脂质体纳米构建体及其制备和使用方法
阅读：658发布：2021-04-01
专利汇可以提供脂质体纳米构建体及其制备和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了以下脂质体，该脂质体包含：a)包含溶血磷脂和 光敏剂 的轭合物；b)包含第一磷脂和应变环辛炔部分的第一衍生化磷脂；c)包含第二磷脂和聚乙二醇 聚合物 的第二衍生化磷脂；和d)阳离子或阴离子脂质。本文还提供了以下脂质体，该脂质体包含：a)包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物；b)包含第一磷脂和靶向部分的第一衍生化磷脂；c)包含第二磷脂和聚乙二醇聚合物的第二衍生化磷脂；和d)阳离子或阴离子脂质。本文提供的脂质体可以用于例如癌症的 治疗 或癌 肿瘤 的成像。，下面是脂质体纳米构建体及其制备和使用方法专利的具体信息内容。
1.一种脂质体，该脂质体包含：
a)包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物；
b)包含第一磷脂和应变环辛炔部分的第一衍生化磷脂；
c)包含第二磷脂和聚乙二醇聚合物的第二衍生化磷脂；以及
d)阳离子或阴离子脂质。
2.一种脂质体，该脂质体包含：
a)包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物；
b)包含第一磷脂和靶向部分的第一衍生化磷脂；
c)包含第二磷脂和聚乙二醇聚合物的第二衍生化磷脂；以及
d)阳离子或阴离子脂质。
3.如权利要求1或2所述的脂质体，其中该光敏剂是疏水性的。
4.如权利要求1-3中任一项所述的脂质体，其中该光敏剂是卟啉光敏剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的脂质体，其中该光敏剂包含苯并卟啉部分。
6.如权利要求1-5中任一项所述的脂质体，其中该光敏剂是苯并卟啉衍生物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的脂质体，其中该溶血磷脂在脂肪酸链中包含14至22个碳。
8.如权利要求1-7中任一项所述的脂质体，其中该溶血磷脂在脂肪酸链中包含16至20个碳。
9.如权利要求1-8中任一项所述的脂质体，其中该溶血磷脂包含不饱和脂肪酸链。
10.如权利要求1-9中任一项所述的脂质体，其中该溶血磷脂选自16:0溶血磷脂、20:0溶血磷脂及其组合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的脂质体，其中该包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物以约0.01摩尔百分比至约1摩尔百分比存在于该脂质体中。
12.如权利要求1-11中任一项所述的脂质体，其中该包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物以约0.05摩尔百分比至约0.5摩尔百分比存在于该脂质体中。
13.如权利要求1-12中任一项所述的脂质体，其中该包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物以约0.08摩尔百分比至约0.12摩尔百分比存在于该脂质体中。
14.如权利要求1-13中任一项所述的脂质体，其中该包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物以约0.1摩尔百分比存在于该脂质体中。
15.如权利要求1-14中任一项所述的脂质体，其中该第一磷脂选自下组，该组由以下组成：氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DDPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DEPA)；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)；1,
2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DEPE)；1,2-二反油酰基-磷脂酰甘油(DEPG)；1,
2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLOPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DLPA)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DLPG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DLPS)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DMPS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DOPG)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DOPS)；1,
2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-
3-磷脂酰甘油(DPPG)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DPPS)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DSPA)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；
1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)，及其组合。
16.如权利要求15所述的脂质体，其中该第一磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
17.如权利要求15或16所述的脂质体，其中该第一衍生化磷脂进一步包含接头。
18.如权利要求15-17中任一项所述的脂质体，其中该接头是聚乙二醇。
19.如权利要求18所述的脂质体，其中该聚乙二醇的分子量为约350g/mol至约30,
000g/mol。
20.如权利要求18或19所述的脂质体，其中该聚乙二醇具有选自下组的分子量，该组由以下组成：350g/mol、550g/mol、750g/mol、1000g/mol、2000g/mol、3000g/mol、5000g/mol、
10,000g/mol、20,000g/mol以及30,000g/mol。
21.如权利要求18-20中任一项所述的脂质体，其中该聚乙二醇的分子量为2000g/mol。
22.如权利要求18-22中任一项所述的脂质体，其中该第一衍生化磷脂包含DSPE-PEG2000。
23.如权利要求1和3-22中任一项所述的脂质体，其中该应变环辛炔包括氮杂-二苯并环辛炔(ADIBO)、二苯并环辛炔(DIBO)、(OCT)、少芳基辛炔(ALO)、单氟化环辛炔(MOFO)、二氟化环辛炔(DIFO)、双芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)或二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)部分。
24.如权利要求1和3-22中任一项所述的脂质体，其中该应变环辛炔在与溶血磷脂轭合之前选自下组，该组由以下组成：二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(ADIBO-NHS)、二苯并环辛炔-C6-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-PEG(4,5,13或n)-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-S-S-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-马来酰亚胺、二苯并环辛炔-PEG(4,5,13或n)-马来酰亚胺、以及(1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯。
25.如权利要求2-22中任一项所述的脂质体，其中该靶向部分选自下组，该组由以下组成：叶酸、RGD肽、天然蛋白质配体、亲和体、抗体、抗体片段和基于工程化抗体的蛋白质。
26.如权利要求2-22中任一项所述的脂质体，其中该靶向部分是抗体。
27.如权利要求2-22和25中任一项所述的脂质体，其中使用无铜点击化学将该靶向部分与该第一衍生化磷脂进行轭合。
28.如权利要求2-22、25和26中任一项所述的脂质体，其中该靶向部分在与该第一磷脂轭合之前包含叠氮化物部分。
29.如权利要求28所述的脂质体，其中该第一衍生化磷脂包含该第一磷脂，以及应变环辛炔与包含叠氮化物的靶向部分的反应产物。
30.如权利要求29任一项所述的脂质体，其中该应变环辛炔包括氮杂-二苯并环辛炔(ADIBO)、二苯并环辛炔(DIBO)、(OCT)、少芳基辛炔(ALO)、单氟化环辛炔(MOFO)、二氟化环辛炔(DIFO)、双芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)或二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)部分。
31.如权利要求30所述的脂质体，其中该应变环辛炔在与溶血磷脂轭合之前选自下组，该组由以下组成：二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(ADIBO)、二苯并环辛炔-C6-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-PEG(4,5,13或n)-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-S-S-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-马来酰亚胺、二苯并环辛炔-PEG(4,5,13或n)-马来酰亚胺、以及(1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯。
32.如权利要求1-31中任一项所述的脂质体，其中该第二磷脂选自下组，该组由以下组成：氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DDPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DEPA)；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)；1,
2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DEPE)；1,2-二反油酰基-磷脂酰甘油(DEPG)；1,
2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLOPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DLPA)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DLPG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DLPS)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DMPS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DOPG)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DOPS)；1,
2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-
3-磷脂酰甘油(DPPG)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DPPS)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DSPA)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；
1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)；及其组合。
33.如权利要求32所述的脂质体，其中该第二磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
34.如权利要求1-33中任一项所述的脂质体，其中该第二衍生化磷脂中的聚乙二醇聚合物的分子量为约350g/mol至约30,000g/mol。
35.如权利要求1-34中任一项所述的脂质体，其中该聚乙二醇聚合物具有选自下组的分子量，该组由以下组成：350g/mol、550g/mol、750g/mol、1000g/mol、2000g/mol、3000g/mol、5000g/mol、10,000g/mol、20,000g/mol以及30,000g/mol。
36.如权利要求1-35中任一项所述的脂质体，其中该聚乙二醇聚合物的分子量为
2000g/mol。
37.如权利要求1-36中任一项所述的脂质体，其中用烷氧基、羧基、胺、生物素、马来酰亚胺、琥珀酰、N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、硅烷、吡啶基二硫醇或氰尿酸部分对该聚乙二醇聚合物进行封端。
38.如权利要求1-37中任一项所述的脂质体，其中该第二衍生化磷脂是DSPE-PEG2000、DSPE-mPEG2000或其组合。
39.如权利要求1-38中任一项所述的脂质体，其中该第二衍生化磷脂以约0.5摩尔百分比至约5摩尔百分比的量存在于该脂质体中。
40.如权利要求1-39中任一项所述的脂质体，其中该轭合物与该第二衍生化磷脂的摩尔比为约1:10。
41.如权利要求1-40中任一项所述的脂质体，其中该第二衍生化磷脂以比该轭合物的量高约8倍至约10倍的量存在于该脂质体中。
42.如权利要求1-41中任一项所述的脂质体，其中该脂质体包含阴离子脂质。
43.如权利要求1-42中任一项所述的脂质体，其中该阴离子脂质是阴离子磷脂。
44.如权利要求43所述的脂质体，其中该阴离子磷脂选自下组，该组由以下组成：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)(DOPG)；磷脂酰甘油(PG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)(DMPG)；磷脂酰丝氨酸(PS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；以及双十六烷基磷酸酯(DCP)。
45.如权利要求1-44中任一项所述的脂质体，其中该阴离子脂质以约5至约10摩尔百分比的量存在于该脂质体中。
46.如权利要求1-45中任一项所述的脂质体，其中该阴离子脂质以约7至约9摩尔百分比的量存在于该脂质体中。
47.如权利要求1-41中任一项所述的脂质体，其中该脂质体包含阳离子脂质。
48.如权利要求1-41中任一项所述的脂质体，其中该阳离子脂质是阳离子磷脂。
49.如权利要求48所述的脂质体，其中该阳离子磷脂是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。
50.如权利要求1-41中任一项所述的脂质体，其中该阳离子脂质以约5至约10摩尔百分比的量存在于该脂质体中。
51.如权利要求1-41中任一项所述的脂质体，其中该阳离子脂质以约7至约9摩尔百分比的量存在于该脂质体中。
52.如权利要求1或2所述的脂质体，其中该脂质体进一步包含选自下组的运载物，该组由以下组成：一种或多种化学治疗化合物；一种或多种聚合纳米颗粒；一种或多种基于蛋白质的纳米颗粒；一种或多种树枝状结构；一种或多种壳聚糖纳米颗粒；一种或多种多聚糖结构；一种或多种无机纳米颗粒；一种或多种显像剂；一种或多种激酶抑制剂；一种或多种生物制剂；以及其两种或更多种的组合。
53.如权利要求52所述的脂质体，其中该激酶抑制剂是受体酪氨酸激酶抑制剂。
54.如权利要求53所述的脂质体，其中该一种或多种化学治疗化合物中的一种或多种与光敏剂表现出协同作用。
55.如权利要求1或2所述的脂质体，其中该脂质体进一步包含一种或多种磷脂、鞘脂、生物活性脂质、天然脂质、胆固醇、甾醇或其组合。
56.如权利要求55所述的脂质体，其中该一种或多种磷脂选自下组，该组由以下组成：
磷脂酰胆碱；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰甘油；以及磷脂酰丝氨酸。
57.如权利要求55或56所述的脂质体，其中该一种或多种磷脂选自下组，该组由以下组成：氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DDPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DEPA)；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)；1,
2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DEPE)；1,2-二反油酰基-磷脂酰甘油(DEPG)；1,
2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLOPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DLPA)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DLPG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DLPS)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DMPS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DOPG)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DOPS)；1,
2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-
3-磷脂酰甘油(DPPG)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DPPS)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DSPA)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；
1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)；及其组合。
58.如权利要求55-57中任一项所述的脂质体，其中该一种或多种磷脂中的至少一种是
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)。
59.如权利要求55-58中任一项所述的脂质体，其中该一种或多种磷脂以约40摩尔百分比至约80摩尔百分比存在于该脂质体中。
60.如权利要求55-59中任一项所述的脂质体，其中该一种或多种磷脂以约50至约70摩尔百分比存在于该脂质体中。
61.如权利要求55-60中任一项所述的脂质体，其中该一种或多种磷脂以约55至约65摩尔百分比存在于该脂质体中。
62.如权利要求55-61中任一项所述的脂质体，其中该胆固醇以约15摩尔百分比至约45摩尔百分比存在于该脂质体中。
63.如权利要求55-62中任一项所述的脂质体，其中该胆固醇以约20摩尔百分比至约30摩尔百分比存在于该脂质体中。
64.如权利要求1-63中任一项所述的脂质体，其中该脂质体进一步包含荧光团、造影剂或其组合。
65.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-63中任一项所述的脂质体、以及药学上可接受的赋形剂。
66.一种治疗患者中的癌症的方法，该方法包括：
(a)向该患者给予治疗有效量的如权利要求2-22和25-63中任一项所述的脂质体；以及(b)辐照该患者以破坏该脂质体。
67.一种对患者中的癌症进行成像的方法，该方法包括：
(a)向该患者给予治疗有效量的如权利要求1-63中任一项所述的脂质体；
(b)辐照该患者以破坏该脂质体；以及
(c)对该患者进行成像。
脂质体纳米构建体及其制备和使用方法
[0002] 本申请要求2015年5月26日提交的美国临时申请序列号62/166,353的权益，将其通过引用以其全文结合在此。
技术领域
[0003] 本披露涉及包含轭合的光敏剂的脂质体。
背景技术
[0004] 纳米级药物递送系统(例如脂质体)允许营养素和药物选择性地释放到分子靶标上。脂质体通常由含磷脂的外层(例如含有磷脂酰胆碱和/或卵磷脂酰乙醇胺)和含水核心组成。脂质体类型的实例包括多层囊泡(其包括若干个层状相脂双层)、小单层囊泡(其包括一个脂双层)、大单层囊泡以及螺旋状囊泡(参见，例如WO/09032716)。由于疏水区和亲水区两者的存在，脂质体可以装载疏水和/或亲水分子，包括例如药物、DNA和/或其他生物活性分子。脂质体的表面可以补充有配体以与特定靶标结合，从而能够使装载在脂质体中的分子选择性递送到靶标。脂质体通过各种方式释放分子，包括例如与细胞膜的双层融合(参见，例如，Advanced Drug Delivery Reviews[先进药物递送评论]38(3):207-232,1993)或巨噬细胞吞噬作用。发明内容
[0005] 本文提供了以下脂质体，该脂质体包含：a)包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物；b)包含第一磷脂和应变环辛炔(strained cyclooctyne)部分的第一衍生化磷脂；c)包含第二磷脂和聚乙二醇聚合物的第二衍生化磷脂；和d)阳离子或阴离子脂质。本文还提供了以下脂质体，该脂质体包含：a)包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物；b)包含第一磷脂和靶向部分的第一衍生化磷脂；c)包含第二磷脂和聚乙二醇聚合物的第二衍生化磷脂；和d)阳离子或阴离子脂质。本文提供的脂质体可以用于例如癌症的治疗或癌肿瘤的成像。
[0006] 本文进一步提供了治疗患者中的癌症的方法，该方法包括向患者给予治疗有效量的本文提供的脂质体；以及辐照患者以破坏该脂质体。
[0007] 本文提供的脂质体还可以用于使患者中的癌症成像。在一些实施例中，所述方法包括向患者给予有效量的本文提供的脂质体；辐照该患者以破坏该脂质体；以及对该患者进行成像。
附图说明
[0009] 图1描绘了在OVCAR-5细胞中的脂质体配制品中，针对(1)具有嵌入脂双层中的BPD的脂质体、(2)具有与16:0Lyso PC-BPD轭合的BPD的脂质体、以及(3)具有与20:0Lyso PC-BPD轭合的BPD的脂质体，中值BPD荧光强度对比BPD浓度。
[0010] 图2描绘了通过掺入5％、4％、3％、2％、1％和0.5％的磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-mPEG2000)而空间上稳定的、含有16:0Lyso PC-BPD的脂质体的Z-平均直径和多分散性指数。
[0011] 图3A-3C针对含有DOTAP、DOPG或无电荷添加的、ADIBO修饰的含16:0Lyso PC-BPD的脂质体，分别显示ζ电位、Z平均直径和多分散性指数(PDI)。
[0012] 图4显示OVCAR-5细胞、A431细胞和T47D细胞中含非靶向DOTAP和DOPG的脂质体的细胞更新(pmol 16:0Lyso PC-BPD/μg细胞蛋白)的定量。
[0013] 图5显示具有(1)Lyso PC-BPD(最上图)、(2)Lyso PC-BPD和叠氮化物(中图)以及(3)无Lyso PC-PBD(最低图)的脂质体的释放倍数，对比690nm光下的注量(光剂量)。
[0014] 图6A是通过无铜点击化学，与西妥昔单抗-蛋白Z结合的脂质体表面的示意图。蛋白Z与任何IgG分子(例如西妥昔单抗)的Fc区进行位点特异性结合，并通过非天然苯甲酰基苯丙氨酸氨基酸进行光交联。将肽结合的蛋白Z上的末端叠氮化物与最佳表面摩尔比的DSPE-PEG2000-ADIBO(一种应变环辛炔衍生化磷脂)进行点击轭合。图6B是通过无铜点击化学，与叠氮基-西妥昔单抗Z结合的脂质体表面的示意图。随机连接到靶向蛋白(例如西妥昔单抗)上的PEG4分子上的末端叠氮化物与最佳表面摩尔比的DSPE-PEG2000-ADIBO(一种应变环辛炔衍生化磷脂)进行点击轭合。
[0015] 图7A-B分别显示位点特异性叠氮化物轭合物的UV-可见光谱和结构示意图。使用PEG4-叠氮化物的N-羟基琥珀酰亚胺酯实现叠氮化物部分随机引入西妥昔单抗。将单个荧光团(针对位点特异性西妥昔单抗的5-FAM和针对随机西妥昔单抗的 488)引入到每个抗体轭合物中。蛋白Z与西妥昔单抗的比为1.13±0.17。
[0016] 图8A-B分别显示结合 488的随机叠氮化物轭合物的UV-可见光谱及其结构示意图。 488与西妥昔单抗的比为1.00±0.04。
[0017] 图9显示位点特异性(图9A)和随机性(图9B)轭合的脂质体大小(各图中的最上图)和多分散性指数(各图中的下图)的比较。
[0019] 图11显示位点特异性(左边最上图)和随机性(左边下图)轭合的ζ-电位对比轭合效率。
[0020] 图12显示轭合的西妥昔单抗数/脂质体，对比位点特异性(最上图)和随机性(下图)轭合的轭合效率。
[0021] 图13显示A431细胞(高EGFR；最上图)、T47D细胞(低EGFR；中图)和CHO-WT细胞(无EGFR；下图)中结合选择性的比较。
[0022] 图14显示在A431细胞(高EGFR；最上图)、T47D细胞(低EGFR；中图)和CHO-WT细胞(无EGFR；下图)中脂质体-西妥昔单抗轭合物与 488的结合选择性的比较。
[0023] 图15显示靶向和非特异性脂质体以及当EGFR被阻断时的靶向和非特异性脂质体的流式细胞术数据。
[0024] 图16显示使用与西妥昔单抗位点特异性和随机性轭合的16:0Lyso PC-BPD脂质体进行选择性光动力学疗法后的细胞活性。
[0025] 图17证实，当点击ADIBO修饰的、含有16:0Lyso PC-BPD的脂质体时，曲妥珠单抗(抗-HER-2抗体， )和运铁蛋白(运铁蛋白受体的天然配体)的随机叠氮基修饰表现出结合的细胞选择性。
[0026] 图18A显示ADIBO-修饰的、无包埋的16:0Lyso PC-BPD的膜的脂质体负载有水溶性光敏剂二氢卟酚e6单乙二胺单酰胺(CMA)，并显示当随机轭合西妥昔单抗时提供细胞选择性。脂质体的示意图示于图18B中。
[0027] 图19显示在渐进时间间隔下OVCAR-5细胞中的非靶向和随机靶向的脂质体的共聚焦荧光显微术图像，这表明靶向的脂质体的细胞内化。
[0029] 图21A显示包含各种染料的脂质体的大小和多分散性指数，并且图21B显示每个脂质体的UV-可见光谱。
[0030] 图22显示为每个脂质体的西妥昔单抗-蛋白Z(Cet-Pz)密度的函数的中值丽丝胺罗丹明B(Lissamine Rhodamine B)强度，这表明与T47D细胞(低EGFR；下图)相比，荧光标记的脂质体选择性结合A431细胞(高EGFR；上图)。
[0031] 图23显示 680RD(上图)和 800CW(下图)相对于时间的校正的荧光平均值，这表明与点击轭合于假人IgG1对照的共注射的IRDye800CW标记的脂质体相比，点击轭合于西妥昔单抗(Erbitux)的IRDye680RD标记的脂质体与皮下U251肿瘤的选择性结合。
[0032] 图24显示靶向脂质体(每对中的右侧柱)相比非靶向脂质体(每对柱中的左侧柱)对于A431肿瘤更具选择性。
[0033] 图25显示16:0Lyso PC-BPD的荧光可用于定量成像生物分布，并证实与含有非轭合DIBO的16:0Lyso PC-BPD脂质体对照相比，在施用0.25mg/kg BPD等效物后24小时具有皮下A431(高EGFR)肿瘤的小鼠中随机点击轭合的脂质体的肿瘤选择性。
[0034] 图26描绘了包含16:0Lyso PC-BPD光敏剂的脂质体的结构示意图，显示有PEG链。
[0036] 图28提供了流式细胞术数据并且显示了来自与v0、10、50或100西妥昔单抗-蛋白Z轭合物(Cet-Pz)/脂质体进行反应的脂质体的中值光敏剂(BPD)强度。
[0037] 图29A提供了描绘源自脂质体膜的中值光敏剂(BPD)强度的流式细胞术数据。图29B显示源自附着于蛋白Z的荧光标记的肽的中值5-FAM荧光强度。
[0038] 图30A-30B显示在描绘于图30A(高EGFR)中的A431细胞中、和在描绘于图30B中的T47D细胞(低EGFR)中，结合西妥昔单抗的BPD和5-FAM蛋白Z的中值荧光强度之间的相关性。高相关系数指示与脂质体点击轭合的西妥昔单抗的完整性。
[0039] 图31A-C描绘了流式细胞术数据，其中中值BPD强度是50,000个单独测量的细胞的平均值。将细胞与点击轭合至50西妥昔单抗/脂质体(图31A)的脂质体，相对于非轭合脂质体(图31B)，一起孵育30分钟、90分钟或180分钟。脂质体的选择性(图31C)用靶向脂质体孵育的细胞的中值BPD强度除以用非特异性脂质体孵育的细胞的中值BPD强度来表示。
[0040] 图32描绘了用20J/cm2的690nm激光进行PDT治疗后，A431和OVCAR-5细胞(高EGFR)以及T47D细胞(低EGFR)的MTT测定结果。将随机靶向的脂质体与所述细胞一起孵育24小时。
[0041] 图33显示为每个脂质体的西妥昔单抗-蛋白Z密度的函数的中值5-FAM荧光强度，这也表明相比于T47D细胞(下图)，对A431细胞(上图)的高选择性。在约100个Cet-Pz/脂质体处出现最佳密度。
[0042] 图34显示在500nM和100nM浓度的丽丝胺罗丹明B(分别为最上图和下一个图)下的A431细胞、以及在500nM和100nM浓度的丽丝胺罗丹明B(下两个图)下的T47D细胞的最佳西妥昔单抗-蛋白Z密度。
[0043] 图35显示在500nM丽丝胺罗丹明B当量下，使用GOA_111-CetPz(10CetPz/脂质体)中值丽丝胺罗丹明B强度，各种癌细胞系的倍数选择性。将100μL脂质体样品在37℃与50,000个细胞一起孵育30分钟。
[0044] 图36显示根据上述过程处理的脂质体的透射电子显微镜(TEM)图像。
[0045] 图37显示相对于nM当量的罗丹明的倍数选择性，这表明点击轭合西妥昔单抗并且包含脂质锚定罗丹明染料和疏水包埋的游离BPD两者的脂质体与没有抗体轭合的脂质体相比，显示出差异水平的选择性。
[0046] 图38显示与罗丹明标记的脂质体(红色)一起孵育30分钟，MGG6细胞神经球(用Hoechst 33324染色的细胞核，蓝色)的共焦荧光显微图像。图38显示在30分钟时，与非靶向脂质体(图38B)相比，点击轭合西妥昔单抗-抗EGFR的靶向脂质体显示优先结合(图38A)。
[0047] 图39A提供了掺入脂质锚定荧光团丽丝胺罗丹明B-DPPE的实例配制品。三个样品(50％v/v GOA_111+5x ADIBO 1(最上图)、50％v/vGOA_111+5x ADIBO 2(中图)和50％v/v GOA_111+5x ADIBO 3(最下图))的大小和多分散性指数示于图39B中。
[0048] 图40显示每个样品的大小和多分散性指数。
具体实施方式
[0049] 本文提供了一种稳定的无铜点击化学脂质体。脂质体已经被化学优化以稳定地掺入脂质锚定的光敏剂分子，该光敏剂分子可以充当用于脂质体运载物(cargo)的时空控制的光触发释放的光动力治疗剂、荧光团和/或介质。脂质体运载物可以包括可与光敏剂协同作用的游离或纳米颗粒结合的第二生物或化学治疗剂。本文提供的脂质体针对结合的稳定性和选择性、以及光毒性，在化学上进行了调整。例如，脂质体可以包括靶向部分，如选择性靶向光敏剂和可选运载物的抗体。可以进一步调整脂质体，用于近红外成像剂的稳定模块化轭合和非干扰性轭合，以允许平行的深层组织追踪和靶向脂质体的成像。
[0050] 例如，图27是如本文提供的靶向脂质体的概念图。在一些实施例中，脂质体在双层内或在包埋核心的PEG-PLGA纳米颗粒内包含试剂。这些试剂可以包括光敏剂、成像剂、药物或激酶抑制剂。亲水性光敏剂、成像剂、药物或激酶抑制剂可以包封在含水核心内。使用例如DSPE-PEG2000-ADIBO的脂质体组合物，通过无铜点击化学将脂质体的表面与靶向部分(如抗体)轭合。
[0051] 本文提供了以下脂质体，该脂质体包含：a)包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物；b)包含第一磷脂和应变环辛炔部分的第一衍生化磷脂；c)包含第二磷脂和聚乙二醇聚合物的第二衍生化磷脂；和d)阳离子或阴离子脂质。
[0052] 本文还提供了以下脂质体，该脂质体包含：a)包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物；b)包含第一磷脂和靶向部分的第一衍生化磷脂；c)包含第二磷脂和聚乙二醇聚合物的第二衍生化磷脂；和d)阳离子或阴离子脂质。
[0053] 如本文所使用的光敏剂是指用于时空控制的光触发性破裂脂质体和/或释放脂质体运载物的小分子光动力治疗剂、荧光团和/或介质。在一些实施例中，该光敏剂是疏水的。在一些实施例中，该光敏剂是亲水的。在一些实施例中，光敏剂是卟啉光敏剂。例如，该光敏剂包含苯并卟啉部分。在一些实施例中，该光敏剂是苯并卟啉衍生物(BPD)。
[0054] 在一些实施例中，该光敏剂选自以下类别的光敏剂，包括卟啉、二氢卟酚、细菌卟吩、酞菁、萘酞菁、替沙林(texaphrin)、蒽醌、蒽环、苝醌(perylenequinone)、呫吨、花菁、吖啶、吩噁嗪、吩噻嗪、三芳基甲烷、硫属吡喃鎓(chalcogenapyrylium)染料以及酞染料。在一些实施例中，该光敏剂选自维替泊芬(3-[(23S,24R)-14-乙烯基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-22,23-双(甲氧基羰基)-4,10,15,24-四甲基-25,26,27,28-四氮杂六环[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]二十八烷-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-十二烯-
9-基]丙酸)；原卟啉IX；替莫泊芬(3,3',3”,3”'-(2,3-二氢卟啉-5,10,15,20-四基)四苯酚)；莫特沙芬镥；9-乙酰氧基-2,7,12,17-四-(β-甲氧基乙基)-卟啉烯(ATMPn)；二氢卟酚e6；二氢卟酚单乙二胺单酰胺；原卟啉IX；酞菁锌；酞菁硅Pc 4；以及萘酞菁。
9-基]丙酸)；原卟啉IX；替莫泊芬(3,3',3”,3”'-(2,3-二氢卟啉-5,10,15,20-四基)四苯酚)；莫特沙芬镥；9-乙酰氧基-2,7,12,17-四-(β-甲氧基乙基)-卟啉烯(ATMPn)；二氢卟酚e6；二氢卟酚单乙二胺单酰胺；原卟啉IX；酞菁锌；酞菁硅Pc 4；以及萘酞菁。
[0055] 在一些实施例中，该光敏剂与溶血磷脂轭合。参见，例如，J.Lovell，C.Jin，E.Huynh，H.Jin，C.Kim，J.Rubinstein，W.Chan，W.Cao，L.Wang和G.Zheng，Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents[由卟啉双层产生的卟啉纳米囊泡用作多模式生物光子造影剂]2011Nature Materials[自然材料]，10,324-332。在一些实施例中，该光敏剂被水性包封。在一些实施例中，该光敏剂与如本文所述的第二衍生化磷脂轭合(例如，通过与聚乙二醇聚合物轭合)。在一些实施例中，光敏剂通过与磷脂的磷酸酯头基反应而与本文提供的磷脂轭合(参见K.A.Riske，T.P.Sudbrack，N.L.Archilha，A.F.Uchoa，A.P.Schroder，C.M.Marques，M.S.Baptista，R.Itri，Biophys.J.[生物物理学杂志]97(2009)1362-1370)。在一些实施例中，光敏剂与磷脂的酰基链轭合(参见T.Komatsu，M.Moritake，A.Nakagawa，E.Tsuchida，Chemistry[化学]8(2002)5469-5480)。在一些实施例中，光敏剂与脂质体的另一种组分如胆固醇轭合。
[0056] 如本文所使用的，溶血磷脂是其中一个或两个酰基衍生物已经通过水解而去除的磷脂的任何衍生物。在一些实施例中，溶血磷脂在脂肪酸链中包含14至22个碳。例如，该溶血磷脂在脂肪酸链中可以包含16至20个碳。在一些实施例中，该溶血磷脂包括不饱和脂肪酸链。在一些实施例中，该溶血磷脂选自16:0溶血磷脂、20:0溶血磷脂及其组合。
[0057] 包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物能以约0.01摩尔百分比至约1摩尔百分比存在于脂质体中。例如，在脂质体中约0.05摩尔百分比至约0.5摩尔百分比；在脂质体中约0.08摩尔百分比至约0.12摩尔百分比。在一些实施例中，包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物在脂质体中以约0.1至约0.2摩尔百分比存在。例如，包含溶血磷脂和光敏剂的轭合物能以约0.1摩尔百分比存在于脂质体中。
[0058] 在一些实施例中，轭合物(例如，16:0溶血磷脂(LysoPC)和/或20:0LysoPC的BPD轭合物，以及形成的具有16:0LysoPC-BPD和20:0LysoPC-BPD的稳定脂质体)可以稳定地嵌入表面充分优化(用于靶向配体的点击轭合)的磷脂双层中。并非所有的轭合都与其他轭合一样适合。例如，BPD的羧酸酯与胆固醇的羟基的轭合消除了分子表现出的任何极性，并且在两亲性脂双层中不存在稳定的构象，并且包封接近0％。类似地，疏水性BPD与DSPE-PEG2000-胺的亲水性末端的酰胺轭合将BPD锚定到膜中，但由于脂质体表面之间的BPD部分的外周疏水性堆叠而产生不稳定的脂质体。如本文所示，稳定的脂质体可以是光敏剂与溶血磷脂轭合形成的(例如，16:0LysoPC-BPD和20:0LysoPC-BPD)。本文提供的脂质体阻断光敏剂非特异性渗漏到周围细胞，如观察到疏水性BPD包埋在脂质双层中。
[0059] 针对如本文提供的那些溶血磷脂(例如溶血磷脂和溶血磷脂-接头衍生物(例如溶血磷脂-PEG衍生物))，可以使用标准轭合方法，以实现溶血磷脂与含有化学反应性官能团(如-OH、-COOH、-NH2和-SH)的疏水性光敏剂的轭合。含有化学反应性官能团(如-OH、-COOH、-NH2和-SH)的亲水性光敏剂的轭合可以通过与磷脂的磷酸酯头基的衍生物(如DPPC、DPPE、DSPE-PEG-NH2、DSPE-PEG-COOH、DSPE-PEG-OH、DOPG)或与胆固醇的极性-OH基团轭合来实现。
[0060] 如本文所述的第一磷脂可以选自下组，该组由以下组成：磷脂酰胆碱；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰甘油；以及磷脂酰丝氨酸。本文提供的脂质体的第一磷脂的非限制性实例包括：氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DDPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DEPA)；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DEPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DEPE)；1,2-二反油酰基-磷脂酰甘油(DEPG)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLOPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DLPA)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DLPG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DLPS)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DMPS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DOPG)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DOPS)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DPPG)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DPPS)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DSPA)；1,
2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-
3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-
3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)，及其组合。在一些实施例中，第一磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-
3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-
3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)，及其组合。在一些实施例中，第一磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
[0061] 在一些实施例中，第一衍生化磷脂进一步包含接头。例如，该接头可以是聚乙二醇，其中聚乙二醇是二价的并且是第一磷脂和应变环辛烯部分之间的接头，或者是第一磷脂和靶向部分之间的接头。在一些实施例中，接头可以作为第一磷脂和应变环辛炔与靶向部分的无铜点击化学反应产物之间的接头。
[0062] 在一些实施例中，聚乙二醇的分子量为约350g/mol至约30,000g/mol。例如，聚乙二醇可以具有选自下组的分子量，该组由以下组成：350g/mol、550g/mol、750g/mol、1000g/mol、2000g/mol、3000g/mol、5000g/mol、10,000g/mol、20,000g/mol或30,000g/mol。在一些实施例中，聚乙二醇的分子量为2000g/mol。
[0063] 在一些实施例中，第一衍生化磷脂包括DSPE-PEG2000。
[0064] 应变环辛炔的非限制性实例包括氮杂-二苯并环辛炔(ADIBO)、二苯并环辛炔(DIBO)、(OCT)、少芳基辛炔(aryl-less octyne，ALO)、单氟化环辛炔(MOFO)、二氟化环辛炔(DIFO)、双芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)或二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)部分。在与第一磷脂或接头进行反应之前，应变环辛炔可以选自下组，该组由以下组成：二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(ADIBO-NHS)、二苯并环辛炔-C6-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-PEG(4,5,13或n)-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-S-S-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二苯并环辛炔-马来酰亚胺、二苯并环辛炔-PEG(4,5,13或n)-马来酰亚胺、以及(1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯。
[0065] 如本文所使用的靶向部分可以包括以下中的一种或多种：叶酸、RGD肽、天然蛋白配体(如TNF、EGF、运铁蛋白)、亲和体、抗体、抗体片段、基于工程化抗体的蛋白质、癌症相关受体、叶酸受体、运铁蛋白受体、HER-2受体、avb5整合素以及生长抑素受体。在一些实施例中，靶向部分是抗体。
[0066] 在一些实施例中，靶向部分在与第一衍生化磷脂轭合之前包含叠氮化物部分。在一些实施例中，靶向部分在与第一磷脂轭合之前包含如本文所提供的应变环辛炔。在一些实施例中，使用无铜点击化学使靶向部分与第一磷脂轭合。例如，靶向部分上的叠氮化物或应变环辛炔可以经由无铜点击化学分别与第一磷脂上的应变环辛炔或叠氮化物进行反应。在一些实施例中，第一衍生化磷脂包含第一磷脂以及应变环辛炔与包含叠氮化物的靶向部分的反应产物。
[0067] 针对靶向部分与用应变环辛炔预修饰的脂质体表面的无铜点击轭合，将靶向部分用叠氮基部分进行修饰。例如，可以使用生物工程化的蛋白Z分子实现叠氮化物部分位点特异性引入西妥昔单抗中，所述生物工程化的蛋白Z分子仅结合IgG分子的Fc部分(参见，例如，Hui,J.Z.,Al Zaki,A.,Cheng,Z.,Popik,V.,Zhang,H.,Prak,E.T.L和Tsourkas,A.，Facile Method for the Site-Specific,Covalent Attachment of Full-Length IgG onto Nanoparticles[用于将全长IgG位点特异性共价附着到纳米颗粒上的简便方法](2014)10(16):3354-63.doi:10.1002/smll.201303629)。可以使用PEG4-叠氮化物的N-羟基琥珀酰亚胺酯实现叠氮化物部分随机引入西妥昔单抗。可以将单个荧光团(针对位点特异性西妥昔单抗的5-FAM和针对随机西妥昔单抗的 488)引入到每个抗体轭合物中。在一些实施例中，预先点击于应变环辛炔脂质中的胶束化叠氮基靶向配体也可以后插入到携带任何治疗/成像运载物的预先形成的脂质体中。靶向配体还可以用应变环辛炔修饰以用于与叠氮基修饰的脂质体(例如，包含第一磷脂和叠氮基部分的第一衍生化磷脂)进行点击轭合。
[0068] 本文提供的靶向部分增加了本文提供的脂质体的选择性。例如，对于任何点击轭合的靶向部分及其各自的靶-过表达细胞系，可以实现选择性结合和光毒性。叠氮基修饰的配体(为与脂质体平台进行无铜点击轭合的潜在候选物)包括叶酸、RGD肽、天然蛋白质配体(例如TNF、EGF、运铁蛋白)、亲和体或抗体片段的任何变体。对于包封水性光敏剂(例如，二氢卟酚e6、亚甲蓝、磺化铝酞菁、玫瑰红)的任何靶向的环辛炔修饰的脂质体，也可以实现选择性结合和光毒性。在一些实施例中，包埋任何疏水性光敏剂的水溶性PEG-PLGA纳米颗粒还可以被包封在靶向的、经DIBO修饰的脂质体内(针对选择性PDT基形式)。针对本文提供的脂质体还可以实现选择性结合和光毒性，所述脂质体进一步包含包埋的、疏水性脂质锚定的光敏剂，如原卟啉IX。
[0069] 在一些实施例中，第一衍生化磷脂以高达约0.5摩尔百分比的量存在于脂质体中。例如，第一衍生化磷脂能以约0.05摩尔百分比至约0.5摩尔百分比(例如，约0.1摩尔百分比、约0.2摩尔百分比、约0.25摩尔百分比、约0.3摩尔百分比以及约0.4摩尔百分比)的量存在。
[0070] 如本文所述的第二磷脂可以选自下组，该组由以下组成：磷脂酰胆碱；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰甘油；以及磷脂酰丝氨酸。第二磷脂的非限制性实例包括：氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DDPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DEPA)；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DEPE)；1,2-二反油酰基-磷脂酰甘油(DEPG)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLOPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DLPA)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DLPG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DLPS)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DMPS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-
3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DOPG)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DOPS)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DPPG)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DPPS)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-
3-磷酸酯(DSPA)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)；及其组合。在一些实施例中，第二磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DMPS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-
3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DOPG)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DOPS)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DPPG)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DPPS)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-
3-磷酸酯(DSPA)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)；及其组合。在一些实施例中，第二磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
[0071] 在一些实施例中，存在于第二衍生化磷脂中的聚乙二醇聚合物可以具有约350g/mol至约30,000g/mol的分子量。例如，聚乙二醇聚合物可以具有选自下组的分子量，该组由以下组成：350g/mol、550g/mol、750g/mol、1000g/mol、2000g/mol、3000g/mol、5000g/mol、10,000g/mol、20,000g/mol以及30,000g/mol。在一些实施例中，聚乙二醇聚合物的分子量为2000g/mol。在一些实施例中，用烷氧基、羧基、胺、生物素、马来酰亚胺、琥珀酰、N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、硅烷、吡啶基二硫醇或氰尿酸部分对聚乙二醇聚合物进行封端。在一些实施例中，第二衍生化磷脂是DSPE-PEG2000、DSPE-mPEG2000或其组合。
[0072] 在一些实施例中，第二衍生化磷脂以约0.5摩尔百分比至约5摩尔百分比的量存在于脂质体中。在一些实施例中，轭合物与第二衍生化磷脂的摩尔比为约1:10。在一些实施例中，第二衍生化磷脂以比轭合物的量高约10倍的量存在于脂质体中。
[0073] 不受任何理论束缚，第二衍生化磷脂可以赋予脂质体稳定性。
[0074] 在一些实施例中，脂质体包含阴离子脂质。例如，脂质体可以包含阴离子磷脂。阴离子磷脂的非限制性实例包括1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)(DOPG)；磷脂酰甘油(PG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)(DMPG)；磷脂酰丝氨酸(PS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；以及双十六烷基磷酸酯(DCP)。阴离子脂质(例如阴离子磷脂)能以高达约10摩尔百分比(例如，约0.1摩尔百分比至约10摩尔百分比)的量存在于脂质体中。例如，阴离子脂质以约5至约10摩尔百分比的量存在于脂质体中。在一些实施例中，阴离子脂质以约7至约9摩尔百分比的量存在于脂质体中。
[0075] 在一些实施例中，脂质体包含阳离子脂质。例如，脂质体可以包含阳离子磷脂。阳离子磷脂的非限制性实例包括1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。阳离子脂质(例如阳离子磷脂)能以高达约10摩尔百分比(例如，约0.1摩尔百分比至约10摩尔百分比)的量存在于脂质体中。例如，阴离子脂质以约5至约10摩尔百分比的量存在于脂质体中。在一些实施例中，阴离子脂质以约7至约9摩尔百分比的量存在于脂质体中。
[0076] 不受任何理论束缚，认为阳离子或阴离子脂质提供脂质体的静电稳定化。例如，静电稳定性的缺乏可能会导致脂质体的沉淀。在一些实施例中，与缺乏阳离子或阴离子脂质的脂质体相比，阳离子或阴离子脂质的存在可以有助于增加如本文提供的脂质体的细胞摄取。
[0077] 在一些实施例中，本文提供的脂质体可以进一步包含选自下组的运载物，该组由以下组成：一种或多种化学治疗化合物；一种或多种聚合纳米颗粒；一种或多种基于蛋白质的纳米颗粒；一种或多种树枝状结构；一种或多种无机纳米颗粒；一种或多种显像剂；一种或多种激酶抑制剂；一种或多种生物制剂；以及其两种或更多种的组合。
[0078] 在一些实施例中，激酶抑制剂是受体酪氨酸激酶抑制剂。该运载物可以是生物制剂(S.Tangutoori，B.Q.Spring，Z.Mai，A.Palanisami，L.Mensah和T.Hasan，Nanomedicine[纳米医学]，2015,DOI:10.1016/j.nano.2015.08.007)；化学治疗剂(H.C.Huang，S.Mallidi，J.Liu，C.T.Chiang，Z.Mai，R.Goldschmidt，N.Ebrahim-Zadeh，I.Rizvi和T.Hasan，Cancer Res[癌症研究]，2016,76,1066-1077)；或小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(B.Q.Spring，R.B.Sears，L.K.Zheng，Z.Mai，R.Watanabe，M.E.Sherwoord，D.A.Schoenfeld，B.W.Pogue，S.P.Pereira，E.Villa和T.Hasan，Nat.Nanotechnol.[自然纳米技术]，2016，出版中)。在一些实施例中，该一种或多种化学治疗化合物中的一种或多种与光敏剂表现出协同作用。
[0079] 在一些实施例中，运载物(例如疏水性化学治疗剂或小分子抑制剂)可以包埋在脂质体双层中。
[0080] 本文提供的脂质体还可以包括一种或多种磷脂、鞘脂、生物活性脂质、天然脂质、胆固醇、甾醇或其组合。
[0081] 如本文所述的磷脂可以选自下组，该组由以下组成：磷脂酰胆碱；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰甘油；以及磷脂酰丝氨酸。磷脂的非限制性实例包括：氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)；1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DDPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DEPA)；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DEPE)；1,2-二反油酰基-磷脂酰甘油(DEPG)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLOPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DLPA)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DLPG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DLPS)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DMPA)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DMPS)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DOPA)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DOPG)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DOPS)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DPPA)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DPPG)；
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DPPS)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DSPA)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)；及其组合。在一些实施例中，所述一种或多种磷脂中的至少一种是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)。
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DPPS)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DSPA)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DSPS)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MPPC)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)；1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(POPG)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)；及其组合。在一些实施例中，所述一种或多种磷脂中的至少一种是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)。
[0082] 在一些实施例中，所述一种或多种磷脂以约40摩尔百分比至约80摩尔百分比存在于脂质体中。例如，所述一种或多种磷脂以约50至约70摩尔百分比存在于脂质体中；以约55至约65摩尔百分比存在于脂质体中；以约15摩尔百分比至约45摩尔百分比存在于脂质体中；或以约20摩尔百分比至约30摩尔百分比存在于脂质体中。
[0083] 在一些实施例中，该胆固醇以约10摩尔百分比至约50摩尔百分比的脂质体的量存在。例如，约20摩尔百分比至约40摩尔百分比的脂质体；约25至约35摩尔百分比；以及约27摩尔百分比至约29摩尔百分比的脂质体。
[0084] 在一些实施例中，本文提供的脂质体包含约50摩尔百分比至约65摩尔百分比的一种或多种磷脂；约5摩尔百分比至约10摩尔百分比的阴离子或阳离子脂质；约20至约35摩尔百分比的胆固醇；约2摩尔百分比至约8摩尔百分比的第二衍生化磷脂；以及约0.05摩尔百分比至约0.25摩尔百分比的轭合物。例如，本文提供的脂质体包含约55摩尔百分比至约60摩尔百分比的一种或多种磷脂；约7摩尔百分比至约9摩尔百分比的阴离子或阳离子脂质；约25至约30摩尔百分比的胆固醇；约4摩尔百分比至约6摩尔百分比的第二衍生化磷脂；以及约0.08摩尔百分比至约0.12摩尔百分比的轭合物。
[0085] 在一些实施例中，该脂质体进一步包含荧光团、造影剂(例如，MRI、PET或SPECT造影剂)或其组合。
[0086] 如本文所述，“荧光团”可以是在光激发时可以重新发光的任何小分子(例如，可见光谱中的光)。例如，荧光团可以包括罗丹明、荧光素、硼-二吡咯甲烷、香豆素、芘、花菁、噁嗪、吖啶、金胺锇及其衍生物。在一些情况下，衍生物包括磺化衍生物，如磺化芘、磺化香豆素、磺化罗丹明和磺化花菁(例如 染料)。
[0087] 在一些实施例中，通过与溶血磷脂和溶血磷脂衍生物(例如，与聚乙二醇聚合物结合的溶血磷脂)轭合可以实现含有化学反应性官能团(如-OH、-COOH、-NH2、-SH)的任何疏水性荧光团的脂质锚定。这些脂质体可以点击轭合到任何靶向部分，并将选择性地结合到它们的靶标上。含有化学反应性官能团(如-OH、-COOH、-NH2和-SH)的任何亲水性荧光团的脂质锚定可以通过与磷脂的磷酸酯头基的衍生物(如DPPC、DPPE、DSPE-PEG-NH2、DSPE-PEG-COOH、DSPE-PEG-OH、DOPG)或与胆固醇的极性-OH基团轭合来实现。这些脂质体可以点击轭合到任何靶向部分，并将选择性地结合到它们的靶标上。
[0088] 如本文所提供的脂质体可以使用本领域普通技术人员已知的方法来制备。例如，脂质体能以悬浮液形式制备或者可以在用水性溶液重构含有本文提供的脂质体组合物的冻干粉末时形成。在一些实施例中，本文提供的脂质体具有小于200nm的平均粒度分布。例如，本文提供的脂质体可以具有约100nm至约150nm的平均粒度分布。
[0089] 本文还提供了包含本文提供的脂质体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[0090] 本文提供的脂质体可以单独或者与常规药物载体、赋形剂或类似物组合给予。药学上可接受的赋形剂包括但不限于，药物剂型中使用的表面活性剂(如Tweens)、泊洛沙姆或其他类似的聚合的递送基质；缓冲物质(如磷酸盐，tris，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸、水、盐或电解质的部分甘油酯混合物(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、聚乙二醇和羧甲基纤维素钠))。还可以使用环糊精(如α-、β、以及γ-环糊精)或化学修饰的衍生物(如羟烷基环糊精)，包括2-和3-羟丙基-β-环糊精或其他增溶衍生物。可以制备含有0.005％至100％范围内的如本文所述的脂质体的剂型或组合物，余量由无毒载体制成。所预期的组合物可以含有0.001％-100％的本文提供的脂质体，在一个实施例中为0.1％-95％，在另一个实施例中为75％-85％，在一个另外的实施例中为20％-80％。制备这种剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或将是显而易见的；例如，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第22版(Pharmaceutical Press[药物科学出版社]，英国伦敦2012)。
[0091] 例如，液体药学上可施用的组合物可以例如通过将本文提供的化合物和任选的药用物佐剂溶解、分散(等)在载体(例如水、盐水、水性右旋糖、甘油、乙二醇、乙醇或类似物)中来制备以形成溶液、胶体、脂质体、乳液、复合物、凝聚物或悬浮液。如果需要，该药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、pH缓冲剂等(例如，乙酸钠、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸酯、三乙醇胺油酸酯等)。
[0092] 注射剂能以常规形式制备，如液体溶液、胶体、脂质体、复合物、凝聚物或悬浮液(像乳液)，或者在注射前以适于在液体中重构的固体形式制备。包含在此类肠胃外组合物中的本文提供的脂质体的百分比高度依赖于脂质体的特定性质和患者的需求。
[0093] 应注意的是，浓度和剂量值可以根据特定的脂质体和待缓解的病症的严重程度而变化。应当进一步理解，对于任何具体的患者，应根据个体需要以及给予或监督组合物给予的人的专业判断随时间调整具体的剂量方案。
[0094] 本文进一步提供了治疗患者中的癌症的方法，该方法包括向患者给予治疗有效量的本文提供的脂质体；以及辐照患者以破坏该脂质体。
[0095] 本文提供的脂质体还可以用于使患者中的癌症成像。在一些实施例中，所述方法包括向患者给予有效量的本文提供的脂质体；辐照该患者以破坏该脂质体；以及对该患者进行成像。
[0096] 非限制性癌症包括但不限于以下：
[0097] 1)乳腺癌症(cancer)(包括例如ER+乳腺癌、ER-乳腺癌、her2-乳腺癌、her2+乳腺癌)、间质瘤(如纤维腺瘤、叶状肿瘤和肉瘤)、以及上皮性肿瘤如大导管乳头状瘤；乳腺癌(carcinoma)，包括原位(非侵入性)癌(包括原位导管癌(包括佩吉特氏病)和原位小叶癌)，以及侵入性(浸润)癌(包括但不限于侵入性导管癌、侵入性小叶癌、髓样癌、胶样(黏液)癌、管状癌和侵入性乳头状癌)；以及各种恶性肿瘤。乳腺癌的另外的实例可以包括管腔上皮(luminal)A型、管腔上皮B型、基底A型、基底B型和三阴性乳腺癌，该三阴性乳腺癌是雌激素受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性和her2阴性(her2-)。在一些实施例中，乳腺癌可以具有高风险Oncotype评分。
[0098] 2)贲门癌，包括例如，肉瘤，例如血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和脂肪肉瘤；黏液瘤；横纹肌瘤；纤维瘤；脂肪瘤以及畸胎瘤。
[0099] 3)肺癌，包括例如，支气管癌，例如鳞状细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞和腺癌；肺泡和细支气管癌；支气管腺瘤；肉瘤；淋巴瘤；软骨瘤性错构瘤；以及间皮瘤。
[0100] 4)胃肠癌，包括例如，食管癌，例如鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤和淋巴瘤；胃癌，例如癌、淋巴瘤和平滑肌肉瘤；胰腺癌，例如导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤和舒血管肠肽瘤；小肠癌，例如腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤和纤维瘤；大肠癌，例如腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤和平滑肌瘤。
[0101] 5)泌尿生殖道癌症，包括例如，肾癌，例如腺癌、维耳姆斯瘤(Wilm'stumor)(肾母细胞瘤(nephroblastoma))、淋巴瘤和白血病；膀胱癌和尿道癌，例如鳞状细胞癌、移行细胞癌和腺癌；前列腺癌，例如腺癌和肉瘤；睾丸癌，例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤和脂肪瘤。
[0102] 6)肝癌(Liver cancer)，包括例如，肝瘤(hepatoma)，例如肝细胞癌；胆管癌；肝胚细胞瘤；血管肉瘤；肝细胞腺瘤；以及血管瘤。
[0103] 7)骨癌，包括例如骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨黏液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤。
[0104] 8)神经系统癌症，包括例如，头骨癌症，例如骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤和畸形性骨炎；脑膜癌症，例如脑膜瘤、脑膜肉瘤和胶质瘤；脑部癌症，例如星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤和先天性肿瘤；以及脊髓癌，例如神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤和肉瘤。
[0105] 9)妇科癌症，包括例如，子宫癌，例如子宫内膜癌；子宫颈癌症，例如宫颈癌和肿瘤前宫颈非典型增生；卵巢癌症，例如卵巢癌，包括浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、未分类癌、颗粒状泡膜细胞瘤、赛尔托利莱迪希(Sertoli Leydig)细胞瘤、无性细胞瘤和恶性畸胎瘤；外阴癌症，例如鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤和黑色素瘤；阴道癌症，例如透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤和胚胎性横纹肌肉瘤；以及输卵管癌症，例如癌。
[0106] 10)血液性癌症，包括例如血液癌症，例如急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(恶性淋巴瘤)以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
[0107] 11)皮肤癌和皮肤病，包括例如恶性黑色素瘤和转移性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、痣、异常增生性痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤和硬皮病。
[0108] 12)肾上腺癌，包括例如神经母细胞瘤。
[0109] 癌症可以是实体瘤(可以是或可以不是转移性的)。癌症还可以作为弥漫性组织发生在如白血病中。因此，如本文提供的，术语“肿瘤细胞”包括受以上鉴定的紊乱中的任一种困扰的细胞。
[0110] 使用如本文所述的化合物或组合物治疗癌症的方法可以与现有的治疗癌症的方法(例如，通过化学疗法、辐照或手术(例如卵巢切除术))组合。在一些实施例中，可以在另一种抗癌剂或治疗之前、期间或之后给予化合物或组合物。
[0111] 治疗效果在一定程度上缓解了疾病的一种或多种症状。
[0112] 如本文所使用的“治疗”(treat/treatment/treating)是指出于治疗目的，给予如本文提供的化合物或药物组合物。术语“治疗性治疗”是指对已经患有疾病的患者施用治疗，从而引起治疗上有益的效果，如改善现有症状，改善症状的根本代谢原因，推迟或预防病症的进一步发展，和/或降低将发展或预期会发展的症状的严重程度。
[0113] 本文提供的脂质体对于光氧化是不稳定的。在一些实施例中，本文提供的脂质体可用于脂质体有效载荷的光触发释放。参见，例如，B.Q.Spring，R.B.Sears，L.K.Zheng，Z.Mai，R.Watanabe，M.E.Sherwoord，D.A.Schoenfeld，B.W.Pogue，S.P.Pereira，E.Villa和T.Hasan，Nat.Nanotechnol.[自然纳米技术]，2016，出版中。为了活化本文提供的脂质体的光敏剂，使用任何合适的吸收波长。该吸收波长可以使用本领域已知的用于介导细胞毒性或荧光发射的各种方法来提供，如可见辐射，包括白炽光源或荧光光源或者光电二极管，如发光二极管。激光也用于将光原位递送至局部的脂质体。
[0114] 在一些实施例中，使用荧光成像将如本文所提供的脂质体在体内进行成像。例如，使用这样的方法允许容易的实时成像以及对用本文提供的脂质体标记的细胞或组织的定位。在一些实施例中，使用腹腔镜检查和/或内窥镜检查将如本文所提供的脂质体在体内进行成像。例如，使用腹腔镜检查允许容易的实时成像以及对用本文提供的脂质体标记的细胞或组织的定位。在一些实施例中，可以使用光纤显微内镜术对脂质体进行成像。
[0115] 可以设想本文提供的脂质体的许多临床前和临床应用。例如，可以使用在此描述的脂质体：1)用于早期检测癌症；2)作为手术期间对外科医生的帮助(例如，通过允许实时检测癌细胞)；以及3)作为监测癌症治疗的进展的方法(例如，通过对在治疗之前、期间和之后存在的癌细胞进行定量)。
[0116] 例如，可以将本文提供的脂质体与手术方法(例如，肿瘤切除术)组合，向受试者给予。可以在手术之前、期间或之后向个体给予脂质体。脂质体可以在肿瘤移除后胃肠外、静脉内或注射到肿瘤或周围区域，例如，以成像或检测残余癌细胞。例如，脂质体可以用于检测肿瘤的存在并指导手术切除。在一些实施例中，脂质体可以用于检测残余癌细胞的存在，并指导连续外科治疗直到至少一部分(例如全部)这样的细胞从受试者中被移除。因此，提供了一种引导手术以从受试者移除至少一部分肿瘤的方法，该方法包括提供本文所提供的脂质体；使脂质体存在于至少一些癌细胞中；观察脂质体活化后的图像(例如荧光)；以及对受试者进行手术以去除包含检测到的癌细胞的至少一部分肿瘤。
[0117] 关于体外成像方法，本文所述的脂质体和组合物可以用于多种体外测定中。示例性的体外成像方法包括：使样品(例如生物样品(例如细胞))与本文提供的一种或多种脂质体接触；使脂质体与样品中的生物靶相互作用；用可由光敏剂或成像剂吸收的波长的光照射样品。
[0118] 亲水性荧光团的稳定锚定可以通过荧光团与胆固醇、与磷脂的磷酸酯头基如1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)或与聚乙二醇化磷脂的末端如DSPE-PEG2000-NH2进行轭合来实现。
[0119] 无铜点击化学的高化学选择性使得能够将不同反应性实体与脂质体的表面(不具有与点击化学反应物(例如，应变环辛炔或叠氮化物部分)的交叉反应性)进行模块化轭合。例如，将含有0.2％DSPE-PEG2000-NH2和DIBO修饰的溶血磷脂的脂质体用于使近红外染料的胺反应性NHS-酯与DSPE-PEG2000-NH2的末端胺进行轭合以制备一组稳定的、能够使深部组织体内成像的点击反应性脂质体。这样的染料可以包括 633、 647、
680、 700、 680RD和 800CW。如本文所提供的脂
质体可在含胺的脂质与胺反应性染料进行反应之前在膜中含有16:0LysoPC-BPD(或用于光动力疗法的任何其他脂质锚定的疏水性光敏剂)，而不影响荧光团标记、靶向部分的轭合或选择性。本文提供的脂质体还可以在含胺的脂质与胺反应性染料进行反应之前在核心中含有水性治疗剂，而不影响荧光团标记、靶向部分的轭合或选择性。
680、 700、 680RD和 800CW。如本文所提供的脂
质体可在含胺的脂质与胺反应性染料进行反应之前在膜中含有16:0LysoPC-BPD(或用于光动力疗法的任何其他脂质锚定的疏水性光敏剂)，而不影响荧光团标记、靶向部分的轭合或选择性。本文提供的脂质体还可以在含胺的脂质与胺反应性染料进行反应之前在核心中含有水性治疗剂，而不影响荧光团标记、靶向部分的轭合或选择性。
[0120] 可以经由任何可接受的给予模式给予本文所披露的脂质体。在一些实施例中，脂质体是胃肠外(例如静脉内)给予的。
[0121] 实例
[0122] 材料与方法
[0123] BPD光敏剂与磷脂16:0Lyso PC和20:0 Lyso PC的偶联
[0124] 根据改进的合成方案，将苯并卟啉衍生物光敏剂的羧酸酯与磷脂1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0Lyso PC)或磷脂1-花生酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:0Lyso PC)的羟基部分通过酯化进行偶联。参见，J.Lovell，C.Jin，E.Huynh，H.Jin，C.Kim，J.Rubinstein，W.Chan，W.Cao，L.Wang和G.Zheng，Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents[由卟啉双层产生的卟啉纳米囊泡用作多模式生物光子造影剂]2011Nature Materials[自然材料]，10,324-332。将16:0Lyso PC(99.13μl，在氯仿中的25mg/ml原种)或20:0Lyso PC(110.35μl，在氯仿中的25mg/ml原种)置于13x 100mm 管中，并使用氮气流通过16号计量注射针(16gauge needle)将氯仿蒸发。将光敏剂苯并卟啉衍生物一元酸环A(BPD，维替泊芬，17.97mg，718.79g/mol)添加到干燥的16:0Lyso PC或20:0Lyso PC中。
然后将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，38.81mg，155.24g/mol；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，15.27mg，122.17g/mol；西格玛-奥德里奇公司)以及N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，52.25μl，129.24g/mol，0.742g/ml；西格玛-奥德里奇公司)添加到16:0Lyso PC或20:0Lyso PC与BPD混合物的干燥混合物中。16:0Lyso PC/20:0Lyso PC:BPD:EDC:DMAP:DIPEA的摩尔比为1:5:50:25:300。将混合物溶解在二氯甲烷(DCM，5ml)中，并使用磁力搅拌板在室温下在黑暗中以2500转/分钟剧烈搅拌24小时。使用Analtech制备型薄层色谱法二氧化硅Uniplates(Analtech Preparative Thin Layer Chromatography Silica Uniplates)，用在DCM中的10％甲醇洗脱来纯化16:0Lyso PC-BPD和20:0Lyso PC-BPD脂质轭合物。从TLC板上去除极性最大的含16:0Lyso PC-BPD或20:
0Lyso PC-BPD的二氧化硅级分(Rf约0.144)，并置于50ml聚丙烯管中。通过在DCM中的33％甲醇(30ml)中超声处理10分钟，从二氧化硅级分中提取16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD。通过在3,700xg下离心10分钟使二氧化硅沉积，并将含有提取的16:0Lyso PC-BPD或
20:0Lyso PC-BPD的上清液收集在250ml圆底烧瓶中。将二氧化硅级分用在DCM中的33％甲醇再洗涤两次，并且分别将所有的16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD溶液合并到250ml的圆底烧瓶中。通过连接到液氮阱冷凝器进行的旋转蒸发，在减压下，在40℃将溶剂混合物从提取的16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD中去除。通过在100％DCM中重新溶解干燥的
16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD提取物来去除预先溶解在甲醇-DCM溶剂混合物中的残余二氧化硅。通过使用粘附在聚丙烯注射器末端的FisherbrandTM聚(四氟乙烯)(PTFE)过滤器(0.22μm孔径，13mm直径)进行过滤来去除不溶性二氧化硅沉淀。使用旋转蒸发从过滤的16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD溶液中去除DCM。然后将纯化的轭合物重新溶解在氯仿(5ml)中并在-20℃在黑暗中储存。通过在DMSO中稀释该磷脂轭合物并且使用34,895M-1.cm-1的消光系数ε687nm测量UV-可见吸收光谱来确定16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD的浓度。
然后将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，38.81mg，155.24g/mol；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，15.27mg，122.17g/mol；西格玛-奥德里奇公司)以及N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，52.25μl，129.24g/mol，0.742g/ml；西格玛-奥德里奇公司)添加到16:0Lyso PC或20:0Lyso PC与BPD混合物的干燥混合物中。16:0Lyso PC/20:0Lyso PC:BPD:EDC:DMAP:DIPEA的摩尔比为1:5:50:25:300。将混合物溶解在二氯甲烷(DCM，5ml)中，并使用磁力搅拌板在室温下在黑暗中以2500转/分钟剧烈搅拌24小时。使用Analtech制备型薄层色谱法二氧化硅Uniplates(Analtech Preparative Thin Layer Chromatography Silica Uniplates)，用在DCM中的10％甲醇洗脱来纯化16:0Lyso PC-BPD和20:0Lyso PC-BPD脂质轭合物。从TLC板上去除极性最大的含16:0Lyso PC-BPD或20:
0Lyso PC-BPD的二氧化硅级分(Rf约0.144)，并置于50ml聚丙烯管中。通过在DCM中的33％甲醇(30ml)中超声处理10分钟，从二氧化硅级分中提取16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD。通过在3,700xg下离心10分钟使二氧化硅沉积，并将含有提取的16:0Lyso PC-BPD或
20:0Lyso PC-BPD的上清液收集在250ml圆底烧瓶中。将二氧化硅级分用在DCM中的33％甲醇再洗涤两次，并且分别将所有的16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD溶液合并到250ml的圆底烧瓶中。通过连接到液氮阱冷凝器进行的旋转蒸发，在减压下，在40℃将溶剂混合物从提取的16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD中去除。通过在100％DCM中重新溶解干燥的
16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD提取物来去除预先溶解在甲醇-DCM溶剂混合物中的残余二氧化硅。通过使用粘附在聚丙烯注射器末端的FisherbrandTM聚(四氟乙烯)(PTFE)过滤器(0.22μm孔径，13mm直径)进行过滤来去除不溶性二氧化硅沉淀。使用旋转蒸发从过滤的16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD溶液中去除DCM。然后将纯化的轭合物重新溶解在氯仿(5ml)中并在-20℃在黑暗中储存。通过在DMSO中稀释该磷脂轭合物并且使用34,895M-1.cm-1的消光系数ε687nm测量UV-可见吸收光谱来确定16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD的浓度。
[0125] 脂质体合成
[0126] 所有脂质体配制品均使用水合脂质膜方法制备。首先在13x 100mm 管中从所有脂质和掺杂剂的氯仿溶液制备脂质膜。从1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC，734.04g/mol)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯化物盐)(DOTAP，阳离子，698.54g/mol)或1,2-二(9Z-十八烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)(钠盐)(DOPG，阴离子，797.026g/mol)、胆固醇(386.65g/mol)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(DSPE-mPEG2000，2805.50g/mol)以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[二苯并环辛基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(DSPE-PEG2000-ADIBO，3077.80g/mol)制备脂质混合物。所有前述试剂购自 极性脂质公司(Polar Lipids,Inc.)，并制备成总共34.043μmol脂质。除非其他地方另有说明，将DPPC、DOTAP(阳离子)/DOPG(阴离子)、胆固醇、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-ADIBO分别以58.2:
7.9:28.9:4.5:0.5的摩尔百分比混合。聚乙二醇化的DSPE始终保持总共5％，其中0.5％替代为DSPE-PEG2000-ADIBO以介导与叠氮化物衍生化抗体的无铜点击轭合。在一个实验中，聚乙二醇化的DSPE的摩尔百分比变化为5％、4％、3％、2％、1％和0.5％，同时保留1:10比率的DSPE-PEG2000-ADIBO:DSPE-mPEG2000。光敏剂-磷脂轭合物，即16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD代替DPPC 200nmol(0.6mol％)的一部分。对于需要游离BPD疏水掺入的脂质体配制品，将未轭合的BPD的氯仿溶液添加到氯仿中的脂质混合物中。将所有脂质短暂涡旋，并使用氮气流通过16号计量注射针在连续旋转下使氯仿蒸发以形成薄的脂质膜。通过在真空下储存该脂质膜24小时来去除残留的氯仿。使用冻-融-涡旋方法，使用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)将干燥的脂质膜进行水合。将1x DPBS(1ml)添加到脂质膜中，并且将 管紧密密封并包裹在 中。对于水性光敏剂如二氢卟酚e6单乙二胺单酰胺(CMA)的实验，将脂质膜空隙16:0Lyso PC-BPD与1ml的PBS(含有400μM CMA和作为赋形剂的1％PEG300)进行水合，以防止CMA堆积。然后将该管在42℃在黑暗水浴中孵育10分钟，以最大速度涡旋30秒，然后在冰浴中孵育10分钟。将该循环再重复4次以制备多层囊泡。为了制备单分散的单层脂质体，使用 微型挤出机试剂盒，将多层囊泡悬浮液(1ml)在42℃挤出通过两个聚碳酸酯膜(0.1μm孔径，19mm直径)5次。将脂质体在4℃在黑暗的容器中储存。通过在DMSO中稀释和均质化所述脂质体并使用34,895M-1.cm-1的消光系数ε687nm测量UV-可见吸收光谱来确定脂质体配制品中的16:0Lyso PC-BPD的浓度。
7.9:28.9:4.5:0.5的摩尔百分比混合。聚乙二醇化的DSPE始终保持总共5％，其中0.5％替代为DSPE-PEG2000-ADIBO以介导与叠氮化物衍生化抗体的无铜点击轭合。在一个实验中，聚乙二醇化的DSPE的摩尔百分比变化为5％、4％、3％、2％、1％和0.5％，同时保留1:10比率的DSPE-PEG2000-ADIBO:DSPE-mPEG2000。光敏剂-磷脂轭合物，即16:0Lyso PC-BPD或20:0Lyso PC-BPD代替DPPC 200nmol(0.6mol％)的一部分。对于需要游离BPD疏水掺入的脂质体配制品，将未轭合的BPD的氯仿溶液添加到氯仿中的脂质混合物中。将所有脂质短暂涡旋，并使用氮气流通过16号计量注射针在连续旋转下使氯仿蒸发以形成薄的脂质膜。通过在真空下储存该脂质膜24小时来去除残留的氯仿。使用冻-融-涡旋方法，使用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)将干燥的脂质膜进行水合。将1x DPBS(1ml)添加到脂质膜中，并且将 管紧密密封并包裹在 中。对于水性光敏剂如二氢卟酚e6单乙二胺单酰胺(CMA)的实验，将脂质膜空隙16:0Lyso PC-BPD与1ml的PBS(含有400μM CMA和作为赋形剂的1％PEG300)进行水合，以防止CMA堆积。然后将该管在42℃在黑暗水浴中孵育10分钟，以最大速度涡旋30秒，然后在冰浴中孵育10分钟。将该循环再重复4次以制备多层囊泡。为了制备单分散的单层脂质体，使用 微型挤出机试剂盒，将多层囊泡悬浮液(1ml)在42℃挤出通过两个聚碳酸酯膜(0.1μm孔径，19mm直径)5次。将脂质体在4℃在黑暗的容器中储存。通过在DMSO中稀释和均质化所述脂质体并使用34,895M-1.cm-1的消光系数ε687nm测量UV-可见吸收光谱来确定脂质体配制品中的16:0Lyso PC-BPD的浓度。
[0127] 脂质体有效载荷的光触发释放
[0128] 如上所述制备含有最佳DSPE-PEG2000-ADIBO浓度和200nmol的16:0Lyso PC-BPD或无光敏剂(作为对照)的脂质体，但使用1ml的含有100mM钙黄绿素二钠盐的PBS进行水合。如上所述，在42℃将脂质体挤出通过两个聚碳酸酯膜(0.1μm孔径，19mm直径)5次。通过在4℃将Float-A- 透析管(300kDa分子量截留)中的1ml脂质体等分试样针对1x PBS进行透析48小时而去除未包封的钙黄绿素二钠盐。然后使脂质体穿过用Sephadex G-25预包装的illustra NAP柱以去除残留的脂质体外的钙黄绿素二钠盐。使用70,000M-1.cm-1的ε492nm测量钙黄绿素二钠盐的浓度，并且在1xPBS或含有10mM叠氮化钠(作为反应性分子种类的淬灭剂)的1x PBS中稀释至2μM。使用690nm二极管激光器以150mW/cm2的辐照度辐照脂质体，用于递增地增加注量至高达100J/cm2。测量脂质体有效载荷的钙黄绿素替代物的释放(作为荧光去淬灭程度的函数)，其通过使用450nm激发滤光器、475nm截留和500-70nm的发射谱的读板仪进行测量。
[0129] 位点特异性蛋白Z与西妥昔单抗轭合
[0130] 根据先前公开的方案进行蛋白Z与西妥昔单抗的位点特异性轭合。参见J.Hui，S.Tamsen，Y.Song和A.Tsourkas，LASIC:Light Activated Site-Specific Conjugation of Native IgGs[LASIC：天然IgG的光激活的位点特异性轭合]，2015Bioconjugate Chemistry[生物共轭化学]，26,1456-1460。生物工程化蛋白Z分子含有非天然氨基酸苯甲酰基苯丙氨酸(BPA)和IgG结合位点以介导通过365nm UV光致交联的共价交联。蛋白Z构建体还含有具有5-羧基荧光素分子(5-FAM)和叠氮化物部分的末端定制肽，用于点击化学。使用UV-可见分光光度法和217,315M-1.cm-1的消光系数ε280nm(使用Expasy Protoparam工具获得的信息)来确定西妥昔单抗的浓度。使用UV-可见分光光度法和82,000M-1.cm-1的消光系数ε492nm来确定与位点特异性轭合的蛋白Z分子对应的5-FAM的浓度。将纯化的叠氮基西妥昔单抗-蛋白Z在黑暗中在4℃保存，直至需要用于与脂质体进行点击轭合。
[0131] 针对抗体和靶向部分的随机叠氮基修饰
[0132] 通过N-羟基琥珀酰亚胺基叠氮基聚(乙二醇)4(NHS-PEG4-叠氮化物，388.37g/mol)与抗体的赖氨酸残基的随机轭合，将叠氮基部分随机引入西妥昔单抗。同时，将西妥昔单抗随机地与Alexa 488(AF488-NHS，643.4g/mol)的N-羟基琥珀酰亚胺酯进行轭合。将NHS-PEG4-叠氮化物(10mg/ml)和AF488-NHS(1mg/ml)在无水二甲基亚砜(DMSO)中的储备溶液以相当于每分子2.5倍摩尔过量的量混合到西妥昔单抗中，然后添加抗体溶液。然后将西妥昔单抗(在1x DPBS中的2mg/ml，145781.6g/mol(FASTA序列分析)， 百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))添加到NHS-PEG4-叠氮化物和AF488-NHS混合物中，并通过轨道旋转在4℃在黑暗中混合24小时。通过用Sephadex G-25预包装的illustra NAP柱从轭合的西妥昔单抗去除未反应的NHS-PEG4-叠氮化物和AF488-NHS，并用1x DPBS进行平衡。收集与AF488和PEG4-叠氮化物(AF488-Cet-PEG4-叠氮化物)轭合的纯化的西妥昔单抗，并通过在30kDa超滤管中以2,500xg在4℃离心20分钟进行浓缩。使用UV-可见分光光度法和217,315M-1.cm-1的消光系数ε280nm(使用Expasy Protoparam工具获得的信息)来确定西妥昔单抗的浓度。使用UV-可见分光光度法和71,000M-1.cm-1的消光系数ε494nm来确定与AF488-Cet-PEG4-叠氮化物构建体轭合的Alexa 488的浓度。将纯化的AF488-Cet-PEG4-叠氮化物在黑暗中在4℃保存，直至需要用于与脂质体进行点击轭合。对于抗HER-2抗体、曲妥珠单抗和运铁蛋白(运铁蛋白受体的天然配体)采用相同的方法。将所有随机叠氮基配体在黑暗中在4℃保存，直至需要用于与脂质体进行点击轭合。
[0133] 与脂质体的无铜点击轭合
[0134] 通过脂质体表面ADIBO与靶向部分上的叠氮基官能度的无铜点击轭合，将所有脂质体与西妥昔单抗位点特异性轭合，或与西妥昔单抗、曲妥珠单抗随机地轭合。脂质体与靶向部分之间的点击轭合在室温下过夜进行。通过尺寸排阻琼脂糖CL-4B(Sepharose CL-4B)凝胶过滤色谱从点击轭合的脂质体去除过量的靶向部分，并在完全物理和光谱表征后在4℃在黑暗中保存。
[0135] 动态光散射和ζ电位表征
[0136] 使用Zetasizer Nano ZS(马尔文仪器有限公司(Malvern Instruments Ltd.))测量每种修饰之后的所有脂质体的Z-平均直径、多分散性指数和ζ电位。为了同时进行z-平均直径和多分散性指数测量，将2μl的脂质体置于4ml聚苯乙烯4x光学比色皿中，并将1ml的1x DPBS添加到脂质体中。在对每个样品进行三次单独测量之前，进行120秒持续时间的温度平衡。使用折叠的ζ毛细管细胞进行ζ电位测量。用1ml的3mM NaCl稀释10μl的脂质体，加载到细胞中，并对每个样品进行三次单独的测量。
[0137] 针对细胞结合选择性的流式细胞术
[0138] 使用BD FACSAria，按照相同的程序进行所有的流式细胞术分析。简言之，将75％汇合的单层细胞培养物在1x PBS(5ml)中洗涤一次，在含有5mM乙二胺四乙酸(EDTA)和5mM乙二醇四乙酸(EGTA)的1x PBS中洗涤一次，并在新鲜的含EDTA和EGTA的1x PBS(5ml)中在37℃孵育15分钟，伴随频繁搅拌。然后将无胰蛋白酶的细胞悬浮液以1000转/分钟离心5分钟，吸出含有EDTA和EGTA的1x PBS，并将细胞再分散在它们各自的培养基中，并使用Coulter计数器计数。将50,000个细胞放入针对每种条件的各1.5ml离心管中，并以1000xg离心5分钟以沉淀细胞。吸出培养基，并将细胞沉淀物再分散于100μl的它们各自的培养基中，所述培养基包括在其各自浓度下待测的脂质体配制品。在37℃孵育30分钟、90分钟或
180分钟的持续时间后，将细胞以1000xg离心5分钟以沉淀细胞，吸出培养基，并将细胞沉淀物再分散于200μl的冰冷PBS中。将细胞保持在冰上直到进行BD FACSAria细胞术分析。使用来自405nm激光的激发来检测来自细胞的BPD荧光发射，使用来自488nm激光的激发来实现来自细胞的5-羧基荧光素(5-FAM)和 488发射，并且使用来自488nm激光的激
发来实现来自细胞的丽丝胺罗丹明B发射。在脂质体与细胞的孵育期间，使用1mg/ml最终浓度的游离西妥昔单抗进行竞争性阻断测定。
180分钟的持续时间后，将细胞以1000xg离心5分钟以沉淀细胞，吸出培养基，并将细胞沉淀物再分散于200μl的冰冷PBS中。将细胞保持在冰上直到进行BD FACSAria细胞术分析。使用来自405nm激光的激发来检测来自细胞的BPD荧光发射，使用来自488nm激光的激发来实现来自细胞的5-羧基荧光素(5-FAM)和 488发射，并且使用来自488nm激光的激
发来实现来自细胞的丽丝胺罗丹明B发射。在脂质体与细胞的孵育期间，使用1mg/ml最终浓度的游离西妥昔单抗进行竞争性阻断测定。
[0139] 透射电子显微术
[0140] 如先前所述制备ADIBO-修饰的脂质体，其含有200nmol 16:0Lyso PC-BPD或0.1％DPPE-丽丝胺罗丹明B。将这两种脂质与西妥昔单抗-蛋白Z进行位点特异性点击轭合，使用琼脂糖CL-4B凝胶过滤色谱进行纯化，并使用30kD分子量截留的4ml纤维素超滤管进行超滤离心而浓缩，所述超滤管以3000xg在室温下离心30分钟。将10μl的浓缩的脂质体加载到铜网碳包覆栅格上持续1分钟，然后用磷钨酸染色10秒。将样品干燥过夜，然后使用Philips CM10透射电子显微镜(TEM)以80kV的加速电压和46,000x的放大倍数进行成像。
[0141] 共聚焦显微术
[0142] 将OVCAR-5(高EGFR)细胞以每孔2000个细胞的密度接种在玻璃底96孔板的含血清RPMI培养基中持续48小时。用具有100nM 16:0Lyso PC-BPD(随机轭合或非轭合的脂质体的等效物)的新鲜含血清RPMI培养基替换培养基。在使用Leica TCS NT共聚焦显微镜孵育后1小时、6小时和24小时处，使用共聚焦荧光显微术对细胞进行成像。
[0143] 细胞摄取研究
[0144] 将感兴趣的细胞以每孔100,000个细胞的密度接种在96孔板的其各自的含血清培养基中持续24小时。用含有不同电荷的所希望脂质体的新鲜培养基替换培养基，并在37℃孵育。在所需的时间点，将含有脂质体的培养基吸出，将细胞在100μl的1x PBS中洗涤3次，然后在 组织消化溶液中裂解。取25μl等分试样，并且用于使用比色 测定法对各孔中的细胞蛋白质浓度进行定量。将剩余的细胞消化液用于使用荧光对内化的Lyso PC-BPD浓度进行定量，该荧光最终归一化为衍生的蛋白质浓度。
[0145] 体外靶向光毒性
[0146] 如上所述合成含有200nmol的16:0Lyso PC-BPD和优化的量的DSPE-PEG2000-ADIBO的阴离子脂质体，并且将其与114个位点特异性西妥昔单抗-蛋白Z分子(每个脂质体)或者11个随机的西妥昔单抗分子(每个脂质体)进行点击缀合。使用琼脂糖CL-4B凝胶过滤色谱来纯化未轭合的抗体，并使用赛默飞世尔(Thermo Fisher)UV-可见分光光度计确定16:
0Lyso PC-BPD的浓度。在使用前所有脂质体均在4℃保存在黑暗中。
0Lyso PC-BPD的浓度。在使用前所有脂质体均在4℃保存在黑暗中。
[0147] 将A431人表皮样癌细胞(高EGFR)以3000个细胞/孔的密度接种于透明底黑壁96孔板的含血清E-MEM培养基中(A431细胞)，并且将野生型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-WT，零EGFR)以2500个细胞/孔的密度接种于透明底黑壁96孔板的含血清F12K培养基中(CHO-WT)。接种后24小时，用含有所希望浓度的与西妥昔单抗位点特异性或随机点击轭合的脂质体的新鲜培养基替换孔板中的培养基，并孵育3小时。然后用新鲜培养基替换含有脂质体的培养基，并用690nm二极管激光器在150mW/cm2的辐照度和40J/cm2的注量下辐照细胞。辐照后24小时，用含有3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)的新鲜培养基替换培养基，并将细胞在37℃下孵育1小时。然后去除培养基，用DMSO溶解细胞和甲臜MTT产物，并且使用读板仪在576nm测量吸光度。将细胞活力描述为代谢活性的函数(归一化为未处理的对照细胞)。
[0148] 脂质体平台的模块化近红外染料标记
[0149] 如上所述，在不存在光敏化16:0Lyso PC-BPD轭合物的情况下，用4.3％DSPE-mPEG2000、0.5％DSPE-PEG2000-ADIBO和0.2％DSPE-PEG2000-NH2制备阴离子脂质膜。如上所述，将脂质膜在1x PBS中水合并且挤出通过两个100nm聚碳酸酯膜。为了将近红外染料与DSPE-PEG2000-NH2氨基末端直接轭合，将染料 633、 647、680、 700、 680RD和 800CW的N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯的
DMSO溶液(10mg/ml)与脂质体以5倍摩尔过量进行反应以得到表面可及的氨基磷脂。简言之，将1ml脂质体配制品中的0.034微摩尔的表面可及的DSPE-PEG2000-NH2部分与5倍摩尔过量(0.171微摩尔)的染料NHS酯进行反应。使用磁力搅拌器将脂质体染料混合物以2500转/分钟在室温下搅拌24小时，并且然后针对1x PBS在4℃透析48小时。最后，在室温下通过表面DSPE-PEG2000-ADIBO部分将脂质体与50个随机叠氮基西妥昔单抗分子(每个脂质体)或50个叠氮基IgG分子(每个脂质体)点击轭合24小时。使用琼脂糖CL-4B凝胶过滤色谱来纯化未轭合的抗体，并使用赛默飞世尔(Thermo Fisher)UV-可见分光光度计确定与脂质体轭合的近红外染料的浓度。将所有脂质体均在4℃保存在黑暗中。
DMSO溶液(10mg/ml)与脂质体以5倍摩尔过量进行反应以得到表面可及的氨基磷脂。简言之，将1ml脂质体配制品中的0.034微摩尔的表面可及的DSPE-PEG2000-NH2部分与5倍摩尔过量(0.171微摩尔)的染料NHS酯进行反应。使用磁力搅拌器将脂质体染料混合物以2500转/分钟在室温下搅拌24小时，并且然后针对1x PBS在4℃透析48小时。最后，在室温下通过表面DSPE-PEG2000-ADIBO部分将脂质体与50个随机叠氮基西妥昔单抗分子(每个脂质体)或50个叠氮基IgG分子(每个脂质体)点击轭合24小时。使用琼脂糖CL-4B凝胶过滤色谱来纯化未轭合的抗体，并使用赛默飞世尔(Thermo Fisher)UV-可见分光光度计确定与脂质体轭合的近红外染料的浓度。将所有脂质体均在4℃保存在黑暗中。
[0150] 体内动态双示踪成像
[0151] 将用 或 模块化标记的、ADIBO修饰的脂质体分别与50个西妥昔单抗分子(每个脂质体)或50个IgG分子(每个脂质体)进行随机点击轭合。使用琼脂糖CL-4B凝胶过滤色谱进行纯化后，使用赛默飞世尔UV-可见分光光度计确定或 的浓度。在雌性瑞士裸鼠(6周龄)的左下腹侧皮下植入
在生长因子降低的基质胶(Matrigel)中的1x 106U251人成胶质细胞瘤细胞(高EGFR)，并使其生长两周。向小鼠共注射西妥昔单抗靶向的 脂质体和IgG非靶向的
脂质体的混合物，其量为每个脂质体轭合物0.1nmol染料当量。使用
脉冲小动物成像系统，针对靶向的 脂质体和IgG非靶向的
对照脂质体动态和纵向监测相对肿瘤荧光强度。双示踪剂纳米平台的联
合给予后，对肿瘤进行成像长达120小时。
在生长因子降低的基质胶(Matrigel)中的1x 106U251人成胶质细胞瘤细胞(高EGFR)，并使其生长两周。向小鼠共注射西妥昔单抗靶向的 脂质体和IgG非靶向的
脂质体的混合物，其量为每个脂质体轭合物0.1nmol染料当量。使用
脉冲小动物成像系统，针对靶向的 脂质体和IgG非靶向的
对照脂质体动态和纵向监测相对肿瘤荧光强度。双示踪剂纳米平台的联
合给予后，对肿瘤进行成像长达120小时。
[0152] 靶向光敏化脂质体平台的生物分布
[0153] 在6周龄雌性瑞士裸鼠的右下腹侧皮下植入在生长因子减少的基质胶中的1x 106A431人表皮样癌细胞(高EGFR)，并使这些细胞生长两周。然后向小鼠注射0.25mg/kg BPD当量的16:0Lyso PC-BPD脂质体，所述脂质体(1)与10个随机西妥昔单抗分子/脂质体点击轭合或(2)非轭合。静脉内给予后24小时，处死动物，并使用 Lumina III体内临床前成像站对器官进行成像。使用Living 软件分析并量化16:0Lyso PC-BPD脂质体的荧光强度，并将肿瘤中的强度归一化为器官中各自的强度以量化组织选择性。优化研究[0154] 16:0Lyso PC脂质锚定的苯并卟啉衍生物光敏剂(16:0Lyso PC-BPD)
[0155] 已经观察到，如果光敏剂没有稳定地固定到脂质体上，则光敏剂或荧光团从纳米脂质体载体的膜上渗出，这导致选择性降低。疏水性荧光团或光敏剂稳定地锚定到膜中可以通过将荧光团或光敏剂与溶血磷脂轭合来实现。
[0156] 合成了16:0Lyso Pc和20:0Lyso PC的苯并卟啉衍生物(BPD)轭合物，并且将16:0Lyso PC-BPD和20:0Lyso PC-BPD轭合物嵌入磷脂双层中形成稳定的脂质体，其中表面被完全优化，用于叠氮基修饰的靶向配体的点击轭合。为了评估来自脂质体的非特异性BPD渗漏，将OVCAR-5细胞悬浮液(50,000个细胞/条件)与不同浓度的脂质体的BPD等效物一起孵育30分钟，然后通过流式细胞术分析BPD摄取，所述脂质体的BPD等效物是用以下配制的：
(1)未轭合的BPD、(2)16:0Lyso PC-BPD以及(3)20:0Lyso PC-BPD轭合物。图1描绘了在OVCAR-5细胞中的脂质体配制品中，针对(1)具有嵌入脂双层中的BPD的脂质体、(2)具有与
16:0Lyso PC-BPD轭合的BPD的脂质体、以及(3)具有与20:0Lyso PC-BPD轭合的BPD的脂质体，中值BPD荧光强度对比BPD浓度。轭合的BPD的非Lyso PC显示随着BPD当量浓度的增加，中值荧光强度增加，这表明BPD非特异性渗漏到细胞中。含有溶酶体的轭合Lyso PC的BPD未显示这样的渗漏，这表明用16:0Lyso PC-BPD和20:0Lyso PC-BPD形成的稳定脂质体阻断了光敏剂向细胞的所有非特异性渗漏(如观察到疏水BPD包埋于双层中)。
(1)未轭合的BPD、(2)16:0Lyso PC-BPD以及(3)20:0Lyso PC-BPD轭合物。图1描绘了在OVCAR-5细胞中的脂质体配制品中，针对(1)具有嵌入脂双层中的BPD的脂质体、(2)具有与
16:0Lyso PC-BPD轭合的BPD的脂质体、以及(3)具有与20:0Lyso PC-BPD轭合的BPD的脂质体，中值BPD荧光强度对比BPD浓度。轭合的BPD的非Lyso PC显示随着BPD当量浓度的增加，中值荧光强度增加，这表明BPD非特异性渗漏到细胞中。含有溶酶体的轭合Lyso PC的BPD未显示这样的渗漏，这表明用16:0Lyso PC-BPD和20:0Lyso PC-BPD形成的稳定脂质体阻断了光敏剂向细胞的所有非特异性渗漏(如观察到疏水BPD包埋于双层中)。
[0157] 针对点击化学的优化的表面功能化
[0158] 当用强疏水性应变环辛炔部分(如二苯并环辛炔(DIBO))衍生化脂质体表面时，无铜点击化学是可能的。
[0159] 聚乙二醇化
[0160] 图2描绘了通过掺入5％、4％、3％、2％、1％和0.5％的磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-mPEG2000)而空间上稳定的、含有16:0Lyso PC-BPD的脂质体的Z-平均直径和多分散性指数。对于通过轭合应变环辛炔(ADIBO)的脂质1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[二苯并环辛基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000-ADIBO)的点击化学功能性，当引入并保持1:10摩尔比的DSPE-PEG2000-ADIBO:
DSPE-mPEG2000时，脂质体保持稳定。据信使用DSPE-mPEG2000对DSPE-PEG2000-ADIBO疏水性进行9倍摩尔反稳定化支持总体脂质体稳定性。将ADIBO的N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯与磷脂1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-NH2)进行偶联。将DSPE-PEG-NH2整合到脂质体中并用9倍摩尔量的DSPE-mPEG2000进行反稳定化。
还进行了靶向配体与稳定的ADIBO官能化脂质体的无铜点击轭合。图26描绘了包含16:
0Lyso PC-BPD光敏剂的脂质体的结构示意图，显示有PEG链。实例配制品包括57.6％DPPC、
7.9％DOPG、28.9％胆固醇、4.5％DSPE-mPEG2000、0.5％DSPE-mPEG2000-ADIBO和0.6％16:
0Lyso PC-BPD。
DSPE-mPEG2000时，脂质体保持稳定。据信使用DSPE-mPEG2000对DSPE-PEG2000-ADIBO疏水性进行9倍摩尔反稳定化支持总体脂质体稳定性。将ADIBO的N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯与磷脂1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-NH2)进行偶联。将DSPE-PEG-NH2整合到脂质体中并用9倍摩尔量的DSPE-mPEG2000进行反稳定化。
还进行了靶向配体与稳定的ADIBO官能化脂质体的无铜点击轭合。图26描绘了包含16:
0Lyso PC-BPD光敏剂的脂质体的结构示意图，显示有PEG链。实例配制品包括57.6％DPPC、
7.9％DOPG、28.9％胆固醇、4.5％DSPE-mPEG2000、0.5％DSPE-mPEG2000-ADIBO和0.6％16:
0Lyso PC-BPD。
[0161] 静电学
[0162] 通过掺入7.9％1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP，阳离子)或1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)(DOPG，阴离子)，将阴离子和阳离子电荷引入到含有苯并卟啉衍生物光敏剂的脂质体中。图3A-3C针对含有DOTAP、DOPG或无电荷添加的、ADIBO修饰的含16:0Lyso PC-BPD的脂质体，分别显示ζ电位、Z平均直径和多分散性指数(PDI)。发现阴离子或阳离子电荷进一步提供了ADIBO修饰的、含16:0Lyso PC-BPD的脂质体的静电稳定性。图3C中所示的带电脂质体与中性脂质体的相对多分散性指数表明，在没有引入带电脂质的情况下，脂质体聚集并沉淀。图4显示OVCAR-5细胞、A431细胞和T47D细胞中含非靶向DOTAP和DOPG的脂质体的细胞更新(pmol 16:0Lyso PC-BPD/μg细胞蛋白)的定量。当阴离子带电脂质DOPG被掺入到脂质体中时，发现ADIBO修饰的、含16:0Lyso PC-BPD的脂质体的非特异性摄取在细胞系中更均匀。均匀的非特异性摄取谱促进了精确的细胞靶向。
[0163] 光触发释放
[0164] 将钙黄绿素以足够高的浓度加载在脂质体中，用于荧光团(100mM)的自淬灭。膜中的脂质体配制品具有16:0Lyso PC-BPD或者无光敏剂(作为对照)。脂质体形成后，将所有脂质体外钙黄绿素荧光团通过透析和凝胶过滤进行纯化，并将脂质体置于96孔板中。用690nm的光辐照脂质体以释放脂质体内钙黄绿素，该脂质体内钙黄绿素对释放进行去淬灭。使用读板仪测量释放后钙黄绿素的去淬灭(和荧光增加)，并在辐照之前归一化为对照。图5显示具有(1)Lyso PC-BPD(最上图)、(2)Lyso PC-BPD和叠氮化物(中图)以及(3)无Lyso PC-PBD(最低图)的脂质体的释放倍数，对比690nm光下的注量(光剂量)。在辐照膜和表面DSPE-PEG-ADIBO中的含有16:0Lyso PC-BPD的脂质体时，释放淬灭浓度的荧光团钙黄绿素二钠盐(脂质体包封的治疗剂的替代物)。未见16:0Lyso PC-BPD在膜中释放，并且在10mM叠氮化钠存在下释放被抑制。据信，这表明ADIBO修饰的含有16:0LysoPC-BPD的脂质体对于脂质体有效载荷的光氧化和光触发释放是不稳定的。不希望受理论束缚，认为在叠氮化钠存在下对光引发释放的速率抑制表明该过程是光化学的并且取决于反应性分子种类。
[0165] 靶向配体与脂质体的无铜点击轭合
[0166] 抗体的叠氮基修饰
[0167] 针对靶向部分与用应变环辛炔预修饰的脂质体表面的无铜点击轭合，将靶向部分用叠氮基基团进行装饰。进行西妥昔单抗(抗-EGFR抗体， )的位点特异性或随机叠氮化物修饰，作为IgG点击轭合至含有光敏剂和/或显像剂的优化的脂质体平台的原理论证。使用生物工程化的蛋白Z分子将叠氮化物部分位点特异性引入西妥昔单抗，所述生物工程化的蛋白Z分子仅结合IgG分子的Fc部分。(Hui,J.Z.,Al Zaki,A.,Cheng,Z.,Popik,V.,Zhang,H.,Prak,E.T.L和Tsourkas,A.，Facile Method for the Site-Specific,Covalent Attachment of Full-Length IgG onto Nanoparticles[用于将全长IgG位点特异性共价附着到纳米颗粒上的简便方法](2014)Small 10(16):3354-63.doi:10.1002/smll.201303629。)图6A是通过无铜点击化学，与西妥昔单抗-蛋白Z结合的脂质体表面的示意图。蛋白Z与任何IgG分子(例如西妥昔单抗)的Fc区进行位点特异性结合，并通过非天然苯甲酰基苯丙氨酸氨基酸进行光交联。将肽结合的蛋白Z上的末端叠氮化物与最佳表面摩尔比的DSPE-PEG2000-ADIBO(一种应变环辛炔衍生化磷脂)进行点击轭合。图6B是通过无铜点击化学，与叠氮基-西妥昔单抗Z结合的脂质体表面的示意图。随机连接到靶向蛋白(例如西妥昔单抗)上的PEG4分子上的末端叠氮化物与最佳表面摩尔比的DSPE-PEG2000-ADIBO(一种应变环辛炔衍生化磷脂)进行点击轭合。
[0168] 图7A-B分别显示位点特异性叠氮化物轭合物的UV-可见光谱和结构示意图。使用PEG4-叠氮化物的N-羟基琥珀酰亚胺酯实现叠氮化物部分随机引入西妥昔单抗。将单个荧光团(针对位点特异性西妥昔单抗的5-FAM和针对随机西妥昔单抗的 488)引入到每个抗体轭合物中。蛋白Z与西妥昔单抗的比为1.13±0.17。图8A-B分别显示结合
488的随机叠氮化物轭合物的UV-可见光谱及其结构示意图。
488与西妥昔单抗的比为1.00±0.04。
488的随机叠氮化物轭合物的UV-可见光谱及其结构示意图。
488与西妥昔单抗的比为1.00±0.04。
[0169] 点击轭合
[0170] 在轭合抗体的不同表面密度下进行叠氮基修饰的西妥昔单抗与ADIBO修饰的含有16:0Lyso PC-BPD的阴离子脂质体的位点特异性和随机无铜点击轭合。使用动态光散射收集尺寸和分散性数据。图9显示位点特异性(图9A)和随机性(图9B)轭合的脂质体大小(各图中的最上图)和多分散性指数(各图中的下图)的比较。根据图9A和9B，位点特异性和随机轭合都产生了稳定的脂质体。图10描绘了与在80kV的加速电压和46,000x的放大倍数下成像的西妥昔单抗-蛋白Z进行位点特异性点击轭合的脂质体的透射电子显微镜(TEM)图像。图
11显示位点特异性(左边最上图)和随机性(左边下图)轭合的ζ-电位对比轭合效率。图12显示轭合的西妥昔单抗数/脂质体，对比位点特异性(最上图)和随机性(下图)轭合的轭合效率。至少基于图12所示的数据，据信西妥昔单抗与脂质体的位点特异性点击轭合明显比与脂质体的随机点击轭合更有效。不希望受理论束缚，据信随机共轭所观察到的较低效率是一些叠氮基团对DIBO部分的较低可及性的结果，这可能是随机引入叠氮化物到抗体的任何部分的结果。
11显示位点特异性(左边最上图)和随机性(左边下图)轭合的ζ-电位对比轭合效率。图12显示轭合的西妥昔单抗数/脂质体，对比位点特异性(最上图)和随机性(下图)轭合的轭合效率。至少基于图12所示的数据，据信西妥昔单抗与脂质体的位点特异性点击轭合明显比与脂质体的随机点击轭合更有效。不希望受理论束缚，据信随机共轭所观察到的较低效率是一些叠氮基团对DIBO部分的较低可及性的结果，这可能是随机引入叠氮化物到抗体的任何部分的结果。
[0171] 结合西妥昔单抗的BPD和5-FAM蛋白Z的中值荧光强度之间的相关性在A431细胞描绘于图30A(高EGFR)中，而在T47D细胞中描绘于图30B(低EGFR)中。高相关系数指示与脂质体点击轭合的西妥昔单抗的完整性。
[0172] 体外结合选择性和光毒性
[0173] 使用BPD荧光作为脂质体-细胞结合的标记，使用流式细胞术评估在制备的所有密度下由位点特异性或随机西妥昔单抗轭合而制备的靶向脂质体的EGFR选择性。图13显示A431细胞(高EGFR；最上图)、T47D细胞(低EGFR；中图)和CHO-WT细胞(无EGFR；下图)中结合选择性的比较。图14显示在A431细胞(高EGFR；最上图)、T47D细胞(低EGFR；中图)和CHO-WT细胞(无EGFR；下图)中脂质体-西妥昔单抗轭合物与 488的结合选择性的比较。在图13和14中，选择性随着A431细胞中西妥昔单抗数/脂质体的增加而增加，而在T47D和CHO-WT细胞中几乎没有表现出变化。图14显示随机轭合方法的选择性比位点特异性方法在细胞结合方面更有效。
[0174] 图28中描绘了流式细胞术数据并且显示了来自与v0、10、50或100西妥昔单抗-蛋白Z轭合物(Cet-Pz)/脂质体进行反应的脂质体的中值光敏剂(BPD)强度。将脂质体与A431(高EGFR)或T47D(低EGFR)细胞一起以250nM或500nM BPD当量的靶向脂质体，在37℃孵育30分钟。显而易见的是，更多反应的100Cet-Pz/脂质体在靶向细胞结合方面没有优于与50Cet-Pz/脂质体反应的脂质体的显著优势。
[0175] 图31A和31B描绘了流式细胞术数据，其中中值BPD强度是50,000个单独测量的细胞的平均值。将细胞与点击轭合至50个西妥昔单抗/脂质体(图31A)的脂质体，相对于非轭合脂质体(图31B)，一起孵育30分钟、90分钟或180分钟。数据显示，在所有3个时间点，与非靶向等效物相比靶向脂质体显示优先结合OVCAR-5细胞(表达高EGFR)。脂质体的选择性(图31C)用靶向脂质体孵育的细胞的中值BPD强度除以用非特异性脂质体孵育的细胞的中值BPD强度来表示。
[0176] 靶向脂质体与OVCAR-5细胞的结合的西妥昔单抗依赖性通过与1mg/ml游离西妥昔单抗一起孵育以阻断靶向脂质体与细胞表面EGFR的相互作用来验证。图15显示靶向的和非特异性的脂质体以及当EGFR被阻断时靶向的和非特异性的脂质体的流式细胞术数据。在所有三个时间点(180分钟、90分钟和30分钟)，游离的西妥昔单抗的存在完全阻断了靶向脂质体与OVCAR-5细胞的结合，如通过靶向16:0Lyso PC-BPD脂质体与细胞结合产生的中值BPD发射信号的减少所阐明的。
[0177] 在使用690nm激光辐照的CHO-WT细胞(无EGFR)和A431细胞(高EGFR)中比较光毒性的选择性。图16显示使用与西妥昔单抗位点特异性和随机性轭合的16:0Lyso PC-BPD脂质体进行选择性光动力学疗法后的细胞活性。在没有辐照的情况下，与任一种靶向脂质体的孵育对A431细胞或CHO-WT细胞的活力没有影响。靶向脂质体在CHO-WT细胞中诱导可忽略的光毒性水平，而A431活力降低至约50％，这强调了靶向脂质体平台介导选择性癌症治疗的能力。使用MTT比色测定在PDT处理后24小时评估指示活力的代谢活性(*＝P≤0.05，**＝P≤0.01，***＝P≤0.001)。
[0178] 图32描绘了用20J/cm2的690nm激光进行PDT治疗后，A431和OVCAR-5细胞(高EGFR)以及T47D细胞(低EGFR)的MTT测定结果。将随机靶向的脂质体与所述细胞一起孵育24小时。使用MTS比色测定在PDT处理后24小时评估指示细胞活力的代谢活性(*＝P≤0.05，**＝P≤
0.01，***＝P≤0.001)。在所有的BPD浓度下，T47D细胞的细胞活力最高，并且随着BPD浓度的增加，细胞活力降低。
0.01，***＝P≤0.001)。在所有的BPD浓度下，T47D细胞的细胞活力最高，并且随着BPD浓度的增加，细胞活力降低。
[0179] NHS-PEG4-N3还可以与任何含伯胺的靶向配体随机轭合，并可以与同一光敏化纳米构建体点击轭合。这通过西妥昔单抗(抗-EGFR抗体)、曲妥珠单抗(抗-HER-2抗体)和人运铁蛋白(运铁蛋白受体的天然配体)的轭合来证明。倍数选择性使用流式细胞术来获得并且用过表达靶受体的细胞的中值BPD荧光除以表达很少或不表达靶受体的细胞的中值BPD信号来表示(图17)。红线代表1倍选择性，其中相比非靶细胞，靶向脂质体不优先与靶细胞结合。A431细胞是过表达EGFR受体的人表皮样癌细胞，SKOV-3细胞是过表达HER-2受体的卵巢癌细胞，T47D细胞是过表达运铁蛋白受体的乳腺胸腔积液癌细胞，并且CHO细胞是非癌性的中国仓鼠卵巢细胞。图17证实，当点击ADIBO修饰的、含有16:0Lyso PC-BPD的脂质体时，曲妥珠单抗(抗-HER-2抗体， )和运铁蛋白(运铁蛋白受体的天然配体)的随机叠氮基修饰表现出结合的细胞选择性。
[0180] ADIBO-修饰的、无包埋的16:0Lyso PC-BPD的膜的脂质体负载有水溶性光敏剂二氢卟酚e6单乙二胺单酰胺(CMA)，并显示当随机轭合西妥昔单抗时提供细胞选择性(图18A)。脂质体的示意图示于图18B中。
[0181] 获得流式细胞术数据，其描绘源自脂质体膜的中值光敏剂(BPD)强度(图29A)和源自连接至蛋白Z的荧光标记肽的中值5-FAM荧光强度(图29B)。将A431(高EGFR)和T47D(低EGFR)细胞与25、50、100和250nM BPD当量的靶向西妥昔单抗-蛋白Z点击的脂质体或没有抗体轭合的非特异性脂质体在37℃孵育30分钟。该数据显示荧光标记的西妥昔单抗-蛋白Z和嵌入在点击轭合的脂质体的膜中的16:0Lyso PC-BPD的EGFR依赖性细胞结合之间存在强烈的正相关性。相关性验证了无铜点击轭合的脂质体是可以均匀地递送脂质体有效载荷到靶癌细胞的稳定实体。
[0182] 选择性胞吞：
[0183] 靶向脂质体平台的选择性细胞内递送使细胞内诱导生物/化学治疗剂的光动力治疗和细胞内光触发递送成为可能。图19显示在渐进时间间隔下OVCAR-5细胞中的非靶向和随机靶向的脂质体的共聚焦荧光显微术图像，这表明靶向的脂质体的细胞内化。显微照片表明与西妥昔单抗轭合的含有16:0Lyso PC-BPD的脂质体能以时间依赖性方式被选择性细胞内递送到过表达EGFR的OVCAR-5细胞内。
[0184] 对脂质体纳米构建体进行荧光标记，用于靶向纳米构建体的体外成像和体内生物成像。
[0185] 亲水性荧光团的稳定锚定可以通过它们与(1)胆固醇，(2)磷脂(如1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE))的磷酸酯头基或(3)聚乙二醇化磷脂(如DSPE-PEG2000-NH2)的末端进行轭合来实现。
[0186] 模块化荧光团标记
[0187] 作为无铜点击化学组分的ADIBO的高化学选择性使不同反应性实体与脂质体表面的模块化轭合成为可能，而不与ADIBO发生交叉反应。将0.2％DSPE-PEG2000-NH2掺入ADIBO修饰的脂质体中，并与近红外染料的胺反应性NHS-酯轭合以制备能够用于体内成像的一组稳定的点击-反应性脂质体(图20)。用于标记ADIBO修饰的脂质体的染料包括633、 647、 680、 700、 680RD和
800CW。制备的配制品包括58.2％DPPC、7.9％DOPG/DOTAP、28.9％胆固醇、4.3％DSPE-mPEG2000、0.5％DSPE-PEG2000-ADIBO(用于与抗体进行点击轭合)和0.2％DSPE-PEG2000-NH2(用于与染料进行酰胺偶联)。所有的脂质体在它们与西妥昔单抗或假IgG1对照进行随机点击轭合后保持稳定。图21A显示包含各种染料的脂质体的大小和多分散性指数，并且图21B显示每个脂质体的UV-可见光谱。
800CW。制备的配制品包括58.2％DPPC、7.9％DOPG/DOTAP、28.9％胆固醇、4.3％DSPE-mPEG2000、0.5％DSPE-PEG2000-ADIBO(用于与抗体进行点击轭合)和0.2％DSPE-PEG2000-NH2(用于与染料进行酰胺偶联)。所有的脂质体在它们与西妥昔单抗或假IgG1对照进行随机点击轭合后保持稳定。图21A显示包含各种染料的脂质体的大小和多分散性指数，并且图21B显示每个脂质体的UV-可见光谱。
[0188] 荧光团标记的脂质体的体外选择性
[0189] 掺入脂质锚定的荧光团丽丝胺罗丹明B-DPPE的实例配制品示于图39A中。为了掺入ADIBO，在具有10％DMSO的pH 8的100mM磷酸盐缓冲液中将5当量的二苯并环辛炔NHS酯(ADIBO-NHS 0.426mM)与胺进行反应。三个样品(50％v/v GOA_111+5x ADIBO 1(最上图)、50％v/v GOA_111+5x ADIBO 2(中图)和50％v/v GOA_111+5x ADIBO 3(最下图))的大小和多分散性指数示于图39B中。
[0190] 将包括罗丹明的脂质体与0、10、50和100个西妥昔单抗-蛋白Z/脂质体在室温下以50mL等分试样孵育过夜。使用琼脂糖CL-4B凝胶过滤色谱从未结合的抗体纯化每个轭合物，并使用UV-可见光谱和动态光散射(DLS)进行表征。图40显示每个样品的大小和多分散性指数。
[0191] 将结合丽丝胺罗丹明B的0.1％的DPPE掺入到ADIBO修饰的脂质体中，并且与西妥昔单抗进行位点特异性点击轭合。图22显示为每个脂质体的西妥昔单抗-蛋白Z(Cet-Pz)密度的函数的中值丽丝胺罗丹明B(Lissamine Rhodamine B)强度，这表明与T47D细胞(低EGFR；下图)相比，荧光标记的脂质体选择性结合A431细胞(高EGFR；上图)。在10至50个Cet-Pz/脂质体之间出现最佳密度。
[0192] 图35显示在500nM丽丝胺罗丹明B当量下，使用GOA_111-CetPz(10CetPz/脂质体)中值丽丝胺罗丹明B强度，各种癌细胞系的倍数选择性。将100μL脂质体样品在37℃与50,000个细胞一起孵育30分钟。高EGFR A431细胞表现出最高的选择性。
[0193] 制备与西妥昔单抗-蛋白Z轭合的BPD-罗丹明脂质体，并通过透射电子显微术进行成像。制备具有0或10个西妥昔单抗/脂质体的200μlGOA_113，然后进行2000xg 100kDa超滤持续20分钟。将10μl的浓缩的脂质体加载到铜网碳包覆栅格上持续1分钟，然后用磷钨酸染色10秒。将样品干燥过夜。图36显示根据上述过程处理的脂质体的透射电子显微镜(TEM)图像。
[0194] 图34显示在500nM和100nM浓度的丽丝胺罗丹明B(分别为最上图和下一个图)下的A431细胞、以及在500nM和100nM浓度的丽丝胺罗丹明B(下两个图)下的T47D细胞的最佳西妥昔单抗-蛋白Z密度。在A431中在500nM下最佳密度为10个CetPz/脂质体，并且在A431中在100nM下为50个CetPz/脂质体。
[0195] 图37显示相对于nM当量的罗丹明的倍数选择性，这表明点击轭合西妥昔单抗并且包含脂质锚定罗丹明染料和疏水包埋的游离BPD两者的脂质体与没有抗体轭合的脂质体相比，显示出差异水平的选择性。由于将脂质锚定的罗丹明固定在与抗体共价轭合的膜上，因此在30分钟处以浓度依赖性方式观察到罗丹明结合的选择性高达4.5倍(如通过FACS荧光信号所确定的)。游离西妥昔单抗阻断了这种选择性，这证实罗丹明(和脂质体)选择性依赖于EGFR结合。疏水性包埋在同一脂质体中的游离BPD具有非常不同的选择性谱，其中在靶向脂质体中仅观察到1.5倍优先于非靶向脂质体。基于这些观察，抗体轭合提供了脂质体选择性，但是游离BPD无论是否与脂质体结合都渗入细胞。
[0196] 图33显示为每个脂质体的西妥昔单抗-蛋白Z密度的函数的中值5-FAM荧光强度，这也表明相比于T47D细胞(下图)，对A431细胞(上图)的高选择性。在约100个Cet-Pz/脂质体处出现最佳密度。
[0197] 体内生物成像和选择性
[0198] 用 680RD和 800CW标记的ADIBO修饰的脂质体可以分别与西妥昔单抗或人IgG1假抗体对照进行随机点击轭合。图23显示 680RD(上图)和
800CW(下图)相对于时间的校正的荧光平均值，这表明与点击轭合于假人IgG1对照的共注射的IRDye800CW标记的脂质体相比，点击轭合于西妥昔单抗(Erbitux)的IRDye680RD标记的脂质体与皮下U251肿瘤的选择性结合。
800CW(下图)相对于时间的校正的荧光平均值，这表明与点击轭合于假人IgG1对照的共注射的IRDye800CW标记的脂质体相比，点击轭合于西妥昔单抗(Erbitux)的IRDye680RD标记的脂质体与皮下U251肿瘤的选择性结合。
[0199] 向小鼠静脉内注射0.1nmol染料当量的每种脂质体(与50个随机PEG-叠氮化物西妥昔单抗分子(每个脂质体)和50个随机PEG-叠氮化物非特异性IgG分子(每个脂质体)进行点击轭合的靶向脂质体)后，对过表达EGFR的皮下U251鼠异种移植物成胶质细胞瘤肿瘤进行成像。用近红外荧光团 标记靶向脂质体，用近红外荧光团标记非特异性脂质体。使用PEARL成像系统进行双示踪成像方法。与IgG1
假轭合的脂质体相比，发现靶向脂质体在给予后24小时达到最大选择性。
假轭合的脂质体相比，发现靶向脂质体在给予后24小时达到最大选择性。
[0200] 在靶向光疗的含16:0Lyso PC-BPD的脂质体的单独生物分布研究中，向带有皮下A431表皮样癌肿瘤的小鼠注射0.25mg/kg BPD当量的非靶向和随机的西妥昔单抗靶向脂质体。在注射后24小时收集肿瘤和器官，并对16:0Lyso PC-BPD生物分布进行定量成像。图24显示靶向脂质体(每对中的右侧柱)相比非靶向脂质体(每对柱中的左侧柱)对于A431肿瘤更具选择性。图25显示16:0Lyso PC-BPD的荧光可用于定量成像生物分布，并证实与含有非轭合DIBO的16:0Lyso PC-BPD脂质体对照相比，在施用0.25mg/kg BPD等效物后24小时具有皮下A431(高EGFR)肿瘤的小鼠中随机点击轭合的脂质体的肿瘤选择性。
[0201] 图38显示与罗丹明标记的脂质体(红色)一起孵育30分钟，MGG6细胞神经球(用Hoechst 33324染色的细胞核，蓝色)的共焦荧光显微图像。图38显示在30分钟时，与非靶向脂质体(图38B)相比，点击轭合西妥昔单抗-抗EGFR的靶向脂质体显示优先结合(图38A)。
[0202] 已经描述了本发明的许多实施例。然而，应理解的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可做出诸多改变。因此，其他实施例也处于以下权利要求书的范围内。
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