与AMAR相关的参考标准与各种组织类型的实足年龄；(d)确定与步骤c中各种组织类型的AMAR参考标准最匹配的步骤b中的数值；及(e)基于步骤d中的最匹配，设定生物样品的组织类型，从而鉴别来自已知实足年龄的受试者的生物样品的组织类型。
[0011] 本发明还提供了基于与年龄相关的表观遗传修饰影响基因表达预测受试者年龄的方法，包括(a)获得受试者的生物样品；(b)确定与年龄相关的其表达随年龄而变化的表观遗传标记的一个或者多个基因的表达；(c)对比一个或者多个与随着年龄的变化与年龄相 关的表观遗传标记表达变化相关联的基因表达与来自年龄相关参考人群的相同基因表达；及(d)获得用于预测受试者年龄的一个值或一个值的范围；其中，对比一个或者多个与随着年龄的变化与年龄相关的表观遗传标记表达变化相关联的基因表达与来自年龄相关参考人群的相同基因表达，包括统计方法、多元回归方法、线性回归分析、列表法或者图解法中的任一基于与年龄相关的表观遗传标记相关联的基因表达预测受试者年龄的方法，其表观遗传标记的表达随年龄变化，从而基于与年龄相关的表观遗传修饰影响基因表达预测受试者的年龄。
[0012] 本发明还提供了基于受试者组织或者器官的表观基因组预测受试者组织或者器官的年龄的方法。一个实施例中，该方法包括(a)从受试者获得组织或者器官的生物样品；(b)确定选自于图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组中与年龄相关的一套表观遗传标记的甲基化状态；及(c)对比受试者的与年龄相关的此套表观遗传标记的甲基化状态与来自年龄相关参考人群的相同标记的甲基化状态，以获得用于预测组织或者器官年龄的一个值或者一个值的范围，从而基于受试者组织或者器官的表观基因组预测受试者组织或者器官的年龄。
[0013] 本发明还提供了基于受试者的包括任一与年龄有关的表观遗传标记或如图9、表S3、表S4或表S5所列举的标记的遗传物质表观遗传修饰确定受试者年龄的
试剂盒。
[0014] 本发明还提供了基于利用图9、表S3、S4和/或S5提供的与年龄有关的一套表观遗传标记的受试者的表观基因组预测受试者年龄的试剂盒。
[0016] 图1衰老甲基化的全局数据。(A)标记为cg16867657的甲基化分值的
密度图，年轻个体(绿色)与年老个体(蓝色)分开。(B) 所有个体年龄分布的直方图。(C)与年龄相关的甲基化标记的热图，以关联大小进行排序(回归系数)。个体从最年轻的到最年老的顺序排列。也参见图S1和表S1和S2，分别为与年龄相关的区域特定例子及用于注释重合表。
[0017] 图2模型预测和临床变量。(A)用于产生衰老预测(蓝盒)的数据(绿盒)和分析(红色椭圆形)的
流程图。(B)基于衰老模型对比所有个体的预测年龄与实际年龄。(C)验证行列中个体的样本外预测。(D)基于无临床变量的衰老模型每个个体的显著甲基化衰老速率(AMAR)。衰老速率的分布表明男人比女人衰老快。表S3中提供了衰老模型中所使用的标记表格。也参见图S2和S3、表S3和图9。
[0018] 图3甲基化衰老的遗传效应。(A)我们调查了与年龄相关的甲基化标记相关联的基因变异。对应于14meQTLs，挑选八个基因变异用于验证。其中，七个在验证行列中显著，两个表明与AMAR相关联。(B)甲基化标记cg27367526(STEAP2)和年龄之间的趋势图。变异体rs42663(GTPBP10)的状态引起这种关系的偏移。(C)第二个例子cg18404041和rs2230534(ITIH1，NEK4)。也可参见证实遗传相关性表格的表S4。
[0019] 图4多组织支持。(A)通过完整的衰老模型在TCGA上作出的年龄预测控制样品。在实足年龄与预测年龄之间有高的相关性，但是每个组织具有不同的线性截距和斜率。(B)在调整每个组织的截距和斜率后，模型误差与原始全血数据中模型误差相似。图S2中呈现了癌症样品上作出的年龄预测。(C)来自于TCGA的匹配的正常和
肿瘤样本上作出的年龄预测。预测作母体组织(胸腺、肾、
肺或
皮肤)的线性偏移的调整。(D)肿瘤样本在AMAR中表明显著的增加。也参见图S4和表S5。
[0020] 图5甲基化年龄相关性。分数和偏差(A)甲基化分值显示为标 记cg24724428。在群体中的任一子集，我们考虑两组甲基化统计：均值和方差。标记方差是平均甲基化变异的一种方式，被定义为个体甲基化分值和预期甲基化分值的平方差。(B)示出平均甲基化随着年龄的变化为标记cg24724428的密度图。年少组合和年老组以顶部和底部的10％为
基础。(C)所有标记和年龄之间的甲基化分值的显著相关性的直方图。P值是有符号的，正值代表随着年龄的增加甲基化增加。超过FDR＜0.05
阈值的标记被分组到极值箱中。(D)示出甲基化变异随着年龄的变化为标记cg24724428的密度图。(E)以与(D)相同的方式，所有标记和年龄之间的甲基化变异的显著相关的直方图。衰老趋势映射到图S3的CpG岛上。也参见图S5。
[0021] 图6.甲基化谱宽随年龄的趋势。(A)随年龄增加(红色)及随年龄减少(蓝色)的所有甲基化标记的总回归线。最黑的
颜色代表中位回归线，边界代表25％和75％的分位点。渐增和渐减标记均趋向中等的甲基化分值。(B)熵衰老速率以与年龄相关的表观遗传标记除以实足年龄的平均Shannon熵计算。这与AMAR有强相关性。
[0022] 图7.转录衰老模型。(A)我们用在甲基化中示出衰老趋势的基因的mRNA表达数据构建了一个衰老模型。由于数据集内最近5年间隔年龄的四舍五入，其标准误差(RMSE＝7.22年)增加。(B)与甲基化类似，与女性(p＜10-4)相比，转录表明男性衰老速率是增加的。
也可参见表S6和表S7。
[0023] 图8.示出了生物年龄模型。
[0024] 图9是图9A(9A至9A-7)、图9B(9B至9B-7)、图9C(9C至9C-7)、图9D(9D至9D-7)和图9E(9E至9E-7)的集合，其为
电子表格，示出了与年龄相关的表观遗传标记，由“cg”前缀后跟一个数字(cg#)命名，相关于表S3，其中，每一个CpG二核苷酸均如此经检查嵌入到每个系列的第三个子面板标题为“Forward_Sequence”的所在列示出的序列内(如，图9x-2，其中 “x”为A-E)。例如，把感兴趣的二核苷酸用括号括起来。其他信息可在具有GEO登录号码GPL13534的基因表达综合(GEO)
数据库中和彼彼科娃等，基因组学，2011，98：288-95(Bibikova et al.Genomics，2011，98：288-95)中找到。电子表格的各个子面板应如下所示集合：
[0025]9A 9A-1 9A-2 9A-3 9A-4 9A-5 9A-6 9A-7
9B 9B-1 9B-2 9B-3 9B-4 9B-5 9B-6 9B-7
9C 9C-1 9C-2 9C-3 9C-4 9C-5 9C-6 9C-7
9D 9D-1 9D-2 9D-3 9D-4 9D-5 9D-6 9D-7
9E 9E-1 9E-2 9E-3 9E-4 9E-5 9E-6 9E-7
[0026] 图S1.与图1有关的衰老关系图的一个例子
[0027] 基因4和Half LIM Domains 2(FHL2)的年龄相关
水平。强的衰老相关性在基因中心的CpG岛上显示出几个标记(红色：□log10(p-值))，与内部启动因子(黑色：平均甲基化分值)相一致。
[0028] 图S2.与图2有关的衰老模型应用于海恩(Heyn)等人的数据集
[0029] 我们从海恩等人的数据集中获得甲基化图谱及应用衰老
预测模型。我们的模型成功地分离年老样品和年轻样品(黑圈)。另外，我们应用衰老模型至采用亚
硫酸氢盐测序测量而不用我们数据的
磁珠芯片测量技术的海恩等人的数据集中的三个样品。尽管技术有差别，该模型成功地分离年轻样品、中年样品和年老样品(绿色圆点)。
[0030] 图S3.与图2有关的测量批次相关变量的影响
[0031] 种族和糖尿病性病态的模型协变量与批次变量高度相关，以致于不能确定它们在衰老过程中的影响。然而，我们为子群(A)欧洲人、(B)西班牙人、(C)非糖尿病人和(D)糖尿病患者构建了不同的模型。每个模型均用于预测其互补行列的年龄。结果表明尽管有协变量和/或批次的影响，仍具有强的预测能力。
[0032] 图S4.与图4有关的正常细胞和肿瘤衰老模型预测
[0033] 使用在主行列中鉴别的模型标记，在匹配的正常细胞和肿瘤样品中构建衰老模型。发现通过正常组织预测的肿瘤样品的衰老速率(AMAR)比预期的高(红色，威尔科克斯(Wilcox)测试，P＜10-21)，及通过肿瘤模型预测的正常样品的衰老速率比预期的低(黑色，威尔科克斯(Wilcox)测试，P＜10-17)。两个衰老速率的分离也非常显著(威尔科克斯(Wilcox)测试，P＜10-25)。
[0034] 图S5.与图5有关的CpG岛中衰老趋势图
[0035] (A)27，176CpG岛(黑色)的甲基化分值的一个总基因图谱。在相同的区域(绿色)示出了与年龄甲基化分值相关的衰老系数。标明岛和岸的色带代表75％的置信区间。(B)示出甲基化变异(红色)和变异的衰老系数(绿色)的CpG岛图。
[0036] 附图的详细说明
[0037] 定义
[0038] 如本申请中所使用的，生物年龄(bioage)、化学年龄、甲基化年龄和分子年龄是等价的或者是同义的。使用受试者或有机体与年龄相关的一套表观遗传标记确定生物年龄。在本发明中，从特定的CpG二核苷酸及尤其如甲基化状态在C-5位的胞嘧啶的修饰状态的分析确定生物年龄。
[0039] 实足年龄是受试者或有机体的实际年龄。对于动物和人类，实足年龄可以基于从受孕的那一刻起计算的年龄或者基于从出生时间或日期计算的年龄。从受试者或从有机体中获得细胞、组织或者器官的有机体的实足年龄加上细胞、组织或者器官被置于培养期间来确定细胞、组织或器官的实足年龄。另外，在细胞或组织培养的情况下，实足年龄可能与培养的总时间或累计时间或者通道数量有关。
[0040] 如本申请种所使用的，生物样品的术语“组织”可用“细胞”代替，或者反之亦然。
[0041] 如表S3、S4和S5中所提供的在“标记”或“甲基化标记”列下的，图9所提供的在图9x的“ID”或“Name”列下的，所述的图9x中的x是A-E，在本文中用“cg#”命名所讨论的甲基化标记是与年龄相关的表观遗传标记。在标题“Forward_Sequence”及在括号内探测的特定CpG二核苷酸如[CG]，图9中提供了本发明中所探测的每个表观遗传标记探针内的特定CpG二核苷酸。所有“cg#”命名的其他序列信息，如本文表S4和S5中，可从具有GEO登录号GPL13534的基因表达综合(GEO)数据库中美国国立卫生研究院生物技术信息国家中心(Bethesda，MD)获得。
[0042] 图9、表S3、S4和S5所提供的甲基化标记用于使用人类甲基化450磁珠芯片的Illumina公司的Infinium甲基化分析仪。然而，基于本发明所提供的每个cg#的序列、同源性或者序列的正态关联，这些与年龄相关的表观遗传标记可用于Infinium甲基化分析系统外的其他分析中。
[0043] 发明方法
[0044] 本发明提供了基于受试者的表观基因组预测受试者年龄的方法。受试者可以是人类、
哺乳动物、动物、
植物或任何多细胞有机体。适合的哺乳动物的实施例包括但不限于人类、猴、猿、狗、猫、
牛、
马、羊、猪、兔、小鼠和大鼠。受试者的年龄可为实足年龄、分子年龄、化学年龄、甲基化年龄或生理年龄。表观基因组可为其中DNA可受到表观遗传修饰的脱
氧核糖核酸(DNA)。表观遗传修饰可为CpG残留的甲基化。在一个实施例中，甲基化是甲基基团共价键合在胞嘧啶
碳-5(C-5)
位置上。
[0045] 在一个实施例中，该方法包括获得受试者的生物样品。另外，该方法包括确定选自图9、表S3、S4和/或S5的受试者表观基因组中的与年龄相关的一套表观遗传标记的甲基化状态。更进一步地，该方法包括对比年龄相关的受试者的一套表观遗传标记的甲基化状态与和年龄相关的参考人群的相同标记的甲基化状态，以获得预测受试者年龄的一个值或一个值的范围，从而基于受试者的表观基因组预测受试者的年龄。
[0046] 在一个实施例中，本方法包括使用统计方法对比与年龄相关的受试者的一套表观遗传标记的甲基化状态与和年龄相关的参考人群的相同标记的甲基化状态。适合的统计方法的实施例包括但不限于多元回归方法、线性回归分析、表格方法或者包括弹性网络的图形化方法、套索回归法、岭回归法、最小二乘拟合法、二项检验法、Shapiro-Wilk检验法、Grubb统计法、Benjamini-Hochberg FDR、方差分析、熵统计法和/或Shannon熵。在优选的实施例中，统计方法包括多变量回归
算法或线性回归算法。
[0047] 按照本发明的实际，确定甲基化状态可包括从样品中分离基因组DNA或核DNA，使分离的基因组DNA或核DNA与一种或多种的探针/试剂(如化学探针/试剂)反应，所述探针/试剂与未修饰的胞嘧啶的做出不同的反应，以便胞嘧啶转化为尿嘧啶。该步骤也可包括通过检测胞嘧啶或尿嘧啶的存在，确定或分析在样品分离的基因组DNA或核DNA中的CpG二核苷酸胞嘧啶位置上(此处也可以称为C位置)的甲基化状态。胞嘧啶或尿嘧啶的存在表明在原CpG二核苷酸中分别存在 5-甲基胞嘧啶或未经修饰的胞嘧啶。可选择地，通过限制性内切酶的抗分裂可表明在原CpG二核苷酸中存在5-甲基胞嘧啶。对限制性内切酶分裂灵敏性可表明在原CpG二核苷酸中存在未经修饰的胞嘧啶。更进一步地，该步骤可进一步包括确定5-甲基胞嘧啶或未经修饰的胞嘧啶最初呈现在各自与年龄相关的表观遗传标记的比例，或者，可选择地，基于探测分离的基因组DNA或核DNA的结果特征，确定最初呈现在各自与年龄相关的表观遗传标记5-甲基胞嘧啶与未经修饰的胞嘧啶的比或者未经修饰的胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶的比。
[0048] 按照本发明的实践，确定甲基化状态可包括从样品中分离基因组DNA或核DNA，受到CpG二核苷酸的影响，在内部或接近限制性内切酶的鉴别点或者分裂位点，及基于在所述CpG二核苷酸的胞嘧啶的C-5位位置上存在或不存在甲基基团DNA裂解方式的不同，用一种或多种可鉴别特定DNA序列的限制性内切酶培育分离的基因组DNA或核DNA。该步骤也包括在样品中分离的基因组DNA或核DNA中，通过表明在内部或接近限制性内切酶的鉴别点或者分裂位点的原CpG二核苷酸中存在5-甲基胞嘧啶的限制性内切酶在潜在的分裂位点的抗分裂，确定或分析CpG二核苷酸C位的甲基化状态。限制性内切酶的分裂敏感性可以表明存在未修饰的胞嘧啶。进一步地，该步骤进一步包括确定5-甲基胞嘧啶或未修饰的胞嘧啶最初呈现在各自与年龄相关的表观遗传标记的比例，或者，可选择地，确定最初呈现在各自与年龄相关的表观遗传标记5-甲基胞嘧啶与未经修饰的胞嘧啶的比或者未经修饰的胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶的比。
[0049] 按照本发明的实践，基于选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的5个或5个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的10个或10个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的15个或15个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的20个或20个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的25个或25个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的30个或30个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的35个或35个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的40个或40个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的45个或45个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的50个或50个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的55个或55个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的60个或60个以上的与年龄相关的表观遗传标记；
选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的65个或65个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的70个或70个以上的与年龄相关的表观遗传标记，可确定甲基化状态。
[0050] 进一步地，在优选的实施例中，基于图9或表S3中受试者表观基因组的5个或5个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的10个或10个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的15个或15个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的20个或20个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的25个或25个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3 受试者表观基因组的30个或30个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的35个或35个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的40个或40个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的45个或45个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的50个或50个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或格S3受试者表观基因组的55个或55个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的60个或60个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的65个或65个以上的与年龄相关的表观遗传标记，或者图9或表S3受试者表观基因组的70个或70个以上的与年龄相关的表观遗传标记，可确定甲基化状态。例如，在一个受试者基因组中，受胞嘧啶C-5位甲基化约束的具有单个CpG残留物的该套标记可包括一个或多个以下甲基化标记：表S4的cg05652533，表S4的cg27367526，表S4的cg18404041，图9、表S3和S5的cg23606718，图9、表S3和S5的cg16867657，位置52008487上
染色体3的cg04474832，位置21369010上染色体22的cg05442902，位置25652602上染色体6的cg06493994，位置236557682上染色体1的cg09809672，位置30849114上染色体12的cg19722847，位置18122719上染色体6的cg22736354，表S4的cg05652533，表S4的cg27367526，表S4的cg18404041，位置上131513927染色体2的cg23606718，和/或位置11044877上染色体6的cg16867657。
[0051] 在一个实施例中，在一个受试者基因组中，受尿嘧啶C-5位甲基化约束的具有单个CpG残留物的该套标记可包括甲基化标记位置52008487上染色体3的cg04474832，位置21369010上染色体22的cg05442902，位置25652602上染色体6的cg06493994，位置
236557682上染色体1的cg09809672，位置上30849114染色体12的cg19722847和位置
18122719上染色体6的cg22736354。
[0052] 在另一个实施例中，在一个受试者基因组中，受尿嘧啶C-5位甲 基化约束的具有单个CpG残留物的该套标记可为任何一个或多个甲基化标记图9或表S3的cg20822990，图9或表S3的cg04400972，图9或表S3的cg16054275，图9或表S3的cg03607117，图9或表S3的cg20052760，图9或表S3的cg16867657，图9或表S3的cg06493994，图9或表S3的cg06685111，图9或表S3的cg00486113，图9或表S3的cg20426994，图9或表S3的cg14361627，图9或表S3的cg08097417，图9或表S3的cg07955995，图9或表S3的cg22285878和/或图9或表S3的cg08540945。
[0053] 在进一步的实施例中，与年龄相关的一套表观遗传标记可为任何一个或多个甲基化标记图9、表S3和S5的cg23606718和/或图9、表S3和S5的cg16867657。
[0054] 按照本发明的实际，本发明的方法可为自动化方法。
[0055] 按照本发明的实际，生物样本可为血液、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜
碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、髓系细胞、淋巴系细胞、骨髓、唾液、腮抹试、鼻拭子、尿、
粪便、毛、乳腺组织、卵巢组织、子宫组织、
宫颈组织、前列腺组织、睾丸组织、脑组织、神经细胞、星形胶质细胞、肝组织、肾、甲状腺组织、胃组织、肠组织、胰腺组织、血管组织、皮肤、肺组织、骨组织、软骨、韧带、肌
腱、脂肪细胞、肌细胞、神经元、星形胶质细胞、具有不同传代次数的培养细胞、癌症/肿瘤细胞、癌症/肿瘤组织、正常细胞、正常组织、含有遗传物质核的任一组织或细胞或受试者的已知或未知DNA的形式的遗传物质中的任何一种。
[0056] 肿瘤或癌症细胞可从血液、淋巴结、肝、脑、食道、气管、胃、肠、胰腺、喉、舌、骨、卵巢、子宫、子宫颈、腹膜、前列腺、睾丸、乳腺、肾、肺或皮肤中得到。具有肿瘤或癌症细胞的生物样品可预测有较年长的预测年龄，至少比无肿瘤或癌症细胞的生物样品长约30％或40％。
[0057] 在一个实施例中，与年龄相关的表观遗传标记包括一个CpG残留物。胞嘧啶C-5位的甲基化可能与受试者相关的物种的实足年龄不同。例如，与受试者相关的物种可以是人类。
[0058] 在另一个实施例中，与年龄相关的一套表观遗传标记可包括在受试者基因组中受胞嘧啶C-5位年龄依懒性甲基化的影响的个体CpG残留物。该组标记可包括约70个含有与年龄相关的表观遗传标记独特的CpG残留物。此外，该套标记可包括一个或多个如图9、表S3、表S4或表S5所示的标记。
[0059] 例如，与年龄相关的一套标记可包括如图9或表S3所示的5个或5个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的10个或10个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的15个或15个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的20个或20个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的25个或25个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的30个或30个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的35个或35个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的40个或40个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的45个或45个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的50个或50个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的55个或55个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的60个或60个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如图9或表S3所示的65个或65个以上的与年龄相关的表观遗传标记或者如图9或表S3所示的70个或70个以上的与年龄相关的表观遗传标记。
[0060] 在另一个实施例中，与年龄相关的一组标记可包括如表格S5所示的5个或5个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如表S5所示的10个或10个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如表S5所示的15个或15个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如表S5所示的20个 或20个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如表S5所示的25个或25个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如表S5所示的30个或30个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如表S5所示的35个或35个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如表S5所示的40个或40个以上的与年龄相关的表观遗传标记；如表S5所示的45个或45个以上的与年龄相关的表观遗传标记或如表S5所示的50个或50个以上的与年龄相关的表观遗传标记。
[0061] 仅仅通过举例的方式，实足年龄与预测年龄的关联可至少约为80％、90％或91％，具有低于约5年的误差。
[0062] 在另一个实施例中，与年龄相关的一套表观遗传标记可为图9、表S3和S5的cg23606718和/或图9、表S3和S5的cg16867657中的任一甲基化标记。具有肿瘤细胞或癌症细胞的生物样品可预测的较年长的预测年龄，至少比无肿瘤细胞或癌症细胞的生物样品长约30％或40％。
[0063] 在一个实施例中，在受试者基因组的大多数与年龄相关的表观遗传标记在具有肿瘤细胞的生物样品比在无肿瘤细胞同样类型的生物样品中可预测较年长的年龄。类似地，癌前病变比无此类病变的正常组织类型可显示较年长的生物年龄或预测年龄。
[0064] 在另一个实施例中，在受试者基因组的大多数与年龄相关的表观遗传标记在具有肿瘤细胞的生物样品比在无肿瘤细胞同样类型的生物样品中预测的较年长的年龄可超过总的与年龄相关的表观遗传标记的约70％。
[0065] 在一个实施例中，一种或多种探针(例如化学探针)可与未修饰的胞嘧啶和5-甲基-修饰的胞嘧啶进行不同的反应。探针可选自于包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸氢盐的一组。
[0066] 在另一个实施例中，分离的基因组DNA或核DNA与一种或多种探 针反应的结果可以是未修饰胞嘧啶脱
氨成尿嘧啶和未改变的5-甲基胞嘧啶。表征使分离的基因组DNA或核DNA与一种或多种探针探测(或反应)或分析甲基化状态结果可以涉及到DNA扩增和核酸序列的测定及检测与年龄相关的表观遗传标记中CpG二核苷酸C位或是胞嘧啶或是胸腺嘧啶的存在。进一步地，DNA扩增之后可能是
噬菌体RNA聚合酶的转录、核糖核酸酶裂解和核糖核酸酶裂解产物的基质辅助激光
解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。
[0067] 核酸序列的测定可能涉及到一个或多个下列程序：核酸
片段化、限制性内切酶消化、核酸杂交、引物延伸、焦
磷酸测序、单核苷酸延伸、具有生物素标记的ddNTP的单核苷酸延伸、具有2，4-二硝基
苯酚(DNP)标记的ddNTP的单核苷酸延伸、
放射性同位素标记、非放射性标记掺入、
荧光标记掺入、生物素掺入、
抗原-
抗体复合物的形成、抗体检测、比色检测、荧光检测、用
荧光染料标记的抗体的检测、标记的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的检测、磁珠分析或检测方法、
信号放大、
聚合酶链反应、具有热稳定DNA聚合酶的DNA扩增、phi-29DNA聚合酶DNA扩增、RNA的合成、体外转录、噬菌体RNA聚合酶转录、T7 RNA聚合酶的转录、SP6RNA聚合酶的转录、T3RNA聚合酶转录、RNA酶消化、RNA酶A消化、DNA克隆、细菌转化、凝胶
电泳、质谱法、MALDI-TOF质谱法、微阵列分析、荧光扫描分析、自动化的数字图像捕捉、自动化的数字
图像分析、比率分析和 HumanMethylation450磁珠芯片分析。
[0068] 在另一个实施例中，最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记未修饰的胞嘧啶的比例可以为在CpG二核苷酸嘧啶位置具有胸腺嘧啶的与年龄相关的表观遗传标记的分数或者百分比。
[0069] 最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记的5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的比可以是暴露于一种或多种探针后CpG二核苷酸嘧啶位置上的胞嘧啶与胸腺嘧啶的比，随后进行核酸扩增产品的分析。
[0070] 在另一个实施例中，最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记中的未修饰的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的比可以是暴露于一种或多种探针后CpG二核苷酸嘧啶位置上的胸腺嘧啶与胞嘧啶的比，随后进行核酸扩增产品的分析。
[0071] 在一个实施例中，受到CpG二核苷酸的影响，在内部或接近限制性内切酶的鉴别点或者分裂位点，及基于在所述CpG二核苷酸的胞嘧啶的C-5位位置上存在或不存在甲基基团DNA裂解方式的不同，可以选择一种或多种可鉴别特定DNA序列的限制性内切酶。此类限制性内切酶的例子包括但不限于AatII、Acc65I、AccI、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AhdI、AleI、ApaI、ApaLI、AscI、AsiSI、AvaI、AvaII、BaeI、BanI、BbrPI、BbvCI、BceAI、BcgI、BcoDI、BfuAI、BfuCI、BglI、BmgBI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BseYI、BsiEI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspDI、BsrBI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstAPI、BstBI、BstUI、BstZ17I、Cac8I、ClaI、DpnI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、Eco53kI、EcoRI、EcoRV、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、Hpy166II、Hpy188III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4IV、HpyCH4V、KasI、MboI、MluI、MmeI、MspA1I、MwoI、NaeI、NarI、NciI、NgoMIV、NheI、NlaIV、NotI、NruI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR71、PhoI、PleI、PluTI、PmeI、PmlI、PshAI、PspOMI、PspXI、PvuI、RsaI、RsrII、SacII、SalI、Sau3AI、Sau96I、ScrFI、SfaNI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、StyD4I、TfiI、TliI、TseI、TspMI、XhoI、XmaI，和ZraI。
[0072] 在一个实施例中，分离的基因组DNA或核DNA与一种或多种限制性内切酶探针反应的结果可以是当CpG二核苷酸中的胞嘧啶未修饰时在限制性内切酶分裂位点产生一个双链DNA断裂或者是当CpG二核苷酸中的胞嘧啶在其C-5位用甲基基团修饰时在限制性内切酶分裂位点无DNA双链断裂。
[0073] 在另一个实施例中，分析甲基化状态可以包括DNA扩增和由于限制性内切酶的分裂而特定DNA端(多个)或片段(多个)及与特定年龄相关的表观遗传标记相关联的完整限制性内切酶分裂位点的与年龄相关的表观遗传标记的分析。
[0074] 在另一个实施例中，最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记未修饰的5-甲基胞嘧啶的比例可以为由于限制性内切酶的耐分裂具有完整限制性内切酶分裂位点与年龄相关的表观遗传标记的分数或者百分比。
[0075] 在另一个实施例中，最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记未修饰的胞嘧啶的比例可以为限制性内切酶的分裂的与年龄相关的表观遗传标记的分数或者百分比。
[0076] 在另一个实施例中，最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记的5-甲基胞嘧啶与未修饰的胞嘧啶的比可以为完整地限制性内切酶分裂位点的数目或浓度与由与年龄相关的表观遗传标记的限制性内切酶所产生的DNA双链断裂数目或浓度之比。
[0077] 在另一个实施例中，最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记的未修饰的胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶的比可以为由限制性内切酶所产 生的DNA双链断裂的数目或浓度与由于与年龄相关的表观遗传标记的5-甲基胞嘧啶的存在抗限制性内切酶分裂的限制性内切酶分裂位点的数目或浓度之比。
[0078] 在一个实施例中，确定甲基化状态包括从样品中分离基因组DNA或核DNA。另外，该步骤涉及用一种或多种探针探测分离的基因组DNA或核DNA及扩增DNA，所述的一种或多种探针可与未修饰的胞嘧啶和5-甲基-修饰的胞嘧啶进行不同的反应。该步骤还涉及用一种或多种限制性内切酶消化扩增的DNA，所述的一种或多种限制性内切酶鉴别含有CpG二核苷酸的限制性内切酶位点，但不能消化从CpG二核苷酸突变为TpG二核苷酸的限制性内切酶位点。进一步地，该步骤涉及基于敏感或耐消化的限制性内切酶位点的分数或百分比确定最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记的5-甲基胞嘧啶或胞嘧啶的比例。
[0079] 另外，甲基化状态可以涉及基于敏感性消化限制性内切酶位点的数目或浓度与耐消化限制性内切酶位点的数目或浓度之比，确定最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记的5-甲基胞嘧啶与未修饰的胞嘧啶的比。甲基化状态还可以涉及基于敏感性消化限制性内切酶位点的数目或浓度与耐消化限制性内切酶位点的数目或浓度之比，确定最初呈现在每个与年龄相关的表观遗传标记的未修饰的胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶的比。
[0080] 在另一个实施例中，确定选自图9、表S3、S4和/或S5受试者基因组的与年龄相关的一套表观遗传标记甲基化状态可以包括分离 基因组DNA或核DNA及
破碎基因组DNA或核DNA。另外，所述步骤涉及把破碎的DNA暴露于5-甲基胞嘧啶结合蛋白中，及从5-甲基胞嘧啶结合蛋白-自由DNA片段中分离5-甲基胞嘧啶结合蛋白结合的DNA片段。该步骤进一步涉及通过确定每个与年龄相关的表观遗传标记的5-甲基胞嘧啶结合蛋白结合或游离的DNA片段的分数或百分比，确定每个与年龄相关的表观遗传标记的含DNA片段的5-甲基胞嘧啶或含DNA片段的未修饰的胞嘧啶的比例。
[0081] 此外，甲基化状态可以涉及通过确定5-甲基胞嘧啶结合蛋白结合的DNA片段的数目或浓度与5-甲基胞嘧啶结合蛋白-自由DNA片段的数目或浓度的比，确定每个与年龄相关的表观遗传标记的含DNA片段的5-甲基胞嘧啶与含DNA片段的未修饰的胞嘧啶的比例。
[0082] 甲基化状态步骤还可以涉及通过确定5-甲基胞嘧啶结合蛋白-自由DNA片段的数目或浓度与5-甲基胞嘧啶结合蛋白结合的DNA片段的数目或浓度的比，确定每个与年龄相关的表观遗传标记的含DNA片段的未修饰的胞嘧啶与含DNA片段的5-甲基胞嘧啶的比例。
[0083] 在一个实施例中，5-甲基胞嘧啶结合蛋白可以是5-甲基胞嘧啶、MeCP2、MBD2、MBD2/MBD3L1复合物、MBD2的核MBD区域、或者聚MBD蛋白、天然存在的5-甲基胞嘧啶结合蛋白、遗传工程5-甲基胞嘧啶结合蛋白、或其衍生物或其片段的抗体。
[0084] 在一个实施例中，从5-甲基胞嘧啶结合蛋白-自由DNA片段中分离5-甲基胞嘧啶结合蛋白-结合DNA片段可以包括免疫沉淀法、免疫捕获法、固相色谱法、液相色谱法和/或凝胶电泳法。
[0085] 按照本发明的实际，本发明提供了用于确定受试者表观甲基化衰老速率(AMAR)的方法。该方法包括通过本发明的方法预测年龄及把预测的年龄除以实际实足年龄。
[0086] 在一个实施例中，本发明提供了用于诊断受试者肿瘤存在的方法。该方法包括获得疑似含有肿瘤的生物样品及已知不含有肿瘤的同样类型的第二份生物样品。此外，该方法包括通过本发明的方法预测各个生物样品的年龄。该方法还包括对比两种样品所预测的年龄，得到具有肿瘤的生物样品比无肿瘤的生物样品预测年龄较年长。
[0087] 在一个实施例中，本发明提供了一种从人类组织通过基于本发明方法的表观遗传标记预测受试者的年龄的人类实际年龄的法医诊断。
[0088] 在另一个实施例中，本发明提供了通过基于本发明方法的受试者表观遗传组预测受试者的年龄的受试者健康评估的方法。
[0089] 在另一个实施例中，本发明提供了筛选有益试剂是延缓或加速衰老过程的方法。该方法包括从活有机体中获得生物样品，及所述的有机体优选为从活有机体衍生的培养细胞、组织或器官，及预测年龄或有机体的AMAR，随本发明的方法之后，使用适当的与年龄相关的表观遗传标记的有机体，以便人类受试者与年龄相关的表观遗传标记可以需要被已检查过的有机体的与年龄相关的表观遗传标记所取代。另外，该方法包括把有机体或来自活有机体的培养活细胞、组织或器官暴露于单剂量、多剂量或连续剂量的有益试剂中，从而从活有机体或培养活细胞、组织或器官中获得生物样品。该方法还包括使用适当的与年龄相关的表观遗传标记的有机体预测年龄或生物样品的有机体的AMAR，以便人类受试者的与年龄相关的表观遗传标记可以需要被已检查过的有机体的与年龄相关的表观遗传标记所取代。该方法还包括在另一个个体上实施相同的步骤，该个体来自于同样的生物或完全 相同的培养的活细胞、组织或者同一个体的器官或者未用有益试剂处理或用安慰剂处理过的有机体，及比较相同预测年龄或AMAR的生物样品，预测年龄或用有益试剂处理过的有机体/个体、培养细胞、组织的AMAR与器官的预测年龄或未处理或用安慰剂处理过的有机体/个体或培养细胞、组织或器官的AMAR，得到用有益试剂处理过的有机体/个体或培养细胞、组织或器官的的一个较低的值或值的范围表明有益试剂可减缓衰老过程而较高的值或值的范围表明有益试剂可加速衰老过程。有益试剂可以是抗
氧化剂、还原剂、DNA损伤剂、维生素、
营养补充剂、食品、
食品添加剂、食品
着色剂、盐、蔬菜、蔬菜提取物、水果、水果提取物、花、花提取物、香料、
种子、籽提取物、香草、草本提取物、
植物提取物、
纤维、脂肪、
脂肪酸、油、糖、人造
甜味剂、
益生菌、
乙醇、葡萄酒、
真菌、霉菌、奶油、洗剂、粉末、
化妆品、防晒剂、气体、污染物、烟雾、环境污染物、油漆、
溶剂、
有机溶剂、塑料、
增塑剂、双酚、酚类化合物、
烟草、吸入剂、药物、生物制品、
激素、内分泌干扰物、环境雌激素、激素拮抗剂、激素激动剂，咖啡因、植物雌激素、金属、酶、螯合剂、酸奶、硫化合物，物理屏障、电磁障碍和
辐射屏障。
[0090] 在一个实施例中，有机体可以是
酵母、果蝇、鱼类、蠕虫、昆虫、斑马鱼、
线虫、植物或哺乳动物。哺乳动物包括但不限于为人类、鼠、猴、猫、犬、马、牛、猪、
绵羊、山羊、兔、哺乳类
家畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。
[0091] 在一个实施例中，本发明提供了用于鉴别已知年龄受试者的生物样品的组织类型的方法。该方法包括确定受试者的实足年龄及通过本发明方法确定来自于生物样品的受试者的预测年龄。另外，本方法包括对比各种组织类型的相关预测年龄的参考标准与实足年龄，及确定各种组织类型参考标准中与预测年龄最匹配的值。进一步地，该方法包括基于最匹配
指定生物样品的组织类型。
[0092] 本发明还提供了一种用于鉴别已知实足年龄受试者的生物样品 的组织类型的方法。该方法包括确定受试者的实足年龄及通过从受试者实足年龄分出受试者预测年龄，确定来自于生物样品的受试者的AMAR。另外，该方法包括对比相关AMAR的参考标准与各种组织类型的实足年龄，及确定各种组织类型参考标准的AMAR最匹配的值。该方法进一步包括基于最匹配指定生物样品的组织类型。
[0093] 在一个实施例中，与年龄相关的一套标记包括任何一种或多种图9、表S3和S5的cg23606718和/或图9、表S3和S5的cg16867657表观遗传标记。
[0094] 本发明进一步提供了基于表观遗传修饰影响基因表达预测受试者年龄的方法。该方法包括获得受试者的生物样品及确定与年龄相关的表观遗传标记相关联的其表达随着年龄变化的一个或多个的基因的表达。另外，该方法包括对比与年龄相关的表观遗传标记相关联的其表达随着年龄变化的一个或多个的基因的表达与来自与年龄相关的参考人群的相同基因的表达。该方法进一步包括获得受试者预测年龄的一个值或值的范围。对比与年龄相关的表观遗传标记相关联的其表达随着年龄变化的一个或多个的基因的表达与来自与年龄相关的参考人群的相同基因的表达可以包括使用任一统计方法、多变量回归分析法、线性回归分析、表格法、或图解法基于与年龄相关的表观遗传标记相关联的其表达随着年龄变化的基因的表达预测受试者的年龄。在一个实施例中，统计方法可以是多元回归法或线性回归法。
[0095] 在另一个实施例中，与年龄相关的表观遗传标记相关联的其表达随着年龄变化的一个或多个的基因的表达可以包括一个或多个列在表S6或表S7的基因。
[0096] 在另一个实施例中，基因表达可以是转录或翻译。在另一个实施例中，转录导致RNA转录体的产生，翻译导致
蛋白质的产生。
[0097] 按照本发明的实际，本发明提供了一种用于筛选受试者组织样品以基于由本发明方法的受试者的表观基因组预测组织样品年龄的方 法。
[0098] 在一个实施例中，在高通量的筛选试验中组织样品可以暴露于至少一种测试试剂。在另一个实施例中，所述过程可以用于任一诊断和/或高通量筛选。
[0099] 本发明进一步提供了基于受试者的组织或器官的表观基因组预测受试者的组织或器官年龄的方法。该方法包括从受试者获得组织或器官的生物样品，及在选自于图9、表S3、S4和/或S5受试者表观基因组中确定与年龄相关的一套表观遗传标记的甲基化状态。该方法进一步包括对比受试者与年龄相关的一套表观遗传标记的甲基化状态与来自与年龄相关的参考人群相同标记的甲基化状态，以获得预测组织或器官年龄的一个值或值的范围。
[0100] 来自与年龄相关的参考人群的相同标记的甲基化状态可以在相同或不同类型的组织或器官中确定。来自与年龄相关的参考人群相同标记的甲基化状态可以在血液或分离血液中确定。
[0101] 在一个实施例中，本发明的方法提供了用于确定受试者组织或器官不同衰老速率的方法。该方法包括从受试者不同组织或器官中获得生物样品及使用本发明的方法预测组织或器官的年龄。该方法进一步包括对比预测的年龄，其中预测年龄的差别表明受试者组织或器官衰老速率的差别。预测年龄可除以受试者的实足年龄以获得AMAR。
[0102] 本发明的组合物
[0103] 本发明还提供了组合物，所述组合物包括一套表观遗传标记，所述表观遗传标记基于选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的5个或5个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的10个或10个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的15个或15个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、 S4和/或S5受试者表观基因组的20个或20个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的25个或25个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的30个或30个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的35个或35个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的40个或40个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的45个或45个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的50个或50个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的55个或55个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的60个或60个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的65个或65个以上的与年龄相关的表观遗传标记；选自图9，表S3、S4和/或S5受试者表观基因组的70个或70个以上的与年龄相关的表观遗传标记。
[0104] 进一步地，在优选的实施例中，所述组合物包括一套表观遗传标记，所述表观遗传标记基于图9或表S3受试者表观基因组的5个或5个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的10个或10个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的15个或15个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的20个或20个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的25个或25个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的30个或30个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的35个或35个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的40个或40个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的45个或45个 以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的50个或50个以上的与年龄相关的表观遗传标记；
图9或表S3受试者表观基因组的55个或55个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的60个或60个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的65个或65个以上的与年龄相关的表观遗传标记；图9或表S3受试者表观基因组的70个或70个以上的与年龄相关的表观遗传标记。例如，与年龄相关的一套表观遗传标记可包括任何一个或多个下列的甲基化标记：表S4的cg05652533、表S4的cg27367526、表S4的cg18404041、图9、表S3和S5的cg23606718、图9、表S3和S5的cg16867657、位置52008487上染色体3的cg04474832、位置21369010上染色体22的cg05442902、位置25652602上染色体6的cg06493994、位置236557682上染色体1的cg09809672、位置30849114上染色体12的cg19722847、位置18122719上染色体6的cg22736354、表S4的cg05652533、表S4的cg27367526、表S4的cg18404041、位置131513927上染色体2的cg23606718和/或位置
11044877上染色体6的cg16867657。
[0105] 在另一个实施例中，所述组合物包括与年龄相关的一套表观遗传标记：位置上52008487染色体3的cg04474832、位置21369010上染色体22的cg05442902、位置25652602上染色体6的cg06493994、位置236557682上染色体1的cg09809672、位置30849114上染色体12的cg19722847和位置18122719上染色体6的cg22736354。
[0106] 在另一个实施例中，所述组合物包括任何一个或多个甲基化标记的与年龄相关的一套表观遗传标记，所述的任何一个或多个甲基化标记为：图9或表S3的cg20822990、图9或表S3的cg04400972、图9或表S3的cg16054275、图9或表S3的cg03607117、图9或表S3的cg20052760、图9或表S3的cg16867657、图9或表S3的cg06493994、图9或表S3的cg06685111、图9或表S3的cg00486113、图9或表S3的cg20426994、图9或表S3的cg14361627、图9或表 S3的cg08097417、图9或表S3的cg07955995、图9或表S3的cg22285878和/或图9或表S3的cg08540945。
[0107] 在另一个实施例中，所述组合物包括任何一个或多个甲基化标记的与年龄相关的一套表观遗传标记，所述的任何一个或多个甲基化标记为：图9、表S3和S5的cg23606718和/或图9、表S3和S5的cg16867657。
[0108] 试剂盒
[0109] 根据本发明的另一方面，提供了试剂盒。依据本发明的试剂盒包括装有本发明化合物或组合物的
包装盒。
[0110] 术语“包装盒”是指装有本文所出现的化合物或组合物的任何容器。在优选的实施例中，包装盒可为盒子或包装纸。用于包装药物产品的
包装材料是本领域技术人员公知的技术。药物包装材料的例子包括但不限于罩板包装、瓶、试管、吸入器、
泵、袋、小瓶、容器、
注射器、瓶和适于选择配方及
给药和治疗的预期模式的任何包装材料。
[0111] 该试剂盒也可包括未装在包装盒内而连接到包装盒外面的物品，如吸量管。
[0112] 该试剂盒可任选包括用于将本发明的化合物或组合物给药于具有需要治疗条件的受试者的
说明书。该试剂盒还可包括监管机构如美国食品和药物管理局在此认可化合物使用的说明书。该试剂盒可任选包括该化合物的标签或产品插页。该包装盒和/或任何产品插页本身可通过监管机构认可。该试剂盒可包括包装盒中固相或液相(如提供的缓冲液)的化合物。该试剂盒也可包括用于制备溶液的缓冲液以实施该方法，还及用于把液体从一个容器转移到另一个容器的吸量管。
[0113] 该试剂盒可任选包括描述于本文中组合治疗法所用的一种或多种其他化合物。在某个实施例中，静脉注射中该包装盒是一个容器。在其他实施例中，用吸入器提供化合物。仍然在其他实施例中，用聚 合物基质或脂质体的形式提供化合物。
[0114] 本发明提供了一种基于受试者遗传物质的表观遗传修饰确定受试者年龄的试剂盒，包括与年龄相关的一套表观遗传标记或在本发明方法描述的图9、表S3、表S4或表S5所列举的标记，同上。
[0115] 本发明还提供了一种基于受试者的表观遗传标记确定受试者年龄的试剂盒，使用在本发明方法描述的图9、表S3、S4和/或S5所提供的与年龄相关的一套表观遗传标记，同上。
[0116] 在一个实施例中，与年龄相关的表观遗传标记可包括具有CpG二核苷酸的核酸。在另一个实施例中，所述CpG二核苷酸的胞嘧啶在C-5位的甲基化受年龄依懒性变化的影响。在另一个实施例中，所述CpG二核苷酸在如图9、表S3、S4和/或S5所描述的染色体位置。
[0117] 在一个实施例中，与年龄相关的表观遗传标记可为人类的标记，并选自于位置52008487上染色体3的cg04474832、位置21369010上染色体22的cg05442902、位置25652602上染色体6的cg06493994、位置236557682上染色体1的cg09809672、位置30849114上染色体
12的cg19722847、位置18122719上染色体6的cg22736354、表S4的cg05652533、表S4的cg27367526、表S4的cg18404041、位置131513927上染色体2的cg23606718和位置11044877上染色体6的cg16867657。
[0118] 在另一个实施例中，与年龄相关的表观遗传标记可具有如图9所提供的序列或者是在国家卫生研究院生物技术信息国家中心(Bethesda，MD)具有GEO登录号为GPL13534的基因表达综合(GEO)数据库中可找到的序列。
[0119] 提供以下实施例进一步解释本发明的方面，这些实施例是非限制的，并且不应该被解释为限制本发明的任何方面。实施例
[0120] 实施例1
[0121] 材料和方法
[0122] 样品采集和测试程序
[0123] 该研究得到圣地亚哥的美国加州大学的机构审查委员会、南加州大学和华西医院的认可。所有与会者在参与前都签署知情同意书
声明。血液从病人手臂的静脉
抽取进入含有抗凝血酸
柠檬酸葡萄糖的血液收集管中。基因组DNA用在-20℃下存放的QIAGEN FlexiGene DNA试剂盒从全血中抽取并。常染色体的甲基化分值用Illumina Infinium HumanMethylation450芯片(Bibikova et al.，2011)测定。本程序对可结合到甲基化和未甲基化的的序列中的每个标记使用硫酸氢盐处理的DNA和两位点特异性探针，所述每个标记。甲基化探针强度相对于每个位点的总探针强度代表样品中该位点甲基化的分数水平。这些值是用Illumina公司基因组办公
软件进行内部控制校对的。具有高于0.01的检测P值的甲基化分值被设置为“缺失(missing)”。由于一个病人样品及830个标记具有高于5％的缺失值，因而被除去。余下的缺失值使用R“输入”包(Troyanskaya et al.，2001)通过KNN法(10个最接近的标记)输入。我们在这些样品258上进行外显子组测序，使用溶液混合选择方法以捕获DNA，随后在Illumina HiSeq平台上进行平行测序。基因型调用是由SOAP程序作出(Li et al.，2008)。
质量分数低于20的调用被设置成缺失。只有不到10％缺失调用的变量在哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡(p＜10-4)内，及为共同
频率(＞5％)保留下来(10，
694)。不到20％缺失调用(252)的个体被保留下来。另外的基因型用多重PCR处理，随后用带有iPLEX/MassARRAY/Typer平台的MALDI-TOF质谱分析。
[0124] 甲基化的质量控制
[0125] 我们使用主成分(PC)分析来鉴别和除去异常样品。基于从总体平均数得来的样品第一个PC的平方距离，我们把每一个样品转换成 Z得分统计量。用高斯累积分布和Benjamini-Hochberg程序(Benjamini-Hochberg，1995)把Z统计量转化为错误发现率。落在低于0.2的FDR的样品下降被指定为异常并被除去。反复进行这种过滤程序直到无样品被确定为异常样品。以这种方式总共24个样品被除去。
[0126] 关联测试
[0127] 甲基化分数和偏差中趋势的关联测试用嵌套线性模型和F测试在进行。由于甲基化水平对许多因素敏感，我们列入几个协变量，包括性别、BMI、糖尿病病态、种族和批次。基于带有正系数而不是负系数的标记数目，整个甲基化异常变化的试验用二项检验法计算。当衰老系数为相同的符号及显著性好于p＜0.05时标记被注释为具有TCGA数据的
支撑，。
[0128] 注释富集
[0129] 从来自于Bioconductor( Gentleman et al .，2004 )的IlluminaHumanMethylation450k.db数据库中获得CpG岛的甲基化标记注释和GO术语。注释富集测试用双面Fisher精确测试进行。
[0130] 衰老模型
[0131] 基于在R包装盒“glmnet”中实施弹力网络算法(Friedman et al.，2010)，用多元线性模型方法进行年龄诊断模型。该方法为传统的套索工具与岭回归分析方法的结合，强调模型稀疏，同时适当平衡相关变量的贡献。在变量的数量(标记)远远超过样品的数量的情况下构建线性模型是理想的。优化正则化参数通过10倍交叉验证评估。我们采用自展分析，
采样数据设置更换500次，为每个引导队列建立一个模型。在最终的模型中，我们仅列入其出现占所有引导程序的一半以上的标记。性别协变量、BMI、糖尿病病态、种族和批次列入模型且从零对偶间隙(正则化)中免除。基于最小二乘模型用相同的术语和drop-oneF测试建立P值。由于BMI与年龄密切相关，在计算模型 中显著性以前，为年龄第一次调整术语。用衰老模型但不用性别、体重指数和糖尿病状态的变量计算AMAR。该系数是不变的。然后，AMAR被作为个体的预测年龄除以她或他的实际年龄。
[0132] 基因方差关联
[0133] 以具有与年龄相关的甲基化标记的加法模型用嵌套的线性模型和F测试测试每个基因方差的关联性。我们列入性别、BMI、糖尿病状态和批次的协变量。变异位置以构建GRCh37的人类参考为基础，基因注释以染色体接近于20kbp为基础。
[0134] 计算甲基化异常
[0135] 甲基化异常通过下述方法计算：首先，由于所有给定的包括年龄、性别和BMI的变量，通过拟合每个标记的线性模型，并且只在残留物上作用，我们去除甲基化的趋势。其次，-5在夏皮罗-威尔克(Shapiro-Wilk)测试(p＜10 )的基础上，我们鉴别并除去高度非正常标记。在正态性测试中，允许自然发生的极端异常，首先，基于格拉布(Grubb)的统计，我们估计每个标记的异常值，基于Benjamini-Hochberg FDR(Benjamini and Hochberg，1995)，选择包含阈值。如果任何样品的FDR低于0.4，我们忽视他们并重复异常值的检测，直到无异常值检出。最后，每个剩余标记的异常值被计算为其调整后甲基化值的平方。
[0136] 熵分析
[0137] 熵统计量进行了甲基化数据计算，协变量调整，并过滤成标准值(参见计算甲基化异常值)。我们根据公式计算每个个体甲基化的标准Shannon熵(Shannon and Weaver，1963)。
[0138]
[0139] 其中，MFi是i次甲基化标记的甲基化分值，及N为标记的数目。
[0140] 测绘CpG岛
[0141] 从来自于Bioconductor( Gentleman et al .，2004 )的IlluminaHumanMethylation450k.db数据库中获得27，176CpG岛的基因位置和标记注释。我们获得具有至少四个标记(25，028)的每一个岛的标记的位置及最近的100个上游和下游标记。然后，这些位置与有益的标记值(如甲基化分数、衰老系数或异常值)结合以产生每个岛及周边地区的基因组地图。在把每一副地图规范到岛的中心后，我们把所有岛的每个基因组的相对点的值平均以产生一个通用地图。
[0142] 结果和讨论
[0143] 宽年龄范围内的全局甲基化图谱
[0144] 从426个白种人和236个西班牙个体的混合人群中，年龄从19到101，我们获得两个不同群体(N1＝482，N2＝174)的甲基化谱宽图谱。样品被作为全血及用测定485，577CpG标记的甲基化状态的Illumina Infinium HumanMethylation450磁珠芯片分析仪(Bibikova et al.，2011)处理。甲基化被记录为0至1之间的分数，代表来自于在人群中单一个体血细胞所给的CpG标记的甲基化频率。传统的质量控制应用于过滤假标记和样品。为了简化，我们舍弃性染色体标记上的值。相关性测试显示出70387(15％)的标记在甲基化分值和年龄之间具有显著的相关性(图1，通过F测试错误发现率[FDR]＜0.05)。我们能确认海恩等人(Heyn et al.)最近公开的(2012)在p＜0.05显著水平上用40个年轻和年老的样品的相关性为53，670(76％)。图S1和表S2和S3给出了个体衰老标记及其基因特性的更详细的分析。所得到的数据集代表了由衰老研究产生的规模最大、
分辨率最高的甲基化数据集合，在衰老过程中了解表观遗传学的作用提供了一个前所未有的机会。在基因表达数据库中可得到完整的甲基化图谱(GSE40279)。
[0145] 表S1，与图1有关的与年龄相关标记的功能注释
[0146] 与年龄相关的标记附近的基因富集了许多功能，精选的功能如下所示。
[0147]
[0148] 表S2，与图1有关的与年龄相关的标记属性
[0149] 一个与年龄相关的标记及其与几个基因组特征的一致性的表。每一个值代表了特定类型(列)的与年龄相关的标记的百分比，所述的特定类型与特定的注释(行)是一致的。
[0150]
[0151] 衰老甲基化的预测模型
[0152] 用被称为弹性网络的惩罚多元回归方法(Zou and Hastie，2005)，结合自举法，我们在主要行列构建了衰老的预测模型。该模型包括甲 基化和如性别和体重指数(BMI)(图2A)的临床指标。优化模型选自于具有年龄高度预测性的一套71个甲基化标记(图2A和表S3)。模型的
精度高，年龄与预测年龄之间的相关性为96％及误差3.9年(图2B)。在模型中几乎所有的标记放置在与衰老相关的条件下已知功能基因内或附近，与衰老相关的条件包括阿尔茨海默氏病、癌症、组织降解、DNA损伤和氧化应激。以举例的方式，两个标记放置在内分泌和神经系统功能的一个重要调节器(Yacubova and Komuro，2002)的基因生长抑素(SST)内。众所周知，SST是随着年龄的增长而衰退，且与阿尔茨海默氏病相关联(Saito et al.，2005)。作为第二个例子，六个模型标记放置在转录因子KLF14内，所述的转录因子KLF14被称为肥胖和其他代谢特征的“主调节器”(Small et al.，2011)。考虑到衰老、长寿和新陈代谢活动之间的关联(Lane et al.，1996；Tatar et al.，2003)，我们模型的几个标记与肥胖和代谢活动有关联是不足为奇的。
[0153] 表S3，与图2有关的衰老模型标记
[0154] 甲基化标记的一个表格包括在主要衰老模型中。每个标记所列举的系数是其模型中的回归系数。基于所有样品的模型(主要和验证)提供了第二个表格。
[0155]标记 染色体 位置 基因组 CpG岛 系数
cg20822990 1 17338766 ATP13A2，SDHB No -15.7
cg22512670 1 26855765 RPS6KA1 No 1.05
cg25410668 1 28241577 RPA2，SMPDL3B No 3.87
cg04400972 1 117665053 TRIM45，TTF2 Yes 9.62
cg16054275 1 169556022 F5，SELP No -11.1
cg10501210 1 207997020 Clorf132 No -6.46
cg09809672 1 236557682 EDARADD No -0.74
ch.2.30415474F 2 30561970 LBH No 5.79
cg22158769 2 39187539 ARHGEF33 Yes -2.06
cg02085953 2 97202260 ARID5A No 1.02
cg06639320 2 106015739 FHL2 Yes 8.95
cg22454769 2 106015767 FHL2 Yes 4.85
cg24079702 2 106015771 FHL2 Yes 2.48
cg23606718 2 131513927 FAM123C Yes 8.35
cg22016779 2 230452311 DNER，RNU7-9P No 1.79
[0156]
[0157]
[0158] 在第二个行列中我们验证了该模型，包括了额外的174个独立的样品。这些样品在主要行列中以同样的方式进行，然后，基于原有模型用于预测年龄(如在原有行列中培养过的)。预测高度准确，年龄与预测年龄之间的关联性为91％，及误差为4.9年(图2C)。通过海恩等人(Heyn et al.)所呈现的一组数据也确定了衰老模型的显著性，验证了71个标记中70个年龄的相关性(Heyn et al.，2012)。而且，在海恩等人(Heyn et al.)的研究中，该模型可以完全把年长个体和年轻个体分开，甚至通过亚
硫酸盐测序获得图镨而不是使用本研究的磁珠芯片技术(图S2)。
[0159] 甲基化衰老速率及其相关性
[0160] 当衰老模型可以高准确度地预测大部分个体的年龄时，其相当于可以作为一种用于鉴别不遵循期望值的个别异常值的工具。例如，图2B强调了两个个体，其年龄以甲基化数据为基础大大高于或低于预测。为了检查这些差异是否在个体状态上反映了真正的生物学差异(如与测量误差或固有变异性相对)，我们使用衰老模型来量化每个 个体的显著的甲基化衰老速率(AMAR)，基于甲基化数据，定义了预测年龄与实足年龄的比。然后，我们测试了AMAR和包括性别和BMI的可能相关的临床因素之间的关联性。由于批次变量的关联性(图S3)，种族和糖尿病病态的分析是不可能的。我们发现，性别而不是BMI对衰老速率有显著地贡献(F测试，p＝6 x 10-6，p＞0.05)。即使在行列中年龄的总体分布在男人和女人之间的差异不明显(p＞0.05，KS测试)，男人的甲基化比女人的甲基化衰老好像快约4％(图2D)。同样地，验证行列证实了男人的衰老速率的增加(p＜0.05)，但对BMI是不确定的(p＞0.05)。这补充了随着年龄的变化BMI的表观遗传信号不发生变化的先前发现(Feinberg et al.，2010)。
[0161] 由于之前报道了基因相关性与人类长寿和基因表型的关系(Atzmon et al.，2006；Suh et al.，2008；Willcox et al.，2008；Wheeler et al.，2009)，我们检查该模型是否可区分具有不同基因变异的个体的衰老速率。为此，在15x
覆盖范围内，在甲基化研究中，我们获得了252个个体的全外显子组序列。序列处理及质量控制后，这些序列在整个群体中产生了10,694个常见的单核苷酸变异体。作为阴性控制，我们证实了所有遗传变异都不能显著预测自己的年龄，这是可以预料的，因为基因组序列被认为在一生过程中是相对静止的。另一方面，人们可预期地发现调节与年龄相关的标记的甲基化的基因变异，如甲基化定量性状位点或meQTLs(Bell et al.，2011)。为测试每一个基因变异与顶部年龄相关联的甲基化标记的相关性，我们确定了303个meQTLs(FDR＜0.05，图3A)。为了验证，我们选择了8个基因变异(对应于14 meQTLs)以测试来自于甲基化研究中332个在验证行列中的个体。本分析发现8个基因变异中(对应于7 meQTLs)的7个在验证行列体中仍保留高显著性(FDR＜0.05，表S4)。而具有其meQTLs(在150 kbp内)的顺式起作用的所有变异，我们确认其没有一个可直接修饰CpG位点或者与相关甲基化标记的探针序列相关联。
[0162] 表S4.与图2有关的基因变异影响与年龄相关的标记
[0163] 发现影响与年龄相关的甲基化的基因变异的一个表。间距为从基因标记到甲基化标记的基因组距离。相关值被列为P值。AMAR相关性为基因标记和AMAR之间的显著相关性。
[0164]
[0165] 甲基化标记cg27193080是发现的与年龄有显著相关性的其中之一(p＜10-17)，发现其甲基化分值受到单核苷酸多态性(SNP)变体rs140692的影响(p＜10-21)(图3B)。作为SNP和映射基因甲基-CpG结合结构域蛋白4(MBD4，具有基因内区SNP和仅在编码区的上游的甲基化标记)的甲基化标记的meQTL尤其引人关注，是少数已知基因编码可结合到甲基化DNA的蛋白质中的一个。因此，该meQTL可捕获顺式关系，其中rs140692影响MBD4的甲基化状态。该MBD4在人体衰老中的作用是支持把MBD4和DNA联系在一起的前期工作，及研究表明MBD4的突变及抑制导致的基因组不
稳定性的增加，(Bellacosa et al.，1999；Bertoni et al.，2009)。
[0166] 在7个已验证的meQTL中，确认了三个，不仅在年龄上而且在衰老速率上具有统计上的显著的相关性(AMAR，FDR＜0.05，图3B和3C)。一个为基因标记rs2230534，在基因NEK4中是一个同义突变，并与甲基化标记cg18404041有顺式关联，NEK激酶家族在细胞周期调控和癌症中起着关键的作用(Moniz et al.，2011)；第二变异为基 因标记rs2818384，在基因JAKMIP3中是一个同义突变并与甲基化标记cg05652533有顺式关联，JAKMIP3中复制数目的变异在先与成胶质细胞瘤相关联(Xiong et al.，2010)；发现影响AMAR的最后一个变异为rs42663，在基因GTPBP10中是一个错义突变，并与STEAP2基因中的cg27367526相关联，众所周知，STEAP2在保持作为呼吸链的基本组成部分的金属-
铁和
铜的稳态中发挥着作用(Ohgami et al.，2006)。研究表明在哺乳动物细胞中通过氧化应激铁浓度的扰动可诱导DNA损伤(Hartwig and Schlepegrell，1995；Karthikeyan et al.，2002)。这些meQTL代表了基因变异，所述基因变异好像广泛影响了衰老甲基化，且可能是进一步研究年龄相关的疾病和长寿的好的候选者。
[0167] 多组织的诊断
[0168] 我们的衰老模型来自全血，其对实际诊断中的设计和从其他研究收集的测试样品是有利的。为了研究我们的衰老模型是否代表其他组织，我们从癌症基因组图谱(TCGA)控制类别的368个个体中获得DNA甲基化图谱(Collins and Barker，2007)，包括83个胸脯、183个肾、60个肺和42个皮肤样品。尽管每个组织与预期都有明确的线性偏移量(截距和斜率)(图4A)，基于我们主要和验证的行列的衰老模型对这些样品的实足年龄表现出强的预测能力具有(预期值R＝0.72)。这个偏移量在组织内是一致的，甚至横跨不同批次的TCGA数据。我们使用简单的线性模型调整每个组织的趋势，产生相对于血中所发现的具有误差可比性的年龄预测(图4B)。而且，在每个组织中所预测的AMAR支持了男人比女人衰老更快的效果(p＜0.05)。因此，从血样品中计算衰老速率(AMAR)反映了不特定于血液及可能在人体中许多组织中是常见的的趋势。而且，这种分析提供了证据，所述证据为所观察到的甲基化变化是内在的甲基化，且主要不是由于细胞的异质性，如随着年龄的增长改变全血细胞类型的组成。在这一点上，本研究与纯化的CD4+T细胞和CD14+单核细胞的先前分析结果相一致，其中，发现与年龄相关的表观遗传修饰和在全血中所观察到 的变化相类似(Rakyan et al.，2010)。
[0169] 为了研究组织间的相似性和差异性，我们重新构建了关于胸腺、肾和肺组织的衰老模型(表S5；皮肤行列有太少样品以致于不能构建模型)。尽管所有的模型和主要模型共享标记cg23606718和cg16867657，模型中的大多数标记不同。这些标记都被注释为基因ELOVL2，其与人体皮肤中的光衰老反应相联系(Kim et al.，2010)。
[0170] 表格S5.TCGA数据的衰老模型标记
[0171] 为了研究组织间的相似性和差异性，我们构建了关于胸腺、肾和肺组织的衰老模型。皮肤行列没有足够的样品来构建模型。每个模型的标记和系数列举如下：
[0172]
[0173]
[0174] TCGA数据集还包括代表共319个肿瘤和匹配的正常组织样品(胸腺、肾、肺和皮肤)的甲基化图谱。有趣的是，我们的衰老模型的使用表明，在相同的个体中，肿瘤看上去比匹配的正常组织衰老多40％(威尔科克斯(Wilcox)测试，p＜10-41，图4D和4C)。不管主要组织类型如何，加速肿瘤衰老是明显的。我们通过检查所有70,387个与年龄相关的标记，研究了这是否是全球甲基化水平广泛变化的结 果，其中，随着年龄的增加，44％倾向于增加而56％倾向于减少。在匹配的肿瘤和正常样品中的甲基化分值支持了一个发现，不管趋势方向如何，肿瘤与74％标记的年长值相吻合(二项式p～0)。而且，构建于匹配的正常和肿瘤样品的分离衰老模型确认了显著地衰老效应(表S4)。
[0175] 不同的衰老速率导致不同的甲基化
[0176] 如果个体年龄确实以不同速率，可以预料他们个体甲基化随着时间的推移应该不同。这基于前提是较年轻的甲基化共享某些相似性，及随着时间的推移个体积累的变化，这些相似性减少。在同卵双生中已观察到这种所谓表观遗传漂移的效应(Fraga et al.，2005)，但是，很少提出特定的假说对此作出解释。为了检查我们样品中的表观遗传漂移，我们从预期总体平均数计算了每个甲基化标记的偏移值作为其平方距离(图5A)。然后，除了测试其甲基化分值随着年龄的变化而变化的标记(图5B和5C)，我们能测试其变异随着年龄的变化而变化的标记(图5D和5C)(Breusch and Pagan，1979)。渐增的变异是一种普遍的现象-我们鉴别了27800个标记，标记的变异与年龄有显著的相关性(FDR＜0.05)，其中27，737(99.8％)代表增加而不是减少的变异(图5E和S5)。对于任何给定的个体，尤其高或低的甲基化变异是衰老速率的强预测器(R＝0.47，p～0)，表明了衰老速率的差别为部分甲基化异质和表观遗传漂移作出了解释。
[0177] 检查表观遗传漂移的另一种方法是依据Shannon熵，或者是随着时间的推移甲基化信息内容的缺失(Shannon and Weaver，1963)。CpG标记熵的增加意味着其甲基化状态在细胞群中变得难以预测，如其甲基化分值趋向于50％。确实，与样品行列中甲基化分值的变化相关的所有标记，70％趋向于甲基化分值为50％(图6A，二项式p～0，表S2)。所以，我们观-7察到在样品行列中甲基化熵的高显著的增加(R＝0.21，p＜10 )。而且，基于AMAR，个体极端甲基化熵与加速的衰老速率具有很高的关联性(R＝0.49，p～0，图6B)。
[0178] 衰老速率和转录组
[0179] 由于甲基化中的变化与基因表达的变化有直接的关联(Sun et al.，2011)，我们感兴趣的是，在衰老甲基化中的这些变化是否反映在人类转录组中功能层面上及是否反映了衰老速率的差别。为此，我们从488个个体，跨越年龄范围为20至75的全血中获得和分析公开的可用的基因表达图谱(Emilsson et al.，2008)。我们找到了与年龄相关的基因表达(326个基因，FDR＜0.05)和渐增的表达变异的基因的有利的证据(二项式p＜10-276)。引人瞩目的是，我们发现，在我们的数据中，与年龄相关的基因表达图谱更可能具有附近的与年龄相关的甲基化标记(p＜0.01，表S6)。基于在甲基化中与年龄相关的基因表达，我们利用这些信息构建了一个衰老模型(图7A，表S7)。这个模型显示了使用表达数据测量衰老速率明显的能力，与女人相比，重现了我们在与女人相比时男人渐增的衰老速率的发现(图7B，11％差异，p＜10-4)。性别效应在所构建的模型中是不存在，使用所有的可利用的基因而不是那些在甲基化中与年龄相关的变化(p＞0.05)。因此，与年龄相关的变化表明基因表达模式的功能变化。
[0180] 表S6，与图7有关的在甲基化和转录组两者中的与衰老相关的基因
[0181] 映射到年龄相关的甲基化标记和表转录组明与年龄相关的变化的基因列表。
[0182]
[0183]
[0184] 表S7，与图7有关的转录衰老模型
[0185] 基于转录数据用于预测年龄的基因列表和系数。
[0186]
[0187] 结论
[0188] 在本研究中，我们已经表明全基因组甲基化模式代表生物衰老速率的强大的并可复制的生物标记。这些模式能使衰老甲基化的定量模型显示高精确度及区分衰老中包括性别和基因变异的相关的因素的能力能。而且，我们把这种模型应用到多种组织的能力表明了一个常见的分子钟的能力，通过甲基化变化的部分调节。这些变化是否在跨细胞群中细胞内发生的水平一致或者经过一段时间之后，是否在组织成分中随时间推移显示一致的变化还有待观察。
[0189] 从全血中预测年龄的能力可在纵向研究中允许广泛的分析，如弗雷明汉(Framingham)研究、妇女健康倡议、从新生儿格思里(Guthrie)卡收集的血样品和具有丰富注释的生物统计学和疾病特征的其他纵向研究。衰老趋势可从具有许多潜在的现实意义的此类研究中显现出来，从健康评估和疾病预防到法医分析。类似于本研究中的性别效应，其他影响AMAR的生物或如吸烟、饮酒或节食的环境因素的鉴别可允许对健康和长寿影响的定量评估。一个有用的例子可定期地评估使用AMAR的个体衰老速率及确定节食或环境因素是否可加 速或延缓衰老过程和如年龄相关性黄斑变性的疾病。作为人类衰老模型的改进，可以想象的是，有一天，用分子谱测量的生物年龄在临床评估和患者治疗中可取代实足年龄。
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[0246] 构建衰老甲基化模型
[0247] 我们测量在从302个高加索人全血样品收集的基因组DNA中的485，577 CpG标记的甲基化状态。其中，80个个体被诊断有2-型糖尿病，其中的22个也具有糖尿病性肾病。为了进一步的研究和验证，获得了第二行列的甲基化状态，包括188个西班牙裔人。第二群体的每个人被诊断有2-型糖尿病及89个人也具有糖尿病性肾病。进行仔
细筛选和正常化以除去性别、批次或其他未知的协变量的影响。
[0248] 一般来说，我们假设，生物活性
跟踪实足年龄，允许我们从实足年龄中推断生物模型。我们假定，分子活性中从共同基线的变化将反映衰老过程的减缓或加速，其中，疾病、环境和遗传学可能作出贡献。
[0249] 形式上，我们把生物年龄(bioage)定义为：
[0250]
[0251] 其中，Msub是甲基化数据小子集，αj是数值系数，cj是第j个性状，及ε是模型误差。这儿的
临界点为通过选择与实足衰老协调关联的模 型探针，相对于这些相同的探针甲基状态的改变可能反映为不是衰老过程的衰减就是衰老过程放大。
[0252] 我们考虑到，生物衰老的速率不是一成不变的，及在人类发展和衰老的不同里程碑中，在生物衰老中将发生大的变化。通过首先使用单变量关联测试，我们测试了这一假说，以鉴别主要行列中顶端年龄相关的甲基化标记(FDR＜0.05)。然后，我们使用熵尺度测定年轻和年老个体之间的那些标记的相对一致性(图1)。我们发现，相关标记在年轻个体中比在年老个体中更一致(p＜0.05)。这表明甲基化衰老模式与年轻个体相似，但随着时间偏离。
