急性心脏病症包括急性冠状动脉综合征(ACS)，其包括从不 稳定绞痛到急性心肌梗死(AMI)范围内的广谱心脏缺血事件。这 些事件中AMI的表现最为严重，因此必须快速和准确地诊断。表 现有两种或者多种所述特征(缺血性胸部不适的病史、连续心电图 (ECG)轨迹的渐进变化和血浆心脏生物标记物的升高和降低)的 患者被明确地确诊为患有AMI1。但是，很大比例(40％-50％)表 现有疑似AMI的患者不具有ECG的连续变化或者典型的症状，因 此为了准确诊断，就着重强调循环的生物标记的浓度2-4。
心肌梗塞的准确早期诊断有利于再灌注治疗的迅速引入，包括 有效的经皮或者溶栓血管重建以及附加的抗凝血剂和抗血小板治 疗。诊断和处理每延迟一小时，这样的治疗对于降低死亡率和发病 率的有效性就逐渐降低2-4。鉴于在临床环境下需要尽快作出决定， 人们对提供急性心脏病症，尤其是AMI的早期和特异性诊断的循 环生物标记物的确定相当关注。
出于这个目的，已经提出了多种生物标记物，包括肌酸激酶 -MB(CK-MB)、肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)和肌红蛋 白，但是对它们的使用有限制。血浆心脏生物标记物的可检测到的 或者异常的升高的时间可以为6小时(肌红蛋白、CK-MB)到12 小时(TnT、TnI)，直到损伤发作后24-48小时才出现峰值水平，这 给准确的诊断和治疗造成了延迟的空窗期1-4。而且，肌红蛋白和 CK-MB都是非特异性的，并且可以由心外源分泌，尤其是在损伤 或者外科手术期间1。可用于此目的的其他生物标记是BNP (preproBNP 103-134)和N-BNP(preproBNP 27-134)，N-BNP还 被称为NT-proBNP(见图1)。这两种肽都被分泌进入到循环中。
在AMI后的早期BNP和N-BNP的血浆浓度的测量具有很有 力的预测价值2、6、7，并且将这些肽的血浆浓度整合到治疗体系中去 可以显著改善心力衰竭患者临床结果8。对于具有大约比BNP长约 14倍的半衰期5，因此在AMI之后提供长期心功效的其他重要信息 的N-BNP尤其如此。
与上述心脏生物标记物一样，BNP和N-BNP在损伤发作后6 到12小时可能达不到可检测的或者异常水平，直到发作后24到48 小时才出现峰值水平。因此BNP和N-BNP的长期诊断/预测能力对 于在临床表现的最初几个小时内提供急性心脏病症(如急性心脏损 伤)的早期特异性诊断的特异性标记物的随附能力是不足的。
最近，已经提出BNP-SP在心脏疾病的诊断中可能是有用的 (US 2005/0244904、WO 2005/052593)。心力衰竭的患者中BNP-SP 的水平通常会显示出高于正常患者。没有任何关于何时测量 BNP-SP水平的时程(time course)信息。陈述了BNP-SP的水平升 高与N-BNP有关。
本发明的目的是对满足对急性心脏病症的早期标记的需要起 到一些作用，和/或至少为公众提供一个有用的选择。

人B型钠尿信号肽(BNP-SP)或者preproBNP(1-26)是从 preproBNP(1-134)SEQ ID NO：1分裂出的26个氨基酸的肽。BNP-SP 单独以SEQ ID NO：21示出。
申请人出人意料地发现BNP-SP的循环浓度在急性冠状动脉综 合征(ACS)发作或者临床表现疑似的急性冠状动脉综合征(ACS) 之后的最初几小时内是最高的。在此最初的几小时内，峰值为正常 对照人群的4到10倍，通常为5到8倍。
因此，在第一个方面，本发明提供了预测、诊断或者监测受试 者中急性心脏病症(ACD)的方法，该方法包括：测量在ACD发 作的两小时内或表现出ACD的两小时内从受试者获得的生物样品 中的BNP-SP水平；并且将所述的BNP-SP水平与对照的BNP-SP 水平进行比较，其中所测量到的高于来自对照水平的BNP-SP水平 是ACD的指征。
本发明还提供了监测治疗受试者对急性心脏病症(ACD)的反 应的方法，该方法包括：测量在ACD发作或者表现ACD的两个小 时内从受试者获得的生物样品中的BNP-SP水平；并且将所述 BNP-SP水平与对照的BNP-SP的水平进行比较，其中测量到的水 平对于对照的BNP-SP水平发生变化是对治疗的反应的指征。
另一方面，本发明还提供了预测、诊断或者监测受试者中的心 脏移植排斥的方法，该方法包括测量在心脏移植两个小时内的从受 试者获得的生物样品中的BNP-SP水平，并且将所述的BNP-SP水 平与对照的BNP-SP水平进行比较，其中测量到的高于对照水平的 BNP-SP水平是移植排斥的指征。
本发明还提供了将受试者中的肺病与急性心脏病症(ACD)区别 开来的方法，该方法包括测量在表现该病症的两个小时内从受试者 获得的生物样品中的BNP-SP水平；并且将所述的BNP-SP水平与 对照的BNP-SP水平进行比较，其中测量到的BNP-SP水平高于对 照水平是ACD的指征。
本发明还提供了预测、诊断或者监测受试者中的急性心脏病症 (ACD)、心脏移植排斥或者ACD/肺病的方法，该方法包括测量在 ACD、心脏移植排斥或者ACD/肺病发作或者临床表现ACD、心脏 移植排斥或者ACD/肺病的最初的两小时内从受试者获得的生物样 品中的BNP-SP水平。
优选地，将测量到的BNP-SP水平与对照的BNP-SP水平进行 比较，其中高于对照水平的测量到的BNP-SP水平是ACD或者心 脏移植排斥的指征。
优选地，本发明的方法是体外的方法。
在一种实施方式中，BNP-SP水平的测量是在发作或者临床表 现的一个小时内进行的，优选在30分钟内进行。
优选地，生物样品是血液、唾液、间质液、血浆、尿、血清或 者心脏组织。
在一种实施方式中，测量步骤包括检测BNP-SP与选择性结合 BNP-SP的结合剂之间的结合。该结合剂优选为抗体或者抗体片断。 最常见的是，该抗体为单克隆、多克隆或者人化(或人源化)抗体。 优选单克隆抗体。
在一种替代的实施方式中，利用质谱法来测量BNP-SP水平。
由抗体选择性结合的BNP-SP是全长人BNP-SP分子(SEQ ID NO：21)或者抗原变异体或其片断。优选地，该片断的长度为至少 5个氨基酸。理想的是，抗体结合BNP-SP的N末端或者C末端。
结合剂选择性结合的特异性抗原肽包括人BNP-SP(1-10)(SEQ ID NO：13)、BNP-SP(1-17)(SEQ ID NO：15)、BNP-SP(3-15)(SEQ ID NO：23)、BNP-SP(17-26)(SEQ ID NO：19)、BNP-SP(12-23)(SEQ ID NO：17)和BNP-SP(1-26)(SEQ ID NO：21)或者它们的变异体。
优选使用固定在固相上的抗体或者抗体片断来测量BNP-SP的 结合。
可以用选自RIA、ELISA、荧光免疫分析、免疫荧光测量分析、 质谱法和免疫放射测定的分析法来有效地测量BNP-SP水平。
因此，本发明还提供了在发作或者临床表现ACD、心脏移植 排斥、或ACD/肺病的两小时内从受试者获得生物样品中的BNP-SP 测定，该测定包括利用已知的方法检测和测量样品中的BNP-SP水 平。
优选地，该测定是体外测定。
本发明的方法还包括测量所述ACD、或心脏移植排斥、或ACD/ 肺病中的一种或者多种非-BNP-SP标记物的水平，并且将该水平与 对照的标记物水平进行比较，其中测量到的水平与非-BNP-SP标记 的对照水平有偏差，以及测量到的高于对照BNP-SP水平的BNP-SP 水平被用于ACD预测或者诊断，或者可以被用于监测所述的ACD、 心脏移植排斥或ACD/肺病。
本文中的用于急性冠状动脉综合征的标记物包括肌钙蛋白T、 肌钙蛋白I、肌酸激酶MB、肌红蛋白、BNP、NT-BNP、LDH、天 冬氨酸转氨酶、和心脏特异性脂肪酸结合蛋白(H-FABP)。
另一方面，本发明还提供了选择性结合BNP-SP或者其抗原片 断或变异体的BNP-SP结合剂用于预测、诊断或者监测受试者的急 性心脏病症(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺病的应用，其中ACD、 心脏移植排斥或ACD/肺病的特征为在发作或者临床表现ACD、心 脏移植排斥或ACD/肺病的两个小时内在从受试者获得生物样品中 出现BNP-SP。
在一种实施方式中，结合剂优选为抗体或其片断。
在另一种实施方式中，结合剂为能够结合BNP-SP的任何固体 或者非固体材料。
本发明还提出了BNP-SP结合剂在制造用于判定受试者中的急 性心脏病症(ACD)、心脏移植排斥或者ACD/肺病的预测、诊断或 者监测器具中的应用，其中在ACD、心脏移植排斥或ACD/肺病发 作或临床表现ACD、心脏移植排斥或ACD/肺病的两小时内进行判 定。
本发明还涉及本发明的应用，其中将预测、诊断或者监测器具 校准以测量在0.1到500pmol/L，优选1到400pmol/L，优选10 到350pmol/L，优选20到300pmol/L，优选25到250pmol/L， 优选30到180pmol/L，优选35到150pmol/L和优选40到120 pmol/L的范围内的BNP-SP水平。
另一方面，本发明提供了用于预测、诊断或监测急性心脏病症 (ACD)、心脏移植排斥或者ACD/肺病的包括本发明的BNP-SP结 合剂的试剂盒，其中该试剂盒用于与在ACD、心脏移植排斥或ACD/ 肺病发作或者临床表现ACD、心脏移植排斥或ACD/肺病的两小时 内从受试者获得的生物样品一起使用。
本发明还提供了预测、诊断或者监测急性心脏病症(ACD)的 包括本发明的结合剂的试剂盒，其中将该试剂盒校准以测量在0.1 到500pmol/L，优选1到400pmol/L，优选10到350pmol/L，优选 20到300pmol/L，优选25pmol/L到250pmol/L，优选30到180 pmol/L，优选35到150pmol/L和优选40到120pmol/L的范围内的 BNP-SP水平。
优选地，该试剂盒还包括从发作或临床表现两小时内获得的生 物样品中测量得到的BNP-SP水平，在发作或者临床表现的两小时 内预测、诊断或者监测受试者的ACD的使用说明。
另一方面，本发明涉及编码本发明的BNP-SP的核酸分子，其 中所述的核酸选自：
(a)SEQ ID NO：14；
(b)SEQ ID NO：16；
(c)SEQ ID NO：18；
(d)SEQ ID NO：20；
(e)(a)到(d)中任一者的补体；
(f)能够在严格条件下与(a)到(e)中任一者的序列杂交的 序列，长度为至少15个核苷酸，限制条件为：该序列不是 ccagtgcacaagctgcttggggaggcgaga或SEQ ID NO：22。
本发明还提供了包括本发明的核酸分子的基因构建体、包括该 基因构建体的载体、包括该基因构建体或载体的宿主细胞、由本发 明的核酸分子编码的多肽、选择性地结合本发明的多肽的抗体、以 及重组产生本发明的多肽的方法。
因此，本发明的另一方面提供了选自以下的分离BNP-SP多肽：
(a)SEQ ID NO：13；
(b)SEQ ID NO：15；
(c)SEQ ID NO：17；以及
(d)SEQ ID NO：19。
附图说明
以下将参照附图来描述本发明，其中：
图1是描述导致产生自由信号肽、N-BNP肽和BNP肽的人 preproBNP的过程的示意图；
图2A是七个物种中的preproBNP序列的单个字母符号形式。 信号肽区是粗体并且具有下划线；
图2B是preproBNP信号肽序列的Clustal W version 1.83 JALVIEW多重序列比对。在该比对中所使用的默认Clustal W参数 如下：DNA空位开放罚分＝15.0；DNA空位延伸罚分＝6.66；DNA 矩阵＝Identity；蛋白质空位开放罚分＝10.0；蛋白质空位延伸罚分 ＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA ENDGAP＝-1；蛋白质/DNA GAPDIST＝4。氨基酸以Pearson(fasta)格式提交9；
图3出示了与BNP-SP标准曲线(实心圆)平行的人血浆提取 物(空心方形)的放射免疫分析的结果；
图4示出了证实健康人的BNP-SP的血浆浓度不表现出任何与 年龄的相关性的放射免疫分析结果；
图5示出了证实正常的健康人(n＝13)的BNP和N-BNP血浆 水平表现出紧密相关性(左图)，而BNP-SP浓度与N-BNP不相关 (右图)的放射免疫分析结果；
图6示出了人血浆中的BNP-SP的放射免疫分析SEHPLC(上 图)和RPHPLC(下图)分析的结果，其表示BNP-SP洗脱物接近 于合成的BNP-SP(向下的箭头，下图)；
图7：放射免疫分析结果示于上图：在如所示入院时间从AMI 患者(n＝10)抽取的血浆中的BNP-SP(空心六边形)、BNP(实心 圆形)和N-BNP(空心正方形)的浓度。与在入院后24小时达到 峰值的BNP和N-BNP水平形成对比，观察到BNP-SP的最高水平 是在入院时，比正常健康个体中测量到的水平(空心圆形)平均高 约7倍。下图：与上图中的相同患者的CK-MB、肌红蛋白和TnT 的相匹配的时间过程浓度分布曲线。
图8示出了BNP-SP抗血清的交叉反应性数据表；
图9是示出了患者中来自心源的循环BNP-SP浓度的柱状图。

定义
急性心脏病症(ACD)，包括但不限于：急性冠状动脉综合征 (AMI)(在ECG表现为ST段抬高)、不稳定心绞痛、急性非ST 段抬高MI；心脏缺血；急性心脏损伤；由急性药物毒性引起的急 性心肌损害、急性心肌疾病、和心脏移植排斥。这些病症的定义和 详细描述可以在参考文献1中找到。
ACD/肺病是指具有未诊断、或疑似ACD或者肺病的受试者。
急性冠状动脉综合征(ACS)包括广泛的心脏缺血事件，包括 不稳定心绞痛、心电图(ECG)表现为ST段抬高的急性心肌梗死 和ECG未表现ST段抬高的急性心肌梗死。
术语“抗体”是指具有与包括用于合成该抗体的抗原的分子或 与其密切相关的抗原特异性相互作用(结合)的特定结构的免疫球 蛋白分子。如果该抗体优选地结合到BNP-SP，例如，具有小于25％， 优选小于10％，优选小于1％的与非BNP-SP多肽的交叉反应性， 则抗体选择性或者特异性地结合到本发明的BNP-SP多肽。通常， 该抗体对抗原具有不超过10-7M，优选小于约10-8M，优选小于约 10-9M的亲和力(解离常数(Kd)值)。可以利用表面等离子体共振 (surface plasma resonance)来评估该亲和力。
本文中所使用的生物样品意指来自待筛选的受试者的任何样 品。该样品可以为可检测BNP-SP的领域中已知的任何样品。任何 体液，例如血浆、血液、唾液、间质液、血清、尿、滑液、脑脊液、 淋巴液、精液、羊水、心包液和腹水，以及组织(如心脏组织)均 包括在内，但不限于此。还包括来自不具有急性心脏病症临床病史 的正常健康受试者的样品。
术语“BNP-SP”是指人prepro BNP序列(SEQ ID NO：1)的 完整的26个氨基酸BNP信号肽。BNP-SP另外以SEQ ID NO：21表 示。术语BNP-SP还包括BNP-SP的变异体或者片断。
在本说明书和权利要求中使用的术语“包括”表示“由至少部 分......构成”；也就是说，当解释本说明书或权利要求中包括“包括” 的叙述时，每一叙述中以这个术语为开始的特征都需要存在，但是 其它特征也可以存在。相关的术语如“包含”也可以相似的方式解释。
如本文中所使用的，术语“多核苷酸”表示任意长度的单链或双 链的脱氧核糖核酸或核糖核酸的聚合物，并且包括作为非限定性的 实施例的基因的编码和非编码序列、有义序列和反义序列、外显子、 内含子、基因组DNA、cDNA、前体mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、 miRNA、tRNA、核酶、重组多核苷酸、分离并纯化的天然存在的 DNA或RNA序列、合成的DNA或RNA序列、核酸探针、前体、 片段、基因构建体、载体或者经修饰的多核苷酸。提到核酸分子作 相似的理解。
本文中所提供的多核苷酸序列的“片断”是能够与感兴趣的靶 标特异性杂交的相邻核苷酸的子序列，例如长度少于10个核苷酸 的序列。本发明的片断包括SEQ ID NO.22的多核苷酸的10个，优 选15个核苷酸，优选16，优选17，优选18，优选19，优选21， 优选22，优选23，优选24，优选25，优选26，优选27，优选 28，优选29，优选30，优选31，优选32，优选33，优选34，优 选35，优选36，优选37，优选38，优选39，优选40，优选41， 优选42，优选43，优选44，优选45，优选46，优选47，优选 48，优选49，优选50，优选51，优选52，优选53，优选54，优 选55，优选56，优选57，优选58，优选59，优选60，优选61， 优选62，优选63，优选64，优选65，优选66，优选67，优选 68，优选69，优选70，优选71，优选72，优选73，优选74，优 选75，优选76，优选77个相邻核苷酸。多核苷酸序列的片断可以 被用作包括在微阵列(microarray)中的引物、探针，或者被用于本 文中的基于多核苷酸的选择方法。
术语“引物”是指通常具有自由3′OH基团的短的多核苷酸，其 与模板杂交并且用于与靶标互补的多核苷酸的起始聚合。
术语“探针”是指在基于杂交的分析中用于检测与该探针互补 的多核苷酸序列的短多核苷酸。探针可以由本文中所限定的多核苷 酸的“片断”构成。
如本文中所使用的，术语“多肽”包括任意长度的氨基酸链，优 选至少5个氨基酸，优选至少6个，优选至少7个，优选至少8个， 优选至少9个，优选至少10个，优选至少11个，优选至少12个， 优选至少13个，优选至少14个，优选至少15个，优选至少16个， 优选至少17个，优选至少18个，优选至少19个，优选至少20个， 优选至少21个，优选至少22个，优选至少23个，优选至少24个， 优选至少25个，并且优选BNP-SP(SEQ ID NO：21)的全长的全部 26个氨基酸，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。用于本发明中的 多肽可以为纯化的天然产物，或者可以为部分或者完全利用重组或 合成技术产生。该术语可以是指多肽，多肽聚合体(如二聚体或其 它多聚体)、融合多肽、多肽片断、多肽变异体或者它们的衍生物。
多肽的“片断”是起到所需生物活性或结合的功能和/或提供多 肽的三维结构的多肽的子序列。该术语可以是指多肽、多肽聚合体 (如二聚体或其它多聚体)、融合多肽、多肽片断、多肽变异体或 者能够起到上述信号肽作用的它们的衍生物。
用于本文所公开的多核酸或多肽序列的术语“分离的”是指从 它们的天然细胞环境取出的序列。分离的分子可以通过任何方法或 者包括生物化学、重组和合成技术的方法的组合来获得。可以通过 至少一个纯化步骤来制备多核苷酸或多肽序列。
术语“重组”是指从其天然环境的序列中取得的多核苷酸序列 和/或与其天然环境中不存在的序列重组的序列。
“重组”多肽序列是通过翻译“重组”多核苷酸序列来产生的。
如本文中所使用的，术语“变异体”是指与特异性同一序列不同 的多核苷酸或多肽序列，其中删除、置换或者添加了一个或多个核 苷酸或氨基酸残基。变异体可以是天然存在的等位基因变异体，或 非天然存在的变异体。变异体可以来自相同物种或其它物种并且可 以包括同源(homologue)、旁系同源(paralogue)和直系同源 (orthologue)。在某些实施方式中，用于本发明中的多肽的变异体 和生物活性与亲本多肽或多核苷酸相同或相似。与多核苷酸和多肽 相关的术语“变异体”包括本文中所限定的多核苷酸和多肽的所有形 式。
变异体多核苷酸序列优选表现的与本发明的序列至少50％，至 少60％，优选至少70％，优选至少71％，优选至少72％，优选至少 73％，优选至少74％，优选至少75％，优选至少76％，优选至少77％， 优选至少78％，优选至少79％，优选至少80％，优选至少81％，优 选至少82％，优选至少83％，优选至少84％，优选至少85％，优选 至少86％，优选至少87％，优选至少88％，优选至少89％，优选至 少90％，优选至少91％，优选至少92％，优选至少93％，优选至少 94％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％， 以及优选至少99％的同一性。在至少10个核苷位置，优选至少15 个核苷位置，优选至少20个核苷位置，优选至少27个核苷位置， 优选至少40个核苷位置，优选至少50个核苷位置的整个比较窗 (comparison window)上发现同一性，并且最优选在本发明的多核 苷酸的整个长度上发现同一性。
可以使用全局序列比对程序(例如，Needleman，S.B.和Wunsch， C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)在受试者多核苷酸序列和候 选多核苷酸序列重叠的完整长度上计算多核苷酸序列同一性。在 EMBOSS软件包中的指针(needle)程序中找到Needleman-Wunsch 全局比对算法的完整实施(Rice，P.Longden，I.和Bleasby，A. EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite， Trends in Genetics June 2000，vol 16，No 6.pp.276-277)，EMBOSS软 件包可以从http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/获得。欧 洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)服务器也 在http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/在线提供方便的两个序列之间 的EMBOSS-needle全局比对。
可替代地，可以使用GAP程序，其计算两个序列的最佳全局 比对而不对末端空位罚分。以下的论文中描述了GAP：Huang，X. (1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences 10，227-235。
多核苷酸变异体还包括那些表现出与特异性同一序列中的一 个或者多个的相似性，该特异性同一序列有可能保留了这些序列的 功能相似部分，并且不能合理预期其是通过随机产生的。这个程序 发现了序列间的相似性，并且对于每个这样的区域报告“E值”，“E 值”是在含有随机序列的固定参考大小的数据库中的期望见到这样 的随机配对的预期次数。该数据库的大小是通过bl2seq程序中的默 认值来设定的。对于小的E值(远小于1)，该E值大约是这样的 随机匹配的概率。
当与特异性同一序列中的任意一个进行比较时，变异体多核苷 酸序列的E值优选为小于1×10-5，更优选小于1×10-6，更优选小于 1×10-9，更优选小于1×10-12，更优选小于1×10-15，更优选小于1×10-18， 并且最优选小于1×10-21。
优选使用BLASTN以用于确定本发明的多核苷酸变异体的序 列同一性。
可以使用以下的UNIX命令行参数来检查多核苷酸序列的同一 性：
bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-F F-p blastn
参数-F F关闭低复杂度部分的过滤。参数-p选择用于序列配对 的合适算法。bl2seq程序在“Identities＝”行以相同的核苷酸数目和百 分率来报告序列同一性。
还可以以下的方式来确定多核苷酸序列的同一性和相似性。利 用序列比对算法和序列相似性搜索工具(如Genbank、EMBL、 Swiss-PROT和其它的数据库)将受试者多核苷酸序列与候选多核 苷酸序列进行比较。Nucleic Acids Res 29：1-10和11-16，2001提供了 在线资源的实例。公众可从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast)或从 位于美国马里兰州Bethesda的NCBI得到BLASTN(来自BLAST 程序套装，version 2.2.13 March 2007 in bl2seq(Tatiana A.等FEMS Microbiol Lett.174：247-250(1999)，Altschul等，Nuc.Acis Res 25：3389-3402，(1997))。使用的bl2seq的默认参数，除非应该关闭低 复杂度部分的过滤。
可替代地，在严格的条件下使变异体多核苷酸与特异性多核苷 酸序列，或者其补体杂交。
术语“在严格的条件下杂交”和其语法上的等同表达，是指在确 定的温度和盐浓度条件下多核苷酸分子与目标多核苷酸分子(如固 定在DNA或者RNA印迹上的目标核苷酸分子，如DNA印迹或者 RNA印迹)的杂交能力。在严格杂交条件下的杂交能力可以通过最 初在严格性较小的条件下进行杂交，然后将严格性提高到期望的水 平来确定。
对于长度大于约100个碱基的多核苷酸分子，的严格的杂交条 件一般是不超过25到30℃(例如10℃)低于天然二倍体的解链温 度(Tm)(一般参见Sambrook等，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版；Cold Spring Harbor Press；Ausubel等， 1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing，其 结合于本文作为参考)。可以通过公式 Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+))(Sambrook等，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press； Bolton and McCarthy，1962，PNAS 84：1390)来计算大于100个碱基 的多核苷酸分子的Tm。对于长度大于100个碱基的多核苷酸的一 般严格条件可以为如下的杂交条件：在6X SSC，0.2％SDS溶液中 预洗涤；于65℃，6X SSC，0.2％SDS杂交过夜；随后为分别于65℃， 在1×SSC，0.1％SDS中洗涤两次每次30分钟，以及于65℃，在 0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。
在一种实施方式中，严格条件于42℃使用50％甲酰胺、5×SSC、 50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt′s溶液、超声 处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于 42℃在0.2×SSC中洗涤并于55℃在50％甲酰胺中进行洗涤，随后 于55℃用含有EDTA的0.1×SSC进行洗涤。
对于长度小于100个碱基的多核苷酸分子，示例的严格杂交条 件是比Tm低5到10℃。平均起来，长度小于100bp的多核苷酸 分子的Tm大约降低(500/寡核苷酸长度)/℃。
对于被称为肽核酸(PNA)的DNA模拟物(Nielsen等，Science. 1991年12月6日；254(5037)：1497-500)，Tm值高于DNA-DNA或 者DNA-RNA杂交体的Tm，并且可以利用在Giesen等，Nucleic Acids Res.1998年11月1日；26(21)：5004-6中描述的公式来计算。 长度小于100个碱基的DNA-RNA杂交体的示例性严格杂交条件是 低于Tm 5到10℃。
变异体多核苷酸还包括与本发明的序列不同，但是其作为遗传 密码简并的结果，编码与本发明的多核苷酸编码的多肽具有相似的 活性的多肽的多核苷酸。不会改变多肽的氨基酸序列的序列改变是 “沉默变异(silent variation)”。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色 氨酸)以外，同一种氨基酸的其它密码子可以通过本领域公知的技 术来进行改变，例如，从而优化在特定的宿主生物中的密码子表达。
在本发明还包括导致被编码的多肽序列中的一个或多个氨基 酸的保守置换而不会显著改变被编码多肽序列的生物活性的多核 苷酸序列的改变。一般的技术人员会知道实施表型沉默氨基酸取代 的方法(参见例如，Bowie等，1990，Science 247，1306)。
可以利用bl2seq程序经由如上文所述的tblastx算法来确定在编 码的多肽序列中由沉默变异和保守置换产生的变异体多核苷酸。
与多肽相关的术语“变异体”也包括天然存在的、重组的和合成 产生的多肽。变异体多肽序列优选表现与本发明的序列至少50％， 优选至少60％，优选至少70％，优选至少71％，优选至少72％，优 选至少73％，优选至少74％，优选至少75％，优选至少76％，优选 至少77％，优选至少78％，优选至少79％，优选至少80％，优选至 少81％，优选至少82％，优选至少83％，优选至少84％，优选至少 85％，优选至少86％，优选至少87％，优选至少88％，优选至少89％， 优选至少90％，优选至少91％，优选至少92％，优选至少93％，优 选至少94％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选 至少98％，以及优选至少99％的同一性。在至少5个氨基酸位置， 优选至少7个氨基酸位置，优选至少10个氨基酸位置，优选至少 15个氨基酸位置，优选至少20个氨基酸的比较窗口上发现同一性， 并且最优选在本发明使用的多肽的整个长度上发现同一性。
多肽变异体还包括那些表现出与特异性同一序列中的一个或 多个的相似性，该特异性同一序列有可能保留了这些序列的功能相 似部分，并且不能合理预期其是通过随机产生的。
可以通过以下的方式来确定多肽序列的同一性和相似性。利用 bl2seq中的BLASTP(来自BLAST程序套装，version 2.2.14[2006 年5月])将受试者的多肽序列与候选多肽序列进行比较，公众可以 从NCBI获得BLASTP(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)。使用bl2seq的 默认参数，除非应该关闭低复杂度部分的过滤。
可以使用以下的UNIX命令行参数来检查多肽序列的相似性：
bl2seq-i peptideseq1-j peptideseq2-F F-p blastp
当与特异性同一序列中的任意一个进行比较时，变异体多肽序 列的E值优选为小于1×10-5，更优选小于1×10-6，更优选小于1×10-9， 更优选小于1×1 0-12，更加优选小于1×10-15，更优选小于1×10-18， 并且最优选小于1×10-21。
参数-F F关闭低复杂度部分的过滤。参数-p选择用于序列配对 合适算法。该程序发现序列间的相似性，并且对于每个这样的区域 报告“E值”，该“E值”是在含有随机序列的固定参考大小的数据库 中的期望见到这样的随机配对的预期次数。对于小的E值(远小于 1)，该E值大约是这样的随机匹配的概率。
还可以使用全局序列比对程序，在候选多肽序列和受试者多肽 序列之间重叠的整个长度上计算多肽序列同一性。以上所讨论的 EMBOSS-needle(可从http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/获得)和 GAP(Huang，X.(1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences 10，227-235)也是适合用于计算多肽 序列同一性的全局序列比对程序。
优选使用上文所述的BLASTP用于确定本发明的多肽变异体。
优选的变异体包括其序列通过不影响该肽的生物活性的一个 或者多个保守氨基酸置换、删除、添加或者插入而与本文中的人 BNP-SP(1-26)不同的肽。保守置换一般包括用另外一个具有相似特 性的氨基酸置换一个氨基酸，例如，在以下的组中进行置换：缬氨 酸、甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬 氨酸，谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酸；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精 氨酸；以及苯基丙氨酸，酪氨酸。保守置换的实例还可以在图2A 和图2B中的BNP-SP序列中，通过这所显出的不同哺乳动物种类 的置换与人类序列的比较而发现。其它的保守置换可以来自下表1。
表1

根据相同的侧链特性将天然存在的残基分成几组：
(1)疏水氨基酸：正亮氨酸、甲硫氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；
(2)中性亲水氨基酸：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
(3)酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；
(4)碱性氨基酸：天门冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、 精氨酸；
(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；以及
(6)芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守置换会使这些类别中的一类的成员与另外一个类别的 成员进行互换。参见例如在BNP-SP25中用H置换R。
其它的变异体包括具有影响肽稳定性的变性的肽。这样的类似 物可以含有，例如，肽序列中的一个或多个非肽键(其代替了肽键)。 还包括这样的类似物，其该类似物包括除天然存在的L-氨基酸之外 的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸，例如β氨基酸 或γ氨基酸以及环状类似物。
可以通过所属领域中已知的突变形成方法来制造置换、删除、 添加或插入。一般技术人员会知道实施表型沉默的氨基酸置换的方 法。例如参见Bowie等，1990，Science 247，130610。
本发明的多肽还包括那些已经通过例如生物素化、苄基化、糖 基化、磷酸化、酰胺化、使用封端基团/保护基等来衍生化而在合成 过程中或者之后被改性的多肽。这样的改性可以提高多肽的稳定性 或活性。
术语“基因构建体”是指多核苷酸分子，通常是双链DNA，其可 以被插入到另外一个多核苷酸分子(插入多核苷酸分子)中，例如 但不限于cDNA分子。基因构建体可以含有使插入多核苷酸分子可 以转录，并且可选地使转录物被翻译成多肽的必需元件。插入多核 苷酸分子可以来自宿主细胞，或可以来自不同的细胞或生物体，和 /或可以为重组多核苷酸。一旦在宿主细胞中存在该基因构建体，该 基因构建体就可以被整合到宿主染色体DNA中。该基因构建体可 以连接到载体。
术语“载体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，其被用于将 基因构建体转运至宿主细胞中。载体可以能够在至少一个其他宿主 系统(如大肠杆菌)中复制。
术语“表达构建体”是指包括使得插入的多核苷酸分子进行转 录，并且可选地将转录本翻译成多肽的必需元件的基因构建体。表 达构建体在5′到 3′的方向上通常包括：
a)启动子，在构建体将被转运进的宿主细胞中起作用；
b)待表达的多核苷酸，以及
c)终止子，在构建体将被转运进的宿主细胞中起作用。
术语“编码区”或“开放阅读框”(ORF)是指在合适的调控序列 的控制下能够产生转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA 序列的有义链。编码序列由5′翻译起始密码子和3′翻译终止密码子 的存在来确定。当被插入了基因构建体，当“编码序列”被可操作地 连接到启动子和中止子序列和/或其它调控元件时，“编码序列”就能 够被表达。
“可操作地连接(operably-linked)”意指待表达的序列被置于调 控元件的控制之下，该调控元件包括启动子、转录调控序列、翻译 调控序列、复制起点、组织特异性调控元件、临时调控元件、增强 子、多腺苷酸化信号、阻遏物和终止子。
术语“非编码区”是指不翻译的序列，其是翻译起始位点的上游 和翻译终止位点的下游。这些序列也分别被称为5′UTR和3′UTR。 这些区域包括转录起始和终止以及调控翻译效率所需要的元件。
终止子是终止转录的序列，其被发现位于被翻译序列的基因下 游的3′不翻译末端中。终止子是mRNA稳定性的重要决定因素，并 且在某些情况下发现其具有空间调控功能。
术语“启动子”是指调控基因转录的编码区上游的非转录顺式 调控元件。启动子包括顺式起始元件，其特异于转录起始位点和保 守框(如TATA框)以及由转录因子结合的基因座(或基序，motif)。
本发明的多核苷酸或多肽的术语“改变表达”或者“改变的表 达”，意在包括相应于本发明的多核苷酸的基因组DNA被修饰从而 导致本发明的多核苷酸或者多肽的表达被改变的情况。可以通过遗 传转化或者诱导突变领域中已知的其它方法来修饰基因组DNA。 “改变的表达”可以与所产生的信使RNA和/或多肽的量的增加或减 少有关，并且还会由于所产生的多核苷酸和多肽序列中的改变而导 致多肽的活性改变。
本文中所使用的“受试者”优选为哺乳动物，且包括人类和非人 类哺乳动物，如猫、狗、马、牛、羊、鹿、小鼠、大鼠、灵长类(包 括大猩猩、猕猴和黑猩猩)、负鼠和其它饲养的农场动物或动物园 动物。优选地，该哺乳动物是人。
本文中所使用的术语“表现”是指在医疗结构，如门诊部或者医 院的受试者的表现。
术语“治疗”和“预测”是指减轻、改善、维持、预测、抑制、停 止或逆转ACD或心脏移植排斥或其结果，尤其是ACS的发展的治 疗或预测措施。受试者会表现出TnI、BNP、N-BNP和所属领域的 普通技术人员已知的其它常用临床标记物中的一种或多种的可见 或可测的(统计学显著的)降低，以指征改善。
本文中所披露的涉及数字范围(例如1到10)还包括涉及该范 围内所有相关数字(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、 9和10)和该范围内的有理数的任何范围(例如，2到8、1.5到5.5 以及3.1到4.7)，并且因此，清楚的披露了本文中清楚披露的所有 区间的所有子区间。这些仅是具体说明的实例，并且最小值和最大 值之间的数值的所有可能组合都可以被认为本申请中以相同的方 式而被清楚地说明。
本发明的详细描述
人B型钠尿肽(BNP)是心钠肽家族的成员。如图1中所示， preproBNP是134个氨基酸的分子。信号肽BNP-SP(1-26)被裂解从 而产生preproBNP(27-134)。preproBNP(27-134)被进一步处理从而 产生生物活性形式preproBNP(103-134)和preproBNP(27-102)。 BNP-SP有可能被信号肽酶(SPP)降解成更小的片断；通常接近 BNP-SP(1-26)序列的疏水中心区。
长期以来，人们认为BNP-SP的功能限于调控BNP在内质网膜 上的运输。运输完成后，信号肽随后就会被降解成而细胞不会再分 泌该信号肽。
最近，已经发现BNP-SP出现在循环中(WO 2005/052593；US 2005/0244904)。基于这个发现，已经提出了利用BNP-SP作为心脏 疾病的循环生物标记物。本申请人已经有了更进一步的和非常意想 不到的发现。在急性心肌梗塞(AMI)患者中，BNP-SP的循环浓 度在患者症状发作(实际上，是在医院或者门诊部)的最初的几个 小时内是最高的。这与BNP-SP水平会与N-BNP水平相联系并且因 此被认为在从发作或临床表现ACD、心脏移植排斥、或者未确诊或 疑似ACD或肺病的12到24小时达到它们的峰值的预期相反。在 最初的几小时中观察到的水平出人意料地高，通常达到高于正常对 照群体大约4到10倍，通常为5到8倍的峰值。
从首次临床表现的测量开始，将BNP-SP的水平维持在高于对 照群体的BNP-SP水平的3倍至少6周。这些发现指出了BNP-SP 是可用作心脏移植排斥、包括急性冠状动脉综合征(ACS)的ACD (如AMI)、尤其是非ST段抬高MI、急性心脏缺血的非常清楚的 早期标记物，并且可以用于将ACD与肺病区别开来。
基于这些出人意料的发现，本申请人已经首次确定，在取自发 作或临床表现该病症2小时内的受试者的生物样品中筛选循环的 BNP-SP或者其变异体或其片断，以及编码BNP-SP的核苷酸序列 或其变异体或其片断是有用的。
长度为至少5个氨基酸的BNP-SP的抗原片断或变异体在本发 明中是有用的。尤其有用的片断是BNP-SP的N末端或C末端。特 异性抗原肽的实例是BNP-SP(1-10)(SEQ ID NO：13)、BNP-SP(1-17) (SEQ ID NO.15)、BNP-SP(12-23)(SEQ ID NO：17)和BNP-SP(17-26) (SEQ ID NO：19)。相应的核苷酸序列分别在SEQ ID NO：14、16、 18和20中给出。这些序列由本申请人首次提供。核酸分子和肽都 形成本发明的方面。
因此，在第一方面，本发明提供了编码本发明的BNP-SP的核 酸分子，选自：
(a)SEQ ID NO：14；
(b)SEQ ID NO：16；
(c)SEQ ID NO：18；
(d)SEQ ID NO：20；
(e)(a)到(d)中的任一者的补体；
(f)能够与(a)到(e)中的任一个序列在严格条件下杂交的 序列，长度至少为15个核苷酸，限制条件为：该序列不是 ccagtgcacaagctgcttggggaggcgaga或SEQ ID NO：22。
本发明还提供了由本发明的核酸分子编码的分离的BNP-SP多 肽。
本发明的特异性多肽包括具有SEQ ID NO：13、15、17和19 (都如所附的序列表中列出的)的氨基酸序列的多肽。还可以考虑 本文所限定的这些多肽的功能相等变异体和片断。
优选分离本发明的核酸分子或者本文描述的其他物质。可以使 用所述领域普通技术人员已知的各种技术从生物样品分离它们。例 如，可以通过利用Mullis等，Eds.1994 The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser中描述的聚合酶链式反应(PCR)来分离这样 的多核苷酸。本发明的核酸分子可以使用源自本发明的多核苷酸序 列的前体(如本文所限定的)来进行扩增。
分离多核苷酸的其它方法包括使用所有的或者部分本发明的 多核苷酸，尤其是具有SEQ ID NO：19所列出的序列的多核苷酸作 为杂交探针。将标记的多核苷酸探针与固定在固体支持物(如硝化 纤维素滤膜或者尼龙膜)上的多核苷酸进行杂交的技术可以被用于 筛选基因组或者cDNA文库。类似地，可将探针与珠状物结合并与 靶序列杂交。可以利用已知的实验方案，如磁性分离来实现分离。 示例性的严格杂交和洗涤条件如上文所给出的。
可以通过所属领域中熟知的技术(如限制内切酶消化或低聚核 苷酸合成)来产生多核苷酸片断。
部分的多核苷酸序列可以在所属领域中已知的方法中用作探 针，从而鉴别样品中对应的全长多核苷酸序列。这样的方法包括基 于PCR的方法、5′RACE(Methods Enzymol.218：340-56(1993)； Sambrook et al.，Supra)和基于杂交的方法、基于计算机/数据库的 方法。可以使用诸如放射性同位素、荧光、化学发光和生物发光标 记物之类的可检测标记物以有助于检测。反向PCR也可以获得本文 所披露的多核苷酸序列旁侧的、开始于基于已知区域的引物的未知 序列(Triglia等，Nucleic Acids Res 16，8186，(1998))。该方法使用了 几种限制性内切酶从而产生基因的已知区域中的适合片断。该片断 然后通过分子内连接而被环化并被用作PCR的模板。从已知区域来 设计趋异引物(divergent primer)。为了物理装配全长克隆，可以使 用标准分子生物学方法(Sambrook et al.，Supra)。可以使本发明的 多核苷酸扩增的引物和引物对也形成了本发明的另一个方面。
变异体(包括直系同源)可以通过下述方法进行鉴别。变异体 多核苷酸可以利用基于PCR的方法来进行鉴别(Mullis等，Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser)。通常，可用于通过 PCR扩增的多核苷酸分子的变异的变异体的引物的多核苷酸序列 可以基于编码相应的氨基酸序列的保守区域的序列。
鉴别变异多核苷酸的其他方法包括使用所有的或者部分的特 定多核苷酸作为杂交探针从而筛选上述的基因组或者cDNA文库。 一般可以使用基于编码相应的氨基酸序列的保守区域的序列的探 针。杂交条件的严格性也可以低于筛选与探针一致的序列时所用的 条件。
变异体序列，包括多核苷酸变异体和多肽变异体，也可以通过 以上述的基于计算机的方法来进行鉴别。
一组相关序列的多序列比对可以用CLUSTALW(Thompson， 等，Nucleic Acids Research，22：4673-4680(1994)， http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或 T-COFFEE(Cedric Notredame et al.，J.Mol.Biol.302：205-217 (2000))或者使用渐进式、成对比对的PILEUP(Feng et al.，J.Mol. Evol.25，351(1987))来进行。
可用模式识别软件应用来发现基因座或标记序列。例如， MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)在一组序列中发现基因 座和标记序列，并且MAST(Motif Alignment and Search Tool)使 用这些基因座来鉴别检测序列(query sequence)中的相似或相同的 基因座。提供的MAST的结果是具有适当的统计数据和所发现的基 因座的视觉总览的一系列比对。MEME和MAST是由圣地亚哥的 加利福尼亚大学开发的。
PROSITE(Bairoch等，Nucleic Acids Res.22，3583(1994)； Hofmann et al.，Nucleic Acids Res.27，215(1999))是鉴定从基因组或 cDNA序列翻译的未表征蛋白质的功能的方法。PROSITE数据库 (www.expasy.org/prosite)包含生物重要模式和外形，并且被设计 用于可以与合适的计算工具一起使用从而为已知的蛋白质家族赋 予新的序列，或确定存在于序列中的一个或多个已知结构域 (Falquet et al.，Nucleic Acids Res.30，235(2002))。Prosearch是能够 搜索具有给定序列模式或标记的SWISS-PROT和EMBL数据库的 工具。
蛋白质可以根据它们的序列与同一基因组(旁系同源)或不同 基因组(直系同源)的其它蛋白质的相关性进行分类。直系同源基 因是由共同的祖先基因通过物种形成而发展进化的基因，并且通常 随着它们发展进化而保持相同的功能。旁系同源基因是在基因组中 被复制的基因以及可能获得了可能与原始基因相关的新的特异性 或修饰的功能的基因。Tatusov et al.，Science 278，631-637，1997中综 述了系统发育分析方法。
除了以上所描述的计算机/数据库方法，可以通过物理方法来鉴 别多肽变异体，例如以Sambrook等描述的重组DNA技术利用抗 本发明的多肽的抗体来筛选表达文库(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press， 1987)，或者通过这样的抗体的帮助从自然来源鉴别多肽。
可以使用所属领域中熟知的肽合成技术来制备多肽(包括变异 体多肽)，如使用固相技术的直接肽合成(例如，Merrifield，1963，in J.Am Chem.Soc.85，2149；Stewart et al.，1969，in Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，San Francisco California；Matteucci et al. J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191，1981)或自动合成，例如使用 Applied Biosystems(美国，加利福尼亚州)的合成仪(Synthesizer)。 也可以使用如合成的方法来产生多肽的突变形式，如Adelmen等； DNA 2，183(1983)所描述的编码氨基酸序列的DNA的位点特异 性突变。
优选将本文的多肽和变异体多肽分离。可以适用本领域中熟知 的各种技术从自然来源分离或纯化它们(例如，Deutscher，1990，Ed， Methods in Enzymology，Vol.182，Guide to Protein Purification)。该 技术包括HPLC、离子交换色谱法和免疫色谱法，但不限于这些。
可替代地，多肽和变异体多肽可以在合适的宿主细胞中被重组 表达并且如以下所讨论的被从该细胞分离。除了其他用处之外，该 多肽和变异体还用于产生抗体，以及产生配体。
本文所描述的基因构建体可以包括本发明所披露的多核苷酸 序列和/或编码所披露的多肽的多核苷酸序列中的一个或多个，并且 可以用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物。本发明的 基因构建体倾向于包括本文所限定的表达构建体。包括载体(如 pBR322、pUC18、pU19、Mp18、Mp19、ColE1、PCR1和pKRC)、 噬菌体(如λgt10)、和M13质粒(如pBR322、pACYC184、pT127、 RP4、p1J101、SV40和BPV)、黏粒、YACS，BACs穿梭载体(如 pSA3)、PAT28转位子(如US 5,792,294中所描述的)等。
该构建体可以方便地包括选择基因或者可选的标记物。一般使 用抗生素抗性标记物，如氨苄西林、甲氨蝶呤或四环素。
构建体中有用的启动子包括本领域中熟知的β-内酰胺酶、碱性 磷酸酶、色氨酸和tac启动子系统。酵母启动子包括3-磷酸甘油酸 激酶、烯醇酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖激酶和甘油醛-3- 磷酸脱氢酶，但不限于此。
也可以使用增强子作用于启动子上从而提高转录。合适在此处 使用的增强子包括SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、 球蛋白、白蛋白、胰岛素等。
产生和使用基因构建体和载体的方法在所属领域中是熟知的， 并且在Sambrook et al.，(supra)，以及Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing，1987中进行了简 要地描述。用载体转化所选择的宿主细胞也是已知的，例如，Cohen， SN；PNAS 69，2110，1972所描述的氯化钙处理。
包括所描述的基因构建体和载体的宿主细胞可以来自于原核 或者真核来源，例如酵母、细菌、真菌、昆虫(例如，杆状病毒)、 动物、哺乳动物或植物。在一种实施方式中，宿主细胞是分离的宿 主细胞。最常使用的做为宿主细胞的原核生物是大肠杆菌(E.coli)。 其他的原核宿主包括假单胞菌(Pseudomonas)、杆菌(Bacillus)、 沙雷氏菌(Serratia)、克氏杆菌(Klebsiella)、链霉菌(Streptomyces)、 李斯特菌(Listeria)、酵母菌(Saccharomyces)、沙门氏菌(Salmonella) 和分枝杆菌(Mycobacteria)，但不限于它们。
用于表达重组蛋白质的真核细胞包括，但不限于Vero细胞、 HeLa、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、293、BHK细胞、MDCK细胞 和COS细胞，以及前列腺癌细胞系，如PrEC、LNCaP、Du 145和 RWPE-2。可以从美国弗吉尼亚州的ATCC获得这些细胞。
与本发明的核酸分子表达相容的原核启动子包括已知技术构 建的启动子(如噬菌体λ的int启动子、和pBR322的β-内酰胺酶 基因序列的bla启动子)和可调控启动子(如lacZ、recA和gal)。 编码序列的核糖体结合位点上游也可能是表达所需要的。
包含基因构建体(如表达构建体)的宿主细胞在重组产生多肽 的方法中是有用的。这样的方法在所属领域中是熟知的(例如见 Sambrook等，supra)。该方法通常涉及宿主细胞在适合于或者有利 于本发明的多肽的表达或选择的适合培养基中进行培养。具有选择 标记的细胞也可以在适合于选择表达本发明多肽的宿主细胞的培 养基上生长。表达本发明多肽的转化的宿主细胞被选择出来，并在 适合于多肽表达的条件下对其进行培养。可以使用所属领域中公知 的方法来从培养基分离和纯化表达的重组多肽，包括硫酸铵沉淀、 离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、电泳等(例如，Deutscher，Ed， 1990，Methods in Enzymology，Vol 182，Guide to Protein Purification)。 宿主细胞在由本发明的表达多肽产生的产品的生产方法中也是有 用的。
另一方面，本发明提供了预测、诊断、或监测受试者的急性心 脏病症(ACD)的方法，该方法包括：测量在ACD发作或者临床 表现出ACD的两小时内从受试者获得的生物样品中的BNP-SP水 平；并且将所述的BNP-SP水平与对照的BNP-SP水平进行比较， 其中测量到的高于对照水平的BNP-SP水平是ACD的指征。
另一方面，本发明提供了监测对受试者的急性心脏病症(ACD) 的治疗的反应的方法，该方法包括测量在ACD发作或临床表现出 ACD的两小时内从受试者获得的生物样品中的BNP-SP水平；并且 将所述的BNP-SP水平与对照的BNP-SP水平进行比较，其中测量 到的BNP水平对于对照水平的变化是治疗反应的指征。
本领域中已知，BNP前体(如proBNP27-102、proBNP27-47) 可以被用于预测或诊断心脏移植排斥事件并将呼吸困难(呼吸短 促)的肺部原因和心血管原因相区别。参见US 2005/0244902。因 此，其同样可认为BNP-SP可用作基于心脏组织分析的心脏移植排 斥的早期标记，并且可以将肺病与急性心脏病症区别开来。
因此，本发明还提供了预测、诊断或监测受试者的心脏移植排 斥事件的方法，该方法包括测量心脏移植的两个小时内从受试者获 得的生物样品的BNP-SP水平，并且将所述的BNP-SP水平与对照 的BNP-SP水平进行比较，其中测量到的高于对照水平的BNP-SP 水平是移植排斥的指征。
本发明还提供了区别受试者的肺病和急性心脏病症(ACD)的 方法，该方法包括测量在表现出病症的两小时内从受试者获得的生 物样品中的BNP-SP水平；并将所述的BNP-SP水平与对照的 BNP-SP水平进行比较，其中测量到的高于对照水平的BNP-SP水 平是ACD的指征。
在一种实施方式中，本发明提供了预测、诊断或者监测受试者 的急性心脏病症(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺病的方法，该方 法包括测量在ACD、移植排斥或ACD/肺病发作或者临床表现出 ACD、移植排斥或ACD/肺病的最初的两小时内从受试者获得生物 样品中的BNP-SP水平。
优选地，将测量到的BNP-SP水平与对照的BNP-SP水平进行 比较，其中高于对照水平的BNP-SP水平是ACD或者移植排斥的 指征。
普通技术人员读者会理解，基于评价的目的，标记物必须与参 考值或对照值具有相关性。
本文中所使用的对照可以为个体或群体，从其中获得BNP-SP 样品并且确定平均BNP-SP水平。通常，该个体或群体会包括普通 的健康个体或者已知未患有ACD、心脏移植排斥或者ACD/肺病的 个体的群体。在多数个体中BNP-SP水平在0-15pmol/L之间，平 均的对照水平是大约10pmol/L。可替代地，可以基于之前测量的 个体或群体的多个读数来评定对照水平。对照水平的另一个实例是 心脏组织中的BNP-SP和BNP水平之间的比例式测量。可将受试者 的BNP-SP水平与对照群体的平均BNP-SP水平进行比较。心脏对 照群体中的BNP-SP水平可以比正常对照群体的BNP-SP水平高1.5 到3倍，通常为2到3倍或2.5到3倍。可替代地，对照可以是更 早期的来自同一受试者的读数或这样的读数的平均值。对于特定方 法确定合适的对照和对照水平在所属领域中是熟知的。
术语“在发作或临床表现的两小时内”的表述包括从在医疗机 构ACD、心脏移植排斥或者未诊确或疑似的ACD/肺病发作或者临 床表现出ACD、心脏移植排斥或者未诊确或疑似的ACD/肺病起1 分钟到120分钟并包括120分钟。优选地，在从发作或表现出的一 小时(从1分钟到60分钟并包括60分钟)内进行测量，优选在发 作或者表现出的5到45分钟内，优选15到40分钟，优选20到35 分钟，或者最优地是在25到30分钟内。
“高于”对照或者，对于对照的改变或偏离的水平优选是统计学 显著的。如果与对照水平相比，该水平与对照水平的差别达5％或 者更多，达10％或更多，优选达20％或更多，更加优选达50％或更 多，则可以认为存在相对于对照水平或平均对照水平的更高水平、 偏离或改变。或者可以计算统计学显著性为P≤0.05。在另外一种替 代方式中，可以借助于分析参考限或参考区间来确定更高的水平、 偏离和改变。这些可以从直觉评价或非参数方法来进行计算。总之， 这些方法将0.025和0.975分位数计算为0.025×(n+1)和0.975(n+1)。 这样的方法在所属领域中是熟知的23、24。存在对照中没有的标记也 被认为是更高的水平、偏离或改变。
应该理解测量样品中的BNP-SP水平的步骤是单个样品上的单 次测量，或在多个样品上的重复测量。因此，在发作或者临床表现 的最初两小时内，优选在一小时内的不同时间点取得的样品中，测 量可以包括BNP-SP的1到20次测量，优选1到10次，优选1到 5次，优选1到3次，优选1次或，优选2次或3次测量。在这两 小时之外，也可以进行单一或重复测量从而确定BNP-SP水平是否 已经降低到正常对照水平或心脏对照水平。
在一种优选的实施方式中，该方法包括测量在发作或表现的一 小时内所取的1个或2个样品中的BNP-SP水平，然后为在发作或 表现出或初次测量BNP-SP水平的2到4小时内，优选2到3小时 内，测量1个或2个样品中的BNP-SP水平。
如上所述，在发作或表现出的最初2小时内测量到的BNP-SP 水平通常比正常对照中测量到的BNP-SP水平高4到10倍，一般高 5到8倍。如上所述，特定范围4到9倍、4到8倍、4到7倍、4 到6倍、4到5倍、5到10倍、5到9倍、5到8倍、5到7倍、5 到6倍、6到10倍、6到9倍、6到8倍6到7倍、7到10倍、7 到9倍、7到8倍、8到10倍、8到9倍、以及9到10倍也包括在 这个范围内。
在另一种实施方式中，样品BNP-SP水平在20到300pmol/L 范围内，优选25到250pmol/L，优选30到180pmol/L，优选35 到150pmol/L，优选40到120pmol/L，优选40到90pmol/L，以及 优选45到80pmol/L是ACD、心脏移植排斥的指征，或者将ACD 与肺病区别开来。
如上所述，该范围还包括在例如20到180pmol/L、50到200 pmol/L、40到130pmol/L、50到100pmol/L、45到160pmol/L等 范围内的任意值。
生物样品可以为BNP-SP可以存在或分泌BNP-SP的任意生物 材料。其包括任何的组织或体液，例如血液、唾液、间质液、血清、 血浆、尿、心包液和脑脊液，但不限于此。优选地，该生物样品是 循环生物样品，例如血液、血清或血浆。在一种实施方式中，该生 物样品是心脏组织。
样品中标记物的存在和它们的表达水平可以基于本文所提供 的标记物序列，根据本领域中已知的方法来确定，如DNA印迹法、 RNA印记法、FISH或定量mRNA转录的定量PCR[(Thomas，Pro. NAH，Acad.Sci.USA 77：5201-5205 1980)，(Jain KK，Med Device Technol.2004年五月；15(4)：14-7)]、斑点印迹法、(DNA分析)或 使用合适的标记探针的原位杂交。
因此，本发明还提供了检测样品中的本发明的核酸分子的存在 的分析方法，该方法包括：
(a)使样品与在严格杂交条件下与该核酸序列杂交的多核苷 酸探针接触；以及
(b)检测样品中杂交复合物的存在。
优选该杂交探针是标记的探针。标记(label)的实例包括荧光、 化学发光、放射酶和生物素-亲和素标记。通过如上文所述那些本领 域已知的方法来标记该标记的探针和并使其可视化。
为了方便，可将核酸探针固定在固体支持物上，该固体支持物 包括树脂(例如聚丙烯酰胺)、碳水化合物(例如琼脂糖)、塑料(例 如聚碳酸酯)和乳胶微球。
如上文所讨论的，核酸分子探针可以优选为RNA、cDNA或 DNA分子。优选的探针包括SEQ ID NO：14、16、18、20和22。
严格杂交条件是如上文所讨论的。
核酸标记物的表达水平可以利用本领域已知的技术来确定，如 RT-PCR和包括SDS-PAGE的电泳技术。利用这些技术来扩增受试 者样品中的本发明核酸分子的DNA或cDNA序列，并且测量DNA 或cDNA或RNA水平。
在一种可替代的方法中，可以直接测量样品中的DNA或 cDNA或RNA水平而不进行扩增。
目前优选的方法是RNA印记杂交分析。RNA印记杂交分析中 使用的探针可以基于本文所确定的标记物序列来制备。探针优选包 括至少12、至少15、至少18、至少24、至少30、至少36，优选 至少42，优选至少51，优选至少60，优选至少70或更多的参考序 列的相邻核苷酸。
可替代地，可以利用反转录PCR(RT-PCR)分析使用特异于 该核酸序列的引物来测量表达水平。如果需要的话，可以参照对照 核酸分子来进行样品中标记物水平的比较，对照核酸分子的表达与 被测量的参数和条件无关。对照核酸分子是指在紊乱或移植排斥状 态和健康状态下，其水平没有差异的分子。对照分子水平可以被用 做比较群体中的标准化水平。这样的对照分子的一个实例是 GAP-DH。本发明的标记物的水平会随着病症改变而改变。
在一种实施方式中，测量的步骤包括检测BNP-SP与选择性结 合BNP-SP的结合剂或其片断或变异体之间的结合。优选地，该结 合剂与生物事件的其他标记物(更具体地是BNP和NT-BNP)之间 的交叉反应性较低。结合剂优选为抗体或其片断。
本发明还涉及这样的抗体，或抗体的片断。结合BNP-SP的抗 体或其片断或变异体可以是任何形式，包括所有类型的多克隆抗 体、单克隆抗体、单链抗体、人类抗体、人化抗体和由基因重组产 生的嵌合抗体。还包括通过用BNP-SP或其片断或变异体免疫动物 (如小鼠、大鼠或家兔)而获得的抗血清。
这里也可以使用抗体片断或经修饰的抗体，只要其结合 BNP-SP或其片断或变异体即可。抗体片断可以为Fab、F(ab′)、F(ab′)， 以及Fc或Fv片断或单链Fv(scFv)，其中通过合适的连接子将H 和L链的Fv片断连接起来(Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83(1988))。抗体的“Fc”部分表示免疫球蛋白重链的部分， 其包括一个或多个重链恒定区结构域；CH1、CH2和CH3，但是不 包括重链可变区。
制备抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane (1998)。11最常使用的抗体是通过免疫合适的宿主哺乳动物来产生 的。包括BNP-SP的融合蛋白质可以被用作免疫原。
可以通过与多种分子结合来修饰抗体，如聚乙二醇(PEG)。经 修饰的抗体可以通过化学修饰抗体来获得。这些修饰方法在本领域 中是常规使用的。
可替代地，抗体可以作为来自非人抗体的可变区和来自人类抗 体的恒定区之间的嵌合抗体，或者作为包括来自非人抗体的互补决 定区(CDR)、来自人类抗体的骨架区(FR)和恒定区的人化抗体 来获得。这样的抗体可以利用本领域已知的方法来制备。
简言之，制备多克隆抗体的方法对于普通技术人员来说是公知 的。多克隆抗体可以通过，例如一次或多次注射免疫剂和佐剂(如 果需要)而在哺乳动物中获得。通常，该免疫剂和/或佐剂通过多次 皮下注射或腹膜内注射而注入到哺乳动物体内。免疫剂可以包括 BNP-SP或其片断或变异体或它们的融合蛋白。将该免疫剂结合到 已知对要被免疫的哺乳动物的免疫原性蛋白上可能是有用的。这样 的免疫原性蛋白包括，但不限于钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋 白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant，FCA)和MPL TDM佐剂(单磷酸类脂质A、合 成的海藻糖二霉菌酸酯)。免疫试验方案可以由所属领域的普通技 术人员来选择而不需要过度实验。
可以利用所属领域中熟知的杂交瘤方法来制备单克隆抗体。参 见例如Kohler和Milstein，197512以及US 4,196,265。杂交瘤细胞可 以在合适的培养基中进行培养，可替代地，该杂交瘤细胞可以在体 内(如哺乳动物的腹水中)生长。优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤 细胞系，其可以从例如美国弗吉尼亚州的美国标准生物品收藏中心 (ATCC)获得。免疫测定可以被用于筛选分泌感兴趣的抗体的永 生化细胞系。BNP-SP或其片断或变异的序列可以用于筛选。
因此，本文中还关注能够分泌BNP-SP特异性单克隆抗体的永 生化细胞系的杂交瘤细胞。
确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性的公知方 法包括免疫沉淀反应、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析 法(ELISA)和蛋白质印迹法(Western blot)(Lutz et al.，Exp.Cell. Res.175：109-124(1988))。可以类似地从被免疫动物的样品筛选多克 隆抗体的存在。
为了方便检测，在这里可以用可检测到的标记物来标记抗体和 片断，如荧光、生物发光、和化学放光的化合物，以及放射性同位 素、磁珠和亲和性标记(例如，生物素和亲和素)。可以进行结合 的间接测量的标记的实例包括其底物可提供有色荧光产物的酶，合 适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙硫磷脱氢酶等。荧光 染料(例如，德克萨斯红、荧光素、藻胆蛋白和藻红蛋白)可以与 荧光激活细胞分类器一起使用。标记技术在所属领域中是熟知的。
可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序来从培养基或腹水分离 或纯化细胞分泌的单克隆抗体，如蛋白A琼脂糖凝胶法、羟磷灰石 色谱法、凝胶电泳法、透析法或亲和色谱法。
可以通过重组DNA法(参见例如美国专利第4,816,567号)来 产生单克隆抗体或片断。DNA修饰，例如用人重链和轻链恒定结 构域的编码序列代替同源鼠序列(上述美国专利第4,816,567号) 也是可能的。该抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法在所属 的领域中是熟知的。在本文中也可以考虑产生嵌合二价抗体。
本发明的抗体还可以包括人化抗体或人类抗体。人化抗体包括 人免疫球蛋白，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自 非人类的CDR所替代。来自非人类源(如兔、大鼠和小鼠)的人 化抗体的产生是熟知的。13、14、15
还可以利用各种本领域中已知的方法来产生人类抗体，包括噬 菌体展示文库16；和转基因法，参见例如Neuberger 199617和Vaughan 等，199818。
双特异性抗体也是有用的。这些抗体是对至少两种不同的抗原 具有结合特异性的单克隆抗体，优选是人类抗体或者人化抗体。例 如，BNP-SP或其变异体或片断，以及选自preproBNP、BNP、 CK-MB、TnT、TnI和肌红蛋白的抗原。本文也考虑具有多于两种 特异性的抗体，例如三特异性抗体。
制造双特异性抗体的方法是所属领域公知的。参见例如 Milstein和Cuello 198319、Suresh等，198620和Brennan等，198521。
被抗体选择性结合的BNP-SP是上文所讨论的BNP-SP或其抗 原变异体或片断。
理想的是，抗体结合BNP-SP的N末端或C末端。结合剂选择 性结合特异性抗原多肽的实例包括BNP-SP(1-10)SEQ ID NO：13、 BNP-SP(1-17)SEQ ID NO：15、BNP-SP(12-23)(SEQ ID NO.17)、 BNP-SP(17-26)SEQ ID NO：19和BNP-SP(1-26)SEQ ID NO.21。
可以通过所属领域中已知的方法来检测BNP-SP的结合，包括 特异性的(基于抗体)和非特异性的(如HPLC固相)。最常用的 是，使用如上文所提到的如ELISA或RIA的分析方法来检测本文 的抗体。单独使用竞争性结合测定、夹心测定法、非竞争性测定、 荧光免疫测定、免疫荧光测量测定法、或免疫放射测定、发光测定、 化学发光测定和质谱分析这样的表面增强的激光解吸离子化 (SELDI)、电喷射离子化(ESI)、基质辅助的激光解吸离子化 (MALDI)、傅里叶变换离子回旋加速器共振质谱分析(FTICR)， 或与非特异性结合剂(例如层析试剂)组合使用也是可行的。
方便地，可将抗体固定于固体基底以便于清洗和分离BNP-SP/ 抗体复络合物。可以通过本领域已知的技术将抗体结合于固体支持 物。参见例如《Handbook of Experimental Immunology》，第4版， Blackwell Scientific Publications，Oxford(1986)。可以用于抗体的固 体基底包括玻璃、尼龙、纸和塑料。类似地，可将BNP-SP吸附于 固体基底上，该固体基底例如是可选地被离子交换材料、反相材料 (例如C18涂层)或其他材料涂覆的或由它们衍生的吸附剂硅石、 或树脂颗粒、或二氧化硅片。该基底可以是珠状、片状、管状、条 状或生物芯片的形式。可设定位置和精确微量滴定度的生物芯片或 片材尤其有用。还优选使用多重系统，其中，含有指向多重分析物 的抗体的珠状物被用于测量单个样品中分析物的水平。待测量的分 析物可以包括心脏标记物(cardiac marker)以及BNP-SP或其变异 体和片段。本文中所使用的适合的多重微珠系统(multiplex bead system)是Luminex Flurokine Multianalyte Profiling系统。
抗体分析方法是本领域公知的，参见例如，US 5,221,685、US 5,310,687、US 5,480,792、US 5,525,524、US 5,679,526、US 5,824,799、 US 5,851,776、US 5,885,527、US 5,922,615、US 5,939,272、US 5,647,124、US 5,985,579、US 6,019,944、US 6113,855、US 6,143,576， 以及对于未标记分析的US 5,955,377，以及US 5,631,171还参见Zola， Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques ppl47-158(CRC Press，Inc 1987)、Harlow和Lane(1998)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Publications，New York，以及对于分析 形式和条件参见US 2005/0064511，所有上述参考文献的全文以引 用方式结合于本文作为参考。
免疫分析的分析物也是公知的，除了其他的之外，包括已经相 吸描述的Beckman Acess、Abbott AxSym，Roche ElecSys和Dade Behring Status系统。
能够直接或间接检测BNP-SP与抗体形成复合物的结合。直接 检测是利用标记进行的，例如荧光、发光、放射性核素、金属、染 料等。间接检测包括结合可检测的标记，例如地高辛或酶(例如辣 根过氧化物酶和碱性磷酸酶)，以形成标记的BNP-SP抗体，然后通 过加入检测试剂来实施检测标记的步骤。
辣根过氧化物酶例如可以与诸如邻苯二胺二盐酸盐 (o-Phenylenediamine Dihyhydrochloride(OPD))和过氧化物的底物 一起温育，以产生可测量吸光度的有色的产物，或与发光氨和过氧 化物一起给出能够在发光计中测量的化学发光，这是本领域公知 的。生物素和地高辛能够与结合剂反应，该结合剂与它们强力结合。 例如，蛋白质亲和素和抗生物素蛋白链菌素会与生物素强力结合。 然后，通过与蛋白质直接反应，或通过利用通常可用的交联剂(例 如MCS和碳二亚胺)，或通过加入螯合剂而将其他可测量的标记共 价结合或连接于蛋白质。
通常，通过例如离心将复合物从未复合(uncomplexed)的试 剂中分离。如果抗体是经标记的，则复合物的量会由检测到的标记 的量得到反映。可替代地，当抗体标记的BNP-SP与含未经标记的 BNP-SP生物样品一起温育时，可以通过结合于抗体而标记 BNP-SP，并通过测量结合的经标记的BNP-SP的减少而在竞争性分 析中检测BNP-SP。其他的免疫分析法可以用于夹心分析法的样品。
在一个实例中，在与抗体接触后，通常在4℃，持续18至25 小时过夜，或在25℃，持续1至2至4小时，将结合于结合剂的经 标记的BNP-SP从未结合的经标记的BNP-SP中分离。在溶液相测 试中，该分离可以随着结合于固相颗粒(例如纤维素或磁性材料) 的抗γ球蛋白抗体(二抗)的加入而进行。从不同物种中获得该二 抗以用于一抗并结合该一抗。从而所有的一抗经由二抗被结合于固 相。通过离心或磁吸引将这种复合物从溶液中除去并利用与其结合 的标记来测量结合的经标记的肽。从游离指示物分离结合物的其他 选择包括形成免疫复合物，其从溶液沉淀出来，通过聚乙烯二醇或 将游离的经标记的肽结合于木炭并通过离心或过滤将其从溶液中 除去来实现抗体的沉淀。分离的结合物或游离相中的指示物是通过 诸如上述的方法来测量的。
竞争性结合分析还可以被设置为固相分析，其早已实施并且相 对于上述方法而言是优选的。这种分析利用具有孔的板(通常称为 ELISA或免疫测定板)、固体微珠或管的表面。一抗吸附或共价结 合于该板、微珠或管的表面，或通过吸附于或共价结合于第二抗γ 球蛋白或抗Fc区抗体而间接结合。将样品和经标记的肽(如上所 述)一起加入或顺序加入到板中并在使抗体与样品中的BNP-SP和 经标记的肽竞争性结合的条件下进行温育。随后，可抽除未结合的 标记的肽并清洗板以除去附着在板上的抗体结合的标记的肽。然 后，利用上述技术测量该标记的肽。
由于特异性、速度以及测量较大范围的原因，更加优选夹心分 析。在这种类型的测定中，对于BNP-SP过量的一抗通过吸附、共 价结合、或抗Fc或γ球蛋白抗体而附着在ELISA板、微珠或管的 壁上，如上文所述用于固相竞争性结合分析。使样品液或提取物与 附着于该固相的抗体接触。由于该抗体过量，结合反应通常很迅速。 BNP-SP的二抗也与一抗同时或顺序温育。选择该二抗以结合于 BNP-SP的位点，该位点不同于一抗的结合位点。这两种抗体反应 导致产生BNP-SP的夹心，样品的BNP-SP被两种抗体加在中间。 二抗通常由如上所述用于竞争性结合分析的容易测量的化合物标 记。可替代地，可使特异性结合于该二抗的标记的三抗与样品接触。 在洗掉未标记的材料之后，可以测量结合物标记的抗体，并通过竞 争性结合分析指出的方法进行定量化。
也可以使用浸染测试法(dipstick assay)。这些测试是本领域公 知的。例如可以采用特异性抗体吸附的诸如金或有色的乳胶颗粒之 类的小颗粒。可将待测量的液态样品加入到预先载有颗粒的膜或纸 条的一端，并使其沿着膜或纸条迁移。结合于颗粒的样品中的抗原 改变了颗粒与捕获位点的结合能力，其含有诸如抗原或抗体的颗粒 的结合剂，进一步沿着膜或纸条迁移。着色颗粒在这些位点的蓄积 导致颜色的显现取决于样品中竞争性抗原的浓度。其他的浸染方法 也采用使抗体共价结合于试纸条或膜条，从而捕获样品中的抗原。 随后的反应采用结合于酶(例如辣根过氧化物酶)的二抗并与底物 一起温育以产生能够定量样品中抗原的颜色、荧光或化学光输出。
正如在以下的实施例中所探讨的，放射免疫分析法(RIA)是 一种目前优选的实验室技术。在一次RIA中，使放射标记的抗原和 未标记的抗原与抗体竞争性结合。常用的放射性标记物包括125I、 131I、3H和14C。
放射免疫分析法涉及BNP-SP与结合蛋白的特异性抗体和放射 标记的抗体的沉淀作用，其能够测量沉淀物中的经标记的抗体的 量，该量与样品中的BNP-SP的量成比例。可替代地，使用产生经 标记的BNP-SP和结合蛋白的未标记的抗体。经标记的BNP-SP的 减少与样品中的BNP-SP的量成比例。
在RIA中，从游离的BNP-SP中分离结合BNP-SP也是可行的。 这会涉及使BNP-SP/抗体复合物与二抗一起沉淀。例如，如果 BNP-SP抗体复合物含有兔抗体，则可以使用驴抗兔抗体来沉淀复 合物并计算标记的量。例如，在LKB中，Gammamaster计数器。 参见Hunt et al.，。12
本发明的方法进一步包括测量ACD、心脏移植排斥、或ACD/ 肺病的一种或多种非-BNP-SP标记物水平。可将其他的一种或多种 标记物水平与来自对照群体的平均对照水平进行比较。测量水平与 平均对照水平的偏差是ACD或心脏移植排斥的前兆或诊断特征。
尽管已经描述了本发明的方法与指征ACD或心脏移植排斥的 BNP-SP的高水平或水平增加有关，但在一些事件或病症中BNP-SP 的水平下降也是有可能的。本发明还测量低于对照水平的偏差。
这里特别地使用的其他标记物包括肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、 肌酸激酶MB、肌红蛋白、BNP、NT-BNP、LDH、天冬氨酸氨基转 移酶、H-FABP、内皮缩血管肽、肾上腺髓质素、凝乳酶和血管紧 张素II1。这些标记物在心脏机能障碍在均有涉及。使BNP-SP水平 与其他标记物相关联能够增加对BNP-SP值的预测、诊断或监测。
在ACD、心脏移植排斥或ACD/肺病的情况下，将BNP-SP标 记物水平与已知的心脏标记物相结合能够增加患者输出的预测或 诊断值。
利用单独的测试样品可将肽标记物的数目分析能够同时进行 或分开进行。优选同时进行两个或多个位点形式的测试。尤其采用 多重微珠、微量测定或生物芯片系统。微珠、测定或芯片具有许多 精确(discreet)、经常是可定位的位置，包括针对一种或多种标记 物(例如BNP-SP)的抗体。该一种或多种标记物包括一种以上的 BNP-SP标记物。例如，进行N-末端和C-末端的BNP-SP片段的测 试并简单测试结果组合是有用的。许多其他的这种标记物组合也是 可行的。US2005/0064511描述了用于本发明的芯片和技术。Luminex 提供了用于本发明的多重微珠系统。
当监测受试者时，可以随时间来采集生物学样品。系列采样使 得标记物水平发生改变，尤其是随之间而测量的BNP-SP水平。采 样可以提供接近于事件开始时间、事件严重程度的信息，相应于所 采用的治疗方案和长期的预测，其治疗方案可以使适合的。分析可 以在诸如救护车、医生办公室、诊所、住院期间、门诊、或定期健 康检查过程中进行。
本发明的方法还可以与一种或多种风险因素的分析组合实施， 该风险因素包括，但不限于，年龄、体重、性别和家族病史(例如 心脏病)。测试结果也可以用于与本发明的方法相结合。例如，ECG 结果和临床检查。BNP-SP循环水平的统计学显著增加、与一种或 多种其他的风险因素或测试结果可以被用于更精确地诊断或预测 受试着的病情。
本文的方法还可以用于指导治疗。例如，以什么样的治疗开始 以及何时进行治疗监测、阳性检测或治疗不良反应(例如抗有丝分 裂药物的心脏毒性)的检测，以及如果需要或当需要时根据结果调 整治疗方案。这可以改善患者的短期、中期和长期效果。对于指导 治疗，参见Troughton et al.8。
急性心脏病症
申请人已经示出了全长BNP-SP分子(1-26)的浓缩物及其各 种片段与急性心脏病症的关联。此外，在患者疑似为急性心肌梗塞 (AMI)的情况下在临床表现后BNP-SP水平达到最高。患者表现 急性心脏病症，并且尤其使进行心脏缺血可能会经历或不经历随后 的心肌梗塞(MI)。不表现MI的组不能利用目前的临床技术和标 记物进行简单诊断。因此，申请人第一次提出有用的早期和特异性 标记物，以用于与MI有关的心肌损伤。这可以允许进行由于不良 事件(AE)导致的心肌损伤的早期诊断并允许医生将这样的情况与 其他急性冠状动脉综合征以及导致胸痛的其他原因区分开。例如心 绞痛、胃肠疾病、肺部/胸膜病症等。这显著缩短了目前需经历的6 小时到12小时窗口期，以等待目前的心脏生物标记物(包括肌红 蛋白、CK-MB、TnT和TnI)水平评价。因此，可以尽早地实施更 为精确的诊断和治疗，以减少发病率和死亡率并得到更好的预后效 果。
本发明尤其用于监测对于心脏患者的再灌注治疗。再灌注治疗 通常包括经皮冠状介入(例如血管成形术)和/或药理学的治疗。药 理学治疗中通常采用用于血管成形术中的溶栓药。辅助疗法包括抗 凝血和抗血小板的治疗。在诊断后尽快使用再灌注治疗是最有效 的。加速诊断的BNP-SP测试允许迅速引入再灌注治疗。也可以通 过重复测试来监测治疗的有效性并适当调整治疗。对于再灌注治疗 的综述性讨论参见Braunwald et al.。1
心脏病
本发明的方法还可以用于诊断或预测受试者的心脏病。
申请人已经示出了患有进行心脏病的患者体内的BNP-SP水平 在心脏事件之后的6周仍然在升高。类似地，可预测患有心脏病或 具有同样风险的患者会表现出高于对照群体中的平均对照水平的 BNP-SP水平。除了BNP之外，申请人还示出了BNP-SP水平不受 群体年龄的影响。这表明BNP-SP作为一种心脏病的标记物具有广 泛的应用。
心脏移植排斥
本发明还可用于通过在利用BNP-SP测量的移植过程中或移植 后实施常规的活组织检查来监测心脏移植(通常是心脏的同种异体 移植)的排异反应。在心脏移植的两小时内测量BNP-SP水平相对 于对照水平的增加可以预测或诊断排异反应的发生。
本发明还提供了获得自在ACD、心脏移植排斥、或ACD/肺病 发作或临床表现出ACD、心脏移植排斥、或ACD/肺病的两小时内 从受试者获得的生物样品中的BNP-SP测试，该测试包括利用已知 方法检测和测量样品中的BNP-SP水平。优选地，该测试是体外测 试。这样的方法包括上述的所有已知分析技术和凝胶电泳技术、蛋 白质印迹法、气相色谱法、原子力显微镜、表面等离子体共振、质 谱法，但不限于此。
在测试的一种实施方式中，包括一种或多种结合于一种或多种 本发明的BNP-SP核酸序列的核酸序列。可以由嫩发明的序列来设 计较大范围的有义和反义探针和引物。利用上述的本领域中已知的 技术来确定BNP-SP序列的表达水平。该测试可以采用固相基底(例 如，美国专利第5,744,305所描述的“芯片”)或硝化纤维素膜。
由本文的BNP-SP标记物所表达的蛋白质也可用于测试，并且 将其结果与在正常对照样品中表达的相同蛋白质的表达水平相比 较。利用本领域中已知和本文中所讨论的技术来评价蛋白质的存在 和量。
优选利用BNP-SP与结合剂(例如本发明的抗体)的结合来检 测样品中BNP-SP的存在并测量所存在的结合BNP-SP的量。
如上所述，选择用于BNP-SP(包括变异及其片段)的抗体形 成了本发明的另一方面，并且可以通过上文所讨论的技术来制备该 抗体。该抗体可用于本发明的方法和测试中。
在另一方面，本发明提供了用于预测、诊断或监测急性心脏病 症(ACD)、心脏移植排斥或者ACD/肺病的包括本发明的BNP-SP 结合剂的试剂盒，其中该试剂盒用于与在ACD、心脏移植排斥或 ACD/肺病发作或者临床表现出ACD、心脏移植排斥或ACD/肺病的 两小时内从受试者获得的生物样品一起使用。
本发明还提供了预测、诊断或者监测急性心脏病症(ACD)的 包括本发明的结合剂的试剂盒，其中将该试剂盒校准以测量在0.1 pmol/L到500pmol/L，优选1pmol/L到400pmol/L，优选10pmol/L 到350pmol/L，优选20pmol/L到300pmol/L，优选25pmol/L到 250pmol/L，优选30pmol/L到180pmol/L，优选35pmol/L到150 pmol/L、优选40pmol/L到120pmol/L的范围内的BNP-SP水平。
可以根据本领域已知的技术来进行测试的校准，例如利用具有 已知BNP-SP水平的血液样品，或在测量过程中进行常规校准的一 系列校准。参见例如US 6,780,645。该试剂盒对于测量生物样品中 的BNP-SP水平是有用的。检测的试剂可以是互补于BNP-SP的寡 核苷酸序列或BNP-SP标记物的片段，或结合于由该标记物编码的 多肽的抗体。该试剂可以结合于上述固态基质或由将其结合于基质 的试剂所包封。该固态基质或基底可以是上文所述的微珠、板、管、 浸染条、试纸或生物芯片。
检测试剂包括清洗试剂和能够检测结合抗体(例如二抗)的试 剂，或能够与标记的抗体反应的试剂。
该试剂盒还方便地包括对照试剂(阳性和/或阴性试剂)和/或 用于检测和核酸或抗体的手段。试剂盒中还可以包括使用说明，例 如急性心脏病症(ACD)、心脏移植排斥或者ACD/肺病发作后或表 现出急性心脏病症(ACD)、心脏移植排斥或者ACD/肺病的两小时 内从受试者体内获取生物样品，测量该样品中的BNP-SP水平，与 对照水平进行比较并将结果于心脏状态相联系。通常，来自对照的 BNP-SP标记物水平的增加是ACD或心脏移植排斥、或ACD/肺病 的指征。
更通常地，如本领域公知的，将该试剂盒安排为用于本领域中 公知的测试，并且更通常地，用于PCR、RNA印迹杂交或DNA印 迹ELISA分析。
该试剂盒也可以包括一种或多种用于其他ACD或心脏移植排 斥、或ACD/肺病的标记物。在ACS的情况下，该其他标记物可以 包括肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌酸激酶MB、肌红蛋白、BNP、 NT-BNP、LDH、天冬氨酸氨基转移酶、H-FABP、内皮缩血管肽、 肾上腺髓质素、凝乳酶和血管紧张素II中的一种或多种。在一种实 施方式中，所有这些标记物都包括在试剂盒中。
该试剂盒可由一种或多种内含物组成，且还可以包括收集装 置，例如瓶、袋(例如静脉输液袋)、管形瓶、注射器和试管。至 少一个容器用来盛装对于预测、诊断或监测ACD(尤其是ACS)、 移植排斥、或ACD/肺病有效的产物。该产物通常是本发明的核酸 分子、多肽或结合剂、或包括它们的组合物。在一种优选的实施方 式中，说明书或标签、或与容器联合而指示了该组合物被用于预测、 诊断或监测ACD(尤其是ACS)、移植排斥、或ACD/肺病。其他 组件可以包括针头、稀释剂和缓冲液。通常，该试剂盒可以包括至 少一个包含药用缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水、林格式溶液和葡萄 糖溶液)的容器。
试剂盒中期望包括选择性结合BNP-SP的结合剂。优选地，该 结合剂是抗体。在分析和试剂盒中使用的该抗体可以是单克隆抗体 或多克隆抗体，并且可由上述任何哺乳动物来制备。该抗体优选针 对编码的天然肽来制备或由本发明的BNP-SP核酸序列、BNP-SP (1-26)、或基于其合成的肽来指征，或可以针对融合至编码本发明 的BNP-SP肽的核酸序列的外源性序列来产生。
在一种试剂盒的实施方式中，将BNP-SP检测试剂固定于固体 基质(例如多孔条)上，以形成至少一个BNP-SP检测位点。多孔 条的测量或检测区域可以包括多个检测位点，这样的检测文典含有 BNP-SP检测试剂。该位点可以呈条状、交叉或点状或其他安排。 测试条还可以含有用于阴性和/阳性对照的位点。可替代地，该对照 位点可以在不同的条上。不同的检测位点可以含有不同量的固定的 核酸或抗体，例如，在第一检测位点的量较大而在随后的检测位点 的量较小。加入测试生物样品后，显示了可检测信号的位点数目提 供了样品中存在的BNP-SP的量的定量指征。
该试剂盒还可以包括用于样品分析的装置，包括装有适当组分 (标记物、抗体和试剂)以实施样品测试的一次性测试药液筒。该 装置方便地包括测试区和测试结果窗口。免疫色谱法药筒是这样的 装置的实例。参见例如US 6,399,398、US 6,235,241和US 5,504,013。
可替代地，该装置可以是电子装置，允许输入、储存并针对对 照水平和其他标记物水平来评价测量到的标记物的水平。US 2006/0234315提供了这样的装置的实例。
在本说明书，参考文献被制成专利说明书、其他外部文件、或 其他信息资源，这通常是出于提供讨论本发明的特征的目的。除非 特别指出，所参考的这些外部文件不能被解释为接受这些文件；或 这样的信息资源，在任何管辖权区域内是现有技术，或形成本领域 普通知识的一部分。
现在将参考以下实施例以非限制性的方式举例说明本发明。
实施例1
方法
所有的人类试验均经过新西兰卫生部上南地区伦理委员会 (Upper South Regional Ethics Committee)的批准，并且根据《赫尔 辛基宣言》实施。
化学
合成的人BNP信号肽BNP-SP(1-10)、BNP-SP(17-26)和BNP- SP(1-26)(SEQ ID NO：1)是由Mimotopes(澳大利亚)来合成的。所 有的缓冲试剂购自BDH和/或Sigma。BNP-SP(17-26)由C-末端用 半胱氨酸延伸而合成以用于方向性载体(directional carrier)结合。 BNP-SP(17-26)也可以用酪氨酰残基延伸而合成以用于在同样的肽 上进行示踪剂制备。
人类研究
对健康志愿者进行参考范围研究，在前晚禁食后从13位健康 志愿者(6位女性，平均年龄43±12岁(年龄范围为22-60岁)，BMI 24.4±3.9kg/m2)体内获得血液样品。
为了分析进行性心脏损伤中的BNP-SP浓度，我们研究了10 位在Christchurch医院的冠心病监护室(Coronary Care Unit)住院 的连续患者(4位女性，平均年龄70±8岁(年龄59-79岁))在胸 痛发作或有明显的ST-升高的急性MI症状的6小时内，BNP-SP浓 度随血浆肌钙蛋白T(TnT)升高之后又下降。不包括患有心源性 休克的患者。五位患者之前就患有高血脂症，四位患有高血压、一 位患有早期MI，一位正在接受心肌衰竭治疗，以及两位患有糖尿 病。入院时的治疗方法是给予利尿剂(两位患者)、血管紧张素转 换酶抑制剂(两位患者)、阿司匹林(两位患者)、β-阻滞剂(两位 患者)。一位患者已经接受经皮穿刺冠状动脉成形术(对于前壁MI 的PTCA)，九位患者接受溶栓治疗。七位患者在住院期间具有ECG。 对于所有的患者，平均射血分数为54％(范围为24-75％)。平均住 院期为6.6天(范围为3-15天)。胸痛发作和静脉样品基线图(时 间0)之间的时间间隔为3.9±0.3h。将18-口径(gauge)的静脉套 管插入到前臂静脉中以用于血液采样。在入院时抽取静脉样品(10 ml)到冠心病监护室(时间0)并随后对于住院患者在0.5、1、4、 8、12、24和72h，对于门诊患者在1、6和12周抽取静脉样品。 将样品置于管中置于冰上并在2700g下于+4℃冷藏5分钟，在用 于分析之前将血浆储存于-80℃。
血浆提取
在SepPak净水器(SepPak manufacturer waters，前述的美国药 筒22)上提取所有的血浆样品，干燥并在RIA和HPLC之前存于 -20℃。
激素浓度分析
根据标准的制造商试验方案(Roche Diagnostics)，利用异相免 疫测定在Elecsys 2010上利用钌标记的生物素基化抗体对血浆样品 进行TnT、CK-MB和肌红蛋白测试。18利用我们前文所述的测定方 法来测量免疫反应(IR)的BNP和N-BNP浓度。6-8利用以下的特 异性RIA来测量BNP-SP：
BNP-SP RIA
对于推定的人BNP-SP IR肽的测量，我们提出了一种针对 preproBNP(1-26)信号序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸17-26的新型的且 特异性的RIA。
抗体世代(Antibody generation)
通过一般的在室温下混合将preproBNPCys25(17-26)结合于马 来酰亚胺(malemide)处理的N-e-马来酰己酰氧基琥珀酰亚胺酯 (N-e-maleimidocaproyloxy succinimide ester，EMCS)衍生化的PBS (pH 7.0)中的BSA。用弗氏佐剂将结合的肽乳化并每隔一个月皮 下注射到2只新西兰白兔身体的4-5处。在注射12天后将兔放血以 评价抗体滴度，直至达到足够的水平。对于RIA，利用抗血清在最 终稀释1∶6,000时确定BNP-SP IR。这种抗血清不具有可用人 proBNP(1-13)、proBNP(1-76)、proANP(1-30)、ANP、BNP、内皮缩 血管肽1、血管紧张素II、尾加压素II、CNP、proCNP(1-15)、肾上 腺髓质素、优洛可定I和优洛可定II(全部＜0.01％)来检测的交叉 反应性。
碘化作用和测定方法
通过氯胺T方法将preproBNP Tyr25(17-26)碘化并如上文所述 在反相HPLC上进行纯化。所有的样品、标准样品、放射性示踪剂 和抗血清溶液在基于钾的测试缓冲液中进行稀释。22测试温育由100 μL样品或标准样品(0-640pmol)人preproBNP(17-26)与100μL经 涡流(vortex)并在4℃温育24小时的抗血清混合而构成。然后加 入100μL示踪剂(4000-5000cpm)并继续在4℃温育24小时。最 后通过固相二抗方法(驴抗兔Sac-Cel)来分离游离的和结合的免 疫反应性，并在Gammamaster计数器(LKB，Uppsala，瑞典)上计 数。
高效液相色谱(HPLC)
利用同样的条件(60％乙腈/0.1三氟乙酸的(TFA)，流速为 0.25/ml/分钟)使血浆提取物在室温下在TSK-GeI G2000SW肽柱 (Toyosoda，东京，日本)上经受尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)。每 隔一分钟收集流分并使其经受BNP-SP RIA。用葡聚糖蓝(Vo)、细 胞色素C(～Mr 12,400)、大鼠BNP45(～Mr 5,000)、血管紧张素 II(～Mr 1,045)和甘氨酸(Vt)来校准SE-HPLC柱，然后在Brownlee C18反相HPLC(RP-HPLC)柱(Applied Biosystems，CA)上用线性 洗脱梯度从12％-48％乙腈/0.1％TFA，以1ml/分钟的流速在40分钟 内进一步表征由SE-HPLC/RIA确定的BNP-SP RIA。每一分钟收集 流分，在空气流下干燥并使其经受关于SE-HPLC特异性的RIA。 利用合成的preproBNP(17-26)来校准RP-HPLC。
统计分析
结果表示为平均±SEM。利用双向ANOVA来分析时程 (time-course)数据来进行测试，该双向ANOVA用于在最小显著 差数后重复进行测量。利用一般线性回归模型来实施血浆激素浓度 的相关分析。在所有的分析中，P-值＜0.05被认为是显著的。
结果
为了确定人类循环中是否存在衍生自BNP的SP的26个氨基 酸或片段，我们开发了一种针对preproBNP(1-26)(BNP-SP，图2)的 残基17-26的特异性的放射免疫分析法(RIA)。血浆提取物的稀释 表明与标准曲线的平行性(图3)以及健康人体内的BNP-SP浓度 为9.6±2.2pmol/L(n＝13)。在健康人体内，血液中的BNP-SP IR浓 度未表现出与年龄的显著相关性(图4)。然而，当血浆BNP-SP水 平与其同胞肽BNP和N-BNP相类似时，它们与其他的肽没有相关 性(图5)。
通过反相(RP)和尺寸排阻(SE)高效液相色谱(HPLC)进 行IR血浆BNP-SP的生物化学检查表明我们的特异性RIA检测一 个或多个用大约Mr 1,000-2,000在SE-HPLC上洗脱的BNP-SP片 段，并接近于合成Mr 1,000-2,000在SE-HPLC在RP-HPLC上的洗 脱时间(图6)。
已经确定，IR BNP-SP肽存在于人类血浆中，我们测量了患有 AMI(n＝10，图7)的患者体内的系列IR BNP-SP浓度。在入院时 观察到IR BNP-SP的最高浓度并在6周内缓慢下降至稳定水平。重 要的是，平均峰值水平比正常健康志愿者高7倍(范围为4-12倍)， 并在6周内保持高3倍。这种图形的位置与直到入院后24小时才 出现峰值水平的BNP和N-BNP相对(图7)。肌红蛋白的峰值浓度 出现在入院后1-2小时，而在入院后8-12小时后也不会出现TnT 和CK-MB峰值水平。
实施例2
为32位临床上稳定的疑似ACS患者插入导管并从多个器官处 获取血液样品：这些器官为股动脉(FA)、肝静脉(HV)，下腔静 脉(IVC)、心脏冠状窦静脉(CS)和肺动脉(PA)。将血液收集于 冰冻的EDTA管中，通过离心由血浆制备并将该血浆加入至BNP-SP RIA。图9清楚地示出了BNP-SP浓度的最高处为CS、静脉引流心 脏，尤其是心室。这有力地证明了心脏是BNP-SP分泌的主要部位， 并且与已知的BNP基因表达图谱一致，在心脏中是最高的。
结论
临床稳定的患者体内的循环BNP-SP浓度是心源性的。显著的 心脏分泌与作为心脏激素的BNP-SP相一致。
讨论
这个证据首次证明了在患者表现ACD的两小时内或ACD发作 两小时内在循环和胞外空间中存在preproBNP信号肽。我们示出了 第一种实例，即血液中的BNP-SP测量可能是急性心肌缺血和/或随 后的损伤的快速生物标记物，以及第二种实例，即在具备作为长期 预测和结果的标记物可能优点的事件之后进行BNP-SP测量。
本领域技术人员当然可以理解，上文的描述是以举例的方式提 供的且本发明不限于此。
参考文献：
1.Braunwald E，Zipes DP，Libby P.Acute myocardial infarction Chp.35 Heart disease：a textbook of cardiovascular medicine，6th ed.2001.pgs.1114-1231.
2.Richards AM，Nicholls MG，Yandle TG，Frampton C，Espiner EA，Turner JG， Buttimore RC，Lainchbury JG，Elliott JM，Ikram H，Crozier IG，Smyth DW.Plasma N-terminal pro-brain natriuretic peptide and adrenomedullin：new neurohormonal predictors of left ventricular function and prognosis after myocardial infarction. Circulation 1998 97：1921-1929.
3.Jernberg T，Stridsberg M，Venge P，Lindahl B.N-terminal pro Brain Natriuretic Peptide on admission for early risk stratification of patients with chest pain and no ST-segment elevation.J.Am.Coll.Cardiology 2002 40：437-445.
4.Omland T，Persson A，Ng L，O′Brien R，Karlsson T，Herlitz J，Hartford M， Caidahl K.N-terminal pro-B-type natriuretic peptide and long-tern mortality in acute coronary syndromes.Circulation.2002 106：2913-2918.
5.Pemberton CJ，Johnson ML，Yandle TG，Espiner EA.Deconvolution Analysis of the Secretion and Elimination of Cardiac Natriuretic Peptides During Acute Volume Overload.Hypertension 2000；36：355-359.
6.Richards AM，Nicholls MG，Troughton RW，Lainchbury JG，Elliott J， Frampton C，Espiner EA，Crozier IG，Yandle TG，Turner J.Antecedent hypertension and heart failure after myocardial infarction.J.Am.Coll.Cardiology.2002 39：1182- 1188.
7.Troughton RW，Prior DL，Pereira JJ，Martin M，Fogarty A，Morehead A， Yandle TG，Richards AM，Starling RC，Young JB，Thomas JD，Klein AL.Plasma B- type natriuretic peptide leveks in systolic heart failure：importance of left ventricular diastolic function and right ventricular systolic function.JAm Coll Cardiol.2004 43：416-422.
8.Troughton RW，Frampton CM，Yandle TG，Espiner EA，Nicholls MG，Richards AM.Treatment of heart failure guided by plasma amino-terminal brain natriuretic peptide (N-BNP)concentrations.Lancet 2000 355：1126.1130.
9.Multiple Sequence Alignment with the Clustal series of programs Nucleic Acids Res(2003)31(13)：3497-500.
10.Bowie，J.U et al.，(1990).Decipeing the message in Protein Sequences： Tolerance to Amino Acid Substitutions.Science 247，1306-1310.
11.Harbour and Lane 1998.Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Press New York.27
12.Kohler and Milstein 1975.continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specficity.Nature，256，495-497.
13.Verhoeycn M.C Milstein，and G Winter Reshaping human antibodies： grafting an antilysozyme activity.Science 1988 Mar 25；239(4847)：1534-6.
14.Jones，P.T.，Dear，P.H.，Foote，J.，Neuberger，M.S.and Winter，G.″Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse.″Nature(1986)321：522-525.
15.Riechmann L，Clark M，Waldmann H，Winter G.Reshaping human antibodies for therapy.Nature.1988 Mar 24；332(6162)：323-7.
16.Hoogenboom HR，Winter G(1992)Human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro.J Mol Biol.1992 Sep 20；227(2)：381-8.
17.Michael Neuberger(1996)Generating high-avidity human Mabs in mice Nature Biotechnology 14，826
18.Tristan J.Vaughan，Jane K.Osbourn & Philip R.Tempest(1998)Human antibodies by design.Nature Biotechnology 16，535-539
19.Milstein and Cuello(1983)The co-expression of two immunoglobulin heavy- chain/light-chain pairs，where the two heavy chains have different specificities， Nature，305：537-539.
20.Suresh，M.R.，Cuello，A.C.and Milstein，C.(1986)Bi-specific monoclonal antibodies from hybrid hybridomas.Methods in Enzymoiogy，121：210-228..
21.Brennan et al.，“Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments”Science 229：81-83 (1985).
22.Hunt PJ，Richards AM，Nicholls MG，Yandle TG，Doughty RN，Espiner EA. Immunoreactive amino terminal pro brain natriuretic peptide(NT-proBNP)：a new marker of cardiac impairment.Clin.Endocrinol.1997 47：287-296.
23.The Immunoassay Handbook.3rd edition，ed.David Wild.Elsevier Ltd，2005.
24.Solber H.Approved recommendation(1987)on the theory of reference values. Part 5.Statistical treatment of collected reference values.Determination of reference limits.Journal of clinical Chemistry and Cilinical Biochemistry 1987 25：645-656.
25.Braud VM，Allan DS，O′Callaghan CA，Soderstrom K，D′Andrea A，Ogg GS， Lazetic S，Young NT，Bell JI，Phillips JH，Lanier LL，Mc Michael AJ.HLA-E binds to natural killer cell receptors CD94/NKG2A，B and C.Nature 1998 391：795-799.
以上列出的所有参考文献和引用以及包括专利申请文件全文 的说明书以其全文结合于本文。
序列表
<110>奥塔哥大学
<120>生物标记物
<130>P24866DMS
<140>PCT/NZ2007/000265
<141>2007-9-7
<150>US 60/842,649
<151>2006-9-7
<160>24
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>134
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NP_002512
<309>2006-08-20
<313>(1)..(134)
<400>1
Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro
            20                  25                  30
Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn
        35                  40                  45
His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu
    50                  55                  60
Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg
65                  70                  75                  80
Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr
                85                  90                  95
Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys
        115                 120                 125
Lys Val Leu Arg Arg His
    130
<210>2
<211>708
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NM_002521
<309>2006-08-20
<313>(1)..(708)
<400>2
ccccgcaggc tgagggcagg tgggaagcaa acccggacgc atcgcagcag cagcagcagc     60
agcagaagca gcagcagcag cctccgcagt ccctccagag acatggatcc ccagacagca    120
ccttcccggg cgctcctgct cctgctcttc ttgcatctgg ctttcctggg aggtcgttcc    180
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<210>3
<211>121
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
<300>
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<309>2005-11-06
<313>(1)..(121)
<400>3
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            20                  25                  30
Ser Gln Ser Pro Glu Gln Ser Thr Met Gln Lys Leu Leu Glu Leu Tle
        35                  40                  45
Arg Glu Lys Ser Glu Glu Met Ala Gln Arg Gln Leu Ser Lys Asp Gln
    50                  55                  60
Gly Pro Thr Lys Glu Leu Leu Lys Arg Val Leu Arg Ser Gln Asp Ser
65                  70                  75                  80
Ala Phe Arg Ile Gln Glu Arg Leu Arg Asn Ser Lys Met Ala His Ser
                85                  90                  95
Ser Ser Cys Phe Gly Gln Leu Ile Asp Arg Ile Gly Ala Val Ser Arg
            100                 105                 110
Leu Gly Cys Asp Gly Leu Arg Leu Phe
        115                 120
<210>4
<211>628
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<300>
<308>NM_031545
<309>2005-11-06
<313>(1)..(628)
<400>4
gcgagacaag agagagcagg acaccatcgc agctgcctgg cccatcactt ctgcagcatg     60
gatctccaga aggtgctgcc ccagatgatt ctgctcctgc ttttccttaa tctgtcgccg    120
ctgggaggtc actcccatcc cctgggaagt cctagccagt ctccagaaca atccacgatg    180
cagaagctgc tggagctgat aagagaaaag tcagaggaaa tggctcagag acagctctca    240
aaggaccaag gccctacaaa agaacttcta aaaagagtcc ttaggtctca agacagcgcc    300
ttccggatcc aggagagact tcgaaattcc aagatggcac atagttcaag ctgctttggg    360
cagaagatag accggatcgg cgcagtcagt cgcttgggct gtgacgggct gaggttgttt    420
taggaagacc tcctggctgc agactccggc ttctgactct gcctgcggct cttctttccc    480
cagctctggg accacctctc aagtgatcct gtttatttat ttgtttattt atttattttt    540
atgttgctga ttttctacaa gactgtttct tatcttccag cacaaacttg ccacagtgta    600
ataaacatag cctatttctt gcttttgg                                       628
<210>5
<211>129
<212>PRT
<213>Ovis aries
<300>
<308>AAB92565
<309>2001-02-05
<313>(1)..(129)
<400>5
Met Asp Pro Gln Lys Ala Leu Ser Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu His Leu Ser Leu Leu Gly Cys Arg Ser His Pro Leu Gly Gly Pro
            20                  25                  30
Gly Ser Ala Ser Glu Leu Pro Gly Leu Gln Glu Leu Leu Asp Arg Leu
        35                  40                  45
Arg Asp Arg Val Ser Glu Leu Gln Ala Glu Gln Leu Arg Val Glu Pro
    50                  55                  60
Leu Gln Gln Gly Gln Gly Leu Glu Glu Thr Trp Asp Ser Pro Ala Ala
65                  70                  75                  80
Ala Pro Ala Gly Phe Leu Gly Pro His His Ser Leu Leu Gln Ala Leu
                85                  90                  95
Arg Gly Pro Lys Met Met Arg Asp Ser Gly Cys Phe Gly Arg Arg Leu
            100                 105                 110
Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gly Leu Gly Cys Asn Val Leu Arg Arg
        115                 120                 125
Tyr
<210>6
<211>2125
<212>DNA
<213>ovis aries
<300>
<308>AF037466
<309>2001-01-02
<313>(1)..(2125)
<400>6
gcttgtcttt ctggcaacac cggagttgag gagagcaaga actcttgcgt tggtggctca      60
gcgtgatcag aaccacggac agcggtcagc gcgcccgagg gaccggcggt ctggcgcagg     120
gcagagttgc aggcttgcgc tcttccaggc ggggtgccga gttccaggcg gggagggaag     180
acgcgctgca gtgatggggt gttggctggg gctgttcttt gtgagtcacc tcgtgcgccc     240
ggcatttgcg tcgagtctct gatcgctggg gttctctctt ctcaattcag gaatgggggt     300
ggggaggaaa gaaaaaaatc cacgctaatg cccccggcgg ttttgcagga aaggaagcag     360
agagagagac gaaaggctat tggtgtctac ccctccctgc ctacgccccc actcccgcac     420
cccacccctc caaacccccc cgccccccac cccgggcgcg cgttccagct cccggtcagg     480
cccatttcta tacaaggcct gctctcccca gcctccaccc cctcggcgcg gagaggtgca     540
ttcccccgcc ctgagctcag cgggtcgggc cggaatgcgg ccgataaatc agagataacc     600
cagagaggca gggccggccc agctcccagg accagggata aaaggcctct gttgcccaag     660
gatccgggag agcgcccacc gggcactaga aggtgagacg tgaggcgcaa cccagcgaag     720
cagccgcggc cgcaacccag gaccagggat aaaaggcctc tgttgcccaa ggatccggga     780
gagcgcccac cgggcactag aaggtgagac gtgaggcgca acccagcgaa gcagccgcgg     840
ccgcaacctc catccgctcc gccagcgaca tggaccccca gaaggcgctg tcccgaacgc     900
tcctgcttct cctcttcttg cacctgtcgc tgctaggatg tcgttcccac ccgctgggtg     960
gccccggctc ggcttcggaa ctgcctgggt tacaggtgag cgctgctgaa ctgcgtaaac    1020
ccggttcgcc aagagggcgc ggacagcagc agttagcggg tccccatccc ccgaccctcc    1080
actcacatcc caagaggtcc ccaccctccc ttgggaatta gtgataccag aatcagaaag    1140
ggaattagaa catggagaga ctgggtgcgg gaagccggta cccagcgcgg ttggatcgct    1200
ttgccgccgt cgagggtggc tgggcccaag gtgcgggttt ctgaagatgc ggctccccta    1260
ccgtgcattg caggagctgt tggaccgtct acgagacagg gtctcggagc tgcaggcgga    1320
gcagctgcgc gtggagcccc tccagcaggg ccagggcctg gaagaaacct gggactcccc    1380
ggcggcagcc cccgcggggt tccttgggcc ccaccacagc ctcctccagg ccctgcgggg    1440
ccccaagatg atgcgcgact cgggctgctt tggacggagg ctggaccgga tcggctccct    1500
cagtggcctg ggctgcaacg gtgagcgcct atccgcattc ccactgcaca tcaccattag    1560
agccacttct gggtccgatg tctcagggga ccaaattttg aacaaagaac atcactcttc    1620
tttgctggca gtcctcaggg ccaaggcatg cctctctggg aatattaaat ttggacaaca    1680
ttcattatca tgtctgggag ccccttctat ccacctcctg cctctgactg aaaggggcag    1740
aatctttagg atgtaattca gtcactgttc agcaggccct ccttggagc aaaaagaatag    1800
ttaacatttt tcctcctggt ttcccctgaa ctgtctaaag ctgcaaaggc agaggggggg    1860
gtcaccaggg ggatggtaat ccctggttta caaggaggat ggggaggtcc ggggagatgg    1920
gttattccaa agccccaaac atgcagatga actgaagagg ggggtggcag gggtggcaca    1980
gggtgaggga aagctcagat ccttcctgtc tcccacccca aagtcatcat caccctctct    2040
tttcccccca cagtgctgag gaggtactaa gaggaggtcc tggctgcaga tatggctgca    2100
tctgattctc catcaactcc tgatc                                          2125
<210>7
<211>131
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<300>
<308>NP_999011
<309>2005-04-16
<313>(1)..(131)
<400>7
Met Gly Pro Arg Met Ala Leu Pro Arg Val Leu Leu Leu Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
His Leu Leu Leu Leu Gly Cys Arg Ser Tyr Pro Leu Gly Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Leu Ala Ser Glu Leu Pro Gly Ile Gln Glu Leu Leu Asp Arg Leu Arg
        35                  40                  45
Asp Arg Val Ser Glu Leu Gln Ala Glu Arg Thr Asp Leu Glu Pro Leu
    50                  55                  60
Arg Gln Asp Arg Gly Leu Thr Glu Ala Trp Glu Ala Arg Glu Ala Ala
65                  70                  75                  80
Pro Thr Gly Val Leu Gly Pro Arg Ser Ser Ile Phe Gln Val Leu Arg
                85                  90                  95
Gly Ile Arg Ser Pro Lys Thr Met Arg Asp Ser Gly Cys Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Arg Leu Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gly Leu Gly Cys Asn Val Leu
        115                 120                 125
Arg Arg Tyr
    130
<210>8
<211>670
<212>DNA
<213>Sus scrofa
<300>
<308>NM_213846
<309>2005-04-16
<313>(1)..(670)
<400>8
caggctgcta ggaagtgaaa agtgaacctg gacccagctc agcggcagca gcagcggcag     60
caggcagcag cctctatcct ctcctccagc cacatgggcc cccggatggc gcttccccgc    120
gtgctcctgc tcctgttctt gcacctgttg ctgctaggat gccgttccta tccactgggt    180
ggcgctggcc tggcctcaga actgccaggg atacaggagc tgctggaccg cctgcgagac    240
agggtctccg agctgcaggc ggagcggacg gacctggagc ccctccggca ggaccgtggc    300
ctcacagaag cctgggaggc gagggaagca gcccccacgg gggttcttgg gccccgcagt    360
agcatcttcc aagtcctccg gggaatacgc agccccaaga cgatgcgtga ctctggctgc    420
tttgggcgga ggctggaccg gatcggctcc ctcagcggcc tgggctgcaa tgtgctcagg    480
aggtactgag aagtcctggc tgacaacctc tgtgtccgct tctccaacgc ccctcccctg    540
ctccccttca aagcaactcc tgtttttatt tatgtattta tttatttatt tatttggtgg    600
ttgtatataa gacggttctt atttgtgagc acattttttc catggtgaaa taaagtcaac    660
attagagctc                                                           670
<210>9
<211>121
<212>PRT
<213>Mus musculus
<300>
<308>NP_032752
<309>2006-08-06
<313>(1)..(121)
<400>9
Met Asp Leu Leu Lys Val Leu Ser Gln Met Ile Leu Phe Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu Tyr Leu Ser Pro Leu Gly Gly His Ser Tyr Pro Leu Gly Ser Pro
            20                  25                  30
Ser Gln Ser Pro Glu Gln Phe Lys Met Gln Lys Leu Leu Glu Leu Ile
        35                  40                  45
Arg Glu Lys Ser Glu Glu Met Ala Gln Arg Gln Leu Leu Lys Asp Gln
    50                  55                  60
Gly Leu Thr Lys Glu His Pro Lys Arg Val Leu Arg Ser Gln Gly Ser
65                  70                  75                  80
Thr Leu Arg Val Gln Gln Arg Pro Gln Asn Ser Lys Val Thr His Ile
                85                  90                  95
Ser Ser Cys Phe Gly His Lys Ile Asp Arg Ile Gly Ser Val Ser Arg
            100                 105                 110
Leu Gly Cys Asn Ala Leu Lys Leu Leu
        115                 120
<210>10
<211>667
<212>DNA
<213>Mus musculus
<300>
<308>NM_008726
<309>2006-08-06
<313>(1)..(667)
<400>10
cgaccaccag tgcacaagct gcttggggag gcgagacaag ggagaacacg gcatcattgc     60
ctggcccatc gcttctgcgg catggatctc ctgaaggtgc tgtcccagat gattctgttt    120
ctgcttttcc tttatctgtc accgctggga ggtcactcct atcctctggg aagtcctagc    180
cagtctccag agcaattcaa gatgcagaag ctgctggagc tgataagaga aaagtcggag    240
gaaatggccc agagacagct cttgaaggac caaggcctca caaaagaaca cccaaaaaga    300
gtccttcggt ctcaaggcag caccctccgg gtccagcaga gacctcaaaa ttccaaggtg    360
acacatatct caagctgctt tgggcacaag atagaccgga tcggatccgt cagtcgtttg    420
ggctgtaacg cactgaagtt gttgtaggaa gacctcctgg ctgcaggaga ctccagtttc    480
tgactctgcc tgggtctctt tccccagctc tgggaccacc tttgaagtga tcctatttat    540
ttatttattt atatttattt ttatttttat tttttaattt attttgttgt ttttctacaa    600
gactgtttct tatcttggag cacaaacttg ccacaacata ataaacatag cgtatttcct    660
gcttttg                                                              667
<210>11
<211>140
<212>PRT
<213>Canis familiaris
<300>
<308>P16859
<309>2006-05-02
<313>(1)..(140)
<400>11
Met Glu Pro Cys Ala Ala Leu Pro Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu His Leu Ser Pro Leu Gly Gly Arg Pro His Pro Leu Gly Gly Arg
            20                  25                  30
Ser Pro Ala Ser Glu Ala Ser Glu Ala Ser Glu Ala Ser Gly Leu Trp
        35                  40                  45
Ala Val Gln Glu Leu Leu Gly Arg Leu Lys Asp Ala Val Ser Glu Leu
    50                  55                  60
Gln Ala Glu Gln Leu Ala Leu Glu Pro Leu His Arg Ser His Ser Pro
65                  70                  75                  80
Ala Glu Ala Pro Glu Ala Gly Gly Thr Pro Arg Gly Val Leu Ala Pro
                85                  90                  95
His Asp Ser Val Leu Gln Ala Leu Arg Arg Leu Arg Ser Pro Lys Met
            100                 105                 110
Met His Lys Ser Gly Cys Phe Gly Arg Arg Leu Asp Arg Ile Gly Ser
        115                 120                 125
Leu Ser Gly Leu Gly Cys Asn Val Leu Arg Lys Tyr
    130                 135                 140
<210>12
<211>132
<212>PRT
<213>Felis catus
<300>
<308>AAG13661
<309>2002-07-18
<313>(1)..(132)
<400>12
Met Asp Pro Lys Thr Ala Leu Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu His Leu Ser Pro Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Gly Pro
            20                  25                  30
Gly Pro Ala Ser Glu Ala Ser Ala Ile Gln Glu Leu Leu Asp Gly Leu
        35                  40                  45
Arg Asp Thr Val Ser Glu Leu Gln Glu Ala Gln Met Ala Leu Gly Pro
    50                  55                  60
Leu Gln Gln Gly His Ser Pro Ala Glu Ser Trp Glu Ala Gln Glu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Pro Ala Arg Val Leu Ala Pro His Asp Asn Val Leu Arg Ala Leu
                85                  90                  95
Arg Arg Leu Gly Ser Ser Lys Met Met Arg Asp Ser Arg Cys Phe Gly
            100                 105                 110
Arg Arg Leu Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gly Leu Gly Cys Asn Val
        115                 120                 125
Leu Arg Arg His
    130
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NP_002512
<309>2006-08-20
<313>(1)..(10)
<400>13
Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala
1               5                   10
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NM_002521
<309>2006-08-20
<313>(1)..(30)
<400>14
ccccgcaggc tgagggcagg tgggaagcaa
<210>15
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NP_002512
<309>2006-08-20
<313>(1)..(17)
<400>15
Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu
<210>16
<211>51
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NM_002521
<309>2006-08-20
<313>(1)..(51)
<400>16
ccccgcaggc tgagggcagg tgggaagcaa acccggacgc atcgcagcag c    51
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NP_002512
<309>2006-08-20
<313>(12)..(23)
<400>17
Leu Leu Leu Leu Phe Leu His Leu Ala Phe Leu Gly
1               5                   10
<210>18
<211>36
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NM_002521
<309>2006-08-20
<313>(36)..(69)
<400>18
cggacgcatc gcagcagcag cagcagcagc agaagc                    36
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NP_002512
<309>2006-08-20
<313>(17)..(26)
<400>19
Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser
1               5                   10
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NM_002521
<309>2006-08-20
<313>(51)..(78)
<400>20
agcagcagca gcagcagaag cagcagcagc                                       30
<210>21
<211>26
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NP_002512
<309>2006-08-20
<313>(1)..(26)
<400>21
Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser
            20                  25
<210>22
<211>78
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NM_002521
<309>2006-08-20
<313>(1)..(78)
<400>22
ccccgcaggc tgagggcagg tgggaagcaa acccggacgc atcgcagcag cagcagcagc     60
agcagaagca gcagcagc                                                   78
<210>23
<211>13
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NP_002512
<309>2006-08-20
<313>(3)..(15)
<400>23
Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu
1               5                   10
<210>24
<211>39
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<300>
<308>NM_002521
<309>2006-08-20
<313>(9)..(45)
<400>24
aggctgaggg caggtgggaa gcaaacccgg acgcatcgc                              39