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体外诊断 精神障碍的方法和生物标志物

阅读：313发布：2020-05-14

专利汇可以提供体外诊断精神障碍的方法和生物标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种体外诊断人个体中精神障碍的存在或人个体对该精神障碍的倾向的方法，其中该精神障碍与功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关，该方法包括：a)在来自个体的身体组织或液体样品中测定至少两个标志物基因的表达水平，其中每一个标志物基因编码至少一个标志物蛋白；b)将测得的表达水平与代表所述标志物基因在健康人群中的表达水平的预定阈值比较；和c)基于比较，确定个体是否患有精神障碍或具有精神障碍倾向，其中如果所述标志物基因测得的表达水平超过、达到预定阈值或降到预定阈值以下，则该测得的表达水平指示精神障碍或倾向。例如，标志物基因Ifng、Ccl4、Il13ra1、Il12rb2、C3和Slc27a2中的各自表达水平(相对mRNA表达)在转基因大鼠(TG，灰色)中相对于非转基因同窝大鼠(LM，白色)有显著下降。即，相对于非转基因对照中各标志物基因的表达水平，转基因大鼠中各测试标志物基因较低的表达水平指示了功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡。，下面是体外诊断精神障碍的方法和生物标志物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种体外诊断人个体中精神障碍的存在或人个体中对该精神障碍的倾向的方法，其中该精神障碍与功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关，该方法包括：
a)在来自该个体的身体组织或液体样品中测定至少两种标志物基因的表达水平，每种所述标志物基因编码至少一种标志物蛋白，其中所述标志物基因选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3；
b)将测得的表达水平与代表所述标志物基因在健康人群中的表达水平的预定阈值比较；和
c)基于比较，确定该个体是否患有精神障碍或具有精神障碍倾向，其中如果所述标志物基因测得的表达水平超过、达到预定阈值或降到预定阈值以下，则该测得的表达水平指示精神障碍或倾向。
2.如权利要求1所述的方法，其中第一标志物基因是RGS1和至少一种第二标志物基因选自人NKG7、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2,和C3。
3.如权利要求2所述的方法，其中第一标志物基因是RGS1而第二标志物基因是NKG7和/或CCL4。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其中至少一种额外标志物基因选自表1所示基因的人类等价物。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其中如果测得的每个表达水平低于相应的参比表达水平和/或达到预定阈值或降到预定阈值以下，则该测得的表达水平指示精神障碍或倾向。
6.如权利要求1-5任一所述的方法，其中通过定量反转录聚合酶链式反应或高亲和力结合试验测定表达水平，和/或其中用微阵列分析测定表达水平。
7.衍生自标志物基因的至少两种标志物蛋白的组合或包含编码标志物蛋白的标志物基因的至少两种核酸分子的组合，所述标志物基因选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3，其用于体外诊断。
8.如权利要求7所述的组合，其中第一标志物基因是RGS1而至少一种第二标志物基因选自NKG7、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3。
9.如权利要求7或8所述的组合，其中至少一种额外标志物基因选自表1所示基因的人类等价物。
10.如权利要求7-9任一所述的组合，其用于诊断人个体中精神障碍的存在或人个体对精神障碍倾向的体外方法，其中所述精神障碍与失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关。
11.一种体外诊断人个体中精神障碍的存在或人个体中对该精神障碍的倾向的试剂盒，其中该精神障碍与功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关，该试剂盒包括：
a)一组寡核苷酸引物，其适于引发至少两种标志物基因的转录物在聚合酶链式反应和/或微阵列中的扩增，其中所述标志物基因各编码至少一种标志物蛋白，所述标志物基因选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3，和/或至少两种第一抗体或分子，其各自与个体的身体组织或液体中的标志物蛋白特异性结合，其中所述标志物蛋白衍生自选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3的标志物基因；
b)至少两种报道探针，其能与衍生自所述转录物的互补DNA(cDNA)结合，其适合在定量反转录聚合酶链式反应中被检测，和/或
至少两种标记的第二抗体，其各自与第一抗体或分子之一特异性结合，其设计在高亲和力结合试验中被检测；和可任选的
c)至少两种参比样品。
12.一种确定对至少一种药物化合物的反应的方法，该药物化合物能纠正功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡，其中根据权利要求1所述方法的步骤a)和b)测定至少两种标志物基因的表达水平并进行比较，其中如果所述标志物基因的各异常表达水平正常化或至少改善，则测定的表达水平表示对药物化合物的反应是积极的。
13.一种用于提供器官、组织或细胞的非人转基因动物，其能够稳定表达编码人DISC1蛋白的修饰基因，其中所述修饰基因的表达水平比相应野生型基因的表达水平更高，因此导致DISC1蛋白在细胞中形成聚集物，所述动物代表具有至少一种精神障碍的人对象亚组，所述动物用于鉴定和分析诊断人个体精神障碍的标志物蛋白或标志物基因。
14.一种确定对与人类个体功能失调DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关的精神障碍或人类个体对该精神障碍的倾向的可能治疗性药物化合物疗效的方法，其中对转基因动物施用所述药物化合物，和其中如果选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3中至少两种标志物基因的异常表达水平在所述转基因动物中施用所述药物化合物后正常化，则其指示疗效是积极的。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述转基因动物是用于提供器官、组织或细胞的非人转基因动物，其能稳定表达编码人DISC1蛋白的修饰基因，其中所述修饰基因的表达水平高于相应野生型基因的表达水平，因此导致细胞内DISC1蛋白的聚集物形成，所述动物代表具有至少一种精神障碍的人对象亚组。

说明书全文

体外诊断精神障碍的方法和生物标志物

技术领域

[0001] 本发明涉及体外诊断人类个体中精神障碍或人类个体对精神障碍的倾向的方法。本发明还涉及标志物蛋白、核酸分子或标志物蛋白或核酸分子的组合，其用于体外诊断学中，还涉及用于在体外诊断人类个体中精神障碍的存在或人类个体对精神障碍的倾向的试剂盒。本发明还涉及非人转基因动物，用于提供器官、组织或细胞以鉴定和分析人类个体的标志物蛋白，以及用该转基因动物确定可能的药物化合物对精神障碍或人类个体对精神障碍的倾向的治疗效果的方法。

[0002] 发明背景

[0003] 精神障碍例如精神分裂症或抑郁的诊断目前单纯靠临床方法通过基于病人自身报告经历的问症、亲友报告的行为和精神状态测试。对于精神障碍没有可靠和有用的客观实验室测试，例如基于生物学起因。此等不相匹配的诊断不尽如人意，因为存在小部分的主观因素，而且整个测试都依赖于观察者。另一个问题是不同的疾病过程提示不同的生物学起因。在一种情况下，疾病仅发病一次而并不留驻(residuum)，在另一种情况下，结果是多次发病且没有或很少留驻，例如某些病例的特征是首次发病以后留驻变为复发而不恢复正常，或某些病例在疾病每次发病后有渐进留驻，而不恢复正常。精神障碍的不同方式令其更难于仅靠临床诊断以发现治疗病人的正确途径为目的来正确诊断该疾病。然而，病人及其相关人员，例如医药公司对于诊断精神障碍(如分裂症或抑郁等)的客观独立方法有相当兴趣。

[0004] 已推测精神分裂症或抑郁等精神障碍有许多生物学原因，然而它们都汇聚成共同的行为方式，因此提供了其内在生物学似乎相同的错觉。例如，精神分裂症病人的典型生物学症状是纹状体多巴胺水平提高。另一种可能症状是神经解剖学异常，例如脑室增大、异常中间神经元定位或生物化学异常例如一些关键蛋白质的蛋白质稳态异常。基于这种理解，可发现诊断精神障碍(例如精神分裂症)的客观方法。

[0005] 例如，精神分裂症断裂蛋白1(disrupted in schizophrenia 1，DISC1)是一种已显示参与细胞增殖、分化、迁移、神经元轴突和树突生长、线粒体转运、分裂和/或融合、和突触处神经递质功能调节的蛋白质。一些研究已显示，未受调节的表达可使动物倾向于行为异常，或可使人类个体发生精神分裂、临床抑郁、双相神经障碍和其他精神疾病。已假设神经元中的蛋白质稳态失衡可导致DISC1蛋白在一小组精神分裂症或其他慢性精神障碍病人中聚集，一些发现已证实了DISC-1依赖性大脑疾病，例如蛋白构象疾病的分类，其初步被称作DISC1病(DISC1opathies，Korth，2012)。即，扰乱的蛋白质稳态和蛋白质聚集可被视为一种精神障碍机制。现有技术

[0006] Dean(2011)描绘了诊断精神障碍尤其是精神分裂症的生物标志物的演化概念，以及来自不同生物标志物开发策略的结果。特别是，高通量筛选技术对发现生物标志物的冲击尤受关注，新的或改良的技术如何实现发现精神分裂症的诊断生物标志物或对确定患者的恰当疗法的生物标志物。提议可鉴定生物标志物，且这些生物标志物能用于诊断和治疗患有精神分裂症的人。然而，虽然Dean提示了一些作为可能的精神分裂症和双相神经障碍的生物标志物的蛋白质，该作者也承认这些生物标志物还需要验证，且临床上有用的标志物的开发仍需相当时间。

[0007] Chan等(2015)描述了一种血清生物标志物测试的开发，其用于鉴定有风险发生精神分裂症的个体，并基于多重免疫试验谱分析。进行了对首次发病未经药物治疗的精神分裂症患者和对照的独立集合的元分析。使用最小绝对值收敛和选择算子回归，鉴定了能最佳分辨患者和对照的最优生物标志物组。用两个独立验证集合验证该生物标志物组，用两个发病前或有风险个体的集合测试其在精神病发病前鉴定病人的预测表现。这些发现被认为代表了向能满足精神病学中早期干预的临床需要的测试迈出了成功第一步。然而，该研究并没有考虑精神分裂症的潜在生物学异源性，因为生物标志物的鉴定是在被诊断确定的患者集合中开始的。

[0008] WO2013/186562 A1公开了一组生物标志物，其用于诊断诸如抑郁、焦虑障碍或其他精神障碍等疾病，由11个标志物组成。提示了使用一种或多种选自以下的分析物：白介素10(IL-10)、白介素18(IL-18)、白介素2(IL-2)、白介素(IL-8)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-
1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(ΜΙΡ-Ια)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-Ιβ)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)、白介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)作为这些疾病或其倾向的生物标志物。WO2013/186562 A1还公开了一种在个体内诊断抑郁、焦虑障碍或其他精神障碍的方法，其中对获自个体的生物学样品中所述分析物生物标志物的量进行定量，然后与存在于正常个体的正常对照样品中的量进行比较，生物样品中分析物生物标志物水平的差异指示了疾病或其倾向。提供的数据显示，分析物可以是对诊断抑郁和焦虑障碍统计学显著的生物标志物。特别是，在患有抑郁和焦虑障碍的人中先天免疫应答性提高，指示抑郁或焦虑的可能遗传易感性。

[0009] 根据WO2010/09763A1，已知把IL-17、IgA、皮质醇(CORT)、载脂蛋白Al、IL-6、补体3(C3)、因子VII、血清淀粉样蛋白P(SAP或APCS)、β2-微球蛋白、ICAM-I、IL-Iβ、TNFα、MIF、血管紧张素、NrCAM(神经元细胞粘连分子)、CD40、癌抗原125(CA125)、HCC 4(CCL6；SCYA6)、嗜酸性粒细胞趋化因子3(CCL26或SCYA26)、VEGF、结合珠蛋白(HP)、IL-Iα、载脂蛋白H(β-2糖蛋白)和TIMP 1用作为一组针对严重抑郁障碍或其倾向的特异性分析物生物标志物。这组生物标志物可用于诊断或监控严重抑郁障碍或其倾向的方法中，其中对来自测试对象的样品中所述分析物生物标志物进行检测和/或定量。发现在患有严重抑郁障碍的患者中，这些分析物生物标志物水平提高。

[0010] US2011/0136738A1公开了一种鉴定与精神分裂症或精神分裂症样症状相关的遗传靶标的方法。利用并建立了精神分裂症动物模型，从至少一只此类动物中获得组织，随时间评估相对于精神分裂症模型发病时的转录调节。提示了在随后的时间点和可任选的在模型建立之前测定动物的基因表达，将模型建立之前或之后的基因表达(或两者)与对照动物(并非精神分裂症模型)一个或多个时间点的基因表达比较。然后检测精神分裂症模型动物组织中失调的转录物。精神分裂症模型中观察到的基因表达的任何改变，不论是相对于同一模型中其他时间点、相对于其他精神分裂症模型或相对于对照动物中的同一或多个时间点，均可为精神分裂症或精神分裂症症状的基因靶标提供信息。然而，虽然已鉴定了数种基因，其失调看来似乎能指示精神分裂症或其症状的存在，但该文献没有提供用于诊断精神分裂症的任何临床上合适的生物标志物或任何的已验证测试方法。

[0011] 因此，需要鉴定精神障碍(例如精神分裂症)的生物学起因，和能鉴定这些起因的方法，以用其筛选治疗法、诊断精神障碍和开发对患有精神障碍的个体的疗法。这些生物学起因可以多种多样，由基因、蛋白质病理学等构成。还需要诊断精神障碍或检测对精神障碍的易感性，和预防或跟踪这些障碍发展的新生物标志物和方法。

[0012] 此外，病人及其亲属也需要“客观的”诊断，而不是口头结论，医药公司需要“客观的”测试，基于此进行以亿计的欧盟临床试验，而不是临床诊断。然而，虽然已知道了一些诊断精神障碍的单一生物标志物或较大的生物标志物组，仍然没有可靠和精确的适合替代或甚至支持普通临床方法的测试。相反，已知生物标志物测试的现有问题是其仅仅涉及几种非特异性的，或太多个生物标志物，因此要么不准确，要么太昂贵，因此不可靠且会给出异常的诊断。目前的生物标志物鉴定中的另一个问题是这种鉴定是从已由临床诊断确诊的病人集合中开始的，而没有考虑其潜在的生物学异质性。结果，可能稀释掉病人亚组中的任何可能的特异性效果。

发明内容

[0013] 本发明的目的是提供体外诊断人个体内精神障碍的存在或人个体对精神障碍的倾向的方法，和用于该方法的至少一种标志物蛋白、核酸分子、或标志物蛋白或核酸分子的组合，其确保了精神障碍的准确可靠的诊断。

[0014] 本发明的该目的通过一种体外诊断人个体中精神障碍的存在或人个体中对该精神障碍的倾向的方法实现，其中该精神障碍与功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关，和其中该方法包括：

[0015] a)在来自个体的身体组织或液体样品中测定各自编码至少一种标志物蛋白的至少两种标志物基因的表达水平，其中所述标志物基因选自下组：人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3：

[0016] b)将测得的表达水平与代表所述标志物基因在健康人群中的表达水平的预定阈值比较；和

[0017] c)基于比较，确定个体是否患有精神障碍或精神障碍倾向，其中如果所述标志物基因测得的表达水平超过、达到预定阈值或降到预定阈值以下，则该测得的表达水平指示精神障碍或倾向。

[0018] 在本发明的方法中，在步骤c)中，合并至少两种标志物基因所测得的表达水平用于确定个体是否患有精神障碍或精神障碍倾向。合并两种或多种标志物显著提高了本发明方法的特异性。在一些情况下，同时可能降低方法的灵敏度。然而，本发明的方法中，特异性比起灵敏度更重要，因为方法是仅针对一个患者亚组，因此预期相对于全包性的临床诊断其灵敏度较低，因此可以被忽略。

[0019] 通过经验测定各标志物基因的参比(标准)表达水平，即健康人群中标志物基因的平均表达水平来预定阈值。将个体(患者)身体组织或液体样品中所测得的各标志物基因表达水平与相应预定阈值比较。如果所述标志物基因测得的表达水平超过、达到预定阈值或降到预定阈值以下(改变的方向由各异常表达水平比相应正常表达水平高或低决定)，表明个体患有精神障碍或至少对其有倾向。意即，相对于正常对照中的相同标志物基因的表达水平(健康人群中的参比或标准表达水平)，身体组织或液体样品中所述标志物基因表达水平的改变指示精神障碍的存在或其倾向。

[0020] 根据本发明，该方法针对目前纯粹临床确定与功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡相关的精神障碍的亚组。意即，本发明的方法用于患有DISC1蛋白/通路或多巴胺体内平衡扰乱导致的精神障碍的患者亚组。例如，DISC1不经调控的表达、降解或蛋白结构改变可能使得个体易于发生精神分裂症、复发性抑郁、双相障碍和其他精神病。所谓的DISC1病似乎是由于神经元中蛋白质稳态失衡导致的，其导致DISC1蛋白聚集，因此DISC1-依赖性脑病可被分类为蛋白构象病。因此，蛋白质聚集可被视为是间歇性慢性精神障碍患者亚组(例如精神分裂症或抑郁患者)的一种生物学表现。间歇性疾病应理解为代表不能鉴定出清楚或明确遗传病因的疾病。

[0021] 扩展的DISC1通路包括许多其他基因，其也与精神疾病或神经变性疾病相关(图1；Hennah&Porteous 2009；Soares等2011；Korth 2009和2012)。表1中列出的标志物基因(及其人等价物)，尤其是NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3，属于DISC1、DISC-1相关蛋白或DISC1通路直接或间接调控的基因网络，因此可能用作诊断与功能失调DISC1蛋白通路有关的精神障碍的生物标志物。

[0022] 多巴胺在精神病发生，精神分裂症的急性症状中也有关键作用。猜测存在一个将包括孕期和产后并发症、压力和创伤、用药和基因等风险因子与提高的突触前纹状体多巴胺能功能相关联的体系。该假设解释了病理学、正电子发射计算机断层扫描、核磁共振成像和其他发现(例如额颞结构和功能异常以及认知受损)的复杂阵列如何能在神经化学上合力通过异常突出感(aberrant salience)导致精神病，并导致精神分裂症的诊断(Howes&Kapur 2009)。此外，在分子机制水平上，DISC1的错误装配似乎也调节多巴胺的体内平衡。DISC1病因此基于生物学被归类为一类人类精神疾病，其与多巴胺系统有关，可在动物，即转基因动物(例如tgDISC1大鼠)中建模。因此，参与多巴胺体内平衡的标志物蛋白也可能用作诊断与功能失调的DISC1蛋白通路有关的精神障碍的生物标志物。

[0023] 诊断精神分裂症的已知测试从疾病的临床诊断开始发掘生物标志物，这注定失败，因为潜在的临床异质性稀释(dilutes)了用于临床确诊精神障碍亚组的任何可能的显著生物标志物，而用蛋白质组学产生的已知阵列测试使用替代的标志物而不是基于生物学病因的标志物，因此导致可信度低。本发明的方法基于生物学界定(例如“DISC1病”)及其生物(动物)模型。因此，其中使用的标志物基因(NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3)属于DISC-1相关蛋白直接或间接调控的基因网络。这种有利的方法提供了高可信度，因为其基于具有确定的生物学病因的病人亚组，因此避免受许多精神障碍临床和生物学异质性的影响。使用选自下组标志物基因的人等价物，本发明的方法因此确保了对与功能失调DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡相关的精神障碍准确可靠的诊断：NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3。本文所用的标志物基因和蛋白还包括加工的蛋白质或剪接变体，即衍生自所示原始基因或蛋白的分子。

[0024] 在本发明的一个有利实施方式中，第一标志物基因是RGS1，且至少一个第二标志物基因选自下组：人NKG7、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2,和C3。这些标志物基因或转录物或其相关标志物蛋白(单独或以各种组合形式)特别有利地诊断与功能失调DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关的精神障碍。优选RGS1与CCL4和/或NKG7组合。尤其是，RGS1与患者的认知内表型相关，且在患者中明显降低。在另一方面，NK细胞标志物CCL4和NKG7本身就具有很高的诊断潜力，但它们在脑中不表达。就共同调节而言，NK细胞基因NKG7和CCL4的降低与RGS1不重叠。因此，RGS1与NK细胞标志物组合有利于对亚组的可靠、可信且特异性的诊断。单一的标志物并不能做到这点，这是因为一者在脑中不表达，而另一者则特异性不够。

[0025] 在本发明另一个有利实施方式中，至少一种额外的标志物基因选自表1所列的基因的人等价物。使用额外的标志物可进一步提高灵敏度和/或本发明方法的灵敏度。表1中所示标志物基因和蛋白质还包括加工蛋白或剪接变体，即衍生自所示原始基因或蛋白的分子。

[0026] 在本发明的另一个有利实施方式中，如果每个测得的表达水平都低于相对的参比表达水平和/或达到或降到预定阈值以下，测得的表达水平指示精神障碍或倾向。意即，相对于正常对照中的相应表达水平(健康人群中的参比或标准表达水平)，身体组织或液体样品中标志物基因较低的表达水平指示精神障碍的存在或其倾向。出乎意料的是，选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3的标志物基因都下调，即其转录物水平相对于健康人群中的参比(标准)水平下降。相反，现有技术假设标志物水平上升，特别是促炎性细胞因子的标志物。本发明标志物基因表达水平的下降因此看来代表了具有降低的炎性标志物病例的亚组。出乎意料的是，这与先前的发现并不相违，因为这些标志物在一亚组中的下降由于相同标志物在其他亚组中的升高而被稀释或被过度代偿，从而使得使用全包式临床诊断时这些标志物似乎有所增加。

[0027] 在本发明的另一个有利实施方式中，身体组织或液体选自全血、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、生物活检材料、和/或分离的细胞及其离体衍生物。例如，体液也可以如下建模：从患者或人类个体采集细胞，并将其重编程成各种细胞类型(诱导的多能干细胞(iPS)及其分化物)。

[0028] 在本发明的另一个有利实施方式中，可通过定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)、定量实时PCR或其他适合测定转录物(mRNA或cDNA)量的方法测定体液内标志物基因的表达水平(转录物水平)。另外，可用任何高亲和力结合试验，例如基于免疫/抗体的试验例如酶联免疫吸附分析(ELISA)测定标志物蛋白的表达水平(蛋白水平)。高亲和力结合试验不限于抗体，还可包括肽、小核酸(称作适体)、甚至小有机分子等。还可组合两种技术，其称作免疫PCR。

[0029] 例如，可用天然存在的或化学合成的化合物测定表达水平，该化合物能特异性结合相应标志物蛋白或标志物基因的转录物(mRNA)。这样的化合物可选自肽、抗体或其片段、适体(肽或寡核苷酸)和寡核苷酸。可用可检测标记例如发光、荧光或放射性基团标记化合物。另外或额外，可用亲和标签，例如生物素、亲和素、链霉亲和素或His(例如六聚His)标签标记化合物。对于高通量应用，可使用包含化合物的阵列，例如生物芯片形式的微阵列。

[0030] 最值得注意的尤其是，如果要建立高通量试验，用微阵列分析(生物芯片技术)测定标志物蛋白的表达水平。

[0031] 该目的还通过以下实现：衍生自标志物基因的至少两种标志物蛋白，或包含编码标志物蛋白的标志物基因的至少两种核酸分子的组合，所述标志物基因选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C31，其用于体外诊断。

[0032] 优选第一标志物基因是RGS1，和至少一种第二标志物基因选自人NKG7、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3。

[0033] 由于NK细胞标志物CCL4和NKG7本身已经具有高诊断性能(然而它们不在大脑中表达)且其基因与RGS1在共调控中并不重叠，RGS1与NK细胞标志物的联合有利于对亚组的可靠、可信且特异性的诊断。因此，如果第一标志物基因是RGS1，第二标志物基因是NKG7和/或CCL4，是特别有利的。

[0034] 本发明的标志物组合还可包含至少一种表1所列的基因的人类等价物的额外标志物基因。表1中所示标志物基因和蛋白还包括加工蛋白或剪接变体，即衍生自所示原始基因或蛋白的分子。

[0035] 本发明的组合可有利地用于诊断人个体中精神障碍的存在或人个体对精神障碍倾向的体外方法，其中精神障碍与功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关。

[0036] 本发明还涉及一种体外诊断人个体中精神障碍的存在或人个体中对该精神障碍的倾向的试剂盒，其中该精神障碍与功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关，该试剂盒包括：

[0037] a)一组寡核苷酸引物，其适于引发编码至少两种标志物基因的转录物在聚合酶链式反应和/或微阵列中的扩增，其中所述标志物基因各自编码至少一种标志物蛋白，所述标志物基因选自人NKG7、RGS1，CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3，和/或[0038] 至少两种第一抗体或分子，其各自与个体的身体组织或液体中的标志物蛋白特异性结合，其中所述标志物蛋白衍生自选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3的标志物基因；

[0039] b)至少两种报道探针，其能与衍生自转录物的互补DNA(cDNA)结合，其适合在定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)中被检测，和/或

[0040] 至少两种标记的第二抗体，其各自与第一抗体或分子之一特异性结合，其设计在高亲和力结合试验(基于免疫/抗体的试验，例如酶联免疫吸附试验(ELISA))中被检测；和可任选的

[0041] c)至少两个参比样品。

[0042] 例如，本发明的试剂盒可包含天然存在的或化学合成的分子，其能特异性结合或杂交标志物蛋白或标志物基因的转录物(mRNA)。这样的分子可选自肽、抗体或其片段、适体(肽或寡核苷酸)和寡核苷酸(引物)。可用可检测标记例如发光、荧光或放射性基团标记一些分子。

[0043] 在本发明一个有利实施方式中，所述试剂盒包含选自以下的至少一组寡核苷酸引物：

[0044] a)一组包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0045] b)一组包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0046] c)一组包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0047] d)一组包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0048] e)一组包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0049] f)一组包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0050] g)一组包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0051] h)一组包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0052] i)一组包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0053] j)一组包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0054] k)一组包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0055] l)一组包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0056] m)一组包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0057] n)一组包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0058] o)一组包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列的寡核苷酸引物；

[0059] p)核酸分子，其多核苷酸序列与a)到o)中任一的寡核苷酸引物的核苷酸序列至少90％，优选95％相同，且其能与衍生自编码选自表1所列蛋白质的至少一种标志物蛋白的基因的转录物的互补DNA(cDNA)结合；

[0060] q)核酸分子，其互补链与a)到p)中任一的核酸分子在严格条件下杂交；

[0061] r)核酸分子，其核苷酸序列与a)到q)中任一的核酸分子的核苷酸序列互补。

[0062] 引物序列如表2所示(SEQ ID NO指用于扩增人标志物基因的引物)。

[0063] 本发明还涉及一种确定对至少一种药物化合物的反应的方法，该药物化合物能纠正功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡，其中测定至少两种标志物基因的表达水平并根据权利要求1所述方法的步骤a)和b)进行比较，其中如果所述标志物基因的各异常表达水平正常化或至少改善，则测定的表达水平表示对药物化合物的反应是积极的(positive)。因此，提供了一种监测药物化合物在患有精神障碍的个体内的疗效的方法，包括在施用药物化合物后，将存在于所述个体身体组织或液体样品中的标志物基因目前的表达水平与从同一个体先前(例如在开始治疗前和/或来自相同个体更早治疗阶段)获得的至少一个样品比较。如果施用药物化合物对标志物基因的表达水平的改变方式是至少部分向健康人群的相应平均表达水平(即参比(标准)表达水平)正常化，则对该药物化合物的治疗反应是积极的。意即，如果目前表达水平和阈值之间的差异相对于先前表达水平和阈值之间的差异有所减少，则治疗是有效的。本发明的这种方法能够分析现有药物化合物或未用转基因动物开发的那些的效力，如下所述。

[0064] 如上所述的间歇性精神障碍亚组的蛋白质病理学可用转基因动物(例如通过适度过表达非突变全长人DISC1转基因：tgDISC1大鼠)建模，代表精神疾病药物开发中的新药物学靶标。“反向翻译”的概念意指从开始时精神障碍亚组的存在，因此用生物学上确定的亚组开始标志物探寻，而不是始于仅由临床诊断决定的混合的异源病例。可在动物中对患者/家族的遗传或蛋白质病理学建模，然后可在该动物模型中鉴定标志物。可对间歇性病人“反向翻译”标志物，以在生前(即在活的患者中)确定其生物学亚组。然后可对动物模型、标志物和病人亚组进行匹配，以开发定制的疗法。

[0065] 对此，提供用于提供器官、组织或细胞的非人转基因动物，其用于鉴定和分析诊断人个体精神障碍的标志物蛋白或基因，其能够稳定表达编码人DISC1蛋白的修饰基因，其中修饰基因的表达水平比参比野生型基因的表达水平更高，因此导致DISC1蛋白在细胞中形成聚集物，所述动物代表具有至少一种精神障碍的人个体亚组。转基因动物可以是啮齿类，优选大鼠。

[0066] 本发明还包括一种鉴定和分析用于诊断人个体内精神障碍的标志物蛋白或基因的方法，其采用了所述转基因动物。

[0067] 适度过表达全长DISC1转基因的转基因大鼠模型(称作“tgDISC1大鼠”)显示与间歇性精神障碍亚组中错装配的DISC1的重要功能一致的表型。tgDISC1大鼠主要显示神经元中核周DISC1聚集物。此外，tgDISC1大鼠显示行为表型上强大的特征，包括安非他命超敏性、超探索性(hyperexploratory)行为、转棒缺陷以及异常多巴胺神经解剖学和神经化学，这些都指向多巴胺(DA)神经传导的改变。提高的细胞溶质多巴胺导致DISC1多聚，不可溶解性和与多巴胺转运蛋白复合的提高，提示将DISC1装配和多巴胺体内平衡联系起来的生理机制。DISC1蛋白病理学及其与多巴胺体内平衡的相互作用是一种新的细胞机制，其与行为控制相关，并可能在精神障碍中起作用(Trossbach 2016)。神经解剖学分析揭示了转基因大鼠中多巴胺能神经元在黑质中密度减少，以及在纹状体中多巴胺能纤维的减少。在躯体感觉皮层中出现的小清蛋白阳性中间神经元从层II/III迁移到V/VI，钙结合蛋白阳性中间神经元的数量也稍有减少。胼胝体厚度减少也确认了体内MRI的趋势水平观察和体素上基于紧张肌的形态学观察。这些神经解剖学上的改变帮助解释了该动物模型的功能表型，其中一些代表了人精神分裂症中死后脑组织中观察到的改变。DISC1过表达或错误装配可导致各种看似不相关的形态学表型，因此为在间歇性精神分裂症患者中观察到的发现提供了可能解释(Hamburg等2016)。

[0068] 因此，tgDISC1大鼠反映了患有CMI的间歇性病例亚组的神经病理学特征，而且具有与人类精神分裂症患者非常相似的行为(安非他命敏化)和生物化学(D2R高转换)特征，因此显示了非常高的表面效度。在分子机制水平，DISC1的错误装配似乎调节多巴胺体内平衡，因此tgDISC1大鼠是间歇性CMI亚组的有用模型，推动生物学诊断和治疗。另外，DISC1病基于生物学被归类为一类人类精神障碍，其与多巴胺系统有关，可在动物，即tgDISC1大鼠中建模。tgDISC1大鼠代表了患有称作“DISC1病”的精神分裂症(或其他精神疾病)的患者亚组。

[0069] 据信，类似DISC1转基因适度过表达且分化成各种细胞或脑类器官的人诱导多能干细胞(iPS)(包括人PBMC亚群)也能用于鉴定可能的标志物和病人定制治疗，但是其缺点是这些细胞系统不能用于行为测试范例。然而，对于特定用途，本发明提供了至少一种人诱导多能干细胞(iPS)，其能稳定表达编码人DISC1蛋白的修饰基因，其中该修饰基因的表达水平比相应的野生型基因高，因此导致DISC1蛋白在细胞内形成聚集物。这些iPS细胞也可用于鉴定和分析标志物蛋白或基因，用于诊断人类个体中的精神障碍。本发明还包括一种用所述iPS细胞鉴定和分析用于诊断人个体中精神障碍的标志物蛋白或基因的方法。

[0070] 利用反向翻译，可鉴定不同的标志物组，其可能不完整但足以实现DISC1病的良好特异性血液诊断。可用血液测试鉴定可能(在未来)从在tgDISC1大鼠中也有效的治疗性药物疗法中受益的患者。然而，他们可能也可通过指示哪些病人亚组可能响应多巴胺体内平衡改变药物，从现有的仅基于症状的靶向神经递质系统的药物治疗受益。例如，已经对DISC1病测试阳性的患者可以优选接受一种特定的多巴胺体内平衡恢复药物，而不是如现在临床实践中那样基于临床猜测测试多种药物。

[0071] 治疗性药物的定义是靶向精神障碍生物学病因，例如DISC1蛋白病理学的药物，而症状性药物是靶向生物学病因的一种下游结果，例如异常多巴胺体内平衡的药物。治疗性药物是更有利的，因为它们最终消除所有而不是仅一种下游异常。

[0072] 本发明还涉及一种确定对与功能失调DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡有关的精神障碍或人类个体对该精神障碍的倾向的可能治疗性药物化合物疗效的方法，其中对转基因动物施用所述药物化合物(使用该转基因动物作为精神障碍治疗成功与否的指征)，其中如果选自人NKG7、RGS1、CCL4、IFNG、IL12RB2、IL13RA1、KMO、FPR2、SLC27A2和C3的至少两种标志物基因的异常表达水平在所述转基因动物中施用所述药物化合物后正常化，则其指示疗效是积极的。本发明届时还允许测试患者的所述标志物并对该患者指定治疗性药物疗法。

[0073] 在本发明的一个有利实施方式中，转基因动物是用于提供器官、组织或细胞的非人转基因动物，其能稳定表达编码人DISC1蛋白的修饰基因，其中修饰基因的表达水平高于相应野生型基因的表达水平，因此导致细胞内DISC1蛋白的聚集物形成，所述动物代表具有至少一种精神障碍的人个体的亚组。如上面详细解释的，这样的动物代表了患有称作“DISC1病”的精神分裂症(或其他精神疾病)的病人亚组。

[0074] 在临床上不认为患病的人类个体中也可能会出现异常DISC1通路。这可能由于各种原因，也称作抗性因素(resilience factor)。然而这些个体可能在密切观察时显示细微的认知损害，这可以通过合适的药物改善，其可称作认知增强，而不是药物治疗。意即，对临床患者的可能治疗也可能用作健康个体的认知增强剂。

[0075] 本文所用的术语“标志物基因”指编码独特蛋白质或肽(在此称作“标志物蛋白”)的独特基因，其适用于在体内、组织内或细胞内作为生物、生物化学或生理过程、事件或状况的指征。例如，可通过检测标志物基因的转录物或蛋白质用其检测疾病的至少一种生物、生物化学或生理学症状。此时，“独特”指标志物基因或标志物蛋白能够通过生理、物理化学或电物理检测方法直接或间接地通过至少一种可检测(标记的)化合物或组合物检测。可通过检测标志物蛋白或通过检测标志物基因的转录物(mRNA或间接：cDNA)检测标志物基因。如果本文提到特定的标志物蛋白，则应包括所有其衍生物，包括加工蛋白或剪接变体，即衍生自所指原始基因或蛋白质的分子。

[0076] 本文所用的术语“标志物”包括标志物基因和标志物蛋白。

[0077] 本文所用的术语“表达水平”(或“标志物基因的表达水平”)指身体、组织、细胞或液体样品内编码特定肽或蛋白质的转录物(mRNA)的量(转录物水平)，或衍生自该基因的特定肽或蛋白质的量(蛋白水平)。可通过例如定量测定样品内mRNA(或cDNA)或翻译所得蛋白质的量来测定表达水平。

[0078] 本文所用的术语“异常表达水平”指标志物基因的异常表达水平，其与健康群体中相同标志物基因的平均表达水平显著不同，且在临床方面涉及一种疾病和/或代表疾病症状，例如精神障碍。

[0079] 本发明参考附图进一步示范性描述。

附图说明

[0080] 图1显示了DISC1通路的两种互换的、互补和选择性(不完整的)描述，显示DISC1蛋白与已独立描述为针对精神疾病或其他慢性脑病的许多蛋白质和信号转导通路的相互作用。

[0081] 图2显示柱状图，其代表tgDISC1大鼠(TG，灰色)相对非转基因同窝鼠(LM，白色)中用定量聚合酶链式反应(qPCR)对表1中标志物选择的独立验证。标志物名称为缩写，全称见表1。

[0082] 图3显示了柱状图，代表在精神分裂症患者群中相对于对照(n＝每组20)中表1标志物选择的筛选；精神分裂症患者集合(SCZ，灰色)相对于健康对照(CTRL，白色)。标志物名称为缩写，全称见表1。

[0083] 图4显示了tgDISC1大鼠和精神分裂症患者中不同标志物的关联图示。A.大鼠(左)和人类(右)中标志物的相关性矩阵。B.转基因tgDISC1大鼠(TG)相对于非转基因同窝鼠(LM)与精神分裂患者(SCZ)相对于健康对照(CTRL)的单相关性的选择性描述看来是相似的。

[0084] 图5a和5b显示了人类标志物(见表1)的Spearman相关性(非参数)表格，显示单相关存在于患者和对照之间，或仅存在于患者或对照中，显示标志物调节网络中的破坏或病理学的建立和稳定(所有分析的数据都没有离群值)。

[0085] 图6是柱状图，显示当调查表1中的单个标志物选择时，与精神分裂症的临床诊断有关的检测特异性和灵敏度(SCZ，深灰；健康对照(HC)，浅灰)。阈值定义为低于健康对照组平均值的50％。

[0086] 图7是柱状图，显示当调查表1中的两个或三个标志物组合选择时，与精神分裂症的临床诊断有关的检测特异性和灵敏度(SCZ，深灰，健康对照(HC)，浅灰)。阈值定义为低于健康对照组平均值的50％。

[0087] 图8显示了代表对照(CTRL)、精神分裂症(SCZ)和双相神经障碍(BP)样品中RGS1转录物的标准化表达水平(大脑)图表。

[0088] 发明的示例性和优选实施方式描述

[0089] 对象和分类

[0090] 对照对象和诊断患有精神分裂症的患者是Warbrick等(2011)和Trossbach等(2014)所述的临床研究的一部分。

[0091] 动物

[0092] 遵循德国动物保护法进行动物实验，并已得到当地政府(LANUV NRW,Recklinghausen,德国)的授权。用过表达全长非突变DISC1且携带多态性L607F
(rs6675281)和S704C(rs821616)的转基因Sprague Dawley大鼠(tgDISC1大鼠，Trossbach等，2016)和非转基因同窝鼠进行实验。雄性tgDISC1和对照大鼠饲养在在德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学的动物中心。每笼三只动物装笼，使用标准实验室条件，光照从7点到
19点，随意饮水和饮食。在8-9月龄时，对成年tgDISC1大鼠和同窝对照进行抽血，制备淋巴细胞。

[0093] 从血液制备淋巴细胞

[0094] 心脏穿刺被麻醉大鼠，收集至少8ml血液。用Ficoll-Paque Premium1.084溶液(GE Healthcare,Little Chalfont,英国)根据厂商说明书制备大鼠淋巴细胞。根据Trossbach等(2014)所述用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)制备人淋巴细胞。淋巴细胞样品在液氮中急冻，储藏在-80℃待进一步处理。

[0095] RNA和cDNA的制备

[0096] 用RNeasy小制备试剂盒根据厂商说明书制备大鼠RNA和人淋巴细胞。用无RNA酶的DNA酶I套盒(均为Qiagen,Hilden,德国)在柱上消化剩余的基因组DNA。RNA稀释到100ng/μl浓度，输入1μg在20μL总体积内使用RevertAid第一链合成试剂盒产生cDNA，使用试剂盒提供的随机六聚体引物(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。得到的cDNA以1:50、1:25或1:50稀释，根据表1所示的PCR结果，1和5μl用作输入模板。

[0097] 基因表达概述

[0098] 用Agilent 2100生物分析仪质量控制检查总RNA制备物的RNA完整性。该研究中的全部样品显示高质量的RNA完整性数(RIN>9)。用光度纳米液滴测量进一步分析RNA，并用荧光Qubit RNA实验(Life Technologies)定量。根据厂商说明书，在重复10次的每个试验组中(分别为DISC1转基因(TG)大鼠和同窝(LM)对照)上进行生物素标记cDNA的合成(WT Plus试剂盒；Affymetrix公司)。简单说，将100ng总RNA转换成cDNA。体外转录扩增和第2轮合成后，使cDNA片段化并用末端转录酶进行生物素标记。最后，使末端标记的cDNA与Affymetrix大鼠基因2.0ST基因表达微阵列在45℃杂交16小时，用链霉亲和素/藻红蛋白缀合物染色，根据厂商说明扫描。

[0099] 三个样品(2×TG,1×LM)没有通过杂交质量控制，2个其他样品(3×TG，2×LM)由于异常的脑室体积不能用于进一步分析。

[0100] 12个Affymetrix CEL文件上的数据分析用GeneSpring GX 软件(第12.5版，Agilent Technologies)进行。每个探针组内的探针由GeneSprings’Exon RMA16 算法总结(summarized)前，在根据所有样品的探针水平信号强度分位数标准化，以减少阵列间变动(Bolstad等，2003)。通过基线换算成所有样品中值，总结输入数据的预处理。为了进一步改善信噪比，给定探针组必须在所有的重复内在成对比较随后分析的两个条件之一或两者高于背景(即给定阵列的原始信号分布的20-100％范围内检测到的探针组的荧光信号)表达。用改良T测试统计确定差异基因表达。限制性阈值定为p＝0.01。

[0101] 定量表达分析

[0102] 为了验证差异表达，用HotStarTaq(Qiagen,Hilden,德国)PCR测试目标引物。表2描述了引物序列、稀释度和PCR补充成分。有效引物用于在MicroAmp快速光学96孔反应板(应用生物系统，Carlsbad，CA，USA)中使用StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)和铂SYBR绿qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行定量实时PCR(qPCR)。根据靶标，在混合物中加入5％Factor Q溶液(Qiagen,Hilden,德国)。QPCR条件：95℃10分钟，40轮循环的95℃15秒和60℃1分钟。用对应的StepOne软件v2.3(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)处理得到的数据。各靶标的表达对于管家基因肌动蛋白(大鼠)或ARF1(人)的表达水平标准化，并针对每板的大鼠或人对照cDNA标准化，以使批次之间的变动最小。

[0103] 如图2所示，来自表1的标志物基因Ifng、Ccl4、Il13ra1、Il12rb2、C3和Slc27a2中每一个的表达水平(相对mRNA表达)在tgDISAC1大鼠(TG，灰色)中相对于非转基因同窝大鼠(LM，白色)有显著下降。该结果显示，在微阵列分析(表1)中观察到的这些标志物基因下降的表达可通过独立的检测方法(定量聚合酶链式反应；qPCR)重复。标志物基因Ifng、Ccl4、Il13ra1、Il12rb2、C3和Slc27a2都被下调，即相对于“健康”同窝动物的参比(标准)水平，转录水平下降。即，相对于非转基因对照中相应标志物基因的表达水平，转基因大鼠中每个测试标志物基因较低的表达水平指示了功能失调的DISC1蛋白通路或扰乱的多巴胺体内平衡。因此改变的表达水平可指示神经病理学和生物化学特征，其与人类精神分裂患者非常相似。

[0104] 图3显示了表1的标志物基因IFNG、CCL4、IL13RA1、IL12RB2、RGS1、C3和SLC27A2在精神分裂患者群体(SCZ，灰色)相对于健康对照(CTRL，白色)的筛选，证明了tgDISC1模型中相同标志物降低的表达水平(相对mRNA表达)也可在患精神分裂的患者集合中观察到。标志物基因IFNG、CCL4、IL13RA1、IL12RB2、C3和SLC27A2都被下调，即相对于健康对照的参比(标准)水平，转录水平下降。因此，可认为改变的表达水平能指示人类个体中的精神分裂症。

[0105] 图4显示了tgDISC1大鼠和人类个体中不同标记的关联，证明了大鼠系统与人系统之间的相似性。相对于相应参比表达水平的测试标志物的表达水平改变在tgDISC1大鼠和精神分裂患者中类似。因此，将大鼠系统中观察到的原理和机制转用到人系统也是合理的。

[0106] 图5a和5b显示了人标志物的关联表，显示存在于患者和对照，或仅存在于患者或对照中的单相关性。单个标志物之间的交叉关联性显示疾病可破坏现存的关联网络或稳定新的(病理性)网络，并证明表1所鉴定的标志物是功能上相互联系的。

[0107] 图6和7显示当调查表1中的一种标志物(RGS1、CCL4和NKG7；图6)选择或表1中两种或三种标志物的组合选择(RGS1+CCL4和/或NKG7，以及CCL4+NKG7；图7)时，与精神分裂症临床诊断有关的检测特异性和灵敏度。基本上证明了本发明方法的特异性很高，而灵敏度相当低。然而在本发明的方法中特异性比起灵敏度更重要，因为该方法是仅针对一个患者亚组，因此预期相对于全包性的临床诊断的低灵敏度，因此该低灵敏度可以被忽略。图7显示了与标记物基因RGS1相比，两种或多种标志物的组合能显著提高本发明方法的特异性(单独：88％＝>+CCL4和/或NKG7:94％/97％)。

[0108] 图8令人惊讶地显示，大脑中的RGS1表达在病人(精神分裂和双相神经障碍)中与健康对照相比有明显下降。RGS1与病人的认知内表型相关，似乎是诊断相关疾病的最佳标志物。RGS1与数字符号测试(DSST)中的注意力及记忆力显著相关，表明该标志物与可测量认知障碍的高度临床相关性(数据未显示)。RGS1表达下降不是由于表达它的巨噬细胞数量减少，后者可能对应于还衍生出小胶质细胞(大脑中唯一表达RGS1的细胞类型)的细胞品系(数据未显示)。RGS1优选与NK细胞标志物联合，因此看来有利于可靠、可信且特异性的诊断病人亚组。

[0109] 因此，RGS1似乎与其他表1所列的标志物相比，能成形为最重要的标志物。然而，RGS1表达水平在疾病例如黑色素瘤、多发性硬化等中也会改变，因此至少一种第二标志物可以是有益的。例如，NK细胞标志物NKG7或CCL4可能特别重要(但可互换)。在大鼠中，NKG7和CCL4指示表达水平的下降，在人中并不清楚它们的下降是由于NK细胞数量的减少还是由于每个NK细胞表达的减少或这两者。总的说，诊断可优先是RGS1和一种或两种NK细胞标志物例如NKG7和CCL4，见图7。在病人中，NK细胞标志物似乎由于NK细胞数量减少而减少，但也不能排除表达水平的同时降低(数据未显示)。

[0110] 非专利文献:

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[0124] 表1 TG vs LM[0125]

[0126]

[0127]

[0128]

[0129]

[0130] 表2

[0131]

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