治疗剂的组织选择性导向是制药工业中正在形成的学科。业已设 计出了基于导向的新的癌症治疗方法，以便提高治疗的特异性和效 力，同时降低毒性，从而增强总体效果。为了将毒素、放射性核苷酸 和化疗偶联物导向肿瘤，业已采用了针对肿瘤相关抗原的小鼠单克隆 抗体(MAb′s)。另外，在治疗造血细胞恶性肿瘤时，业已将CD19， CD20，CD22和CD25的分化抗原用作癌特异性靶。然而，深入的研究 表明，该方法具有若干局限。一种局限是难于分离具有选择性结合能 力的合适的单克隆抗体。第二种局限是作为成功分离抗体的前提，需 要高的抗体免疫原性。第三种局限是引起患者对鼠抗体的免疫反应(人 抗小鼠抗体-HAMA反应)，这种反应通常会导致较短的血清半衰期，并 妨碍反复治疗，因此降低了所述抗体的治疗价值。后一种限制因素引 起了在工程生产来源于鼠的嵌合的或人源化的单克隆抗体方面，以及 在发现人类抗体方面的兴趣。
存在多种干扰单克隆抗体(Mabs)治疗癌症的治疗效力的因素。所 述因素包括在肿瘤细胞上抗原表达的特异性，表达的水平，抗原杂合 性，以及肿瘤物质的可接近性。与诸如癌的实体瘤相比，白血病和淋 巴瘤一般来说对用抗体进行的治疗更敏感。MAbs能迅速结合血流中的 白血病细胞和淋巴瘤细胞，并且容易穿透至淋巴组织中的恶性肿瘤细 胞，因此使得淋巴瘤成为基于MAb治疗的最佳候选疾病。一种理想系 统涉及到鉴定能产生识别恶性肿瘤后代细胞的干细胞细胞表面上的标 记的MAb。
为了帮助发现/生产Mabs，业已利用噬菌体文库来选择能结合诸如 抗体、激素和受体的分离的、预先确定的靶蛋白的随机单链Fvs (scFvs)。另外，一般来说，抗体展示文库的使用，具体来说噬菌体 scFv文库的使用，有利于发现具有导向特异性、尚未认知和确定的、 细胞表面成分的特殊分子的其他方法。
白血病、淋巴瘤和骨髓瘤是起源于骨髓和淋巴组织的癌症，并且 涉及细胞的不受控制的生长。急性成淋巴细胞性白血病(″ALL″)是通过 特异性临床和免疫学特征定义的异型疾病。与其他形式的ALL类似， 大部分B细胞ALL(″B-ALL″)的形成原因尚属未知，尽管在很多场合 下，这种疾病是由于单细胞DNA上的获得性遗传改变所导致的，这种 改变使它变得异常并且连续扩增。
AML是一种杂合型肿瘤，其祖细胞在正常情况下能产生骨髓系的最 终分化细胞(红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板)。与其他形式的 肿瘤类似，AML与获得性遗传改变相关，这种改变会导致表现出一种或 多种类型的早期骨髓分化特征的相对未分化的胚细胞取代正常分化的 骨髓细胞。AML一般与骨髓相关，并且在较低程度上与次要造血器官相 关。AML主要影响成年人，发病高峰在15-40岁之间，不过已知这种 病还能影响儿童和老年人。几乎所有AML患者都需要在诊断之后马上 治疗，以便获得临床上的症状缓解，其中，没有异常含量的循环的未 分化胚细胞的证据。
到目前为止，业已开发了能诱导针对肿瘤细胞的细胞溶解活性的 多种单克隆抗体。一种针对P185-生长因子受体(HER2)的细胞外结 构域的人源化形式的单克隆抗体MuMAb4D5获得了FDA的批准，并且正 被用于治疗人类乳腺癌(美国专利5,821,337和5,720,954)。在 结合之后，所述抗体能够抑制肿瘤细胞生长，肿瘤细胞的生长是依赖 于HER2生长因子受体的。另外，一种能导致包括与淋巴瘤相关的B细 胞在内的外周B细胞快速清除的抗CD20的嵌合抗体，最近获得了FDA 的批准(美国专利5,843,439)。这种抗体与靶细胞的结合导致了补 体依赖型裂解。该产品最近已经获得批准，并且正被用于治疗低级B细 胞非何杰金氏淋巴瘤。
若干种其他人源化和嵌合抗体正在开发之中或被用于临床实验。 另外，将能与在正常骨髓细胞和大多数类型的髓细胞白血病细胞上表 达的CD33抗原特异性起反应的人源化Ig偶联在抗癌药物加利车霉 素，CMA-676(Sievers等，Blood，90(10 Suppl.1 Part 1)， 504A(1997))上。这种偶联物被称为药物Mylotarg，最近已经获得批 准(Caron等，Cancer Supplement，73，1049-1056(1994))。由 于它的细胞溶解活性，将目前正在临床试验中的其他抗CD33抗体 (HuM195)偶联在若干种细胞毒性剂上，包括gelonin毒素(McGraw 等，Cancer Immunol.Immunother，39，367-374(1994))和放射 性同位素131I(Caron等，Blood 83，1760-1768(1994))，90Y(Jurcic 等，Blood，92，(10Suppl.Part 1-2)，613A(1998))和213Bi (Sgouros等，J.Nucl.Med.，38(5Suppl.)，231P(1997))。
抗临床前期的白细胞抗原CD-45的嵌合抗体(cHuLym3)被用作骨 髓移植的调理剂治疗人类白血病和淋巴瘤(Sun等，Cancer Immunol. Immunother.，48，595-602(2000))。在体外试验中，在ADCC(抗 体依赖型细胞介导的细胞毒性)试验中观察到了特异性细胞裂解 (Henkart，Immunity，1，343-346(1994)；Squier和Cohen， Current Opin.Immunol.，6，447-452(1994))。
尽管以上初步结果看上去很有希望，但是它们存在以下局限性。 包括非人序列的最终产品，导致了对非人材料的成问题的免疫反应， 如HAMA。这种HAMA反应妨碍了反复治疗，并且导致了该产品具有较 短的血清半衰期。另外，上述方法只能分离一种类型的抗体，并且只 能分离抗已知的和纯化的抗原的抗体。另外，所述方法不是选择性的， 因为所述方法可以分离抗存在于正常细胞和恶性肿瘤细胞上的细胞表 面标记的抗体。
因此，需要一种克服了上述局限性的方法。另外，所述方法优选 能够鉴定癌细胞上的与诸如介导癌细胞转移相关的靶配体或标记。另 外，所述方法还能够生产所述靶的抗体。噬菌体展示技术似乎具有这 种能力。
噬菌体展示技术的应用，使得可以分离包括完整人序列的scFvs。 例如，最近业已开发出了来自噬菌体展示技术的基于scFv克隆的抗人 TGFb2受体的完整的人抗体。这种scFv在转化成能够竞争结合TGFb2 的完整的人IgG4之后(Thompson等，J.Immunol Methods，227， 17-29(1999))，具有很强的抗增殖活性。为本领域技术人员所公知的 这种技术，在以下文献中有更详细的说明：Smith，Science，228， 1315(1985)；Scott等，Science，249，386-390(1990)；Cwirla 等，PNAS，87，6378-6382(1990)；Devlin等，Science，249， 404-406(1990)；Griffiths等，EMBO J.，13(14)，3245-3260 (1994)；Bass等，Proteins，8，309-314(1990)；McCafferty 等，Nature，348，552-554(1990)；Nissim等，EMBO J.，13， 692-698(1994)；美国专利5,427,908，5,432,018，5,223, 409和5,403,484等等。
利用该噬菌体展示技术，本发明的发明人业已鉴定了存在于病变 的或恶性状态的细胞上的细胞标记。因此，本发明的一个目的是鉴定 能识别基本上暴露的或超量表达的，特别是在病变或恶性状态中的细 胞上或细胞内表达的细胞标记的肽和多肽。
本发明的另一个目的是使用并扩展噬菌体展示技术，以便鉴定所 述肽和多肽。
本发明的另一个目的是通过免疫交叉反应性鉴定所述肽和多肽。
本发明的另一个目的是所述肽和多肽是完全来源于人类的。
本发明的另一个目的是所述肽和多肽是用不一定是免疫原性的抗 原分离的。
本发明的另一个目的是提供能够预防、延缓或治愈癌症，特别是 包括白血病或淋巴瘤在内的与血液相关的癌症的肽或多肽。
本发明的另一个目的是提供利用所述肽和多肽本身，或与抗癌剂 和/或诊断标记或标志缔合或偶联的所述肽和多肽对癌细胞进行局部 导向。
本发明的另一个目的是提供一种生产针对所需配体的导向剂的方 法。
本发明的再一个目的是鉴定提供了对在恶性状态下超量表达的细 胞中标记的识别作用的特殊基序，并且可以将该基序用于构建抗癌剂 的导向或诊断标记或标志。
本发明还有一个目的是提供一种包括有效数量的与一种抗癌剂或 诊断标记或标志结合或连接的所述肽、多肽或基序的组合物。
业已证实，SCFv能进入组织，并且比完整大小的抗体更快地从血 液中清除，因为其体积较小。Adams，G.P.，等，Br.J.Cancer 77，1405-1412(1988)；Hudson，P.J.，Curr.Opin.Immunol. 11(5)，548-557(1999)；Wu，A.M.，等，Tumor Targeting 4，47(1999)。因此，scFv通常被用于诸如肿瘤显像的涉及到放射性 标记的诊断方法，可以从体内更快地清除放射性标记。最近业已对多 种癌导向scFv多聚体进行了体内稳定性和效力方面的临床前评估。 Adams，G.P.，等，Br.J.Cancer 77，1405-1412(1988)；Wu， A.M.，等，Tumor Targeting 4，47(1999)。
单链Fv(scFv)片段由通过多肽接头连接在一起的抗体的重链可 变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)组成。所述接头足够长，以便使 (VH)结构域和(VL)结构域折叠成有功能的Fv结构域，使得scFv能识别 并以与亲代抗体类似或更高的亲和力结合其靶位。常用的接头包括甘 氨酸和丝氨酸残基，以便提供灵活性和蛋白酶抗性。
通常，将scFv单体设计成使VH结构域的C-末端通过多肽接头连 接在VL的N-末端残基上。任选采用相反的方向：VL结构域的C-末端通 过多肽接头连接在VH的N-末端残基上。Power，B.，等，J.Immun. Meth.242，193-204(2000)。所述多肽接头的长度通常大约为12个 氨基酸。当所述接头的长度降低到大约3-12个氨基酸时，scFvs就不 再能折叠成有功能的Fv结构域，相反，它与另一个scFv缔合形成双 抗体。如果将所述接头的长度进一步降低到少于3个氨基酸，会迫使 scFv缔合成三聚体或四聚体，这要取决于所述接头的长度、组成和Fv 结构域的方向。B.E.Powers，P.J.Hudson，J.Immun.Meth.242 (2000)193-194。
最近，业已发现诸如scFv二聚体、三聚体和四聚体的多价抗体片 段通常具有高于亲代抗体的对靶的更高的表观结合亲和力。这种较高 的亲和力具有多种优点，包括肿瘤导向应用的理想的药物动力学优 点。
因此，所述多价形式的、较大的结合亲和力，是诊断和治疗方案 所需要的。例如，可以将scFv用作阻断剂，用于结合靶受体，并因此 阻断“天然”配体的结合。在这种场合下，需要scFv和受体之间具有 高的缔合亲和力，以便降低解离的可能性，这种解离可能导致不希望 的天然配体与所述靶的结合。另外，当所述靶受体参与粘附或滚动或 当所述靶受体存在于出现在高剪切流动部位的诸如血小板的细胞上 时，这种高的亲和力是特别重要的。
因此，本发明的目的是多价形式的Y1和Y17 scFv。这种多价形 式包括，但不局限于二聚体、三聚体和四聚体，在本文中，有时分别 称之为双抗体、三抗体和四抗体。
发明概述
本发明提供了能选择性地和/或特异性地结合靶细胞，特别是与血 液相关的癌细胞的肽和多肽，其构建，其自身的用途，或与一种或多 种药用试剂缔合或组合、偶联或融合后的用途。
本发明的一种实施方案提供了包括Fv分子、其构建体、两者的片 段或片段的构建体的肽或多肽，它具有增强了的结合特征，以便相对 其他细胞而言，更有利于选择性地和/或特异性地结合靶细胞，其中， 所述结合选择性或特异性主要是由第一高变区决定的，并且，其中的 Fv是单链(″scFv″)或二硫Fv(″dsFv″)，并任选具有一个或多个标 记。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种包括Fv分子、其构建 体、两者的片段、或片段的构建体的肽或多肽，它具有增强了的结合 特征，以便能选择性地和/或特异性地结合靶细胞上或靶细胞内的基本 上暴露的和/或超量表达的结合位点，其中，相对于其上或内部基本上 不存在和/或表达所述结合位点的其他细胞，更有利于结合靶细胞，其 中，所述结合选择性或特异性主要是由第一高变区决定的，并且，其 中的Fv是scFv或dsFv，并任选具有一个或多个标记。
在本发明的另一种实施方案中，提供了包括Fv分子、其构建体、 其片段或片段的构建体的肽或多肽，它具有增强了的结合特征，以便 相对其他细胞而言，更有利于选择性地和/或特异性地结合靶细胞，其 中，Fv分子包括具有第一、第二和第三高变区的第一条链，和具有第 一、第二和第三高变区的第二条链，其中所述第一条链的高变区之一 具有选自SEQ ID Nos：8-24的序列，并且，其中，所述第二条链的高 变区之一具有选自SEQ ID Nos：1-6和125-202的序列，并且，其中 的第一、第二和第三高变区是CDR3，CDR2和CDR1区，并且，其中 的Fv是scFv或dsFv，并任选具有一个或多个标记。
在本发明的另一种实施方案中，
(a)所述第一条链和第二条链各自包括选自SEQ ID NOs：8-24 的第一高变区，
(b)所述第一条链和第二条链的第一高变区是相同的，并且选自 SEQ ID NOs：8-24，
(c)所述第一条链的第一高变区选自SEQ ID NOs：8-24，所述第 二条链的第一高变区选自SEQ ID Nos：1-6和125-202，或
(d)所述第一条链的第一高变区选自SEQ ID NOs：1-6和 125-202，所述第二条链的第一高变区选自SEQ ID NOs：8-24。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种包括Fv分子、其构建 体、两者的片段或片段的构建体的肽或多肽，它能结合具有第一种状 态和第二种状态的第一种细胞上的未知配体其中，所述结合是通过与 第二种细胞上的配体的免疫交叉反应性、结合特异性或选择性，在所 述第二种状态下实现的，而基本上不能在第一种状态下实现，并且， 其中的Fv是scFv或dsFv，并任选具有一个或多个标记。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种用于鉴定能结合第一 种和第二种细胞上的未知免疫交叉反应性结合位点的导向分子的方 法，包括
(a)一个或多个生物淘选步骤，这些步骤是在处于第二种状态，而 不是第一种状态的第一靶细胞上进行的，在这种状态下基本上能暴露 或展示包括未知配体的结合位点，以便产生第一个识别分子群；
(b)随后的生物淘选和/或选择步骤，由步骤(a)所得到的识别分 子群开始，这些步骤是在包括与所述第一种细胞上的未知配体具有免 疫交叉反应性的未知配体的结合位点的第二种细胞上进行的，以便生 产第二个识别分子群；
(c)扩增并且纯化步骤(b)的第二个识别分子群；和
(d)由步骤(c)的纯化的识别分子的识别位点构建包括导向分子 的肽或多肽，所述导向分子对所述第二种细胞上的未知配体具有选择 性和/或特异性。
在本发明的另一种实施方案中，提供了包括氨基酸序列R1-X Phe Pro-R2的结合基序，其中，R1和R2各自包括0-15个氨基酸残基，并 且，其中的X是Arg，Gly或Lys。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种生产导向剂的方法， 包括以下步骤：
a)分离并选择包括一个主要识别位点的一种或多种导向分子，包 括直接在靶细胞上进行生物淘选程序或间接在处在第二种状态而不是 第一种状态的第一种靶细胞上进行生物淘选程序，以及随后间接在第 二种靶细胞上进行生物淘选程序，以便生产一种或多种所述导向分 子；
b)扩增、纯化和鉴定一种或多种导向分子；和
c)由所述一种或多种导向分子构建一种导向剂，或者，其中，所 述导向剂可以是肽、多肽、抗体或抗体片段，或其多聚体。
其中，所述导向剂可以是肽、多肽、抗体或抗体片段或其多聚体。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种具有以下分子式或结 构的肽或多肽：
A-X-B
其中，X是长度为3-30个氨基酸的高变CDR3区；A和B可以各自 是长度为1-1000个氨基酸的氨基酸链，其中，A是氨基末端，而B是 羧基末端。
附图说明
下面将结合下文披露的附图仅以举例形式，而不是限定形式对本 发明作更详细地说明，其中：
图1表示通过EIA分析测定的结合在固定血小板上的噬菌体克 隆。数据是以在405nm波长下吸光度的函数形式提供的。
图2a，2b和2c表示通过FACS分子测定的、从三位AML患者 体内获得的单核细胞样品与scFvs的结合。示出了通过两种FITC- 标记的测试样品(对照scFv和scFv克隆Y1)结合的细胞的荧光强 度。
图3表示通过FACS分析测定的业已通过Ficoll-纯化的Y-I与血 小板(3a)和单核细胞(3b)的结合。示出了通过两种FITC-标记的测试 样品(对照scFv和scFv克隆Y1)结合的细胞的荧光强度。
图4表示FITC-标记的scFv克隆Y1与脐带血CD34+干细胞的结 合。在FLI-H通道中，分析FL3-H通道中的CD34+门控细胞与FITC- 标记的阴性对照scFv(图4a)或FITC-标记的scFv克隆Y1(图4b) 的结合。图4c表示与图4b中相同的FITC-标记的scFv克隆Y1样品 的FSC和SSC点图分析。在图4b和4c中被圈起来的部分表示CD34+ 细胞的能结合scFv克隆Y1的亚群体。
图5：从存在前B-ALL细胞的两位患者体内获得的样品的FACS分 析：一种样品来自儿童(5a，5c，5e)，而另一种样品来自成人(5b， 5d，5f)。采用双染色方法，该方法使用了通过商业渠道获得的PE- 标记的CD19(正常外周B-细胞的标记；图5a，5c)或PE-标记的CD34 (干细胞的标记，图5d)，同时使用了FITC-标记的阴性对照scFv(5a， 5b)或FITC-标记的Y-I scFv(5c，5d)。图5b是双阴性对照。提供 了与阴性对照染色模式形成对比的由FITC-标记的样品(scFv克隆Y1) 结合的细胞的荧光强度(x轴)(5e和5f)。
图6：该图提供了用Jurkat细胞进行的结合比较研究的结果。提 供了FITC-标记的Y-I scFv单体，双抗体和三抗体以及阴性对照与 Jurkat细胞结合的FACS分析。
图7：该图提供了比较IgG-Y-I和scFv-Y1结合的研究的结果。 为了比较完整大小的IgG-Y1的结合和scFv-YI形式的结合，采用了双 染色方法。将5ng IgG-YI用于对RAJI细胞(YI阴性细胞；图7a)和 Jurkat细胞(Y1阳性细胞；图7b)进行FACS分析。为了进行检测，使 用了PE标记的山羊抗人IgG。将大约1μg(200倍)用于scFv-YI-I结 合，然后用PE-标记的兔抗scFv抗体进行染色，并且进行FACS分析 (图7c)。
图8：该图表示YI二聚体，Y1 scFv(CONY1)和Y1 IgG之间的结 合比较。
图9：该图表示Y1硫醚键二聚体与Y1 scFv(CONY1)之间的结合 比较。
图10：该图是Y1cys-kak的Superdex 75曲线。
图11：该图表示二聚体的大小与在还原和非还原条件下与单体的 大小的比较。
图12：该图提供了ELISA分析结果。
图13：该图是抗GPIbα抗体的表位的曲线图。
图14：该图是氨基酸SEQ ID NO：。
发明详述
特异性在本文中被定义为由本发明的肽或多肽中的一个或多个结 构域对靶配体的识别，以及随后与它的结合。
选择性在本文中被定义为导向分子选择并结合细胞类型或细胞状 态的混合物中的一种类型或细胞状态的能力，该混合物的所有细胞类 型或细胞状态可能对所述导向分子具有特异性。
保守性氨基酸取代被定义为通过改变肽、多肽或蛋白或其片段上 的一个或两个氨基酸导致的氨基酸组成的改变。所述取代是用具有大 体上类似特性(例如，酸性、碱性、芳族、大小、带正电荷或负电荷、 极性或非极性)的氨基酸进行的，以便这种取代不会明显改变肽、多 肽或蛋白的特征(例如，电荷、IEF、亲和力、抗体亲抗原性、构像、 溶解度)或活性。可以在所述保守性氨基酸取代中进行的典型的取代 可以包括在以下氨基酸组中进行的取代：
(i)甘氨酸(G)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)
(ii)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
(iii)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
(iv)组氨酸(H)，赖氨酸(K)和精氨酸(R)
(v)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
(vi)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
保守性氨基酸取代可以在主要决定所述分子的选择性和/或特异 性结合特征的高变区内和高变区侧翼进行，以及在所述分子的其他部 分进行，例如，可变重链盒。作为补充或替代，可以通过重构所述分 子形成完整大小的抗体、双抗体(二聚体)、三抗体(三聚体)、和/ 或四抗体(四聚体)或形成小体或微体进行修饰。
在本说明书和权利要求书中，Fv被定义为由人抗体的重链可变区 和人抗体的轻链可变区组成的分子，所述抗体可以是相同的或不同 的，并且，其中的重链可变区与轻链可变区结合、连接、融合或共价 连接或缔合。
Fv分子的片段被定义为小于原始Fv的、仍然保留了原始Fv的选 择性和/或特异性结合特征的任何分子。所述片段的例子包括，但不局 限于(1)小体，它仅包括Fv重链的一个片段，(2)微体，它包括一 个小的组份单位的抗体重链可变区(PCT申请号PCT/IL99/00581)，(3) 包括所述轻链的片段的类似体，和(4)包括轻链可变区的功能单位的类 似体。
抗癌剂是一种具有抗癌活性，即能抑制癌或不成熟的前癌细胞生 长或分化的任何活性，或能抑制癌细胞转移的任何活性的试剂。在本 发明中，抗癌剂还是一种具有抗血管发生活性的试剂，它能阻止、抑 制、延缓或消除肿瘤组织的血管发生，或者还可以是具有抗粘附活性 的试剂，它能抑制、延缓或消除癌细胞和前癌细胞的粘附和转移性侵 入。
癌细胞生长的抑制在本文中被定义为(i)抑制癌性或转移性生 长，(ii)延缓癌性或转移性生长，(iii)完全抑制癌细胞的生长过程 或转移过程，同时保持所述细胞的完整性和活力，或(iv)杀伤所述癌 细胞。更具体地讲，癌性生长的抑制可特别应用于抗与血液相关的癌， 例如AML，多发性骨髓瘤或慢性淋巴细胞白血病。
噬菌粒被定义为携带有质粒DNA的噬菌体颗粒，因为它携带有质 粒DNA，噬菌粒颗粒就不再具有足够的空间来容纳噬菌体基因组的整个 互补体。从噬菌体基因组中缺少的部分，是包装噬菌体颗粒所必须的 信息。因此，为了繁殖所述噬菌体，必须将需要的噬菌体颗粒与能补 充缺少的包装信息的辅助噬菌体菌株一起培养。
正如本文所定义的，用于多肽的盒表示特定的连续氨基酸序列， 该序列起着构架的作用，并且被认为是一个单位，并且作为一个单位 进行操作。可以在其一端或两端取代、插入、去除或连接氨基酸。同 样，可以在其一端或两端取代、插入、去掉或连接氨基酸片段。
在本文中，免疫球蛋白(Ig)分子被定义为五种类型中的任意一 种，即IgG，IgA，IgD，IgE或IgM。IgG型包括若干种亚型，包 括，但不限于IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
药物组合物表示一种制剂，它包括本发明的肽或多肽，以及可以 药用的载体、赋形剂或其稀释剂。
药用试剂表示可用于哺乳动物的预防性处理或诊断的试剂，所述 哺乳动物包括，但不局限于人、牛、马、猪、鼠、犬、猫、或任何其 他温血动物。所述药用试剂选自下列一组：放射性同位素，毒素，寡 核苷酸，重组蛋白，抗体片段，和抗癌剂。所述药用试剂的例子包括， 但不局限于抗病毒剂，包括阿昔洛韦，更昔洛韦和齐多夫定；抗血 栓/再狭窄剂，包括西洛他唑，dalteparin sodium，瑞维肝素钠， 和阿司匹林；抗炎剂，包括扎托洛芬，普拉洛芬，屈恶昔康，乙酰 水杨酸17，双氯芬酸，异丁苯丙酸，右布洛芬，舒林酸，甲氧萘 丙酸，amtolmetin，celecoxib，消炎痛，rofecoxib，和尼美 舒利；抗自身免疫剂，包括来氟米物，denileukin diftitox， subreum，WinRho SDF，去纤苷酸，和环磷酰胺；和抗粘附/抗聚集 制剂，包括利马前列素，clorcromene，和透明质酸。
抗白血病剂是具有抗白血病活性的试剂。例如，抗白血病试剂包 括能抑制或阻止白血病细胞或不成熟的前白血病细胞生长的试剂，能 杀伤白血病细胞或前白血病细胞的试剂，能增强白血病细胞或前白血 病细胞对其他抗白血病剂的易感性的试剂，以及能抑制白血病细胞转 移的试剂。在本发明中，抗白血病剂还可以是具有抗血管发生活性的 试剂，它能阻止、抑制、延缓或消除肿瘤的血管化。
本文所使用的术语“亲和力”是衡量受体(例如，抗体上的结合 位点)和配体(例如，抗原决定簇)之间的结合强度(缔合常数)的 指标。抗体上的单个抗原结合位点与一个表位之间的总的非共价相互 作用的强度，是所述抗体对所述表位的亲和力。低亲和力抗体对抗原 的结合较弱，并且倾向于很容易解离，而高亲和力抗体能更紧密地结 合抗原，并且保持较长时间的结合。术语“抗体亲抗原性”与亲和力 不同，因为前者体现的是抗原-抗体相互作用的价。
抗体-抗原相互作用的特异性：尽管抗原-抗体反应是特异性的， 但是在某些场合下，由一种抗原诱导的抗体能够与另一种不相关的抗 原发生交叉反应。如果两种不同的抗原拥有同源的或类似的表位或它 的锚定区，或者如果对一种表位特异的抗体结合具有类似化学特性的 不相关的表位的话，就会发生所述交叉反应。
胚细胞是处在细胞发育的不成熟阶段的细胞，它与静息细胞的区 别是具有较高的细胞质-细胞核比例。
血小板是从骨髓窦中排出的巨核细胞的圆盘状细胞质片段，该片 段随后在外周血液中循环。血小板具有若干种生理学功能，包括在凝 血中的主要作用。血小板包括处在其中央部分的颗粒和外周部分的透 明原生质，但是没有明确的细胞核。
术语“表位”在本文中表示能与抗体、抗体片段、抗体复合体相 互作用的抗原决定簇或抗原部位或包括它的结合片段或T-细胞受体的 复合物。在本文中，术语表位可以与术语配体、结构域、和结合域互 换使用。
一种特定的细胞可以在其表面上表达具有对特定抗体的结合位点 (或表位)的蛋白，但是所述结合位点可能以隐蔽形式(例如，从空 间上妨碍或封闭，或缺乏被抗体结合所需要的特征)存在于一种状态 的所述细胞中，该状态可以被称为第一期(I期)，例如，I期可以是 正常的、健康的、非病变的状态。当所述表位以隐蔽形式存在时，它 不能被所述特定抗体识别，即不存在所述抗体与该表位或处在I期的 所述特定细胞的结合。不过，所述表位可能会暴露出来，例如，通过 它自身发生的修饰，或因为相邻的或有关的分子受到修饰而解除封 闭，或因为一个片段发生了构像变化。修饰的例子包括折叠的改变， 翻译后修饰的改变，磷脂化的改变，硫酸化的改变，和糖基化改变等。 所述修饰可以在所述细胞进入一种不同的状态时发生，所述状态可以 被称为第二期(II期)，第二种状态或期的例子包括激活、增殖、转 化、或恶性肿瘤状态。在受到修饰时，所述表位就可以暴露出来，并 且所述抗体能够与它结合。
在本文中，术语“Fab片段”是免疫球蛋白的一价抗原结合片段。 Fab片段由轻链和部分重链组成。
多克隆抗体是免疫反应的产物，并且是由多种不同的B-淋巴细胞 形成的。单克隆抗体源于单一细胞。
本文所使用的凝集一词表示导致具有类似大小的悬浮的细菌、细 胞、圆片或其他颗粒粘附在一起，并形成团块的过程。该过程类似于 沉淀，但是所述颗粒较大，并且存在于悬浮液中，而不是存在于溶液 中。
术语“聚集”表示体外和凝血酶和胶原诱导的血小板的聚集，它 是导致形成血栓或止血栓的一系列机制的一部分。
可以通过分析在各种条件、特定时间、各种组织等中产生的基因 产物的数量，研究基因的表达形式。当基因产物的数量高于存在于正 常对照，例如非病变对照中的数量时，就认为该基因是“超量表达的”。
启动子是DNA上的一个区，RNA聚合酶与它结合，并且启动转录。
抗体或免疫球蛋白是能结合抗原的蛋白分子。它们由通过二硫键 连接在一起的四个多肽链(两个重链和两个轻链)单位组成。每一条 链具有一个恒定区和一个可变区，根据抗体的重链成分，可以将抗体 分成五种类型：IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。抗体是由B淋巴细胞 产生的，能识别特定的外源抗原决定簇，并且能促进清除所述抗原。
抗体能够以多种形式生产并使用，包括抗体复合体。在本文中， 术语“抗体复合体”被用于表示一种或多种抗体与另一种抗体或与一 个或多个抗体片段形成的复合体，或与两个或两个以上抗体片段的复 合体。
F(ab′)2片段是通过胃蛋白酶消化获得的免疫球蛋白二价抗原 结合片段。它包括轻链和部分重链。
Fc片段是免疫球蛋白的非抗原结合部分。它包括重链的羧基末端 部分和Fc受体的结合位点。
Fd片段是免疫球蛋白重链的可变区和第一恒定区。
污染蛋白是这样的蛋白，它不是特异性选择用于一种样品中的， 并且可能存在于该样品中。
肽模拟物是具有与诸如抗体的另一种实体的相同功能作用或活性 的小分子、肽、多肽、脂类、多糖或其偶联物。
噬菌粒是质粒载体，它被设计成包括源于fd的诸如m13的丝状噬 菌体的复制起点。
存在多种疾病，这些疾病涉及到能在其表面上表达细胞特异性和/ 或疾病特异性配体的病变的、改变的、或以其他方式修饰过的细胞。 通过对每一种细胞的识别、选择、诊断和治疗，可以将所述配体用于 实现特定疾病的识别、选择、诊断和治疗。本发明提供了包括Fv分子、 其构建体、其片段、其片段的构建体、或构建体的片段的肽或多肽， 它们都具有增强了的结合特征。这种结合特征使得所述肽或多肽分子 与其他细胞相比，更有利于选择性地和/或特异性地结合靶细胞。所述 结合特异性和/或选择性主要是由第一高变区决定的。所述Fv可以是 scFv或dsFv。
上述Fv分子可用于靶定病变细胞。例如，所述病变细胞可以是癌 细胞。可以通过特异性导向诊断和/或治疗的癌症类型的例子包括，但 不局限于癌、肉瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胚细胞瘤、精 原细胞瘤和黑素瘤。白血病、淋巴瘤、和骨髓瘤是源于骨髓和淋巴组 织的癌症，并且与不受控制的细胞生长相关。
近几年来，业已开发出了用于诊断和治疗疾病、特别是癌症的新 方法。其中包括肿瘤定向方法，该方法使用可以通过多种方式筛选和 生产的导向分子。用于鉴定可能的导向分子的一种方法是噬菌体展 示。噬菌体展示是这样一种技术，其中，肽、多肽、抗体或蛋白是通 过与噬菌体外被蛋白融合从而在丝状噬菌体表面上进行的表达和展示 而产生和选择的，编码展示蛋白的DNA位于噬菌体毒粒内。通过噬菌 体展示技术生产的scFv，由通过柔性氨基酸多肽间隔片段连接的抗体 重链和轻链的每一条的可变区组成(Nissim等，EMBO J，13，692-698 (1994))。
噬菌体展示文库(又被称为噬菌体肽/抗体文库，噬菌体文库，或 肽/抗体文库)包括庞大的噬菌体群(通常为108-109)，每一个噬菌 体颗粒具有不同的肽或多肽序列。所述肽或多肽片段可以以不同的长 度构建。所述展示的肽或多肽可源于，但不一定局限于人类抗体重链 或轻链。
在本发明中，将通过噬菌体展示技术生产的scFv抗体文库用于获 得并生产导向分子。将流式细胞术，特别是荧光激活的细胞分选 (″FACS″)用于鉴定并分离特定的噬菌体克隆，该克隆的肽或多肽能识 别靶细胞。噬菌体表达的scFv抗体片段，可用于高亲和力克隆的体外 筛选、富集和选择(美国专利5,821,337；美国专利5,720,954)。 因此，这种类型的文库提供了生产用于研究和临床应用的新工具的有 效手段，并且，与常规方法相比具有多种优点(Caron等，Cancer Supplement，73，1049-1056(1994))。所述文库包括抗体分子高度 多样性的潜力(Nissim等，EMBO J.，692-698(1994))。在本发 明中，可以将稳定的人cDNA用作抗体生产的连续的材料来源(美国专 利5,843,439)。分子识别和选择不受候选靶蛋白的体内免疫原性的 影响。
尽管噬菌体展示抗体的亲和力选择提供了用于从大型文库中富集 抗原反应性scFvs的有用方法，但是，它需要多个步骤来分离单个克 隆，以及表征可溶性scFv。可以对scFvs本身进行修饰，以便提高其 亲和力和/或抗体亲抗原性，所述修饰是通过进行保守性氨基酸取代， 或生产scFv的片段，或所述片段的构建体实现的。
对不同的人类细胞和组织特异的本发明的scFvs能够以药物有效 量与各种药用试剂和/或放射性同位素结合、组合、融合、或连接，并 且任选地与药物有效的载体组合，以便形成具有抗病和/或抗癌活性， 和/或用于所述疾病的诊断目的药物-肽组合物、融合物或偶联物。
噬菌体克隆是通过被称为生物淘选的多步骤方法选择和鉴定的。 生物淘选是通过以下方法进行的：将噬菌体展示蛋白配体变体(噬菌 体展示文库)与一种靶一起孵育，通过洗涤技术除去未结合的噬菌体， 并特异性地洗脱结合的噬菌体。对洗脱的噬菌体任选进行扩增，然后 通过其他轮次的结合和任选扩增富集特定序列的库，有利于具有表现 出对所述靶的最佳结合能力的抗体片段的噬菌体克隆。在经过若干轮 次之后，对单一的噬菌体克隆进行表征，并且通过对噬菌体毒粒的相 应DNA进行测序，确定由所述克隆展示的肽的序列。
用这种方法获得scFv又被称为前导化合物。前导化合物被定义为 这样一种化合物，它的最终形式包括一个核心肽或多肽。所述前导化 合物可以修饰和/或扩增，但是它必须保留所述核心肽或多肽或它的某 种保守性修饰形式。例如，通过氨基酸取代进行的修饰可以在Fv的N- 末端、羧基末端、或任一种CDR区进行，或者在其上游或下游区进行。 修饰还可以包括，但不局限于融合蛋白，与药物或毒素偶联，构建多 聚体，和扩展成完整的抗体分子。用于本发明的一种优选类型的前导 化合物是作为生物淘选方法的最终产物获得的scFv。
本发明的一种实施方案提供了本发明肽或多肽的至少一种非天然 修饰。所述非天然修饰可以使得所述肽或多肽的免疫原性更高或更 低。非天然修饰包括，但不局限于类肽(peptoid)修饰、半类肽修饰、 环肽修饰、N-末端修饰、C-末端修饰、肽键修饰、主链修饰、和残基 修饰。
抗原特异性噬菌体抗体的选择，在很大程度上取决于对固定化单 抗原的生物淘选。只有有限的选择是用完整细胞作靶进行的。在本发 明中，将完整细胞用于选择能识别白血病细胞表面决定簇的特异抗 体，其中，所述特异受体是以前未知的或未表征过的。该方法不能方 便地调整抗原浓度或除去不希望的显性抗体反应性。另外，与具有较 高亲和力的克隆相比，所述噬菌体可以富集能展示多拷贝scFv的克 隆。不过，该方法的所述优点使得它成为用于分离新型人类抗体分子 的非常有价值的工具。
本发明的一种实施方案提供了包括Fv分子、其构建体、其片段或 片段的构建体的肽或多肽，它能结合具有第一种和第二种状态的第一 种细胞上的未知配体，其中，所述结合是在第二种状态下实现的，而 基本上不能在第一种状态下实现，通过免疫交叉反应性，特异性地或 选择性地结合第二种细胞上的配体，并且，其中的Fv是scFvs或dsFv， 并且任选具有一个或多个标记。
另一种实施方案提供了本发明的肽或多肽，其中，所述肽或多肽 与所述第二种细胞的配体的选择性和/或特异性结合，主要是由第一高 变区决定的。
另一种实施方案提供了本发明的肽或多肽，其中，所述第一高变 区是具有选自SEQ ID NOs：8-24的氨基酸序列的CDR3区。
另一种实施方案提供了本发明的肽或多肽，其中，所述第一高变 区是具有选自SEQ ID NOs：8-24的氨基酸序列的CDR3区，并且， 其中的结合选择性或特异性其次受到第二高变区和/或第三高变区和/ 或分别位于所述第一、第二和第三高变区侧翼的一个或多个上游区和/ 或一个或多个下游区的影响。
另一种实施方案提供了由本发明的肽或多肽结合的第二种细胞的 配体。一种这样的双细胞选择方法基于以下原理：巨核细胞是源于骨 髓中的造血干细胞的大型多核细胞。血小板能破坏巨核细胞细胞质， 并进入外周血液。在体外，有多种细胞因子能直接影响干细胞。例如， 血小板生成素能通过直接增加干细胞向巨细胞的分化提高血小板数。 因此，所述细胞能表达同样出现在不成熟的细胞中的若干细胞表面标 记。
恶性血细胞(白血病和淋巴瘤)以能表达通常存在于部分分化的 造血祖细胞中的细胞表面蛋白的不成熟的细胞为特征。因此，血小板 是用于鉴定在病变的或恶性血细胞上表达的不成熟的细胞表面标记的 诱人的来源。在下面披露的一种方法中，将特定细胞，例如，但不局 限于具有未知配体的血小板用于最初的生物淘选步骤。随后的克隆选 择是用需要的靶细胞进行的，所述靶细胞的表面标记是未知的，例如， 但不局限于AML细胞。在该方法中，通过在血小板上进行生物淘选获 得的噬菌体克隆，可以提供用于识别和结合位于感兴趣的病变细胞或 恶性血细胞上的配体的工具。
上述靶细胞包括从分离的组织中获得的细胞。所述分离的组织可 以是病变的组织，更具体地讲，是癌组织。癌组织可源于任何形式的 恶性肿瘤，包括，但不局限于癌、肉瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨 髓瘤、胚细胞瘤、精原细胞瘤、和黑素瘤。
除了上述生物淘选方法之外，另一种方法是基于能结合一种细胞 上的配体的肽或多肽的分离，所述肽或多肽是通过直接在所述配体上 淘选确定的。
本发明提供了包括Fv分子、其构建体、两者的片段、或片段的构 建体的肽或多肽。一种构建体可以是多聚体(例如，双抗体、三抗体、 四抗体)或完整大小的Ig分子。一种片段可以是小体或微体。所有衍 生的构建体和片段保留了增强的结合特征，以便相对其他细胞而言， 更有利于选择性地和/或特异性地结合靶细胞。所述结合选择性和/或 特异性主要是由第一高变区决定的，并且其中的Fv是scFv或dsFv， 并且任选具有一个或多个标记。
在本发明的一种实施方案中，将一个标记插入或附着在Fv肽或多 肽上，以便有助于所述肽或多肽的制备和鉴定，并且有助于诊断。随 后可以将所述标记从所述分子上除去。所述标记可以是，但不局限于 以下标记：AU1，AU5，BTag，c-myc，FLAG，Glu-Glu，HA，His6， HSV，HTTPHH，IRS，KT3，蛋白C，S·Tag，T7，V5，VSV-G (Jarvik和Telmer，Ann.Rev.Gen.，32，601-618(1998))，和 KAK(赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸)。所述标记优选是c-myc或KAK。
可以用长度为0-20个氨基酸残基的间隔片段，将本发明Fv分子的 两个可变链连接或结合在一起。所述间隔片段可以是分支的或不分支 的。所述接头优选为0-15个氨基酸残基，最优选的接头是(Gly4Ser)3， 以便产生单链Fv(″scFv″)。ScFv可以从噬菌体展示文库中获得。
Fv分子本身由第一条链和第二条链组成，每一条链都包括第一、 第二和第三高变区。位于轻链和重链的可变结构域内的高变环被称为 互补决定区(CDR)。重链和轻链的每一条都具有CDR1，CDR2和CDR3 区。据信，所述区能形成抗原结合位点，并可以进行特异性修饰，以 便产生增强了的结合活性。大部分可变区的本质是所述重链的CDR3 区。CDR3区被理解为Ig分子的最暴露的区域，并且正如业已证实的和 本文所提供的，是主要决定所观察到的选择性和/或特异性结合特征的 位点。
本发明的一种实施方案提供了包括Fv分子、其构建体、两者的片 段、或片段的构建体的肽或多肽，它具有增强了的结合特征，以便相 对所述结合位点基本上不存在和/或不表达的部位的细胞而言，更有利 于与包括一种细胞的靶位上的基本上暴露的和/或超量表达的位点选 择性地和/或特异性地结合，其中，所述结合选择性和特异性主要是由 第一高变区决定的，并且其中的Fv是scFv或dsFv，并且任选具有 一个或多个标记。
本发明的另一种实施方案提供了一种肽或多肽，其中，所述第一 高变区是具有选自SEQ ID NOs：8-24氨基酸序列的CDR3区。
本发明的另一种实施方案提供了一种肽或多肽，其中，所述第一 高变区是具有选自SEQ ID NOs：8-24氨基酸序列的CDR3区。并且， 其中的结合选择性或特异性其次受到第二高变区和/或第三高变区和/ 或分别位于所述第一、第二和第三高变区侧翼的一个或多个上游区和/ 或一个或多个下游区的影响，其中，所述第二和第三高变区分别是CDR2 和CDR1区。
本发明的一种实施方案提供了能结合作为激活的、兴奋的、修饰 的、改变的、失调的或病变的细胞的靶细胞的肽或多肽。本发明的另 一种实施方案提供了作为癌细胞的靶细胞。所述靶细胞可以选自，但 不局限于癌、肉瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胚细胞瘤、精 原细胞瘤、和黑素瘤。在一种优选实施方案中，所述癌细胞是白血病 细胞，在一种最优选的实施方案中，所述白血病细胞是AML细胞。
本发明的肽或多肽还可以是Fv的任何构建体或修饰过的构建体， 它保留了所述重链和/或轻链的一个或多个高变区，并且具有选择性的 和/或特异性的结合特征。构建体或修饰过的构建体包括，但不局限于 scFv，dsFv，scFv的多聚体，如二聚体，三聚体和四聚体等(又被 称为双抗体、三抗体、四抗体)，以及完整抗体，以及可以构建的它 们的任何其他多聚体，并且它掺入了所述抗体的一个或多个高变结构 域。本发明的肽或多肽还是具有原始构建体的某些或全部结合特征的 任何构建体或修饰过的构建体的片段。
本发明的肽或多肽还是具有原始构建体的某些或全部选择性和/ 或特异性结合特征的片段的构建体。本文所披露的Fvs能选择性地和/ 或特异性地结合靶细胞，并且可以与抗癌剂或抗病剂缔合，或偶联。
本发明的肽、多肽、其片段、其构建体和Fv分子的构建体的片段 可以在原核或真核表达系统中制备。在本发明的一种实施方案中，所 述真核表达系统是哺乳动物表达系统，并且在所述哺乳动物表达系统 中生产的肽或多肽在纯化之后，基本上不含哺乳动物污染物。本文所 定义的真核细胞系统是指通过遗传工程方法生产肽或多肽的表达系 统，其中，所述宿主细胞是真核细胞。在本发明的另一种实施方案中， 用于生产本发明的肽或多肽的原核系统将大肠杆菌用作表达载体的宿 主。在所述大肠杆菌系统中生产的肽或多肽，在纯化之后基本上不含 大肠杆菌污染蛋白。使用原核表达系统可能会导致在本发明所提供的 某些或所有序列的N-末端添加甲硫氨酸残基。在肽或多肽生产之后， 除去N-末端甲硫氨酸能够通过本领域普遍公知的方法全面表达所述肽 或多肽，例如，但不局限于在合适条件下使用气单胞菌属氨基肽酶(美 国专利5,763,215)。
本发明提供了基于本发明Fv肽的scFv的生产。掺入到用于在原 核细胞中克隆并扩增scFv的载体中的启动子可以从多种候选启动子中 选择。启动子是一种DNA序列，它位于结构基因上游，并且能够控制 基因的表达。启动子存在于生物的天然状态的染色体中，并且还可以 通过工程方法整合到原核或真核表达载体上。通过工程方法掺入目标 DNA片段的特定基因座上的启动子，能够对感兴趣的基因进行细调的和 精确控制的表达。在本发明中，将若干种启动子用于包括编码选择的 Fv的基因在内的构建体上。启动子包括，但不局限于以下启动子：deo， P1-P2，osmB，λPL，β-lac-U5，SRα5和CMV早期启动子。Deo 是双链DNA质粒，它在导入合适的大肠杆菌宿主之后，使得所述宿主 能够在组成型的大肠杆菌衍生的脱氧核糖核苷酸启动子deo P1-P2的 控制下表达编码希望的天然存在的多肽或多肽类似物的DNA。在美国专 利5,795,776(Fischer，1998年8月18日)和美国专利5,945, 304(Fischer，1999年8月31日)中提供了更全面的说明。
大肠杆菌osmB启动子的表达是由渗透压调控的。具有这种启动子 的载体可用于在大肠杆菌宿主中，在osmB启动子的控制下生产高水平 的多种重组真核和原核多肽。在美国专利5,795,776(Fischer，1998 年8月18日)和美国专利5,945,304(Fischer，1999年8月31 日)提供了更全面的说明。
λPL是由热不稳定性阻遏子cI857调控的λ噬菌体启动子。更全面 的讨论可以参见Hendrix等Lambda II，Cold Spring Harbor Laboratory(1983)。
β-lac-U5是lacZ启动子(Gilbert和Muller-Hill，PNAS (US)，58，2415(1967))。
SRα5是哺乳动物cDNA表达系统，它由猿猴病毒40(SV40)早期启 动子和1型人T-细胞白血病病毒长的末端重复的R-U5片段组成。该表 达系统在多种类型的细胞中的活性比SV40早期启动子高1或2个数量 级(Takebe等，Molecular and Cellular Biology，8，466-472 (1988))。
最优选将被称为CMV中期/早期增强子/启动子的人巨细胞病毒启 动子用于本发明，以便促进克隆DNA插入片段在哺乳动物细胞中的组 成型表达。CMV启动子披露于以下文献中：Schmidt，E.V.等，(1990) Mol.Cell.Biol.，10，4406，和美国专利5,168,062和5,385, 839。
在本发明的一种优选实施方案中，用于诱导原核细胞中的噬菌粒 系统的启动子选自deo，osmB，λPL，β-lac-U5，和CMV启动子。 在本发明的一种更优选的实施方案中，将β-lac-U启动子用于在大肠 杆菌中诱导噬菌粒系统。在最优选的实施方案中，使用CMV启动子。
在本发明的一种实施方案中，本发明的肽或多肽包括：(a)仅存在 于编码序列中但在成熟蛋白中缺乏的前导序列；(b)大小为135-145个 氨基酸的重链的可变区，包括进行修饰的4-12个氨基酸的第一高变 区；(c)≤20个氨基酸的间隔区，该间隔区可以缩短或消除；(d)同样 要进行下文所述的特殊修饰的轻链的可变区；(e)紧随其后的一个标记 序列，该序列任选不存在于最终可注射制品中。ScFv中的间隔片段的 长度通常大约为15个氨基酸残基，使两条可变区链(重链和轻链)能 折叠成有功能的Fv结构域。功能性Fv结构域保留了选择性和/或特异 性增强了的结合活性。
在另一种实施方案中，在上述(d)之后是一种标记序列或标记， 可将其用于偶联、诊断和/或鉴定目的。在本实施方案中，将所述标记 设计成连接本发明的肽或多肽和用于治疗或诊断靶细胞的试剂。
ScFv的间隔区可以是线性的或分支的，并且通常以多个结构式 (Gly4Ser)n形式由甘氨酸和丝氨酸残基组成，并且长度通常为总共 0-20个氨基酸，优选0-15个氨基酸，并且是线性的。通过根据需要 改变间隔片段长度，可以获得多种多聚体。在本发明的实施方案中， 所述间隔片段的长度为0-5个氨基酸。在另一种实施方案中，所述间 隔片段的长度小于3个氨基酸(详细说明见下文)。
下面是本发明scFv分子的氨基酸序列的例子：
         ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC

61    ATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTG
21   E  V  Q  L  V  E  S  G  G  G  V  V  R  P  G  G  S  L
121   AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGC
41     R  L  S  C  A  A  S  G  F  T  F  D  D  Y  G  M  S  W  V  R
181   CAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACA
61     Q  A  P  G  K  G  L  E  W  V  S  G  I  N  W  N  G  G  S  T
241   GGTTATGCAGACTCTGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCC
81     G  Y  A  D  S  V  K  G  R  F  T  I  S  R  D  N  A  K  N  S
301   CTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACCGGCCGGTGTATTACGTGGCAAGA
101    L  Y  L  Q  M  N  S  L  R  A  E  D  T  A  V  Y  Y  C  A  R
361   ATGAGGGCTCCTGTGATTTGGGCCCAAGTAACCCTGGTCACCGTGTCGAGAGTGGGAGGC
121   W  G  Q  G  T  L  V  T  V  S  R  G  G  G
421   GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACACAGGACCCTGCT
141    G  S  G  G  G  G  S  G  G  G  G  S  S  E  L  T  Q  D  P  A
481   GTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGC
161    V  S  V  A  L  G  Q  T  V  R  I  T  C  Q  G  D  S  L  R  S
541   TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCAGGACCAGGCCCCTTGTCTTGTCATCATGGGT
181    Y  Y  A  S  W  Y  Q  Q  K  P  G  Q  A  P  V  L  V  I  Y  G
601   AAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACA
201    K  N  N  R  P  S  G  I  P  D  R  F  S  G  S  S  S  G  N  T
661   GCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCC
221    A  S  L  T  I  T  G  A  Q  A  E  D  E  A  D  Y  Y  C  N  S
721   CGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
241    R  D  S  S  G  N  H  V  V  F  G  G  G  T  K  L  T  V  L  G
781   GCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAG
261    A  A  A
在前导序列下面加点划线。VH区是由粗体氨基酸序列编码的。这 种特定的克隆源于种系VH3-DP32；不过，每一个克隆的种系取决于其 具体来源(参见下文)。用方框圈起来的氨基酸序列编码VH-CDR3，所 有克隆的高变区都源于该文库。连接VH和VL区的间隔区，是由通过斜 体表示的氨基酸编码的柔性多肽。最后，示出了VL区。所有克隆中的 融合的VL片段都源于种系IGLV3SI的单个未突变过的V基因，在这里， 紧随其后的是c-myc标记，在它下面加波浪线。其完整的氨基酸序列 与SEQ ID NO：25相同。
首先由所述文库的提供者用未免疫过的人外周血淋巴细胞的重排 的V-基因，通过PCR制备VH片段的所有组成成分(来子49个种系) (被称为“幼稚组成成分”)。可以通过同源性测定(Blast检索)， 使用下列网站之一鉴定VH-序列的起源(种系)：
可以用若干方法中的一种优化抗体的结合特征。优化抗体以便获 得与原始前导化合物相比具有更高结合亲和力的方法是基于取代前导 化合物中的氨基酸残基，以便导入更高的可变性，或延长该序列。例 如，整个原有的VL区可以用来自不同抗体亚型的VL区取代。
优化结合亲和力的另一种方法是构建噬菌粒展示诱变文库。在噬 菌粒展示诱变文库中，合成了寡核苷酸，以便VH和VL CDR3内的核心 序列的每一种氨基酸序列分别用任何其他的氨基酸取代，优选以本领 域已知的保守方式取代。本发明提供了展示在噬菌体上的一套特殊的 抗体scFv，其中，所展示的抗体片段和可溶性抗体片段可以从具有相 同生物学活性的噬菌体毒粒中提取。
用于本发明的噬菌体展示文库是用未免疫过的人外周血淋巴细胞 构建的，并且用靶细胞表面上的以前未表征过的和未纯化过的抗原选 择所述Fv肽。在本文中，以前未表征过的和未纯化过的抗原，表示存 在于在进行本项研究之前没有通过生物化学或分子方法鉴定、表征、 分离或纯化过的细胞表面上的配体，并且它是通过观察到的与分离的 抗体片段的选择性和/或特异性结合在本研究中发现或预测的。
本发明的scFv表现出对靶细胞的增强了的结合力。所述增强了的 结合是针对特定表面标记的。特定表面标记是这样的分子，它能螯合 在细胞膜中，并且能够接触循环的识别分子。表面标记的存在，使得 人们能够通过本文所披露的生物淘选技术开发出噬菌体展示技术。在 本发明中，用特定的表面标记表征并区分各种细胞类型，并且用作各 种形式的Fvs的结合位点。可以根据其特有的表面标记区分各种造血 细胞类型。类似地，病变细胞或癌细胞所具有的表面标记是所述细胞 类型和阶段所特有的。
可以通过两种不同的生物淘选方法实现scFv克隆的筛选：
1.利用病变细胞或癌细胞作为靶细胞直接筛选，和
2.使用诸如处在第二种状态，例如激活的、兴奋的、修饰的、改 变的、或失调的状态的第一种，如正常细胞逐步选择，以便处在第二 种状态下的第一种细胞的结合位点包括一个基本上暴露的或展示的未 知配体。通过免疫交叉反应性，所得到的克隆在随后的淘选步骤或筛 选步骤之后可以选择性地和/或特异性地结合在第二种细胞上的新的 和未知的配体上。在经过进一步的任选扩增和随后的纯化之后，可以 由所述纯化的识别分子的识别位点构建导向分子，该分子对第二种细 胞上的未知配体具有选择性和/或特异性。
在本发明的一种实施方案中，所述第一种细胞可以是正常细胞， 所述第一种状态是非激活的状态，而第二种状态是激活的、兴奋的、 修饰的、改变的、或失调的状态。在所述逐步选择中的第二种细胞可 以是人类细胞。在本发明的一种优选实施方案中，在所述逐步选择中 的第二种细胞是病变细胞。在本发明的一种更优选的实施方案中，在 所述逐步选择中的第二种细胞是癌细胞，例如，但不限于癌、肉瘤、 白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胚细胞瘤、精原细胞瘤和黑素瘤。 在一种更优选的实施方案中，所述第二种细胞是白血病细胞。在一种 最优选的实施方案中，所述第二种细胞是AML细胞。
本发明的一种更优选的实施方案提供了一种肽或多肽，其中，所 述肽或多肽与第二种细胞上的配体的选择性和/或特异性结合，主要是 由第一高变区决定的。在另一种更优选的实施方案中，所述第一高变 区是具有选自SEQ ID NOs：8-24的氨基酸序列的CDR3。
在本发明的另一种实施方案中，本发明提供了由本发明的肽或多 肽结合的第二种细胞的配体。另一种实施方案提供了能识别并结合由 本发明的肽或多肽结合的配体的任何分子。
对癌细胞的增强了的结合，最有可能是由于相对在正常细胞中的 表达而言，所述配体在癌细胞中的超量表达和/或结合位点的暴露而导 致的。在本文中，术语配体的超量表达被定义为在正常情况下在特定 的细胞类型和/或细胞周期的特定阶段是沉默的基因的表达或其产 物，或一种基因的增加了的表达，该基因在特定细胞类型的正常的、 非恶性状况下是以基础水平表达的。
在本发明的一种更优选的实施方案中，所述生物淘选方法的靶细 胞包含在细胞悬浮液中。造血细胞是以悬浮液形式获得的，并且进行 生物淘选，包括将噬菌体文库与血细胞悬浮液混合，然后用若干种缓 冲液洗涤。从所述人类细胞中提取噬菌体，扩增，并且确定展示抗体 片段序列。
在本发明的另一种更优选的实施方案中，所述血细胞悬浮液包括 白血病细胞。在一种最优选的实施方案中，所述血细胞悬浮液包括AML 细胞。在本发明的另一种实施方案中，所述靶细胞源于分离的器官或 其部分。
在本发明的另一种实施方案中，所述靶细胞或所述第二种细胞源 于一种细胞系。可以对细胞系进行培养和操作，以便它们有助于确定 Fv克隆的结合特征。另外，可以将细胞系用于开发诊断试剂盒。
在一种优选实施方案中，所述细胞系是造血细胞系，例如，但不 局限于以下细胞系：Jurkat，Molt-4，HS-602，U937，TF-I， THP-1，KG-1，ML-2和HUT-78细胞系。
在本发明的一种优选实施方案中，将CDR3区构建、插入、连接或 融合在84个盒(SEQ ID NOs：30-113)中的任意一个内或任意一个上。 在一种更优选的实施方案中，将CDR3区构建、插入、连接或融合在49 个盒(SEQ ID NOs：30-32，35，37-39，41，43，45，46，48，51， 54，57，59-68，70，71，76-85，87，89-92，94，97，99，103，106， 112和113)中的任意一个内或任意一个上。在一种最优选的实施方案 中，将CDR3区构建、插入、连接或融合在SEQ ID NOs：61的盒的 C-末端，或与它具有至少90％序列相似性的上述序列中的任意一个上。
在一种实施方案中，所述盒的氨基酸序列表面上是固定的，而所 述取代的、插入的、或附着的序列可以是高度可变的。所述盒可以由 若干个结构域组成，其中的每一个结构域包括一种对最终构建体重要 的功能。本发明的一种具体实施方案的盒从N-末端开始包括构架区 1(FRI)，CDRI，构架区2(FR2)，CDR2，和构架区3(FR3)。
在本发明的一种的实施方案中，可以取代所述盒内的不同的区。 例如，可以通过非保守性或优选保守性氨基酸取代，取代或修饰所述 盒内的CDR2和CDR1高变区。更具体地讲，选自SEQ ID NOs：30-113 或其片段的连续氨基酸盒的CDR2和CDR1区，可分别用SEQ ID NOs： 115和114取代。更具体地讲，选自SEQ ID NOs：30-32，35，37- 39，41，43，45，46，48，51，54，57，59-68，70，71，76-85，87， 89-92，94，97，99，103，106，112和113或其片段的连续氨基酸 盒的CDR2和CDR1区，可分别用SEQ DD NOs：115和114取代。
在本发明的一种优选实施方案中，所述肽或多肽包括一个重链和 一个轻链，并且每一条链包括第一、第二和第三高变区，它们分别是 CDR3、CDR2和CDR1区。所述结合选择性和特异性特别是由一条链的 CDR3区决定的，可能是由轻链的CDR3区决定的，并且优选是由重链 的CDR3区决定的，并且其次是由轻链的CDR2和CDR1区决定的，并且 优选由重链的CDR2和CDR1区决定。所述结合选择性和特异性还受到 位于所述第一、第二和/或第三高变区侧翼的上游或下游区的辅助影 响。
在一种优选实施方案中，所述肽或多肽的CDR3区具有选自SEQ ID NOs：8-24的氨基酸序列。
在一种更优选的实施方案中，所述重链的CDR3区具有选自SEQ ID NOs：8-24的氨基酸序列，CDR2具有与SEQ ID NO：115相同的氨基 酸序列，而CDR1区具有与SEQ ID NO：114相同的氨基酸序列。
在一种最优选的实施方案中，CDR3区具有与SEQ ID NOs：8相 同的氨基酸序列。
除了重链和轻链之外，Fv包括一个具有0-20个氨基酸残基的柔性 间隔片段。该间隔片段可以是分支链或直链。该间隔片段的两种可能 的序列与SEQ ID NOs：123和124相同。
本发明的一种优选实施方案是具有与SEQ ID NO：8相同的CDR3 序列和与SEQ ID NO：25相同的完整scFv序列的scFv。
本发明的另一种优选实施方案是具有与SEQ ID NO：20相同的CDR3 序列和与SEQ ID NO：203相同的完整scFv序列的scFv。
本发明的一种最优选的实施方案中，CDR3，CDR2和CDR1区分别 具有氨基酸序列SEQ ID NOs：8，115和114。
在本发明的一种实施方案中，Fv肽包括可变重链的CDR1和CDR2 区，它本身所包括的一个盒具有选自SEQ ID NOs：30-113的氨基酸 序列；CDR3区，优选可变重链的CDR3区，它具有选自SEQ ID NO：8-24 的氨基酸序列；位于CDR3区侧翼的上游区，它具有SEQ ID NO：117 的氨基酸序列；位于CDR3区侧翼的下游区，它具有SEQ ID NO：116 的氨基酸序列；具有SEQ ID NO：123或124的0-20个氨基酸残基 的间隔片段；序列为SEQ ID NO：7的可变轻链区。
类似地，在另一种实施方案中，位于CDR2区侧翼的上游区具有SEQ ID NO：119的氨基酸序列，位于CDR2区侧翼的下游区具有SEQ ID NO： 118的氨基酸序列；位于CDR1区侧翼的上游区具有SEQ ID NO：121 的氨基酸序列；而位于CDR1区侧翼的下游区具有SEQ ID NO：120的 氨基酸序列。
本发明的一种优选实施方案提供了一种肽或多肽，其中，所述第 二和第三高变区分别是CDR2和CDR1高变区，并且，其中的CDR3氨基 酸序列是SEQ ID NO：8，其中的CDR2氨基酸序列是SEQ ID NO：115， 其中的CDR1氨基酸序列是SEQ ID NO：114，其中的位于CDR3区侧 翼的上游区具有SEQ ID NO：117的氨基酸序列，其中的位于CDR3区侧 翼的下游区具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列，其中的位于CDR2区侧 翼的上游区具有SEQ ID NO：119的氨基酸序列，其中的位于CDR2区侧 翼的下游区具有SEQ ID NO：118的氨基酸序列，其中的位于CDR1区侧 翼的上游区具有SEQ ID NO：121的氨基酸序列，而其中的位于CDR1 区侧翼的下游区具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列。
本发明的另一种优选实施方案提供了一种Fv分子，它包括具有第 一、第二和第三高变区的第一条链，和具有第一、第二和第三高变区 的第二条链，其中，第一条链的高变区之一具有选自SEQ ID NO：8-24 的氨基酸序列，并且，其中第二条链的高变区之一具有选自SEQ ID NO： 1-6和125-202的氨基酸序列，并且，其中的第一、第二和第三高变 区分别是CDR3，CDR2和CDR1区，并且，其中的Fv是scFv或dsFv， 并且选择性地具有一个或多个标记。
本发明的另一种实施方案提供了一种肽或多肽，(i)其中，所述第 一条链和第二条链各自包括选自SEQ ID NOs：8-24的第一高变区； 或(ii)其中，所述第一条链和第二条链的第一高变区选自SEQ ID NOs： 8-24并与之相同；或(iii)其中，所述第一条链的第一高变区选自SEQ ID NOs：8-24，而所述第二条链的第一高变区选自SEQ ID NOs：1-6 和125-202；或(iv)其中，所述第一条链的第一高变区选自SEQ ID NOs： 1-6和125-202，而所述第二条链的第一高变区选自SEQ ID NOs：8- 24。
另一种实施方案提供了本发明的肽或多肽，其中，所述第一条链 的第二和第三高变区分别是SEQ ID NOs：114和115。
对于本文所披露和详细说明的所有≤25个氨基酸残基的氨基酸序 列(例如，CDR区，CDR侧翼区)来说，可以被理解为和视为本发明的 另一种实施方案的是，所述氨基酸序列在其范围内包括一个或两个氨 基酸取代，并且所述取代优选是保守性氨基酸取代。对于本文所披露 和详细说明的所有＞25个氨基酸残基的氨基酸序列来说，可以被理解 为和视为本发明的另一种实施方案的是，所述氨基酸序列在其范围内 包括与原始序列具有≥90％序列相似性的氨基酸序列(Altschul等， Nucleic Acids Res.，25，3389-3402(1997))。相似或同源氨基 酸被定义为具有相似特性的不相同，例如，酸性、碱性、芳族、大小、 带正电荷或带负电荷、极性、非极性的氨基酸。
百分氨基酸相似性或同源性或序列相似性是通过比较两种不同肽 或多肽的氨基酸序列确定的。对两种序列进行比对，通常通过使用为 此而设计的多种计算机程序中的一种进行比对，并且，比较每一个位 置上的氨基酸残基。然后确定氨基酸相同性或同源性。然后应用一种 算法确定百分氨基酸相似性。通常，优选比较氨基酸序列，因为这大 大提高了检测肽、多肽或蛋白分子之间的精密关系的灵敏度。蛋白比 较，要考虑保守性氨基酸取代的存在，而如果不相同的氨基酸具有类 似的物理和/或化学特性的话，错配可能导致正的得分(Altschul等， Nucleic Acids Res.，25，3389-3402(1997))。
在本发明的一种实施方案中，轻链和重链各自的三个高变区可以 在两条链之间相互交换，并且在所述链内和/或链之间的三个高变位点 之间相互交换。
本领域普通技术人员可以理解的是，验证本发明肽或多肽的特异 性和/或选择性结合必须使用合适的阴性对照。合适的阴性对照可以是 肽或多肽，其氨基酸序列几乎与本发明的肽或多肽相同，唯一的差别 是高变CDR3区。另一种合适的阴性对照可以是与本发明的肽或多肽具 有相同的大小和/或总体三维结构，但是具有完全不相关的氨基酸序列 的肽或多肽。另一种合适的阴性对照可以是与本发明的肽或多肽相比 具有完全不同的物理和化学特征的肽或多肽。用于开发本发明的阴性 对照被命名为N14，它具有与SEQ ID NO：28相同的CDR3序列，和 C181，它具有与SEQ ID NO：29相同的CDR3序列。不过，其他的阴 性对照可能同样适用。
另一种实施方案提供了编码本发明的Fv肽或多肽的核酸分子，优 选DNA分子。
在本发明的一种优选实施方案中，为了优化Fv的选择性结合，可 以将赋予Fv的主要结合选择性和/或特异性的CDR3序列转移到任何其 他的重链种系中。更具体地讲，可将其转移到84种可能的重链种系中 的一个上。这84个种系(SEQ ID NOs：30-113)包括(a)其中所称的 噬菌体克隆是原始分离的种系，(b)在所述噬菌体展示文库中提供的48 种其他的种系，和(c)在本发明中申明的35种其他种系(Tomlinson 等，J.Mol.Biol.，227(3)：776-798(1992))。CDR3区的局部 线性或三维环境与CDR3区本身一致，可能在引导或促进正确的CDR3 结合方面发挥作用。例如，本发明还包括具有SEQ ID NOs：8-24， 125所述的任何CDR3序列的肽，并且源于49种种系序列的任意一种 (SEQ ID NOs：3032，35，37-39，41，43，45，46，48，51，54， 57，59-68，70，71，76-85，87，89-92，94，97，99，103，106， 112和113)。
种系DP-32是本发明若干种克隆的盒。该种系的C-末端业已用一 种共有序列取代，以便有利于噬菌体展示文库制备。SEQ ID NO：61 的羧基末端氨基酸业已被SEQ ID NO：122的7个氨基酸序列所取代。
本发明的Fvs的CDR3区可以包括能特异性结合AML细胞的核心序 列Arg/Gly/Lys Phe Pro。在表2中示出了所述CDR3区的八种例子。尽管 所述基序在每一种情况下与CDR3区的三个N-末端氨基酸残基吻合，它 还可位于CDR3区的其他部位。另外，所述基序是被用于建造或构建更 大的结合或导向或识别分子的一部分的锚定或结合区或被单独用作导 向载体的结合基序。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种结合基序，它包括氨 基酸序列R1-X Phe Pro-R2，其中，R1和R2各自包括0-15，优选1- 9个氨基酸残基，并且，其中的X是Arg，Gly或Lys。最优选的是， CDR3包括氨基酸序列R1-X Phe Pro-R2，其中，R1和R2各自包括0- 15个氨基酸残基，并且，其中的X是Arg，Gly或Lys。
在本发明的肽或多肽的另一种优选实施方案中，可以在所述肽的 C-末端或N-末端添加1-1000个氨基酸，而所述肽保持了它的生物学 活性。在本发明的一种优选实施方案中，可以在所述肽或多肽的C-末 端或N-末端添加150-500个氨基酸，而所述肽保留了它的生物学活 性。在本发明的一种优选实施方案中，可以在所述肽或多肽的C-末端 或N-末端添800-1000个氨基酸，而所述肽或多肽保留了它的生物 学活性。
延长所述核心氨基酸序列的一种例子是通过用一种前导化合物作 为Ig的核心建造完整大小的免疫球蛋白Ig，例如，所述完整大小的 Ig可能属于免疫球蛋白类型，它可以通过补体或细胞裂解活性的激活 诱导内源细胞裂解活性(例如，IgG1，IgG2或IgG3)。所述完整大 小的Ig可能属于具有强力结合抗体(例如IgG4)的免疫球蛋白类型。 在结合时，所述完整大小的Ig能够以多种方式中的一种或多种起作 用，例如，通过作为身体防御机制的标志启动免疫反应，传导细胞内 细胞信号，或导致对靶细胞的破坏。
本发明的一种优选实施方案提供了作为重组多肽表达的，并且是 在真核细胞系统中生产的Ig分子。在本发明的一种优选实施方案中， 所述Ig多肽是IgG多肽，并且它是在哺乳动物细胞系统中生产的。在 一种更优选的实施方案中，所述哺乳动物细胞系统包括CMV启动子。
在本发明的一种优选实施方案中，所述IgG分子包括位于轻链和 重链上的CDR3，CDR2和CDR1高变区。在本发明的一种更优选的实 施方案中，所述Fv分子包括分别具有SEQ ID NOs：8，115和114 的CDR3，CDR2和CDR1区。所述CDR3，CDR2和CDR1区可以是所 述重链的和轻链的。
本发明的另一种优选实施方案提供了具有与SEQ ID NO：27相同 序列的轻链和与SEQ ID NO：26相同的序列的重链，或与它们具有至 少90％的序列相似性的重链和轻链的IgG分子。在本发明的一种最优选 的实施方案中，IgG的两个重链是相同的，而IgG的两条轻链是相同 的。
在另一种实施方案中，本发明的肽被构建成能折叠成多价Fv形 式。
本发明提供了包括scFv分子的Y1或Y17肽或多肽。在本文中， scFv被定义为由人抗体的重链可变区和人抗体的轻链可变区组成的分 子，所述抗体可以相同或不同，并且，其中重链的可变区与轻链的可 变区结合、连接、融合或共价附着或缔合。
Y1和Y17 scFv构建体可以是scFv分子的多聚体(例如，二聚体、 三聚体和四聚体等)，它整合了Y1或Y17抗体的一个或多个高变结构 域。所有scFv衍生的构建体和片段都保留了增强的结合特征，以便相 对其他细胞而言，更有利于选择性地和/或特异性地结合靶细胞。所述 结合选择性和/或特异性主要是由高变区决定的。
轻链和重链可变区内的高变环被定义为互补决定区(CDR)。在重 链和轻链内各自具有CDR1，CDR2和CDR3区。其中变化程度最高的是 重链的CDR3区。CDR3区被认为是Ig分子的最暴露的区，并且正如本 文所披露的，它是主要决定所观察到的选择性和/或特异性结合特征的 位点。
可以构建本发明的Y1和Y17肽，以便折叠成多价Fv形式。构建 Y1和Y17多聚体形式，以便改善结合亲和力和特异性，并且延长在血 液中的半衰期。
其他研究人员业已生产出了多价形式的scFv。一种方法是用接头 连接两个scFvs。另一种方法包括在两个scFvs之间使用二硫键进行 连接。用于生产二聚体或三聚体Fv的最简单的方法披露于以下文献 中：Holliger等，PNAS，90，6444-6448(1993)和A.Kortt，等， Protein Eng，10，423-433(1997)。设计了一种这样的方法，以便 通过添加FOS序列和JUN蛋白区，在scFv的C-末端之间形成亮氨酸 拉链而制备二聚体。Kostelny SA等，J Immunol.1992 Mar 1；148 (5)：1547-53；De Kruif J等，J Biol Chem.1996 Mar 29；271 (13)：7630-4。设计了另一种方法，以便通过在scFv的C-末端添加 链亲和素编码序列制备四聚体。链亲和素由四个亚基组成，因此，当 scFv-链亲和素折叠时，四个亚基容纳它本身，以便形成四聚体。 Kipriyanov SM等，Hum Antibodies Hybridomas，1995；6(3)： 93-101。在另一种方法中，为了制备二聚体、三聚体和四聚体，在感 兴趣的蛋白内导入一个游离半胱氨酸。用具有不同数量(2-4)马来酰 亚胺基团的基于肽的交联接头交联感兴趣的蛋白和所述游离半胱氨 酸。Cochran JR等，Immunity，2000 Mar；12(3)：241-50。
在该系统中，设计能展示scFvs的噬菌体文库(如上文所述)， 它能折叠成一种抗体的Fv区的单价形式。另外，同样如上文所述，所 述构建体适合细菌表达。遗传工程方法生产的scFvs，包括通过连续编 码的15个氨基酸柔性肽间隔片段连接的重链和轻链可变区。优选的间 隔片段为(Gly4Ser)3。该间隔片段的长度及其氨基酸组成提供了一种 不大的间隔片段，它使得VH和VL区能折叠成有功能的Fv结构域，它提 供了对其靶的有效结合能力。
本发明涉及通过本领域任何已知方法制备的Y1和Y17多聚体。生 产多聚体，特别是二聚体的一种优选方法利用半胱氨酸残基在两个单 体之间形成二硫键。在本实施方案中，二聚体是通过在scFvs的羧基 末端添加半胱氨酸形成的(被称为Y1-cys scFv或Y1二聚体)，以便 有利于二聚体的形成。在制备所述DNA构建体(参见实施例2D和6D) 并用于转染之后，Y1二聚体在生产载体中表达，并且在体外重新折叠。 通过SDS-PAGE、HPLC、和FACS分析所述蛋白。进行所述抗体的两升 的批量发酵。在大肠杆菌菌株BL21中表达Y1-cys之后，在精氨酸中 重新折叠。在重新折叠之后，通过Q-琼脂糖和凝胶过滤(sephadex 75) 进行透析和纯化。通过SDS-PAGE(非还原性)和凝胶过滤检测到了两 个峰。分别收集所述两个峰，并且通过FACS分析。通过FACS检查与 Jurkat细胞结合的单体和二聚体。对于相同水平的染色来说，二聚体 的结合只需要单体抗体数量的1/100，这表明所述二聚体具有更高的抗 体亲抗原性。确定用于二聚体重新折叠的条件，并且在透析、层析、 和凝胶过滤步骤之后，生产出含有＞90％的二聚体(mg量)的材料。在 氧化条件下，通过凝胶过滤和SDS-PAGE分析表征了纯化的二聚体。通 过放射性受体分析，ELISA和FACS分析证实了二聚体的结合能力。
CONY1 scF抗体片段源于Y1 scFV。除去编码Y1 scFv的myc标 记的DNA序列，并且用编码赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸(KAK)的合成寡核苷 酸DNA序列取代。
为了比较scFv单体(又称为CONY1)与Y1二聚体的结合，在体 外用KG-1细胞进行结合竞争实验。另外，所述实验还比较了完整Y1 IgG 与scFv Y1单体的结合。为了进行本研究，用生物素标记Y1 IgG。本 研究发现，Y1 IgG能与IgG Y1-生物素竞争。不相关的人IgG不能与 标记过的Y1 IgG竞争。Y1 scFvs(5μg和10μg)能部分与Y1 IgG- 生物素(50ng)竞争。还证实了lng的IgGY1-FITC与KG-1细胞(无血 清)的结合程度与1μg scFv-FITC的结合程度相同，不过，在有血清 的条件下，大部分Y1 IgG结合被“封闭”。本研究还证实，Y1二聚 体的结合至少比scFV单体的结合能力高20倍，这一结果是通过放射 性受体分析，ELISA或FACS分析证实的。
在另一种实施方案中，除了半胱氨酸之外，在所述羧基末端添加 赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸(被称为YI-cys-kak scFv)。该scFv构建体 的氨基酸序列在下面再现。
     1 MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ
     APGKGLEWVS  GINWNGGSTG  60
     61 YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARM
     RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG   120
     121 SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY
     YASWYQQKPG  QAPVLVlYGK   180
     181 NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR
     DSSGNHVVFG  GGTKLTVLGG   240
     241 GGCKAK
     181 NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR
     DSSGNHVVFG  GGTKLTVLGG    240
     241 GGCKAK
Y1-cys-kak是在细菌中在λ-pL载体中生产的。在λ-pL载体中 的表达是通过将温度提高到42℃诱导的。由诱导过的培养物获得包含 体，并且通过水溶液半纯化除去不希望的可溶性蛋白。通过DTT还原， 将所述包含体溶解在胍中，并且在体外，在基于精氨酸/OX-谷胱甘肽 的溶液中重新折叠。在重新折叠之后，对蛋白进行透析，并且通过切 向流过滤，浓缩成含有尿素/磷酸缓冲液的缓冲液。通过在SP-柱中通 过离子层析纯化和浓缩所述蛋白。
为了获得CONY1 scFv和Y1-cys-kak scFv在大肠杆菌中的更高 水平的表达，我们在scFv构建体的N-末端的2号位置导入了编码丙氨 酸残基的氨基酸。通过这种新修饰过的构建体，我们获得了4倍水平 的表达。
进行ELISA分析，以便证实单体(CONY1 scFv-也被称为Y1-kak) 和二聚体Y1-kak(半胱氨酸二聚体)对源于血小板的抗原 GPIb(glycocalicin)的结合的差别。将多克隆抗单链抗体和/或新型 抗VL(源于兔)和抗兔HRP用于检测与GPIb的结合。二聚体比单体的 活性高大约20-100倍。例如，为了达到0.8的OD单位，将12.8mg/ml 的单体用于与仅0.1mg/ml的二聚体进行比较。参见图12。
通过SDS-page电泳、凝胶过滤层析、ELISA、放射性受体结合和 FACS表征所述二聚体。由于抗体亲抗原性作用，二聚体的表观亲和力 比单体高。通过ELISA证实了对glycocalicin的这种作用，通过FAGS 证实了对KG-1细胞的作用，并且通过在放射性受体分析中的竞争证实 了这种作用。
在重新折叠和通过Superdex 75凝胶过滤柱纯化之后进行HPLC， 以便对所述二聚体的特征进行分析。在图10中，Y1-cys-kak(二聚体) 是位于左侧的第一个峰(大约10.8分钟)，而随后的峰是单体(大约 12分钟)。根据在相同柱上处理的蛋白大小标记，所述二聚体大约为 52kDa，而所述单体为26kDa。通过改变重新折叠的条件(重新折叠缓 冲液中氧化剂的浓度和蛋白的浓度)，可以改变二聚体和单体之间的 平衡。通过在superdex 75柱上层析，分离所述二聚体和单体。
在图11中，示出了具有二聚体和单体混合群体的凝胶。在还原形 式下，由于两个单体之间的还原观察到了单体，并且在非还原形式下， 观察到了两个群体(正如在凝胶过滤实验中所看到的)，单体级份大 约为30kDa，二聚体级份大约为60kDa。
另外，对KG-1细胞进行的FACS结合分析证实，在进行二步骤或 三步骤结合分析时，二聚体比单体更敏感。直接通过FITC标记的二聚 体表现出略好于单体(使用少10倍的材料)。在将二聚体用作竞争剂 时，对KG-1细胞进行的放射性受体分析表明，二聚体的效率比单体高 30倍。
改变间隔片段的长度是生产二聚体、三聚体和四聚体(在本领域 中通常分别被称为双抗体、三抗体和四抗体)的另一种优选方法。二 聚体是在连接scFv的两个可变链的间隔片段总体上缩短的条件下形成 的。这种缩短了的间隔片段，抑制了来自相同分子的两个可变链折叠 成有功能的Fv结构域。相反，迫使所述结构域与另一个分子的互补结 构域配对，以便形成两个结合结构域。在一种优选方法中，将仅有5 个氨基酸(Gly4Ser)的间隔片段用于双抗体构建。这种二聚体可以由两 个相同的scFvs形成，或者由不同的scFvs的群体组成，并且保留了 亲代scFv(s)的选择性和/或特异性增强了的活性，和/或具有提高 了的结合强度或亲和力。
在一种类似形式中，三抗体是在连接scFv的两个可变链的间隔片 段总体上缩短到少于5个氨基酸残基时形成的，避免了来自相同分子 的两个可变链折叠成有功能的Fv结构域。相反，三个独立的scFv缔 合形成三聚体。在一种优选方法中，三抗体是通过完全除去该柔性间 隔片段获得的。所述三抗体可以由三个相同的scFvs构成，或由两个 或三个不同的scFvs群构成，并且保留了亲代scFv(s)的选择性和/ 或特异性增强了的活性，和/或具有提高了的结合强度或亲和力。
四抗体是在连接scFv的两个可变链的间隔片段总体上缩短到少于 5个氨基酸残基的条件下以类似方式形成的，避免了来自相同分子的两 个可变链折叠成有功能的Fv结构域。相反，四个独立的Fv分子缔合 形成四聚体。四抗体可以由四个相同的scFvs形成，或者由来自不同 的scFvs群的1-4个独立的单位形成，并且应当保留亲代scFv(s) 的选择性和/或特异性增强了的结合活性，和/或具有提高了的结合强 度或亲和力。
三抗体或四抗体是否是在间隔片段总体上小于5个氨基酸残基长 度的条件下形成，取决于混合物中特定scFv(s)的氨基酸序列和反应 条件。
在一种优选方法中，四聚体是通过生物素/链亲和素缔合形成的。 制备了一种可以用生物素酶促标记的新型发酵构建体(本文称之为Y1- 生物标记或Y1-B)。将作为BirA酶的底物的序列添加在Y1 C-末端。 所述BirA将生物素添加在该序列内的赖氨酸残基上。在大肠杆菌内克 隆并表达Y1-生物标记。分离所述包含体材料，并且重新折叠。所述折 叠蛋白的纯度＞95％，并且从1升培养物中获得了＞100mg(小规模， 非优化条件)。发现这种形式的分子量类似于scFv的根据HPLC、 SDS-PAGE和质谱分析的分子量。发现Y1-生物标记是用于FACS分析的 最稳定的试剂。不过，当在有血清的条件下检查与KG-1细胞结合的Y1- 生物标记时，为了获得与没有血清条件下的相当的结合需要更高的浓 度(高出10倍)。不过，该构建体具有特异性生物素化的优点，其中， 所述分子的结合位点保持完整。另外，每一个分子仅通过一种生物素 标记-每一个分子在其羧基末端接受一个生物素。
对一个生物素/分子在理想位点上的有限标记，可以生产具有链亲 和素的四聚体。所述四聚体是通过与链亲和素-PE一起温育Y1-B形成 的。
FACS分析表明，在没有血清的条件下，通过Y1-生物标记和链亲 和素-PE制备的四聚体比Y1 scFv单体灵敏100-1000倍。具有链亲和 素-PE的Y1-生物标记四聚体表现出对Y1-反应性细胞系(KG-1)之一的 特异性结合。该反应与本底结合的差别是很大的，并且具有检测少量 受体的高的灵敏度。用Y1-SAV四聚体对正常全血进行FACS评估发现， 不存在高反应性群体。单核细胞和粒细胞在较小程度上是阳性的。在 存在阳性结果的细胞系内，如KG-1细胞，所述四聚体的反应性至少高 出100倍。
然后，将所述四聚体与细胞样品一起温育。低剂量的Y1四聚体(5 ng)能很好地结合所述细胞系(KG-1)，与以前用其他Y1抗体形式观察 到的结果相比，产生了高出10-20倍的反应。在用各种剂量的四聚体 检查阴性细胞系时，观察到了微弱的反应。
本发明的一种实施方案提供了用于鉴定能结合第一种和第二种细 胞上的未知免疫交叉反应结合位点的导向分子的方法，该方法包括(a) 在第一种靶细胞上进行的一个或多个生物淘选步骤，所述靶细胞处于 第二种状态而不是第一种状态，基本上暴露或展示包括一个未知配体 的结合位点，以便生产第一个识别分子群；(b)始于步骤(a)所得到 的识别分子库的、随后的生物淘选和/或选择步骤，所述步骤是在第二 种细胞上进行的，第二种细胞展示了包括一个与所述第一种细胞的未 知配体具有免疫交叉反应性的未知配体的结合位点，以便生产第二个 识别分子群；(c)扩增并纯化步骤(b)的第二个识别分子群；和(d) 由步骤(c)的纯化的识别分子的识别位点构建包括导向分子的肽或多 肽，所述导向分子对所述第二种细胞上的未知配体具有选择性和/或特 异性。
一种优选实施方案提供的第一种细胞是正常细胞，所述第一种状 态是非激活的状态，而所述第二种状态是激活的、兴奋的、修饰的、 改变的或失调的状态。在一种更优选的实施方案中，所述第二种细胞 是病变细胞。在一种更优选的实施方案中，所述病变细胞是癌细胞。 癌细胞可以是，但不局限于癌、肉瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓 瘤、胚细胞瘤、精原细胞瘤、和黑素瘤。在一种更优选的实施方案中， 所述癌细胞是白血病细胞。在一种最优选的实施方案中，所述白血病 细胞是AML细胞。
本发明的一种实施方案提供了将任选与一种药用试剂缔合或附 着、偶联、组合、连接或融合的肽或多肽用于生产药物的用途。在一 种优选实施方案中，所述药物具有抗病变细胞的活性。在一种更优选 的实施方案中，所述活性是抗癌细胞的活性。所述癌细胞是，但不局 限于癌、肉瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胚细胞瘤、精原细 胞瘤、和黑素瘤。在一种更优选的实施方案中，所述癌细胞是白血病 细胞。在一种最优选的实施方案中，所述白血病细胞是AML细胞。
本发明的一种实施方案提供了一种药物组合物，它包括不同单体 scFvs的混合物和/或由不同scFvs构建的双抗体、三抗体或四抗体的 混合物。
另一种实施方案提供了将与一种药用试剂缔合或附着、偶联、组 合、连接或融合的本发明的肽或多肽用于生产药物的用途。所述药物 可以具有治疗病变细胞的活性，更优选特异性治疗癌细胞。所述癌细 胞可以是，但不局限于癌、肉瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、 胚细胞瘤、精原细胞瘤、和黑素瘤。在一种更优选的实施方案中，所 述药物具有抗白血病细胞的活性。在一种最优选的实施方案中，所述 药物具有治疗AML细胞的活性。所述药物抗所述细胞的活性，可以导 致癌性生长的延缓，完全抑制所有生长，或杀伤癌细胞。
在本发明的一种实施方案中，所述药物或药物组合物的活性是抑 制细胞生长。
可以将本发明的肽或多肽用于制备组合物，优选制备药物组合 物，以便用于抑制癌细胞，优选白血病细胞，最优选AML细胞的生长。 在本发明的一种优选实施方案中，可将本发明的肽或多肽用于制备用 来抑制癌细胞生长的组合物，所述组合物包括至少一种对所述癌细胞 具有药物配体选择性和/或特异性的化合物。
本发明的肽或多肽可以单独给患者施用，或者作为一种药物或药 物组合物与药物有效量的药用试剂、药用有效的载体，以及选择性地 与佐剂缔合、偶联、连接、或融合使用。所述药物组合物可以包括蛋 白、稀释剂、防腐剂和抗氧化剂(参见Osol等(eds.)，Remington′s Pharmaceutical Sciences(16th ed)，Mack Publishing Company， (1980))。
在另一种实施方案中，所述药用试剂是通过肽键与本发明的肽或 多肽连接的抗体或其片段。
在一种优选实施方案中，所述毒素是，例如gelonin，假单胞菌 属外毒素(PE)，PE40，PE38，白喉毒素，蓖麻毒蛋白，或其修饰物 或衍生物。
在一种优选实施方案中，所使用的放射性同位素包括可用于定位 和/或治疗的γ射线发射体，正电子发射体和x-光发射体，以及可用于 治疗的β射线发射体和α射线发射体。
在本发明的一种具体实施方案中，所述治疗同位素选自111铟，113 铟，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲，165铥，167铥，168 铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇，213铋，77溴，18氟， 95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓等。
在本发明的另一种实施方案中，所述抗癌剂选自阿霉素，阿得里 亚霉素，顺铂，紫杉酚，加利车霉素，长春新碱，阿糖胞苷(Ara-C)， 环磷酰胺，强的松，柔红霉素，伊达比星，氟达拉宾，苯丁酸氮芥， 干扰素α，羟基脲，替莫唑胺，沙利度胺和博来霉素，及其衍生物。
本发明的一种实施方案提供了抑制癌细胞生长的方法，该方法包 括让所述癌细胞与一定量的本发明的肽或多肽接触。在一种优选实施 方案中，所述癌细胞可以是，但不局限于癌、肉瘤、白血病、腺瘤、 淋巴瘤、骨髓瘤、胚细胞瘤、精原细胞瘤、和黑素瘤。在一种更优选 的实施方案中，所述癌细胞是白血病细胞。在一种最优选的实施方案 中，所述白血病细胞是AML细胞。本发明的一种实施方案可以对所述 患者进行体内治疗和离体的治疗。本发明的一种更优选的实施方案可 以对自体骨髓进行来自体内的净化，以便除去异常干细胞。
在本发明的一种更优选的实施方案中，白血病患者的血液可以通 过一种系统进行离体循环，该系统包括与一种抗癌剂偶联的本发明的 肽或多肽。在除去结合的细胞和未结合的抗癌剂之后，可以将所述血 细胞重新导入患者体内。另外，白血病患者的血液可以通过一种系统 进行来离体循环，该系统包括连接在一种固相上的本发明的肽或多 肽。可以将通过该系统的细胞并且没有与连接在固相上的本发明的肽 或多肽结合的细胞重新导入患者体内。
在本发明的另一种优选实施方案中，将所述肽或多肽用于来自体 内的自体骨髓悬浮液中，以便在移植之前除去异常干细胞。异常干细 胞的净化可以通过让所述悬浮液通过一种固体支持物(例如，但不局 限于磁珠和亲和柱)进行，在所述固体支持物上结合了本发明的肽或 多肽(即导向分子)、构建体、片段、构建体的片段或片段的构建体。 然后可以将由此净化过的、来自体内的骨髓用于自身骨髓移植。该优 选实施方案基于在本发明中对噬菌粒克隆(Y1)的鉴定，该克隆能结 合从白血病患者骨髓中释放的干细胞，但不能结合从健康供体骨髓中 释放的干细胞。类似地，Y1噬菌粒克隆能结合通过FACS分析确定为异 常的胚细胞，并且能结合白血病细胞。
母细胞在本文中被定义为原代细胞，它是哺乳动物体内所有循环 细胞的前体。由于其祖细胞特征，胚细胞不以显著的数量存在于成年 生物的循环系统中。在没有外源刺激的情况下，循环胚细胞的存在， 可能表明有恶性肿瘤。例如，造血系统的恶性肿瘤，并且，其随后的 消失，可能表明恶性肿瘤疾病的减轻。
在本发明的另一种实施方案中，所述药物组合物被用于预防目 的。
在一种优选实施方案中，将本发明的两种或两种以上肽或多肽组 合成一种混合物。
在本文中，混合物被定义为包含在一种制剂内的不同类型的两种 或两种以上的分子或颗粒。所述不同类型的分子形成共价键或非共价 化学键。
在本发明的一种实施方案中，本发明的肽或多肽与一种药用试剂 连接、融合或偶联。
在本发明的另一种实施方案中，所述肽和药用试剂之间的连接是 直接连接。在本文中，两个或两个分子之间的直接连接是通过所述分 子的元件或元件组之间的化学键获得的。例如，所述化学键可以是离 子键、共价键、疏水键、亲水键、静电键或氢键。所述键可选自，但 不局限于胺、羧基、酰胺、羟基、肽和二硫键。所述直接连接可优选 蛋白酶抗性键。
在另一种实施方案中，所述肽和药用试剂之间的连接受一种接头 化合物的影响。在本说明书和权利要求书中，接头化合物被定义为将 两个或两个以上部分连接在一起的化合物。所述接头可以是直链的或 支链的。分支接头化合物可以由双分支、三分支或四分支或更多分支 的化合物组成。所述接头化合物可以是，但不局限于二羧酸，马来酰 亚胺酰肼，PDPH，羧酸酰肼和小肽。其他接头化合物的例子包括：二 羧酸，如琥珀酸，戊二酸和己二酸；马来酰亚胺酰肼，如N-[ε-马来 酰亚胺己酸]酰肼，4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基酰肼和N- [κ-马来酰亚胺十一烷酸]酰肼；PDPH接头，如与巯基反应性蛋白偶 联的(3-[2-吡啶基二硫]丙酰肼)。选自2-5个碳原子的羧酸酰肼；和 使用诸如抗癌药物阿霉素的游离糖和scFv之间的小的肽接头直接连 接。小肽包括，但不局限于AU1，AU5，BTag，c-myc，FLAG， Glu-Glu，HA，His6，HSV，HTTPHH，IRS，KT3，蛋白C，S·Tag， T7，V5，VSV-G，和KAK Tag。
可以用任何已知方法施用本发明的肽和多肽，如静脉内、肌内、 皮下、局部、气管内、鞘内、腹膜内、淋巴内、鼻内、舌下、口腔、 直肠、阴道、呼吸道、颊、真皮内、经皮或胸膜内。
对于静脉内施用来说，所述制剂优选制备成使给患者施用的剂量 是从大约0.1mg-大约1000mg所需组合物的有效用量。所述施用剂 量更优选在大约1mg-大约500mg所需化合物的范围内。本发明的组合 物在很大的剂量范围内是有效的，并且取决于多种因素，如要治疗的 具体疾病，基于所述肽或多肽的药物组合物在患者体内的半衰期，所 述药用试剂和药物组合物的物理和化学特征，所述药物组合物的施用 方式，要治疗或诊断的患者的具体情况，以及被治疗医生认为是重要 的其他因素。
用于口服的药物组合物可以是片剂、液体、乳液、悬浮液、糖浆、 丸剂、囊片或胶囊形式。所述药物组合物还可以用器械施用。
用于局部施用的药物组合物可以是霜剂、软膏、洗液、贴剂、溶 液、悬浮液或凝胶形式的。
另外，所述药物组合物可以制备成固体、液体、或持续释放制剂。
含有按照本发明生产的抗体片段的组合物可以包括常见的可以药 用的稀释剂或载体。片剂、丸剂、囊片、和胶囊可以包括常见赋形剂， 如乳糖、淀粉和硬脂酸镁。栓剂可以包括诸如蜡和甘油的赋形剂。可 注射的溶液包括无菌无致热原的介质，如盐水，并且可以包括缓冲剂、 稳定剂或防腐剂。还可以使用常见的肠包衣。
本发明还包括通过本领域已知的合成方法生产抗体片段的方法。
本发明的一种实施方案包括一种药物组合物，该组合物含有至少 一种与显影剂附着、偶联、组合、连接或融合的本发明的肽或多肽， 用于肿瘤的诊断性定位和/或显像。
本发明另一种实施方案提供了用于在治疗之前、期间或之后对治 疗效果进行体外分析的诊断试剂盒，它包括含有与指示标记分子连接 的本发明的肽的显像制剂。本发明还提供了将所述显像制剂用于癌 症，更具体地讲用于肿瘤的诊断定位和/或显像的方法，包括以下步 骤：
a)让所述细胞与所述组合物接触，
b)测定与所述细胞结合的放射活性，和
c)显现所述肿瘤。
在本发明的一种优选实施方案中，所述试剂盒的显像剂是一种荧 光染料，并且所述试剂盒提供了对癌症，更具体地讲与血液相关的癌 症，如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的治疗效果的分析。利用FACS分析确 定在疾病的各个阶段的由所述显像剂染色的细胞的百分比，和染色强 度，例如，在诊断时、治疗期间、在恢复期间和复发期间。
本发明还提供了包括有效量的显影剂、本发明的肽和可以药用的 载体的组合物。
在一种优选实施方案中，所述指示标记分子是本领域已知的任何 已知标记，它包括，但不局限于放射性同位素、X-射线不能通过的元 素，顺磁离子，或荧光分子等。
在本发明的一种具体实施方案中，所述指示性放射性同位素可以 是，但不局限于111铟，113铟，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m 碲，125m碲，165铥，167铥，168铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33 氙，90钇，213铋，77溴，18氟，95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞， 67镓和68镓。
根据另一种优选实施方案，所述指示标记分子是荧光标记分子。 根据一种更优选的实施方案，所述荧光标记分子是荧光素、藻红蛋白 或罗丹明，或其修饰物或偶联物。
本发明还涉及含有有效量的本发明的显像制剂、与它连接的药用 试剂和生理学上可接受的载体的组合物。
本发明还提供了用于对器官或细胞进行显像的方法，包括在使得 显像剂能结合所述器官或细胞的条件下，让所述待显像的器官或细胞 接触本发明的显像剂，使所结合的显像剂显像，并因此使所述器官或 细胞显像。
本发明还提供了一种治疗体内器官的方法，该方法包括让要治疗 的器官与本发明的组合物在所述组合物能结合所述器官的条件下接 触，以便治疗所述器官。
在本发明的一种优选实施方案中，可以用所述肽或多肽治疗靶恶 性肿瘤细胞，更具体地讲，治疗全血中的白血病细胞，包括监测所述 细胞并使所述细胞显像，如通过FACS分析。将相对正常细胞而言获得 了更高(例如，高4倍)得分的肿瘤细胞样品用于治疗。
本发明提供了对患有癌症的患者的治疗，包括给所述患者施用能 有效治疗所述癌症的量的本发明的肽或多肽。在一种优选实施方案 中，所述癌症选自癌、肉瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胚细 胞瘤、精原细胞瘤、和黑素瘤。在一种更优选的实施方案中，所述癌 症是一种白血病。在一种最优选的实施方案中，所述白血病是AML。
在一种最优选的实施方案中，本发明的肽或多肽能特异性地或选 择性地结合AML细胞。本发明提供了出现在结合了本发明的肽或多肽 的AML细胞上的配体，并且还提供了能结合所述配体的肽或多肽。
本发明的新型抗体片段或其相应的肽模拟物，被用于生产用来治 疗各种疾病和状况的组合物和药物。
本发明提供了一种用于生产导向制剂的方法，包括以下步骤：
a)通过生物淘选程序直接在靶细胞上，或通过生物淘选程序间接 在处在第二种状态、而不是第一种状态的第一种靶细胞上，以及随后 通过生物淘选程序直接在第二种靶细胞上分离并选择包括一个主要识 别位点的一种或多种导向分子，以便生产一种或多种所述导向分子；
b)扩增、纯化并鉴定所述一种或多种导向分子；和
c)由所述一种或多种导向分子或所述分子的识别位点构建导向 剂，其中，所述导向剂可以是肽、多肽、抗体或抗体片段或其多聚体。
还可以对所述导向剂进行额外构建，以便与一种药用试剂偶联、 附着、组合、连接或融合或缔合。
在本发明的一种优选实施方案中，所述导向剂是抗病或抗癌剂。
在本发明的另一种优选实施方案中，所述药用试剂选自放射性同 位素、毒素、寡核苷酸、重组蛋白、抗体片段、和抗癌剂。所述同位 素可选自111铟，113铟，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m 碲，165铥，167铥，168铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇， 213铋，77溴，18氟，95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。
在另一种实施方案中，所述毒素选自gelonin，假单胞菌属外毒 素(PE)，PE40，PE38，白喉毒素，蓖麻毒蛋白，或其修饰物或衍生 物。
在本发明的另一种实施方案中，所述抗癌制剂选自阿霉素，吗啉 代阿霉素(MDOX)，阿得里亚霉素，顺铂，紫杉酚，加利车霉素，长春 新碱，阿糖胞苷(Ara-C)，环磷酰胺，强的松，柔红霉素，伊达比星， 氟达拉宾，苯丁酸氮芥，干扰素α，羟基脲，替莫唑胺，沙利度胺和 博来霉素，及其衍生物。
本发明提供了一种用于鉴定抗体片段的方法，包括：(a)生物淘 选，它包括将噬菌体展示文库与源于血液的细胞一起培养；(b)洗涤， 以便除去未结合的噬菌体；(c)从所述血细胞中洗脱结合的噬菌体；(d) 扩增所得到的结合噬菌体；和(e)测定所述结合噬菌体的展示肽序列， 以便鉴定所述肽。
本发明提供了具有下式或结构的肽或多肽：
A-X-B
其中，X是具有3-30个氨基酸的高变CDR3区；而A和B可分别 是长度为1-1000个氨基酸的氨基酸链，其中，A是氨基末端，B是羧 基末端。
在本发明的一种优选实施方案中，A是150-250个氨基酸残基， 而B是350-500个氨基酸残基。
在另一种优选实施方案中，所述肽的CDR3区具有5-13个氨基酸 残基。
在另一种实施方案中，上述结构式中的X是选自SEQ ID NOs：8-24 的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，所述肽或多肽是较大的或完整抗 体的或多聚体的一部分。
在另一种实施方案中，一种二聚体分子包括两个肽或多肽，其中 之一是本发明的肽或多肽。所述二聚体分子可以包括两个相同的本发 明的肽或多肽。
在本发明的一种优选实施方案中，所述二聚体分子中的X是选自 SEQ ID NOs：8-24的氨基酸序列。
另一种实施方案提供了编码本发明的肽或多肽或二聚体分子的核 酸分子。
本发明提供了将任选与一种药用试剂缔合或附着、偶联、组合、 连接或融合的所述肽或多肽用于生产药物的用途。
本发明还提供了将所述肽或多肽用于生产具有抗病变细胞，更具 体地讲用于抗癌细胞的活性的药物的用途。所述癌细胞可选自癌、肉 瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胚细胞瘤、精原细胞瘤、和黑 素瘤。更具体地讲，所述癌细胞可以是白血病细胞，最具体地讲，所 述白血病细胞是AML细胞。
在本发明中定义的，并且在下面的实施例中讨论的一种可交换的 系统是一种核酸构建体，该构建体被设计成能够交换或取代所述构建 体内的重新界定的可变区，而没有必要进一步操作或重建所述分子。 这种系统可以快速而且方便地制备需要的核酸分子。
实施例
提供以下实施例是为了理解本发明，而不是要，并且不应当被理 解成是以任何方式对本发明的范围进行限定。尽管披露了具体的试剂 和反应条件，但是可以进行改进，这些改进被认为包括在本发明的范 围内。因此，提供下面的实施例是为了进一步说明本发明。
实施例1：
1.用于生物淘选方法的细胞、细菌菌株、scFv噬菌体展示文库、 细胞膜的制备和蛋白纯化。
1.1 白血病细胞的制备。由白血病患者体内获得血液样品。在 Ficoll垫层(Iso-prep，Robbins Scientific Corp.，Sunnyvale， CA，USA)上将单核细胞(原代细胞)与其他血细胞分离。以110×g的 速度离心25分钟。收集界面上的细胞，并且用PBS洗涤两次。然后将 细胞悬浮在RPMI+10％胎牛血清(FCS)中，并且计数。为了长期保存， 将10％FCS和10％DMSO添加到所述淋巴细胞中，然后在-70℃下冷冻。
1.2 固定血小板的制备。在37℃下，温育从血库中获得的血小板 浓缩物1小时。添加等体积的2.0％低聚甲醛，并且在40℃下固定血小 板18小时。用冷盐水洗涤血小板两次(以2500×g的速度离心10分 钟)。重新悬浮在含有0.01％HEPES的盐水中，并且用显微镜计数。
验证血小板对血浆von Willebrand因子和瑞斯托菌素的敏感性。 将血浆von Willebrand(vWF；18，ug/ml)和瑞斯托菌素(0.6mg/ml) 添加到固定的血小板中，诱导血小板聚集，并且通过chronolog lumi- 聚集仪监测。
1.3 细菌菌株-TG-1和HB2151：通过让细胞生长到A600为0.5-0.9 (指数生长细胞)，制备用于感染的新鲜细菌培养物。将大肠杆菌TG-1 细胞用于噬菌体制备，而将大肠杆菌HB2151细胞用于scFv蛋白生产。
1.4 scFv展示噬菌体文库来源。ScFv文库(Nissim等，EMBO J.， 13，692-698(1994))是在得到MRC许可后，由A.Nissim博士提供 的。该文库最初是作为展示ScFv片段的噬菌粒文库构建的，其中，VH 和VL结构域是通过柔性多肽连接的。将展示在该噬菌粒文库中的ScFvs 融合在所述噬菌体的次要外被蛋白pIII的N-末端，然后将它亚克隆到 pHEN1载体上(Nissim等，EMBO J.，13，692-698(1994))。首先， 通过PCR由免疫过的人的外周血淋巴细胞的重排V-基因制备抗体片段 的所有组成成分(被称为“天然所有组成成分”)。为了使所述所有 组成成分多样化，将编码长度为4-12个残基的重链CDR3的随机核苷 酸序列导入具有49个克隆的人VH基因片段的文库中。所有克隆中融合 的VL片段源于种系IGLV3S1的单一的未诱变的V基因，产生了大约具 有108个克隆的单一的pot文库。
1.5 来自AML细胞的膜制剂。向含有108洗涤过的细胞的沉淀中添 加1ml冷的裂解溶液(0.3M蔗糖，5mM EDTA，1mM PMSF)，然后在4 ℃下以11,000×g的速度离心20分钟。丢弃上清液，并且将沉淀重 新悬浮在TE(10mM Tris，1mM EDTA，1mM PMSF)中，并且按上述 方法离心。将最终的沉淀以0.4的A280重新悬浮在6ml PBS中，并且 用于在37℃下对三个Maxisorb免疫试管(NUNC)进行包被2小时。 在包被之后，用PBS漂洗试管3次，然后在室温下用MPBS(2％脱脂奶， 溶解在PBS)中封闭2小时。在生物淘选之前，再用PBS漂洗所述试管 3次。
实施例2：
2.噬菌粒颗粒的操作：生物淘选方法
2.1噬菌粒筛选和扩增：通过四个步骤的生物淘选方法，从所述 文库中筛选能表达特别感兴趣的表位的噬菌粒：
a)使噬菌粒颗粒与一种靶位结合，更具体地讲，使所述噬菌粒颗 粒与洗涤过的靶细胞或细胞膜结合
b)除去未结合的噬菌粒颗粒，更具体地讲，通过充分洗涤除去未 结合的噬菌粒颗粒
c)洗脱结合的噬菌粒颗粒
d)繁殖和扩增洗脱的噬菌粒颗粒，更具体地讲，在大肠杆菌中繁 殖和扩增
2.2 克隆鉴定：将所述四个步骤的生物淘选方法大体上重复3-5 次。分别繁殖所选择的噬菌粒克隆，并且通过以下方法进一步表征：
a)DNA测序
b)对与若干种细胞类型结合的噬菌体进行来自体内的比较
c)感染大肠杆菌HB2151，以便生产可溶性scFv
2.3序列分析：使用上游引物#203743(5′-GAAATACCTATTGCCTACGG) 和下游引物#181390(5′-TGAATTTTCTGTATGAGG)，通过PCR扩增所述噬 菌粒颗粒内的大约800bp的编码的scFv DNA。使用ABI PRISM Big Dye 终止循环测序试剂盒和上述引物，通过自动ABI PRISM DNA测序仪(310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer)，从两端对DNA片段进行全面鉴定。 将位于重链和轻链之间的柔性多肽结合区的另外两个引物，引物#191181 (5’-CGATCCGCCACCGCCAGAG)及其互补引物#191344(5′- CTCTGGCGGTGGCGGATCG)用于测序。
实施例3：
3.生物淘选方法
3.1 基础生物淘选方法：所述生物淘选方法是上述噬菌体展示技 术的一个组成部分。在本研究中开发并采用了三种生物淘选方法：
a)方法AM(AML细胞膜淘选/细菌洗脱，随后进行完整AML细胞淘 选/胰蛋白酶洗脱)
b)方法YPR(固定的人血小板淘选/酸洗脱)
c)方法YPNR(固定的人血小板淘选/酸洗脱)
下面详细披露上述方法
3.1.1 方法AM
3.1.1.1 预洗涤：在37℃下快速解冻在-70℃下保存的含有来自患 者的2×107个冷冻AML细胞的1ml等份试样，并马上稀释到10ml 冷的2％PBS-乳(MPBS)中。在室温(RT)下，以120×g的速度离心细 胞5分钟，重新悬浮在MPBS中，并且用血细胞计计数。按1.5节所述 制备细胞膜。
3.1.1.2 选择是通过添加2ml含有来自原始Nissim文库的1012噬 菌粒的MPBS在固定化的AML细胞膜上进行的。缓慢搅动所述试管30 分钟，然后在不搅拌的条件下再温育90分钟，这两个步骤都是在室温 下进行。在AML细胞膜上进行3轮淘选之后，在完整AML细胞上进行1 轮淘选。
3.1.1.3 洗涤：为了除去多余的未结合的噬菌粒，将试管中的内 容物倒出，并且用PBS，0.1％Tween洗涤试管10次，然后仅用PBS 洗涤10次。
3.1.1.4 洗脱：将指数生长的大肠杆菌TG-1细胞(2ml)直接添加 到所述试管中，并且在37℃下缓慢搅拌温育30分钟。如上文所述，将 一份样品铺平板，用于滴定，并且将其余体积铺平板用于扩增。
3.1.1.5 扩增：刮取来自所述大的平板的菌落，并且合并。让一 份样品(大约107)的氨苄青霉素抗性大肠杆菌TG-1细胞在液体培养 物中生长到A600大约为0.5，然后用辅助噬菌体(VSC-M13， Stratagene)感染，以便生产大型扩增的噬菌粒原种。通过PEG沉淀方 法恢复噬菌粒(18a)。将上述扩增的T16MI原种(大约1011噬菌粒/ml) 用于随后轮次的淘选。使用前面扩增的原种的1011噬菌粒，将所述筛 选方法再重复两轮。在固定化膜上进行的第三种淘选方法的扩增原种 被命名为T16M3。
3.1.1.6 在完整细胞上进行再淘选：将第三种膜淘选的扩增原种 T16M3用于淘选完整AML细胞。择选是在含有2×107细胞和1010噬菌 粒(Nissim文库)的集落形成单位(CFU)，和1013野生型噬菌体M13的 0.5mlMPBS的最终体积中进行的，在4℃下缓慢搅拌2小时。用50μl 的胰蛋白酶：EDTA(0.25％：0.05％)洗脱结合的噬菌粒，然后通过添 加50μl FCS中和。为了滴定和扩增，使用1ml大肠杆菌TG-I培养 物(A600＝0.5)。扩增的、最终的原种被命名为T16M3.1。
3.1.2 方法YPR
3.1.2.1 选择：克隆选择是通过在1ml PBS/HEPES/1％BSA缓 冲液中，用1011噬菌粒(Nissim文库)淘选108固定人血小板完成的。 使结合在室温下进行1小时，同时通过旋转混合样品。
3.1.2.2 细胞洗涤：通过低速离心(3500×g)将血小板洗涤5次， 并按上述方法重新悬浮。
3.1.2.3 洗脱：通过酸洗脱技术将第一轮结合的噬菌粒从固定的 血小板上洗脱：
在室温下用200μl 0.1M甘氨酸(pH 2.2)温育所述血小板10分 钟。在用pH 8.0的0.5M Tris-HCl中和并且离心之后，通过添加200 μl胰蛋白酶-EDTA(0.25％/0.05)洗脱其余的血小板结合的噬菌体， 并且通过添加50μl FCS中和。通过离心除去所述细胞，收集来自酸 洗脱方法和胰蛋白酶洗脱方法的洗脱噬菌体的上清液，并分别命名为 YPR(a)-1和YPR(t)-1原种。然后通过添加1ml指数生长的TG-1细 胞在37℃下扩增所述原种30分钟。将一等份样品铺平板用于滴定，并 且将其余感染过的大肠杆菌细胞铺平板在2×TV/AMP 15厘米的平板 上。在30℃下温育平板过夜。通过统计滴定板上的集落数量，确定在 每一轮淘选之后的产量。
3.1.2.4 扩增：按3.1.1.5节所述方法扩增克隆。合并来自酸洗 脱方法和胰蛋白酶洗脱方法的，分别被命名为R1(a)和R1(t)原种的 大约1012噬菌粒/毫升的扩增原种，并用于随后轮次的淘选。
3.1.2.5 第二轮和第三轮淘选是按照所述YPR方法的第一轮淘选 方法进行的，进行了以下改进：(i)为了进行第二轮淘选，使用与1012R1 (t)组合的1012R1(a)，和(ii)洗脱是仅用甘氨酸(pH 2.2)进行的。 所述第二轮淘选的扩增洗脱物被命名为R2。(iii)为了进行第三轮生 物淘选，使用1012 R2，并且洗脱是按第二轮淘选方法进行的。第三轮 的扩增原种被命名为R3。
3.1.3 YPNR方法
3.1.3.1 生物淘选和洗涤是大体上按YPR方法中所述方法进行 的。不过，在本发明中，(i)洗脱是在三轮淘选的每一轮之后用甘氨酸 (pH 2.2)进行的，和(ii)在第一轮淘选和扩增之后，接着进行两轮淘 选，不进行扩增。第一、第二和第三轮分别被命名为YPNRI，YPNR2 和YPNR3。
3.2 阴性对照scFv克隆的筛选
3.2.1 N14 CDR3序列：对于所有结合实验来说，从天然文库中挑 选一个克隆(选择之前)。由该克隆制备噬菌体原种和被命名为N14 的可溶性scFv。序列分别表明，它属于VH4-DP65基因家族。由该克隆 编码的11-聚体VH-CDR3的序列被命名为N14 CDR3，其序列如下(SEQ ID NO：28)：
Phe Leu Thr Tyr Asn Ser Tyr Glu Val Pro Thr
3.2.2 C181 CDR3序列：将另一种阴性克隆C181用于结合分析实 验。克隆C181(对重组乙型肝炎病毒[HBV]颗粒有反应性)属于VH3- DP35家族，由该克隆编码的9-聚体VH-CDR3的序列被命名为C181 CDR3，其序列如下(SEQ ID NO：29)：
Thr Asn Trp Tyr Leu Arg Pro Leu Asn
实施例4
4.scFv克隆的生产、纯化、标记和表征
4.1可溶性scFv的生产：将用于构建原始噬菌粒文库的载体pHEN1 设计成在scFv基因和pIII基因的结合部位编码的琥珀终止密码子。 因此，当通过噬菌粒感染将特定克隆的载体导入大肠杆菌HB2151(它 是非抑制菌株)时，该系统能够生产可溶性scFv，并且分泌到所述细 菌周质中(Harrison等，Methods in Enzymology，267，83-109 (1996))。然后可以从培养液中方便地回收scFv。可溶性scFvs是在 lacZ启动子的控制下生产的(Gilbert和Muller-Hill，PNAS(US)， 58，2415(1967))，该启动子是用IPTG诱导的。
在所述载体的琥珀突变上游，包括一个编码c-myc标记的序列(10 个氨基酸-Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu；SEQ ID NO： 123)。所表达的scFv的C-末端应当具有c-myc标记，该标记可以用 小鼠抗-myc标记抗体(来自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)9E10- 杂交瘤)检测。
4.2 在蛋白-A珠亲和柱上纯化scFv：所选择的克隆的scFvs和对 照克隆C181的scFvs都属于VH3家族，可以在蛋白-A亲和柱上纯化。 制备来自每一种克隆的诱导培养物的周质级分(100-250ml)，并且用 蛋白-A琼脂糖凝胶珠温育。通过酸洗脱(0.1M甘氨酸，pH 3.0)从所 述柱中回收结合的scFvs，然后用pH8.0的Tris中和洗脱物。通过A280 测定确定所回收的蛋白的浓度，然后通过透析或在G-25琼脂糖凝胶柱 上进行PBS缓冲液交换。
4.3 在Sephacryl S-200柱上纯化N14-scFv：阴性克隆N14的 scFv属于VH4基因家族，并因此不能在蛋白-A亲和柱上纯化。为了进 行scFv-N14纯化，通过60％的硫酸铵使200ml诱导培养物的周质级份 中的总蛋白沉淀。将沉淀重新悬浮在2ml 0.1×PBS，5mM EDTA，5mM PMSF中，并且加样到Sephaeryl S-200柱(1.5×90cm)上，该柱用流 通缓冲液预平衡过(0.1×PBS，5mM EDTA)。分离蛋白，并且合并含有 N14-scFv的级份(通过SDS-PAGE和Western分析检测)，冷冻干燥， 并且重新悬浮在1/10体积的水中。然后在FACS分析实验中，将 N14-scFv(未标记过的和FITC-标记过的)用作阴性对照。
4.4.用FITC标记纯化过的scFvs：将来自每一种制备物的大约 1毫克纯化的FITC重新悬浮在PBS中，并且使用Fluoro-Tag FITC偶 联商业试剂盒(Sigma cat.#FITC-1)，按照生产商的方法偶联在FITC 上。
4.5 纯化的和标记过的scFv的质量分析
4.5.1 在纯化和FITC标记之后，通过SDS-PAGE，Western印迹， 使用Superdex-75柱的HPLC(A280和A495)和荧光测定分析每一种制 备物(标记过的和未标记过的)的特征。该分析表明，N 14 scFv的 纯度为80％，VH3克隆的纯度为90％，大约两个FITC分子与每一个scFv 分子偶联(F/P比例为2∶1)。
4.5.2 在FITC标记之后评估结合活性，以便证实保留了scFv特 异性(参见实施例5)。
4.6 噬菌粒克隆的生化表征：用若干种类型的分析评估所述构建 体，并且评估各种scFv制备物的纯度(参见实施例8)，所述方法包 括SDS-PAGE，质谱法(仅适用于Y1和Y17 scFvs)和HPLC。用Western 分析和EIA鉴定scFv；并且用FACS表征scFv结合。
实施例5：
5.结合试验
在噬菌粒和可溶性scFv这两种水平上评估选定克隆与细胞的结 合。
5.1 在噬菌粒水平上的结合
为此，由每一个特定的克隆分别制备噬菌粒原种
5.1.1 菌落试验：在一种实验中，将来自所述生物淘选方法的能 感染氨苄青霉素抗性大肠杆菌的109特定噬菌粒的混合物和不具有氨 苄青霉素抗性并且被用作“阻断剂”的1011野生型M13噬菌体，与选 自一组细胞类型的105细胞一起温育。在温育和洗涤之后，用胰蛋白酶 洗脱结合的噬菌体，并且将一等份试样用于感染大肠杆菌TG-I。然后 将所述大肠杆菌铺平板在2×TY/AMP上，并且在30℃下温育过夜。计 算并比较所获得的每一种克隆的菌落数量。所述结果提供了所述噬菌 粒的结合亲和力和特异性的指标。
5.1.2 白色/兰色菌落试验：在该试验中，每一个实验包括一个内 部对照，将特定的噬菌粒以与上面的5.1.1节相同的比例，即1/100， 与被命名为pGEM7的另一种对照噬菌粒(Promega Corp.，Madison， Wisconsin，USA)混合。pGEM7噬菌粒具有对氨苄青霉素的抗性。不 过，它不能在其pIII基因的N-末端表达任何重组多肽。在TG-1感染 和在含有1mM X-gal氨苄青霉素平板上温育之后，统计菌落数量。所 获得的含有pGEM7的菌落是兰色的，而由特定噬菌粒获得的菌落是白 色的。然后计算每一个试管的来自所述白色/兰色菌落的输入/产出比 例(生长在相同平板上)的富集因数。
5.1.3 噬菌粒的EIA
5.1.3.1 与选择的细胞结合的噬菌粒：用丙酮∶甲醇(1∶1)将 大约5×105选择的的细胞固定在24孔平板的表面上。该结合试验需要 109噬菌粒。结合是在37℃下进行1小时，然后用PBS/Tween(0.05％) 充分洗涤。在用PBS充分洗涤之后，用兔抗M13，抗兔IgG HRP和底 物培养所述平板。所产生的颜色强度是通过ELISA平板读数器在A405 下读出的，并且与结合的噬菌粒的含量成正比。
5.1.3.2 与固定血小板结合的噬菌粒：用108固定血小板对聚苯乙 烯微量滴定板进行包衣，并且在4℃下培养过夜。将大约1010噬菌粒用 于评估结合。平板的洗涤和培养以及结合水平的测定是按上述5.1.3.1 节所述方法进行的。
5.1.4 对选自人生长激素(hGH)、血纤蛋白原、纤连蛋白、BSA，SM (脱脂乳)和glycocalicin(GPIb的蛋白水解片段)的特定蛋白进行结 合分析。结合是按以下方法分析的。用待测试的所述蛋白之一，以2μ g/孔的用量对聚苯乙烯微量滴定板的孔进行包被。包被是在4℃下通过 温育过夜进行的。添加大约1010噬菌粒进行测试结合。在用PBS充分 洗涤之后，用兔抗M13、抗兔BRP和底物培养所述平板。通过所产生的 颜色强度测定结合水平。在A405下测定光学密度。对每一份样品进行重 复测定，并且计算平均值。
5.2 在scFv水平上的结合试验：通过两种不同的分析，即EIA分 析和FACS分析，在若干种类型的细胞中比较在HB2151的周质中产生 的scFvs结合。
5.2.1 可溶性scFv的EIA：将大约5×105AML细胞与5-10μg总 蛋白一起温育。在4℃下进行结合1小时，然后用小鼠抗myc抗体，抗 小鼠HRP和底物进行EIA分析。在每一个步骤之后，通过用PBS洗涤 细胞3次，除去多余的未结合的抗体。所产生的颜色的强度，是通过 ELISA平板读数器读出的(O.D.405)。如上文所述，颜色强度与结合 水平成正比。
5.2.2 细胞的FACS分析
5.2.2.1 分析通过“三步骤染色”方法染色的细胞
方法：进行FACS分析，以便测试并证实所选择的克隆的特异性。 首先，建立“三步骤染色”方法，使用粗制提取物或纯化的未标记过 的scFv，然后使用小鼠抗myc抗体，最后使用FITC或PE-偶联的抗小 鼠抗体。
FACS分析需要业已通过Ficoll纯化的并且重新悬浮在PBS+1％ BSA中的5-8×105细胞，结合是在4℃下进行1小时。在每一个步骤之 后，洗涤细胞，并且重新悬浮在PBS+1％BSA中。在最后的染色步骤之 后，通过重新悬浮在PBS、1％BSA、2％甲醛中固定细胞，然后通过FACS 读数(Becton-Dickinson)。
5.2.2.2 通过一个染色步骤用FITC-标记的scFv对细胞染色：在 PBS+1％BSA中将FITC-标记的scFv与5-8×105 Ficoll纯化的细胞进 行温育。结合是在4℃下进行1小时。然后洗涤细胞，并且按上述 5.2.2.1的方法固定，并且通过FACS读数。
实施例6：淘选和测序结果
6.1 AM方法的结果
6.1.1 AM方法的淘选结果：在下面的表格中(表1)归纳了用于 淘选的噬菌粒的估计数量(输入)，和在AM方法中洗脱的结合噬菌粒 的估计数量(产出)：
                     表1.来自方法AM的淘选结果 输入原种 细胞来源   洗脱 产出 扩增的原种 2×1011 AML的膜   细菌TG-1 3×104 T16M1 T16MI-1011 AML的膜   细菌TG-1 6.4×105 T16M2 T16M2-1011 AML的膜   细菌TG-1 106 T16M3 T16M3-1010 AML细胞   胰蛋白酶 2×106 T16M3.1
发现了通过每一次成功的淘选所获得的产量(产出)的富集。另 外，当T16M3被用于淘选AML完整细胞时没有出现产量降低，这表明 所结合的噬菌粒可能对所述细胞外表面上的成分具有特异性，或者该 特异系统可能含有较大数量的非特异性结合噬菌粒。
6.1.2 AM方法的克隆序列结果：尽管克隆是从T16M1，T16M2和 16M3产出原种中挑选并测序的，下面提供的结果主要是来自T16M3.1 产出原种的克隆的结果(AML完整细胞淘选)。克隆AM10，AM11和AM12 是在T16M3原种中鉴定的，而不是在随后的产出物中鉴定的。
在下面的表2中归纳了在VH-CDR3中展示的氨基酸序列及其在测 试克隆中的频率。
           表2.按照AM生物淘选方法从T16M3和T16M3.1产出物中选择的克
           隆。 克隆 编号  VH-  CDR  3大小     VH-CDR3序列 种系  在T16M3  产出物中  的频率  在T16M3.1  产出物中  的频率 AM1  8     Pro    Trp    Asp    Asp    Val    Thr            Pro    Pro            1      2      3      4            5      6      7      8 VH3- DP47  5/31  8/51 AM2  12     Gly    Phe    Pro   Arg    lle     Thr    Pro    Pro    Ser    Ala     Glu    Ile     1      2      3      4      5     6      7      8      9      10     11     12 VH3- DP46  11/31  20/51 AM3  5     Gly    Phe    Pro   Met    Pro     1      2      3      4      5 VH3- DP46  1/31  2/51 AM6  10     Gly    Phe    Pro    His   Ser     Ser    Ser    Val    Ser     Arg     1      2      3      4      5     6      7      8      9      10 VH3- DP46  4/31  6/51 AM7  11     Arg   Phe    Pro    Met     Arg    His    Glu    Lys    Thr     Asn    Tyr     1      2      3      4      5     6      7      8      9      10     11 VH3- DP46  3/31  4/51 AM8  8     Arg    Phe    Pro   Pro    Thr     Ala    Thr    Ile     1      2      3      4      5     6      7      8 VH3- DP46  6/31  8/51 AM9  7     Thr    Gln    Arg    Arg     Asp    Leu    Gly     1      2      3      4      5     6      7 VH3- DP87  0/31  2/51 AM10  11     Lys    Phe    Pro   Gly     Gly    Thr    Val    Arg     Gly    Leu    Lys     1      2      3      4      5     6      7      8      9      10     11 VH3- DP46  0/31  1/31 AM11  12     Gly    Phe    Pro   Val    Ile     Val    Glu    Gln    Arg     Gln    Ser    Thr     1      2      3      4      5     6      7      8      9      10     11     12 VH3- DP49  0/31  1/31 AM12  10     Arg    Phe    Pro    Gln     Arg    Val    Asp    Asn     Arg    Val     1      2      3      4      5     6      7      8      9      10 VH3- DP46  0/31  1/31
氨基酸序列Arg/GlyPhePro出现在表2中所提供的10个分离的克隆 中的7个中，并且表示其中的一个基序。另外，应当指出的是，在每 一种情况下，所鉴定的基序表示CDR 3区的N-末端3个氨基酸。因此， 该基序可以是一个有效的锚定或结合位点，该位点独立存在或与延伸 到CDR 3区一端或两端的其他氨基酸残基组合存在或作为较大的肽或多 肽或Fv分子的一部分。
可以根据核心序列Arg/GlyPhePro，构建对AML细胞具有高的结合力 的其他CDR3区。所述CDR3区可以通过添加、缺失或突变，同时保持 了Arg/GlyPhePro核心序列来改变上述5-12聚体中的任意一种而构建。
本发明的CDR3区具有氨基酸序列R1-Arg/GlyPhePro-R2，其中，R1 包括0-15个氨基酸，优选0-9个，最优选0-1个氨基酸，而R2包括 具有1-15个氨基酸，最优选1-9个氨基酸的氨基酸序列。R1和R2是 不会对Arg/GlyPhePro序列对AML细胞的特异性结合产生负面影响的氨 基酸序列。
上述克隆的轻链的CDR3区是相同的，并且如SEQ ID NO：125所 示。
6.2 YPR和YPNR方法的结果
6.2.1 YPR和YPNR方法的淘选结果：在下面的表格中(表3，4) 归纳了用于淘选的噬菌粒的估计数量(输入)，和洗脱的结合噬菌粒 的估计数量(产出)。
                表3.来自YPR方法的淘选结果 输入原种 洗脱 产出 扩增的原种 Nissim文库Y1011 酸 胰蛋白酶 107 4×107 R1(a) R1(t) 合并的「R1(a)-1012， +R1(t)-1012) 酸 5×105 R2 R2-1012 酸 3×108 R3
表3表明，与第一轮的酸洗脱相比，胰蛋白酶洗脱的产量提高了4 倍。
按照YPNR方法进行的没有扩增步骤的再淘选，降低了优先扩增噬 菌粒感染或细菌感染的可能性。所得到的产量在表4中示出。
      表4.来自YPNR方法的淘选结果 输入原种 洗脱 产出 扩增的原种 Nissim文库Y1011 酸 3×107 YPNR1 YPNR1-3×107 酸 4×105 YPNR2 YPNR2-4×105 酸 103 YPNR3
正如所预料的，表4中的结果表明在每一轮淘选之后噬菌体产量 降低。使用该方法是为了防止由于扩增非特异性噬菌体而导致的偏 性。
6.2.2 YPR和YPNR方法的克隆序列结果
选择来自两种方法的第三次淘选的若干克隆用于测序。在表5中 示出的氨基酸序列是重链CDR3区的序列(VH-CDR3)。在该表中还示出 了有关种系和该序列在R3产出物中的出现频率。
表5：按照YPR生物淘选方法用R3产出物选择的Y系列克隆

通过YPNR方法分离的克隆同样主要是Y1。
上述克隆的轻链CDR3区是相同的，并且如SEQ ID NO：125所示。
实施例7：
7.结合评估结果
7.1 选择的噬菌粒克隆与AML细胞(AM克隆序列)的结合：用AM 克隆进行用于评估噬菌粒结合细胞的结合试验，如实施例5中所披露 的白色/兰色菌落试验。除了克隆AM7之外，没有检测到对测试细胞的 优势结合。观察到了作为噬菌粒或纯化scFv的克隆AM7对所有靶细胞 的显著的，但是非选择性的结合。结果证实，没有AM克隆系列的富集。
7.2 丫克隆系列的结合
7.2.1 噬菌粒结合-使用固定血小板的EIA：在用两种不同的方法 进行三轮淘选之后，通过EIA测试噬菌体克隆与固定血小板的结合。 噬菌粒原种是用每一种选择的克隆制备的，并且用两套EIA测试所述 克隆。对每一份样品进行重复分析，并且计算其平均值。结果归纳在 图1中，并且表明9个Y系列克隆中的6个出现了阳性EIA反应。最 大程度的结合，与克隆Y1，Y16，Y17和Y-27相关。将噬菌体原种 M13(野生型噬菌体)和E6(在CLL白血病细胞上选择)用作阴性对照。 显性克隆噬菌体Y1表现出对固定血小板的最强的结合，它与Y17一起 表现出明显强于M13或E6噬菌体克隆的结合能力。
实施例8：
8.scFvs的详细表征和克隆结合
8.1 scFv的结构和鉴定：用Superdex 75柱通过HPLC分析和通 过质谱分析评估Y-I的天然构建体。前一种方法的结果表明在该制备 物中存在单体，二聚体和四聚体。质谱分析的灵敏度足以鉴定预期的 26.5kD的分子量，并且当c-myc标记被裂解时，获得了24kD的分 子量。
不过，SDS-PAGE的结果表明，完整的、未裂解过的分子的表观分 子量为30kD，尽管根据核酸序列和上述质谱分析结果推测的分子量为 26.5kD。用c-myc-特异性抗体进行的Western分析，证实了SDS-PAGE 的30kD的结果，并且支持c-myc标记存在于完整分子末端的观点。 两种方法的结果之间的差异，是由于所述方法的精确程度和SDS-PAGE 的运行条件导致的，这些因素可以改变测试蛋白的表观分子量。
8.2 血小板选择的克隆与白血病细胞的结合：正如在前言部分所 指出的，血小板细胞表面标记可以在不成熟的造血细胞上表达。血小 板选择的克隆的结合，是通过FACS分析测试的。在对全血染色之后进 行FACS分析，随后进行RBC裂解或在分离-制备-(Ficoll垫层)纯化 的单核细胞上进行。ScFvs是用每一种克隆制备的，在蛋白-A上纯化， 并且进行FITC标记(如4.1-4.4节所述)。为了能在非阻遏大肠杆菌 菌株HB2151中生产完整的scFv，通过DNA定点诱变将存在于Y-27克 隆的VH-CDR3中的琥珀密码子(TAG)突变成编码谷氨酸(GAG)。用于所 述研究的靶细胞，是从各种患有白血病的患者的新鲜血液样品中分离 的。所述样品是从以色列的三个医学中心获得的。
克隆Y1和Y17表现出对测试的白血病细胞的优势结合。而所有其 他Y系列克隆仅产生了本底水平的结合。表6提供了FITC-标记的Y- I和Y-17与多种白血病细胞的结合。
        表6.Y-I对白血病细胞的结合特异性

*未测定
在表6中以分数形式表示的结果表示患者的比例，通过FACS分析 确定所述患者的细胞能与每一种测试抗体发生阳性反应。分子表示阳 性患者的数量，分母表示测试特定scFv/细胞类型组合的患者的总数 量。Y-17能与所有测试细胞紧密结合。因此，该结合被认为是非细胞 选择性的。不过，发现Y1结合对若干种白血病细胞的样品，特别是急 性期的样品具有高度选择性。按下述方法进一步分析了Y1-scFv结 合。
在图3中示出了YI与三种AML样品结合的代表性结果。在每一种 情况下，大部分细胞群体所发出的荧光强度明显高于通过用阴性对照 scFv染色所获得的本底荧光强度。以上结果表明，对于每一位患者来 说，Y1与所述总的细胞群体中的不同部分结合。在每一个曲线图上右 侧的Y-1峰被认为表示所述群体中Y1-结合细胞的最低数量，该峰下面 的总细胞的比例可能表示每一种样品中YI-结合细胞的最小比例。
8.3 Y-1与正常血细胞的结合：根据不同的血细胞类型分析Y1与 Ficoll纯化的正常血细胞的结合。尽管未检测到与正常淋巴细胞的结 合，Y1能结合来自9/28受试者的纯化Ficoll纯化的单核细胞，来自 5/8受试者的血小板，和来自1/4受试者的红血细胞(RBC)。不过，CD14- 特异性抗体能结合所有单核细胞制备物中的细胞，和很多中性粒细胞 制备物中的细胞。在表7中提供了该分析的概况。
表7.scFv与Ficoll纯化的正常血细胞结合的FACS分析。

以上结合结果表示通过FACS分析确定的正常血液样品的比例，它 能与每一种测试抗体发生阳性反应。应当指出的是，尽管是在固定血 小板上选择，FITC-Y1 scFv表现出与血小板的较低的结合力。
图4表示Y1与Ficoll纯化的血小板的结合(4a)和与单核细胞门 控细胞的结合(4b)。在单核细胞群上的变动大于在血小板上观察到 的变动，计算出的平均荧光强度，分别比阴性对照高30倍和5倍。这 一结果极有可能是血小板重复附着在Ficoll纯化的单核细胞上的特 征所导致的。随后的实验表明，当在全血样品中分析时，在测试的正 常单核细胞，粒细胞，血小板和RBC中都观察到Y1结合。类似地，当 血小板来自血小板富集血浆(PRP)时，没有观察到Y1与血小板的结 合。在相同的结合条件下(在全血中，随后在FACS裂解缓冲液[Becton Dickenson])进行RBC裂解)，Y1以类似于在Ficoll纯化之后获得 的方式与白血病细胞结合。因此，我们可以得出这样的结论，在天然 条件下，血小板或单核细胞上的Y-I表位是隐藏的。在Ficoll纯化过 程中，所述表位暴露出来，使它能够被Y1识别，而对于白血病细胞来 说，所述表位在纯化和非纯化条件下都是暴露的。
除了淋巴和骨髓系的正常造血细胞祖细胞之外，测试了Y1与脐带 血中的造血干细胞(CD34+细胞)的结合。图5表示FITC标记过的scFv 克隆与脐带血CD34+干细胞的结合结果；图5a表示CD34+门控细胞与 FITC标记的阴性对照scFv的结合结果，而图5b表示对CD34+门控细 胞与FITC标记的scFv克隆Y1的相同的分析结果。图5c表示与图5b 中相同的FITC标记的scFv克隆Y-I样品的FSC和SSC点作图分析。 该分析的结果表明，存在来自脐带血的两种CD34+干细胞亚群，在表示 细胞大小的前向散射(FSC)方面具有差异。Y1能与这两个群体中的较 小的细胞结合。在图5b和5c中用圆圈圈起来的部分表示能结合克隆 Y1 scFv的CD34+细胞的亚群。进一步分析表明，较小的细胞是出现在 细胞群中的死亡细胞，而Y1结合可能表明存在由Y1识别细胞内配体。
还用GM-CSF预处理过的健康供体的外周血细胞进行了该实验 (GM-CSF处理将干细胞转移释放到血液中)。获得了类似于图5所示 的结果。
8.4 与AML细胞上的各种细胞标记相比较的Y1 scFv的结合特异 性：将来自AML患者的Ficoll纯化的外周细胞和骨髓细胞的Y1染色 与通过一组其他抗体对所述细胞的染色进行比较。在表8中归纳了对 来自14位患者的样品进行的FACS分析的结果。应当指出的是，对包 括Y1在内的所有测试过的标记来说，在来自各个个体的制备物中的染 色细胞的频率存在显著的变异。在各种标记的结果和Y1的结合之间缺 乏相关性，这表明Y1不能结合由其他测试标记结合的任何配体，并且， Y-1配体并不构成测试过的任何细胞表面标记。
     表8.比较Y1 scFv和抗体与各种细胞标记的结合

**BM/PB-骨髓/外周血
以上结果是以在特定患者的Ficoll纯化的样品中细胞的百分比形 式表达的，所述结果是通过FACS分析确定的，它与每一种独立的抗体 发生阳性反应。
就结合检测所需要的Y1的浓度(大约1μg/5×105)而言，以上结 果表明，Y1 scFv对AML细胞上的特定抗体具有较高的结合力。
除了表8所示的表示Y1与AML细胞结合的结果之外，上面我们业 已证实(表6)Y1还能结合包括B-ALL细胞在内的测试过的大多数其 他类型的白血病细胞，不过，所述其他白血病样品的样品大小是有限 的。图6表示Y1 scFv与从两位患者体内获得的前-B-ALL细胞的结合 的FACS分析。采用双染色方法，使用市售PE-标记的CD 19(正常外 周B细胞的标记，图6a，6c)或PE-标记的CD 34(干细胞的标记，图 6d)，同时使用FITC标记的阴性对照scFv或FITC标记的Y1 scFv。 图6b是双阴性对照。提供了由FITC标记的样品结合的细胞(scFv克 隆Y1)的荧光强度(X轴)，对比提供了阴性对照染色模式(6e和6f)。 图6的结果表明，在两种样品的每一种中的白血病、前-B-ALL细胞的 大部分由于Y-I结合，对于Y1细胞染色来说是阳性的。
8.5 YI-scFv与细胞系的结合：筛选了来自恶性造血细胞系的若 干细胞系被Y1识别的能力。FACS分析表明，Y1能结合很多测试过的 细胞(表9)。应当注意的是，仅试验了一个人B-细胞系和一个小鼠 骨髓细胞系。重要的是，这种结合局限于指数生长细胞。处在静止期 的细胞基本上不能结合Y1，这表明Y1配体表达是在所述细胞的生命周 期中受调控的。另外，在所述反应细胞之间的结合强度不同。这一发 现意味着不同细胞中的所述配体在表达水平或亲和力方面存在差异。
                       表9.Y1与造血细胞系的结合 类型 高反应性 中等反应性 低反应性 人骨髓 KG-1；THP-1；U937； Tf-1；MEG HL-60；HEL；K-562； MC1010 NB-4 人B-细胞 Namalwa；Daudi； UMUC3，RAJI 人T-细胞 Jurkat；Hs-602 CCRF-CEM；Molt-4； Hut-78； 小鼠骨髓 M1；P388D1；PU5- 1.8； WEHI-274.1
8.6 在存在DTT的条件下纯化的Y1的结合：一旦选择了Y1克隆， 就进一步开发生产scFv的方法。Y1批量的FTLC分析结果表明，所述 蛋白可以多聚体化，主要形成单体和四聚体，这两种形式之间的比例 在一种制备物与另一种制备物之间存在差别。为了获得一致的物质， 在蛋白-A琼脂糖凝胶柱上进行亲和纯化期间添加5mM DTT，然后通过 PBS缓冲液交换除去。实际上，在DTT处理之后，大部分(＞90％)物 质出现在单体级份中。在单体形式的Y1的结合(在存在DTT的条件下 纯化，并且在HPLC上分析)和Y1形式的混合物的结合之间，不存在 显著差别。
8.7 Y1是对白血病细胞特异的克隆：Y1盒属于VH-DP32种系。在 实施例6中分离并详细说明了来自相同种系若干种其他克隆。所述克 隆包括Y17，Y27和Y-44，所有这些克隆的一级序列(种系盒)的差 别仅在于它的CDR3区。不过，Y1表现出对白血病细胞的选择性。在表 10中归纳了这些克隆的CD3序列，并且在表11中归纳了所述克隆的结 合特征。
        表10：VH3-DP32分离的克隆的CDR3序列。

        表11：VH3-DP32分离的克隆的结合特征     克隆编号 结合特异性     Y1 能与很多白血病细胞结合     Y17 能与包括正常淋巴细胞在内的所有测试过 的造血细胞结合     Y-27 不能与任何测试过的造血细胞结合     Y-44 不能与任何测试过的造血细胞结合
表10和11表明，尽管在四种克隆之间除了VH-CDR3区之外，主 要序列相同，但是克隆之间的结合特征明显不同。这一发现加强了 VH-CDR3区的序列在对所述抗原的结合位点的特异性方面发挥重要作 用的观点。应当指出的是，CDR3序列的长度或存在该序列的特定种系 盒似乎都不是结合特异性的主要决定因素。与Y1一样，Y17和Y-27 各自包括一个六聚体CDR3，并且所有三个克隆的重链都来自相同的种 系。对于Y17和Y-27来说，没有证实与造血细胞的选择性结合。
实施例9
9.1 三抗体的构建：通过PCR分别扩增编码原始Y1的载体pHEN-Y1 的VL区和VH区。对于VLPCR反应来说，使用有义寡核苷酸5′- AACTCGAGTGAGCTGACACAGGACCCT，和反义寡核苷酸5′- TTTGTCGACTCATTTCTTTTTTGCGGCCGCACC。对大约350bp的预期大小的 cDNA产物进行纯化、测序，并且用XhoI和NotI限制酶消化。
用相同方法扩增VH区(使用有义寡核苷酸5′-ATGAAATACCTATTGCCTACGG 和反义寡核苷酸5′-AACTCGAGACGGTGACCAGGGTACC)。用NcoI和XhoI限制 酶消化VHPCR产物。将三重连接方法用在用NcoI-NotI预先消化过的 pHEN载体上。最终的载体被命名为pTria-Y1。
在大肠杆菌转化之后，挑选若干克隆作进一步的分析，所述分析 包括DNA测序、蛋白表达、和从细菌的周质间隙中提取。在还原条件 下进行SDS-PAGE分析和Western印迹分析，以便证实Y1三抗体的大 小。
9.2 双抗体的构建
用XhoI限制酶使上述pTria-Y1载体线性化，并且使合成的互补 双链寡核苷酸(5′-TCGAGAGGTGGAGGCGGT和5′TCGAACCGCCTCCACCTC) 预先退火，并且连接到Y1重链和Y1轻链之间的XhoI位点上。这种新 的载体被命名为pDia-Y1。按照说明三抗体时所披露的方法，验证其 DNA序列和蛋白表达。
9.3 三抗体和双抗体的表达和纯化
在大肠杆菌中的表达大体上如上文结合scFv-Y1所述。不过，从 转化过的大肠杆菌细胞的周质中纯化Y1双抗体和三抗体的方法不同。 scFv Y1单体形式可以在蛋白-A琼脂糖凝胶珠的亲和柱上纯化。不过， 这种方法不能有效纯化多聚体形式的Y1。因此，用60％的硫酸铵使从 所述细菌中提取的周质蛋白沉淀过夜，重新悬浮在水中，并且加样到 用0.1×PBS预平衡过的Sephacryl-200(Pharmacia)大小排阻柱上。 收集级份，并且通过HPLC分析，收集含有二聚体或三聚体形式的独立 的级份，用于FITC标记和FACS分析。
9.4 Y1双抗体和三抗体与细胞的结合
用“三步染色方法”对Jurkat细胞进行FACS分析。首先，对粗 制提取物或纯化的未标记过的scFv进行染色，然后使用小鼠抗-myc 抗体，最后使用FITC-或PE-偶联的抗小鼠抗体。FACS分析需要5-8×105 细胞，所述细胞经过Ficoll纯化，并且重新悬浮在PBS+1％BSA中。 在4℃下进行结合1小时。在每一个步骤之后，洗涤细胞，并且重新悬 浮在PBS+1％BSA中。在最终的染色步骤之后，通过重新悬浮在PBS， 1％BSA，2％甲醛中固定细胞，然后通过FACS(Becton-Dickinson) 读数。
将Y1-scFv的结合与双抗体和三抗体的结合加以比较。在该分析 (图7)中，所有三种形式的结合特征非常相似，这表明在所述分子上 的上述修饰不会改变、消除或破坏Y1与它的配体的表观结合力。
9.5 Y1-cys-kak(半胱氨酸二聚体)的生产
在42℃下诱导1升λpL-y1-cys-kak细菌培养物2-3小时。以 5000RPM的速度将该培养物离心30分钟。将沉淀重新悬浮在180ml TE (50mM Tris-HCl pH 7.4，20mM EDTA)中。添加8ml的溶菌酶(来自 5mg/ml的母液)，并且温育1小时。添加20ml的5M NaCl和25ml 的25％Triton，并且再温育1小时。在4℃下以13000RPM的速度离 心该混合物60分钟，弃掉上清液。借助于组织搅拌器(或匀浆器)， 将沉淀重新悬浮在TE中。重复该过程3-4次，直到包含体(沉淀物) 变成灰色/浅棕色。将所述包含体溶解在6M盐酸胍，0.1M Tris pH 7.4，2mM EDTA(溶解在10ml溶解缓冲液中的1.5克包含体，能提 供大约10mg/ml溶解蛋白)。将该溶液培养至少4小时。测定蛋白浓 度，并且将浓度调整到10mg/ml。添加DTE至最终浓度为65mM，并 且在室温下培养过夜。通过将10ml蛋白稀释(逐滴稀释)到含有0.5 M精氨酸，0.1M Tris pH 8，2mM EDTA，0.9mM GSSG的溶液中启 动重新折叠。在大约10℃下，将重新折叠的溶液培养48小时。在含有 25mM磷酸缓冲液pH 6，100mM尿素的缓冲液中透析含有所述蛋白的 重新折叠的溶液，并且浓缩到500ml。将浓缩的/透析的溶液结合到SP- 琼脂糖凝胶柱上，并且通过梯度NaCl(最高达1M)洗脱所述蛋白。
9.6 通过放射性受体结合测定(RRA)，使用KG-1细胞研究S-S Y1- 二聚体的亲和力，并与CONY1和Y1-IgG进行比较
所述分析系统包括使用放射性配体，所述配体是通过用125I进行碘 化制备的，将氯胺T用在Y1-IgG构建体上，或者将Bolton-Hunter 试剂用在CONY1(Y1 scFV)构建体上。分析试管中每0.2ml溶液中含 有5×106KG-1细胞，和具有不同数量的未标记过的竞争剂的标记过的 示踪剂，溶解在PBS+0.1％BSA，pH 7.4中。在4℃下搅拌培养1 小时之后，用冷缓冲液充分洗涤所述细胞，并且用于放射性计数。
在使用标记过的Y1-IgG的RRA研究中，使用了2ng/试管的 125I-Y1-IgG，并且与上述三种分子中的每一种进行竞争。结果如图8 所示。在图8中提供的结果表明，S-S Y1二聚体的亲和力比CONY1的 亲和力高30倍。在该实验中大体上估计的Y1-IgG的亲和力为2×10-8 M。因此，所述二聚体的相应的亲和力为4×10-8M。
在使用标记过的CONY1的第二种RRA研究中，使用了100ng/试管 的125I-Y1-IgG，并且与上述三种分子中的每一种进行竞争。结果如图 9所示。该图表明，S-S Y1二聚体的亲和力比CONY1的亲和力高20倍。 在该实验中大体上估计的CONY1的亲和力为10-6M。因此，所述二聚 体的相应的亲和力为5×10-8M。
9.7 对GC(glycocalicin)的ELISA分析
在4℃下，在96孔平底maxisorp平板上温育100μl纯化的 glycocalicin过夜，用PBST(PBS+0.05％tween)洗涤所述平板3次， 然后添加200ml PBST-乳(PBST+2％无脂乳)，在室温下温育1小时。 用PBST洗涤所述平板，并且以不同的浓度将所述单体或二聚体(100μ 1)添加到PBST-乳液中，在室温下温育1小时。然后洗涤所述平板， 并且添加抗-VL多克隆抗体(来自免疫过的兔，VL来自Y1)(在PBST- 乳中以1∶100的比例稀释)，温育1小时。洗涤所述平板，并且添加 抗-兔HRP，再温育1小时。洗涤所述平板5次，并且添加100μl TMB 底物，温育大约15分钟，然后添加100μl0.5 H2SO4，以便终止反应。 在ELISA读数器中，在450nm波长下测定该平板的光学密度。
9.8 Y1与在原核(大肠杆菌)系统中表达的重组glycocalicin(GC) 的反应性
将编码人血小板GP1b-glycocalicin的N-末端可溶性部分(GC， 1-493号氨基酸)的DNA片段克隆到IPTG诱导型原核载体盒上。在37 ℃下，将获得了新构建的质粒的大肠杆菌(BL21 DE3)细胞生长到O.D. 为0.7-0.8，然后在37℃下生长3小时，以便在存在IPTG的条件下进 行诱导。分析加载了来自GC的天然半纯化人血小板或来自诱导过的和 未诱导过的细胞的大肠杆菌细胞裂解物(总蛋白含量)的SDS-聚丙烯 酰胺凝胶。用scFv Y1-生物素化的，多克隆兔抗人GC抗体，从商业 渠道获得的人抗小鼠CD42单克隆抗体(SZ2 Immunotech，PM640 Serotec，HIP1 Pharmigen，AN51 DAKO)和抗gp1ba的N-末端的多克 隆抗体(Sc-7071，Santa Cruz)进行Western印迹分析。以上两种多 克隆抗体能识别重组细菌来源的GC和天然人血小板来源的GC。所述 scFv Y1和市售抗体只能识别天然人来源的GC，而不能识别所述细菌 来源的重组血小板GC。
诸如糖基化和硫酸化的翻译后修饰对于与GC结合的scFv和市售 抗体来说是必需的。所述原核(大肠杆菌)系统缺少诸如糖基化和硫 酸化的翻译后修饰机制。
9.9 制备Y1的四聚体
设计一种构建体，其中，通过PCR将以下序列LNDIFEAQKIEWHE 添加在Y1的C-末端，并且克隆到IPGC诱导型表达系统中。该克隆被 命名为Y1-生物标记。该序列是酶BirA的底物，在存在游离生物素的 条件下，这种酶能够将生物素共价连接到赖氨酸(K)残基上(抗原特 异性T淋巴细胞的表型分析。Science.1996 Oct 4；274(5284)： 94-6，Altman JD等)。该构建体是作为包含体在BL21细菌细胞中 生产的。按上述方法进行重新折叠。将该包含体溶解在胍-DTE中。通 过在含有精氨酸-tris-EDTA的缓冲液中稀释进行重新折叠。在透析和 浓缩之后，进行HiTrapQ离子交换纯化。
按照供应商的推荐，将纯化的Y1-生物标记scFv与BirA酶(购 自Avidity)和生物素一起温育。通过HABA测试，分析生物素化的Y1- 生物标记(该分析估算出每个分子的生物素量)，并且表明存在大约＞ 0.8生物素残余物/分子。
将生物素化的Y1-生物标记与链亲合素-PE(藻红蛋白)一起培 养，以便形成复合物，并用于采用KG-1细胞(Y1阳性)的FACS实验。 链亲合素最多能结合4个生物素化的Y-1-生物标记分子。由于抗体亲 抗原性的提高，所述结合的灵敏度提高了至少100倍。
Y1-生物标记的序列如下：
   1    MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ
   41   APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL
   81   YLQMNSLRAE DTAVYYCARM RAPVTWGQGT LVTVSRGGGG
   121  SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY
   161  YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA
   201  SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSGNNVVFG GGTKLTVLGG
   241  GGLNDIFEAQ KIEWHE
实施例10：完整大小Y1-IgG1的构建
与Fv形式相比，完整的IgG分子具有若干优点，包括在体内的较 长的半衰期和诱导体内细胞反应的潜力，如由ADCC或CDC(补体依赖 型细胞毒性；Tomlinson，Current Opinions of Immunology，5， 83-89(1993))介导的反应。通过下文披露的分子克隆方法，我们业 已将Y1 Fv区转化成完整大小的Y1-IgG1分子。Y1-IgG1构建体的构 建是通过按以下顺序彼此连接cDNA片段完成的。
10.1 与哺乳动物表达系统相容的前导序列：设计一种可交换的系 统，以便能方便地插入完整IgG分子所需要的elerAents。合成了以 下编码推测的前导序列的互补双链寡核苷酸，退火，并且连接到哺乳 动物表达载体(受SRα5启动子的控制)的XhoI位点上。
5′-
TCGACCTCATCACCATGGCCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTC
AGGACACAGGGTCCTGGGCCGAT
和
5′-
GATCGATTGCACCAGCTGGATATCGGCCCAGGACCCTGTGTCCTGAGTGA
GGAGGGTGAGGAGCAGCAGCCCAGGCCATGGTGATGAGG.
在起始ATG密码子上游包括两个Kozak元件。另外，在所述前导序列 的推测的裂解位点和XhoI位点导入一个内部EcoRV位点，以便能亚克 隆其可变区。这种修饰过的载体被命名为pBJ-3。
10.2 将来自Y1 scFv cDNA序列的VL编码序列插入前导序列和所 述构建体轻区编码序列之间。类似地，将来自Y1 scFv cDNA序列的VH 编码序列插入前导序列和所述构建体重区编码序列之间。这一目的是 通过PCR扩增编码起始Y1的载体pHEN-Y1实现的，以便分别获得VL 和VH区。
10.3 将寡核苷酸5′-TTTGATATCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA(有义) 和5′-GCTGACCTAGGACGGTCAGCTTGGT(反义)用于VL PCR反应。纯化具 有大约350bp的预期大小的cDNA产物，测序，并且用EcoRV和AvrII 限制酶消化。用相同的方法扩增并纯化VH cDNA区，分别使用有义和 反义寡核苷酸5′-GGGATATCCAGCTG(C/G)(A/T)GGAGTCGGGC和 5′-GGACTCGAGACGGTGACCAGGGTACCTTG。
10.4 恒定区：按以下方法分别合成用于IgG1 cDNA的恒定λ3(CL- λ3)区和恒定重区CH1-CH3。
10.4.1 对于恒定CL-λ3区来说，用从正常外周B细胞(CD 19+细胞)库 中提取的mRNA进行RT-PCR，同时使用有义5′-CCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGC 和反义5′-TTTGCGGCCGCTCATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGT寡核苷酸。纯化具有 预期大小(大约400bp)的PCR产物，测序，并且用AvrII和NotI 限制酶消化。
10.4.2 对于恒定IgGI区(γ链)来说，选择在BTG永生化的人 B细胞克隆(CMV-克隆#40)进行PCR扩增。证实该克隆能分泌抗人CMV 的IgG1，并且还证实能在体外分析中诱导ADCC反应。对于CH1-CH3 cDNA来说，合成寡核苷酸5′-CCGCTCGAGTGC(T/C)TCCACCAAGGGCCCATC(G/C) GTCTTC(有义)和5′TTTGCGGCCGCTCATTTACCC(A/G)GAGACAGGGAGAGGCT(反 义)，并用于PCR扩增。正如对CL cDNA编码序列所披露的，纯化预期大小(大 约1500bp)的PCR产物，测序，并且用AvrII和NotI限制酶消化。
10.5 对于最终的表达载体来说，用EcoRV-NotI预消化的载体， EcoRV-AvrII可变cDNAs和AvrII-NotI恒定区实施三重连接方法。用 于重链和轻链表达的最终载体分别被命名为Y-I-HC和Y1-LC。
10.6 根据Y1-LC构建另一种载体pBJ-Y1-LP，以便能够根据嘌呤 霉素抗性基因(PAC)进行双筛选。在该载体中，Y1-LC质粒的新霉素抗 性基因被一个编码PAC基因的大约1600bp的片段(来自pMCC-ZP载 体)所取代。
10.7 下面提供了Y-1-IgG-HC和Y1-IgG-LC的开放读框(ORL) 及其编码的氨基酸序列：
10.7.1 Y1-IgG-HC的ORF(VH CH1 CH2 CH3)
1      ATGGCCTGGGCTCTGCTGCTCCTOACCCTCCTCACTCAGGACACAGGGTCCTGGGCCGAT
1       M  A  W  A  L  L  L  L  T  L  L  T  Q  D  T  G  S  W  A  D
61     ATCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGOTGTGGTACGGCCTGGGGOGTCCCTGAGACTCTCC
21      I  Q  L  V  E  S  G  G  G  V  V  R  P  G  G  S  L  R  L  S
121    TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCA
41      C  A  A  S  G  F  T  F  D  D  Y  G  M  S  W  V  R  Q  A  P
181    GGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACAGGTTATGCA
61      G  K  G  L  R  W  V  S  G  I  N  W  N  G  G  S  T  G  Y  A
241    GACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTG
81      D  S  V  K  G  R  F  T  I  S  R  D  N  A  K  N  S  L  Y  L
301    CAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAATGAGGGCT
101     Q  M  N  S  L  R  A  E  D  T  A  V  Y  Y  C  A  R  M  R  A
361    CCTGTGATTTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTTCCACCAAGGGCCCA
121     P  V  I  W  G  Q  G  T  L  V  T  V  S  S  A  S  T  K  G  P
421    TCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGC
141     S  V  F  P  L  A  P  S  S  K  S  T  S  G  G  T  A  A  L  G
481    TGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTG
161     C  L  V  K  D  Y  F  P  E  P  V  T  V  S  W  N  S  G  A  L
541    ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC
181     T  S  G  V  H  T  F  P  A  V  L  Q  S  S  G  L  Y  S  L  S
601    AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT
201     S  V  V  T  V  P  S  S  S  L  G  T  Q  T  Y  I  C  N  V  N
661    CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT
221     H  K  P  S  N  T  K  V  D  K  R  V  E  P  K  S  C  D  K  T
721    CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACTGTCAGTCTTCOTCTTC
241     H  T  C  P  P  C  P  A  P  E  L  L  G  G  P  S  V  F  L  F
781    CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTG
261     P  P  K  P  K  D  T  L  M  I  S  R  T  P  E  V  T  C  V  V
841    GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG
281     V  D  V  S  H  E  D  P  E  V  K  F  N  W  Y  V  D  G  V  E
901    GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC
301     V  H  N  A  K  T  K  P  R  E  E  Q  Y  N  S  T  Y  R  V  V
961    AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC
321      S  V  L  T  V  L  H  Q  D  W  L  N  G  K  E  Y  K  C  K  V
1021    TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
341      S  N  K  A  L  P  A  P  I  E  K  T  I  S  K  A  K  G  Q  P
1081    OGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC
361      R  E  P  Q  V  Y  T  L  P  P  S  R  E  E  M  T  K  N  Q  V
1141    AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
381      S  L  T  C  L  V  K  G  F  Y  P  S  D  I  A  V  E  W  E  S
1201    AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGTCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC
401      N  G  Q  P  E  N  N  Y  K  T  T  S  P  V  L  D  S  D  G  S
1261    TTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGCACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC
421     F  F  L  Y  S  K  L  T  V  D  K  S  R  W  Q  Q  G  N  V  F
1321    TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
441      S  C  S  V  M  H  E  A  L  H  N  H  Y  T  Q  K  S  L  S  L
1381    TCTCTGGGTAAATGA
461      S  L  G  K  *
10.7.2 Y1-IgG-LC的ORF(VL CL)
1       ATGGCCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAGGACACAGGGTCCTGGGCCGAT
1        M  A  W  A  L  L  L  L  T  L  L  T  Q  D  T  G  S  W  A  D
61      GCAGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACA
21       A  E  L  T  Q  D  P  A  V  S  V  A  L  G  Q  T  V  R  I  T
1212    TGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAG
41       C  Q  G  D  S  L  R  S  Y  Y  A  S  W  Y  Q  Q  K  P  G  Q
181     GCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTC
161      A  P  V  L  V  I  Y  G  K  N  N  R  P  S  G  I  P  D  R  F
241     TCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGAT
81       S  G  S  S  S  G  N  T  A  S  L  T  I  T  G  A  Q  A  E  D
301     GAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGA
101      E  A  D  Y  Y  C  N  S  R  D  S  S  G  N  H  V  V  F  G  G
361     GGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCG
121      G  T  K  L  T  V  L  G  Q  P  K  A  A  P  S  V  T  L  F  P
421     CCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTC
141      P  S  S  E  E  L  Q  A  N  K  A  T  L  V  C  L  I  S  D  F
481     TACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTG
161      Y  P  G  A  V  T  V  A  W  K  A  D  S  S  P  V  K  A  G  V
541     GAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGC
181      E  T  T  T  P  S  K  Q  S  N  N  K  Y  A  A  S  S  Y  L  S
601     CTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGG
201      L  T  P  E  Q  W  K  S  H  K  S  Y  S  C  Q  V  T  H  E  G
661     AGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATGA
221      S  T  V  E  K  T  V  A  P  T  E  C  S  *
对前导序列加下划线。VH和VL区分别是由粗体氨基酸序列编码 的，随后是IgG1(对于重链而言)或λ3(对于轻链而言)恒定区序列。
10.8 Y1重链和轻链在CHO细胞中的表达
将载体Y1-HC和Y1-LC分别用于转染和选择能表达所述重链或轻 链的稳定细胞。在G418上选择和细胞生长之后，通过下文所述的捕获 EIA分析和Western印迹分析上清液中分泌的蛋白，以便证实IgGI表 达。
10.8.1 捕获EIA分析：预先用小鼠抗人IgGI Fc(Sigma)对96 孔平板的孔进行包被，将从上述方法获得的上清液添加到所述孔中， 并且用生物素化的山羊抗γ链特异性抗体(Sigma)，链亲合素-HRP和 底物检测重链IgGI的存在。在A405波长下用ELISA平板读数器监测颜 色的形成。
10.8.2 Western印迹分析：将上述细胞的上清液放在12.5％ SDS-PAGE上电泳。用(a)山羊抗人IgG-HRP(H+L；Sigma目录号A8667) 检测重链表达，并且用(b)生物素化的山羊抗人λ3链(Southern Biotechnology Association，目录号2070-08)用于检测轻链表达。
通过上述分析证实了两条链的表达，并且进行共转染，以便获得 完整大小的Y1-IgG1。
10.9 Y1-IgG的表达和纯化
10.9.1 细胞培养和转染：在37℃下，在5％CO2空气中，用含有 10％胎牛血清和40μg/ml庆大霉素的F-12培养基培养CHO细胞。在 转染前1天，将0.8×106个细胞接种到90mm的培养皿上。通过FuGene (Roche)转染试剂技术，用10μg轻链和重链DNA共转染所述培养物。 在非选择性培养基中生长2天之后，在含有550μg/ml新霉素和3μ g/ml嘌呤霉素的F-12培养基中培养所述细胞10-12天。对所述细胞 进行胰蛋白酶酶解，并且通过在Costar 96孔平板中进行0.5细胞/ 孔的限制稀释而进行克隆。挑选单克隆，在6孔培养皿上生长，并且 转移到烧瓶中。
10.9.2 测定重链和轻链分泌：利用夹心ELISA分析测定分泌到转 染过的CHO细胞的上清液中的抗体浓度。为了测定所述抗体的浓度， 使用以下试剂：用单克隆抗人IgG1(Fc)(Sigma)作包被抗体，用山 羊抗人IgG(γ链特异性)生物素偶联物作检测剂(Sigma)，并且用纯 的人IgG1、λ(Sigma)作标准物。根据该ELISA分析证实，产量率在 3-4μg/ml之间波动。
10.9.3 从所述细胞中生产并纯化Mab：让细胞在滚瓶中在补充了 新霉素和嘌呤霉素的含有10％胎牛血清的F-12培养基中生长到每瓶 1-2×108细胞的最终浓度。为了生产，让细胞在含有2％胎牛血清的相同 培养基中再培养2天。在蛋白G-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia)上纯化分 泌的抗体。结合是在pH 7.0的20mM磷酸钠缓冲液中进行的；洗脱是 用pH 2.5-3-0的0.1M甘氨酸进行的。通过UV吸收值测定纯化抗体 的数量；通过SDS PAGE分析纯度。在非变性条件下，完整的IgG抗体 具有其预期的160kD的分子量。在变性凝胶中，重链和轻链分别具有 55和28kD的预期分子量。
10.9.4 完整大小Y1-IgG分子的结合：进行结合实验，以便确定 Y1-IgG分子的结合水平，并且与scFv-Y1分子的结合水平进行比较。 采用两步骤染色方法，其中，让5ng Y1-IgG与RAJI细胞(阴性对照， 图7a)和Jurkat细胞(Y1阳性细胞，图7b)起反应。为了检测，使 用PE标记的山羊抗人IgG。类似地，让1μg scFv-Y1与Jurkat细胞 起反应(图7c)，并且将P1-标记的兔抗scFv用于检测。结果表明， Y1-IgG和scFv-Y1都能结合Jurkat细胞，为了获得类似于Y1-IgG的 检测水平需要高出大约103倍的scFv-Y1分子。
表格的简要说明
表1：来自方法AM的淘选结果。归纳了四个连续步骤的AM生物淘 选方法的用于淘选的估算噬菌粒数量(输入)，和洗脱的结合噬菌粒 的估计数量(产出)。列举了每一种产出结果的细胞来源和洗脱介质， 以及用于区分每一种毒粒的独立的原种的术语。
表2：按照AM生物淘选方法选择的克隆。归纳了CDR3区中的氨基 酸数量(VH-CDR3大小)，和分离的不同类型克隆的CDR3氨基酸序列。 另外，提供了在两种AM生物淘选产出物T16M3和T16M3.1产出物中 每一种类型克隆的频率。
表3：来自YPR方法的淘选结果。归纳了用于淘选的噬菌粒的估计 数量(输入)，和洗脱的结合噬菌粒的估计数量(产出)。列举了每 一种产出结果的洗脱介质，以及用于区分每一种独立的原种的术语。
表4：来自YPNR方法的淘选结果。归纳了三个连续步骤的YPNR生 物淘选方法的用于淘选的噬菌粒的估计数量(输入)和洗脱的结合噬 菌粒的估计数量(产出)。列举了每一种产出结果的洗脱介质，以及 用于区分每一种不同原种的术语。
表5：用R3产出物按照YPR生物淘选方法选择的Y-系列克隆。在 R3产出原种中鉴定了若干不同的克隆。提供了所鉴定克隆的VH-CDR3 区所包含的氨基酸残基数量和氨基酸序列，以及种系名称。
表6：Y1对白血病细胞的结合特异性。提供了三种不同scFv克隆 的结合实验的结果，通过FACS分析证实，每一种克隆能与主要含有七 种不同类型的白血病细胞的每一种的细胞混合物起反应。所述结果表 示患者的比例，所述患者的细胞通过FACS分析证实能够与每一种测试 抗体发生阳性反应。分子表示阳性患者的数量，而分母表示测试特定 scFv/白血病细胞类型组合的患者的总数。
表7：scFv与Ficoll纯化的正常血细胞结合的FACS分析。分别 分析三种scFv克隆与五种不同的Ficoll纯化的正常血细胞类型的结 合。所述结合结果表示正常血液样品的比例，所述样品通过FACS分析 证实能与每一种测试抗体起阳性反应。
表8：Y1 scFv和抗体与各种细胞标记结合的比较。提供了通过Y1 和一组其他抗体染色的scFv分析结果。制备来自ANE患者的Ficoll 纯化的外周和骨髓细胞，并且在AML细胞上对比研究了Y1 scFv的结 合特异性和各种细胞标记的结合特异性。结果以特定患者的Ficoll纯 化的样品中细胞的百分比形式表示，所述细胞通过FACS分析证实能与 每一种Fv起阳性反应。用四种其他的抗体进行比较：(1)CD13-粒细 胞和单核细胞标记；(2)CD14-单核细胞和中性粒细胞的标记；(3) CD33-正常骨髓细胞和白血病骨髓细胞的标记；和(4)CD34-干细胞标 记。
表9：Y1与造血细胞系的结合。进行FACS分析，以便确定Y1 scFv 与不同类型人白血病细胞系的结合，以及与一种鼠细胞系的结合。列 举了Y1能阳性结合(反应性)或不能结合(无反应性)的细胞系。
表10：VH3-DP32分离的克隆的CDR3序列。
按照不同的生物淘选和选择方法，分离了基于DP32种系的若干个 克隆。克隆Y1，Y17，Y-27和Y-44是在用血小板生物淘选选择期间 鉴定的(YPR和YPNR方法)。提供所述每一种克隆的VH-CDR3区序列。
表11：VH3-DP32分离的克隆的结合特征。通过FACS分析检测了 DP32-衍生克隆与若干种造血细胞的结合特异性。
业已结合特定实施方案，材料和数据对本发明进行了说明。正如 本领域技术人员可以理解的，可以获得使用或制备本发明的各个方面 的替代方案。所述替代方案被认为包括在由以下权利要求书所限定的 本发明的期望和构思范围内。
序列表
<110>生物技术通用公司
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val
1               5                   10
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>2
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Gly
1               5                   10
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>3
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Leu Arg Val
1               5
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>4
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Thr
1               5
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>5
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Phe Gln Leu Val
1               5                   10
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>6
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr
1               5
<210>7
<211>111
<212>PRT
<213>人
<400>7
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1               5                   10                  15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
            20                  25                  30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
        35                  40                  45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly rle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
    50                  55                  60
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65                  70                  75                  80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val
                85                  90                  95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala
            100                 105                 110
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>8
Met Arg Ala Pro Val Ile
1               5
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>9
Pro Trp Asp Asp Val Thr Pro Pro
1               5
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>10
Gly Phe Pro Arg Ile Thr Pro Pro Ser Ala Glu Ile
1               5                   10
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>11
Gly Phe Pro Met Pro
1               5
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>12
Gly Phe Pro His Ser Ser Ser Val Ser Arg
1               5                   10
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>13
Arg Phe Pro Met Arg His Glu Lys Thr Asn Tyr
1                 5                      10
<210>14
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>14
Arg Phe Pro Pro Thr Ala Thr Ile
1                 5
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>15
Thr Gln Arg Arg Asp Leu Gly
1                 5
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>16
Lys Phe Pro Gly Gly Thr Val Arg Gly Leu Lys
1                 5                      10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>17
Gly Phe Pro Val Ile Val Glu Glu Arg Gln Ser Thr
1                  5                       10
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>18
Arg Phe Pro Gln Arg Val Asp Asn Arg Val
1                 5                     10
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>19
Thr Gly Gln Ser Ile Lys Arg Ser
1                   5
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>20
Leu Thr His Pro Tyr Phe
1                  5
<210>21
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>21
Leu Arg Pro Pro Gln Ser
1                 5
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>22
Thr Ser Lys Asn Thr Ser Ser Ser Lys Arg His
1                 5                        10
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>23
Arg Tyr Tyr Cys Arg Ser Ser Asp Cys Thr Val Ser
1                 5                      10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>24
Phe Arg Arg Met Glu Thr Val Pro Ala Pro
1                 5                      10
<210>25
<211>277
<212>PRT
<213>人
<400>25
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1                 5                      10                      15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
              20                     25                     30
Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
         35                     40                     45
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                     55                     60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr
65                     70                      75                    80
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                  85                     90                      95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
              100                   105                     110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly
         115                    120                     125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    130                     135                     140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
145                    150                    155                    160
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp
                  165                      170                   175
Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
              180                     185                    190
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile
         195                     200                    205
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
    210                     215                     220
Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser
225                     230                    235                   240
Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
                   245                        250               255
Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
              260                    265                     270
Leu Asn Gly Ala Ala
        275
<210>26
<211>464
<212>PRT
<213>人
<400>26
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Asp Thr Gly
1                 5                      10                     15
Ser Trp Ala Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg
              20                      25                     30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                     40                      45
Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                     55                     60
Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala
65                      70                     75                    80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                  85                      90                     95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
              100                   105                     110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly Gln Gly Thr
         115                    120                     125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
    130                     135                     140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145                     150                     155                  160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
                  165                    170                     175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
              180                     185                    190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
          195                     200                     205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
    210                     215                     220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225                   230                     235                    240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
                   245                    250                    255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
              260                    265                     270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
         275                     280                    285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
    290                     295                   300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305                    310                    315                    320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
                  325                     330                    335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
             340                     345                     350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
          355                     360                    365
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
     370                    375                    380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385                    390                     395                   400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Ser Pro Val Leu Asp
                  405                    410                    415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
              420                     425                   430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
         435                    440                     445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    450                     455                     460
<210>27
<211>233
<212>PRT
<213>人
<400>27
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Asp Thr Gly
1                 5                      10                    15
Ser Trp Ala Asp Ala Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
              20                     25                      30
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
         35                      40                     45
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
     50                     55                      60
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
65                      70                      75                   80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
                    85                     90                    95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
              100                   105                     110
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
         115                    120                     125
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
    130                     135                     140
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145                    150                   155                     160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Tro Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
                  165                     170                    175
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
             180                     185                     190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
         195                     200                     205
His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
     210                    215                     220
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                     230
<210>28
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>28
Phe Leu Thr Tyr Asn Ser Tyr Glu Val Pro Thr
1                 5                       10
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>29
Thr Asn Trp Tyr Leu Arg Pro Leu Asn
1                 5
<210>30
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                      15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
               20                      25                    30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
    50                     55                      60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                      70                      75                   80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Thr
<210>31
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                     15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
              20                      25                      30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro G1y Gln Glu Leu Gly Trp Met
         35                      40                    45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                      55                     60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                     70                      75                    80
Thr Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                   85                     90                    95
Ala Arg
<210>32
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ghu Leu
              20                      25                     30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                     55                      60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                    70                      75                     80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Thr
<210>33
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
              20                      25                     30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                      55                     60
Gln Gly Arg Val Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                     70                      75                    80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>34
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                     15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
              20                      25                     30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                      55                     60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                     70                      75                    80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>35
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
              20                      25                     30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                     40                     45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                      55                      60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                     70                      75                    80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>36
<211>98
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>X
<222>(1)..(98)
<223>Xaa
<400>36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Leu Gly Ala
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
              20                      25                     30
Tyr Met His Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                      55                      60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                     70                      75                    80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>37
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
              20                      25                     30
Cys Met His Trp Val Arg Gln Val His Ala Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Leu Val Cys Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                      55                      60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65                      70                     75                    80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Val Arg
<210>38
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>38
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser
              20                      25                     30
Ala Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
         35                      40                    45
Gly Trp Ile Val Val Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                      55                     60
Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                      70                     75                    80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Ala
<210>39
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                      30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
           35                      40                    45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                        55                     60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                      70                     75                    80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Arg
<210>40
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                      30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
          35                      40                     45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                        55                       60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                      70                     75                    80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>41
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                      55                      60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                      70                     75                    80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Arg
<210>42
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Trp Ser Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Glu Phe
     50                     55                     60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                      70                     75                    80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
                   85                    90                      95
Ala Arg
<210>43
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                       10                     15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                     40                     45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
     50                      55                     60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                     70                      75                    80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                   85                     90                     95
Ala Arg
<2l0>44
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                       10                     15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                     40                     45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
    50                      55                     60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                     70                      75                    80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                    85                     90                    95
Ala Arg
<210>45
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                     45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                     55                    60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                    70                       75                    80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>46
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                     15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
          35                      40                     45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
     50                      55                     60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                    70                      75                     80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                    90                      95
Ala Arg
<210>47
<211>92
<212>PRT
<213>人
<400>47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                     15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
          35                      40                     45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
     50                      55                    60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                     70                     75                     80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                  85                    90
<210>48
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                      10                     15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                       55                     60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                    70                      75                     80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>49
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1                 5                       10                    15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr
              20                      25                     30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                       55                     60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                     70                     75                     80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>50
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>50
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1                 5                      10                     15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg
              20                      25                     30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                       55                    60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65                      70                    75                     80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Arg
<210>51
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>51
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1                 5                      10                      15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg
              20                      25                     30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
         35                      40                    45
Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                      55                    60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65                      70                    75                     80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
               85                        90                     95
Ala Arg
<210>52
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>52
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1                 5                       10                    15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala
              20                     25                      30
Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
         35                      40                      45
Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser
     50                      55                     60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
65                     70                      75                    80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                  85                     90                     95
<210>53
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>53
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1                  5                       10                    15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
             20                       25                     30
Glu Trp Cys Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp
         35                      40                     45
Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu
    50                      55                     60
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val
65                      70                      75                   80
Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                  85                    90                      95
Ala His Arg
<210>54
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>54
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1                 5                      10                      15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
              20                     25                      30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
         35                      40                      45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
     50                     55                    60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                    70                       75                    80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                  85                    90                      95
<210>55
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>55
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1                 5                       10                    15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
              20                     25                      30
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
         35                      40                      45
Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser
     50                     55                    60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                     70                      75                    80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                  85                    90                      95
<210>56
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>56
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1                  5                       10                    15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
             20                      25                      30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
         35                      40                      45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
    50                       55                    60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                    70                     75                      80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                  85                     90                     95
Cys Ala His Arg
             100
<210>57
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1                5                      10                     15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
              20                     25                     30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                     40                     45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Val
     50                    55                      60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65                    70                       75                    80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                  85                     90                     95
Tyr Cys Ala Arg
             100
<210>58
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                     15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
              20                     25                     30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
         35                     40                     45
Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
     50                     55                     60
Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr
65                    70                       75                    80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
                  85                     90                     95
Tyr Cys Ala Arg
             100
<210>59
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
              20                     25                      30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
         35                     40                     45
Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
    50                      55                     60
Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr
65                     70                      75                    80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
                  85                    90                    95
Tyr Cys Ala Arg
             100
<210>60
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1                 5                      10                     15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
             20                      25                     30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                      60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                  85                    90                     95
Ala Lys
<210>61
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro G1y Gly
1                 5                      10                     15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
              20                     25                     30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
     50                     55                      60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                      70                    75                     80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
                  85                    90                     95
Ala Arg
<210>62
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                   10                        15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
              20                     25                     30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                  85                     90                     95
Ala Lys
<210>63
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>63
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1                 5                      10                     15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
              20                     25                     30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                     45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                       55                      60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                      70                    75                     80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                    90                      95
Ala Arg
<210>64
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1                 5                      10                     15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
              20                      25                    30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
    50                       55                    60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                     70                      75                    80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                  85                     90                     95
Tyr Cys Thr Thr
              100
<210>65
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                       10                    15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
              20                      25                     30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser Pro Tyr
65                      70                    75                     80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                     85                    90                    95
Val Lys
<210>66
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                     15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
              20                     25                     30
Tyr Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                     45
Ser Tyr Ser Ser Gly Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                    90                      95
Val Lys
<210>67
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
              20                      25                     30
Asp Met Asn Trp Val His Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                      40                     45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                     60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65                       70                    75                    80
Leu Gln Thr Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Val Arg
<210>68
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>68
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
              20                     25                      30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                     45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
     50                      55                      60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                      70                     75                    80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                     85                      90                      95
Arg
<210>69
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
             20                      25                      30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                     45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
     50                       55                     60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                      70                     75                    80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                  85                     90                      95
Arg
<210>70
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>70
Glu Val Gln Leu Val His Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                      25                      30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                     45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
     50                      55                     60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                      70                     75                    80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                  85                     90                      95
Arg
<210>71
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>71
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                     25                      30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                     40                     45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
     50                      55                     60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                      70                     75                    80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                  85                     90                      95
Arg
<210>72
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                     30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
         35                      40                    45
Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                      60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Val Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                   85                    90                      95
Val Arg
<210>73
<211>35
<212>PRT
<213>人
<400>73
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
1                  5                      10                     15
Gly Leu Glu Tyr Val Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr
              20                       25                     30
Tyr Ala Asp
         35
<210>74
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>74
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                     30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Arg
<210>75
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>75
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                     25                      30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Arg
<210>76
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                     25                      30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                      60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Arg
<210>77
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                     30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                       55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Lys
<210>78
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                     30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                     40                     45
Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
     50                      55                      60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                      70                     75                    80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                  85                     90                      95
Arg
<210>79
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                     30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                     40                     45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                     55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Arg
<210>80
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                     25                      30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                      60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Lys
<210>81
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
l                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                      25                      30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Arg
<210>82
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                     25                      30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                     40                     45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                        55                      60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                    90                       95
Ala Arg
<210>83
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>83
Glu Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
l                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Pro Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                     30
Val Leu His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
         35                      40                     45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met
     50                      55                     60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr Leu
65                      70                     75                    80
Gln Met Asn Ser Leu Ile Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                  85                      90                     95
Arg
<210>84
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                     30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
         35                      40                    45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                      55                     60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                    90                       95
Ala Arg
<210>85
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
              20                      25                     30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                      40                    45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
     50                      55                    60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                     90                      95
Ala Arg
<210>86
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>86
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
              20                     25                      30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                       40                     45
Gly Glu Ile Ile His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                        55                     60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                      70                      75                   80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                   85                     90                     95
Arg
<210>87
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>87
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
              20                     25                      30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                       40                     45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                       55                     60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                      70                      75                   80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                   85                     90                     95
Arg
<210>88
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>88
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Val Ser Gly Tyr
              20                     25                      30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                       40                     45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys
     50                      55                     60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                      70                      75                   80
Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys Ala
                  85                     90                      95
Arg
<210>89
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>89
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
              20                      25                      30
Gly Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
         35                       40                     45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
     50                       55                     60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe
65                     70                       75                   80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                  85                      90                     95
Cys Ala Arg
<210>90
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>90
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
              20                      25                      30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
         35                      40                      45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
     50                       55                      60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                     70                       75                   80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                   85                     90                     95
Cys Ala Arg
<210>91
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>91
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
              20                      25                      30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
          35                      40                     45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
     50                      55                     60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                      70                      75                   80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                   85                     90                     95
Cys Ala Arg
<210>92
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>92
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
              20                      25                      30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                       40                     45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                        55                     60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                      70                      75                   80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                      90                     95
Ala Arg
<210>93
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>93
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
l                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
              20                     25                       30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                      40                      45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                        55                     60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                      70                      75                   80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                      90                     95
Ala Arg
<210>94
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
              20                      25                      30
Asn Trp Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                      40                     45
Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                     55                     60
Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                     70                      75                    80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                   85                     90                     95
Ala Arg
<210>95
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>95
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
              20                     25                       30
Asn Trp Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                      40                     45
Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                       55                       60
Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                     70                      75                    80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                      90                     95
Ala Arg
<210>96
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>96
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                       10                     15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
              20                      25                      30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                      40                     45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Asn Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                       55                     60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                      70                       75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                      90                     95
Ala Arg
<210>97
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>97
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
             20                      25                       30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                      40                     45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                      55                     60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                       70                     75                   80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                   85                     90                     95
Ala Arg
<210>98
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Pro Gly
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
              20                     25                       30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                      40                     45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                       55                     60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                      70                      75                   80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val TyT Cys Cys
                  85                      90                     95
Ala Arg
<210>99
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>99
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
              20                      25                      30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
         35                      40                     45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
     50                       55                     60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                      70                      75                   80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                  85                      90                     95
Ala Arg
<210>100
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>100
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
              20                      25                      30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
          35                      40                     45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                       55                     60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                      70                      75                   80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                  85                      90                     95
Cys Ala Arg
<210>101
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>101
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
              20                      25                      30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
          35                      40                     45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
     50                       55                      60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65                     70                       75                   80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                  85                      90                     95
Cys Ala Arg
<210>102
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>102
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
              20                     25                       30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                       40                     45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                       55                     60
Ser Arg Val Thr Asn Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                      70                     75                    80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                  85                      90                     95
Arg
<210>103
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>103
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
              20                     25                       30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
          35                      40                     45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
     50                      55                      60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                      70                      75                   80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                    85                      90                      95
Arg
<210>104
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>104
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Tyr
              20                     25                      30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
          35                      40                     45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
     50                      55                     60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Met Gln Phe Ser Leu
65                      70                      75                   80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                   85                     90                     95
Arg
<210>105
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>105
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
              20                      25                      30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
         35                       40                     45
Gly Tyr lle Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                       55                      60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                      70                      75                   80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                   85                     90                     95
Arg
<210>106
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>106
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1                 5                      10                      15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
               20                      25                     30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
          35                     40                     45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                       55                     60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                      70                      75                   80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                   85                     90                     95
Ala Arg
<210>107
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>107
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1                 5                      10                      15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
               20                      25                     30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
          35                     40                     45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                       55                     60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Pro Ile Ser Thr Ala Tyr
65                      70                      75                   80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                   85                     90                     95
Ala Arg
<210>108
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>108
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1                 5                      10                      15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
               20                      25                     30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
            35                    40                      45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                       55                     60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                      70                       75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                  85                      90                     95
Ala Arg
<210>109
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>109
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Glu
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
               20                      25                     30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Met
          35                     40                     45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                       55                      60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                      70                      75                   80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys
                   85                     90                     95
Val Arg
<210>110
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>110
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
              20                      25                      30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
          35                      40                     45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                      55                      60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                      70                       75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                   85                     90                     95
Ala Arg
<210>111
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>111
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1                 5                      10                      15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
               20                      25                     30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
          35                     40                     45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                      55                      60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                      70                     75                    80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                   85                     90                     95
Ala Arg
<210>112
<211>101
<212>PRT
<213>人
<400>112
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1                 5                      10                      15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
              20                      25                      30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
         35                      40                      45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
     50                     55                     60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                      70                      75                   80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                  85                      90                     95
Tyr Tyr Cys Ala Arg
              100
<210>113
<211>87
<212>PRT
<213>人
<400>113
Arg Lys Leu Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Arg Lys Ala Ser Ser Tyr
1                 5                       10                     15
Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile His Cys Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
              20                      25                     30
Gly Leu Lys Gly Trp Met Gly Gly Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Lys Thr
         35                     40                      45
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Met Ser
     50                     55                     60
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Gln Arg Ser Glu Asp Ile
65                      70                     75                    80
Asp Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
                  85
<210>114
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>114
Asp Tyr Gly Met Ser
1                 5
<210>115
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>115
Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1                 5                       10                     15
Gly
<210>116
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>116
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg
 1                5                       10
<210>117
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>117
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
1                 5                      10
<210>118
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>118
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
1                  5                      10
<210>119
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>119
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1                 5
<210>120
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>120
Trp Val Arg Gln Ala Pro
1                 5
<210>121
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>121
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
1                  5                      10
<210>122
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>122
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
1                 5
<210>123
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>123
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1                 5                      10                      15
Gly Gly Gly Ser
              20
<210>124
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>124
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1                 5                      10                      15
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>125
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His
1                 5
<210>126
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>126
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Val
1                 5
<210>127
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>127
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Thr
1                  5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>128
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Ala Thr
1                 5
<210>129
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>129
Ala Ala Trp Asp Asp Gly Leu Ser Leu Val
1                 5                      10
<210>130
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>130
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val
1                 5                      10
<210>131
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>131
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ser Val Arg Val
1                 5                      10
<210>132
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>132
Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly Ala Tyr Val
1                 5
<210>133
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>133
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Val Ser Arg Val
1                 5                      10
<210>134
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>134
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Tyr Val
1                 5                      10
<210>135
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>135
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Cys Pro Glu Phe Val
1                 5                      10
<210>136
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>136
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Trp Phe Val
1                 5                      10
<210>137
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>137
Leu Ala Trp Asp Thr Ser Pro Arg Trp Val
1                 5                      10
<210>138
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>138
Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Val Val
1                 5                      10
<210>139
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>139
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Arg Val
1                 5                      10
<210>140
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>140
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Gln Arg Thr
1                  5
<210>141
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>141
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Arg Leu Val
1                 5                      10
<210>142
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>142
Met Gln Gly Thr His Trp Arg Pro Thr
1                 5
<210>143
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>143
Met Gln Gly Lys His Trp Pro Leu Thr
1                 5
<210>144
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>144
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Gly Phe
1                 5
<210>145
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>145
Met Gln Gly Thr His Arg Arg Ala Thr
1                 5
<210>146
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>146
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr
1                 5
<210>147
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>147
Met Arg Gly Thr His Arg Arg Ala Thr
1                 5
<210>148
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>148
Met Gln Gly Thr His Trp His Pro Thr
1                 5
<210>149
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>149
Met Gln Ala Leu Gln Ser Pro Thr
1                 5
<210>150
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>150
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Phe Val
1                 5                      10
<210>151
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>151
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Thr
1                 5
<210>152
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>152
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr
 1                 5
<210>153
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>153
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Phe Thr
1                 5
<210>154
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>154
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Ala Thr
1                 5
<210>155
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>155
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Arg Ser Val
1                 5                      10
<210>156
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>156
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Leu Val
1                 5
<210>157
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>157
Asp Ser Trp Asp Asn Ser Leu Val Ser Pro Val
1                 5                       10
<210>158
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>158
Met Gln Ala Leu Gln Ser Pro Ala Thr
1                 5
<210>159
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>159
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Val Thr
1                 5
<210>160
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>160
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val
1                 5                       10
<210>161
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>161
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Arg Val Asn Val
1                 5                      10
<210>162
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>162
Met Gln Ala Leu Arg Thr Arg Thr
1                 5
<210>163
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>163
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Phe Tyr Pro Val
1                 5                      10
<210>164
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>164
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Val Thr
1                 5
<210>165
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>165
Met Gln Gly Thr His Trp Arg Thr
1                 5
<210>166
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>166
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Phe Tyr Val
1                 5                      10
<210>167
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>167
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Leu Thr
1                  5
<210>168
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>168
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Leu Gly Ser Val
1                 5                      10
<210>169
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>169
Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Tyr Val
1                  5
<210>170
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>170
Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Leu Thr
1                 5
<210>171
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>171
Val Leu Tyr Met Gly Ser Gly Ser Ala Val
1                 5                      10
<210>172
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>172
Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Asn Thr
1                 5
<210>173
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>173
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Cys Ala Val
1                 5                      10
<210>174
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>174
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Arg Thr
1                 5
<210>175
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>175
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Arg Pro Val
1                 5                       10
<210>176
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>176
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Tyr Asn Val
1                 5                      10
<210>177
<21>11
<212>PRT
<213>人
<400>177
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Arg Asn Val
1                 5                      10
<210>178
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>178
Met Gln Val Leu Gln Thr Arg Thr
1                 5
<210>179
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>179
Met Gln Ala Leu Gln Thr Arg Thr
1                 5
<210>180
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>180
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Met
1                  5
<210>181
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>181
Met Gln Ala Leu Gln Thr Leu Thr
1                 5
<210>182
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>182
Met Arg Ala Leu Gln Thr Pro Thr
1                 5
<210>183
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>183
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Gly Tyr Val
1                 5                      10
<210>184
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>184
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Gly Phe Val
1                 5                      10
<210>185
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>185
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Phe Leu Val
1                 5                      10
<210>186
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>186
Met Gln Ser Ile Gln Leu Arg Thr
1                  5
<210>187
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>187
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ile Val
1                 5                      10
<210>188
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>188
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Thr
1                 5
<210>189
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>189
Met Gln Ala Leu His Thr Arg Thr
1                 5
<210>190
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>190
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ser Val
1                 5
<210>191
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>191
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1                 5
<210>192
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>192
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr
1                  5
<210>193
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>193
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Ala Ala Thr
1                 5
<210>194
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>194
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ala Thr
1                 5
<210>195
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>195
Val Leu Tyr Met Gly Ser Gly Val Tyr Val
1                 5                     10
<210>196
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>196
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Trp Ser Ala Val
1                 5                       10
<210>197
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>197
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Arg Arg Leu Val
1                 5                      10
<210>198
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>198
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Ser Gly Val
1                 5                       10
<210>199
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>199
Met Gln Ala Leu Gln Thr Leu Thr
1                 5
<210>200
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>200
Ala Ala Trp Asp Asp Gly Leu Leu Arg Val
1                 5                     10
<210>201
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>201
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Leu Val
1                 5                     10
<210>202
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>202
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Phe Gln Leu Val
1                 5                      10
<210>203
<211>277
<212>PRT
<213>人
<400>203
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1                 5                      10                     15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
              20                     25                     30
Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
         35                     40                      45
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
     50                    55                     60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr
65                     70                     75                     80
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                  85                     90                     95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
              100                    105                    110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Thr His Pro Tyr Phe Trp Gly
         115                    120                     125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    130                     135                    140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
145                    150                    155                    160
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp
                   165                     170                   175
Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
              180                     185                    190
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile
         195                      200                    205
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
     210                    215                     220
Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser
225                     230                    235                   240
Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
                   245                    250                    255
Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
              260                    265                     270
Leu Asn Gly Ala Ala
         275