1.糖尿病孕妇维生素D代谢与糖代谢相关性及胎盘检测方法，其特征在于：它的检测方法为：
1) 研究对象的选择：
随机选取妇产科住院的正常妊娠妇女、GDM患者各100例；所有患者均接受基本情况调查和常规实验室检查，平衡所有入选者的个体状况如年龄、收入情况、民族、文化程度、家族性糖尿病史、个人史及孕产史；选择进入研究的研究对象，在进入研究前签署知情同意书；
a、接受受试对象的条件：妊娠达37孕龄的妇女，年龄22-40岁，汉族，经济状况相当，无吸烟及饮酒史；
b)、除外受试对象的条件：孕前有糖尿病史、多囊卵巢综合症、肝病、孕前及孕期有高血压病、类风湿病、甲状腺及内分泌类相关疾病，孕前及孕期使用皮质激素类药物的孕妇，多胎或死胎的孕妇；
c)、受试对象分组：所有孕妇于孕24至28周行75 g OGTT，空腹、餐后1 h和餐后2 h血糖分别以5.1、10.0和8.5 mmol/L为诊断界值；具体做法：孕妇试验前3天未服用利尿剂、激素影响糖代谢的药物；实验前一晚9点后不再进食，于第二天7点抽肘静脉血一次，测空腹血糖后，将75 g葡萄糖粉溶于250 ml水中，5 min内口服完；从服糖水第一口开始计时，分别于l h、2 h抽取肘静脉血测血糖；任何一项血糖水平异常者，即诊断为GDM；按此标准，GDM组和正常孕妇组均为100例；所有孕妇均未出现胃肠道不良反应，受试过程中未服用饮料、茶及咖啡，未做剧烈运动；
2) 研究资料的收集：
随访期间，进行孕产期母婴健康调查问卷收集信息，信息包括孕妇的实足年龄、孕妇身高、孕前体重、职业、文化程度、既往妊娠史及疾病史、末次月经时间、本次妊娠意愿、孕早期心理健康状况、孕妇家庭经济收入情况、孕期营养及生活方式、孕前半年至今环境有害物质的接触情况；根据孕妇身高、孕前体重、孕期各个阶段的体重，计算各个阶段的BMI；并在孕中期和孕晚期两个时间段平卧位测量上肢血压；新生儿出生相关信息由专业医生填写并记录，主要信息有出生日期、性别、分娩孕周、分娩方式、新生儿并发症、出生体重、身长、头围、
1’-Apgar评分、5’-Apgar评分、胎盘重量、羊水及出血量；
3)样本的收集：
a)孕妇血液标本的采集与处理：在整个研究中，每位孕妇需在孕中期和孕晚期两个时间段共采血2次；各受试者于实验前一晚9点后不再进食，于第二天7点抽肘静脉血一次；一部分血液使用不加抗凝剂的10ml真空玻璃试管，新采集的血样于室温放置30 min，然后于4 ℃、3000转/min共离心15 min；取血清置于血清管中，保存于-80 ℃直到分析；另一部分全血样品加于含EDTA作为抗凝剂的真空采血管中，2-8 ℃下可保存7天；
b) 脐血和胎盘标本的采集与处理：胎儿分娩后，采集脐血和胎盘组织；脐血的处理同a）孕妇血液标本的采集与处理；胎盘娩出后，由专业医生采集，立即在胎盘的中央取长2 cm、宽2 cm、包括胎盘母体面和胎儿面标本2块；1块标本固定于4 %多聚甲醛溶液中，用于HE和免疫组化染色；另外1块标本浸入2.5 %戊二醛中过夜固定，用于后续的电镜观察；余下胎盘中选择相同部位的组织块储存于-80 ℃冰箱；
4) 血液糖代谢相关指标的测定：
a)、快速血糖仪测定血糖水平；
b)、亲和层析法测定EDTA抗凝血浆中HbA1c水平；
c)、全自动生化分析仪测定TG、CHO、LDL和HDL水平；放射免疫法测定胰岛素和C肽水平；
d)、并用稳态模式评估法计算IR指数（HOMA-IR）和胰岛β细胞功能，即HOMA-IR =[血糖水平（mmol/l）×胰岛素水平（μIU/ml）]/22.5；HOMA-B =[20×胰岛素水平（μIU/ml）]/[血糖水平（mmol/l）-3.5]；
5)、血液VD代谢相关指标的测定：
ELISA法检测25(OH)D、1,25(OH)2D、DBP、PTH、钙水平；实验前从冰箱取出ELISA试剂盒以平衡至室温；设立标准孔以建立标准曲线；待测样品孔中每孔各加入已稀释的待测样品，将反应板置于37 ℃恒温箱120 min；然后用洗涤液将反应板充分洗涤并印干；每孔再加入第一抗体工作液，将反应板置于37 ℃恒温箱60 min；反应板取出后充分洗涤并印干；每孔加酶标抗体工作液，将反应板置于37 ℃恒温箱60 min；反应板取出后充分洗涤并印干；每孔加入底物液避光置37 ℃暗处反应5-10 min；每孔迅速加入终止液并混匀；使用酶标仪，在
450 nm处尽快测OD值；根据所测样品OD值在标准曲线上査出血清相关指标的浓度；
6)、胎盘形态学观察：
胎盘样本制作成石蜡切片进行光学显微镜观察细胞形态；并制作超薄切片进行电子显微镜观察其超微结构；
a)光学显微镜观察：组织经4%多聚甲醛溶液固定后，逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋，并制成7 μm厚度的切片；石蜡切片经常规HE染色后，在光学显微镜下以×
100到×400的放大倍数进行形态学观察；
b)电子显微镜观察：组织经2.5%戊二醛溶液固定后，在0.1 mol/l PBS中充分洗涤；小样组织块用1 %锇酸固定液固定，逐级乙醇脱水，纯丙酮置换，Epon 812包埋；选择合适的区域用于超微结构的观察；超薄切片机切片制作显微切片，包埋于铜载网上；切片经4 %醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，在电子显微镜下以×4000到×12000的放大倍数进行细胞超微结构的观察；
7)、脂肪细胞因子检测：
ELISA法检测血清和胎盘瘦素、脂连素和抵抗素水平，具体操作同4）血液VD代谢相关指标的测定；
8)、胎盘胰岛素信号通路相关指标检测：
免疫组化和western blot法测定胎盘PI3k-Akt通路中相关分子PI3k、p-PI3k、Akt、p-Akt的蛋白表达水平；
a)免疫组化法：石蜡切片常规脱蜡，经枸橼酸钠缓冲液高压进行抗原修复；自然冷却后经3 % H2O2阻断内源性过氧化物酶；山羊血清封闭后，滴加一抗于4 ℃过夜孵育；而后滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，37 ℃孵育；DAB显色，镜下观察染色，自来水冲洗；苏木素染色液进行复染；盐酸酒精分化液分化；自来水冲洗后，更换双蒸水清洗，使其返蓝；逐级常规乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封固；将切片置于显微镜下以×100到×400的放大倍数观察阳性染色表达部位及数量，并拍照；结果判定：
有棕黄色颗粒，且染色强度高于背景非特异性染色者为抗原阳性细胞；胞浆内棕黄色颗粒多呈弥散状分布，少数成团块状或颗粒状；采用Image-Pro Plus 6.0 软件计算积分光密度值为免疫组化结果进行半定量分析；
b)Western blot法：从-80 ℃低温冰箱中取出胎盘组织，称重后，加入冰预冷的组织裂解液（50 mmol/l Tris-HCl，150 mmol/l NaCl，0.1 % Triton X-100，2 mmol/l Na2EDTA，
0.5 mmol/l EGTA，1 mmol/l Na4P2O7，1 mmol/l Na3VO4，50 mmol/l NaF，10 μg/ml苯甲基磺酰氟化物和哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物），置于冰上用匀浆器匀浆裂解；于4 ℃、12000 ×g离心15 min，收集上清；用BCA法定量蛋白浓度；等量样品中加入十二烷基硫酸钠样品缓冲液，煮沸变性；蛋白后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，被转到PVDF膜上；
PVDF膜经含有吐温的Tris缓冲液（Tris-buffered saline plus Tween, TBST）（10 mmol/l Tris，pH 7.5，100 mmol/l NaCl和0.1 % Tween 20）漂洗后，用含5 %脱脂奶粉的TBST液室温封闭2 h；加入一抗抗体4 ℃过夜杂交；洗膜后再以IgG辣根过氧化物酶标记的二抗孵育；
膜经清洗后，用ECL化学发光试剂盒进行自显影；以GAPDH为内对照，用Quantity One软件对条带进行分析；
9)、胎盘VD代谢通路相关指标检测：
Real-time PCR法、免疫组化法和Western blot法分别检测胎盘VDR、CYP24a1、CYP27b1 mRNA和蛋白表达水平；亚硫酸氢盐测序法检测胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平；
a) Real-time PCR法：TRIzol法进行总RNA提取，通过测定260 nm波长下样品的吸光度值确定样品中总RNA含量，同时测定280 nm波长下样品的吸光度值，用OD260/OD280比值反映RNA的纯度，并用琼酯糖凝胶电泳技术检测RNA的完整性；再用0.1 ‰ DEPC水将所有总RNA样品稀释定量至0.5µg/µl分装总RNA样品-80 ℃冰箱保存；根据试剂盒说明配制DNA消化反应体系和逆转录反应体系，将RNA逆转录成cDNA，并保存于-20 ℃冰箱；而后进行PCR；20µl的PCR反应体系中含1µl cDNA、10 µl PCR反应Mix、0.5 µM正向引物 1 µl、0.5 µM逆向引物
1µl和7µl的无酶水；PCR扩增反应在95 ℃预变性5 min启动热启动酶，按95 ℃变性15 sec，
60 ℃退火15 sec，72 ℃延伸30 sec三步法循环扩增50次，末次循环后进行溶解曲线分析以检测PCR扩增产物质量；以GAPDH为内对照，用Quantity One软件对条带进行分析；
b) 免疫组化法同7）胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；
c) Western blot法同7）胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；
d) 亚硫酸氢盐测序法检测胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平：采用Promega公司的Wizard○R Genomic DNA Purification Kit提取基因组DNA，具体操作过程按照试剂盒说明进行；取1.5µl基因组DNA，用NanoDrop 100检测DNA浓度及纯度；琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段的完整性；采用Chemicon公司的CpGenomeTM DNA Modification Kit将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰；亚硫酸氢盐修饰基因组DNA的原理为：基因组DNA在亚硫酸氢盐的作用下，所有未被甲基化的胞嘧啶均脱氨磺化转变为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变；根据这一特征性变化，可针对甲基化和未甲基化的等位基因设计特异性引物对目的序列进行扩增，根据扩增产物的有无即可确定有无CpG岛甲基化；二次巢式MSP扩增：
第一次反应扩增一段CYP24a1启动子区富含CG的序列，第二次巢式MSP反应时，将第一次扩增后的产物稀释20倍作为模板，并使用甲基化和非甲基化特异性引物；反应体系中同时设有阴性、阳性和空白对照：正常人外周血淋巴细胞DNA作为阴性对照，经SssI甲基转移酶处理过的正常人外周血淋巴细胞DNA作为阳性对照，ddH2O作为空白对照；取5µl PCR终产物进行琼脂糖凝胶电泳；结果认定需符合琼脂糖凝胶上可观测到与预期片断大小一致的PCR产物，而且条带单一；可观察到与预期片断大小一致的u_CYP24a1或/和m_CYP24a1条带；有相应的阳性对照、阴性对照和空白对照；符合这些条件的样本可根据观测到的条带分为CYP24a1启动子甲基化和CYP24a1启动子未甲基化两类；修饰的DNA进行荧光定量PCR，PCR扩增反应按95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 sec，60 ℃退火延伸1 min三步法循环扩增40次；用SDS 1.2分析软件，计算出扩增曲线与阈值交叉的横坐标值，即是Ct值；为了计算目的基因的拷贝数，我们将已知浓度的经亚硫酸氢盐修饰过的质粒DNA做梯度稀释以绘制的标准曲线，根据标准曲线的Ct值确定样本中的待测基因的拷贝数；经内参和目的基因最低拷贝数检测确定DNA的浓度和纯度符合检测标准；为弥补由于样本体积、样本处理、DNA抽提导致的拷贝数的差异，将每个样本的m_CYP24a1除以相对应的ACTB拷贝数，然后乘以1000以便于操作，我们将得到的结果称为该样本的比例值；将比例值求log2对数后进行统计学分析；
把截距代入到上述比例值中即可确定样本是否发生甲基化；高斯混合数据模型用于复孔求均值后的log（2 1000×m_CYP24a1/ACTB）；该值大于3则认定为甲基化阳性；
10)、质量控制：
制定统一的调查表及填表说明，由专人负责对测量仪器进行定期校正；所有调査员在调查之前均由本课题组进行统一严格的专业培训；由专人对填写的调查表回收统计，回收问卷时确认问卷的完整性，避免漏项和错误的填写，并由专业人员对调查表的问卷的完整性、一致性和逻辑性进行逐项审核；实验过程中严格遵守各项实验操作规程；对标本的采集进行严格的操作培训，保证样品不被污染；对主观判定指标严格按照盲法由两位研究者同时进行，保证判定结果不受人主观因素的影响；同一石蜡块尽可能包括两组的组织样品，尽可能保证两组别的相关操作在同一时间内完成；对同一指标采用相同检测方法，严格遵守同样的实验条件，使用同一厂家和批号的试剂；
11)、统计分析：
采用SPSS17.0统计软件进行基础统计学分析；符合正态分布的定量试验资料除特殊说明均采用均数±标准差表示，卡方检验及两样本t检验或近似t检验分析两组之间统计学差异，方差不齐用Mann-Whitney U检验，计数资料采用卡方检验或者Fisher精确检验法分析两组之间统计学差异；采用直线相关及多因素非条件logistic回归进行关联性和相关影响因素的横断面分析。