视网膜组织的制备方法
阅读：116发布：2020-05-13
专利汇可以提供视网膜组织的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的课题在于提供抑制包含视细胞前 体细胞 和/或视细胞的神经 视网膜 组织中的神经节细胞、无长突细胞、 水 平细胞和/或双极细胞分化的方法等。一种抑制包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞分化的方法，所述方法包括将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织在包含甲状腺 激素 信号 转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。，下面是视网膜组织的制备方法专利的具体信息内容。
1.抑制包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞分化的方法，所述方法包括将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到出现视杆细胞前体细胞和/或双极细胞的分化阶段。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到形成外丛状层的分化阶段。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到出现穆勒细胞的分化阶段。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的抑制分化的方法，其中所述方法包括抑制PAX6阴性/CHX10强阳性细胞及PAX6阳性/CHX10阴性细胞的生成。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，神经视网膜组织源自干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，干细胞为多潜能干细胞。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，干细胞为从发育成熟的视网膜得到的成体干细胞。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，甲状腺激素信号转导途径作用物质为三碘甲状腺原氨酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，三碘甲状腺原氨酸的浓度为1～100nM。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，包含神经视网膜祖细胞，且处于神经节细胞刚出现后的分化阶段的视网膜组织，为相对于总细胞数而言神经视网膜祖细胞含有率为50％以上的视网膜组织。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，培养方法为悬浮培养。
13.成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，所述方法包括：
(1)将发育早期阶段的视网膜组织在培养基中培养，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
(2)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，步骤(1)中的培养基和/或步骤(2)中至少一部分的步骤中的培养基为包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基。
15.根据权利要求13或14所述的制备方法，其中，步骤(2)中的培养基包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的制备方法，其中，步骤(1)中的培养基包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的制备方法，其中，成熟的神经视网膜组织具有以下(i)～(iii)的特征：
(i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞(photoreceptor precursor)及视细胞(photoreceptor)的细胞数的比例为40％以上；
(ii)视细胞前体细胞及视细胞中包含的视锥细胞前体细胞(cone photoreceptor precursor)及视锥细胞(cone photoreceptor)的含有率为70％以上；及
(iii)相对于总细胞数，双极细胞，神经节细胞，无长突细胞及水平细胞的细胞数的比例为30％以下。
18.根据权利要求13～16中任一项所述的制备方法，其中，能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织具有以下(i)～(ii)的特征：
(i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞及视细胞(CRX阳性细胞)的细胞数的比例为11％以上、优选为20％以上；及
(ii)相对于总细胞数，CRX阳性且TRβ2阳性细胞的细胞数的比例为7％以上、优选为
10％以上；
其中，在确认到视锥细胞前体细胞的出现以后继续培养30～50天、优选为30～40天。
19.根据权利要求13～16中任一项所述的制备方法，其中，能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织具有以下(i)～(ii)的特征：
(i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞及视细胞(CRX阳性细胞)的比例为25％以上；及(ii)视细胞前体细胞和/或视细胞(CRX阳性细胞)与顶端面相接，沿着与顶端面的切线垂直相交的直线至少并排存在2个细胞；
其中，在确认到视锥细胞前体细胞的出现以后继续培养55～80天、优选为55～70天。
20.根据权利要求13～17中任一项所述的制备方法，其中，
步骤(2)包括以下步骤(2-1)及(2-2)：
(2-1)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中，培养到确认到视锥细胞前体细胞的出现以后第30～80天的步骤；及，(2-2)将步骤(2-1)中得到的视网膜组织在任选包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养60～120天的步骤。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其中，步骤(2-2)中使用的培养基为包含甲状腺激素信号转导途径作用物质和/或抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基。
22.根据权利要求13～21中任一项所述的制备方法，其中，背侧化信号转导物质为BMP4。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其中，BMP4的浓度为0.05～0.45nM。
24.根据权利要求13～21中任一项所述的制备方法，其中，背侧化信号转导物质为环巴胺-KAAD。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其中，环巴胺-KAAD浓度为0.01～100μM。
26.根据权利要求20～25中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2-2)中使用的培养基为连续上皮结构维持培养基。
27.利用权利要求13～26中任一项所述的方法得到的包含异位性CRX阳性细胞的神经视网膜组织。
28.神经视网膜组织，其包含视锥细胞及视锥细胞前体细胞，并具有以下(1)～(3)的特征：
(1)视细胞前体细胞及视细胞的细胞数的比例为总细胞数的11％以上、优选为20％以上；
(2)包含在成神经细胞层的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞和/或视细胞；及(3)所述神经视网膜组织为视锥细胞前体细胞最初出现后培养30～50天的神经视网膜组织，不包含CRX阳性且NRL阳性的视细胞或视细胞前体细胞。
29.根据权利要求28所述的神经视网膜组织，其中，视锥细胞前体细胞及视锥细胞的细胞数的比例为总细胞数的7％以上、优选为10％以上。
30.根据权利要求28或29所述的神经视网膜组织，其中，成神经细胞层为存在CHX10阳性且PAX6阳性、或存在Ki67阳性细胞的层。
31.根据权利要求28～30中任一项所述的神经视网膜组织，其中，进一步地，成神经细胞层(NBL)的基膜侧的异位性视细胞前体细胞及视细胞每一定面积的细胞数为包含NBL的顶端面侧区域的视细胞前体细胞及视细胞的该细胞数的1/10倍～10倍。
32.神经视网膜组织，其具有以下(1)～(4)的特征：
(1)CRX阳性细胞的含有率为25％以上；
(2)视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)与顶端面相接，沿着与顶端面切线垂直相交的直线至少并排存在2个细胞；
(3)包含视锥细胞前体细胞和/或视锥细胞，并且包含双极细胞，不包含穆勒细胞；及(4)包含视杆细胞前体细胞和/或向双极细胞分化阶段的神经视网膜祖细胞。
33.根据权利要求32所述的神经视网膜组织，其进一步具有以下(5)的特征：
(5)在成神经细胞层(NBL)的基膜侧存在异位性视细胞前体细胞。
34.包含视锥细胞前体细胞和/或视锥细胞的成熟的神经视网膜组织，其具有以下(1)～(5)的特征：
(1)为检测到穆勒细胞的分化阶段；
(2)神经节细胞、无长突细胞、水平细胞的含有率为30％以下；
(3)双极性细胞的含有率为10％以下；
(4)神经节细胞、无长突细胞、水平细胞及双极细胞的含有率为30％以下；及(5)视细胞前体细胞及视细胞的细胞数的比例为总细胞数的40％以上。
35.根据权利要求34所述的神经视网膜组织，其中，在基膜侧的细胞层形成有异位性视细胞层。
36.根据权利要求34或35所述的成熟的神经视网膜组织，其PAX6阴性/CHX10强阳性细胞及PAX6阳性/CHX10阴性细胞的含有率为30％以下。
37.根据权利要求34～36中任一项所述的成熟的神经视网膜组织，其中，进一步地，相对于外核层的细胞数，异位性视细胞前体细胞和/或视细胞的细胞数的比例为30％以上。
38.根据权利要求34～37中任一项所述的成熟的神经视网膜组织，其中，进一步地，视细胞前体细胞及视细胞中包含的视锥细胞前体细胞及视锥细胞的含有率为70％以上。
39.根据权利要求34～38中任一项所述的成熟的神经视网膜组织，其中，相对于总细胞数，CRX阳性细胞的细胞数的比例为40％以上。
40.根据权利要求27～33中任一项所述的神经视网膜组织，或权利要求34～39中任一项所述的成熟的神经视网膜组织，其中，神经视网膜组织的层结构的50％以上形成连续上皮结构。
41.根据权利要求40所述的神经视网膜组织，其中，视网膜组织的长轴方向的直径为
0.6mm以上。
42.神经视网膜组织，其通过培养能够成熟为权利要求34～41中任一项所述的成熟的神经视网膜组织。
43.移植用药物组合物，其含有权利要求27～33及40～42中任一项所述的神经视网膜组织，或权利要求34～41中任一项所述的成熟的神经视网膜组织。
44.发生视力下降或视野缺损的疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将权利要求27～33及40～42中任一项所述的神经视网膜组织，或权利要求34～41中任一项所述的成熟的神经视网膜组织移植到动物中。
45.权利要求27～33及40～42中任一项所述的神经视网膜组织或权利要求34～41中任一项所述的成熟的神经视网膜组织作为毒性/药效评价用试剂的用途。
视网膜组织的制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 已知在视网膜色素变性等由于视细胞的变性、脱落引起的发生视力下降、视野缺损的疾病中，对于伴随变性、脱落的视细胞，最初接收来自视细胞的信号的双极细胞、除此以外的视网膜细胞在视细胞变性、脱落后也在一定时期中残存在视网膜组织内(非专利文献1)。因此，认为为了通过基于包含视细胞、视细胞前体细胞的视网膜组织的移植的再生医疗发挥治疗效果，优选源自所移植的视网膜组织的视细胞、视细胞前体细胞与接受移植的患者(接受者)的双极细胞进行接触，形成突触，即，形成视网膜神经通路(非专利文献2)。像这样，强烈需要开发来自患者的视网膜组织的双极细胞与来自被移植的视网膜组织的视细胞能够有效地形成突触的适于移植的视网膜组织及其制备方法。
[0003] 另一方面，有报告在使用从胎儿收集的视网膜细胞使其分化为视细胞前体细胞时，在将包含神经视网膜祖细胞的视网膜组织分散后，添加视黄酸、甲状腺激素之一的三碘甲状腺原氨酸(T3)而进行了贴壁培养(非专利文献3)。另外，有报告在将大鼠视网膜组织分散后，在视黄酸存在下进行贴壁培养的情况下，无长突细胞减少了(非专利文献4)。
[0004] 然而，尚不知晓甲状腺激素是否对双极细胞，神经节细胞，水平细胞等的分化造成影响。
[0005] 另外，也尚未已知从干细胞诱导的具有立体结构的视网膜组织中包含的无长突细胞，双极细胞，神经节细胞及水平细胞等细胞，调节这些细胞与视细胞前体细胞及视细胞的比例，制备适于移植的视网膜组织的方法。
[0006] 现有技术文献
[0007] 非专利文献
[0008] 非专利文献1：Prog Retin Eye Res，17(2)，175-205(1998)
[0009] 非专利文献2：Proc Natl Acad Sci USA，113(1)，E81-90(2016)
[0010] 非专利文献3：Invest Ophthalmol Vis Sci，36(7)，1280-1289(1995)
[0011] 非专利文献4：Development 120(8)，2091-2102(1994)
发明内容
[0012] 发明要解决的问题
[0013] 本发明的课题为提供一种来自患者的视网膜组织的双极细胞与来自被移植的视网膜组织的视细胞能够有效地形成突触的适于移植的视网膜组织及其制备方法。
[0014] 解决问题的手段
[0015] 已知在视网膜色素变性等由于视细胞的变性、脱落引起的发生视力下降、视野缺损的疾病中，对于伴随变性、脱落的视细胞，最初接收来自视细胞的信号的双极细胞、除此以外的视网膜细胞在视细胞变性、脱落后也在一定时期中残存在视网膜组织内(非专利文献1)。因此，认为为了通过基于包含视细胞前体细胞的视网膜组织的移植的再生医疗发挥治疗效果，优选源自所移植的视网膜组织的视细胞与接受移植的患者(接受者)的双极细胞进行接触，经由上述视细胞前体细胞(或者视细胞)的突触末端而形成突触，即，形成视网膜神经通路(非专利文献2)。
[0016] 另外，已报告了移植的视网膜组织在其移植到的部位植活，取得特征性的莲座样结构，及视细胞前体细胞(或者视细胞)的基膜侧(即视细胞前体细胞，或视细胞的突触末端侧)与接受者的双极细胞接触能形成突触(非专利文献2)。在视网膜组织中，除了双极细胞的以外包含无长突细胞、神经节细胞，水平细胞，而这些细胞存在于视细胞前体细胞所存在的层(外核层)的神经视网膜组织的基膜侧。因此，在移植的视网膜组织取莲座样结构时，源自移植的视网膜组织的双极细胞，无长突细胞，神经节细胞及水平细胞成了位于源自移植的视网膜组织的视细胞前体细胞和接受者的双极细胞之间。
[0017] 因此，发明人认为，在源自移植的视网膜组织的视细胞将要与接受者的双极细胞接触时，源自移植的视网膜组织的双极细胞，无长突细胞，神经节细胞及水平细胞可构成空间、或物理上的障碍。另外，也存在以下可能性：在移植的神经视网膜组织内存在双极细胞时，在移植的神经视网膜组织内，视细胞会和双极细胞形成回路，不能实现源自移植的视网膜组织的视细胞与接受者的双极细胞有效地形成神经通路。根据这些认为，移植的神经视网膜组织内的双极细胞，无长突细胞，神经节细胞及水平细胞的比例越少，越优选。
[0018] 即，本发明人考虑通过降低用于移植的视网膜组织中这些不需要的细胞的比例，由此提高源自接受者的视网膜组织的双极细胞与来自被移植的视网膜组织的视细胞发生接触而形成突触的概率，并进行了深入研究。结果发现，将处于神经节细胞不出现或者刚出现后的分化阶段的包含神经视网膜祖细胞的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中悬浮培养并使其成熟，由此降低视网膜组织中包含的对与生物体的移植部位的突触形成而言不需要的细胞，且提高视细胞前体细胞的比例，从而完成了本发明。另外，通过除了甲状腺激素信号转导途径作用物质以外，添加背侧化信号转导物质，由此进一步得到了神经视网膜中包含的全部细胞中视细胞前体细胞的比例，及视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例高的神经视网膜组织。
[0019] 即，本发明涉及以下内容：
[0020] [1]一种抑制包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞分化的方法，所述方法包括将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0021] [2]根据上述[1]所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到出现视杆细胞前体细胞和/或双极细胞的分化阶段。
[0022] [3]根据上述[1]所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到形成外丛状层的分化阶段。
[0023] [4]根据上述[1]所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到出现穆勒细胞的分化阶段。
[0024] [5]根据上述[1]～[4]中任所述的抑制分化的方法，所述方法包括抑制PAX6阴性/CHX10强阳性细胞及PAX6阳性/CHX10阴性细胞的生成。
[0025] [6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，神经视网膜组织源自干细胞。
[0026] [7]根据上述[6]所述的方法，其中，干细胞为多潜能干细胞。
[0027] [8]根据上述[6]所述的方法，其中，干细胞为从发育成熟的视网膜得到的成体干细胞。
[0028] [9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，甲状腺激素信号转导途径作用物质为三碘甲状腺原氨酸。
[0029] [10]根据上述[9]所述的方法，其中，三碘甲状腺原氨酸的浓度为1～100nM。
[0030] [11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，包含神经视网膜祖细胞，且处于神经节细胞刚出现后的分化阶段的视网膜组织，为相对于总细胞数而言神经视网膜祖细胞含有率为50％以上的视网膜组织。
[0031] [12]根据上述[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，培养方法为悬浮培养。
[0032] [13]成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，所述方法包括；
[0033] (1)将发育早期阶段的视网膜组织在培养基中培养，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
[0034] (2)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0035] [14]根据上述[13]所述的制备方法，其中，步骤(1)中的培养基和/或步骤(2)中至少一部分的步骤中的培养基为包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基。
[0036] [15]根据上述[13]或[14]所述的制备方法，其中，步骤(2)中的培养基包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质。
[0037] [16]根据上述[13]～[15]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(1)中的培养基包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质。
[0038] [17]上述[13]～[16]中任一项所述的制备方法，其中，成熟的神经视网膜组织具有以下(i)～(iii)的特征：
[0039] (i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞(photoreceptor precursor)及视细胞(photoreceptor)的细胞数的比例为40％以上；
[0040] (ii)视细胞前体细胞及视细胞中包含的视锥细胞前体细胞(cone photoreceptor precursor)及视锥细胞(cone photoreceptor)的含有率为70％以上；及
[0041] (iii)相对于总细胞数，双极细胞，神经节细胞，无长突细胞及水平细胞的细胞数的比例为30％以下。
[0042] [18]上述[13]～[16]中任一项所述的制备方法，其中，能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织具有以下(i)～(ii)的特征：
[0043] (i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞及视细胞(CRX阳性细胞)的细胞数的比例为11％以上、优选为20％以上；及
[0044] (ii)相对于总细胞数，CRX阳性且TRβ2阳性细胞的细胞数的比例为7％以上、优选为10％以上；
[0045] 其中所述方法包括在确认到视锥细胞前体细胞的出现以后继续进行培养30～50天、优选为30～40天。
[0046] [19]根据上述[13]～[16]中任一项所述的制备方法，其中，能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织具有以下(i)～(ii)的特征：
[0047] (i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞及视细胞(CRX阳性细胞)的比例为25％以上；及
[0048] (ii)视细胞前体细胞和/或视细胞(CRX阳性细胞)与顶端面相接，沿着与顶端面的切线垂直相交的直线至少并排存在2个细胞；
[0049] 其中所述方法包括在确认到视锥细胞前体细胞的出现以后继续进行培养55～80天、优选为55～70天；
[0050] [20]根据上述[13]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，
[0051] 步骤(2)包括以下步骤(2-1)及(2-2)：
[0052] (2-1)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中，培养到确认到视锥细胞前体细胞的出现以后第30～80天的步骤；及，[0053] (2-2)将步骤(2-1)中得到的视网膜组织在任选包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养60～120天的步骤。
[0054] [21]根据上述[20]所述的制备方法，其中，步骤(2-2)中使用的培养基为包含甲状腺激素信号转导途径作用物质和/或抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基。
[0055] [22]根据上述[13]～[21]中任一项所述的制备方法，其中，背侧化信号转导物质为BMP4。
[0056] [23]根据上述[22]所述的制备方法，其中，BMP4的浓度为0.05～0.45nM。
[0057] [24]根据上述[13]～[21]中任一项所述的制备方法，其中，背侧化信号转导物质为环巴胺-KAAD。
[0058] [25]根据上述[24]所述的制备方法，其中，环巴胺-KAAD浓度为0.01～100μM。
[0059] [26]根据上述[20]～[25]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2-2)中使用的培养基为连续上皮结构维持培养基；
[0060] [27]利用上述[13]～[26]中任一项所述的方法得到的包含异位性CRX阳性细胞的神经视网膜组织。
[0061] [28]神经视网膜组织，其包含视锥细胞及视锥细胞前体细胞，并具有以下(1)～(3)的特征：
[0062] (1)视细胞前体细胞及视细胞的细胞数的比例为总细胞数的11％以上、优选为20％以上；
[0063] (2)包含在成神经细胞层的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞和/或视细胞；及[0064] (3)所述神经视网膜组织为从视锥细胞前体细胞最初出现起经30～50天培养的神经视网膜组织，不包含的CRX阳性且NRL阳性的视细胞或视细胞前体细胞。
[0065] [29]根据上述[28]所述的神经视网膜组织，其中，视锥细胞前体细胞及视锥细胞的细胞数的比例为总细胞数的7％以上、优选为10％以上。
[0066] [30]根据上述[28]或[29]所述的神经视网膜组织，其中，成神经细胞层为CHX10阳性且PAX6阳性、或为Ki67阳性。
[0067] [31]根据上述[28]～[30]中任一项所述的神经视网膜组织，其中，进一步地，成神经细胞层(NBL)的基膜侧的异位性视细胞前体细胞及视细胞的每一定面积的细胞数为包含NBL的顶端面侧的区域的视细胞前体细胞及视细胞的该细胞数的1/10倍～10倍。
[0068] [32]神经视网膜组织，其具有以下(1)～(4)的特征：
[0069] (1)CRX阳性细胞的含有率为25％以上；
[0070] (2)视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)与顶端面相接，沿着与顶端面的切线垂直相交的直线至少并排存在2个细胞；
[0071] (3)包含视锥细胞前体细胞和/或视锥细胞，以及包含双极细胞，不包含穆勒细胞；及
[0072] (4)包含视杆细胞前体细胞和/或向双极细胞分化的阶段的神经视网膜祖细胞。
[0073] [33]上述[32]所述的神经视网膜组织，其进一步具有以下(5)的特征：
[0074] (5)在成神经细胞层(NBL)的基膜侧存在异位性视细胞前体细胞。
[0075] [34]包含视锥细胞前体细胞和/或视锥细胞的成熟的神经视网膜组织，其具有以下(1)～(5)的特征：
[0076] (1)为检测到穆勒细胞的程度的分化阶段；
[0077] (2)神经节细胞、无长突细胞、水平细胞的含有率为30％以下；
[0078] (3)双极性细胞的含有率为10％以下；
[0079] (4)神经节细胞、无长突细胞、水平细胞及双极细胞的含有率为30％以下；及[0080] (5)视细胞前体细胞及视细胞的细胞数的比例为总细胞数的40％以上。
[0081] [35]根据上述[34]所述的神经视网膜组织，其中，在基膜侧的细胞层形成了异位性视细胞层。
[0082] [36]根据上述[34]或[35]所述的成熟的神经视网膜组织，其中，PAX6阴性/CHX10强阳性细胞及PAX6阳性/CHX10阴性细胞的含有率为30％以下；
[0083] [37]根据上述[34]～[36]所述的成熟的神经视网膜组织，进一步地，相对于外核层的细胞数，异位性视细胞前体细胞和/或视细胞的细胞数的比例为30％以上。
[0084] [38]根据上述[34]～[37]中任一项所述的成熟的神经视网膜组织，其中，进一步地，视细胞前体细胞及视细胞中包含的视锥细胞前体细胞及视锥细胞的含有率为70％以上。
[0085] [39]根据上述[34]～[38]中任一项所述的成熟的神经视网膜组织，其中，相对于总细胞数，CRX阳性细胞的细胞数的比例为40％以上。
[0086] [40]根据上述[27]～[33]中任一项所述的神经视网膜组织，或上述[34]～[39]中任一项所述的成熟的神经视网膜组织，其中，神经视网膜组织的层结构的50％以上形成连续上皮结构。
[0087] [41]根据上述[40]所述的神经视网膜组织，其中，视网膜组织的长轴方向的直径为0.6mm以上。
[0088] [42]神经视网膜组织，其通过培养能够成熟为上述[34]～[41]中任一项所述的成熟的神经视网膜组织。
[0089] [43]移植用药物组合物，其含有上述[27]～[33]及[40]～[42]中任一项所述的神经视网膜组织，或上述[34]～[41]中任一项所述的成熟的神经视网膜组织。
[0090] [44]发生视力下降或视野缺损的疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将上述[27]～[33]及[40]～[42]中任一项所述的神经视网膜组织，或上述[34]～[41]中任一项所述的成熟的神经视网膜组织移植到动物中。
[0091] [45]上述[27]～[33]及[40]～[42]中任一项所述的神经视网膜组织，或上述[34]～[41]中任一项所述的成熟的神经视网膜组织的作为毒性/药效评价用试剂的用途。
[0092] 发明的效果
[0093] 根据本发明，能够实现视网膜组织中包含的双极细胞，无长突细胞，神经节细胞或水平细胞等的比例低，且使视细胞前体细胞的比例增大的视网膜组织的制备。另外，在本发明的一种实施方式中，能够实现使上述视网膜组织中的视细胞前体细胞之中，视锥细胞前体细胞的比例增大。另外，在在本发明的一种实施方式中，可以期待视细胞前体细胞，或视锥细胞前体细胞异位性地出现，存在于存在双极细胞，无长突细胞，或神经节细胞等的视网膜层的基膜侧，在移植的情况下形成与源自患者的双极性细胞的效率良好的神经通路。像这样，本发明的视网膜组织在由视网膜色素变性等视细胞的变性、脱落引起的发生视力下降、视野缺损的疾病的治疗中是有用的。附图说明
[0094] [图1]图1为示出在将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体开始悬浮培养后的第35天(a，b)及第42天(c，d)利用荧光立体显微镜拍摄的图像的例子。a及b为在将包含视网膜组织的聚集体悬浮培养开始后第35天用镊子切取，利用荧光立体显微镜拍摄的图像，c及d为确认了在悬浮培养开始后第42天，在包含视网膜组织的细胞聚集体中出现了可见CRX::Venus蛋白质的荧光的细胞，即，视细胞前体细胞的图像。
[0095] [图2]图2为将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到开始悬浮培养后的第69～74天，利用荧光立体显微镜拍摄的图像(a～d)。与T3无添加组(-T3；a)相比，在T3添加组(+T3；b)中，CRX::Venus发出的荧光更强，可知CRX::Venus阳性细胞增加了。另外，在除了T3以外还添加了背侧化信号转导物质的情况下(+T3+BMP；c，+T3+环巴胺-KAAD；d)，可知与T3添加组相比，CRX::Venus阳性细胞进一步增加了。特别是，可知在+T3+环巴胺-KAAD组中，与+T3+BMP组相比，CRX::Venus阳性细胞进一步增加了。需要说明的是，报告了在体外培养的包含视网膜组织的细胞聚集体中，分化是经过与人的视网膜产生大致相同的顺序和时期而进展的，在该分化阶段中出现的CRX::Venus阳性细胞为视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞。另外，在图2中，以使得T3为60nM，BMP4为0.15nM，环巴胺-KAAD为
500nM的方式添加到培养基中。
500nM的方式添加到培养基中。
[0096] [图3]图3为将由人ES细胞制作的包含视网膜组织的细胞聚集体，从视细胞前体细胞开始出现的悬浮培养开始第38天起，在100nM的9-顺式视黄酸存在下培养到悬浮培养开始后第74天，利用荧光立体显微镜拍摄的图像(a～c)。与T3无添加组(-T3；a)相比，在T3添加组(+T3；b)中，CRX::Venus发出的荧光更强，可知CRX::Venus阳性细胞增加了。另外，在除了T3以外还添加了背侧化信号转导物质的情况下(+T3+BMP；c)，可知与T3添加组相比，CRX::Venus阳性细胞进一步增加了。需要说明的是，报告了在体外培养的包含视网膜组织的细胞聚集体中，分化是经过与人的视网膜产生大致相同的顺序和时期而进展的，在该分化阶段中出现的CRX::Venus阳性细胞为视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞。另外，在图3中，以使得T3为60nM，BMP4为0.45nM的方式添加到培养基中。
[0097] [图4]图4为示出将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到开始悬浮培养后的约第71-75天，针对回收的包含视网膜组织的细胞聚集体制作切片，使用抗CRX抗体，抗TRβ2抗体，DAPI而采用普通方法实施了免疫染色后，分析了CRX阳性细胞及CRX阳性细胞中TRβ2阳性细胞的结果的图。与T3无添加组(-T3；a，e，i)相比，可知T3添加组(+T3；b，f，j)中，CRX阳性细胞及CRX阳性且TRβ2阳性细胞增加了。另外，在除了T3以外还添加了背侧化信号传递物质的情况下(+T3+BMP4；c，g，k，+T3+环巴胺-KAAD；d，h，l)，可知CRX阳性细胞及CRX阳性且TRβ2阳性细胞进一步增加了。特别是，在+T3+环巴胺-KAAD组中，与+T3+BMP4组相比，可知CRX阳性细胞及CRX阳性且TRβ2阳性细胞进一步增加了。另外，可知这些细胞不仅在顶端面侧，在基膜侧(成神经细胞层及神经节细胞层)也异位性地出现，就其比例而言，在成神经细胞层的基膜侧和除其以外的区域中为约同程度的比例。需要说明的是，在该分化阶段中，CRX阳性细胞、及CRX阳性且TRβ2阳性细胞为视细胞前体细胞，及视锥细胞前体细胞。需要说明的是，在图4中，以使得T3为60nM，BMP4为0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
[0098] [图5]图5为将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到为可见穆勒细胞的分化阶段的悬浮培养开始后第188～191天，针对回收的包含视网膜组织的细胞聚集体制作切片，使用抗PAX6抗体，抗CHX10抗体，DAPI而采用普通方法实施了免疫染色的例子。可知对神经视网膜组织中的无长突细胞，神经节细胞或水平细胞中的任一种细胞(PAX6阳性/CHX10阴性细胞)和双极细胞(PAX6阴性/CHX10强阳性细胞)而言，与没有添加T3的情况下(-T3；a，g，m，+BMP；c，i，o，+环巴胺-KAAD；e，k，q)相比，均在添加了T3的情况下(+T3；b，h，n，+T3+BMP；d，j，p，+T3+环巴胺-KAAD；f，l，r)明显降低。需要说明的是，在图5中，以使得T3为60nM，BMP4为0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
[0099] [图6]图6为示出将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到为可见穆勒细胞的分化阶段的悬浮培养开始后第188～193天，针对回收的包含视网膜组织的细胞聚集体制作切片，使用抗GFP抗体(检测CRX::Venus蛋白质)，抗NRL抗体，抗RXR-γ抗体，DAPI而采用普通方法实施免疫染色，分析了GFP阳性细胞，即CRX::Venus阳性细胞中的RXR-γ阳性且NRL阴性细胞(视锥细胞前体细胞)，或CRX::Venus阳性细胞中的NRL阳性细胞(视杆细胞前体细胞)的结果的图(a～p)。可知与T3无添加组(-T3；a，e，i，m)相比，在T3添加组(+T3；b，f，j，n，+T3+BMP；c，g，k，o，+T3+环巴胺-KAAD；d，h，1，p)中，为CRX::Venus阳性细胞的视细胞前体细胞及视锥细胞前体细胞的比例增加了。特别是，可知在除了T3以外作为背侧化信号转导物质添加了BMP4的情况下(+T3+BMP；c，g，k，o)，与T3添加组相比，基膜侧的细胞减少，结果为视细胞前体细胞及视锥细胞前体细胞的比例进一步增加了。另外，可知此时几乎确认不到视杆细胞前体细胞。需要说明的是，在图6中，以使得T3为60nM，BMP4为0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
[0100] [图7]图7为示出将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到开始悬浮培养后的约第70天时，针对回收的包含视网膜组织的细胞聚集体制作切片，使用抗CRX抗体，抗TRβ2抗体，DAPI而采用普通方法实施免疫染色后，使用图像分析软件(ImageJ)测定了视网膜组织中包含的CRX阳性细胞数，及CRX阳性细胞中的TRβ2阳性细胞数的结果的图。可知与无添加T3的情况(白色直方)相比，在添加了T3的组(黑色直方)中，CRX阳性细胞，CRX阳性且TRβ2阳性细胞，即视细胞前体细胞，视锥细胞前体细胞均增加了。另外，可知在除了T3以外添加了背侧化信号转导物质(BMP4，环巴胺-KAAD)的组中，与除了T3以外没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，CRX阳性细胞，CRX阳性且TRβ2阳性细胞，即视细胞前体细胞，视锥细胞前体细胞均进一步增加了。需要说明的是，在图7中，以使得T3为60nM，BMP4为
0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
[0101] [图8]图8示出了将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到可见穆勒细胞的悬浮培养开始后约第190天时，针对回收的包含视网膜组织的细胞聚集体制作切片，使用抗PAX6抗体，抗CHX10抗体，DAPI而采用普通方法实施免疫染色后，使用图像分析软件(ImageJ)测定了对神经视网膜组织中的PAX6阳性/CHX10阴性细胞和，PAX6阴性/CHX10强阳性细胞，即无长突细胞，神经节细胞或水平细胞中的任一种细胞和双极细胞的比例的结果。可知与无添加T3的情况(白色直方)相比，在添加了T3的组(黑色直方)中的无长突细胞，神经节细胞或水平细胞中的任一种细胞(PAX6阳性/CHX10阴性细胞)和双极细胞(PAX6阴性/CHX10强阳性细胞)的比例均减少了。另外，可知在除了T3以外作为背侧化信号转导物质添加了BMP4的组中，与除了T3以外没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，虽然双极细胞(PAX6阴性/CHX10强阳性细胞)的比例有少许增加，但无长突细胞，神经节细胞或水平细胞中的任一种细胞(PAX6阳性/CHX10阴性细胞)的比例减少，将双极细胞(PAX6阴性/CHX10强阳性细胞)和无长突细胞，神经节细胞或水平细胞中的任一种细胞(PAX6阳性/CHX10阴性细胞)进行合计的比例几乎没有变化。另一方面，可知在除了T3以外作为背侧化信号转导物质添加了环巴胺-KAAD的组中，与除了T3以外没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，虽然双极细胞(PAX6阴性/CHX10强阳性细胞)的比例没有变化，但无长突细胞，神经节细胞或水平细胞中的任一种细胞(PAX6阳性/CHX10阴性细胞)的比例减少，将双极细胞(PAX6阴性/CHX10强阳性细胞)和无长突细胞，神经节细胞或水平细胞中的任一种细胞(PAX6阳性/CHX10阴性细胞)进行合计的比例减少了。需要说明的是，在图8中，以使得T3为60nM，BMP4为0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
[0102] [图9]图9示出了将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到可见穆勒细胞的悬浮培养开始后约第190天时，针对回收的包含视网膜组织的细胞聚集体制作切片，使用抗GFP抗体(检测CRX::Venus蛋白质)，抗NRL抗体，抗RXR-γ抗体，DAPI而采用普通方法实施免疫染色，使用图像分析软件(ImageJ)对GFP阳性细胞，即CRX::Venus阳性细胞(视细胞前体细胞)和，CRX::Venus阳性细胞中的RXR-γ阳性且NRL阴性细胞(视锥细胞前体细胞)，或CRX::Venus阳性细胞中的NRL阳性细胞(视杆细胞前体细胞)的比例进行测定的结果。可知与在无添加T3的情况(白色直方)相比，在添加了T3的组(黑色直方)中视细胞前体细胞，或视锥细胞前体细胞的比例均增加了。另外，可知在除了T3以外还添加了背侧化信号转导物质的组中，与除了T3以外没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，视细胞前体细胞，或视锥细胞前体细胞的比例均更加增加了。特别是，可知在除了T3以外作为背侧化信号转导物质为BMP4时，与除了T3以外没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，视杆细胞前体细胞的比例更少，视锥细胞前体细胞的比例更高。另一方面，可知在除了T3以外作为背侧化信号转导物质添加了环巴胺-KAAD的情况，与除了T3以外没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，视杆细胞前体细胞的比例中没有较大的变化，另一方面，视细胞前体细胞，或视锥细胞前体细胞的比例更进一步高。需要说明的是，在图9中，以使得T3为60nM，BMP4为0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
[0103] [图10]图10为示出将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到开始悬浮培养后的约第100-105天，针对回收的包含视网膜组织的细胞聚集体制作切片，进行了使用抗CRX抗体，抗Ki67抗体的免疫染色，或染色细胞核的DAPI染色，使用荧光显微镜进行观察的结果的图。另外，将使用图像分析软件(ImageJ)测定了利用同样的条件制备的神经视网膜组织内包含的CRX阳性细胞的比例的结果示于图中。根据图10可知，对作为视细胞前体细胞的CRX阳性细胞而言，与-T3组(没有添加T3的组)的视网膜组织相比，在+T3组(添加了T3的组)的视网膜组织中明显增加，特别是，对在顶端面存在的视细胞前体细胞层的厚度而言，与-T3组相比，在+T3组中为约2、3倍的厚度。另外，可知与这些结果同样，+T3+BMP4组(除了T3以外添加了BMP4的组)，+T3+环巴胺-KAAD组(除了T3以外添加了环巴胺-KAAD的组)也相同。另外，在悬浮培养开始后第100天前后的阶段的神经视网膜组织中，也确认到为Ki67阳性的有增殖性的神经视网膜祖细胞存在的层，即成神经细胞层，可知与-T3组的视网膜组织相比，在+T3组的视网膜组织中，在胎儿期的视网膜组织中除了原本有视细胞前体细胞存在的顶端面(视细胞层，外核层)以外，即在有Ki67阳性的神经视网膜祖细胞存在的成神经细胞层、所述成神经细胞层的基膜侧的神经节细胞层中也包含许多异位性视细胞前体细胞。另外，可知这样的结果在+T3+环巴胺-KAAD组中也相同。另一方面，虽然在+T3+BMP4组中也确认到，但在+T3+BMP4组中没有确认到+T3组、+T3+环巴胺-KAAD组程度的这样的异位性视细胞前体细胞，启示在该分化阶段中，视细胞前体细胞的出现变得少于+T3组、+T3+环巴胺-KAAD。另外，从图中可知，神经视网膜组织中包含的CRX阳性细胞的比例以-T3组，+T3组，+T3+BMP4组，+T3+环巴胺-KAAD组的顺序升高。根据这些可知，甲状腺激素信号转导途径作用物质具有使悬浮培养开始后第100天前后的视网膜组织的视细胞前体细胞增加的作用，及与甲状腺激素信号转导途径作用物质单独发挥作用的情况相比，在将甲状腺激素信号转导途径作用物质与背侧化信号转导物质进行组合发挥作用的情况下，可以使视细胞前体细胞进一步增加。需要说明的是，在图10中，以使得T3为60nM，BMP4为0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
[0104] [图11-1]图11-1为示出将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到开始悬浮培养后的约第69天，约第104～105天，约第188天～第192天，分别进行了观察及分析的结果的图。图11-1为示出将悬浮培养开始后分别培养到所述的天数(例如：第69天则记载为d69)的包含视网膜组织的细胞聚集体利用荧光立体显微镜拍摄的图像的例子。根据该图像可知，在任一条件及天数中，都包含了包含至少直径2mm以上的视网膜组织的细胞聚集体。
[0105] [图11-2]图11-2为示出将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到开始悬浮培养后的约第188天，针对回收的包含视网膜组织的细胞聚集体制作切片，进行了使用抗GFP抗体的免疫染色，使用荧光显微镜进行观察的结果的图。根据该图可知，被抗GFP抗体染色的CRX::Venus阳性细胞，即视细胞前体细胞或视细胞在任一条件下都在包含视网膜组织的细胞聚集体的表面连续而有规律的排列。即，可知这些包含视网膜组织的细胞聚集体在从悬浮培养开始起至少第188天中也不包含莲座样结构，为具有连续的上皮结构的视网膜组织。进一步根据该图可知，不仅在顶端面附近的视细胞层(外核层)，可确认到许多异位性视细胞前体细胞。
[0106] [图11-3]图11-3为对将包含由人ES细胞制作的视网膜组织的细胞聚集体培养到开始悬浮培养后的第70天时，第100天时，第190天时的包含视网膜组织的细胞聚集体，利用荧光显微镜进行观察而获得图像后，对获得的图像使用分析软件测定了长轴的直径，算出包含视网膜组织的细胞聚集体的平均值的图(左侧)及将长轴的直径作图的图(右侧)。根据左侧的图可知，在任一条件及任一阶段的包含视网膜组织的细胞聚集体中，都以平均计为1.1mm以上的大小。另一方面，根据右侧的图可知，1.0mm以上的包含视网膜组织的细胞聚集体有大半，1.5mm以上的包含视网膜组织的细胞聚集体也可容易地确认到。另外，可知在包含视网膜组织的细胞聚集体中，长轴的直径较大的那些达到3.0mm附近(2.93mm)。
具体实施方式
[0107] 1.定义
[0108] 在本说明书中，所述“干细胞”意指即使经历细胞分裂也维持相同的分化潜能，具有增殖潜能(特别是自我更新能力)的未分化的细胞。在干细胞中，根据分化潜能而包括多潜能干细胞(pluripotent stem cell)，多能干细胞(multipotent stem cell)，单能干细胞(unipotent stem cell)等亚群。多潜能干细胞意指能够在体外培养，并且具有可向属于三胚层(外胚层，中胚层，内胚层)的细胞系列的全部进行分化的潜能(分化多潜能性(pluripotency))的干细胞。多能干细胞意指具有分化成多种类型的组织或细胞、但不是所有种类的组织或细胞的潜能的干细胞。单能性干细胞意指具有分化成特定的组织、细胞的潜能的干细胞。
[0109] 多潜能干细胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞等诱导。作为多潜能干细胞，可列举：胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stem cell)，EG细胞(Embryonic germ cell)，人工多潜能干细胞(iPS细胞：induced pluripotent stem cell)等。
[0110] 胚胎干细胞最先在1981年建立，并且自1989年起还已经用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也持续用于再生医学。可以通过在饲养细胞上或在含有LIF的培养基中培养内细胞团而产生ES细胞。ES细胞的制备方法记载在例如，WO 96/22362、WO 02/101057、US 5,843,780、US 6,200,806、US 6,280,718等中。胚胎干细胞可从给定的机构得到，或可以购买市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1，KhES-2和KhES-3，可从京都大学再生医科学研究所得到。作为任意小鼠胚胎干细胞的EB5可从国立研究开发法人理化学研究所得到，并且D3细胞系可从ATCC得到。
[0111] 作为ES细胞之一的核移植ES细胞(ntES细胞)可以由通过将体细胞的细胞核移植到去核卵中产生的克隆胚胎建立细胞株。
[0112] 本发明中的“人工多潜能干细胞”(也称为iPS细胞)意指通过公知的方法等将体细胞重编程(reprogramming)而被诱导具有多潜能性的细胞。具体而言，可列举将成纤维细胞、外周血单核细胞等分化成的体细胞通过表达选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等组成的组中的重编程基因组中的多个基因的组合中的任一种而进行重编程，从而被诱导具有多潜能性的细胞。优选的作为重编程因子的组合，可列举：(1)Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc(c-Myc或L-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及L-Myc(Stem Cells，2013；31：458-466)等。
[0113] 人工多潜能干细胞由山中等人在2006年在小鼠细胞中建立(Cell，2006，126(4)pp.663-676)。在2007年还从人成纤维细胞中建立了人工多潜能干细胞，与胚胎干细胞同样具有多潜能性和自我更新能力(Cell，2007，131(5)pp.861-872；Science，2007，318(5858)pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)pp.101-106)。在那后也对于人工多潜能干细胞的诱导方法进行了各种改良(例如：小鼠iPS细胞：Cell.2006Aug 25；126(4)：663-76，人iPS细胞：Cell.2007Nov 30；131(5)：861-72)。
[0114] 除了利用基因表达的直接重编程而制备人工多潜能干细胞的方法以外，也可以通过化合物的添加等由体细胞诱导人工多潜能干细胞(Science，2013，341pp.651-654)。
[0115] 另外，还能够获取建立细胞系的人工多潜能干细胞，例如：由京都大学建立的201B7细胞，201B7-Ff细胞，253G1细胞，253G4细胞，1201C1细胞，1205D1细胞，1210B2细胞，
1231A3细胞，Ff-I01细胞或QHJI01细胞等人的人工多潜能细胞系可从国立大学法人京都大学获取。
1231A3细胞，Ff-I01细胞或QHJI01细胞等人的人工多潜能细胞系可从国立大学法人京都大学获取。
[0116] 尽管用于获得人工多潜能干细胞的体细胞没有特别限制，但是可列举组织来源的成纤维细胞、血液谱系细胞(例如，外周血单核细胞、T细胞)、肝细胞、胰细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。作为成纤维细胞可列举真皮来源的那些等。
[0117] 当通过表达一些种类的基因进行重编程而产生人工多潜能干细胞时，对用于基因表达的方式没有特别限制。作为前述方式，可列举使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒(Sendai virus)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)的感染法，使用质粒载体(例如，质粒载体、附加体载体)的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、RetroNectin法、电穿孔法)，使用RNA载体的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法)，直接注射蛋白的方式等。
[0118] 用于本发明的多潜能干细胞优选为ES细胞或人工多功能性干细胞，更优选为人工多潜能干细胞。
[0119] 用于本发明的多潜能干细胞优选为灵长类(例如，人、猴)的多潜能干细胞、优选为人多潜能干细胞。因此，本发明使用的多潜能干细胞优选为人ES细胞或人的人工多潜能干细胞(人iPS细胞)、最优选为人的人工多潜能干细胞(人iPS细胞)。
[0120] 作为本发明使用的干细胞，也可以收集在成人的视网膜中存在的干细胞(例如：成体干细胞)而使用。
[0121] 可以例如，通过使用同源重组技术产生遗传上修饰的多潜能干细胞。作为被修饰的染色体上的基因，可举出例如：细胞标记基因、组织相容性抗原的基因、与由视网膜细胞的障碍导致的疾病相关的基因等。染色体上的靶基因的修饰可以使用以下各项所述的方法进行：Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual(操作小鼠胚胎，实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting，A PracticalApproach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using EScell(基因靶向，使用ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHACO.，LTD.(1995)；等等。
[0122] 具体而言，例如，分离包含要修饰的靶基因(例如，细胞标记基因、组织相容性抗原基因、疾病相关的基因等)的基因组DNA，并使用该分离的基因组DNA制备用于将该靶基因进行同源重组的靶向载体。将所产生的靶向载体引入到干细胞中，并选择在所述靶基因与所述靶向载体之间发生了同源重组的细胞，由此，能够制备染色体上的基因得到了所述修饰的干细胞。
[0123] 作为用于分离包含靶基因的基因组DNA的方法，可列举以下各项所述的已知的方法：Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学流程)，John Wiley&Sons(1987-1997)等。对包含靶基因的基因组基因而言，也可以使用基因组DNA文库筛选系统(由Genome Systems制造)、通用基因组步量试剂盒(Universal Genome Walker试剂盒)(由CLONTECH制造)等分离。也可以使用编码目标蛋白质的多核苷酸取代基因组DNA。所述多核苷酸可以通过用PCR法扩增相对应的多核苷酸而得到。
[0124] 用于靶基因同源重组的靶向载体的制备和同源重组子的有效筛选可以按照以下各项所述的方法进行：Gene Targeting，APractical Approach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用了ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHA CO.，LTD.(1995)；等等。靶向载体可以使用替换类型或插入类型中的任一种。作为所述筛选方法，可以使用诸如阳性选择、启动子选择、阴性选择、聚腺苷酸(polyA)选择等的方法。
[0125] 作为用于从所选的细胞系中选择需要的同源重组子的方法，可列举用于基因组DNA的DNA杂交法(Southern hybridization method)、PCR法等。
[0126] 本发明中的“悬浮培养”或者“悬浮培养法”意指将细胞或细胞的聚集体维持在培养液中悬浮存在的状态下培养，及进行该培养的方法。即，悬浮培养为细胞或细胞的聚集体在与培养器材等不黏附的条件下进行，在与培养器材等黏附的条件下进行的培养(贴壁培养，或贴壁培养法)不包括在悬浮培养的范畴中。在该情况下，细胞黏附意指细胞或细胞的聚集体与培养器材之间形成强的细胞-基质间接合(cell-substratum junction)。更具体而言，悬浮培养意指在细胞或细胞的聚集体与培养器材等之间未形成强的细胞-基质间接合的条件下的培养，“贴壁培养”意指在细胞或细胞的聚集体与培养器材等之间形成强的细胞-基质间接合的条件下的培养。
[0127] 在悬浮培养中的细胞的聚集体中，细胞和细胞为面黏附(plane attachment)。在悬浮培养中的细胞的聚集体中，与培养器材等之间几乎不形成细胞-基质间接合、或即使形成，其贡献也是小的。在一些实施方式中，在悬浮培养中的细胞的聚集体中，聚集团块的内部存在内源的细胞-基质间接合，但是与培养器材等之间几乎不形成细胞-基质间接合、或即使形成，其贡献也是小的。从该观点出发，在“悬浮培养”的一种形态中，也可列举将细胞的聚集体固定于作为细胞的聚集体的构架的细针状的器材等，并在充满培养液的器材中进行培养的培养方法等。作为该培养方法，可列举日本药学会第136年会29AB-pm009中发表的使用株式会社Cyfuse制的生物3D打印“Regenova(注册商标)”的方法等。
[0128] 细胞-细胞发生面黏附，意指一个细胞以面与另一个细胞连接。更具体地，细胞-细胞面黏附意指例如，在一个细胞的表面积中，与另一个细胞的表面发生黏附的比例为，例如1％以上，优选3％以上，更优选5％以上。细胞的表面可以通过基于将膜染色的试剂(例如，DiI)的染色、细胞黏附分子(例如，E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白)的免疫染色而观察到。
[0129] 进行悬浮培养时使用的培养容器没有特别限制，只要其能够实现“悬浮培养”即可，并且本领域普通技术人员能够适当确定此类培养容器。作为这样的培养容器，可列举例如：烧瓶、组织培养瓶、平皿、皮氏培养皿、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、微孔、多联平板、多孔平板、室载玻片、盆、管、托盘、培养袋、旋转烧瓶或转瓶。为了能够实现悬浮培养，这些培养容器优选为非细胞黏附性的。作为非细胞黏附性的培养容器，可以使用培养容器的表面没有处于提高与细胞的黏附性的目的而进行了人工处理(例如：用基膜制剂，层粘连蛋白，巢蛋白，胶原蛋白，明胶等细胞外基质等，或聚赖氨酸，多聚鸟氨酸等高分子等进行的包被处理，或正电荷处理等表面加工)的那些等。作为非细胞黏附性的培养容器，可以使用培养容器的表面处于降低与细胞的黏附性的目的而进行了人工处理(例如：MPC聚合物等超亲水性处理，蛋白低吸附处理等)的那些等。可以使用旋转烧瓶、摇瓶等进行转管培养。培养容器的培养表面可以是平底的或可以具有凹陷和凸出。
[0130] 另一方面，作为用于进行贴壁培养时的培养容器，可列举培养容器的表面出于改善与细胞的黏附性的目的而进行了人工处理(例如：用基膜制剂，层粘连蛋白，巢蛋白，胶原蛋白，明胶，基质胶(Matrigel)，Synthemax，玻连蛋白等细胞外基质等，或聚赖氨酸，多聚鸟氨酸等高分子等进行的包被处理，或正电荷处理等表面加工)的那些。
[0131] 在本说明书中，细胞的“聚集体”(Aggregate)[細胞团块或细胞聚集体(Cell aggregate)]只要是多个细胞彼此黏附而形成了团块即可，没有特别限制，可以为在培养基中分散的细胞进行汇聚而形成的团块，可以源自通过细胞培养而形成的克隆，也可以为从另外的细胞团块新出芽、形成的细胞团块。在细胞的聚集体中，也包括胚样体(Embryoid body)，球体(Sphere)或球状体(Spheroid)。优选在细胞的聚集体中细胞彼此为面黏附。在一些实施方式中，在聚集体的一部分或全部中，有时细胞彼此形成了细胞-细胞间连接(cell-cell junction)或细胞黏附(cell adhesion)，例如黏附连接(adherence junction)。在聚集体中也包括作为从上述细胞团块得到的分生物质的细胞群体。
[0132] “均一聚集体”意指在培养多个聚集体时，各聚集体的大小是一定的，在用最大直径的长度来评价聚集体的大小时，均一聚集体指最大直径的分散较小。更具体而言，是指全部聚集体的群体中的75％以上的聚集体在该凝集团块的群体中最大直径的平均值±100％、优选为平均值±50％的范围内，更优选为平均值±20％的范围内。
[0133] “形成均一聚集体”意指，当细胞汇聚而形成细胞的聚集体进行悬浮培养时，通过使“给定数量的经分散的细胞迅速聚集”由此形成大小均一的细胞的聚集体。即，如果使多潜能干细胞迅速汇聚而形成多潜能干细胞的聚集体，则能够再现性良好地在由形成的聚集体诱导分化的细胞中形成上皮样结构。具体而言，可以在无血清培养基中使多潜能干细胞迅速凝聚，形成具有上皮样结构的细胞聚集体(SFEBq法(胚状体样聚集体的快速再聚集无血清悬浮培养法，Serum-free Floating culture of Embryoid Body-like aggregates with quick reaggregation))。
[0134] 作为形成该聚集体的实验操作，可列举例如：使用小孔的板(例如：孔的底面积用平底换算时为0.1～2.0cm2左右的板；96孔板)、微孔等将细胞控制在小空间中的方法，通过使用小的离心管进行短时间离心而使细胞聚集的方法等。
[0135] 作为小孔的板，可列举例如24孔板(面积用平底换算时为1.88cm2左右)、48孔板(面积用平底换算时为1.0cm2左右)、96孔板(面积用平底换算时为0.35cm2左右，内径6～8mm左右)、384孔板。优选地，可列举96孔板。关于小孔的板的形状，从上方看孔时底表面的形状可列举为多边形、长方形、椭圆形、正圆形，优选为正圆形。作为小孔的板的形状，从侧面看孔时的底表面的形状优选为外周部高而内凹部低的下凹结构，可列举为例如：U型底，V型底，μ型底、优选为U型底或V型底，最优选可列举为V型底。作为小孔的板，也可以使用细胞培养皿(例如：60mm～150mm平皿，培养瓶)的底表面具有凹凸或齿状的那些(例如EZSPHERE(旭Techno Glass))。小孔的板的底表面优选使用非细胞黏附性底表面，优选经前述非细胞黏附性包被的底表面。
[0136] “分散”意指将细胞、组织通过酶处理、物理处理等分散处理而分离成小的细胞块(2个细胞以上且100个细胞以下，优选为50个细胞以下)或单个细胞。给定数量的分散的细胞是细胞块或特定数量的单个细胞的汇聚。作为使多潜能干细胞的分散方法，可列举机械分散处理、细胞分散液处理和添加细胞保护剂的处理。这些处理可以联合进行。优选地进行细胞分散处理，然后进行机械分散处理。作为机械分散处理的方法，可列举吹打处理或利用刮刀的刮片操作。
[0137] 本说明书中的“组织”意指具有以下结构的细胞群体的结构体，在所述结构中，形态、性质不同的多种类型细胞以给定模式在空间上配置。
[0138] 本说明书中的“视网膜组织”意指在生物体视网膜中构成各视网膜层的视细胞，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，神经节细胞，视网膜色素上皮细胞，穆勒细胞，它们的前体细胞，神经视网膜祖细胞，或视网膜祖细胞等视网膜细胞中的至少多种类型(其中，在视网膜祖细胞的情况下，可能不包含其它视网膜细胞)以层状形式在空间上排列的组织。对各种细胞是否为构成任一种视网膜层的细胞而言，可采用公知的方法通过例如有无细胞标记的表达或其水平等确认。
[0139] 作为本说明书中的“视网膜组织”，可列举通过将多潜能干细胞诱导分化而得到的视网膜组织，或源自生物体的视网膜组织。具体而言，可列举通过将由多潜能干细胞形成的聚集体在适当的诱导分化条件下悬浮培养而得到的，具有在上述聚集体的表面形成的包含视网膜祖细胞和/或神经视网膜祖细胞等的上皮组织的细胞聚集体、或其的一部分。
[0140] 本说明书中的“包含视网膜组织的细胞聚集体”只要是包含上述视网膜组织的细胞聚集体即可，没有特别限制。
[0141] 本说明书中的“视网膜层”意指构成视网膜的任意各个层，具体而言可列举视网膜色素上皮层及神经视网膜层，在神经视网膜层中包括外界膜，视细胞层(外核层)，外网织层，内核层，内网织层，神经节细胞层，神经纤维层及内界膜。另外，在处于从后述的“发育早期阶段的视网膜组织”到达成熟的视网膜组织之前的中途阶段的视网膜组织中，神经视网膜层包括：神经视网膜组织中的被称为成神经细胞层的包含神经视网膜祖细胞的层。
[0142] 本说明书中的“视网膜祖细胞(retinal progenitor cell)”意指可分化成任一种构成视网膜组织的成熟的视网膜细胞的前体细胞，所述成熟的视网膜细胞包括：视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、穆勒细胞。
[0143] 本说明书中的“神经视网膜祖细胞(neural retinal progenitor)”为命运在于成为视杯(optic cup)的内层的细胞，可列举可分化成任一种构成不包括视网膜色素上皮的神经视网膜层(包含视网膜层特异性神经细胞的视网膜层)的成熟的细胞的前体细胞。
[0144] 视细胞前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、神经节细胞前体细胞、视网膜色素上皮前体细胞分别意指确定分化成视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞、视网膜色素上皮细胞的前体细胞。其中，分化阶段是连续的，例如，明确地区分从视细胞前体细胞过渡到向视细胞分化的阶段的界线是很难的。为此，在本说明书中，在描述视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞或视网膜色素上皮细胞等的情况下，可以包括各自的前体细胞。反过来，在描述视细胞前体细胞，水平细胞前体细胞，双极细胞前体细胞，无长突细胞前体细胞，神经节细胞前体细胞，或视网膜色素上皮细胞前体细胞等情况下，也可以包括各自分化成的细胞，即，视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞或视网膜色素上皮细胞等。
[0145] 本说明书中的“视网膜层特异性神经细胞”是构成视网膜层的细胞且为视网膜层特异性的神经细胞。作为视网膜层特异性神经细胞，可列举：双极细胞、神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、视细胞，作为视细胞可列举：视杆细胞(Rod photoreceptor cell)及视锥细胞(Cone photoreceptor cell)等。另外，作为视锥细胞，可列举表达S-视蛋白(S-opsin)而接受蓝色光的S视锥细胞，表达L-视蛋白(L-opsin)而接受红色光的L视锥细胞，及表达M-视蛋白(M-opsin)而接受绿色光的M视锥细胞。
[0146] 在本说明书中的“视网膜细胞”是指，包括上述的视网膜色素上皮细胞、穆勒细胞、视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞及它们的前体细胞、视网膜祖细胞、神经视网膜祖细胞、以及视网膜层特异性神经细胞及视网膜层特异性神经细胞的前体细胞的概念。
[0147] 对上述的构成视网膜组织的细胞而言，可以将在各自中表达或者不表达的视网膜细胞标记作为指标进行检测或者鉴定。
[0148] 作为视网膜细胞标记，可列举在视网膜细胞中优势表达的基因、蛋白质，针对各个细胞中的每个，可以如下所述例示。或者，也可以将在视网膜细胞以外优势表达的基因、蛋白质用作阴性标记。
[0149] 作为视网膜祖细胞，神经视网膜祖细胞，视细胞前体细胞等视网膜细胞的阴性标记，可列举在下丘脑神经元的前体细胞中表达而在视网膜祖细胞中不表达的NKX2.1，在下丘脑神经上皮中表达而在视网膜中不表达的SOX1等。
[0150] 作为视网膜祖细胞的标记，可列举RX(也称为RAX)及PAX6。
[0151] 作为神经视网膜祖细胞的标记，可列举RX，PAX6及CHX10。
[0152] 作为视网膜层特异性的神经细胞的标记，可列举在双极细胞中强表达的CHX10，在双极细胞中表达的PKCα，Goα，VSX1及L7，在神经节细胞中表达的TUJ1及BRN3，在无长突细胞中表达的钙视网膜蛋白(Calretinin)及HPC-1，在水平细胞中表达的钙结合蛋白(Calbindin)，LIM1等。
[0153] 另外，作为在视细胞前体细胞及视细胞中表达的标记，可列举CRX，恢复蛋白(Recoverin)，BLIMP1及OTX2等。进一步，作为在视杆细胞及视杆细胞前体细胞中表达的标记，可列举NRL，视紫质(Rhodopsin)等。因此，可以例如以CRX阳性细胞为NRL阳性为指标而鉴定视杆细胞及视杆细胞前体细胞。作为在视锥细胞，视锥细胞前体细胞及神经节细胞中表达的标记，可列举RXR-γ。另外，作为在视锥细胞及视锥细胞前体细胞中表达的标记，可列举TRβ2，或TRβ1。例如，视锥细胞前体细胞可以以共表达TRβ2及CRX，或TRβ1及CRX为指标进行鉴定。另外，视锥细胞前体细胞也可以以共表达RXR-γ及CRX，不表达NRL为指标进行鉴定。
[0154] 另外，OC1(ONECUT1/HNF6)及OC2(ONECUT2)对视锥细胞前体细胞的分化是必要的，为在分化时一过性地表达的因子。另外，在神经节细胞的一部分，水平细胞，一部分的无长突细胞中也有表达。例如，在从表达OC1及OC2的视锥细胞前体细胞或视锥细胞及水平细胞的祖细胞分化为视锥细胞前体细胞或视锥细胞及水平细胞时，在视锥细胞前体细胞或视锥细胞中，OC1及OC2的表达降低，与此相对，在水平细胞中OC1及OC2的表达升高。因此，可以通过测定其表达量或比例而判定视锥细胞前体细胞的分化效率。
[0155] 另外，对为视锥细胞及视锥细胞前体细胞被诱导，视杆细胞前体细胞出现之前的阶段的视网膜组织而言，可以以CRX阳性细胞为NRL阴性且TRβ2阳性，或为NRL阴性且RXR-γ阳性作为指标而确认。虽然OTX2为除了视细胞前体细胞及视细胞以外，在双极细胞中也表达的标记，但在神经视网膜组织中包含的OTX2阳性细胞，如果为CHX10阴性且NRL阴性，则能够用作视锥细胞前体细胞及视锥细胞的标记。另一方面，神经视网膜组织中包含的OTX2阳性中的NRL阳性细胞能够鉴定为视杆细胞前体细胞及视杆细胞。
[0156] 进一步，作为S视锥细胞的标记、L视锥细胞的标记及M视锥细胞的标记，可分别列举S-视蛋白，L-视蛋白，M-视蛋白。
[0157] 作为在水平细胞，无长突细胞及神经节细胞中共同表达的标记，可列举PAX6等。
[0158] 此外，作为在视网膜组织中包含的视网膜细胞的标记，可列举在视网膜色素上皮细胞中表达的RPE65，MITF及PAX6，在穆勒细胞中表达的CRABP及CRALBP等。
[0159] 视网膜组织中的背侧标记及腹侧标记是指在视网膜组织中，分别在相当于背侧及腹侧的组织中表达的基因、蛋白质。
[0160] 作为背侧标记，可列举在视网膜组织中，在神经视网膜组织的背侧化区域中表达的TBX5，TBX3，TBX2，COUP-TF II，CYP26A1，CYP26C1及ALDH1A1等标记。这之中，COUP-TF II可以分类为“最背侧的标记”，ALDH1A1也是随着靠近该区域而其表达量升高的因子。另外，作为腹侧标记，可列举在神经视网膜组织的腹侧区域中表达的VAX2，COUP-TF I及ALDH1A3等标记。
[0161] 本说明书中的“无血清培养基”意指不包含未调节或未纯化的血清的培养基。在本说明书中，将混入有经过纯化的血液来源的成分、动物组织来源的成分(例如：生长因子)的培养基也包括在不包含未调节或未纯化的血清的限度的无血清培养基中。
[0162] 本说明书中的“无血清条件”意指不包含未调节或未纯化的血清的条件，具体而言是指使用无血清培养基的条件。
[0163] 在此，无血清培养基任选含有血清代替物。作为血清代替物，可列举适当含有例如：白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫醇甘油，或它们的等效物等的那些。此种血清代替物可以通过例如：WO98/30679中记载的方法制备。作为血清代替物也可以利用市售品。作为此种市售的血清代替物，可列举例如：KnockoutTM血清替代品(Life Technologies公司，下文中有时也被称为KSR)，化学成分确定的脂质浓缩物(Chemically Defined Lipid Concentrate，由Life Technologies公司制)，GlutamaxTM(由Life Technologies公司制)，B27(由Life Technologies公司制)，N2(由Life Technologies公司制)。
[0165] 为避免复杂的制备，作为此种无血清培养基，可以使用添加有适量的市售的KSR(由Life Technology公司制)(例如：约0.5％～约30％、优选为约1％～约20％)的无血清培养基(例如：在F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合液中添加了10％KSR及450μM 1-一硫代甘油的培养基)。另外，作为KSR相当的产品，可列举在日本特表2001-508302中公开的培养基。
[0166] 本说明书中的“含血清培养基”意指包含未调节或未纯化的血清的培养基。所述培养基可以含有脂肪酸、脂质、氨基酸(例如、非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、1.一硫代甘油、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。另外，含血清培养基可以使用在维持由本发明制备的视网膜细胞或视网膜组织的步骤中(Cell Stem Cell，10(6)，771-775(2012))。
[0167] 也可以在上述无血清培养基或含血清培养基中添加已知的生长因子、蛋白质、促进增殖的添加剂或化学物质等。作为已知的生长因子、蛋白质，可列举：EGF、FGF、IGF、胰岛素等。作为促进增殖的添加剂，可列举N2补充剂(N2，Invitrogen公司)，B27补充剂(Invitrogen公司)等。作为促进增殖的化学物质，可列举：类视黄醇类(例如：视黄酸或其衍生物)、牛磺酸、谷氨酰胺等。
[0168] 在本说明书中，“Zeno free”是指已将源自与培养对象的细胞的生物种类不同的生物种类的成分排除的条件。
[0169] 在本发明中，“包含物质X的培养基”“在物质X的存在下”是指添加了外源性(exogenous)的物质X的培养基或包含外源性的物质X的培养基、或在外源性的物质X的存在下。即，当在该培养基中存在的细胞或组织内源性(endogenous)表达、分泌或产生该物质X时，应理解为将内在的物质X与外源性的物质X相区别，即使不包含外源性的物质X的培养基包含有内源性物质X，也不符合“包含物质X的培养基”的范畴。
[0170] 例如，“包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基”是指，添加了外源性的甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基或包含外源性的甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基，在“甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下”是指在外源性的甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下。另外，“不包含BMP信号转导途径抑制物质的培养基”是指，没有添加外源性的BMP信号转导途径抑制物质的培养基或不包含外源性的BMP信号转导途径抑制物质的培养基。
[0171] 在本说明书中，甲状腺激素信号转导途径作用物质是指能增强由甲状腺激素介导的信号转导的物质，没有特别的限定，只要是能增强甲状腺激素信号转导途径的即可。作为甲状腺激素信号转导途径作用物质，可列举例如：三碘甲状腺原氨酸(下文中，有时简写为T3)，甲状腺素(下文中，有时简写为T4)，甲状腺激素受体(优选为TRβ受体)激动剂等。
[0172] 另外，作为本领域技术人员众所周知的甲状腺激素受体激动剂，可列举国际公开第97/21993号公报，国际公开第2004/066929号公报，国际公开第2004/093799号，国际公开第2000/039077号公报，国际公开第200I/098256号公报，国际公开第2003/018515号公报，国际公开第2003/084915号公报，国际公开第2002/094319号公报，国际公开第2003/064369号公报，日本特开2002-053564号公报，日本特开2002-370978号公报，日本特开2000-256190号公报，国际公开第2007/132475号公报，国际公开第2007/009913号公报，国际公开第2003/094845号公报，国际公开第2002/051805号公报或国际公开第2010/122980号公报中记载的二苯基甲烷衍生物，二芳基醚衍生物，哒嗪衍生物，吡啶衍生物或者吲哚衍生物等化合物。
[0173] 2.发育早期阶段的视网膜组织的制备
[0174] 在本说明书中，“发育早期阶段”意指出现了视网膜祖细胞但未出现神经节细胞的阶段。该阶段中，神经视网膜祖细胞也可以出现。
[0175] 即，在该阶段中，包含RX(RAX)阳性及PAX6阳性(并且可为CHX10阳性细胞)的细胞，而不包含TUJ1阳性细胞，BRN3阳性细胞，及TUJ1，BRN3及PAX6中至少2种标记为阳性细胞。对“发育早期阶段的视网膜组织”而言，只要包含视网膜祖细胞和/或神经视网膜祖细胞，即可分化成视细胞及神经节细胞的细胞，而不包含神经节细胞即可，没有特别限制，可以包含睫状缘区结构体。
[0176] 发育早期阶段的视网膜组织，例如在按照后述的原料制备方法5～7制备的情况下，相当于悬浮培养开始后第22天(d22)～第33天(d33)，在按照原料制备方法1～4制备的情况下，相当于悬浮培养开始后第12天(d12)～第27天(d27)。
[0177] “发育早期阶段的视网膜组织”可以通过确认视网膜祖细胞标记、神经视网膜祖细胞标记及神经节细胞标记的表达情况而鉴定。
[0178] 在发育早期阶段的视网膜组织中包含相当于“视泡”的那些或“视杯的最早期”的视网膜组织，其中，所述“视杯的最早期”的视网膜组织中包含从视泡稍稍进行了分化的为RX阳性、PAX6阳性及CHX10阳性的神经视网膜祖细胞、且不存在神经节细胞。
[0179] 作为发育早期阶段的视网膜组织，可列举由多潜能干细胞诱导分化的，包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞，且处于未出现神经节细胞的分化阶段的视网膜组织。进一步，发育早期阶段的视网膜组织中可以包含能分化为视细胞或者神经细胞的细胞。对制备发育早期阶段的视网膜组织的方法没有特别限制，还可以为悬浮培养、贴壁培养中的任一种培养方法。
[0180] 具体而言，可列举将由ES细胞或者iPS细胞等多潜能干细胞采用SFEBq法(参考Nat Commun.6：6286(2015))制备的聚集体(细胞团块)在BMP4等分化诱导剂的存在下进行悬浮培养，由此得到的包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0181] 另外，发育早期阶段的视网膜组织可以为由包含神经上皮细胞的细胞群体诱导的细胞，上述细胞群体可以由ES细胞或者iPS细胞等多潜能干细胞进行诱导分化，或也可收集在成人的视网膜中存在的干细胞并进行诱导分化而获得。
[0182] 对发育早期阶段的视网膜组织而言，具体而言为视网膜祖细胞标记阳性(优选地，RX阳性且PAX6阳性)的视网膜祖细胞，或神经视网膜祖细胞标记阳性(优选地，CHX10阳性且PAX6阳性且RX阳性)的神经视网膜祖细胞的含量为视网膜组织中包含的总细胞数的30％以上、优选为50％以上、更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，进一步更优选为99％以上的视网膜组织，所述视网膜组织中神经节细胞标记阳性(优选地，BRN3阳性)的神经节细胞的比例为总细胞数的40％以下、优选为20％以下，10％以下，5％以下，更优选为1％以下，进一步优选为0.1％以下，进一步更优选为0.01％以下。
[0183] 对从人iPS细胞等多潜能干细胞制备发育早期阶段的视网膜组织的方法进行说明。
[0184] 人iPS细胞等多潜能干细胞能够采用如上所述的本领域技术人员众所周知的方法获取或制备，进行维持培养及放大培养。多潜能干细胞的维持培养、放大培养可以利用悬浮培养也可以利用贴壁培养实施，但优选利用贴壁培养实施。多潜能干细胞的维持培养、放大培养可以在饲养层细胞存在下实施，也可以在不存在饲养层细胞下(无饲养层)实施，优选在不存在饲养层细胞下实施。
[0185] 使用经维持培养的多潜能干细胞，采用本领域技术人员众所周知的方法，能够制备发育早期阶段的视网膜组织。作为这些方法，可列举：WO2013/077425(&US2014/341864)，WO2015/025967(&US2016/251616)，WO2016/063985，WO2016/063986及WO2017/183732中记载的方法等。另外，作为这些方法，可列举非专利文献：Proc Natl Acad Sci U S A.111(23)：8518-8523(2014)，Nat Commun.5：4047(2014)，Stem Cells.(2017)：35(5)，1176-1188等中记载的方法等。
[0186] 2-1.原料制备方法1
[0187] 作为制备发育早期阶段的视网膜组织的优选一种实施方式，WO2015/025967中记载的，可列举以下包括步骤的方法：
[0188] (1)第一步骤，通过在无血清培养基中悬浮培养多潜能干细胞而使其形成细胞的聚集体；
[0189] (2)第二步骤，将在第一步骤中形成的聚集体在不含SHH信号转导途径作用物质而包含BMP信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养，得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0190] 采用该方法得到的包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体，能够用作作为本发明的方法使用的起始物质的发育早期阶段的视网膜组织。
[0191] [对于第一步骤]
[0192] 第一步骤可以按照WO2015/025967(&US2014/341864)中记载的方法进行。即，在第一步骤中，通过在无血清培养基中悬浮培养多潜能干细胞而使其形成细胞的聚集体。
[0193] 在第一步骤中使用的无血清培养基只要是上文提及的那些即可，没有特别限制。例如，可以使用不添加BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径抑制物质两者的无血清培养基。为了避免复杂的制备，优选使用例如：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基(例如：在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加了10％KSR，450μM 1-一硫代甘油及
1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基)。作为血清代替物，也可以在无血清培养基中以
0.1mg/mL～20mg/mL、优选为4mg/mL～6mg/mL左右的浓度添加牛血清白蛋白(BSA)。另外，关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES细胞或者人iPS细胞的情况下，通常为约
1％～约20％、优选为约2％～约20％。
1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基)。作为血清代替物，也可以在无血清培养基中以
0.1mg/mL～20mg/mL、优选为4mg/mL～6mg/mL左右的浓度添加牛血清白蛋白(BSA)。另外，关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES细胞或者人iPS细胞的情况下，通常为约
1％～约20％、优选为约2％～约20％。
[0194] 第一步骤中的培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
[0195] 第一步骤中可使用的多潜能干细胞的浓度可以以使更均一，更有效地形成多潜能干细胞的聚集体的方式适当设定。例如使用96孔板悬浮培养人ES细胞时，将配制使得每孔约1×103～约1×105细胞、优选为约3×103～约5×104细胞，更优选为约5×103～约3×104细胞，进一步更优选为约0.9×104～1.2×104细胞的液体添加于孔中，将板静置而形成聚集体。
[0196] 用于形成聚集体所必需的悬浮培养的时间能够根据使用的多潜能干细胞而适当确定，但为了形成均一聚集体，优选为尽可能短的时间(例如：SFEBq法)。从经分散的细胞到形成细胞聚集体的步骤可分为：细胞发生汇聚的步骤；及汇聚的细胞形成细胞聚集体的步骤。对从接种经分散的细胞的时刻(即，悬浮培养开始时)到细胞发生汇聚为止，例如：在为人ES细胞或者人iPS细胞的情况下、优选为约24小时以内，更优选为约12小时以内形成聚集体。对从接种经分散的细胞的时刻(即，悬浮培养开始时)到形成细胞聚集体的时间而言，例如：在为人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)的情况下，优选为约72小时以内，更优选为约48小时以内。该形成细胞聚集体的时间可以通过控制使细胞聚集的工具、离心条件等而适当调节。
[0197] 对细胞的聚集体的形成而言，可以基于聚集体的尺寸及细胞数目，宏观形态，采用组织染色分析的微观形态及其均一性、分化及未分化标记的表达及其均一性、分化标记的表达控制及其同步性、聚集体间的分化效率的再现性等而判断。
[0198] [对于第二步骤]
[0199] 对于第二步骤进行说明，所述第二步骤在不含SHH信号转导途径作用物质而包含BMP信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养在上述第一步骤中形成的聚集体，得到作为发育早期阶段的视网膜组织的包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0200] 在第二步骤中使用的培养基，例如为不添加SHH信号转导途径作用物质而添加了BMP信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基，不是必需添加基膜制剂。用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，其可以是上文提及的那些。为了避免复杂的制备，优选使用例如：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基(例如：在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加了10％KSR，450μM 1-一硫代甘油及1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基)。作为血清代替物，也可以在无血清培养基中以0.1mg/mL～20mg/mL、优选为4mg/mL～6mg/mL左右的浓度添加BSA。另外，关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES细胞的情况下通常为约1％～约20％、优选为约2％～约20％。
[0201] 对第二步骤中使用的无血清培养基而言，只要第一步骤中使用的无血清培养基不包含SHH信号转导途径作用物质，则也可以直接使用该培养基，也可以更换为新的无血清培养基。在将第一步骤中使用的不包含BMP信号转导途径物质的无血清培养基直接用于第二步骤的情况下，只要向培养基中添加BMP信号转导途径作用物质即可。
[0202] 在“不包含SHH信号转导途径作用物质”的培养基中，包括实质上不含SHH信号转导途径作用物质的培养基，例如不含有对向视网膜祖细胞及视网膜组织的选择性分化造成不利影响的程度的浓度的SHH信号转导途径作用物质的培养基。
[0203] 在“未添加SHH信号转导途径作用物质”的培养基中，也包括实质上未添加SHH信号转导途径作用物质的培养基，例如：未添加对向视网膜祖细胞及视网膜组织的选择性分化造成不利影响的程度的浓度的SHH信号转导途径作用物质的培养基。
[0204] 作为第二步骤中使用的BMP信号转导途径作用物质，可列举例如BMP2，BMP4或者BMP7等BMP蛋白，GDF7等GDF蛋白，抗BMP受体抗体，或BMP部分肽等。BMP2，BMP4及BMP7可获自例如R&D Systems，GDF7可获自例如和光纯药公司。作为BMP信号转导途径作用物质，可列举优选为BMP4。
[0205] 第二步骤中使用的BMP信号转导途径作用物质的浓度，只要为能够诱导上述由第一步骤得到的聚集体中包含的细胞向视网膜细胞的分化的浓度即可。例如当为BMP4时，在培养基中添加使得为约0.01nM～约1μM、优选为约0.1nM～约100nM，更优选为约1nM～约10nM，进一步优选为约1.5nM(55ng/mL)的浓度。在使用除了BMP4以外的BMP信号转导途径作用物质的情况下，优选以起到与上述BMP4的浓度同等的BMP信号转导途径活化作用的浓度进行使用。
[0206] BMP信号转导途径作用物质只要在第一步骤的悬浮培养开始～约24小时后以后添加即可，也可以在第一步骤的悬浮培养开始后数天以内(例如：15天以内)添加到培养基中。将BMP信号转导途径作用物质在悬浮培养开始后优选第1～15天，更优选为第1～9天，进一步优选为第2～9天，进一步优选为第3～8天，更进一步优选为第3～6天，进一步更优选为第
6天添加到培养基中。
6天添加到培养基中。
[0207] 在将BMP信号转导途径作用物质添加到培养基中而启动了将由第一步骤得到的聚集体中包含的细胞向视网膜细胞的诱导分化后，不需要进一步将BMP信号转导途径作用物质添加到培养基中，使用不包含BMP信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基进行培养基更换即可。
[0208] 或者，也可以在第二步骤的期间使培养基中BMP信号转导途径作用物质的浓度改变。例如，也可以在第二步骤的开始时使BMP信号转导途径作用物质为上述范围，每2～4天以减少40～60％的比例缓慢或逐步地降低该浓度。
[0209] 作为具体实施方式，可以在悬浮培养开始后(即上述第一步骤的开始后)第1～9天、优选为第2～9天，进一步优选为第3～8天，更进一步优选为第3～6天将培养基的一部分或全部更换为含BMP4的培养基，将BMP4的终浓度调整为约1～10nM，在BMP4的存在下培养例如1～16天、优选为2～9天，进一步优选为6～9天。另外，电能够进行更长期，具体而言20天以上，30天以上的培养。即，在第二步骤中，对在BMP信号转导途径作用物质的存在下进行的培养而言，可将由第一步骤得到的聚集体向发育早期阶段的视网膜组织进行诱导分化为止的期间适当继续，具体而言在添加BMP信号转导途径作用物质后6～12天能够得到发育早期阶段的视网膜组织。
[0210] 用于本文时，为了将BMP4的浓度维持在相同浓度，可以将培养基的一部分或全部更换为含BMP4的培养基1次或2次左右。或如上所述，也可以逐步减小BMP4的浓度。
[0211] 在一种实施方式中，启动在包含BMP信号转导途径作用物质的培养基中的培养后，可以通过基于不包含BMP信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基的培养基更换，由此将培养基中的BMP信号转导途径作用物质的浓度每2～4天以减少40～60％的比例缓慢或逐步降低。
[0212] 可以通过检测例如该组织中细胞中的视网膜祖细胞标记、神经视网膜祖细胞标记的表达来确认已向发育早期阶段的视网膜组织诱导分化。将通过使用在RX基因座中敲入GFP等荧光报告蛋白基因的多潜能干细胞在第一步骤中形成的聚集体，在向视网膜细胞的诱导分化所必需的浓度的BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，检测由表达的荧光报告蛋白发射的荧光，由此也可以确认向视网膜细胞的诱导分化开始的时间。
[0213] 作为第二步骤的实施方式之一，可列举将在第一步骤中形成的聚集体在包含向视网膜细胞的诱导分化所必需的浓度的BMP信号转导途径作用物质而不包含SHH信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养，直到开始表达视网膜祖细胞标记、神经视网膜祖细胞标记(例如，RX，PAX6，CHX10)的细胞出现，由此得到作为发育早期阶段的视网膜组织而包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体的步骤。
[0214] 在第二步骤中，在进行培养基更换操作的情况下，可列举例如：不丢弃原有培养基且加入新培养基的操作(添加培养基操作)，弃掉半量左右(原有培养基的体积量的40～80％左右)的原有培养基且加入半量左右(原有培养基的体积量的40～80％)的新培养基的操作(半量培养基更换操作)，和弃掉全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的原有培养基且加入全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的新培养基的操作(全量培养基更换操作)。
[0215] 当在特定时间点添加特定成分(例如：BMP4)时，例如可以进行这样的操作：在计算终浓度的基础上，弃掉半量左右的原有培养基，并且加入半量左右的新培养基的操作，所述新培养基包含比终浓度高的浓度(具体而言，为终浓度的1.5～3.0倍，例如终浓度的约2倍的浓度)的特定的成分(半量培养基更换操作，半量培养基更换)。
[0216] 当在特定时间点维持原有培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉半量左右的原有培养基，并且添加半量左右的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与原有培养基中相同的特定成分。
[0217] 当通过在特定时间点稀释而降低原有培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点的稀释降低原有培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
[0218] 培养基更换操作中使用的工具没有特别限制，可列举例如：移液管、微量移液管、多通道微量移液管、连续的分配器等。例如，使用96孔板作为培养容器的情况下，可以使用多通道微量移液管。
[0219] 在优选实施方式中，当换算为SAG的SHH信号转导促进活性时，第二步骤中使用的培养基中SHH信号转导途径作用物质的浓度为700nM以下、优选为300nM以下，更优选为10nM以下，进一步优选为0.1nM以下，进一步优选不包含SHH信号转导途径作用物质。在“不包含SHH信号转导途径作用物质”的培养基中，也包括实质上不含SHH信号转导途径作用物质的培养基，例如：不含有对向视网膜祖细胞及视网膜组织的选择性分化造成不利影响的程度的浓度的SHH信号转导途径作用物质的培养基。在“未添加SHH信号转导途径作用物质”的培养基中，也包括实质上未添加SHH信号转导途径作用物质的培养基，例如：未添加对向视网膜祖细胞及视网膜组织的选择性分化造成不利影响的程度的浓度的SHH信号转导途径作用物质的培养基。
[0220] 第二步骤中的培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
[0221] 通过所述培养，可诱导从由第一步骤得到的形成聚集体的细胞向发育早期阶段的视网膜组织的分化。可以通过检测在聚集体中包含表达例如作为视网膜祖细胞的标记的RX，PAX6，或作为神经视网膜祖细胞的标记的RX，PAX6，CHX10的细胞，从而确认得到了作为发育早期阶段的视网膜组织，包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0222] 作为第二步骤的实施方式之一，可列举将在第一步骤中形成的聚集体在包含向视网膜细胞的诱导分化所必需的浓度的BMP信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养，直到表达RX基因的细胞开始出现，由此得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体的步骤。在一种实施方式中，实施第二步骤的培养直至聚集体中包含的细胞的20％以上(优选为30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、80％以上)变为表达RX的状态为止。
[0223] 采用上述方法得到的聚集体，在经不包含SHH信号转导途径作用物质、BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质中的任一种的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养后，能够用作作为本发明的制备方法的原料的发育早期阶段的视网膜组织。该悬浮培养的期间只要为直至神经节细胞出现的期间即可，没有特别限制，可列举1天～50天、优选为1天～15天，更优选为1天～7天。
[0224] 上述悬浮培养中使用的培养基例如为未添加：SHH信号转导途径作用物质、BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质中的任一种的无血清培养基或含血清培养基。
[0225] 在“不包含SHH信号转导途径作用物质、BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质中的任一种”培养基中，也包括实质上不含SHH信号转导途径作用物质、BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质中的任一种的培养基，例如，不含有对向视网膜组织的选择性分化造成不利影响的程度的浓度的SHH信号转导途径作用物质、BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质的培养基。
[0226] 在“未添加SHH信号转导途径作用物质、BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质中的任一种”的培养基中，也包括实质上未添加SHH信号转导途径作用物质、BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质中的任一种的培养基，例如，未添加对向视网膜组织的选择性分化造成不利影响的程度的浓度的SHH信号转导途径作用物质、BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质的培养基。
[0227] 用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，其可以是上文提及的那些。为了避免复杂的制备，优选使用例如：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基(例如：在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加了10％KSR，450μM 1-一硫代甘油及1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基)。在无血清培养基中，也可以以0.1mg/mL-20mg/mL、优选为4mg/mL-6mg/mL添加牛血清白蛋白(BSA)。另外，关于向无血清培养基的KSR的添加量，例如在人ES细胞的情况下通常为约1％～约20％、优选为约2％～约20％。另外，为了避免含血清培养基的复杂的制备，更优选使用适量添加了市售的血清的含血清培养基(例如：在DMEM和F-12的1∶1的混合液中添加了血清，N2补充剂的培养基)。作为向含血清培养基的血清的添加量，例如在人ES细胞的情况下通常为约1％～约20％、优选为约2％～约20％。
上述培养基中均可以添加使用牛磺酸等。
上述培养基中均可以添加使用牛磺酸等。
[0228] 培养温度、CO2浓度，O2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。O2浓度为约5％以上，例如约20％～约70％、优选为约20％～约60％，更优选为约20％～约40％，特别优选为约
20％。
20％。
[0229] 如上所述，可以通过测定RX及PAX6等视网膜祖细胞标记，CHX10，RX及PAX6等神经视网膜祖细胞标记，BRN3等神经节细胞标记中的至少1个的表达情况，由此鉴定由原料制备方法1得到的视网膜组织处于发育早期阶段，即，包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞，且未出现神经节细胞的发育早期的分化阶段。即，可以确认处于以下分化阶段：表达视网膜祖细胞标记和/或神经视网膜祖细胞标记的细胞的含量为视网膜组织中包含的全部细胞中的30％以上、优选为50％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、更进一步优选为99％以上，且表达神经节细胞标记的细胞为视网膜组织中包含的细胞的40％以下，优选为20％以下，10％以下，5％以下，1％以下，进一步优选为0.1％以下，进一步更优选为0.01％以下。此时，对于腹侧标记和/或最背侧的标记(例如：ALDH1A3和/或ALDH1A1)的表达而言，不构成问题，均可以是能由背侧化信号转导物质抑制或促进的分化阶段。
[0230] 2-2.原料制备方法2
[0231] 作为制备发育早期阶段的视网膜组织的优选一种实施方式，可列举WO2016/063985或WO2017/183732中记载的包括以下步骤的方法：
[0232] (1)第一步骤，在不存在饲养层细胞下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质，以及2)用于维持未分化的因子的培养基中培养多潜能干细胞，
[0233] (2)第二步骤，悬浮培养由第一步骤得到的细胞，使其形成细胞的聚集体；及(3)第三步骤，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养第二步骤中得到的聚集体，得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0234] 采用该方法得到的包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体，能够作为发育早期阶段的视网膜组织而用作本发明的方法使用的起始物质。
[0235] [对于第一步骤]
[0236] 第一步骤可以按照WO2016/063985中记载的方法进行。即，第一步骤中的不存在饲养层细胞下(下文中，也称为无饲养细胞)意指实质上不含饲养层细胞(例如：相对于总细胞数，饲养层细胞数的比例为3％以下)的条件。优选在不包含饲养层细胞的条件中实施第一步骤。对第一步骤中使用的培养基没有特别限制，只要是在无饲养细胞条件下能够实现多潜能干细胞的维持未分化的培养的培养基(无饲养细胞培养基)即可，为了能够实现维持未分化的培养而优选包含用于维持未分化的因子。
[0237] 用于维持未分化的因子没有特别限制，只要是具有抑制多潜能干细胞的分化的作用的物质即可。作为本领域技术人员广泛使用的用于维持未分化的因子，可列举：FGF信号转导途径作用物质、TGFβ家族信号转导途径作用物质、胰岛素等。关于FGF信号转导途径作用物质，具体而言可列举成纤维细胞生长因子(例如：bFGF、FGF4、FGF8)。另外，关于TGFβ家族信号转导途径作用物质，可列举：TGFβ信号转导途径作用物质，Nodal/激活蛋白(Activin)信号转导途径作用物质。作为TGFβ信号转导途径作用物质，可列举例如：TGFβ1、TGFβ2。作为Nodal/激活蛋白信号转导途径作用物质，可列举例如：Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B。培养人多潜能干细胞(人ES细胞，人iPS细胞)时，对于第一步骤中的培养基，优选作为用于维持未分化的因子包含bFGF。
[0238] 本发明使用的用于维持未分化的因子没有特别限制，只要是源自哺乳动物的用于维持未分化的因子即可，优选可使用与培养的细胞为同一种哺乳动物的用于维持未分化的因子。例如，在人多潜能干细胞的培养中，使用人的用于维持未分化的因子(例如，bFGF、FGF4，FGF8，EGF，Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，TGFβ1，TGFβ2等)，可以将分离的用于维持未分化的因子进行外部性(或外源性)添加。或者，也可以在第一步骤中使用的培养基中预先添加用于维持未分化的因子。
[0239] 第一步骤中使用的培养基中的用于维持未分化的因子浓度是能够维持培养的多潜能干细胞的未分化状态的浓度，可以由本领域技术人员适当设定。例如，具体而言，当作为用于维持未分化的因子在不存在饲养层细胞下使用bFGF的情况下，其浓度通常为4ng～500ng/mL左右、优选为10ng～200ng/mL左右，更优选为30ng～150ng/mL左右。
[0240] 作为包含用于维持未分化的因子而能够用于培养多潜能干细胞的无饲养细胞培养基，已经开发、市售了众多合成的培养基，可列举例如Essential 8培养基(Life Technologies公司制)。Essential 8培养基是在DMEM/F12培养基中作为添加剂包含以下各项：L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/L)，硒酸钠(14μg/L)，胰岛素(19.4mg/L)，NaHCO3(543mg/L)，转铁蛋白(10.7mg/L)，bFGF(100ng/mL)，及TGFβ家族信号转导途径作用物质(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods，8，424-429(2011))。作为其他的市售的无饲养细胞培养基，可列举：S-medium(DS Pharma Biomedical公司制)，StemPro(Life Technologies公司制)，hESF9(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2008Sep 9；105(36)：13409-14)，mTeSR1(STEMCELL Technologies公司制)，mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)，TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司制)，或StemFit(Ajinomoto Co.，Inc.制)。通过在上述第一步骤中使用这些，可以简便地实施本发明。
[0241] 关于第一步骤中的多潜能干细胞的培养，可以在悬浮培养及贴壁培养中的任一种条件下进行，优选为通过贴壁培养进行。
[0242] 进行贴壁培养时使用的培养容器没有特别限制，能进行“贴壁培养”即可，优选为细胞黏附性的培养容器。作为细胞黏附性的培养容器，可列举培养容器的表面出于提高与细胞的黏附性的目的而进行了人工处理的培养容器，具体而言可列举上述的内部由涂层剂涂层的培养容器。作为涂层剂，可列举例如：层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(以下称为层粘连蛋白511)、层粘连蛋白α1β1γ1(以下称为层粘连蛋白111)等及层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)]、巢蛋白、胶原蛋白、明胶、玻连蛋白(Vitronectin)、Synthemax(Corning公司)、基质胶(Matrigel)等细胞外基质等，或聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等高分子等。另外，也可以使用经过正电荷处理等表面加工的培养容器。优选可列举层粘连蛋白，更优选可列举层粘连蛋白511E-8。对层粘连蛋白511E-8而言，可以购入市售品(例如：iMatrix-
511，Nippi)。
511，Nippi)。
[0243] 第一步骤中使用的培养基包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质。
[0244] TGFβ家族信号转导途径抑制物质意指抑制TGFβ家族信号转导途径，即经由Smad家族转导的信号转导途径的物质，具体而言，可列举：TGFβ信号转导途径抑制物质，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质及BMP信号转导途径抑制物质。
[0245] 作为TGFβ信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要是抑制由TGFβ引起的信号转导途径的物质即可，可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：与TGFβ直接作用的物质(例如：蛋白质、抗体、适体等)、抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制TGFβ受体与TGFβ的结合的物质、抑制基于TGFβ受体的信号转导引起的生理活性的物质(例如：TGFβ受体的抑制剂、Smad的抑制剂等)。关于作为TGFβ信号转导途径抑制物质而已知的蛋白质，可列举Lefty等。作为TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物，具体而言可列举：SB431542(4[4-(1，3-苯间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)，LY-364947(4-[3-(2-吡啶)-1H-吡唑-4-基]-喹啉)，SB-505124(2-(5-苯[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶)，A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-羧硫基酰胺)等。
[0246] 作为Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要是抑制Nodal或激活蛋白引起的信号转导途径的物质即可，可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：直接作用于Nodal或者激活蛋白的物质(例如：抗体，适体等)，抑制编码Nodal或者激活蛋白的基因的表达的物质(例如：反义寡核苷酸，siRNA等)，抑制Nodal/激活蛋白受体和Nodal/激活蛋白的结合的物质，抑制基于Nodal/激活蛋白受体的信号转导引起的生理活性的物质。作为Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物，具体而言可列举SB431542，A-83-01等。另外，可以使用作为Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质而已知的蛋白质(Lefty，Cerberus等)。Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质优选为SB431542，A-83-01或Lefty。
[0247] 作为BMP信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要是抑制BMP引起的信号转导途径的物质即可，可以使用上述的那些。作为BMP信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物，具体而言可列举LDN193189(4-[6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉)，Dorsomorphin等。另外，也可以使用作为BMP信号转导途径抑制物质已知的蛋白质(Chordin，Noggin等)。BMP信号转导途径抑制物质优选为LDN193189。
[0248] TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选为：Lefty，SB431542，A-83-01或LDN193189。
[0249] 也可以将作用点不同的多种类型TGFβ家族信号转导途径抑制物质进行组合使用。期待通过组合而增强将聚集体的素质提高的效果。可列举例如：TGFβ信号转导途径抑制物质与BMP信号转导途径抑制物质的组合，TGFβ信号转导途径抑制物质与Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的组合，BMP信号转导途径抑制物质与Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的组合，优选为将TGFβ信号转导途径抑制物质与BMP信号转导途径抑制物质组合使用。具体而言，作为优选的组合可列举SB431542与LDN193189的组合。
[0250] 作为SHH信号转导途径作用物质没有特别的限定，只要是能增强由SHH(表示音猬因子，sonic hedgehog)介导的信号转导的物质即可，可列举例如：属于Hedgehog家族的蛋白质(例如：SHH、Ihh)，SHH受体，SHH受体激动剂，嘌吗啡胺(PMA)，或SAG(SmoothenedAgonist；N-甲基-N′-(3-吡啶基苄基)-N′-(3-氯代苯并[b]噻吩-2-羰基)-1，
4-二氨基环己烷)等。作为SHH信号转导途径作用物质，优选可列举SAG。SHH信号转导途径作用物质优选为SHH蛋白质(Genbank登记号：NM 000193，NP 000184)，SAG或PMA。
4-二氨基环己烷)等。作为SHH信号转导途径作用物质，优选可列举SAG。SHH信号转导途径作用物质优选为SHH蛋白质(Genbank登记号：NM 000193，NP 000184)，SAG或PMA。
[0251] TGFβ家族信号转导途径抑制物质也可以与SHH信号转导途径作用物质组合使用。作为具体组合，可列举例如：将选自由Lefty，SB431542，A-83-01及LDN193189组成的组中的任一种TGFβ家族信号转导途径抑制物质，与选自由SHH蛋白质、SAG及PMA组成的组中的任一种SHH信号转导途径作用物质的组合。在将TGFβ家族信号转导途径抑制物质与SHH信号转导途径作用物质组合使用的情况下，可以在包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和SHH信号转导途径作用物质这两者的培养基中培养细胞，也可以在用TGFβ家族信号转导途径抑制物质及SHH信号转导途径作用物质中的任一者处理细胞后，用任一者或两者接着处理细胞。
[0252] TGFβ家族信号转导途径抑制物质及SHH信号转导途径作用物质的浓度，能够在能实现上述效果的范围内适当设定。例如，SB431542通常以0.1μM～200μM、优选为2μM～50μM的浓度使用。A-83-01通常以0.05μM～50μM、优选为0.5μM～5μM的浓度使用。LDN193189通常以1nM～2000nM、优选为10nM～300nM的浓度使用。Lefty通常以5ng/ml～200ng/mL、优选为10ng/mL～50ng/mL的浓度使用。SHH蛋白质通常以20ng/ml～1000ng/mL、优选为50ng/mL～
300ng/mL的浓度使用。SAG通常以1nM～2000nM、优选为10nM～700nM，更优选为30～600nM的浓度使用。PMA通常以0.002～20μM、优选为0.02μM～2μM的浓度使用。
300ng/mL的浓度使用。SAG通常以1nM～2000nM、优选为10nM～700nM，更优选为30～600nM的浓度使用。PMA通常以0.002～20μM、优选为0.02μM～2μM的浓度使用。
[0253] 在一种实施方式中，TGFβ家族信号转导途径抑制物质能够以具有与上述浓度的SB431542相同的TGFβ家族信号转导途径抑制活性的量进行适当使用。另外，在一种实施方式中，SHH信号转导途径作用物质能够以起到与上述浓度的SAG相同的SHH信号转导途径活化作用的浓度适当使用。
[0254] 第一步骤中使用的培养基可以为含血清培养基或无血清培养基，但从避免混入化学未确定的成分的观点出发，优选为无血清培养基。
[0255] 从避免混入化学未确定的成分的观点出发，第一步骤中使用的培养基也可以为含有成分经化学确定的培养基。
[0256] 第一步骤中的多潜能干细胞的培养可以在悬浮培养及贴壁培养中的任一种条件下实施，但优选通过贴壁培养进行。
[0257] 在第一步骤中的无饲养细胞条件下的多潜能干细胞的培养中，为了代替饲养层细胞而为多潜能干细胞提供构架，可以将适当的基质用作构架。利用作为构架的基质而在已涂层表面的细胞容器中贴壁培养多潜能干细胞。
[0258] 作为可用作构架的基质，可列举：层粘连蛋白(Nat.Biotechnol.28，611-615(2010))，层粘连蛋白片段(Nat.Commun.3，1236(2012))，基膜制剂(Nat.Biotechnol.19，971-974(2001))，明胶，胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，巢蛋白或玻连蛋白
(Vitronectin)等。
(Vitronectin)等。
[0259] 优选地，对于第一步骤中的无饲养细胞条件下的多潜能干细胞的培养而言，在将表面利用分离的层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段(进一步优选为层粘连蛋白511的E8片段)涂层的细胞容器中贴壁培养多潜能干细胞。
[0260] 第一步骤中的多潜能干细胞的培养时间没有特别限制，只要在能实现提高第二步骤中形成聚集体的素质的效果的范围即可，通常为0.5～144小时。第一步骤中的多潜能干细胞的培养时间优选为1小时以上，2小时以上，6小时以上、12小时以上、18小时以上，或24小时以上。第一步骤中的多潜能干细胞的培养时间优选为96小时以内，或72小时以内。在一种实施方式中，第一步骤中的多潜能干细胞的培养时间的范围优选为2～96小时，更优选为6～48小时，进一步优选为12～48小时，更进一步优选为18～28小时(例如，24小时)。即，在开始第二步骤的0.5～144小时(优选为18～28小时)前启动第一步骤，在第一步骤结束后接着进行第二步骤。在进一步的实施方式中，第一步骤中的多潜能干细胞的培养时间的范围优选为18～144小时，24～144小时，24～96小时或24～72小时。当利用TGFβ家族信号转导途径抑制物质及SHH信号转导途径作用物质中的任一者处理细胞后，利用另一者接着处理细胞时，可以使各自的处理时间为上述的培养时间的范围内。
[0261] 第一步骤中的培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
[0262] 在优选的实施方式中，由第一步骤得到的细胞为维持多潜能样性质(pluripotent-like state)的细胞，通过第一步骤而得以维持多潜能样性质。多潜能样性质是指维持包括多潜能性在内的、并在多潜能干细胞中共通的由多潜能干细胞所特有的特质中的至少一部分的状态。在多潜能样性质中不要求严格的多潜能性。具体而言，在“多潜能样性质”中，包括表达作为多潜能性性质(pluripotent state)的指标的标记的全部或一部分的状态。作为多潜能样性质的标记，可列举Oct3/4阳性、碱性磷酸酶阳性等。在一种实施方式中，维持多潜能样性质的细胞为Oct3/4阳性。即使在Nanog的表达量低于ES细胞或iPS细胞的情况下，也符合“示出多潜能样性质的细胞”。
[0263] 在一种实施方式中，由第一步骤得到的细胞为具有向至少视网膜组织，视网膜细胞，视网膜祖细胞及视网膜层特异性神经细胞分化的能力的干细胞。
[0264] 在优选的实施方式中，在不存在饲养层细胞下将人多潜能干细胞(例如，iPS细胞)在含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质，以及bFGF的无血清培养基中贴壁培养。
[0265] 上述该贴壁培养优选在利用层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段涂层了表面的细胞容器中实施。TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选为TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01，Lefty)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189，Chordin，Noggin)，或其的组合(例如，SB431542及LDN193189)。TGFβ家族信号转导途径抑制物质进一步优选为Lefty，SB431542，A-83-01，或LDN193189，或其的组合(例如，SB431542及LDN193189)。SHH信号转导途径作用物质优选为SHH蛋白质、SAG或嘌吗啡胺(PMA)，更优选为SAG。TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)可以与SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)组合使用。培养时间为0.5～144小时(优选为，18～144小时，24～144小时，24～96小时，或24～72小时(例如：18～28小时))。
[0266] 例如，在饲养层细胞不存在下将人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)在包含bFGF的无血清培养基中进行维持培养。该维持培养优选通过贴壁培养进行。该贴壁培养优选在利用玻连蛋白、层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段涂层了表面的细胞容器中实施。然后，向该培养中添加TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质，继续培养。TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选为TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01，Lefty)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，SB431542，A-83-01，Lefty)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或其的组合(例如，SB431542及LDN193189)。TGFβ家族信号转导途径抑制物质，进一步优选为Lefty，SB431542，A-83-01，或LDN193189，或其的组合(例如，SB431542及LDN193189)。SHH信号转导途径作用物质优选为SHH蛋白质、SAG或PMA。TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-
01，LDN193189)可以与SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)组合使用。添加后，继续培养0.5～144小时(优选为，18～144小时，24～144小时，24～96小时，或24～72小时(例如：18～28小时))。
01，LDN193189)可以与SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)组合使用。添加后，继续培养0.5～144小时(优选为，18～144小时，24～144小时，24～96小时，或24～72小时(例如：18～28小时))。
[0267] [对于第二步骤]
[0268] 对于第二步骤进行说明，其中通过将由第一步骤得到的细胞在培养基中悬浮培养而使其形成细胞的聚集体。
[0269] 第二步骤中使用的培养基可以为含血清培养基或无血清培养基。从为了避免化学未确定的成分的混入的观点出发，在本发明中优选使用无血清培养基。例如，可以使用不添加BMP信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径抑制物质两者的无血清培养基。为了避免复杂的制备，例如优选使用：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基(例如：在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加了10％KSR，450μM 1-一硫代甘油及1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基，或在GMEM中添加了5％～20％KSR，NEAA，丙酮酸，2-巯基乙醇的培养基)。关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人多潜能干细胞的情况下通常为约1％～约30％、优选为约2％～约20％。
[0270] 在聚集体的形成时，首先，通过对由第一步骤得到的细胞的分散操作而制备经分散的细胞。通过分散操作得到的“经分散的细胞”可列举例如，7成以上为单个细胞，2～50个细胞的团块以3成以下存在的状态。作为经分散的细胞，优选可列举8成以上为单个细胞，2～50个细胞的团块以2成以下存在的状态。经分散的细胞可列举细胞之间的黏附(例如面黏附)几乎消失的状态。
[0271] 由第一步骤得到的细胞的分散操作可以包括：上文提及的机械分散处理，细胞分散液处理，细胞保护剂处理。这些处理可以联合进行。优选地，在细胞保护剂处理的同时进行细胞分散液处理，然后进行机械分散处理即可。
[0272] 作为用于细胞保护剂处理的细胞保护剂，可列举：FGF信号转导途径作用物质(例如，bFGF、FGF4、FGF8等成纤维细胞生长因子)，肝素，IGF信号转导途径作用物质(例如，胰岛素)，血清和血清代替物。另外，作为用于抑制由分散诱导的多潜能干细胞(特别是人多潜能干细胞)的细胞死亡的细胞保护剂，也可以添加Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)的抑制剂或肌球蛋白抑制剂。为了抑制由分散诱导的多潜能干细胞(特别是人多潜能干细胞)的细胞死亡，保护细胞，也可以从第二步骤培养开始时添加ROCK的抑制剂或肌球蛋白的抑制剂。作为ROCK抑制剂，可列举Y-27632，法舒地尔(Fasudil)(HA1077)，H-1152等。关于肌球蛋白抑制剂，可列举Blebbistatin。
[0273] 关于用于细胞分散处理的细胞分散液，可列举包含诸如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶、木瓜蛋白酶等和诸如乙二胺四乙酸等螯合剂中的任一种的溶液。也可以使用市售的细胞分散液，诸如TrypLE Select和TrypLE Express(由Life Technologies制造)。
[0274] 作为机械分散处理的方法，可列举吹打处理或利用刮刀的刮片操作。
[0275] 将分散的细胞悬浮在上述培养基中。
[0276] 然后，将经分散的细胞的悬浊液接种在上述培养容器中，将经分散的细胞在相对于培养容器为非黏附性的条件下培养，由此使多个细胞汇聚而形成聚集体。此时，可以通过将经分散的细胞接种在诸如10cm平皿的比较大的培养容器中，由此在1个培养容器中同时形成多个的细胞聚集体，但如果这样则每个聚集体的大小会产生偏差。为此，例如将给定数量的经分散的干细胞放置在诸如96孔板的多孔板(U底，V底)的各孔中，并将其静置培养，则细胞迅速聚集，由此在每个孔中形成1个聚集体。可以从多个孔中回收聚集体，由此得到均一的聚集体群(例如：SFEBq法)
[0277] 第二步骤中的细胞的浓度可以适当设定使得更均一，有效地形成细胞的聚集体。例如，当使用96孔板悬浮培养人细胞(例如，第一步骤中由人iPS细胞得到的细胞)时，将配置使得每孔约1x103～约1x105细胞、优选为约3x103～约5x104细胞，更优选为约4x103～约
2x104细胞，进一步优选为，约4x103～约1.6x104细胞，更进一步优选为约8x103～约1.2x104细胞的液体添加于孔中，将板静置而形成聚集体。
2x104细胞，进一步优选为，约4x103～约1.6x104细胞，更进一步优选为约8x103～约1.2x104细胞的液体添加于孔中，将板静置而形成聚集体。
[0278] 第二步骤中的培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
[0279] 在第二步骤中，当进行培养基更换操作的情况下，可列举例如：不丢弃原有培养基且加入新培养基的操作(添加培养基操作)，弃掉半量左右(原有培养基的体积量的30～90％左右，例如40～60％左右)的原有培养基且入半量左右(原有培养基的体积量的30～
90％，例如40～60％左右)的新培养基的操作(半量培养基更换操作)，弃掉全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的原有培养基并加入全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的新培养基的操作(全量培养基更换操作)。
90％，例如40～60％左右)的新培养基的操作(半量培养基更换操作)，弃掉全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的原有培养基并加入全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的新培养基的操作(全量培养基更换操作)。
[0280] 培养基更换操作中使用的工具没有特别限制，可列举例如：移液管、微量移液管(PIPETMAN)、多通道微量移液管(MULTICHANNEL PIPETMAN)、连续的分配器等。例如，使用96孔板作为培养容器的情况下，可以使用多通道微量移液管。
[0281] 用于形成细胞的聚集体所必需的悬浮培养的时间，能够以使得细胞均一地聚集的方式根据使用的细胞而适当确定，但为了形成均一细胞的聚集体，优选为尽可能短的时间。从经分散的细胞到形成细胞聚集体的步骤可分为：细胞发生汇聚的步骤；及汇聚的细胞形成细胞聚集体的步骤。对从接种经分散的细胞的时刻(即，悬浮培养开始时)到细胞发生汇聚为止，例如：在为人细胞(例如，第一步骤中由人iPS细胞得到的干细胞)的情况下，优选为约24小时以内，更优选为约12小时以内形成汇聚的细胞。对从接种经分散的细胞的时刻(即，悬浮培养开始时)到形成细胞聚集体的时间而言，例如：在为人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)的情况下，优选为约72小时以内，更优选为约48小时以内。该形成细胞聚集体的时间可以通过控制使细胞聚集的工具、离心条件等而适当调节。
[0282] 对细胞的聚集体的形成及其均一性而言，可以基于聚集体的尺寸及细胞数目，宏观形态，采用组织染色分析的微观形态及其均一性、分化及未分化标记的表达及其均一性、分化标记的表达控制及其同步性、聚集体间的分化效率的再现性等而判断。
[0283] 在聚集体形成后，也可以原样继续进行聚集体的培养。对第二步骤中的悬浮培养的时间而言，通常继续到添加BMP信号转导途径作用物质之前即可，具体而言可列举通常为12小时～6天、优选为12小时～3天左右。
[0284] 作为第二步骤中使用的培养基的一种实施方式，可列举：包含SHH信号转导途径作用物质的培养基(参考WO2016/063985)，包含Wnt信号转导途径抑制物质的培养基，或包含Wnt信号转导途径抑制物质及SHH信号转导途径作用物质的培养基(参考WO2017/183732)。在第一步骤中，用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质处理多潜能干细胞，在第二步骤中，在包含SHH信号转导途径作用物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的培养基(优选为无血清培养基)中悬浮培养由第一步骤得到的细胞，使其形成聚集体，由此将聚集体的素质进一步提高，提高向视网膜组织的分化潜能。通过使用该素质高的聚集体，能够以高效率诱导包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0285] 作为SHH信号转导途径作用物质，可以使用上文提及的那些。优选SHH信号转导途径作用物质为SHH蛋白质、SAG或PMA。培养基中的SHH信号转导途径作用物质的浓度可在能够实现上述效果的范围内适当设定。SAG通常以1nM～2000nM、优选为10nM～700nM，更优选为30nM～600nM的浓度使用。PMA通常以0.002μM～20μM、优选为0.02μM～2μM的浓度使用。SHH蛋白质通常以20ng/ml～1000ng/mL，优选为50ng/mL～300ng/mL的浓度使用。在使用除了SHH蛋白质、SAG、PMA以外的SHH信号转导途径作用物质的情况下，优选以起到与上述SAG的浓度相同的SHH信号转导途径活化作用的浓度进行使用。
[0286] 也可以在第二步骤的期间使培养基中的SHH信号转导途径作用物质的浓度改变。例如，也可以在第二步骤的开始时使SHH信号转导途径作用物质为上述范围，每2～4天以减少40～60％的比例缓慢或逐步地降低该浓度。
[0287] 向培养基中添加SHH信号转导途径作用物质的时间没有特别限制，只要可以提供上文提及的效果即可，但是越早添加能够获得更高的效果。SHH信号转导途径作用物质通常在自第二步骤开始6天以内、优选为3天以内，更优选为1天以内，进一步优选为在第二步骤开始时添加到培养基中。
[0288] 作为Wnt信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要可抑制由Wnt介导的信号转导即可，可列举例如：直接作用于Wnt或Wnt受体的物质(抗Wnt中和抗体，抗Wnt受体中和抗体等)，抑制编码Wnt或Wnt受体的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸，siRNA等)，抑制Wnt受体和Wnt的结合的物质(可溶型Wnt受体，显性负性Wnt受体等，Wnt拮抗剂，Dkk1，Cerberus蛋白等)，抑制基于Wnt受体信号转导引起的生理活性的物质[CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5-氯异喹啉-8-砜酰胺)，D4476(4-[4-(2，3-二氢-1，4-苯并二噁英-6-基)-5-(2-吡啶)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)，IWR-1-endo(IWR1e)(4-[(3aR，4S，7R，7aS)-1，3，3a，4，7，7a-六氢-1，3-二氧代-4，7-桥亚甲基-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺)，以及，IWP-2(N-(6-甲基-2-苯噻唑基)-2-[(3，4，6，7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺)等低分子化合物等]等。作为Wnt信号转导途径抑制物质优选可以使用IWR1e。
[0289] 培养基中的Wnt信号转导途径抑制物质的浓度可在能够实现上述效果的范围内适当设定。IWR1e通常以使得为约0.1μM～约100μM、优选为约0.3μM～约30μM，更优选为约1μM～约10μM，进一步优选为约3μM的浓度的方式添加到培养基中。在使用除了IWR-1-endo以外的Wnt信号转导途径抑制物质的情况下，优选以显示与上述IWR-1-endo的浓度相同的Wnt信号转导途径抑制活性的浓度使用。
[0290] 也可以在第二步骤的期间使培养基中Wnt信号转导途径抑制物质的浓度改变。例如，也可以在第二步骤的开始时使Wnt信号转导途径抑制物质为上述范围，每2～4天以减少40～60％的比例缓慢或逐步地降低该浓度。
[0291] 向培养基中添加Wnt信号转导途径抑制物质的时间没有特别限制，只要可以提供上文提及的效果即可，但是越早添加能够获得更高的效果。Wnt信号转导途径抑制物质通常在从第二步骤中的悬浮培养开始6天以内、优选为3天以内，更优选为1天以内，更优选为12小时以内，进一步优选为在第二步骤中的悬浮培养开始时添加到培养基中。具体而言可以进行例如：添加了Wnt信号转导途径抑制物质的基础培养基的添加、该基础培养基的一部分或者全部的培养基更换。将由第一步骤得到的细胞在第二步骤中与Wnt信号转导途径抑制物质作用的期间没有特别限制，在可以实现上述效果的范围内即可，优选为在第二步骤中的悬浮培养开始时添加到培养基中后，作用至第二步骤结束时为止。进一步，在第二步骤结束后(即第三步骤的期间中)也可继续暴露于Wnt信号转导途径抑制物质。作为一种实施方式，也可以在第二步骤结束后(即第三步骤的期间中)也继续与Wnt信号转导途径抑制物质作用，作用至形成神经上皮组织和/或神经组织为止。
[0292] 在优选的实施方式中，在包含SHH信号转导途径作用物质(例如，SAG、PMA、SHH蛋白质)和/或Wnt信号转导途径抑制物质(例如，IWR1e)的无血清培养基中悬浮培养由第一步骤得到的人细胞(例如，第一步骤中由人iPS细胞得到的细胞)，形成聚集体。SHH信号转导途径作用物质优选从悬浮培养开始时就包含在培养基中。也可以在培养基中添加ROCK抑制物质(例如，Y-27632)。培养时间为12小时～6天、优选为12小时～3天。形成的聚集体优选为均一的聚集体。
[0293] 例如，回收由第一步骤得到的人细胞(例如，第一步骤中由人iPS细胞得到的细胞)使其分散至成为单个细胞或接近单个细胞的状态为止，并在包含SHH信号转导途径作用物质(例如，SAG、PMA)和/或Wnt信号转导途径抑制物质(例如，IWR1e)的无血清培养基中进行悬浮培养。该无血清培养基中也可以包含ROCK抑制剂(例如，Y-27632)。将人干细胞(例如，源自人iPS细胞的干细胞)的悬浊液接种在上述的培养容器中，将经分散的细胞在相对于培养容器为非黏附性的条件下培养，由此使多个细胞汇聚而形成聚集体。培养时间为12小时～6天(优选为12小时～3天)。形成的聚集体优选为均一的聚集体。
[0294] 如上所述地，通过实施第二步骤，形成由第一步骤得到的细胞，或源自其的细胞的聚集体。与在第一步骤中未利用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质处理的情况相比，第二步骤中得到的聚集体具有更高的品质。具体而言，可以得到富集了圆润，表面光滑且聚集体的内部紧密，形态不崩溃的聚集体的比例的聚集体的群体。在一种实施方式中，从第二步骤开始的第6天，随机地选出聚集体(例如：100个以上)时，没有嚢胞化的聚集体的比例为例如70％以上、优选为80％以上。
[0295] 在第二步骤中得到的聚集体具有向视网膜组织分化的能力。
[0296] 在优选的一种实施方式中，在第一步骤中利用TGFβ信号转导途径抑制物质处理多潜能干细胞，且在第二步骤中利用包含SHH信号转导途径作用物质(例如，SAG、PMA、SHH蛋白质)和/或Wnt信号转导途径抑制物质(例如，IWR1e)的培养基实施由第一步骤得到的细胞的悬浮培养。在此，优选地，作为TGFβ信号转导途径抑制物质可以使用SB431542或A-83-01。
[0297] 另外，在优选一种实施方式中，在第一步骤中，利用BMP信号转导途径抑制物质处理多潜能干细胞，且在第二步骤中，利用不包含SHH信号转导途径作用物质(例如，SAG、PMA、SHH蛋白质)的培养基实施由第一步骤得到的细胞的悬浮培养。在此，优选地作为BMP信号转导途径抑制物质可以使用LDN193189。
[0298] 优选在一种实施方式中，在第一步骤中，利用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如：TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或其的组合(例如，SB431542及LDN193189)等)；SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)；或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)与SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)的组合来处理多潜能干细胞(例如，人多潜能干细胞)，且在第二步骤中，利用包含SHH信号转导途径作用物质(例如，SAG、PMA、SHH蛋白质)的培养基实施由第一步骤得到的细胞的悬浮培养。
[0299] 在另外的实施方式中，在第一步骤中，利用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如：TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或其的组合(例如，SB431542及LDN193189)等)；SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)；或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)与SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)的组合来处理多潜能干细胞(例如，人多潜能干细胞)，且在第二步骤中，利用不包含SHH信号转导途径作用物质(例如，SAG、PMA、SHH蛋白质)的培养基实施由第一步骤得到的细胞的悬浮培养。
[0300] 在任一种实施方式中，还包括第二步骤的培养基优选包含ROCK抑制剂(例如，Y-27632)。
[0301] [对于第三步骤]
[0302] 通过在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养由第二步骤形成的聚集体，由此可以得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。该步骤可以按照在上述的原料制备方法1中的第二步骤制备。
[0303] 在一种实施方式中，当第二步骤中在培养基中添加的SHH信号转导途径作用物质的浓度为比较低的浓度(例如：对于SAG为700nM以下，对于其它SHH信号转导途径作用物质，为与上述浓度的SAG起到相同或以下的SHH信号转导途径活化作用的浓度)的情况下，培养基更换不是必须进行的，只要在第二步骤中使用的培养基中添加BMP信号转导途径作用物质(例如，BMP4)即可。另一方面，当SHH信号转导途径作用物质的浓度为比较高的浓度(例如：对于SAG为高于700nM，或1000nM以上，对于其它SHH信号转导途径作用物质为与上述浓度的SAG起到相同的SHH信号转导途径活化作用的浓度)的情况下，为了抑制在添加BMP信号转导途径作用物质时残存的SHH信号转导途径作用物质的影响，优选更换为包含BMP信号转导途径作用物质(例如，BMP4)的新鲜的培养基。
[0304] 在优选的实施方式中，当换算为SAG的SHH信号转导促进活性时，第三步骤中使用的培养基中SHH信号转导途径作用物质浓度为700nM以下，优选为300nM以下，更优选为10nM以下，进一步优选为0.1nM以下、进一步优选不包含SHH信号转导途径作用物质。在“不包含SHH信号转导途径作用物质”的培养基中，也包括实质上不含SHH信号转导途径作用物质的培养基，例如：不含有对向视网膜祖细胞及视网膜组织的选择性分化造成不利影响的程度的浓度的SHH信号转导途径作用物质的培养基。在“未添加SHH信号转导途径作用物质”的培养基中，也包括实质上未添加SHH信号转导途径作用物质的培养基，例如：未添加对向视网膜祖细胞及视网膜组织的选择性分化造成不利影响的程度的浓度的SHH信号转导途径作用物质的培养基。
[0305] 在制备发育早期阶段的视网膜组织基础上的优选实施方式中，通过第一步骤，在不存在饲养层细胞下在含有TGFβ信号转导途径抑制物质(例如SB431542，A-83-01)以及bFGF的无血清培养基中贴壁培养人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)，通过第二步骤，在含有SHH信号转导途径作用物质(例如SAG、PMA、SHH蛋白质)的无血清培养基中悬浮培养细胞，通过第三步骤，在含有BMP信号转导途径作用物质(例如BMP4)的无血清培养基中悬浮培养聚集体。
[0306] 另外，在制备发育早期阶段的视网膜组织基础上的优选的实施方式中，通过第一步骤，在不存在饲养层细胞下，在含有BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)及bFGF的无血清培养基中贴壁培养人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)，通过第二步骤，在不含有或含有SHH信号转导途径作用物质(例如SAG、PMA)的无血清培养基中悬浮培养细胞，通过第三步骤，在含有BMP信号转导途径作用物质(例如BMP4)的无血清培养基中悬浮培养聚集体。
[0307] 在制备发育早期阶段的视网膜组织基础上的优选的实施方式中，通过第一步骤，在不存在饲养层细胞下，在含有SHH信号转导途径作用物质(例如SAG、PMA)以及bFGF的无血清培养基中贴壁培养人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)优选为1天以上6天以下，进一步优选为2天～4天，通过第二步骤，在含有SHH信号转导途径作用物质(例如SAG、PMA)的无血清培养基中悬浮培养细胞，通过第三步骤，在含有BMP信号转导途径作用物质(例如BMP4)的无血清培养基中悬浮培养聚集体。
[0308] 在制备发育早期阶段的视网膜组织基础上的优选的实施方式中，通过第一步骤，在不存在饲养层细胞下，在含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如：TGFβ信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01)，BMP信号转导途径抑制物质(例如，LDN193189)，或其的组合(例如，SB431542及LDN193189)等)；SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)；或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如，Lefty，SB431542，A-83-01，LDN193189)与SHH信号转导途径作用物质(例如，SHH蛋白质、SAG、PMA)的组合；以及bFGF的无血清培养基中贴壁培养人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)，通过第二步骤，在包含SHH信号转导途径作用物质(例如，SAG、PMA、SHH蛋白质)的无血清培养基中悬浮培养由第一步骤得到的细胞，使其形成细胞的聚集体，通过第三步骤，在含有BMP信号转导途径作用物质(例如BMP4)的无血清培养基中悬浮培养聚集体，得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0309] 2-3.原料制备方法3
[0310] 作为制备发育早期阶段的视网膜组织的优选一种实施方式，也可以列举WO2016/063986中记载的包括以下步骤的方法：
[0311] (1)第一步骤，在不存在饲养层细胞下，在包含用于维持未分化的因子的培养基中培养多潜能干细胞，
[0312] (2)第二步骤，在SHH信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养由第一步骤得到的多潜能干细胞，从而形成细胞的聚集体，及
[0313] (3)第三步骤，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养第二步骤中得到的聚集体，得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0314] [对于第一步骤]
[0315] 第一步骤可以按照WO2016/063986中记载的方法进行。即，在第一步骤中，在不存在饲养层细胞下，在包含用于维持未分化的因子的培养基中培养人多潜能干细胞、优选为人的人工多潜能干细胞(iPS细胞)或人胚胎干细胞(ES细胞)。第一步骤中的不存在饲养层细胞下(无饲养细胞)意指实质上不含饲养层细胞(例如：相对于总细胞数，饲养层细胞数的比例为3％以下)的条件。优选在不包含饲养层细胞的条件中实施第一步骤。
[0316] 对第一步骤中使用的培养基没有特别限制，只要是在无饲养细胞条件下能够实现多潜能干细胞的维持未分化的培养的培养基(无饲养细胞培养基)即可，为了能够实现维持未分化的培养而优选包含用于维持未分化的因子。可列举例如：包含用于维持未分化的因子、TGFβ家族信号转导途径抑制物质且不包含SHH信号转导途径作用物质的培养基。
[0317] 作为用于维持未分化的因子及无饲养细胞培养基，可列举上述原料制备方法2所述的那些。
[0318] 第一步骤中的多潜能干细胞的培养时间没有特别限制，只要在能实现提高在第二步骤中形成的聚集体的素质的效果的范围内即可，通常为0.5～144小时、优选为2～96小时，更优选为6～48小时，进一步优选为12～48小时，更进一步优选为18～28小时(例如，24小时)。即，在开始第二步骤的0.5～144小时(优选为18～28小时)前启动第一步骤，在第一步骤结束后接着进行第二步骤。
[0319] 在第一步骤中，可以适当进行培养基更换，作为一种实施方式，可列举具体而言每隔1～2天更换培养基的方法。用于本文时，也可以进行培养基更换而换为例如：不包含ROCK抑制剂等细胞保护剂或者细胞死亡抑制剂的培养基。
[0320] 第一步骤中的培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
[0321] 在一个优选的实施方式中，在不存在饲养细胞的条件下，并在包含bFGF的无血清培养基中以黏附状态培养人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)。该贴壁培养优选在利用层粘连蛋白511、层粘连蛋白511的E8片段或玻连蛋白涂层了表面的细胞容器中实施。该贴壁培养优选使用Essential8、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基或StemFit培养基、进一步优选使用Essential 8或StemFit培养基作为无饲养细胞培养基实施。
[0322] [对于第二步骤]
[0323] 通过在SHH信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养由第一步骤得到的多潜能干细胞，从而形成多潜能干细胞的聚集体的第二步骤，可以按照上述原料制备方法2的第二步骤中记载的方法进行。
[0324] [对于第三步骤]
[0325] 第三步骤可以按照上述原料制备方法1中的第二步骤，或上述原料制备方法2中的第三步骤进行。
[0326] 2-4.原料制备方法4
[0327] 作为制备发育早期阶段的视网膜组织的优选一种实施方式，也可以列举WO2013/077425中记载的包括以下步骤的方法：
[0328] (1)第一步骤，通过在包含Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基中悬浮培养多潜能干细胞，而使其形成多潜能干细胞的聚集体，及
[0329] (2)第二步骤，在包含基膜制剂的无血清培养基中悬浮培养在第一步骤中形成的聚集体，得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0330] 原料制备方法4可以按照WO2013/077425(&US2014/341864)的记载实施。
[0331] [对于第一步骤]
[0332] 作为Wnt信号转导途径抑制物质可列举上文提及的那些。
[0333] 在此使用的Wnt信号转导途径抑制物质的浓度只要为可形成多潜能干细胞的聚集体浓度即可。例如在为IWR1e等常规Wnt信号转导途径抑制物质时，浓度为0.1μM～100μM、优选为1μM～10μM，更优选为约3μM。
[0334] Wnt信号转导途径抑制物质可以在悬浮培养开始前添加到无血清培养基中，另外，也可以在悬浮培养开始后数天以内(例如：5天以内)添加到无血清培养基中。Wnt信号转导途径抑制物质优选在悬浮培养开始后5天以内，更优选为3天以内，最优选为在与悬浮培养开始同时添加到无血清培养基中。另外，以添加了Wnt信号转导途径抑制物质的状态悬浮培养到悬浮培养开始后第18天，更优选为第12天。
[0335] 培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度没有特别限制，例如约30℃～约40℃、优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
[0336] 另外，多潜能干细胞的浓度可以由本领域技术人员以使更均一、有效地形成多潜能干细胞的聚集体的方式适当设定。形成聚集体时的多潜能干细胞的浓度没有特别限制，只要为能够形成干细胞的均一聚集体的浓度即可，例如在使用96孔板悬浮培养人ES细胞时，添加配制使得每孔约1×103～约5×104细胞、优选为约3×103～约3×104细胞，更优选为约5×103～约2×104细胞，最优选为9×103个细胞前后的液体并将板静置而形成聚集体。
[0337] 用于形成聚集体所必需的悬浮培养的时间只要可以使细胞迅速聚集即可，能够根据使用的多潜能干细胞而适当确定，但为了形成均一聚集体，优选为尽可能短的时间(例如：SFEBq法)。例如，在为人ES细胞、人iPS细胞的情况下，期望优选在24小时以内，更优选在12小时以内形成聚集体。该形成聚集体的时间，本领域技术人员可以通过控制使细胞聚集的工具、离心条件等而适当调节。
[0338] 对多潜能干细胞的聚集体形成而言，本领域技术人员可以基于聚集体的尺寸及细胞数目，宏观形态，采用组织染色分析的微观形态及其均一性、分化及未分化标记的表达及其均一性、分化标记的表达控制及其同步性、聚集体间的分化效率的再现性等而判断。
[0339] [对于第二步骤]
[0340] 对于第二步骤进行说明，所述第二步骤在包含基膜制剂的无血清培养基中悬浮培养在第一步骤中形成的聚集体，得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的聚集体。
[0341] 作为“基膜制剂”指包含具有以下功能的基膜构成成分的制剂：当在其上接种并培养具有基膜形成能力的期望的细胞的情况下，控制上皮细胞样的细胞形态，分化，增殖，运动，功能表达等。用于本文时，“基膜构成成分”意指在动物的组织中的上皮细胞层与间质细胞层等之间存在的薄膜状的细胞外基质分子。基膜制剂可以通过例如以下操作而制作：将具有经由基膜而黏附于支撑体上的基膜形成能力的细胞，使用具有该细胞的脂质溶解能力的溶液、碱溶液等除去。作为优选的基膜制剂，可列举包含作为基膜成分市售的商品(例如Matrigel(下文中，有时称为基质胶))，作为基膜成分公知的细胞外基质分子(例如层粘连蛋白，IV型胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，巢蛋白等)的制剂。
[0342] 基质胶为来自Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤的基膜制备物。基质胶的主要成分为IV型胶原蛋白，层粘连蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，巢蛋白，除了这些之外，包含TGF-β，成纤维细胞生长因子(FGF)，组织纤溶酶原激活物和由EHS肿瘤天然产生的生长因子。基质胶的“生长因子减少的产品”比常规的基质胶的生长因子的浓度低，其标准的浓度为EGF＜0.5ng/mL，NGF＜0.2ng/mL，PDGF＜5pg/mL，IGF-1为5ng/mL，TGF-β为1.7ng/mL。在原料制备方法4中，优选使用“生长因子减少的产品”。
[0343] 作为在第二步骤中的悬浮培养中添加到无血清培养基中的基膜制剂的浓度没有特别限制，只要维持神经组织(例如视网膜组织)的上皮结构稳定即可，例如在使用基质胶的情况下，可列举优选为培养液的1/20～1/200的容量，更优选为1/100前后的容量。基膜制剂可以在多潜能干细胞的聚集体的培养开始时已经添加到培养基中，优选在悬浮培养开始后5天以内，更优选为悬浮培养开始后2天以内添加到无血清培养基中。
[0344] 对第二步骤中使用的无血清培养基而言，可以直接使用第一步骤中使用的无血清培养基，也可以更换为新的无血清培养基。
[0345] 在将第一步骤中使用的无血清培养基直接使用于本步骤中的情况下，只要将“基膜制剂”添加到培养基中即可。
[0346] 用于第一步骤及第二步骤中悬浮培养的无血清培养基没有特别限制，只要为上文提及的那些即可。然而，从为了避免复杂的制备观点出发，作为所述无血清培养基，优选使用适量添加了市售的KSR的无血清培养基(GMEM或DMEM，0.1mM 2-巯基乙醇，0.1mM非必需氨基酸Mix，1mM丙酮酸钠)。关于KSR向无血清培养基中的加入量没有特别限制，例如在为人ES细胞的情况下通常为1～20％、优选为2～20％。
[0347] 第二步骤中的培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度没有特别限制，例如约30℃～约40℃、优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
[0348] 由第二步骤得到的聚集体虽然能够作为发育早期阶段的视网膜组织使用，但也可以为了提高视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的含有率，在包含基膜制剂的无血清培养基中悬浮培养后实施以下第三步骤，将得到的聚集体作为发育早期阶段的视网膜组织使用：
[0349] (3)第三步骤，在含血清培养基中悬浮培养由第二步骤培养的聚集体。
[0350] 对第三步骤中使用的含血清培养基而言，可以使用在第二步骤中培养中使用的无血清培养基中直接添加血清的，也可以使用更换为新的含血清培养基的。
[0352] 血清的添加在悬浮培养(即第一步骤)开始后第7天以后，更优选为第9天以后，最优选为第12天进行。关于血清浓度，以1～30％、优选为3～20％，更优选为约10％进行添加。
[0353] 第三步骤中使用的含血清培养基没有特别限制，可以是上文提及的那些，优选使用在上述无血清培养基(GMEM或DMEM，0.1mM 2-巯基乙醇，0.1mM非必需氨基酸Mix，1mM丙酮酸钠)中添加了血清的培养基。
[0354] 另外，也可以在所述含血清培养基中适量添加市售的KSR等血清代替物而使用。
[0355] 在第三步骤中，可以除了血清以外还添加SHH信号转导途径作用物质，由此提高发育早期阶段的视网膜组织的制备效率。
[0356] 作为SHH信号转导途径作用物质没有特别限制，只要可增强利用SHH介导的信号转导即可，可列举上文提及的那些。
[0357] 对本步骤中使用的SHH信号转导途径作用物质的浓度而言，在为例如SAG等常规SHH信号转导途径作用物质时，以0.1nM～10μM、优选为10nM～1μM，更优选为约100nM的浓度添加。
[0358] 如上所述地得到的聚集体也可以作为发育早期阶段的视网膜组织使用。
[0359] 另外，作为制备发育早期阶段的视网膜组织的优选一种实施方式，也可以在上述实施第三步骤后实施以下第四步骤，将得到的视杯样结构体作为发育早期阶段的视网膜组织使用：
[0360] (4)第四步骤，在包含SHH信号转导途径作用物质和Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基中或含血清培养基中悬浮培养由第三步骤培养的聚集体。
[0361] 用于本文时，作为SHH信号转导途径作用物质没有特别限制，只要可增强利用SHH介导的信号转导即可，可列举上文提及的那些。
[0362] 对这里使用的SHH信号转导途径作用物质的浓度而言，在为例如SAG等常规SHH信号转导途径作用物质时，以0.1nM～10μM、优选为10nM～1μM，更优选为约100nM的浓度添加。
[0363] 作为Wnt信号转导途径作用物质，只要能增强由Wnt介导的信号转导即可，没有特别限制，可列举例如：属于Wnt家族的蛋白质(例如：Wnt1，Wnt3A，Wnt7A，Wnt2B)，Wnt受体，Wnt受体激动剂，抗Wnt受体抗体，Wnt部分肽，β连环蛋白信号转导物质，GSK3β抑制剂(例如：6-溴靛玉红-3′-肟(BIO)，CHIR99021(6-[[2-[[4-(2，4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈)，肯帕罗酮(Kenpaullone))等。
[0364] 对这里使用的Wnt信号转导途径作用物质的浓度而言，在为例如CHIR99021等常规Wnt信号转导途径作用物质时，以0.1μM～100μM、优选为1nM～30μM，更优选为约3nM的浓度添加。
[0365] SHH信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质在悬浮培养开始(第一步骤开始)后第12天以后且第25天以内添加。优选在第15天以后且第18天以内添加。此时，优选使用在聚集体形成步骤中添加的不包含Wnt信号转导途径抑制物质的培养基。
[0366] 从悬浮培养开始第18天以后，从聚集体中，视杯样结构体形成突起状。采用上述第四步骤制备的视杯样结构体还能够用作作为在本发明的方法中使用的起始物质的发育早期阶段的视网膜组织。
[0367] 也能够将由上述第四步骤得到的聚集体在不含SHH信号转导途径作用物质及Wnt信号转导途径作用物质中的任一种的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养1天～20天后，用作作为在本发明的方法的起始物质的发育早期阶段的视网膜组织。也存在通过本原料制备方法而同时形成除了视网膜组织以外的神经组织的情况，它们可能表达作为背侧化信号转导物质的Wnt信号转导途径作用物质等。因此，优选为了排除过量的作为背侧化信号转导物质的Wnt信号转导途径作用物质等带来的影响，而使用镊子(pincette)，剪刀，注射针，剃刀及类似的工具等，从聚集体将存在于聚集体的表面的该视杯样结构体物理地切出。
[0368] 2-5.原料制备方法5
[0369] 在发育早期阶段的视网膜组织中也可以包含睫状缘区结构体，包含睫状缘区结构体的发育早期阶段的视网膜组织可以采用WO2015/087614(&US2016/376554)中记载的方法制备。
[0370] 具体而言，也可以将作为包含视网膜组织的细胞聚集体，上述视网膜组织中CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体[例如在原料制备方法1～4的制备方法中，相当于悬浮培养开始后约第9～60天、优选为第9～40天，进一步优选为悬浮培养开始后约第15～20天，例如第18天的细胞聚集体。]经过在包含Wnt信号转导途径作用物质及FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或血清培养基中，仅在出现表达RPE65基因的细胞之前的期间内进行培养的步骤而得到的聚集体，或将进一步得到的“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”经过在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养的步骤而得到的包含睫状缘区样结构体的聚集体，用作作为本发明的方法的起始物质的发育早期阶段的视网膜组织。
[0371] 具体而言，在发育早期阶段的视网膜组织中，也包括例如根据下述的方法制备的包含睫状缘区结构体的聚集体：
[0372] (1)包含睫状缘区样结构体的聚集体的制备方法，其包括以下步骤：将作为包含视网膜组织的细胞聚集体，在上述视网膜组织中的CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体，仅在出现表达RPE65基因的细胞之前的期间内，在包含Wnt信号转导途径作用物质及FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中培养，之后，将得到的“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中培养。
[0373] “作为包含视网膜组织的细胞聚集体，上述视网膜组织中的CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体”可以采用上述的原料制备方法1～4所述的方法得到。即，该细胞聚集体为包含其自身发育早期阶段的视网膜组织的聚集体。例如，将在原料制备方法1中的第二步骤或原料制备方法2或3中的第三步骤中，通过在BMP4等BMP信号转导途径作用物质的存在下培养6天～15天，可以得到发育早期阶段的视网膜组织，即“作为包含视网膜组织的细胞聚集体，上述视网膜组织中CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体”。另外，对上述“仅在出现表达RPE65基因的细胞之前的期间内，在包含Wnt信号转导途径作用物质及FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中培养的步骤”而言，优选在通过在包含Wnt信号转导途径作用物质及FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中继续进行培养(例如30天以上)，从而视网膜组织中包含的细胞中的50％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上，进一步更优选为
99％以上能够表达RPE65基因的时间之前，即，视网膜组织中包含的细胞中有上述比例的细胞为能够分化为视网膜色素上皮的期间之前开始。具体而言，在悬浮培养开始后40天、优选为30天，更优选为20天之前开始。
99％以上能够表达RPE65基因的时间之前，即，视网膜组织中包含的细胞中有上述比例的细胞为能够分化为视网膜色素上皮的期间之前开始。具体而言，在悬浮培养开始后40天、优选为30天，更优选为20天之前开始。
[0374] 如上所述地得到的细胞聚集体，可以用作本步骤的“作为包含视网膜组织的细胞聚集体，上述视网膜组织中Chx10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体”。
[0375] 首先，将“作为包含视网膜组织的细胞聚集体，上述视网膜组织中的CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体”仅在出现表达RPE65基因的细胞之前的期间内，按照WO2015/087614中记载的方法在包含Wnt信号转导途径作用物质及FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中培养。用于本文时，作为优选的培养，可列举悬浮培养。
[0376] 作为无血清培养基，可列举在基础培养基中添加了N2或KSR的无血清培养基，更具体而言，可列举在DMEM/F-12培养基中添加了N2补充剂(N2，Invitrogen公司)的无血清培养基。作为含血清培养基，可列举在基础培养基中添加了胎牛血清的含血清培养基。
[0377] 培养温度、CO2浓度等培养条件只要适当设定即可。作为培养温度可列举例如：约30℃～约40℃的范围。优选可列举例如约37℃。另外，作为CO2浓度可列举例如：约1％～约
10％的范围。优选可列举例如约5％。
10％的范围。优选可列举例如约5％。
[0378] 在无血清培养基或含血清培养基中培养上述细胞聚集体时，作为该培养基中包含的Wnt信号转导途径作用物质没有特别限制，只要可增强由Wnt介导的信号转导即可，可列举上文提及的那些。
[0379] 作为无血清培养基或含血清培养基中包含的Wnt信号转导途径作用物质的浓度，在为CHIR99021等常规Wnt信号转导途径作用物质的情况下，可列举例如：约0.1μM～约100μM的范围。优选可列举例如：约1μM～约30μM的范围。更优选可列举例如约3μM的浓度。
[0380] 在无血清培养基或含血清培养基中培养上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”时，作为该培养基中包含的FGF信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要可抑制利用FGF介导的信号转导即可。作为FGF信号转导途径抑制物质，可列举：FGF受体，FGF受体抑制剂(例如，SU-5402，AZD4547，BGJ398)，MAP激酶级联抑制物质(例如，MEK抑制剂，MAPK抑制剂，ERK抑制剂)，PI3激酶抑制剂，Akt抑制剂等。
[0381] 对在无血清培养基或含血清培养基中包含的FGF信号转导途径抑制物质的浓度而言，为能诱导形成多潜能干细胞的聚集体的细胞向视网膜细胞的分化的浓度即可。例如在为SU-5402的情况下，以约0.1μM～约100μM、优选为约1μM～约30μM，更优选为约5μM的浓度添加。
[0382] 本说明书中的“仅在出现表达RPE65基因的细胞之前的期间内培养”意指在出现表达RPE65基因的细胞之前的期间的全部或其一部分内培养。即，只要在培养体系中存在的前述“包含视网膜组织的细胞聚集体”在实质上不表达RPE65基因的细胞组成的期间的全部或一部分(任意时间)内培养即可，通过采用这样的培养，可以得到未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体。在“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”中，包括“完全未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”及“实质上未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”。作为“实质上未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”，可列举在该细胞聚集体中包含的视网膜组织中RPE65阳性细胞的存在比例为约1％以下的细胞聚集体。
[0383] 为了设定这样的特定的期间，可以将上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”作为试样，使用常规基因工程学方法或生物化学方法测定该试样中包含的RPE65基因的表达的有无或其程度即可。具体而言，例如可以使用针对RPE65蛋白质的抗体采用免疫染色的方法，对上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”的冷冻切片检查RPE65基因的表达有无或其程度。
[0384] 作为“在出现表达RPE65基因的细胞之前的期间”，可列举例如，在上述视网膜组织中的CHX10阳性细胞的存在比例，比在包含Wnt信号转导途径作用物质及FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中的上述细胞聚集体的培养开始时减少，成为30％～0％的范围内之前的期间。作为“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”，可列举这样的细胞聚集体，其中在前述视网膜组织中Chx10阳性细胞的存在比例为30％至0％的范围内。
[0385] “到达出现表达RPE65基因的细胞之前的期间”的天数根据Wnt信号转导途径作用物质及FGF信号转导途径抑制物质的种类，无血清培养基或含血清培养基的种类，其它培养条件等而变化，可列举例如：14天以内。更具体而言，在使用无血清培养基(例如：在基础培养基中添加了N2的无血清培养基)的情况下，作为上述期间优选可列举例如：10天以内，更优选可列举例如：2天～6天，进一步具体而言为3天～5天。在使用含血清培养基(例如：在基础培养基中添加了胎牛血清的含血清培养基)的情况下，作为上述期间、优选可列举例如：12天以内，更优选可列举例如：6天～9天。
[0386] 这样进行得到的聚集体可以用作作为本发明的方法的起始物质的发育早期阶段的视网膜组织。
[0387] 然后，如上所述培养得到的“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”在进一步在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中培养1天～50天(相当于“从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段”)、优选为1天～15天(相当于「从神经节细胞出现开始后约5天以内」)，进一步优选为1天～7天(相当于“神经节细胞开始出现的阶段”)后，也可以用作作为本发明的方法中的起始物质的发育早期阶段的视网膜组织，对于所述培养方法，可以参考WO2015/087614(例如：[0076]～[0079]段)。
[0388] 2-6.原料制备方法6
[0389] 能够作为本发明的制备方法的起始物质使用的包含睫状缘区结构体的发育早期阶段的视网膜组织，也可以利用WO2013/183774(&US2015/132787)中记载的方法制备。
[0390] 具体而言，以下聚集体也为发育早期阶段的视网膜组织：经过如下培养步骤得到的聚集体，在所述步骤中，将作为包含视网膜组织的细胞聚集体，上述视网膜组织中的CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体，仅在到达出现表达RPE65基因的细胞之前的期间内，在包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中培养；或将进一步得到的“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”，在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中培养，经过所述培养步骤得到的包含睫状缘区样结构体的聚集体。
[0391] 在此，关于作为原料使用的“作为包含视网膜组织的细胞聚集体，上述视网膜组织中的CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体”，或“Wnt信号转导途径作用物质”，可列举与上述原料制备方法5的情况相同的那些。
[0392] 作为优选的培养，可列举例如悬浮培养。另外，作为优选的培养基，可列举例如无血清培养基。
[0393] 培养温度、CO2浓度等培养条件只要适当设定即可。作为培养温度，可列举例如：约30℃～约40℃的范围。优选可列举例如约37℃。另外，作为CO2浓度可列举例如约1％～约
10％的范围。优选可列举例如约5％。
10％的范围。优选可列举例如约5％。
[0394] 作为该培养基中包含的Wnt信号转导途径作用物质没有特别限制，只要可增强利用Wnt介导的信号转导即可，可列举上文提及的那些。
[0395] 另外，作为无血清培养基或含血清培养基中包含的Wnt信号转导途径作用物质的浓度，在为CHIR99021等常规Wnt信号转导途径作用物质的情况下，可列举例如：约0.1μM～100μM的范围。优选可列举例如约1μM～30μM的范围。更优选可列举例如约3μM的浓度。
[0396] 任选不包含FGF信号转导途径抑制物质，除此以外与制备方法5同样地进行，将该细胞聚集体“仅在出现表达RPE65基因的细胞之前的期间内培养”。
[0397] 作为优选的“到达出现表达RPE65基因的细胞之前的期间”可列举例如：上述视网膜组织中的CHX10阳性细胞的存在比例为50％～1％的范围内的期间。在该情况下，得到的“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”为上述视网膜组织中的CHX10阳性细胞的存在比例为50％～1％的范围内的细胞聚集体。
[0398] “到达出现表达RPE65基因的细胞之前的期间”的天数根据Wnt信号转导途径作用物质的种类，无血清培养基或含血清培养基的种类，其它培养条件等变化，可列举例如：14天以内。更具体而言，在使用无血清培养基(例如：在基础培养基中添加了N2的无血清培养基)的情况下，作为上述期间优选可列举例如：10天以内，更优选可列举例如：2天～6天，进一步具体而言为3天～5天。在使用含血清培养基(你如：在基础培养基中添加了胎牛血清的含血清培养基)的情况下，作为上述期间、优选可列举例如：12天以内，更优选可列举例如：6天～9天。
[0399] 这样进行得到的聚集体可以用作作为本发明的方法的起始物质的发育早期阶段的视网膜组织。然后，如上所述培养得到的“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”，可以直接作为发育早期阶段视网膜组织使用，也可以进一步在不包含Wnt信号转导途径作用物质无血清培养基或含血清培养基中培养1天～50天、优选为1天～15天，进一步优选1天～7天后，用作作为包含发育早期阶段的视网膜组织的聚集体，对于所述培养方法，可以参考WO2015/087614(例如：[0076]～[0079]段)。
[0400] 2-7.原料制备方法7
[0401] 在发育早期阶段的视网膜组织中也可以包含睫状缘区结构体，包含睫状缘区结构体的发育早期阶段的视网膜组织可以采用WO2015/107738(及美国专利申请No.15/112,187)中记载的方法制备。具体而言，例如采用包含下述的步骤的方法制备的视网膜圈(Retinosphere)也能够用作作为本发明的制备方法中使用的方法的起始物质的发育早期阶段的视网膜组织：
[0402] (1)将从由多潜能干细胞诱导分化成的包含睫状缘区样结构体的细胞聚集体得到的细胞进行悬浮增殖培养，得到视网膜圈的步骤。
[0403] 即，“由多潜能干细胞诱导分化成的包含睫状缘区样结构体的细胞聚集体”可以依照上述原料制备方法5或6制备，将由此得到的细胞进行分散并悬浮培养，能够得到视网膜圈。
[0404] 作为所述细胞，可列举使上述“由多潜能干细胞诱导分化成的包含睫状缘区样结构体的细胞聚集体”分散而得到的细胞，使从上述细胞聚集体分离的睫状缘区样结构体分散而得到的细胞，或使从上述细胞聚集体分取的细胞分散而得到的细胞。当将所述细胞在生长因子等存在下以低密度进行悬浮培养时，形成来源于1个细胞，或2～10个细胞左右的少数的细胞的球状的细胞聚集体，即视网膜圈。关于该视网膜圈的制备方法，可以参考WO2015/107738(及美国专利申请No.15/112,187)。
[0405] 具体而言，可以将经分散的细胞在加入了神经细胞培养用添加物及生长因子的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养。作为培养基，优选可列举包含选自由FGF信号转导途径作用物质及EGF信号转导途径作用物质组成的组中的一种以上的物质的无血清培养基或含血清培养基。在此，作为可使用的FGF信号转导途径作用物质，可列举FGF1，bFGF、FGF4，FGF7，FGF8，FGF9等FGF蛋白质及作为FGF信号的辅助剂的肝素(heparine)等，作为EGF信号转导途径作用物质可列举EGF，TGF-α等。
[0406] 如上所述制备的视网膜圈与视网膜组织同样包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞，因此能够用作作为本发明的制备方法的原料的发育早期阶段的视网膜组织。另外，也可以将上述步骤(1)后，在包含BMP信号转导途径作用物质(例如，BMP4)的无血清培养基或血清培养基中悬浮培养的视网膜圈用作作为本发明的制备方法的原料的发育早期阶段的视网膜组织。然后，也可以将如上所述得到的视网膜圈进一步在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或含血清培养基中培养1天～50天、优选为1天～15天，进一步优选为1天～7天后而得到的细胞聚集体用作作为发育早期阶段的视网膜组织。
[0407] 3.包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织(本发明[1]涉及的方法中可使用的原料)的制备
[0408] 在以下对上述本发明[1]中使用的“包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织”进行说明。
[0409] 开始在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基下的培养的期间的视网膜组织，只要是在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养，分化、成熟到可见穆勒细胞的程度时，可使PAX6阴性且CHX10强阳性细胞(例如：双极细胞)，及PAX6阳性且CHX10阴性细胞(例如：无长突细胞，神经节细胞，或水平细胞中的任一种细胞)的比例降低的分化阶段，能够提高视细胞前体细胞和/或视细胞的包含比例的分化阶段即可，没有特别的限定，可优选使用如后所述那样“包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段”的视网膜组织。
[0410] 具体而言，对“包含神经视网膜祖细胞，且神经节细胞刚出现后的分化阶段”的视网膜组织而言，可列举在可检测的水平中检测到作为神经视网膜祖细胞的标记的CHX10、优选为RX，PAX6及CHX10，且在可检测的水平中刚能够检测到作为神经节细胞的标记的TUJ1或BRN3等的分化阶段中，包含能分化为视细胞，以及视网膜色素上皮细胞，神经节细胞，水平细胞，无长突细胞，双极细胞及穆勒细胞中的至少2个以上、优选为5个以上、更优选为6个以上的细胞的神经视网膜祖细胞(例如：CHX10阳性、RX阳性且PAX6阳性细胞)的视网膜组织，该视网膜组织任选包含视网膜祖细胞。
[0411] 在此，是否为“神经节细胞刚出现后的分化阶段”，可以通过特别指定在神经视网膜组织中开始出现作为神经节细胞标记的BRN3阳性细胞的期间来判断。具体而言，作为“神经节细胞刚出现后的分化阶段”，可列举从检测到神经节细胞标记起约10天以内、优选为约5天以内，更优选为1天以内，进一步更优选为1小时以内。例如，该视网膜组织中包含的总细胞数的30％以上、优选为50％以上、更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步更优选为90％以上，特别优选为99％以上为神经视网膜祖细胞，检测到神经节细胞标记阳性(优选地，BRN3阳性)细胞，且其比例为总细胞数的40％以下、优选为20％以下，10％以下，
5％以下，更优选为1％以下，进一步优选为0.1％以下，进一步更优选为0.01％以下的视网膜组织，其任选包含视网膜祖细胞。
5％以下，更优选为1％以下，进一步优选为0.1％以下，进一步更优选为0.01％以下的视网膜组织，其任选包含视网膜祖细胞。
[0412] 例如，作为“包含神经视网膜祖细胞，且神经节细胞刚出现后的分化阶段”的视网膜组织，可列举相当于利用上述的原料制备方法1～4所述的方法制备时，悬浮培养开始后约27天～第40天、优选为第28天～37天，更优选为第28～33天的视网膜组织。
[0413] 另外，例如可列举利用上述的原料制备方法5～7所述的方法制备时，相当于悬浮培养开始后约第33天～第45天、优选为约第33天～第42天，更优选为第33天～第38天(相当于从在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养开始起约第11天～23天、优选为第11天～20天，更优选为第11～16天)的视网膜组织。
[0414] 作为本说明书中处于“包含神经视网膜祖细胞，且神经节细胞刚出现后的分化阶段”的视网膜组织的一种实施方式，可列举视细胞前体细胞或视锥细胞前体细胞开始出现的阶段，例如：CRX阳性细胞或CRX阳性且TRβ2阳性细胞开始出现的阶段的视网膜组织。
[0415] 例如，可列举利用上述的原料制备方法1～4所述的方法制备时，相当于悬浮培养开始后约第30天～45天、优选为约第30天～40天的视网膜组织。
[0416] 例如，可列举利用上述原料制备方法5～7中任一项所述的方法制备时，相当于悬浮培养开始后约第35天～第45天、优选为约第35天～第42天(相当于从在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养开始起约第13天～23天、优选为第13天～20天)的视网膜组织。
[0417] 作为本说明书中“到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段”的视网膜组织的一种实施方式，具体而言可列举“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的视网膜组织”至少1天以上之前的分化阶段的视网膜组织。另外，这里，“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的视网膜组织”为相当于从确认到视锥细胞前体细胞，或视锥细胞的出现起30～50天后、优选为30～40天后的分化阶段。
[0418] 作为开始在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基下的培养的期间的视网膜组织，可优选使用如后所述“包含神经视网膜祖细胞，神经节细胞刚出现后的分化阶段”以后，且尽可能早的分化阶段的视网膜组织。因此，作为“到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的视网膜组织”、优选可列举视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的优选为10天以上之前，更优选为20天以上之前，进一步更优选为30天以上之前，40天以上之前，且出现了神经节细胞的阶段的视网膜组织，即“包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段的神经视网膜组织，视细胞前体细胞或视锥细胞前体细胞开始出现的阶段的任一分化阶段的视网膜组织”。
[0419] 对“包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织”而言，例如：如果是上述原料制备方法1(WO2015/025967)，原料制备方法2(WO2016/063985)及原料制备方法3(WO2016/063986)中记载的方法，相当于从在包含BMP信号转导途径作用物质(例如BMP4)的培养基中培养开始起，约第27天～69天、优选为第28天～60天，更优选为第28～50天，进一步更优选为第28～40天，第28～35天。
[0420] 另外，例如如果是上述原料制备方法4(WO2013/077425)中记载的方法，上述分化阶段相当于从包含基膜制剂(例如Matrigel)的培养基中培养开始起，约第27天～69天、优选为第28天～60天，更优选为第28～50天，进一步更优选为第28～40天，第28～35天。
[0421] 另外，例如如果是上述原料制备方法5(WO2015/087614)，原料制备方法6(WO2013/183774)或原料制备方法7(WO2015/107738)中记载的方法，上述分化阶段相当于可得到包含RPE65阳性的睫状缘区结构体的视网膜组织的阶段，相当于悬浮培养开始后约第33天～第74天、优选为约第33天～第65天，更优选为第33天～第55天，进一步更优选为第33天～第
45天，第33天～第40天，在上述原料制备方法5(WO2015/087614)，原料制备方法6(WO2013/
183774)或原料制备方法7(WO2015/107738)中记载的方法中相当于结束在Wnt信号转导途径作用物质存在下的培养，而从在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养开始起约第11天～52天、优选为第11天～43天，更优选为第1l～33天，进一步更优选为第11～23天，第11～18天。
45天，第33天～第40天，在上述原料制备方法5(WO2015/087614)，原料制备方法6(WO2013/
183774)或原料制备方法7(WO2015/107738)中记载的方法中相当于结束在Wnt信号转导途径作用物质存在下的培养，而从在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养开始起约第11天～52天、优选为第11天～43天，更优选为第1l～33天，进一步更优选为第11～23天，第11～18天。
[0422] 即，对制备“发育早期阶段的视网膜组织”的步骤；及培养“发育早期阶段的视网膜组织”制备“包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织”的步骤而言，也可以不鉴定或者分离发育早期阶段的视网膜组织，没有步骤的界线地连续地进行。
[0423] 4.抑制双极细胞，无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞分化的方法
[0424] 作为本发明的一种实施方式，可列举在包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中，双极细胞，神经节细胞，无长突细胞，和/或水平细胞的分化的抑制方法。
[0425] 根据本发明的抑制分化的方法，通过将“包含神经视网膜祖细胞，且处于神经节细胞刚出现后的分化阶段的视网膜组织”，即“包含神经视网膜祖细胞，且处于神经节细胞刚出现后的分化阶段的细胞聚集体”，在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养，能够使包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞及双极细胞，它们的前体细胞中的至少1个的细胞数，或它们的总细胞数的比例降低，视细胞前体细胞及视细胞的比例提高。另外，根据本发明的抑制分化的方法，能够使双极细胞的比例降低，视细胞前体细胞及视细胞的比例提高。
[0426] 进一步，可以制作在构成视网膜组织的各层中，能够在有双极细胞及无长突细胞等存在的内核层、有神经节细胞存在的神经节细胞层这样的基膜侧的细胞层形成异位性视细胞层(也称为视细胞前体细胞层)，移植时，接受者的双极细胞和移植的视网膜组织内包含的视细胞前体细胞在空间，或物理的距离上接近的，适于移植的视网膜组织。
[0427] 在为包含视细胞前体细胞和/或视细胞的移植用的视网膜组织的一个实施方式的，分化，成熟为在神经视网膜组织内可见穆勒细胞的程度的阶段中，本领域技术人员了解：PAX6阴性/CHX10强阳性细胞为双极细胞，PAX6阳性/CHX10阴性细胞为神经节细胞，无长突细胞或水平细胞。因此，对在本说明书中包含的视细胞前体细胞的移植用的神经视网膜组织中，是否可以使在移植时不需要的双极细胞，无长突细胞，神经节细胞和/或水平细胞的比例降低，可以特别指定例如：分化，成熟至可见穆勒细胞的程度的阶段的视网膜组织中包含的PAX6阴性/CHX10强阳性细胞，和/或PAX6阳性/CHX10阴性细胞的比例即可。另外，在该视网膜组织内是否可见穆勒细胞，只要确认例如CRALBP阳性细胞和/或CRABP阳性细胞存在即可。
[0428] 在此添加的甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度没有特别的限定，只要是双极细胞，以及无长突细胞，神经节细胞及水平细胞中的任一种细胞的分化抑制的程度的浓度，且不抑制视细胞前体细胞的分化的程度的浓度即可，可以测定双极细胞，无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞的标记为阳性细胞数与视细胞前体细胞标记阳性细胞数的比例而适当设定。
[0429] 添加的甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度可以设定为使得例如在相对于分化到穆勒细胞出现了的程度的，后期的分化阶段(例如，将利用上述原料制备方法1～3，4，或5～7所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，相当于悬浮培养开始后约第180～200天)的神经视网膜组织中包含的全部细胞，PAX6阴性/CHX10强阳性细胞为8％以下，优选6％以下，更优选为5％以下的方式。或，可以设定甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度，使得PAX6阳性/CHX10阴性细胞的比例为30％以下、优选为20％以下，更优选为15％以下的方式。或，可以设定甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度，使得视细胞(或视细胞前体细胞)的比例为40％以上、优选为45％以上、更优选为50％以上的方式。
[0430] 或者对添加的甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度而言，甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度只要设定为使得例如在视锥细胞前体细胞(例如：CRX阳性且TRβ2阳性细胞，或CRX阳性且RXR-γ阳性细胞)的出现率为最大的分化阶段的视网膜组织(即，在从确认到视锥细胞前体细胞的出现起30～50天后、优选为30～40天后的分化阶段，或在例如利用原料制备方法1～4所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，相当于悬浮培养开始后约第60～70天，利用原料制备方法5～7所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，悬浮培养开始后约第65～75天的分化阶段)中，观察到在成神经细胞层(NBL)的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞的程度，且，在包含NBL的顶端面侧出现的视细胞前体细胞数及视细胞的细胞数，与在NBL的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞数及视细胞的细胞数的每单位面积的比例为10∶1～1∶10、优选为2∶1～1∶2，更优选为10∶7～7∶10左右即可。这里，“每单位面积的比例”可通过以下顺序鉴定。1)由本领域技术人员通过通常实施的切片制作方法，及免疫染色等方法特别指定神经视网膜组织和该处中包含的细胞，2)使用图像分析软件等测量，比较神经视网膜组织的每一定的面积(即，每单位面积)中包含的CRX阳性细胞。通过这样进行，由此能够比较在包含NBL的顶端面侧出现的视细胞前体细胞数与在NBL的基底面侧出现的异位性视细胞前体细胞数的每单位面积的比例。这里，神经视网膜组织能够通过如下特别指定：例如与针对上述神经视网膜组织及神经视网膜组织中包含细胞的标记进行联合，鉴定顶端面，基膜，和/或DAPI阳性细胞核存在的区域而比较位置关系。另外，作为顶端面的标记，可列举例如：非典型-PKC(以下简写为aPKC)，E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白，作为基膜的标记为层粘连蛋白(Laminin)，IV型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，巢蛋白等，可以利用针对这些标记的抗体等。另外，NBL可以作为神经视网膜祖细胞进行增殖的层而从视网膜结构中大致鉴定，也可以作为有在NBL中存在的神经视网膜祖细胞，和/或神经视网膜中包含的增殖细胞存在的层而使用针对CHX10，RX，PAX6和/或Ki67的抗体进行鉴定。
[0431] 或者，添加的甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度只要设定为使得该分化阶段(视锥细胞前体细胞(例如：CRX阳性且TRβ2阳性细胞，或CRX阳性且RXR-γ阳性细胞)的出现率为最大的分化阶段)的视网膜组织中，相对于神经视网膜组织中包含的全部细胞，为CRX阳性细胞的视细胞前体细胞的比例为11％以上、优选为15％以上，进一步优选为20％以上即可。或者，只要没定使得相对于神经视网膜组织中包含的全部细胞，该分化阶段的视网膜组织中CRX阳性且TRβ2阳性细胞的比例为7％以上、优选为10％以上，进一步优选为11％以上的方式即可。
[0432] 在作为甲状腺激素信号转导途径作用物质使用T3的情况下，可以例如以使得为0.1～1000nM的范围的方式添加到培养基中。可列举具有相当于优选1～500nM；更优选为10～100nM；进一步优选为30～90nM；进一步更优选为60nM前后的浓度的T3的甲状腺激素信号转导亢奋活性的浓度。
[0433] 作为甲状腺激素信号转导途径作用物质使用T4的情况下，可以例如以使得为1nM～500μM的范围的方式添加到培养基中。优选为50nM～50μM；更优选为500nM～5μM的范围。
[0434] 或者，添加的甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度只要设定使得为视杆细胞前体细胞(或双极细胞)开始出现的分化阶段的视网膜组织中，相对于神经视网膜组织中包含的全部细胞，视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)的比例为20％以上、优选为25％以上，进一步优选为30％以上的方式即可。或者，添加的甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度只要设定使得在该分化阶段中，在视网膜组织中，沿着与顶端面的切线垂直相交的直线有平均2个细胞、优选为平均3个细胞以上、更优选为平均4个细胞以上为视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)的方式即可。另、优选为可以确定添加的甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度而使得该分化阶段中在视网膜组织中NBL的基膜侧含有异位性视细胞前体细胞。
[0435] 作为开始在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基下的培养的期间，没有特别的限定，为在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养，分化、成熟到穆勒细胞可见的程度时，能使PAX6阴性且CHX10强阳性细胞(例如：双极细胞)，及PAX6阳性且CHX10阴性细胞(例如：无长突细胞，神经节细胞，或水平细胞中的任一种细胞)的比例降低的分化阶段，只要在能够提高视细胞前体细胞和/或视细胞的包含比例的分化阶段前开始即可，可列举优选为上述的包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一时期。
[0436] 这里，对“到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段”而言，具体而言可列举“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段”至少1天以上之前的分化阶段的视网膜组织。
[0437] 另外，开始在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基下的培养的期间，优选为原料的神经视网膜组织在“包含神经视网膜祖细胞，神经节细胞刚出现后的分化阶段”以后且尽可能早的分化阶段前开始，因此，作为“到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段”的期间，可列举优选为视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的10天以上之前，更优选为20天以上之前，进一步更优选为30天以上之前，40天以上之前，且出现了神经节细胞的阶段，即具体而言优选从“包含神经视网膜祖细胞，且神经节细胞刚出现后的分化阶段”到“视细胞前体细胞或视锥细胞前体细胞开始出现的阶段”。
[0438] 另外，神经节细胞刚出现后的分化阶段，即，神经节细胞或视锥细胞前体细胞开始出现的期间，可通过将含有包含神经视网膜祖细胞，且未出现神经节细胞的分化阶段的视网膜组织的聚集体在培养液中悬浮培养，并鉴定神经节细胞，视锥细胞前体细胞，或视细胞前体细胞标记阳性细胞最初出现的期间而由此确定。具体而言，例如将正在进行分化的视网膜组织隔一定时期(例如1天)进行回收((例如从培养开始起26天后，27天后，28天后，29天后，30天后，31天后，32天后，33天后，34天后，35天后，36天后，37天后，38天后，39天后，40天后，41天后，42天后)，利用多聚甲醛等固定后，制作冷冻切片。可以对该冷冻切片使用例如抗BRN3抗体，抗CRX抗体，抗TRβ2抗体，抗RXR-γ抗体等染色，同时使用DAPI等将细胞核染色后，鉴定神经节细胞(BRN3阳性细胞)，视锥细胞前体细胞(CRX及RXR-γ，或CRX及TRβ2阳性细胞)，或视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)出现的期间。
[0439] 另外，对于本领域技术人员而言，可采用具有视锥细胞前体细胞标记的免疫染色及基于DAPI的核染色等鉴定视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段。
[0440] 具体而言，例如将正在进行分化的视网膜组织隔一定期间(例如1-20天)进行回收(例如从培养开始起40天后，50天后，60天后，70天后，80天后)，用多聚甲醛等固定后，制作冷冻切片。可以对该冷冻切片使用例如抗CRX抗体，抗TRβ2抗体，抗RXR-γ抗体等染色，同时使用DAPI等将细胞核染色后，鉴定视锥细胞前体细胞(即表达CRX及RXR-γ，或，CRX及TRβ2的细胞)的比例。此时，通过多个时期(时刻)求出在上述一定期间中出现的视锥细胞前体细胞标记阳性细胞相对于总细胞数的比例，即出现率，由此可以特别指定锥细胞前体细胞标记阳性细胞的出现的比例最高的期间，并作为“视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的时期”。
[0441] 另外，在特定的时期(例如1～7天)，在培养液中添加处于细胞增殖期的细胞(在此为具有增殖潜能的视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞)可摄入的BrdU或EdU等，并通过以本领域技术人员众所周知的免疫染色等测定摄入了BrdU或EdU等的细胞作为上述的表达视锥细胞前体细胞标记的细胞而分化的比例，从而判定该比例和分化阶段的关系(例如：该比例为最高的时期(阶段)等等)，可以鉴定“视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的时期”。
[0442] 具体而言，例如能够采用以下顺序进行鉴定：
[0443] 1)将BrdU或EdU在任意1天添加到培养任意分化阶段的视网膜组织的培养液中进行培养(例如，从培养开始40天之后～41天之后，从41天之后～42天之后，从42天之后～43天之后这样的方式，从培养开始到80天之后反复进行隔1天添加BrdU而培养1天的操作)，对在其后立即回收的视网膜组织测定BrdU或EdU阳性细胞中的CRX及RXR-γ阳性细胞的比例，或CRX及TRβ2阳性细胞的比例的步骤，
[0444] 2)比较测定结果，鉴定BrdU或EdU阳性中，CRX及RXR-γ阳性细胞的增加比例，或CRX及TRβ2阳性细胞的增加比例变得最高的视网膜组织的步骤；及
[0445] 3)将培养BrdU或EdU阳性中，CRX及RXR-γ阳性细胞的增加比例，或CRX及TRβ2阳性细胞的增加比例变得最高的视网膜组织时，将BrdU或EdU添加到培养液中的期间(例如：1天)，鉴定为“视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的期间”的步骤。
[0446] 具体而言，“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段”相当于从确认到视锥细胞前体细胞的出现起30～50天后、优选为30～40天后。
[0447] 在实施本发明的方法之时，优选使用不包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基预先鉴定上述“视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的期间”。
[0448] 在使用由多潜能干细胞制备的细胞聚集体的情况下，特别是使用利用原料制备方法1～4所述的方法制备的视网膜组织的情况下，开始在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基下的培养的期间具体而言为从视细胞前体细胞最初出现起60～65天以内(悬浮培养开始约95天以内)；优选为从视细胞前体细胞最初出现起30～40天以内(悬浮培养开始约60～70天以内；上限为到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的期间)；更优选为视细胞前体细胞最初出现之时，或其以前(悬浮培养开始约30～40天以内；进一步更优选为神经节细胞刚出现后之时(悬浮培养开始约第28～33天)。
[0449] 在使用由多潜能干细胞制备的细胞聚集体的情况下，特别是使用利用原料制备方法5～7所述的方法制备的视网膜组织的情况下，开始在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基下的培养的期间具体而言为从视细胞前体细胞最初出现起60～65天以内(悬浮培养开始约100天以内)；优选为从视细胞前体细胞最初出现起30～40天以内(悬浮培养开始约65～75天以内；上限为到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的期间)；更优选为视细胞前体细胞最初出现之时或其以前(悬浮培养开始约35～42天以内)；或为神经节细胞刚出现后之时(悬浮培养开始约第33～38天)。
[0450] 在甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下的培养优选在从神经视网膜祖细胞到出现视锥细胞前体细胞的期间继续。
[0451] 对视锥细胞前体细胞出现的期间而言，可以通过将在作为对象的视网膜组织中的增殖细胞可摄入的BrdU或EdU等添加到培养液中，使用抗体鉴定摄入了BrdU或EdU等到细胞是否表达视锥细胞前体细胞的标记而设定。例如，可以在将BrdU隔一定时期(例如第30天起1天，第40天起1天，第50天起1天，第60天起1天，第70天起1天，第80天起1天，第90天起1天等)添加到培养基中后不久，对视网膜组织进行分析的结果，在可观察到BrdU阳性且视锥细胞前体细胞的标记阳性细胞到情况下，将添加了BrdU的期间鉴定为视锥细胞前体细胞出现的期间。
[0452] 更具体而言，可列举从视锥细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段起65天～70天后的期间。
[0453] 另外，作为在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的期间，可列举“能分化为双极细胞，无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞的期间”。该期间可以作为从神经视网膜祖细胞重新出现双极细胞，无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞的期间鉴定。
[0454] 具体而言，可以通过将在发育早期阶段的视网膜组织中的细胞可摄入的BrdU或EdU等添加到培养液中，使用抗体鉴定摄入了BrdU或EdU等的细胞(在此为神经视网膜祖细胞)是否表达无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞的标记而设定。例如，可以在将BrdU隔一定时期(例如，悬浮培养开始后第60天起1天，第70天起1天，第90天起1天，第110天起1天，第130天起1天等)添加到培养基中后不久，对视网膜组织进行分析的结果，在可观察到BrdU阳性且无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞的标记阳性细胞情况下，将添加了BrdU的期间(若为1天，则为该天)鉴定为能出现无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞的期间(天)。
[0455] 另外，对无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞开始出现的期间而言，可以将包含视网膜组织的聚集体在培养液中悬浮培养，鉴定无长突细胞，神经节细胞，和/或水平细胞标记阳性细胞最初出现的期间。作为该标记，除了作为神经节细胞标记的BRN3等以外，可以使用例如在无长突细胞及水平细胞的祖细胞中共同表达的PTF1a。
[0456] 另外，对在甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下的培养而言，优选在从神经视网膜祖细胞能分化为PAX6阴性/CHX10强阳性细胞，及PAX6阳性/CHX10阴性细胞等，即双极细胞，及无长突细胞，神经节细胞，水平细胞中的任一种细胞的期间继续。另外，在制备视锥细胞前体细胞的情况下，也可以继续进行在甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下的培养，直到得到目标细胞。
[0457] 例如，可列举通常从神经节细胞最初开始分化的，即出现后不久的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段；例如：在上述原料制备方法1～4的情况下，相当于悬浮培养开始后30～40天后，在上述原料制备方法5～7的情况下，为35～42天后)起，到至少发育早期的视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的期间；优选地，为从神经节细胞最初开始分化的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段，到双极细胞(或视杆细胞前体细胞)进行分化的分化阶段的期间。这里，双极细胞(或视杆细胞前体细胞)开始出现的阶段，可通过使用对本领域技术人员而言普通的免疫染色等办法，特别指定作为双极细胞标记的CHX10强阳性且PAX6阴性细胞开始出现的阶段(或为视杆细胞前体细胞标记的NRL阳性且CRX阳性细胞开始出现的阶段)而确定。具体而言，双极细胞(或视杆细胞前体细胞)开始出现的阶段为从双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)出现起20天以内、优选为15天以内，更优选为10天以内，进一步优选为5天以内的分化阶段，为包含向双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)分化的阶段的神经视网膜祖细胞的分化阶段。神经视网膜祖细胞是否为向双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)分化的阶段，可以通过将为视网膜组织中的增殖细胞的神经视网膜细胞可摄入的BrdU或EdU等添加到培养液中，使用抗体鉴定摄入了BrdU或EdU等的细胞是否表达双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)的标记而设定。例如，在将BrdU隔一定时期(例如到悬浮培养开始后第90，91，92，93，94天～第110天的1天等)添加到培养基中后不久，对视网膜组织进行分析的结果，可观察到BrdU阳性且双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)标记阳性细胞情况下，可以将添加了BrdU的期间(若为1天，则为该天)鉴定为包含向双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)分化的阶段的神经视网膜组织的阶段。或者，也可以作为检测到双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)标记阳性细胞，检测到且已知在视细胞前体细胞中一过性地表达的BLIMP1阳性细胞的阶段而鉴定。此时，由于甲状腺激素信号转导途径作用物质存在抑制双极细胞(或视杆细胞前体细胞)的出现的作用，因此优选使用不包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基预先鉴定上述阶段。更具体而言，可列举从神经节细胞最初开始分化的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段)到35天～45天后的期间；优选为从神经节细胞最初开始分化的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段)到65天～70天后的期间。
[0458] 从抑制视杆细胞前体细胞的分化的观点出发，优选从在神经节细胞最初开始分化的，即神经节细胞刚出现后的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段；相当于悬浮培养开始后第30天～45天后)，到形成外丛状层的分化阶段，即表达外网织层标记的期间、优选为到穆勒细胞出现，即到表达穆勒细胞标记的期间添加甲状腺激素信号转导途径作用物质。更具体而言，可列举从神经节细胞最初开始分化的，即神经节细胞刚出现后的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段)起90～100天后的期间、优选为150～160天后以后的期间。
[0459] 从提高视锥细胞前体细胞的比例，不使视杆细胞前体细胞的比例降低的观点出发，优选在从神经节细胞最初开始分化的，即神经节细胞刚出现后的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段)起，到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的期间添加甲状腺激素信号转导途径作用物质。更具体而言，可列举从神经节细胞最初开始分化的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段)起到30天～50天后、优选为30天～40天后的期间。
[0460] 另外，也可以继续在甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下进行培养到使用得到的视网膜组织(例如向接受者的移植)的期间。更具体而言，可列举从神经节细胞最初开始分化的，即神经节细胞刚出现后的分化阶段(或视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段)，到使包含视细胞前体细胞和/或视细胞的视网膜组织分化到能对接受者移植的阶段的期间。即，在甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下培养到制备移植用细胞聚集体的最终阶段为止，也是另外优选的实施方式之一。
[0461] 例如，作为“神经节细胞刚出现后的分化阶段”的视网膜组织，可列举在利用上述的原料制备方法1～4所述的方法制备时，相当于悬浮培养开始后约第27天～40天、优选为第28天～37天，更优选为第28～33天的视网膜组织。在利用上述的原料制备方法5～7所述的方法制备时，可列举相当于悬浮培养开始后约第33天～第45天、优选为约第33天～第42天，更优选为第33天～第38天(相当于从开始在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养起约第11天～23天、优选为第11天～20天，更优选为第11～16天)的视网膜组织。
[0462] 例如，对“视细胞前体细胞最初开始分化的分化阶段”的视网膜组织而言，可列举利用上述的原料制备方法1～4所述的方法制备时，相当于悬浮培养开始后约第30天～45天、优选为约第30天～40天的视网膜组织。利用上述原料制备方法5～7中任一项所述的方法制备时，可列举相当于悬浮培养开始后约第35天～第45天、优选为约第35天～第42天(相当于从开始在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养起约第13天～23天、优选为第13天～20天)的视网膜组织。
[0463] 另外，对于在根据本发明的抑制分化的方法形成的包含视网膜组织的聚集体中的外网织层形成的期间，即外网织层标记表达的期间，可以如上述所述在悬浮培养结束后，将培养前和培养后的该聚集体作为试样，使用常规的基因工程学方法或生物化学方法进行测定、比较该试样中包含的PSD95基因的表达有无或其程度。具体而言，可以将培养前和培养后的“包含视网膜组织的聚集体”的冷冻切片使用针对PSD95蛋白质的抗体采用进行免疫染色的方法，在视细胞层(外核层)的基膜侧确认到PSD95蛋白质阳性的区域时，判断为形成了外网织层。另外，在根据本发明的抑制分化的方法形成的包含视网膜组织的聚集体中，对穆勒细胞是否可见而言，只要确认例如存在CRALBP阳性细胞，和/或CRABP阳性细胞即可。
[0464] 另外，作为本发明的优选一种实施方式，可列举使视锥细胞前体细胞的比例增加，抑制双极细胞，无长突细胞，神经节细胞和/或水平细胞的分化的方法，其包括通过将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段，到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织，在包含T3等甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养，由此使得视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的神经视网膜组织中，在视网膜组织中包含的总细胞数中，CRX阳性细胞、及CRX阳性且TRβ2阳性的视锥细胞前体细胞分别为约22％及约11％左右以上。
[0465] 另外，作为本发明的优选一种实施方式，可列举使视锥细胞前体细胞的比例增加，抑制双极细胞，无长突细胞，神经节细胞和/或水平细胞的分化的方法，其包括通过将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段，到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织，在包含T3等甲状腺激素信号转导途径作用物质及BMP或者环巴胺-KAAD等背侧化信号转导物质的培养基中培养，由此使得在视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的神经视网膜组织中，在视网膜组织中包含的总细胞数中，CRX阳性细胞的视细胞前体细胞、及CRX阳性且TRβ2阳性的视锥细胞前体细胞分别为约29％以上及约15％以上。
[0466] 另外，作为本发明另外优选一种实施方式，可列举使视锥细胞前体细胞的比例增加，抑制双极细胞，无长突细胞，神经节细胞和/或水平细胞的分化的方法，其包括通过将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段，到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织，在包含T3等甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养，由此使得在分化为可见CRABP，CRALBP等穆勒细胞标记阳性细胞的程度的阶段的视网膜组织中，在视网膜组织中包含的总细胞数中，为CRX阳性的视细胞前体细胞，或CRX阳性且RXR-γ阳性且NRL阴性的视锥细胞前体细胞分别为约53％以上，及约44％以上。
[0467] 另外，作为本发明的优选一种实施方式，可列举使视锥细胞前体细胞的比例增加，抑制双极细胞，无长突细胞，神经节细胞和/或水平细胞的分化的方法，其包括通过将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段，到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织，在包含T3等甲状腺激素信号转导途径作用物质及BMP或者环巴胺-KAAD等背侧化信号转导物质的培养基中培养，由此使得在分化为可见CRABP，CRALBP等穆勒细胞标记阳性细胞的程度的阶段的视网膜组织中，在视网膜组织中包含的总细胞数中，为CRX阳性的视细胞前体细胞，或CRX阳性且RXR-γ阳性且NRL阴性的视锥细胞前体细胞分别为约50％以上。
[0468] 另外，在本发明的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞的抑制分化的方法中，通过在包含为甲状腺激素信号转导途径作用物质的T3和/或为背侧化信号转导物质的环巴胺-KAAD的培养基中培养，由此可以不使CHX10强阳性且PAX6阴性的细胞的比例变化，而使PAX6阳性且CHX10阴性的细胞的比例进一步减少(例如，参考实施例8)。另外，在利用也包含背侧化信号转导物质和甲状腺激素信号转导途径作用物质中的任一物质的培养基进行培养时，对于将这些物质添加到培养液中时的顺序而言可以是任一种在先，没有特别的限定。
[0469] 作为本发明的抑制分化的方法中的视网膜组织及神经视网膜组织，可列举源自干细胞的视网膜组织及神经视网膜组织。在此，作为干细胞，可列举上述的多潜能干细胞，或源自生物体视网膜的干细胞。作为多潜能干细胞、优选可列举ES细胞或人工多功能性干细胞(iPS细胞)。
[0470] 5.背侧化信号转导物质的添加
[0471] 在本发明的神经节细胞等的分化的抑制方法(上述[1]～[12]及上述4.)，及神经视网膜组织的制备方法(上述[13]～[26]及后述的6.)(在下文中，也合称为本发明的方法)中，无论上述甲状腺激素信号转导途径作用物质的添加的有无，都能够通过在包含背侧化信号转导物质的培养基中培养，与没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，促进视锥细胞前体细胞的出现，提高视细胞前体细胞，和/或视锥细胞前体细胞的比例。即，与上述甲状腺激素信号转导途径作用物质进行单独发挥作用的方法相比，通过与甲状腺激素信号转导途径作用物质联合而包含背侧化信号转导物质的培养基中培养，可能将视网膜组织中包含的视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例进一步提高，使双极细胞，无长突细胞，神经节细胞，水平细胞及它们的前体细胞中的至少1个，或它们的总细胞数的比例降低。
[0472] 以下对背侧化信号转导物质的添加方法，时期，期间进行说明。这里，背侧化信号转导物质的添加方法，时期，期间可以不依赖于甲状腺激素信号转导途径作用物质的添加的有无，添加方法，时期，期间而确定。
[0473] 通过将从发育早期阶段到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的视网膜组织，在包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基中培养，由此可以使视网膜组织中包含的视细胞前体细胞(photoreceptor precursor)及视细胞(photoreceptor)中的视锥细胞前体细胞的比例增加。背侧化信号转导物质的浓度优选为不诱导最背侧的标记的表达的程度的浓度。
[0474] 作为上述“腹侧标记”，具体而言，可列举VAX2，COUP-TF I或ALDH1A3。
[0475] 上述“最背侧的标记”是指在发育的阶段中，在视网膜组织的最背侧区域中存在的细胞中表达的标记，也可以说是由于过量，或比较强力的背侧化信号引起表达升高的标记。作为视网膜组织中最背侧的标记，具体而言，可列举由于过量的背侧化信号引起在向视网膜色素上皮或者其前体细胞分化的细胞中表达的RPE65或MITF，COUP-TF II、优选为由于比较强力的背侧化信号引起在神经视网膜组织中表达的COUP-TF II等。
[0476] 在此，对本领域技术人员而言，可容易地确定“抑制腹侧标记表达的程度的浓度”。例如，可以使用针对上述腹侧标记的抗体等采用免疫染色等办法，在从最初出现视细胞前体细胞的阶段”到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的任一阶段的视网膜组织中，例如在视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的视网膜组织中，与没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，使用ImageJ等图像分析软件分析可见上述腹侧标记的表达的区域，适当将该表达被抑制的区域增大的背侧化信号转导物质的浓度，作为用于使视锥细胞前体细胞的比例增大的适当的浓度而确定。即，可以以在包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中，可见上述腹侧标记的表达的区域为50％以下、优选为20％以下，更优选为
1％以下，进一步更优选为0.01％以下的方式确定添加的背侧化信号转导物质的浓度。或者，可以利用作为腹侧化信号转导物质的BMP信号转导途径抑制物质进行腹侧化，将ALDH1A3等腹侧标记为高表达的视网膜组织作为指标，使得与其相比，ALDH1A3的基因表达量为50％以下、优选为20％以下，更优选为5％以下的方式确定添加的背侧化信号转导物质的浓度。
1％以下，进一步更优选为0.01％以下的方式确定添加的背侧化信号转导物质的浓度。或者，可以利用作为腹侧化信号转导物质的BMP信号转导途径抑制物质进行腹侧化，将ALDH1A3等腹侧标记为高表达的视网膜组织作为指标，使得与其相比，ALDH1A3的基因表达量为50％以下、优选为20％以下，更优选为5％以下的方式确定添加的背侧化信号转导物质的浓度。
[0477] 另外，对本领域技术人员而言，可适当确定“不诱导最背侧的标记程度的浓度”。例如，可以采用使用针对上述最背侧的标记的抗体等的免疫染色等办法，在视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的视网膜组织中，使用ImageJ等图像分析软件分析可见上述最背侧的标记的表达的区域，使得没有确认到最背侧的标记的表达诱导的区域(在此，“没有确认到表达诱导”是指，与生物体的最背侧的神经视网膜组织中的表达量相比为1/5以下、优选为1/10以下，进一步优选为1/50以下)为神经视网膜组织的50％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上，进一步更优选为99％以上的方式适当确定背侧化信号转导物质的浓度。
[0478] 作为一种实施方式，可列举使视网膜组织中包含的视细胞前体细胞(photoreceptor precursor)及视细胞(photoreceptor)中的视锥细胞前体细胞的比例增加的方法，其包括将从发育早期阶段到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的视网膜组织，在包含促进背侧标记的表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基中培养的步骤。
[0479] 对本领域技术人员而言，可容易地确定“促进背侧标记的表达的程度的浓度”。例如，可通过分析上述背侧标记的蛋白质或基因(mRNA)的表达量，由此容易地确定。具体而言，可以将各种浓度的背侧化信号转导物质添加到培养基中，通过免疫染色，或定量PCR而确定背侧的表达量，或基因表达量变得最高的浓度。
[0480] 例如，可以以CYP26A1和/或CYP26C1的表达被最强力诱导的程度的浓度的方式来确定背侧化信号转导物质的浓度。具体而言，与利用上述的BMP信号转导途径抑制物质进行腹侧化而使CYP26A1的表达受到抑制的视网膜组织相比，为CYP26A1的表达量为1.2倍以上、优选为1.5倍以上、更优选为2倍以上的程度的浓度。其中，在基于CYP26A1和/或CYP26C1的表达量来确定背侧化信号转导物质的浓度时，由于全反式(all反式)视黄酸，9-顺式视黄酸等视黄酸类会以与背侧化的程度无关地过量地诱导这些基因表达，而使背侧化信号转导物质的浓度确定变得困难，因此，优选使用实质上添加不视黄酸类的培养基进行确定。
[0481] 另一方面，在为ALDH1A1的情况下，ALDH1A1在CYP26A1阳性区域中为较弱表达，随着进一步接近背侧，表达量连续地提高。即，ALDH1A1为与CYP26A1或CYP26C1阳性区域相比，在作为神经视网膜组织中最背侧的COUP-TF II阳性区域中表达量更高的标记。因此，期望ALDH1A1的表达不要过高。具体而言，在视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段中，ALDH1A1阳性细胞的频率为约1％以下。即，期望将背侧化信号转导物质的浓度调整至在该阶段中ALDH1A1的表达充分降低的程度的浓度。
[0482] 在此，对本领域技术人员而言，可确定“ALDH1A1的表达充分降低的程度的浓度”。例如，可以使用针对ALDH1A1的抗体等采用通常实施的免疫染色等办法，在视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的视网膜组织中，使用ImageJ等图像分析软件分析表达ALDH1A1的区域，确定为该区域为视网膜组织中的神经视网膜组织的50％以下、优选为20％以下，更优选为10％以下，进一步更优选为1％以下的程度的浓度。或者，可以采用定量PCR等对于所述视网膜组织的基因表达量进行测定。即，如果加入例如0.45nM～1.35nM这样的比较高浓度的BMP4，则ALDH1A1的表达被过量诱导。因此，ALDH1A1的表达量优选为可以确定为与添加
1.35nM的BMP4而进行诱导分化的情况相比为30％，更优选为15％，进一步更优选为10％以下的程度的浓度。
1.35nM的BMP4而进行诱导分化的情况相比为30％，更优选为15％，进一步更优选为10％以下的程度的浓度。
[0483] 作为本发明的一种实施方式，作为“抑制腹侧标记表达，且不诱导最背侧的标记的表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质”，可列举在相对于视网膜组织中包含的细胞，视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段的视网膜组织中，相对于神经视网膜组织中包含的总细胞数而言，表达OC2的细胞数的比例与没有添加背侧化信号转导物质的情况相比，抑制到约20％～70％、优选为约30％～70％，更优选为约50％～65％为左右，或与添加了上述BMP信号转导途径抑制物质的情况相比，为约30％～60％、优选为约40％～50％的程度的浓度的背侧化信号转导物质。或，可列举在与没有添加背侧化信号转导物质的情况下，和/或添加了上述BMP信号转导途径抑制物质的情况相比，OC2阳性细胞的OC2蛋白质的表达量被抑制到平均约20％～70％、优选为约30％～70％，更优选为约30～40％的程度的浓度的背侧化信号转导物质。
[0484] 这里，对于神经视网膜组织中包含的OC2阳性细胞数的比例，可以使用抗OC2抗体，DAPI等实施对本领域技术人员而言通常能实施的免疫染色等，测定OC2阳性细胞数，DAPI阳性细胞数等，鉴定在神经视网膜组织中的包含比例。对OC2蛋白质的表达量而言，对本领域技术人员而言如果使用抗OC2抗体，DAPI等实施通常能实施的免疫染色等，使用ImageJ等图像分析软件分析利用抗OC2抗体染色的区域，则可鉴定OC2阳性细胞的信号强度。或者，神经视网膜组织中包含的OC2阳性细胞数的比例，和/或OC2阳性细胞的OC2蛋白质的表达量，也可以根据使用针对OC2蛋白质的抗体采用普通流式细胞术的分析而鉴定。
[0485] 另外，在培养基中加入甲状腺激素信号转导途径作用物质的情况下，OC2阳性细胞增加，另一方面OC2蛋白质的表达量的平均值降低。因此，背侧化信号转导物质的浓度设定时，期望使用不包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基来预先确定。
[0486] 另一方面，在将ALDH1A1，ALDH1A3，COUP-TFI，COUP-TF II等作为指标而确定背侧化信号转导物质的浓度时，可以在培养基中添加甲状腺激素信号转导途径作用物质，但由于甲状腺激素信号转导途径作用物质对腹侧化及背侧化给予的影响并不清楚，因此，优选使用不包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基预先确定背侧化信号转导物质的浓度。
[0487] 另外，对本领域技术人员而言，上述“最初出现视细胞前体细胞的阶段”可采用基于视细胞前体细胞标记，和/或视锥细胞前体细胞标记的免疫染色及基于DAPI的核染色等而鉴定。具体而言，例如将正在进行分化的视网膜组织利用多聚甲醛等固定后，制作冷冻切片。可以对冷冻切片使用例如CRX抗体，TRβ2抗体，RXR-γ抗体等染色，同时使用DAPI等将细胞核染色后，鉴定在视网膜组织中最初出现视细胞前体细胞和/或视锥细胞前体细胞的阶段。
[0488] 另外，对本领域技术人员而言，上述“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段”可采用基于视细胞前体细胞标记，和/或视锥细胞前体细胞标记的免疫染色及基于DAPI的核染色等鉴定。
[0489] 具体而言，例如将正在进行分化的视网膜组织隔一定时期(例如1～20天)回收(例如从培养开始起40天后，50天后，60天后，70天后，80天后)，用多聚甲醛等固定后，制作冷冻切片。对该冷冻切片使用例如CRX抗体，TRβ2抗体，RXR-γ抗体等染色，同时使用DAPI等将细胞核染色之后，鉴定相对于神经视网膜组织中包含的总细胞数，视锥细胞前体细胞数(即CRX及RXR-γ、或表达CRX及TRβ2的细胞数)的比例。此时，通过多个时期(时刻)求出在上述一定期间中出现的视锥细胞前体细胞标记阳性细胞相对于总细胞数的比例，即出现率，由此可以特别指定锥细胞前体细胞标记阳性细胞的出现的比例为最高的期间并作为“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段”。
[0490] 另外，在特定的时期(例如1～7天)，在培养液中添加处于细胞增殖期的细胞(在此为具有增殖潜能的视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞)可摄入的BrdU或EdU等，并将摄入了BrdU或EdU等的细胞作为上述的表达视锥细胞前体细胞标记的细胞而分化的比例通过以本领域技术人员众所周知的免疫染色等测定，从而根据该比例判定视锥细胞前体细胞的出现率为最高的时期，可以鉴定“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段”。具体而言，将例如BrdU或EdU在任意分化阶段的培养视网膜组织的培养液中添加BrdU或Edu等并培养任意1天，对在其次日回收的视网膜组织测定BrdU或EdU阳性细胞中的CRX及RXR-γ阳性细胞的比例，或CRX及TRβ2阳性细胞的比例。可以将在神经视网膜组织中该比例达到最高的添加BrdU或EdU的日子鉴定为“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段”。
[0491] 具体而言，“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段”相当于从确认到视锥细胞前体细胞的出现起30～50天后、优选为30～40天后。
[0492] 在本发明的方法中，在包含背侧化信号转导物质的培养基中培养的步骤，只要在从“发育早期阶段”到“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段”之间的任意期间实施即可，只要是该期间内，对开始该步骤的时期、期间没有限制。该步骤的开始期间优选为在从发育早期阶段起约40天以内开始，更优选为20天以内，进一步更优选在发育早期阶段开始。
[0493] 用于将发育早期阶段的视网膜组织在背侧化信号转导物质的存在下培养时的培养基没有特别的限定，只要不以能阻碍上述效果的量含有抑制背侧化信号转导物质的效果的物质即可，可以使用在作为细胞培养用的市售的培养基中适当根据需要加入添加物的培养基。该培养基优选为能维持视网膜组织的连续上皮结构的培养基，作为具体可使用的培养基，可列举添加了Wnt2b的培养基，Neurobasal培养基，包含Neurobasal培养基的培养基等，也可以为添加了Wnt2b的Neurobasal培养基。另外，可以使用后述的连续上皮组织维持用培养基。
[0494] 上述培养基可任选含有类视黄醇类(例如：视黄酸或其衍生物)，作为一种实施方式，可以包含9-顺式视黄酸。另外，作为更优选的实施方案可列举实质上不含类视黄醇类、优选为由ALDH1A3生物合成的，抑制视锥细胞前体细胞的分化的类视黄醇类的培养基。作为由ALDH1A3生物合成的，抑制视锥细胞前体细胞的分化的类视黄醇类，具体而言，可列举全反式视黄酸(all-trans retinoic acid；也称为atRA)等。
[0495] 培养基中包含的背侧化信号转导物质的浓度，只要是显现不抑制视锥细胞前体细胞的出现的程度的BMP信号转导途径活化作用的浓度即可。不抑制视锥细胞前体细胞的出现的程度的背侧化信号转导物质的浓度，可根据神经视网膜组织中出现的视锥细胞前体细胞的比例等适当设定。具体而言，设定使得在从视细胞前体细胞开始出现起30～50天后、优选为30～40天后的神经视网膜组织中，在总细胞数中有平均10％以上、优选为13％以上、更优选为16％以上为视细胞前体细胞即可。另外，具体而言作为背侧化信号转导物质使用BMP信号转导途径作用物质，特别是BMP4的情况下、可优选以0.01nM～0.90nM，进一步优选为0.05nM～0.45nM的浓度使用BMP4。
[0496] 培养基中包含的背侧化信号转导物质的浓度，可以为显现不使视网膜色素上皮细胞出现的程度的Wnt信号路径活化作用的浓度。不使视网膜色素上皮细胞出现的程度的背侧化信号转导物质的浓度，具体而言可列举与0.01nM～0.90nM、优选为0.05nM～0.45nM的BMP4起到同等Wnt信号路径活化作用的浓度。
[0497] 在培养基实质上不含9-顺式视黄酸等外源性的类视黄醇类的情况下，作为培养基中包含的背侧化信号转导物质可列举优选为0.05nM～0.15nM，进一步优选为0.1nM～0.15nM的BMP4。另外，也可以将Wnt信号转导途径作用物质以与优选为0.05nM～0.15nM，进一步优选为0.1nM～0.15nM的BMP4起到同等的BMP信号转导途径活化作用的浓度进行作用。
[0498] 另外，在培养基包含9-顺式视黄酸等类视黄醇类的情况下，作为培养基中包含的背侧化信号转导物质，可列举优选为0.15nM～0.90nM，进一步优选为0.15nM～0.45nM的BMP4。另外，也可以将Wnt信号转导途径作用物质以与优选为0.15nM～0.90nM进一步优选为0.15nM～0.45nM的BMP4起到同等的BMP信号活化作用的浓度进行作用。
[0499] 另外，作为背侧化信号转导物质，可列举抑制腹侧化信号转导的SHH信号转导途径抑制物质。作为SHH信号转导途径抑制物质，可列举：SHH受体拮抗剂，SHH显性负性体，针对SHH信号转导途径作用物质的抗体，可溶型SHH受体等。作为SHH信号转导途径抑制物质，具体而言可列举：GANT58，GANT61，白藜芦碱(Jervine)，SANT-1，藜芦胺(Veratramine)，环巴胺，环巴胺-KAAD(GENES&DEVELOPMENT 16：2743-2748)等。作为SHH信号转导途径抑制物质，优选可列举环巴胺-KAAD。培养基中包含的环巴胺-KAAD的浓度具体而言为0.01μM～5μM，进一步优选为0.2μM～1μM。
[0500] 另外，作为背侧化信号转导物质，也可以与上述BMP信号转导途径作用物质，上述Wnt信号转导途径作用物质和/或抑制腹侧化信号转导的上述SHH信号转导途径抑制物质组合使用。在作为背侧化信号转导物质使用上述抑制腹侧化信号转导的SHH信号转导途径抑制物质的情况下，准备制备以更高比例包含视锥细胞前体细胞的视网膜组织时、优选与上述BMP信号转导途径作用物质和/或上述Wnt信号转导途径作用物质组合使用。
[0501] 在包含背侧化信号转导物质的培养基中培养的期间，只要在背侧化信号转导物质非存在下进行培养的情况下，背侧化信号转导物质的效果持续到视杆细胞前体细胞出现的期间即可，可以适当设定为通常4天以上、优选为20天以上、更优选为70天以上。具体而言，例如可以培养50天～170天。进一步具体而言，可以培养70天～100天，但从抑制视杆细胞前体细胞的出现的观点出发，优选添加的期间长。
[0502] 另外，可以使视锥细胞前体细胞向L视锥细胞，M视锥细胞及S视锥细胞成熟。优选地，可以通过将视锥细胞前体细胞在背侧化信号转导物质的存在下培养，得到富于L视锥细胞及M视锥细胞的神经视网膜组织。此时，更优选在使向L视锥细胞及M视锥细胞成熟的同时与甲状腺激素信号转导途径作用物质组合而进行分化，对使向S视锥细胞成熟而言，优选在实质上不含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中分化。进一步优选在无血清培养基中使其分化。
[0503] 另外，为了诱导向L视锥细胞或M视锥细胞的选择性分化，作为背侧化信号转导物质优选使用BMP4信号转导物质，以使得最终浓度为0.01nM以上100nM以下、优选为0.05nM以上10nM以下，更优选为0.1nM以上1.5nM以下的方式添加到培养液中。作为甲状腺激素信号转导途径作用物质使用T3时，可以以0.01nM以上100nM以下、优选为0.5nM以上10nM以下，更优选为2nM以上10nM以下的浓度进行作用。作为甲状腺激素信号转导途径作用物质使用T4时，可以以与上述T3显示同等作用的T4的浓度进行作用。对与背侧化信号转导物质同时组合甲状腺激素信号转导途径作用物质进行培养的期间没有特别的限定，可列举通常50天以上、优选为70天以上、更优选为100天以上，进一步更优选为150天以上。对开始与背侧化信号转导物质同时组合甲状腺激素信号转导途径作用物质进行培养的期间、优选为从视细胞前体细胞最初出现起，100天后以后、优选为150天后以后开始培养，将与背侧化信号转导物质同时甲状腺激素信号转导途径作用物质组合进行培养到从最初视细胞前体细胞出现起通常250天后、优选为300天后，更优选为400天后以后。另外，为了向视锥细胞前体细胞，L-视锥细胞或间视锥细胞成熟、优选为使用与视网膜色素上皮共培养或、在培养视网膜色素上皮后的调整培养基(条件培养基)。
[0504] 反过来，也可以将视网膜组织中到视细胞前体细胞(视锥细胞前体细胞或视锥细胞，视杆细胞前体细胞或视杆细胞)，不分化到L视锥细胞，M视锥细胞和/或S视锥细胞，不表达或者产生视色素等对光应答必要的分子，维持不到达最终的成熟化的状态。已知视细胞前体细胞伴随成熟而与双极细胞连接，通过这样进行抑制在移植到视网膜组织内的视细胞前体细胞与双极细胞的连接，移植视网膜组织时，可升高制备的视网膜组织中的视细胞前体细胞与接受者的双极细胞的连接效率。具体而言，可以通过在不包含谷氨酸的培养基，更优选为不包含谷氨酸及天冬氨酸的培养基，进一步优选为不包含谷氨酸，天冬氨酸等神经传递物质的培养基中培养，维持不到达最终的成熟的状态。进一步更优选通过在包含血清的培养基，具体而言包含5％以上、优选为10％以上的血清培养基中培养，可以维持不到达最终的成熟的状态。作为该培养基，更具体而言，可列举后述的连续上皮组织维持用培养基。在此使用的血清没有特别的限定，具体而言可列举胎牛血清(FBS)。
[0505] 即，抑制视细胞前体细胞的最终的成熟的方法也包括在本发明的范畴中，其包括将包含视细胞前体细胞的视网膜组织在不含神经传递物质，包含血清的培养基中培养的步骤。
[0506] 另外，作为背侧化信号转导物质也可以使用上述Wm信号转导途径作用物质。在该情况下，具体而言可以重复以下步骤(1)及(2)：
[0507] (1)1～5天、优选为1～3天，将上述Wnt信号转导途径作用物质加入培养基中培养；
[0508] (2)1～15天，1～10天、优选为1～7天或5～10天，在实质上不含上述Wnt信号转导途径作用物质的培养基中培养。通过这样进行，由此可以调整Wnt信号的强度。
[0509] 6.神经视网膜组织的制备方法
[0510] 作为本发明的一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0511] (1)将发育早期阶段的视网膜组织在培养基中培养，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤，
[0512] (2)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0513] 另外，作为本发明的另外一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，其中，在上述步骤(1)中的培养基和/或步骤(2)中至少一部分的步骤中的培养基为包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基。即，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0514] (1)将发育早期阶段的视网膜组织在培养基中培养，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤，
[0515] (2)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤，其中，步骤(1)中的培养基和/或步骤(2)中至少一部分的步骤中的培养基为包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基。
[0516] 以下进行说明。
[0517] 在上述步骤(1)中，对于“发育早期阶段的视网膜组织”的制备方法，如上述2.描述的那样。另外，对于得到的步骤(1)的“包含神经视网膜祖细胞，且处于神经节细胞刚出现后的分化阶段的视网膜组织”，或从该分化阶段“到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段”的视网膜组织的步骤，如上述3.描述的那样。在上述步骤(2)中，对于在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤的具体实施方式，如上述4.描述的那样。
[0518] 在上述步骤(1)和/或(2)中，“抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质”的浓度、添加方法，时期，期间如上述5.描述的那样。
[0519] 术语“成熟的神经视网膜组织”表示包含视锥细胞前体细胞和/或视锥细胞，视杆细胞前体细胞和/或视杆细胞，神经节细胞、无长突细胞、水平细胞，双极细胞及穆勒细胞的形成层状结构的神经视网膜组织。作为利用本说明书中记载的方法能制备的成熟的神经视网膜组织的一种实施方式，可列举具有以下特征的神经视网膜组织：
[0520] (i)包含穆勒细胞；
[0521] (ii)相对于总细胞数，双极细胞(具体而言，PAX6阴性且CHX10强阳性细胞)，神经节细胞，无长突细胞及水平细胞(具体而言，PAX6阳性且CHX10阴性的细胞)的比例为30％以下、优选为25％以下，更优选为20％以下，进一步更优选为14％以下；
[0522] (iii)相对于总细胞数，神经节细胞，无长突细胞及水平细胞(具体而言，PAX6阳性且CHX10阴性的细胞)的比例为30％以下、优选为20％以下，更优选为15％以下，进一步更优选为10％以下；
[0523] (iv)相对于总细胞数，双极细胞(具体而言，PAX6阴性且CHX10强阳性细胞)为10％以下、优选为5％以下；及
[0524] (v)为CRX阳性的视细胞前体细胞(photoreceptor precursor)及视细胞(photoreceptor)的比例为总细胞数中的40％以上、优选为50％以上，进一步优选为53％以上、更优选为57％以上，进一步更优选为66％以上；
[0525] (vi)相对于视细胞前体细胞及视细胞，视锥细胞前体细胞(cone photoreceptor precursor)及视锥细胞(cone photoreceptor)的比例为70％以上；
[0526] (vii)在相当于外核层的基膜侧的区域存在异位性视细胞前体细胞，或视细胞；
[0527] (viii)包含CRABP或CRALBP阳性细胞；及
[0528] (ix)CRX阳性细胞中的RXR-γ阳性且NRL阴性细胞的细胞数为32％以上、优选为40％以上、更优选为54％以上，进一步更优选为57％。
[0529] “能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织”没有限制，只要是通过在适当的条件下中培养，通过细胞分化，成熟使得为与构成上述“成熟的神经视网膜组织”的细胞相同的比例，及与上述“成熟的神经视网膜组织”为相同的结构，能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织即可。
[0530] 添加背侧化信号转导物质情况的“步骤(2)中至少一部分的步骤”表示在步骤(2)中包含的任意期间，对期间的长度没有限定。该期间可以是连续的，也可以是间断的。
[0531] 具体而言，可以在步骤(1)的全部期间，步骤(2)的一部分期间，步骤(2)的全部期间，步骤(1)的全部期间及步骤(2)的一部分期间，或步骤(1)的全部期间及步骤(2)的全部期间中，在包含背侧化信号转导物质的培养基中培养。
[0532] 在步骤(1)中，神经视网膜祖细胞的出现可以通过检测RX，PAX6及CHX10等众所周知的标记，可以适当设定步骤(1)需要的天数。例如，在将多潜能干细胞作为原料利用上述原料制备方法1～4所述的方法悬浮培养由此形成包含视网膜组织的聚集体情况下，相当于悬浮培养开始后第12天～第18天，具体而言例如第15天～第18天。
[0533] 另外，在将多潜能干细胞作为原料利用上述原料制备方法5，6，和/或7所述的方法形成包含视网膜组织的聚集体的情况下，相当于第22天～第30天，具体而言例如第22～25天(相当于从在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养开始起约第0天～8天，具体而言第0～3天。)。
[0534] 神经节细胞的出现可以通过BRN等众所周知的标记进行检测，可以适当设定步骤(1)需要的天数。例如，在将多潜能干细胞作为原料利用上述原料制备方法1～4所述的方法悬浮培养，由此形成包含视网膜组织的聚集体的情况下，出现了神经节细胞的阶段，即，神经节细胞刚出现后的分化阶段相当于悬浮培养开始后第27天～第40天、优选为第28天～37天，更优选为第28～33天。
[0535] 例如，在将多潜能干细胞作为原料通过悬浮培养利用上述原料制备方法5，6，和/或7所述的方法而形成包含视网膜组织的聚集体的情况下，相当于具体而言悬浮培养开始后第33天～第45天、优选为约第33天～第42天，更优选为第33天～第38天(相当于从在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养开始起约第11天～23天、优选为第11天～20天，更优选为第11～16天。)。
[0536] 另外，神经节细胞刚出现后的分化阶段表示在神经节细胞出现后，利用RX，PAX6及CHX10等众所周知的标记检测到的神经视网膜祖细胞的比例为总细胞数的30％以上、优选为50％以上、更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步更优选为90％以上，特别优选为99％以上，神经节细胞标记阳性(优选地，BRN3阳性)的神经节细胞的比例为总细胞数的40％以下、优选为20％以下，10％以下，5％以下，更优选为1％以下，进一步优选为0.1％以下，进一步更优选为0.01％以下的阶段，或者，神经节细胞出现后约10天以内、优选为约5天以内，更优选为1天以内，进一步更优选为1小时以内的分化阶段。
[0537] 作为本发明的一种实施方式，在步骤(2)中，作为甲状腺激素信号转导途径作用物质使用T3的情况下，可以例如以0.1nM～1000nM的范围的方式添加到培养基中。优选为1～500nM；更优选为10～100nM；进一步优选为30～90nM；进一步更优选为60nM前后的浓度。
[0538] 即，作为甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度，可列举具有相当于0.1～1000nM、优选为1～500nM，更优选为10～100nM，进一步优选为30～90nM，进一步更优选为
60nM前后的浓度的T3的甲状腺激素信号转导亢奋活性的浓度。在此所述的甲状腺激素信号转导亢奋活性可作为例如：如上所述的抑制双极细胞，以及无长突细胞，神经节细胞及水平细胞中的任一种细胞的分化的程度的浓度，且不抑制视细胞前体细胞的分化的程度的浓度而适当设定。
60nM前后的浓度的T3的甲状腺激素信号转导亢奋活性的浓度。在此所述的甲状腺激素信号转导亢奋活性可作为例如：如上所述的抑制双极细胞，以及无长突细胞，神经节细胞及水平细胞中的任一种细胞的分化的程度的浓度，且不抑制视细胞前体细胞的分化的程度的浓度而适当设定。
[0539] 即，可以以在例如穆勒细胞为出现了的程度地后期的分化阶段(例如：在将利用上述原料制备方法1～3，4，5～7所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，相当于悬浮培养开始后约第180～200天)的神经视网膜组织中，PAX6阴性/CHX10强阳性细胞为8％以下，优选地，6％以下，更优选为5％以下的方式设定甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度。或可以以PAX6阳性/CHX10阴性细胞的比例为30％以下、优选为20％以下，更优选为15％以下，进一步更优选为10％以下的方式设定甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度。或可以以视细胞(或视细胞前体细胞)的比例为40％以上、优选为45％以上、更优选为50％以上，进一步更优选为57％以上，66％以上的方式设定甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度。
[0540] 或者对甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度而言，也可以确定为使得例如在视锥细胞前体细胞(例如：CRX阳性且TRβ2阳性细胞，或CRX阳性且RXR-γ阳性)的出现率为最大的分化阶段的视网膜组织(即，在从确认到视锥细胞前体细胞的出现起30～50天后、优选为30～40天后的分化阶段，或在例如利用原料制备方法1～4所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，相当于悬浮培养开始后约第60～70天，利用原料制备方法5～7所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，悬浮培养开始后约第65～75天的分化阶段)中，观察到在成神经细胞层(NBL)的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞的程度，且在包含外成神经细胞层(NBL)的顶端面侧出现的视细胞前体细胞的比例，与在NBL的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞的比例相比为一定程度，更优选为同程度的浓度。具体而言，可以以NBL的基膜侧和包含NBL的顶端面侧中包含的视细胞前体细胞的每面积的比例的比为10∶1～1∶10、优选为2∶1～1∶2，更优选为10∶7～7∶10左右的方式设定甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度。
[0541] 或者，可以以使得相对于神经视网膜组织中包含的全部细胞，为CRX阳性细胞的视细胞前体细胞的比例为11％以上、优选为15％以上、更优选为20％以上，进一步优选为25％以上，更进一步优选为30％以上的方式设定添加的甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度。或者，可以以使得相对于神经视网膜组织中包含的全部细胞，CRX阳性且TRβ2阳性细胞的比例为7％以上、优选为10％以上、更优选为11％以上，进一步优选为15％以上，更进一步优选为16％以上，20％以上的方式设定。
[0542] 在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中的培养基和/或步骤(2)中的培养基至少一部分可以为包含抑制腹侧标记表达的程度的背侧化信号转导物质的培养基。在包含背侧化信号转导物质的情况下，对在上述步骤(1)～步骤(2)中，将甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质添加到培养基中的顺序而言，也可以是任一种在先。
[0543] 在上述步骤(1)和/或步骤(2)中，通过包含背侧化信号转导物质的培养基中培养，与甲状腺激素信号转导途径作用物质单独发挥作用的方法相比，能够进一步提高视网膜组织中包含的视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例。即，通过该步骤，可以制作使PAX6阴性/CHX10强阳性细胞，及PAX6阳性/CHX10阴性细胞等，即双极细胞，及无长突细胞，神经节细胞，水平细胞中的任一种细胞等的比例降低，同时将视网膜组织中包含的细胞中视细胞前体细胞的比例，特别是视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例进一步提高的视网膜组织。
[0544] 进一步，通过该步骤，能够实现使在视网膜组织中有双极细胞、无长突细胞等存在的内核层、有神经节细胞存在的神经节细胞层这样的基膜侧的细胞层形成异位性视细胞层(视细胞前体细胞层)之后，进一步提高包含的视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例。
[0545] 如上所述地制作的视网膜组织，视锥细胞前体细胞的比例更高，并且在移植时，接受者的双极细胞与移植的视网膜组织内包含的视细胞前体细胞的物理的距离变近，因此，可作为更适于移植到黄斑部或黄斑部中心部分的视网膜组织。
[0546] 在步骤(1)中，对背侧化信号转导物质而言，在添加背侧化信号转导物质的情况可以自始至终添加，也可以从中途添加，优选至少在步骤(1)中在包含背侧化信号转导物质的培养基中培养。
[0547] 另外，在步骤(2)中添加背侧化信号转导物质的情况，更优选为在步骤(2)中至少一部分，进一步优选为全部的期间在包含背侧化信号转导物质的培养基中培养。
[0548] 具体而言，在包含背侧化信号转导物质的培养基中开始培养的期间没有特别限制，只要在从“发育早期阶段”到“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段”之间的任意期间实施即可，优选为在从发育早期阶段起约40天以内开始，更优选为20天以内，进一步更优选地，在发育早期阶段开始。
[0549] 上述“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的阶段”可以将甲状腺激素信号转导途径作用物质添加到培养基中鉴定，但利用甲状腺激素信号转导途径作用物质将视锥细胞前体细胞的出现率提高，由于上述阶段不易鉴定，因此，优选不将甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质添加到培养基中培养而预先鉴定上述阶段。
[0550] 对在甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质的存在下培养的期间而言，只要到上述“视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段”为止、优选为在甲状腺激素信号转导途径作用物质，和/或背侧化信号转导物质非存在下培养的情况下到视杆细胞前体细胞出现的期间为止甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质的效果持续即可，甲状腺激素信号转导途径作用物质通常可以适当设定为20天以上、优选为40天以上、更优选为70天以上，背侧化信号转导物质为通常4天以上、优选为20天以上、更优选为40天以上，70天以上。具体而言，例如，甲状腺激素信号转导途径作用物质为在从神经节细胞最初出现优选为20天～40天(相当于到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的期间)，更优选为40天～70天(相当于出现视杆细胞前体细胞的阶段)，进一步优选为70天～100天，进一步更优选为从神经节细胞最初出现经过步骤(2)的全部期间而持续。例如，背侧化信号转导物质为从发育早期阶段起4天以上、优选为20天～50天(相当于到视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的期间)，更优选为50天～70天，进一步优选为70天～80天(相当于出现视杆细胞前体细胞的阶段)，进一步更优选为从发育早期阶段起经过步骤(2)的全部期间而持续。另外，在甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质的存在下培养的期间为也可以继续到为了特定的目标(例如：移植)而使用神经视网膜组织。
[0551] 另外，作为本发明的一种实施方式，可列举上述制备方法，其中，步骤(2)中至少一部分的期间的培养基包含甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质，得到的视网膜组织为出现了穆勒细胞的分化阶段的神经视网膜组织。
[0552] 分化进展到出现穆勒细胞的分化阶段，对制备上述神经视网膜组织所必需的甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质的浓度，及在包含它们的培养基中培养的期间而言，对本领域技术人员而言能够基于上述4.及5.的记载而适当设定，以下进行说明上述神经视网膜组织的一种实施方式。
[0553] 该视网膜组织中的PAX6阳性/CHX10阴性细胞为30％以下、优选为20％以下，更优选为15％以下，进一步更优选为10％以下。另外，该视网膜组织中的PAX6阴性/CHX10强阳性细胞为10％以下、优选为5％以下。另外，该视网膜组织中的PAX6阳性/CHX10阴性细胞，及PAX6阴性/CHX10强阳性细胞的合计为30％以下、优选为20％以下，更优选为14％以下。
[0554] 另外，该视网膜组织中为CRX阳性细胞的视细胞前体细胞的比例为40％以上、优选为50％以上、更优选为57％以上，进一步更优选为66％以上。或者，该分化阶段的视网膜组织中CRX阳性细胞中的RXR-γ阳性且NRL阴性细胞的细胞数为32％以上、优选为40％以上、更优选为54％以上，进一步更优选为57％以上。
[0555] 另外，在一种实施方式中，该视网膜组织具有异位性视细胞前体细胞和/或视细胞。在此，异位性视细胞前体细胞和/或视细胞是指在构成视网膜的细胞层中在除了视细胞层(或外核层)以外的层存在的视细胞前体细胞和/或视细胞。该视网膜组织中，上述异位性视细胞层(也称为视细胞前体细胞层)中包含的视细胞前体细胞的比例具体而言为神经视网膜组织中包含的总细胞数的10％以上、优选为15％以上、更优选为20％以上，进一步更优选为25％以上。另外，相对于在外核层存在的视细胞前体细胞，上述异位性视细胞前体细胞的比例为30％以上、优选为40％以上、更优选为50％以上，进一步更优选为60％以上。
[0556] 对在包含背侧化信号转导物质的培养基下的培养，具体而言可以参考上述5.。
[0557] 6-1.能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法
[0558] 作为本发明的一种实施方式，可列举上述制备方法，其中，步骤(2)中的培养基包含甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质，通过步骤(2)得到的能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织为视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段的神经视网膜组织。
[0559] 对分化进展到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段，对制备上述神经视网膜组织所必需的甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质的浓度，及在包含它们的培养基中培养的期间而言，对本领域技术人员而言能够基于上述4.及5.的记载而适当设定，以下说明上述神经视网膜组织的一种实施方式。
[0560] 在该视网膜组织中为CRX阳性细胞的视细胞前体细胞的比例为11％以上、优选为15％以上、更优选为20％以上，进一步更优选为25％以上，进一步更优选为30％以上。或者，该分化阶段的视网膜组织中为CRX阳性且TRβ2阳性细胞的视锥细胞前体细胞的比例为7％以上、优选为10％以上、更优选为11％以上，进一步更优选为15％以上，进一步更优选为
16％以上，20％以上。
16％以上，20％以上。
[0561] 另外，在一种实施方式中，上述视网膜组织的CRX阳性细胞，和/或CRX阳性且TRβ2阳性细胞中，优选包含在成神经细胞层(NBL)的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞。另外，在包含成神经细胞层(NBL)的顶端面侧出现的视细胞前体细胞与在NBL的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞的比例为一定程度，更优选为同程度。具体而言，在NBL的基膜侧和包含NBL的顶端面侧中包含的视细胞前体细胞的每面积的比例的比为10∶1～1∶10、优选为2∶1～1∶2，更优选为10∶7～7∶10。
[0562] 另外，在一种实施方式中，表达称为对视细胞前体细胞的分化而言必需的OTX2基因的OTX2阳性细胞的比例为该视网膜组织中13％以上、优选为20％以上、更优选为24％以上，进一步更优选为29％以上，进一步更优选为30％以上。
[0563] 另外，在一种实施方式中，不论有无背侧化信号转导物质的添加而通过甲状腺激素信号转导途径作用物质的添加，相对于总细胞数，视锥细胞前体细胞中表达的OC2的比例在该视网膜组织中为30～50％、优选为35％～45％，更优选为39～43％，与没有添加甲状腺激素信号转导途径作用物质的情况相比增加。
[0564] 该神经视网膜组织可以通过上述步骤(1)及步骤(2)制备，可以通过贯穿全部步骤，在确认到视锥细胞前体细胞的出现以后30～50天、优选为30～40天培养而制备。
[0565] 另外，在本发明的一种实施方式中、优选为上述步骤(1)及步骤(2)的全部期间使用包含“抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质”的培养基，在步骤(2)的全部期间使用包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基。另外，开始在背侧化信号转导物质或甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下培养的期间优选为发育早期阶段，或优选从神经节细胞刚出现后，如上述4.，或5.所述。
[0566] 另外，该神经视网膜组织例如，对发育早期阶段的视网膜组织而言，以利用原料制备方法1～4所述的方法制备的视网膜组织作为原料的情况，相当于悬浮培养开始后约60～第70天、优选为约第65天，以利用原料制备方法5～7所述的方法制备的视网膜组织作为原料的情况，相当于悬浮培养开始后约第65～75天、优选为约第70天(即，在神经视网膜组织中出现的视锥细胞前体细胞的比例最大的阶段的视网膜组织)得到的聚集体。
[0567] 另外，作为本发明的一种实施方式，可列举上述制备方法，其中，在步骤(2)中至少一部分的期间(具体而言，40天～70天、优选为70天～100天)中培养基包含甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质，得到的视网膜组织为开始出现视杆细胞前体细胞的分化阶段(或开始出现双极细胞的分化阶段)的神经视网膜组织。
[0568] 分化进展到开始出现视杆细胞前体细胞的分化阶段(或开始出现双极细胞的分化阶段)，对制备上述神经视网膜组织必需的甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质的浓度，及在包含它们的培养基中培养的期间而言，对本领域技术人员而言能够基于上述4.及5.的记载而适当设定，以下说明上述神经视网膜组织的一种实施方式。
[0569] 该神经视网膜组织的特征在于，在开始出现视杆细胞前体细胞的阶段(或开始出现双极细胞的阶段)中，相比于生物体神经视网膜组织，或在甲状腺激素信号转导途径作用物质非存在下制备的视网膜组织，所述神经视网膜组织中的视细胞前体细胞，和/或视锥细胞前体细胞的比例高。即，该神经视网膜组织中，CRX阳性细胞为总细胞数的20％以上、优选为25％以上，进一步优选为30％以上，进一步更优选为40％以上，更进一步更优选为50％以上。另外，在该分化阶段中，在神经视网膜组织中，沿着与顶端面的切线垂直相交的直线有平均2个细胞、优选为平均3个细胞以上、更优选为平均4个细胞以上为视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)。另外，这些神经视网膜组织优选在该分化阶段中的视网膜组织中，在成神经细胞层(NBL)的基膜侧包含异位性视细胞前体细胞。
[0570] 这里，开始出现视杆细胞前体细胞的阶段(或开始出现双极细胞的阶段)可通过使用对本领域技术人员而言普通免疫染色等办法，特别指定作为视杆细胞前体细胞标记(或双极细胞标记)的NRL阳性且CRX阳性细胞(或CHX10强阳性且PAX6阴性细胞)开始出现的阶段而确定。具体而言，双极细胞(或视杆细胞前体细胞)开始出现的阶段为从双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)出现起20天以内、优选为15天以内，更优选为10天以内，进一步优选为5天以内的分化阶段，为包含向双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)分化的阶段的神经视网膜祖细胞的分化阶段。神经视网膜祖细胞是否为向双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)分化的阶段，可以通过将为视网膜组织中的增殖细胞的神经视网膜细胞可摄入的BrdU或EdU等添加到培养液中，使用抗体鉴定摄入了BrdU或EdU等的细胞是否表达双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)的标记而设定。例如，在将BrdU隔一定时期(例如到悬浮培养开始后第90，91，92，93，94天～第110天的1天等)添加到培养基中后不久，对视网膜组织进行分析的结果，可观察到BrdU阳性且双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)标记阳性细胞情况下，可以将添加了BrdU的期间(若为1天，则为该天)鉴定为包含向双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)分化的阶段的神经视网膜组织的阶段。或者，也可以作为检测到双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)标记阳性细胞，检测到且已知在视细胞前体细胞中一过性地表达的BLIMP1阳性细胞的阶段而鉴定。此时，由于甲状腺激素信号转导途径作用物质存在抑制视杆细胞前体细胞的出现的作用，因此优选使用不包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基预先鉴定上述分化阶段。
[0571] 该神经视网膜组织可以通过上述步骤(1)及步骤(2)制备，可以通过贯穿全部步骤，在确认到视锥细胞前体细胞的出现以后55～80天、优选为55～70天培养而制备。另外，在本发明的一种实施方式中，在上述步骤(1)及步骤(2)的全部期间使用包含“抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质”的培养基，在步骤(2)的全部期间使用包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基。另外，开始在背侧化信号转导物质或甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下培养的期间为神经节细胞刚出现后、优选为从发育早期阶段起，如上述4.或5.所述。
[0572] 该神经视网膜组织为例如在发育早期阶段的视网膜组织在利用上述原料制备方法1～4制备的情况下，相当于在悬浮培养开始后85天～100天、优选为约第95天得到的聚集体。在利用上述原料制备方法5～7制备的情况下，相当于在悬浮培养开始后90天～105天、优选为约第100天(即，双极细胞(或视杆细胞前体细胞)开始出现的阶段的视网膜组织)得到的聚集体。
[0573] 作为本发明的一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，具体而言，包括以下步骤：
[0574] (1’)利用原料制备方法1～7所述的方法制备发育早期阶段的视网膜组织的步骤；
[0575] (2’)培养在步骤(1’)中形成的发育早期阶段的视网膜组织，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
[0576] (3’)将在步骤(2’)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0577] 各步骤如已经说明的那样，步骤(1’)及步骤(2’)可以不鉴定或分离发育早期阶段的视网膜组织，没有步骤的界线地连续地进行。
[0578] 另外，作为本发明的一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，具体而言，包括以下步骤：
[0579] (a1)通过在无血清培养基中悬浮培养多潜能细胞而使其形成细胞的聚集体的步骤，
[0580] (a2)将在步骤(a1)中形成的聚集体在不含SHH信号转导途径作用物质，包含BMP信号转导途径作用物质的培养基中悬浮培养，制备包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的发育早期阶段的视网膜组织的步骤，
[0581] (a3)培养在步骤(a2)中得到的视网膜组织，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
[0582] (a4)将步骤(a3)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0583] 各步骤如已经说明的那样，步骤(a2)及步骤(a3)可以不鉴定或分离发育早期阶段的视网膜组织，没有步骤的界线地连续地进行。
[0584] 作为另一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，具体而言，包括以下步骤：
[0585] (b1)在不存在饲养层细胞下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质，以及2)用于维持未分化的因子的培养基中培养多潜能干细胞的步骤，
[0586] (b2)悬浮培养由步骤(b1)得到的细胞，使其形成细胞的聚集体的步骤；
[0587] (b3)将步骤(b2)中的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，制造包含视网膜前体细胞或神经视网膜祖细胞的发育早期阶段的视网膜组织的步骤，[0588] (b4)培养在步骤(b3)中得到的视网膜组织，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
[0589] (b5)将步骤(b4)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0590] 各步骤如已经说明的那样，步骤(b3)及步骤(b4)可以不鉴定或分离发育早期阶段的视网膜组织，没有步骤的界线地连续地进行。
[0591] 作为另一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，具体而言，包括以下步骤：
[0592] (c1)将多潜能干细胞在饲养层细胞非存在下中，在包含未分化维持因子，且任选包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤，
[0593] (c2)将步骤(c1)中得到的细胞在SHH信号转导途径作用物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞的聚集体的步骤，
[0594] (c3)将步骤(c2)中的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，制造包含视网膜前体细胞或神经视网膜祖细胞的发育早期阶段的视网膜组织的步骤，[0595] (c4)培养在步骤(c3)中得到的视网膜组织，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
[0596] (c5)将步骤(c4)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0597] 各步骤如已经说明的那样，步骤(c3)及步骤(c4)可以不鉴定或分离发育早期阶段的视网膜组织，没有步骤的界线地连续地进行。
[0598] 作为另一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，具体而言，包括以下步骤：
[0599] (d1)将多潜能干细胞在饲养层细胞非存在下中，在包含未分化维持因子，且任选包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或SHH信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤，
[0600] (d2)将步骤(d1)中得到的细胞根据情况在SHH信号转导途径作用物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞的聚集体的步骤，
[0601] (d3)将步骤(d2)中形成的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞，CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体的步骤，
[0602] (d4)将步骤(d3)中得到的细胞聚集体在包含Wnt信号转导途径作用物质，及根据情况FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或血清培养基中，仅在出现表达RPE65基因的细胞的期间内培养后，将得到的“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养，得到包含睫状缘区样结构体，发育早期阶段的视网膜组织的步骤，
[0603] (d5)培养在步骤(d4)中得到的视网膜组织，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
[0604] (d6)将在步骤(d5)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0605] 各步骤如已经说明的那样，步骤(d4)及步骤(d5)可以不鉴定或分离发育早期阶段的视网膜组织，没有步骤的界线地连续地进行。
[0606] 另外，作为本发明的一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，具体而言，包括以下步骤：
[0607] (e1)通过在包含Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基中悬浮培养多潜能细胞，而使其形成多潜能干细胞的聚集体的步骤，
[0608] (e2)将在步骤(e1)中形成的聚集体在包含基膜制剂的无血清培养基中悬浮培养，制备包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的发育早期阶段的视网膜组织的步骤，[0609] (e3)培养在步骤(e2)中得到的视网膜组织，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
[0610] (e4)将步骤(e3)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0611] 各步骤如已经说明的那样，步骤(e2)及步骤(e3)可以不鉴定或分离发育早期阶段的视网膜组织，没有步骤的界线地连续地进行。
[0612] 作为另一种实施方式，可列举成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，具体而言，包括以下步骤：
[0613] (f1)通过在包含Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基中悬浮培养多潜能细胞，而使其形成多潜能干细胞的聚集体的步骤，
[0614] (f2)将步骤(f1)中形成的聚集体在包含基膜制剂的无血清培养基中悬浮培养，得到包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞，CHX10阳性细胞的存在比例为20％以上100％以下的细胞聚集体的步骤，
[0615] (f3)将步骤(f2)中得到的细胞聚集体在包含Wnt信号转导途径作用物质，及根据情况FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或血清培养基中，仅在出现表达RPE65基因的细胞的期间内培养后，将得到的“未出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”在不包含Wnt信号转导途径作用物质的无血清培养基或血清培养基中培养，得到包含睫状缘区样结构体的发育早期阶段的视网膜组织的步骤，
[0616] (f4)培养在步骤(f3)中得到的视网膜组织，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
[0617] (f5)将在步骤(f4)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。
[0618] 各步骤如已经说明的那样，步骤(f3)及步骤(f4)可以不鉴定或分离发育早期阶段的视网膜组织，没有步骤的界线地连续地进行。
[0619] 6-2.成熟的神经视网膜组织的制备方法
[0620] 成熟的神经视网膜组织可以通过将上述6-1.中制备的神经视网膜组织在适当的培养基中成熟而制备。此种情况中，步骤(2)包括成熟步骤。具体而言，可列举步骤(2)包括以下步骤(2-1)及(2-2)的实施方式：
[0621] (2-1)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中，培养到确认到视锥细胞前体细胞的出现以后第30～80天的步骤；及，[0622] (2-2)将步骤(2-1)中得到的视网膜组织在任选包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养60～120天的步骤。
[0623] 在上述步骤(2-2)中，将步骤(2-1)中得到的培养物在培养基中培养的步骤可以适当利用本领域技术人员众所周知的方法实施。对步骤(2-1)及步骤(2-2)进行的期间没有特别的限定，只要继续培养到达到穆勒细胞开始出现的阶段的视网膜组织即可。具体而言，虽然也依赖于步骤(1)需要的期间，例如在将利用原料制备方法5～7所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，步骤(2-1)可以以优选为相当于从对多潜能干细胞进行悬浮培养的时刻起约第33天～第75天、优选为第33天～第100天，更优选为第33天～第130天的期间进行培养的方式设定为适当期间。另外，虽然也依赖于步骤(1)需要的期间，例如步骤(2-2)可以以相当于从将多潜能干细胞进行悬浮培养的时刻起约第75天～第190天、优选为第100天～第190天，更优选为第130天～第190天的期间进行培养的方式设定为适当期间。这里，从将多潜能干细胞进行悬浮培养的时刻起约第33天～第45天为包含神经视网膜祖细胞，且神经节细胞刚出现后的分化阶段(作为一种实施方式，包含视锥细胞前体细胞开始出现的分化阶段)，第65天～第75天为视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段，第90天～第105天为双极细胞(或视杆细胞前体细胞)开始出现的分化阶段，第120天～第140天为形成外丛状层的分化阶段，第190天为可见穆勒细胞的分化阶段的视网膜组织。
[0624] 例如将利用原料制备方法1～4所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，步骤(2-1)可以以相当于从将多潜能干细胞进行悬浮培养的时刻起约第27天～第70天、优选为第27天～第95天，更优选为第27天～第130天期间进行培养的方式设定为适当期间。另外，虽然也依赖于步骤(1)需要的期间，例如步骤(2-2)可以以相当于从将多潜能干细胞进行悬浮培养的时刻起约第70天～第190天以上、优选为第95天～第190天以上，更优选为第130天～第190天以上的期间进行培养的方式设定为适当期间。这里，从将多潜能干细胞进行悬浮培养的时刻起约第27天～第40天为包含神经视网膜祖细胞，且神经节细胞刚出现后的分化阶段(作为一种实施方式，包含视锥细胞前体细胞开始出现的分化阶段)，第60天～第70天为视锥细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段，第85天～第100天为双极细胞(或视杆细胞前体细胞)开始出现的分化阶段，第120天～第140天为形成外丛状层的分化阶段，第190天为可见穆勒细胞的分化阶段的视网膜组织。
[0625] 另外，可以在步骤(2-1)及步骤(2-2)的一部分的期间或全部期间中添加甲状腺激素信号转导途径作用物质，具体实施方式为如上述4.描述的那样。
[0626] 另外，在步骤(2-1)及步骤(2-2)的一部分的期间或全部期间中可以使用包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基，具体实施方式为如上述5.描述的那样。
[0627] 对步骤(2-2)中的培养基而言，虽然也依赖于使用的培养基的量，例如可以适当每1天～10天、优选为1天～4天进行培养基交换，虽然对其组成没有必要特别地变更，但如果为出现视杆细胞前体细胞的阶段以后的神经视网膜组织，则由于容易维持连续上皮结构，因此，可以进行适当的培养基交换。例如，也可以从后述的B培养基变更为其它培养基。视杆细胞前体细胞出现的期间以后可以优选使用血清培养基。
[0628] 进一步，在为出现穆勒细胞的阶段的神经视网膜组织的情况下，也可以将血清培养基或无血清培养基中的任一培养基作为能维持连续上皮结构的培养基优选使用。这里，对视杆细胞前体细胞或穆勒细胞是否出现，可以通过通常实施的使用针对视杆细胞前体细胞，或穆勒细胞标记的抗体的免疫染色等确认。
[0629] 另外，通过在培养基(例如，后述的B培养基)中加入血清培养，视网膜组织内包含的视细胞前体细胞中有90％以上、优选为99％以上的视细胞前体细胞不进展到最终的成熟。在此“最终的成熟”是指有一部分、优选为15％以上、更优选为30％以上，进一步优选为60％以上的视细胞前体细胞或视细胞形成了突触的状态，或表达了视色素等功能分子的状态。即，虽然成熟到分化到可见穆勒细胞的阶段的阶段，但没有最终的成熟的神经视网膜组织，优选为不产生突触形成的阶段(或不表达视色素等功能分子的状态)的神经视网膜组织。另外，本领域技术人员已知：视网膜组织内包含的视细胞前体细胞(至少视杆细胞前体细胞)在最终地成熟的分化阶段中，可从视细胞的突触末端分泌的谷氨酸依赖性地促进与双极细胞的神经通路形成(非专利文献：Neuron，87(6)，1248-60(2015))。因此，使视网膜组织内包含的视细胞前体细胞不进展最终的成熟，抑制待移植的视网膜组织内的视细胞前体细胞和双极细胞的神经通路形成，即，从不会导致移植的视网膜组织与接受者的双极细胞的神经通路形成的效率降低的观点出发，优选使用不包含谷氨酸的培养基，更优选为在后述的B培养基中加入血清而培养。
[0630] 这里，视细胞前体细胞是否最终地成熟可以使用针对S-视蛋白，L-视蛋白，M-视蛋白等视细胞特异性的视色素、对光刺激反应必需的功能因子的抗体鉴定。即，可将表达S-视蛋白，L-视蛋白，M-视蛋白，视紫质，Cone-视紫红质抑制蛋白，视紫红质抑制蛋白，CNGA3，CNGA1，G alpha t2，G alpha t1，PDE6c，PDE6a，PDE6b等功能分子的细胞作为最终地成熟的视细胞鉴定。另外，对于在视网膜组织内视细胞前体细胞是否与双极细胞接触而形成了神经通路，可以将在针对视细胞与双极细胞形成了神经通路的区域中表达的RIBEYE，CtBP2，在该区域的双极细胞中表达的mGluR6，在该区域的视细胞的突触末端(synaptic ending)中可见表达的视紫红质抑制蛋白，恢复蛋白(Recoverin)，锥体特异性的视紫红质抑制蛋白(Arrestin)(Gene symbol；ARR3)，称为视锥细胞特异性的PNA、称为视杆细胞特异性的ELFN1的抗体组合而进行多重染色而鉴定。或者，也可以使用电子显微镜观察视细胞的突触末端和双极细胞的突触结构，鉴定是否形成了神经通路。
[0631] 在反过来促进视细胞前体细胞的最终的成熟，向表达视色素的视细胞进行最终分化的情况下，优选可列举在步骤(2-2)之后(从维持神经视网膜组织的层结构的观点出发，优选从视细胞前体细胞，或视细胞最初出现的阶段起150天后以后)使用包含谷氨酸的培养基和/或不包含血清的培养基培养的方法。另外，优选为了S-视锥细胞，视杆细胞的进一步成熟而使用不包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的上述培养基，为了LM-视锥细胞的成熟将背侧化信号转导物质及甲状腺激素信号转导途径作用物质添加到上述培养基中使用。对背侧化信号转导物质及甲状腺激素信号转导途径作用物质的浓度没有特别的限定，在作为甲状腺激素信号转导途径作用物质使用T3的情况下，可以例如以使得为0.01nM～100nM的范围的方式添加到培养基中。优选为0.5～10nM；更优选为2～10nM。
[0632] 作为甲状腺激素信号转导途径作用物质使用T4的情况下，可以例如以使得为1nM～500μM的范围的方式添加到培养基中。优选为10nM～50μM；更优选为20nM～5μM的范围。
[0633] 将视锥细胞前体细胞向LM视锥细胞成熟情况下的背侧化信号转导物质，优选为添加与上述抑制腹侧标记表达的程度以上的背侧化信号转导物质同等的背侧化信号转导物质，从不诱导在S视锥细胞中表达的视色素，即S-视蛋白的表达的观点，优选上述抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质。具体而言，在使用作为背侧化信号转导物质BMP信号转导途径作用物质，特别是BMP4的情况下、优选浓度为0.01nM～0.90nM，更优选为0.05nM～0.45nM，进一步优选为0.05nM～0.15nM，更进一步优选为0.1nM～0.
[0634] 另外，对步骤(2-2)之后，向表达视色素的视细胞最终成熟的步骤所需要的期间没有特别限制，培养到适宜对人体移植、适于功能分析的最终成熟的分化阶段即可，具体而言在促进S-视锥细胞的最终的成熟的情况下，为步骤(2-2)之后，10天以上、优选为30天以上、更优选为70天以上、更优选为100天以上。在促进LM-视锥细胞、视杆细胞的最终的成熟的情况下，具体而言可列举上述步骤(2-1)之后，50天以上、优选为70天以上、更优选为100天以上，进一步更优选为150天以上。
[0635] 7.培养基
[0636] 在上述6.的神经视网膜组织的制备方法中，在步骤(1)，和/或步骤(2)中使用的培养基没有特别的限定，只要是神经类细胞，详细为构成视网膜组织的细胞能生存的培养基即可，可以将动物细胞的培养中通常使用的培养基作为基础培养基制备。
[0637] 作为基础培养基，可列举例如：BME培养基，BGJb培养基，CMRL 1066培养基，Glasgow MEM(GMEM)培养基，改良的MEM Zinc Option培养基，IMDM培养基，Medium 199培养基，Eagle MEM培养基，αMEM培养基，DMEM培养基，F-12培养基，DMEM/F12培养基，IMDM/F12培养基，Ham′s培养基，RPMI 1640培养基，Fischer’s培养基，或它们的混合培养基等可以用于动物细胞的培养的培养基。
[0638] 从维持神经视网膜组织的连续上皮结构的观点出发，可以使用以下说明的连续上皮组织维持用培养基。
[0639] 在本说明书中，连续上皮组织维持用培养基中含有可抑制视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的细胞分化的浓度的甲基供体或甲基供体的基质，及可抑制轴突伸长的浓度的轴突伸长抑制剂中的至少一个。优选地，连续上皮组织维持用培养基含有抑制视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的细胞分化的浓度的甲基供体或甲基供体的基质，及抑制轴突伸长的浓度的轴突伸长抑制剂。
[0640] 在生物体内，利用甲基转移酶将甲基从甲基供体向包含DNA、组蛋白的蛋白质转移。在本说明书中，甲基供体意指能够对包含DNA或组蛋白的蛋白质提供用于转移的甲基的物质(甲基供体)。另外，在本说明书中，甲基供体的基质意指用于生物合成上述甲基供体所必需的基质。具体而言，作为甲基供体可列举S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，也称为SAM)，作为甲基供体的基质可列举甲硫氨酸，S-甲基-5’-硫代腺苷(S-methyl-5’-thioadenosine，有时简写为MTA)，高半胱氨酸(homocysteine，有时简写为Hcy)等。在本发明中，优选使用甲硫氨酸。
[0641] 是否抑制视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的细胞分化，只要通过例如：将包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的发育早期阶段的视网膜组织与评价对象的物质进行作用，在培养一定时间后鉴定视网膜组织内的视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的比例，或鉴定视网膜组织内的分化细胞，或分化而停止增殖的细胞的比例即可。具体而言，例如在神经节细胞出现开始，经过一定的期间(例如5天～50天)后通过免疫染色、定量PCR等鉴定视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的减少率；视网膜组织内的分化细胞、停止增殖的细胞或表达对最终分化所必需的bHLH型转录因子的细胞的增加率；或者bHLH型转录因子的表达量即可。作为视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞标记，可以使用例如：RX及PAX6的组合，RX，PAX6及CHX10的组合等。另外，作为视网膜组织中包含的已分化的细胞的标记，已分化的祖细胞的标记，或最终分化所必需的bHLH型转录因子标记，可以使用例如：BRN3，CRX，HuNu，Cath5，NeuroM，NGN1，NGN2，ISLET-1(也称为ISL1)，OLIG2等。作为由于细胞分化而停止细胞增殖的细胞的标记，可以使用例如：p53，p27，p21等。
[0642] 在作为甲基供体的基质使用甲硫氨酸的情况下，连续上皮组织维持用培养基中的甲硫氨酸浓度通常为高于17.24mg/L(优选为23.62mg/L以上、25mg/L以上、25.75mg/L以上、26mg/L以上、26.81mg/L以上、27mg/L以上、30mg/L以上)。连续上皮组织维持用培养基中的甲硫氨酸浓度的上限值没有特别限制，只要实现连续上皮组织的维持即可，通常为100mg/L以下(优选为75mg/L以下)。连续上皮组织维持用培养基中的甲硫氨酸浓度的范围为例如：
高于17.24mg/L且100mg/L以下、优选为23.62mg/L以上且75mg/L以下、25mg/L以上且75mg/L以下、25.75mg/L以上且75mg/L以下、26mg/L以上且75mg/L以下、26.81mg/L以上且75mg/L以下、27mg/L以上且75mg/L以下、30mg/L以上且75mg/L以下。在使用除了甲硫氨酸以外的甲基供体或其基质的情况下，优选使用起到与上述浓度的甲硫氨酸相同的抑制视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的细胞分化的作用的浓度。
高于17.24mg/L且100mg/L以下、优选为23.62mg/L以上且75mg/L以下、25mg/L以上且75mg/L以下、25.75mg/L以上且75mg/L以下、26mg/L以上且75mg/L以下、26.81mg/L以上且75mg/L以下、27mg/L以上且75mg/L以下、30mg/L以上且75mg/L以下。在使用除了甲硫氨酸以外的甲基供体或其基质的情况下，优选使用起到与上述浓度的甲硫氨酸相同的抑制视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞的细胞分化的作用的浓度。
[0643] 在本说明书中，轴突伸长抑制剂是指抑制神经节细胞的轴突伸长的物质，具体而言可列举：糖皮质激素等轴突伸长抑制激素，轴突导向因子(Semaphorin)，Nogo，Mag，OMgp蛋白质，硫酸软骨素蛋白多糖等轴突伸长抑制蛋白质等。作为糖皮质激素，可列举例如：皮质酮，皮质醇，可的松等。轴突伸长抑制剂优选为糖皮质激素，更优选为皮质酮。
[0644] 轴突伸长抑制作用可以通过例如将视网膜组织，或视网膜组织中包含的神经节细胞在评价对象的物质的存在下贴壁培养，利用图像分析软件(例如Image J)等测量伸长的神经突起的长度由此而评价。
[0645] 在作为轴突伸长抑制剂使用皮质酮的情况下，连续上皮组织维持用培养基中的皮质酮浓度为抑制视网膜组织中包含的神经节细胞等的轴突伸长的浓度，通常为0.1nM以上(优选为1nM以上，5nM以上、10nM以上，50nM以上、100nM以上)。连续上皮组织维持用培养基中的皮质酮浓度的上限值没有特别限制，只要实现连续上皮组织的维持即可，通常为10μM以下(优选为5μM以下，1μM以下)。连续上皮组织维持用培养基中的皮质酮浓度的范围为例如：0.1nM～10μM、优选为1nM～5μtM，在使用除了皮质酮以外的上述轴突伸长抑制剂的情况下，优选以起到与上述浓度的皮质酮相同的轴突伸长抑制作用的浓度使用。
[0646] 在一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中包含上述浓度的甲硫氨酸及皮质酮。在一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基含有高于17.24mg/L(优选为23.62mg/L以上、25mg/L以上、25.75mg/L以上、26mg/L以上、26.81mg/L以上、27mg/L以上，
30mg/L以上)的甲硫氨酸及0.1nM以上(优选为1nM以上、更优选为5nM以上，进一步优选为
10nM以上，进一步优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上)的皮质酮。
30mg/L以上)的甲硫氨酸及0.1nM以上(优选为1nM以上、更优选为5nM以上，进一步优选为
10nM以上，进一步优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上)的皮质酮。
[0647] 连续上皮组织维持用培养基可以进一步含有酸性氨基酸，抗氧化剂及视网膜神经细胞保护物质，优选各浓度为更低的浓度。
[0648] 在本说明书中，作为酸性氨基酸，具体而言可列举谷氨酸或天冬氨酸，分别包含L型和D型。在本说明书中，L型的谷氨酸标记为L-谷氨酸，L型的天冬氨酸标记为L-天冬氨酸，D型的谷氨酸标记为D-谷氨酸，D型的天冬氨酸标记为D-天冬氨酸。在本说明书中，对D型和L型不作区别时标记为“谷氨酸”或“天冬氨酸”。
[0649] 连续上皮组织维持用培养基中的L-谷氨酸的浓度优选低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)。在一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中的谷氨酸的浓度优选低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)。
[0650] 连续上皮组织维持用培养基中的L-天冬氨酸的浓度优选低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)。一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中包含天冬氨酸的浓度优选为低于50μM(更优选为10μM以下，进一步优选为1μM以下，进一步优选为0.1μM以下)。
[0651] 作为优选的一种实施方式，连续上皮组织维持用培养基含有高于17.24mg/L(优选为23.62mg/L以上、25mg/L以上、25.75mg/L以上、26mg/L以上、26.81mg/L以上、27mg/L以上、30mg/L以上)的甲硫氨酸及0.1nM以上(优选为1nM以上、更优选为5nM以上，进一步优选为
10nM以上，进一步优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上)的皮质酮中的至少一者(优选为两者)，且L-谷氨酸的浓度低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)。
10nM以上，进一步优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上)的皮质酮中的至少一者(优选为两者)，且L-谷氨酸的浓度低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)。
[0652] 作为进一步优选的实施方式，连续上皮组织维持用培养基含有高于17.24mg/L(优选为，23.62mg/L以上、25mg/L以上、25.75mg/L以上、26mg/L以上、26.81mg/L以上、27mg/L以上、30mg/L以上)的甲硫氨酸及0.1nM以上(优选为1nM以上，5nM以上、10nM以上，50nM以上、100nM以上)的皮质酮中的至少一者(优选为两者)，L-谷氨酸的浓度低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)，且L-天冬氨酸的浓度低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为
1μM以下，特别优选为0.1μM以下)。
1μM以下，特别优选为0.1μM以下)。
[0653] 在本说明书中，作为抗氧化剂可列举：谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、α-生育酚、半胱氨酸等。在一种实施方式中，选自由谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、α-生育酚、及半胱氨酸组成的组中的至少1种、优选为多种，更优选为全部抗氧化剂在连续上皮组织维持用培养基中的浓度为以下范围内：
[0654] 谷胱甘肽：100ng/mL以下(优选为10ng/mL以下，更优选为1ng/mL以下，进一步优选为0.1ng/mL以下)；
[0655] 过氧化氢酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0656] 超氧化物歧化酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0657] α-生育酚：50nM以下(优选为5nM以下，更优选为0.5nM以下，进一步优选为0.05nM以下)；及
[0658] 半胱氨酸：0.26mM以下(优选为0.22mM以下，更优选为0.18mM以下，进一步优选为0.1mM以下)。
[0659] 在一种实施方式中，在连续上皮组织维持用培养基中的选自由谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶，及α-生育酚组成的组中的至少1种、优选为多种，更优选为全部抗氧化剂的浓度为确认不到对连续上皮结构造成影响的程度的抗氧化作用的浓度，半胱氨酸的浓度为0.26mM以下(优选为0.22mM以下，更优选为0.18mM以下，进一步优选为0.1mM以下)。在包含其它抗氧化剂的情况下，其浓度优选为起到与上述浓度中的上述抗氧化剂相同的抗氧化作用的浓度以下，或确认不到抗氧化作用的浓度。抗氧化作用可以采用例如：电子自旋共振装置(Electron Spin Resonance，也称为ESR)直接在自旋捕获剂的存在下测定类似自由基的一部分的活性氧，并评价抗氧化作用。也可以通过测定活性氧的其它各种方法(例如：诸如测定由于活性氧而生成的过氧化脂质的量、作为氧化应激标记利用的8-羟基脱氧鸟苷，8-硝基鸟苷的量等)评价抗氧化作用。在活性氧量等测定中，也可以利用市售的测定试剂盒(Cosmobio，同仁化学研究所，Thermo Fisher Scientific等)。
[0660] 在本说明书中，作为视网膜神经细胞保护物质可列举黄体酮等。在一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中的黄体酮的浓度为100nM以下，优选为50nM以下，更优选为20nM(或6.3μg/mL(20.033708nM))以下，进一步优选为10nM以下，进一步优选为3nM以下。在一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中的黄体酮的浓度为确认不到神经节细胞保护作用的浓度。在包含其它视网膜神经细胞保护物质的情况下，优选为与上述浓度的黄体酮起到相同的视网膜神经细胞保护作用的浓度以下，或确认不到视网膜神经细胞保护作用的浓度。视网膜神经细胞保护作用可以通过例如：鉴定视网膜组织中包含的神经节细胞的比例、作为细胞凋亡标记已知的切割型半胱天蛋白酶3阳性的神经节细胞的比例、鉴定其增减来确认。在评价对象的物质显示神经节细胞保护作用的情况下，与未与相同物质作用的情况相比，与该物质作用一定时期的视网膜组织中包含的神经节细胞的比例增加，相反，切割型半胱天蛋白酶3阳性神经节细胞的比例减少。神经节细胞的比例只要使用基于针对上述神经节细胞标记(例如BRN3)的抗体的免疫组化染色，DAPI染色，PI染色，Hoechst染色等鉴定即可。
[0661] 作为优选的一种实施方式，连续上皮组织维持用培养基含有高于17.24mg/L(优选为，23.62mg/L以上、25mg/L以上、25.75mg/L以上、26mg/L以上、26.81mg/L以上、27mg/L以上、30mg/L以上)的甲硫氨酸及0.1nM以上(优选为1nM以上、更优选为5nM以上，进一步优选为10nM以上，进一步优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上)的皮质酮中的至少一者(优选为两者)，L-谷氨酸的浓度低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)，且进一步选自由L-天冬氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、α-生育酚、半胱氨酸及黄体酮组成的组中的至少1种、优选为多种，更优选为全部化合物的浓度为以下范围内：
[0662] L-天冬氨酸：低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)；
[0663] 谷胱甘肽：100ng/mL以下(优选为10ng/mL以下，更优选为1ng/mL以下，进一步优选为0.1ng/mL以下)；
[0664] 过氧化氢酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0665] 超氧化物歧化酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0666] α-生育酚：50nM以下(优选为5nM以下，更优选为0.5nM以下，进一步优选为0.05nM以下)；
[0667] 半胱氨酸：0.26mM以下(优选为0.22mM以下，更优选为0.18mM以下，进一步优选为0.1mM以下)；及
[0668] 黄体酮：100nM以下(优选为50nM以下，更优选为20nM以下(或6.3μg/mL(20.033708nM)以下)，进一步优选为10nM以下，进一步优选为3nM以下)。
[0669] 连续上皮组织维持用培养基可进一步具有次黄嘌呤，胸苷及维生素B12，各浓度为优选为较低浓度。
[0670] 在一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中的次黄嘌呤浓度例如为低于15μM(优选为7.5μM以下，更优选为3.75μM以下，进一步优选为1μM以下，进一步更优选为0.1μM以下(例如：0μM))。
[0671] 在一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中的胸苷浓度低于1.5μM(优选为0.75μM以下，更优选为0.375μM以下，进一步优选为0.1μM以下，进一步更优选为0.01μM以下(例如：0μM))。
[0672] 在一种实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中的维生素B12浓度低于0.5μM(优选为0.253μM以下，更优选为0.129μM以下，进一步优选为0.005μM以下)。
[0673] 在优选的实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中的选自由次黄嘌呤、胸苷及维生素B12组成的组中的2或3种化合物在连续上皮组织维持用培养基中的浓度为上述范围内。
[0674] 作为优选的一种实施方式，连续上皮组织维持用培养基含有高于17.24mg/L(优选为，23.62mg/L以上、25mg/L以上、25.75mg/L以上、26mg/L以上、26.81mg/L以上、27mg/L以上、30mg/L以上)的甲硫氨酸及0.1nM以上(优选为1nM以上、更优选为5nM以上，进一步优选为10nM以上，进一步优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上)的皮质酮中的至少一者(优选为两者)，且L-谷氨酸的浓度低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)，且选自由L-天冬氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶，α-生育酚、半胱氨酸、黄体酮、次黄嘌呤、胸苷及维生素B12组成的组中的至少1种、优选为多种，更优选为全部化合物的浓度为以下范围内：
[0675] L-天冬氨酸：低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)；
[0676] 谷胱甘肽：100ng/mL以下(优选为10ng/mL以下，更优选为1ng/mL以下，进一步优选为0.1ng/mL以下)；
[0677] 过氧化氢酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0678] 超氧化物歧化酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0679] α-生育酚：50nM以下(优选为5nM以下，更优选为0.5nM以下，进一步优选为0.05nM以下)；
[0680] 半胱氨酸：0.26mM以下(优选为0.22mM以下，更优选为0.18mM以下，进一步优选为0.1mM以下)；
[0681] 黄体酮：100nM以下(优选为50nM以下，更优选为20nM以下(或6.3μg/mL(20.033708nM)以下)，进一步优选为10nM以下，进一步优选为3nM以下)；
[0682] 次黄嘌呤：低于15μM(优选为7.5μM以下，更优选为3.75μM以下，进一步优选为1μM以下，进一步更优选为0.1μM以下(例如：0μM))；
[0683] 胸苷：低于1.5μM(优选为0.75μM以下，更优选为0.375μM以下，进一步优选为0.1μM以下，进一步更优选为0.01μM以下(例如：0μM))；及
[0684] 维生素B12：低于0.5μM(优选为0.253μM以下，更优选为0.129μM以下，进一步优选为0.005μM以下)。
[0685] 作为优选的一种实施方式，连续上皮组织维持用培养基具有以下组成：
[0686] 甲硫氨酸：高于17.24mg/L(优选为，23.62mg/L以上、25mg/L以上、25.75mg/L以上、26mg/L以上、26.81mg/L以上、27mg/L以上、30mg/L以上)；
[0687] 皮质酮：0.1nM以上(优选为1nM以上、更优选为5nM以上，进一步优选为10nM以上，进一步优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上)；
[0688] L-谷氨酸：低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)；
[0689] L-天冬氨酸：低于50μM(更优选为25μM以下，进一步优选为12.5μM以下，进一步更优选为1μM以下，特别优选为0.1μM以下)；
[0690] 次黄嘌呤：低于15μM(优选为7.5μM以下，更优选为3.75μM以下，进一步优选为1μM以下，进一步更优选为0.1μM以下(例如：0μM))；
[0691] 胸苷：低于1.5μM(优选为0.75μM以下，更优选为0.375μM以下，进一步优选为0.1μM以下，进一步更优选为0.01μM以下(例如：0μM))；及
[0692] 维生素B12：低于0.5μM(优选为0.253μM以下，更优选为0.129μM以下，进一步优选为0.005μM以下)。
[0693] 在该实施方式中，选自由谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、α-生育酚、L-半胱氨酸及黄体酮组成的组中的至少1种、优选为多种，更优选为全部化合物的浓度为以下范围内：
[0694] 谷胱甘肽：100ng/mL以下(优选为10ng/mL以下，更优选为1ng/mL以下，进一步优选为0.1ng/mL以下)；
[0695] 过氧化氢酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0696] 超氧化物歧化酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0697] α-生育酚：50nM以下(优选为5nM以下，更优选为0.5nM以下，进一步优选为0.05nM以下)；
[0698] 半胱氨酸：0.26mM以下(优选为0.22mM以下，更优选为0.18mM以下，进一步优选为0.1mM以下)；及
[0699] 黄体酮：100nM以下(优选为50nM以下，更优选为20nM(6.3μg/mL)以下，进一步优选为10nM以下，进一步优选为3nM以下)。
[0700] 连续上皮组织维持用培养基可以适当配合市售的培养基进行制备。
[0701] 作为可用于连续上皮组织维持用培养基的制备的基础培养基，可列举例如：不包含上述的酸性氨基酸，抗氧化剂及黄体酮等视网膜神经细胞保护物质中的至少1个(例如：酸性氨基酸)、优选为2个以上(例如：酸性氨基酸和另外的任一种物质)，更优选为全部，或为上述浓度范围内的培养基。在该基础培养基的一种实施方式中，次黄嘌呤、胸苷及维生素B12中的1个、优选为2个，更优选为3个为上述浓度范围内。在该基础培养基的一种实施方式中，不包含次黄嘌呤及胸苷，且维生素B12的浓度为上述浓度范围内。
[0702] 作为可用于连续上皮组织维持用培养基的制备的基础培养基，优选甲基供体(例：S-腺苷甲硫氨酸)，甲基供体的基质(例如：甲硫氨酸，MTA，Hcy)及轴突伸长抑制剂(例；皮质酮)中的至少一个浓度处于上述浓度范围的培养基。可以通过在该基础培养基中以为上述的浓度范围的方式适当补充必需的物质，由此制备连续上皮组织维持用培养基。
[0703] 对可用于连续上皮组织维持用培养基的制备的基础培养基而言，只要依照上述选择标准基于生产商等发表的成分表从市售的基础培养基中适当选择即可。作为可用于连续上皮组织维持用培养基的基础培养基，可例示例如：市售的Neurobasal培养基(包括Neurobasal-A培养基，不含酚红的Neurobasal培养基等)，改良的MEMZinc Option培养基，MEM，DMEM，或Leibovitz′s L-15，E-MEM，G-MEM等。另外，也能够向培养基生产商下单并购买个别定制成分的培养基，也可以使用依照上述的记载定制的可用于连续上皮组织维持用培养基的制备的基础培养基用的培养基。
[0704] 为了补充皮质酮，也可以适当配合辅助培养基。作为该辅助培养基，具体而言可例示B27补充剂等。作为连续上皮组织维持用培养基的一种实施方式，具体而言可列举在Neurobasal培养基中配合了B27补充剂的培养基。该培养基可以适当包含L-谷氨酰胺、牛磺酸，血清等。
[0705] Neurobasal培养基为为了神经细胞培养用而开发的公知的基础培养基(J.Neurosci.Res.，vol.35，p.567-576，1993)。Neurobasal培养基从该报告改良了一部分，但作为市售的Neurobasal培养基可以从培养基生产商取得(例如：Thermo Fisher Scientific公司制，21103049)。可以从Thermo Fisher Scientific取得的Neurobasal培养基(21103049)的组成，具有不含酸性氨基酸(L-谷氨酸及L-天冬氨酸)，黄体酮，次黄嘌呤及胸苷，且与DMEM/F12相比甲硫氨酸浓度更高(30mg/L)，半胱氨酸浓度更高(0.26mM)，维生素B12浓度更低(0.005μM)这样的特征，具体组成如下所述。
[0706] [表1-1]
[0707]
[0708] [表1-2]
[0709]
[0710] B27补充剂为为了神经细胞培养用而开发的公知的辅助培养基(J.Neurosci.Res.，vol.35，p.567-576，1993)。B27补充剂在Neurobasal培养基等基础培养基中，通常以容量比率计约2％的比例添加使用。可以通过将包含皮质酮B27补充剂与Neurobasal培养基组合，从而作为连续上皮组织维持用培养基使用。例如，可以以实现上述的甲硫氨酸浓度及皮质酮浓度的方式相对于含有甲硫氨酸的基础培养基(Neurobasal培养基等)添加含有皮质酮的B27补充剂，制备连续上皮组织维持用培养基。
[0711] B27补充剂(J.Neurosci.Res.，vol.35，p.567-576，1993)可以从例如培养基生产商(例如：Thermo Fisher Scientific，12587010)购买，其组成如下所述。
[0712] [表2]
[0713]
[0714] 另外，在另外的实施方式中，连续上皮组织维持用培养基中包括：对于细胞增殖用基础培养基(例如：DMEM/F12混合培养基(DMEM∶F12＝1∶1))，以容量比计1以上(优选为2以上、更优选为3以上)的比例包含在Neurobasal培养基中配合了B27补充剂的培养基的培养基。
[0715] 用于本文时，细胞增殖用基础培养基没有特别限制，可以单独或适当混合使用市售的基础培养基。该细胞增殖用基础培养基可以包含适当的添加剂(补充剂)，作为具体的补充剂，可例示N2补充剂。
[0716] 将在上述市售的Neurobasal培养基(Thermo Fisher Scientific公司，21103049)中配合了B27补充剂(Thermo Fisher Scientific，12587010)的培养基，以及在Neurobasal培养基中配合了B27补充剂的培养基和DMEM/F12混合培养基(DMEM∶F12＝1∶1)中配合了N2补充剂的培养基以3∶1，2∶1或1∶1的比例混合的培养基中，L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、次黄嘌呤、胸苷、及维生素B12的浓度例如为如下所述。
[0717] [表3]
[0718]
[0719] 在一种实施方式中，具有与表3同样的浓度的L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、次黄嘌呤、胸苷、及维生素B12的组成的培养基可以作为连续上皮组织维持用培养基使用。用于本文时，“同样的浓度”指关于各因子的浓度的含量独立地为±20％(优选为±10％，更优选为±5％，进一步优选为±2.5％，进一步更优选为±1％)的范围内。
[0720] 在一种实施方式中，具有与表3同样的浓度的L-甲硫氨酸，L-谷氨酸，L-天冬氨酸，次黄嘌呤、胸苷、及维生素B12的组成，且选自由皮质酮，谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、α-生育酚、L-半胱氨酸及黄体酮组成的组中的至少1种、优选为多种，更优选为全部化合物的浓度为以下范围内的培养基能够作为连续上皮组织维持用培养基使用：
[0721] 皮质酮：0.1nM以上(优选为1nM以上、更优选为5nM以上，进一步优选为10nM以上，进一步优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上)；
[0722] 谷胱甘肽：100ng/mL以下(优选为10ng/mL以下，更优选为1ng/mL以下，进一步优选为0.1ng/mL以下)；
[0723] 过氧化氢酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0724] 超氧化物歧化酶：100U/mL以下(优选为10U/mL以下，更优选为1U/mL以下，进一步优选为0.1U/mL以下)；
[0725] α-生育酚：50nM以下(优选为5nM以下，更优选为0.5nM以下，进一步优选为0.05nM以下)；
[0726] 半胱氨酸：0.26mM以下(优选为0.22mM以下，更优选为0.18mM以下，进一步优选为0.1mM以下)；及
[0727] 黄体酮：100nM以下(优选为50nM以下，更优选为20nM以下(或6.3μg/mL(20.033708nM)以下)，进一步优选为10nM以下，进一步优选为3nM以下)。
[0728] 连续上皮组织维持用培养基中也可以适当包含L-谷氨酰胺、牛磺酸、N2等。牛磺酸的浓度通常为1μM～1000μM、优选为10μM～500μM。另外，更优选在包含N2时不添加B27，取而代之以上述的浓度添加皮质酮等糖皮质激素。
[0729] 连续上皮组织维持用培养基可以在能维持连续上皮组织的范围中包含作为培养基通常可包含的适当选自：缓冲剂(例如：HEPES)，盐(例如：氯化钠，碳酸氢钠等无机盐)或者抗氧化剂(例如：2-巯基乙醇，在一种实施方式中不含抗氧化剂)等调节剂，氨基酸(例如：非必需氨基酸，在一种实施方式中不含酸性氨基酸)，脂肪酸，糖，维生素，脂质或者丙酮酸等营养剂，抗生素(例如：青霉素，链霉素)，细胞外基质(例如：基质胶，层粘连蛋白，层粘连蛋白片段，层粘连蛋白511-E8片段)及染料(例如：酚红)等中的1个以上的添加物，但不限于这些。
[0730] 连续上皮组织维持用培养基可以为含血清培养基、无血清培养基中的任一种。优选为含血清培养基。含血清培养基中的血清的浓度通常为0.1～20％(v/v)、优选为0.1～12％(v/v)(例如，10％(v/v))。在本说明书中，关于由以0.1～20％(v/v)的浓度下的血清添加带来的培养基中包含的组成的浓度变化不作考虑。
[0731] 作为上述6.的步骤(1)中使用的培养基，具体而言可以例示约10％的FBS，约1％的N2补充剂(Thermo Scientific公司制)及包含约100μM的牛磺酸的DMEM/F12培养基(以下称为A培养基)。
[0732] 另外，作为上述6.的步骤(2)中的培养基，除了上述A培养基以外，具体而言可以例示包含约10％的FBS，约2％的B27补充剂(Thermo Scientific公司制)，约200mM的谷氨酰胺及约100μM的牛磺酸的Neurobasal培养基(以下称为B培养基)。
[0733] 另外，也可以将上述B培养基适当与上述A培养基等进行混合而使用。例如可以将A培养基和B培养基适当以4∶1～1∶4的比率混合使用。或者也可以逐个阶段提高混合培养基中B培养基的比率。
[0734] 优选为可以使用A培养基到视细胞或视细胞前体细胞出现的分化阶段。
[0735] 到视细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段，优选为可以使用A培养基和B培养基的混合培养基。
[0736] 在视细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段以后，优选为可以使用B培养基，但如果为出现视杆细胞前体细胞的阶段以后的神经视网膜组织，则由于容易维持连续上皮结构，因此，也可以适当从B培养基变更为其它培养基。
[0737] 作为上述步骤(2-1)和/或(2-2)中使用的培养基没有特别的限定，可以将在动物细胞的培养中通常使用的培养基作为基础培养基制备。作为基础培养基，可列举例如：BME培养基，BGJb培养基，CMRL 1066培养基，Glasgow MEM(GMEM)培养基，改良的MEM Zinc Option培养基，IMDM培养基，Medium 199培养基，Eagle MEM培养基，αMEM培养基，DMEM培养基，F-12培养基，DMEM/F12培养基，IMDM/F12培养基，Ham′s培养基，RPMI 1640培养基，Fischer’s培养基，或它们的混合培养基等可以用于动物细胞的培养的培养基。
[0738] 由于在步骤(2-1)和/或(2-2)中希望维持神经视网膜组织的连续上皮结构，因此，作为培养基可以例示除上述A培养基以外，上述的B培养基，或A培养基和B培养基的混合培养基。
[0739] 优选为可以使用A培养基到视细胞或视细胞前体细胞出现的分化阶段。
[0740] 到视细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段，优选为可以使用A培养基和B培养基的混合培养基。
[0741] 在视细胞前体细胞的出现率为最大的分化阶段以后，优选为可以使用B培养基，但如果为出现视杆细胞前体细胞的阶段以后的神经视网膜组织，则由于容易维持连续上皮结构，因此，也可以适当从B培养基变更为其它培养基。
[0742] 在视网膜组织中的“连续上皮结构”意指视网膜组织具有上皮组织特有的顶端面，且顶端面在形成神经视网膜层的各层中，至少与视细胞层(外核层)或成神经细胞层(neuroblastic layer)大致平行，且在视网膜组织的表面连续地形成的结构。即，在连续上皮结构中不具有认为是莲座样结构那样的顶端面为离断的结构。例如，在为由多潜能干细胞制作的包含视网膜组织的细胞聚集体的情况下，在聚集体的表面形成顶端面，在相对于表面的切线方向上有10个细胞以上、优选为30个细胞以上、更优选为100个细胞以上，进一步优选为400个细胞以上的视细胞或视细胞前体细胞规规矩矩地连续排列。连续排列的视细胞或视细胞前体细胞的数量与细胞聚集体中包含的神经视网膜组织的大小相关。在本说明书中，相对于上皮组织的切线方向意指在上皮组织中例如形成顶端面的一个一个细胞沿一定方向排列的情况下，细胞排列的方向，是指相对于上皮组织(或上皮片层)的平行方向或宽度方向。
[0743] 在一种实施方式中，在神经视网膜组织的表面中形成顶端面，其沿着顶端面，视细胞或视细胞前体细胞规规矩矩地连续排列。
[0744] 本领域技术人员知晓，在为视细胞或视细胞前体细胞的出现比例较少的阶段的视网膜组织(例如：发育早期阶段的视网膜组织)的情况下，将包含增殖的神经视网膜祖细胞的层称为“神经母细胞层”。另外，在这样的阶段的视网膜组织的表面，除了视细胞或视细胞前体细胞以外，有时存在具有极性，能够形成顶端面的神经视网膜祖细胞，从神经视网膜祖细胞分裂，增殖的细胞，和/或从神经视网膜祖细胞向构成神经视网膜的细胞分化的阶段的细胞。通过将这样状态的视网膜组织在维持“连续上皮结构”的条件下继续培养，由此可得到沿着在神经视网膜组织的表面形成的顶端面，视细胞或视细胞前体细胞规规矩矩地连续排列的视网膜组织。
[0745] 在一种实施方式中，在视网膜组织的表面存在的顶端面的面积相对于视网膜组织的表面的面积平均为30％以上、优选为50％以上、更优选为80％以上，进一步更优选为95％以上。对在视网膜组织的表面存在的顶端面的面积的比例而言，如后所述，能够通过将顶端面的标记进行染色而测定。
[0746] 在本说明书中，视网膜组织中的“莲座样结构”意指细胞以围绕中央部的管腔的方式排列为辐射状或螺旋状的结构。在形成了莲座样结构的视网膜组织中，沿着其中央部(管腔)为存在顶端面及视细胞，或视细胞前体细胞的状态，顶端面被离断为各个莲座样结构。
[0747] 在本说明书中，“顶端面”意指在上皮组织中，在与存在富于粘多糖(PAS染色阳性)，较多包含层粘连蛋白、IV型胶原蛋白的50-100nm的上皮细胞产生的层(基膜)的基膜侧为相反侧形成的表面(表层面)。在一种实施方式中，“顶端面”指在产生阶段进展到可确认到视细胞或视细胞前体细胞的程度的视网膜组织中，形成外边界膜，与存在视细胞，视细胞前体细胞的视细胞层(外核层)相接的面。另外，这样的顶端面可以使用针对顶端面的标记(例如：非典型-PKC(以下简写为aPKC)，E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白)的抗体，采用本领域技术人员众所周知的免疫染色法等鉴定。在发育早期阶段，即使在在视细胞或视细胞前体细胞未出现的情况下、或未出现视细胞或视细胞前体细胞充分覆盖视网膜组织的表面的程度的情况下，上皮组织也具有极性，在顶端面中表达上述顶端面的标记。
[0748] 可以通过视网膜组织具有的顶端面的连续性(即，不离断的形态)来确认视网膜组织是否具有连续上皮结构。顶端面的连续性可通过如下判定：例如对顶端面的标记(例如：aPKC，E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白)，位于顶端面侧的视细胞或视细胞前体细胞的标记(例如：
Crx或rikavarin))进行免疫染色，针对获得的图像等而分析顶端面和视细胞层，及各视网膜层的位置关系。对于除了顶端面、视细胞层(外核层)以外的视网膜层，可采用基于利用将细胞核染色的DAPI染色，PI染色，Hoechst染色，或标记在细胞核中部分地存在的蛋白(Rx，Chx10，Ki67，Crx等)等免疫染色等而鉴定。
Crx或rikavarin))进行免疫染色，针对获得的图像等而分析顶端面和视细胞层，及各视网膜层的位置关系。对于除了顶端面、视细胞层(外核层)以外的视网膜层，可采用基于利用将细胞核染色的DAPI染色，PI染色，Hoechst染色，或标记在细胞核中部分地存在的蛋白(Rx，Chx10，Ki67，Crx等)等免疫染色等而鉴定。
[0749] 可通过将细胞聚集体用4％多聚甲醛固定等后制作冷冻切片，并使用针对作为顶端面标记的aPKC，E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白的抗体、将核特异性染色的DAPI等而采用通常实施的免疫染色等观察莲座样结构的非正常形成(例如：离断的顶端面或顶端面向细胞聚集体内侵入)，由此确定是否产生了莲座样结构。
[0750] 作为本发明的一种实施方式，可列举连续上皮结构具有包含视网膜组织的聚集体，即包含在视网膜组织的表面的至少50％以上(优选为60％以上，70％以上，80％以上，85％以上，90％以上)中有视细胞或其祖细胞连续存在的视网膜组织的聚集体。另外，包含该聚集体和连续上皮组织维持用培养基的制备物也包括在本发明的范畴中。
[0751] 作为具有本发明的连续上皮结构的视网膜组织的一种实施方式，可列举包含相对于视网膜组织的表面的面积，在视网膜组织的表面存在的顶端面的面积为至少50％以上(优选为60％以上，70％以上，80％以上，85％以上，90％以上)的视网膜组织的聚集体。作为本发明的一种实施方式，可列举包含具有长轴方向的直径为0.5mm以上(优选为0.6mm以上，0.8mm以上，1.0mm以上，1.2mm以上，1.4mm以上，1.6mm以上，1.8mm以上，2.0mm以上，2.2mm以上，2.4mm以上，2.6mm以上，2.8mm以上，2.9mm以上)的连续上皮结构的视网膜组织的聚集体。从能覆盖具有障碍的接受者的视网膜组织的广泛范围的观点出发，移植的视网膜组织优选较大的。一般而言，超过0.5mm～1.0mm的视网膜组织在移植时容易产生莲座结构。但是，根据本发明，即使是超过0.5mm～1.0mm的视网膜组织也不产生莲座结构，能提供包含具有连续上皮结构的视网膜组织的聚集体。需要说明的是，该视网膜组织的结构为如后述的“8.神经视网膜组织”描述的那样。
[0752] 用于本文时，视网膜组织的长轴方向的直径指例如当基于使用立体显微镜拍摄的图像测定时，连结视网膜组织的外周(轮廓，表面)中的任意2点的直线中最长的直线的长度。需要说明的是，在包含视网膜组织的聚集体中，可能多个视网膜组织互相重叠存在(例如：苜蓿型)。对于本领域技术人员，能够容易地判断是否包含多个视网膜组织。在该情况下，视网膜组织的长轴方向的直径意指聚集体中各自的视网膜组织中的长轴方向的直径，至少1个视网膜组织的长轴方向的直径为0.5mm以上即可。优选为聚集体中全部视网膜组织的长轴方向的直径为0.5mm以上。更具体而言，测定连结以从形状上观察有2个圆或椭圆发生重叠的点(更具体而言，将包含视网膜组织的聚集体的外周的连续的位置信息进行暂时地设定的情况下，将该位置信息作为横轴，该位置中切线的倾斜度作为纵轴进行作图时得到的曲线中，该曲线的失去连续性的点)区分成的外周中任意2点的直线中最长的直线的长度。进一步，在包含视网膜组织的聚集体中可能包含视网膜色素上皮细胞和/或睫状缘区。此时也与在聚集体中存在多个视网膜组织时同样，测定连结以在视网膜色素上皮和/或睫状缘区和视网膜组织的接点区分成的外周中任意2点的直线中最长的直线的长度。
[0753] 该视网膜组织中的表达RAX、CHX10和/或CRX的细胞的比例优选为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上。
[0754] 在为包含多个视网膜组织的聚集体的情况下，相对于总个数，满足上述条件的包含视网膜组织的聚集体的个数的比例优选为至少50％以上(优选为60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上)。
[0755] 包含该聚集体和连续上皮组织维持用培养基的制备物中包含的连续上皮组织维持用培养基为本说明书中定义的连续上皮组织维持用培养基。该制备物在能维持连续上皮组织的范围内，可以包含例如：抗生素、防腐剂、稳定剂、保存剂等。
[0756] 8.神经视网膜组织
[0757] 利用上述4.，5.及6.所述的方法得到的神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中。即，利用上述4.，5.及6.所述的方法，可以得到相应于培养期间的各种成熟度的神经视网膜组织。以下，对成熟度不同的神经视网膜组织分别说明。
[0758] (1)成熟的神经视网膜组织
[0759] 利用上述4.所述的方法从悬浮培养开始起继续培养180～200天以上得到的神经视网膜组织为富于视锥细胞前体细胞，包含视细胞前体细胞及视细胞，穆勒细胞的成熟的神经视网膜组织。在该神经视网膜组织中，与生物体神经视网膜组织的情况相比，神经节细胞、无长突细胞、水平细胞，及双极细胞的比例更低，视细胞前体细胞及视细胞，以及视锥细胞前体细胞及视锥细胞的比例更高。即，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：PAX6阳性/CHX10阴性细胞(即，神经节细胞、无长突细胞、水平细胞中的任一种细胞)的比例，及PAX6阴性/CHX10强阳性细胞(即，双极细胞)的比例均降低，这些细胞的含量分别为总细胞数的30％以下、优选为20％以下，更优选为15％以下，及总细胞数的8％以下、优选为
6％以下，更优选为5％以下，进一步地，CRX阳性细胞(即，视细胞前体细胞)为总细胞数的
35％以上、优选为40％以上、更优选为45％以上，进一步更优选为50％以上，进一步更优选为53％以上，和/或，CRX阳性且RXR-γ阳性且NRL阴性细胞(即，视锥细胞前体细胞)为总细胞数的25％以上、优选为32％以上、更优选为35％以上，进一步更优选为40％以上，进一步更优选为44％以上。
6％以下，更优选为5％以下，进一步地，CRX阳性细胞(即，视细胞前体细胞)为总细胞数的
35％以上、优选为40％以上、更优选为45％以上，进一步更优选为50％以上，进一步更优选为53％以上，和/或，CRX阳性且RXR-γ阳性且NRL阴性细胞(即，视锥细胞前体细胞)为总细胞数的25％以上、优选为32％以上、更优选为35％以上，进一步更优选为40％以上，进一步更优选为44％以上。
[0760] 另外，利用上述5.所述的方法从悬浮培养开始起继续培养180～200天以上得到的神经视网膜组织为富于视锥细胞前体细胞包含视细胞前体细胞及视细胞，穆勒细胞的成熟的神经视网膜组织。与在背侧化信号转导物质非存在下制备的视网膜组织相比，该神经视网膜组织在总细胞中的视细胞前体细胞，和/或视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例更加高。即，在可见穆勒细胞的阶段中PAX6阳性/CHX10阴性细胞(即，神经节细胞、无长突细胞、水平细胞中的任一种细胞)和PAX6阴性/CHX10强阳性细胞(即，双极细胞)的合计比例降低，为总细胞数的30％以下、优选为25％以下，更优选为20％以下。进一步，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：CRX阳性细胞(即，视细胞前体细胞)的含量为总细胞数的40％以上、优选为53％以上、更优选为57％以上，和/或，CRX阳性且RXR-y阳性且NRL阴性细胞为总细胞数的32％以上、优选为44％以上、更优选为54％以上。
[0761] 另外，在上述神经视网膜组织中，当背侧化信号转导物质为SHH信号转导途径抑制物质的情况下，与在背侧化信号转导物质非存在下，或BMP4等背侧化信号转导物质的存在下制备的视网膜组织和相比，总细胞中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞，及双极细胞的比例更加低，视细胞前体细胞及视细胞，和/或，视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞，和/或视细胞中的视锥细胞的比例更加高。即，在可见穆勒细胞的阶段中，PAX6阳性/CHX10阴性细胞(即，神经节细胞、无长突细胞、水平细胞中的任一种细胞)和PAX6阴性/CHX10强阳性细胞(即，双极细胞)合计的比例降低，为总细胞数的30％以下、优选为25％以下，更优选为20％以下，进一步更优选为14％以下。进一步，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：CRX阳性细胞(即，视细胞前体细胞)的含量为总细胞数的40％以上、优选为53％以上、更优选为57％以上，进一步更优选为66％以上，和/或，CRX阳性且RXR-γ阳性且NRL阴性细胞为总细胞数的32％以上、优选为44％以上、更优选为54％，进一步更优选为57％以上。
[0762] 另外，利用上述4.，5.及6.所述的方法得到的神经视网膜组织具有异位性视细胞前体细胞和/或视细胞。在此，异位性视细胞前体细胞和/或视细胞是指在构成视网膜的细胞层中在除了视细胞层以外的层存在的视细胞前体细胞和/或视细胞。在该神经视网膜组织中、优选为套用于生物体的视网膜组织的情况下，基膜侧，具体地相当于外核层的基膜侧的区域，即从在包含神经视网膜祖细胞的发育中途阶段中的神经视网膜组织的神经视网膜祖细胞层跨神经节细胞层的区域，换言之，在成神经细胞层及成神经细胞层的基膜侧的区域出现异位性CRX阳性细胞(即，视细胞前体细胞或视细胞)，伴随成熟而在构成视网膜组织的各层中，在有双极细胞及无长突细胞等存在的内核层、有神经节细胞存在的神经节细胞层这样的基膜侧的细胞层中，形成异位性视细胞层(也称为视细胞前体细胞层)。因此，其为在移植时接受者的双极细胞和移植的视网膜组织内包含的视细胞前体细胞在空间，或物理的距离上接近的适于移植的视网膜组织。
[0763] 即，以下视网膜组织也包括在本发明的范畴中，其中，所述神经视网膜组织的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞，及双极细胞的比例低，视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞，和/或，视细胞中的视锥细胞的比例更加高，且为形成上述异位性视细胞层(也称为视细胞前体细胞层)的视网膜组织。
[0764] 在该视网膜组织中，上述异位性视细胞层(也称为视细胞前体细胞层)中包含的视细胞前体细胞的比例具体而言为神经视网膜组织中包含的总细胞数的10％以上、优选为15％以上、更优选为20％以上，进一步更优选为25％以上。另外，相对于在外核层存在的视细胞前体细胞，上述异位性视细胞前体细胞的比例为30％以上、优选为40％以上、更优选为
50％以上，进一步更优选为60％以上。
50％以上，进一步更优选为60％以上。
[0765] 上述任一成熟的神经视网膜组织能以构成包含连续上皮结构的细胞聚集体，其表面的顶端(apical)面与培养基侧相接的形式形成。
[0766] (2)中程度的成熟度的神经视网膜组织
[0767] 以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中，所述神经视网膜组织为在上述4.所述的方法中，从悬浮培养开始起继续培养65天～75天左右得到，能分化为上述(1)所述的成熟的神经视网膜组织。该神经视网膜组织富于视锥细胞或视锥细胞前体细胞，在一种实施方式中为视锥细胞前体细胞的出现率最大的分化阶段。该神经视网膜组织的特征在于，在视锥细胞前体细胞的出现率最大的阶段中，相比于生物体神经视网膜组织，或在甲状腺激素信号转导途径作用物质非存在下制备的视网膜组织，视细胞前体细胞，和/或视锥细胞前体细胞的比例更高。即，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：在视锥细胞前体细胞的出现率最大的阶段中，CRX阳性细胞的含量为总细胞数的10％以上、优选为11％以上、更优选为15％以上，进一步优选为20％以上，和/或CRX阳性且TRβ2阳性细胞的比例为7％以上、优选为10％以上，进一步优选为11％以上。
[0768] 另外，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：所述神经视网膜组织在上述5.所述的方法中，通过从悬浮培养开始起继续培养65天～75天左右得到，能分化为上述(1)所述的成熟的神经视网膜组织。该神经视网膜组织富于视锥细胞或视锥细胞前体细胞，在一种实施方式中为视锥细胞前体细胞的出现率最大的分化阶段。与在背侧化信号转导物质非存在下制备的视网膜组织相比，该神经视网膜组织在总细胞中的视细胞前体细胞，和/或视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例更加高。即，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：视锥细胞前体细胞的出现率最大的阶段中CRX阳性细胞的含量为总细胞数的20％以上、更优选为25％以上，进一步优选为29％以上，和/或CRX阳性且TRβ2阳性细胞的比例为11％以上、优选为13％以上，进一步优选为15％以上。
[0769] 另外，在利用上述5.所述的方法得到的神经视网膜组织中，在作为背侧化信号转导物质使用了SHH信号转导途径抑制物质的情况下，与在背侧化信号转导物质非存在下，或在BMP4等背侧化信号转导物质的存在下制备的视网膜组织相比，总细胞中视细胞前体细胞的比例更加高。即，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：视锥细胞前体细胞的出现率最大的阶段中CRX阳性细胞的含量为总细胞数的20％以上、更优选为25％以上，进一步优选为30％以上。
[0770] 作为本发明的从悬浮培养开始起继续培养65天～75天左右得到的神经视网膜组织，可列举CRX阳性细胞(即，视细胞前体细胞)为20％以上，和/或CRX阳性/TRβ2阳性细胞(即，在发育早期阶段出现的视锥细胞前体细胞)为10％以上的神经视网膜组织。该神经视网膜组织可通过在甲状腺激素信号转导途径作用物质的存在下培养而制备。另外，可列举在套用于生物体的情况下，相当于外核层的基膜侧的区域，即从神经视网膜祖细胞层跨神经节细胞层的区域，换言之，在包含神经视网膜祖细胞的发育中途阶段中的神经视网膜组织的成神经细胞层及成神经细胞层的基膜侧的区域中，存在异位性CRX阳性细胞(即，视细胞前体细胞)的神经视网膜组织。即，该神经视网膜组织为在移植时接受者的双极细胞和移植的视网膜组织内包含的视细胞前体细胞在空间，或物理上的距离接近的适于移植的视网膜组织。另外，该神经视网膜组织为视细胞前体细胞，和/或，视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例高的视网膜组织，且，在包含成神经细胞层(NBL)的顶端面侧出现的视细胞前体细胞与在NBL的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞的比例为一定程度、优选为同程度。这里，“一定程度、优选为同程度”是指具体而言，在NBL的基膜侧和包含NBL的顶端面侧中包含的视细胞前体细胞的每面积的比例的比为10∶1～1∶10、优选为2∶1～1∶2，更优选为10∶7～7∶10。
[0771] 以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：在上述4.所述的方法中，从悬浮培养开始起继续培养90天～105天左右得到的神经视网膜组织，其能分化为上述(1)所述的成熟的神经视网膜组织。该神经视网膜组织富于视锥细胞或视锥细胞前体细胞，在一种实施方式中为视杆细胞前体细胞，或视杆细胞前体细胞(或双极细胞)开始出现的分化阶段。该神经视网膜组织的特征在于，在视杆细胞前体细胞开始出现的阶段中，相比于生物体神经视网膜组织，或在甲状腺激素信号转导途径作用物质非存在下制备的视网膜组织，视细胞前体细胞，和/或视锥细胞前体细胞的比例更高。即，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：开始出现视杆细胞前体细胞的阶段中CRX阳性细胞的含量为总细胞数的20％以上、优选为25％以上，进一步优选为30％以上。另外，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：在该分化阶段中，在视网膜组织中，沿着与顶端面的切线垂直相交的直线有平均2个细胞、优选为平均3个细胞以上、更优选为平均4个细胞以上为视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)。另外，这些神经视网膜组织优选在该分化阶段中的视网膜组织中，在成神经细胞层(NBL)的基膜侧包含异位性视细胞前体细胞。
[0772] 以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：在上述5.所述的方法中，从悬浮培养开始起继续培养90天～105天左右得到的神经视网膜组织，其能分化为上述(1)所述的成熟的神经视网膜组织。该神经视网膜组织富于视锥细胞或视锥细胞前体细胞，在一种实施方式中为视杆细胞前体细胞，或视杆细胞(或双极细胞)开始出现的分化阶段。该神经视网膜组织的特征在于，在视杆细胞前体细胞(或双极细胞)开始出现的阶段中，相比于生物体神经视网膜组织，或在甲状腺激素信号转导途径作用物质非存在下制备的视网膜组织，视细胞前体细胞，和/或视锥细胞前体细胞的比例更高。即，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：视杆细胞前体细胞(或双极细胞)开始出现的阶段中CRX阳性细胞的含量为总细胞数的25％以上、优选为30％以上，进一步优选为40％以上，进一步更优选为50％以上。另外，以下神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中：在该分化阶段中，在视网膜组织中，沿着与顶端面的切线垂直相交的直线有平均2个细胞、优选为平均3个细胞以上、更优选为平均4个细胞以上为视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)。另外，这些神经视网膜组织优选在该分化阶段中的视网膜组织中，在成神经细胞层(NBL)的基膜侧包含异位性视细胞前体细胞。
[0773] 作为本发明的神经视网膜组织的优选的实施方式，可列举具有以下特征中的至少1个、优选为3个，更优选为下述(3)加上2个，进一步优选为下述(3)加上3个，进一步更优选为全部特征的神经视网膜组织：
[0774] (1)CRX阳性细胞的细胞数为10％以上、优选为20％以上，进一步优选为25％以上、更优选为30％以上；
[0775] (2)CRX阳性且TRβ2阳性细胞的细胞数为10％以上、优选为15％以上；及
[0776] (3)在相当于成神经细胞层(NBL)的基膜侧(或外核层的基膜侧)存在区域异位性CRX阳性细胞；
[0777] (4)在成神经细胞层(NBL)的基膜侧出现的异位性视细胞前体细胞和，在包含成神经细胞层的顶端面侧出现的视细胞前体细胞的比率为10∶1～1∶10(例如：1∶1)；
[0778] (5)连续上皮率为50％以上、优选为80％以上、更优选为95％以上。
[0779] 另外，本发明的神经视网膜细胞，作为一种实施方式为神经视网膜组织中出现的视锥细胞前体细胞的比例为最大的阶段的视网膜组织。这里，对视锥细胞前体细胞的比例为最大的阶段而言，可利用上述的方法，通过检查从神经视网膜祖细胞而视锥细胞前体细胞进行分化的比例为最大的期间而鉴定。具体而言，相当于从确认到视锥细胞前体细胞的出现起30～50天后、优选为30～相0天后的神经视网膜组织(或包含神经视网膜组织的细胞聚集体)，或例如利用原料制备方法1～4所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，悬浮培养开始后约第60～70天，利用原料制备方法5～7所述的方法制备的视网膜组织作为原料时，相当于悬浮培养开始后约第65～75天的神经视网膜组织(或包含神经视网膜组织的细胞聚集体)。
[0780] 作为本发明的神经视网膜组织的优选的实施方式，可列举具有以下特征中的至少1个、优选为2个，更优选为下述(1)和(2)，进一步优选为(3)加上2个，进一步更优选为全部特征的神经视网膜组织：
[0781] (1)CRX阳性细胞的细胞数为25％以上、优选为30％以上、更优选为40％以上，进一步更优选为50％以上；
[0782] (2)沿着与顶端面的切线垂直相交的直线有平均2个细胞、优选为平均3个细胞以上、更优选为平均4个细胞以上为视细胞前体细胞(CRX阳性细胞)；及
[0783] (3)在成神经细胞层(NBL)的基膜侧包含异位性视细胞前体细胞；
[0784] (4)连续上皮率为50％以上、优选为80％以上、更优选为95％以上。
[0785] 另外，本发明的神经视网膜细胞，作为一种实施方式为神经视网膜组织中开始出现视杆细胞前体细胞的阶段的视网膜组织。这里，对开始出现视杆细胞前体细胞的阶段而言，可通过检查神经视网膜组织中开始出现针对视杆细胞前体细胞的标记，具体而言CRX且NRL阳性细胞(或CHX10强阳性且PAX6阴性细胞)的阶段而鉴定。或者，也可通过特别指定作为与开始出现视杆细胞前体细胞的阶段为相同的阶段的，开始出现双极细胞的阶段而鉴定。这里，对开始出现双极细胞的阶段而言，可通过神经视网膜组织中开始出现针对双极细胞的标记CHX10强阳性且PAX6阴性细胞而鉴定。具体而言，开始出现视杆细胞前体细胞(或双极细胞)的阶段为视从杆细胞前体细胞(或双极细胞)出现起20天以内、优选为15天以内，更优选为10天以内，进一步优选为5天以内，且包含向视杆细胞前体细胞(或双极细胞)分化的阶段的神经视网膜祖细胞的分化阶段。是否为神经视网膜祖细胞向视杆细胞前体细胞(或双极细胞)分化的阶段，可以通过对作为视网膜组织中的增殖细胞的神经视网膜细胞所摄入的BrdU或EdU等添加到培养液中，使用抗体鉴定摄入了BrdU或EdU等的细胞是否表达视杆细胞前体细胞(或双极细胞)的标记而设定。例如，在将BrdU隔一定时期(例如到悬浮培养开始后第90，91，92，93，94天～第110天的1天等)添加到培养基中后不久，对视网膜组织进行分析的结果，可观察到BrdU阳性且双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)标记阳性细胞情况下，可以将添加了BrdU的期间(若为1天，则为该天)鉴定为包含向双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)分化的阶段的神经视网膜组织的阶段。或者，也可以作为检测到双极细胞(或，视杆细胞前体细胞)标记阳性细胞，检测到且已知在视细胞前体细胞中一过性地表达的BLIMP1阳性细胞的阶段而鉴定。更具体而言，相当于从确认到视锥细胞前体细胞的出现起55～80天后、优选为55～70天后的神经视网膜组织(或包含神经视网膜组织的细胞聚集体)，或例如在将利用原料制备方法1～4所述的方法制备的视网膜组织作为原料的情况，为悬浮培养开始后约第85～100天，利用上述制备方法5，6，和/或7制作的视网膜组织(或包含视网膜组织的细胞聚集体)的情况下，该神经视网膜组织相当于悬浮培养开始后第90天～第105天(相当于确认到视锥细胞前体细胞的出现以后第55～80天、优选为第55～70天)的神经视网膜组织。
[0786] 另外，作为本发明的神经视网膜组织的优选的实施方式，可列举具有以下特征中的至少3个、优选为5个，更优选为下述(1)及(7)加上4个，进一步优选为下述(1)及(7)加上5个，进一步优选为全部特征的神经视网膜组织：
[0787] (1)包含CRABP或CRALBP阳性细胞；
[0788] (2)PAX6阳性/CHX10阴性细胞为30％以下、优选为20％以下，更优选为15％以下，进一步更优选为10％以下；
[0789] (3)PAX6阴性/CHX10强阳性细胞为10％以下、优选为5％以下；
[0790] (4)PAX6阳性/CHX10阴性细胞，及PAX6阴性/CHX10强阳性细胞的合计为30％以下、优选为20％以下，更优选为14％以下；
[0791] (5)CRX阳性细胞为40％以上、优选为50％以上、更优选为57％以上，进一步更优选为66％以上；
[0792] (6)CRX阳性细胞中的RXR-γ阳性且NRL阴性细胞的细胞数为32％以上、优选为40％以上、更优选为54％以上，进一步更优选为57％；
[0793] (7)在相当于外核层的基膜侧的区域存在异位性CRX阳性细胞；及
[0794] (8)连续上皮率为50％以上、优选为80％以上、更优选为95％以上。
[0795] 另外，本发明的神经视网膜细胞，作为一种实施方式为分化到神经视网膜组织中可见穆勒细胞的程度的视网膜组织。这里，穆勒细胞可以通过检测众所周知的标记，例如CRABP阳性细胞，和/或CRALBP阳性细胞而鉴定。具体而言，在例如利用上述制备方法1～3，4，5，6，和/或7制作的视网膜组织(或包含视网膜组织的细胞聚集体)的情况下，该神经视网膜组织为相当于悬浮培养开始后第180天～第200天的神经视网膜组织。
[0796] 特别是，在上述5.的制备方法中作为背侧化信号转导物质使用BMP4等BMP信号转导途径作用物质的情况下，可以制备除了上述特征以外，视网膜组织中包含的视细胞前体细胞中基本不存在视杆细胞前体细胞，而是视锥细胞前体细胞选择性的神经视网膜组织。另外，在上述5.的制备方法中作为背侧化信号转导物质使用环巴胺-KAAD等SHH信号转导途径抑制物质情况下，可以制备除了上述的特征以外，视网膜组织中包含的双极细胞的比例低，视细胞前体细胞的比例高，且视锥细胞前体细胞的比例高的神经视网膜组织。这些神经视网膜组织也包括在本发明的范畴中。
[0797] 能分化为上述任一成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织能以构成包含连续上皮结构的细胞聚集体，其表面的顶端(apical)面与培养基侧相接的形式形成。相对于神经视网膜组织的表面，与培养基侧相接的顶端(apical)面的比例为50％以上、优选为80％以上、更优选为95％以上。
[0798] 另外，作为本发明的方法中得到的上述的“成熟的神经视网膜组织”或“能分化为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织”，可列举平均直径1～2mm，具体而言1.3mm左右的大小的细胞聚集体的形态。另外，有至少60％、优选为70％，80％，更优选为85％，90％，95％以上的聚集体具有1.0mm以上的大小的细胞聚集体的聚集体也包括在本发明的范畴中。该细胞聚集体的聚集体包含1.5mm以上、优选为2.0mm以上，进一步优选为2.5mm，2.9mm以上的细胞聚集体。
[0799] 9.药物组合物
[0800] 本发明提供包含有效量的本发明的神经视网膜组织的药物组合物。该药物组合物中包含有效量的本发明的神经视网膜组织，及药学上允许的载体。
[0801] 关于药学上允许的载体，可以使用生理水性溶剂(生理盐水，缓冲液，无血清培养基等)。必要时，在移植治疗中，在包含要移植的组织或细胞的药物中可以包含常规使用的保存剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。
[0802] 本发明的药物组合物可以通过将本发明的神经视网膜组织在适当的生理的水性溶剂中悬浊而以悬浊液形式制备。如果需要，也可以添加冷冻保存剂而冻存，在使用时解冻，用缓冲液中洗涤而用于移植医疗。
[0803] 本发明的神经视网膜组织可以取适于医疗用途的各种形态。可以为片状，柱状，块状，栓状等各种形状，可以通过适当成型而加工成适于施用的形状。从优异的治疗效果，简便性等观点出发，优选为片状。
[0804] 本发明的神经视网膜组织也可用镊子等器具切成适当的大小，以制备施用用的视网膜组织片。另外，也可以将切成片状的视网膜组织片制成片剂。另外，制成片剂时，也可以使用以本发明的神经视网膜组织的伸展为目的的利用具有生物体适合性的聚合物，单体，或凝胶制作的适当的片、网状的片。
[0805] 即，包含从本发明的神经视网膜组织切成的视网膜组织片的药物组合物也包括在本发明的范畴中。
[0806] 采本发明的神经视网膜组织可以使用包含木瓜蛋白酶等蛋白质分解酶的细胞分散液分散，制备成施用用的视网膜细胞悬浊液。另外，也可以作为使用目标的细胞表达的抗原蛋白质的特异性的抗体，适体，肽，等作为有效成分而从细胞悬浊液中包含的细胞中分离所要细胞的药物组合物。
[0807] 即，包含将本发明的神经视网膜组织分散，和/或纯化而制备的细胞悬浊液的药物组合物也包括在本发明的范畴中。
[0808] 可知在本发明的神经视网膜组织中，在为了在与接受者侧的细胞之间形成突触而使不希望的双极细胞，无长突细胞等的比例降低的基础上，使外核层的基膜侧的与容易接受者侧的细胞之间形成突触的部分也出现异位性视细胞前体细胞，进一步提高视细胞前体细胞的比例。即，本发明可以制备作为再生医疗中使用的医药品有用的移植用视网膜组织。
[0809] 该移植用视网膜组织的移植部位没有特别限制，只要是需要视细胞的再生的眼睛部区域即可，由于视锥细胞前体细胞的比例高，因此作为用于移植到特别是黄斑部，或黄斑部的中央部的移植用视网膜组织有用。
[0810] 10.治疗方法
[0811] 本发明的神经视网膜组织在基于该视网膜组织，及其中包含的由视网膜细胞的障碍导致(作为原因)的疾病的移植医疗中有用。为此，本发明提供治疗方法，其包括将本发明的神经视网膜组织，由神经视网膜组织的障碍导致的疾病的治疗药及该治疗药施用于患者。本发明的神经视网膜组织可以作为由该视网膜组织导致的障碍的疾病的治疗药，或者，该视网膜组织处于损伤状态中，为了在该损伤部位补充视网膜组织而使用。可以通过对需要移植的由视网膜组织的障碍导致的疾病、或视网膜组织损伤状态的患者移植本发明的备维的视网膜其的组织，补充受到损伤的视网膜组织自身，而治疗由视网膜组织的障碍导致的疾病，或视网膜组织的损伤状态。作为由视网膜组织的障碍导致的疾病，可列举例如：视网膜变性，视网膜色素变性，年龄相关性黄斑变性，有机汞中毒，氯喹视网膜病变(chloroquineretinopathy)，青光眼，糖尿病视网膜病变或新生儿视网膜病变等。
[0812] 对在本发明的神经视网膜组织中，富于视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织，以及富于视锥细胞前体细胞和/或视锥细胞的包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织而言，作为向患者的眼睛中视锥细胞多的区域的移植用药物组合物有用。作为视锥细胞前体细胞和/或视锥细胞多的区域，具体而言可列举包含无视杆细胞区(Rod-free zone)的区域。作为包含无视杆细胞区的区域，可列举具有黄斑部(Macular)样结构的区域、优选为黄斑部。即，包含富于视锥细胞前体细胞的视细胞的本发明的视网膜组织作为移植到患者的黄斑部、优选为黄斑部的更中心区域的移植用药物组合物有用。作为需要向黄斑部的移植的疾病，可以利用于用于改善或者治疗年龄相关性黄斑变性症等中，在亮处的视力(即，白天的视力)降低的状态，在亮处的视野狭窄，全盲等状态。
[0813] 在移植治疗中，由组织相容性抗原的差异导致的排异通常构成问题，然而，该问题可以通过使用由移植接受者的体细胞建立的多潜能干细胞(例如，人工多潜能干细胞)而解决。即，在优选的一种实施方式中，在本发明的方法中，通过使用由接受者的体细胞建立的多潜能干细胞(例如，人工多潜能干细胞)作为多潜能干细胞，由此针对该接受者制备在免疫学上为自身性的神经组织或神经类细胞，将其移植至该接受者。
[0814] 另外，也可以从与接受者免疫上相容的(例如：HLA型、MHC型的一部分或全部相容)其他对象的体细胞建立的多潜能干细胞(例如，人工多潜能干细胞)制备同种异体的视网膜组织或视网膜细胞，并将其移植至该接受者。
[0815] 11.评价毒性/药效的方法
[0816] 本发明的神经视网膜组织，由于作为由视网膜组织的障碍导致的疾病的治疗药的筛选、毒性评价中的疾病研究材料，新药材料有用，因此可作为被检物质的毒性/药效评价用试剂。例如，从由视网膜组织的障碍导致的疾病，特别是基于遗传性的障碍的疾病的人类患者建立iPS细胞，使用该iPS细胞并采用本发明的方法制备本发明的视网膜组织。该视网膜组织可将作为该患者所患有的疾病的原因的视网膜组织的障碍在体外再现。因此，本发明提供包括使利用本发明的制备方法制备的视网膜组织与被检物质接触，检验该物质对该组织造成的影响的步骤的评价该物质的毒性/药效方法。
[0817] 例如将采用本发明的制备方法制备的具有特定的障碍(例如，遗传性的障碍)的视网膜组织，在被检物质的存在下或非存在下(阴性对照)中培养。然后，将利用被检物质处理的视网膜组织中的障碍的程度与阴性对照相比。结果，可以选择减轻了障碍的严重性的被检物质作为由所述障碍导致的疾病的治疗药的候选物质。例如可以将使采用本发明的制备方法制备的视网膜组织的生理活性(例如：促进生存，或成熟)更加提高的被检物质作为医药品的候选物质探索。或者，可以从具有显示具有视网膜组织的障碍疾病等特定的障碍的具有基因突变的体细胞制备人工多潜能干细胞，向将该细胞采用本发明的方法诱导分化而制备的视网膜祖细胞或者视网膜层特异性神经细胞添加被检物质，将是否显示上述障碍作为指标而探索作为该障碍的治疗药、预防药有效的被检物质的候选。
[0818] 在毒性评价中，将本发明的神经视网膜组织在被检物质的存在下或非存在下(阴性对照)培养。然后，将利用被检物质处理的视网膜组织的毒性的程度与阴性对照进行比较。其结果，可以将与阴性对照相比显示毒性的被检物质，作为相对于视网膜组织具有毒性的物质判定。
[0819] 即，本发明中包含包括以下步骤的毒性评价方法。
[0820] (步骤1)将本发明的神经视网膜组织在能生存的培养条件下，在被检物质的存在下培养一定时间，测定细胞的损伤的程度的步骤，
[0821] (步骤2)将采用本发明的制备方法制备的视网膜组织在能生存的培养条件下，在被检物质的非存在下或阳性对照的存在下培养一定时间后，测定细胞的损伤的程度的步骤，
[0822] (步骤3)基于(步骤1)和(步骤2)中测量的结果的差异，评价步骤1中的被检物质的毒性的步骤。
[0823] 用于本文时，“在被检物质的非存在下”包括代替被检物质而仅添加培养液或用于溶解所述被检物质的溶剂。另外，“阳性对照”是指具有毒性的已知化合物。作为测定细胞损伤的程度的方法，可列举测量生存的细胞数的方法，例如测定细胞内ATP量的方法，或细胞染色(例如细胞核染色)与形态观察，由此测量活细胞数的方法等。
[0824] 在(步骤3)中，作为评价被检物质具有的毒性的方法，例如在将步骤1中的测量值与(步骤2)中的阴性对照的测量值进行比较，当步骤1中的细胞损伤的程度高时，可以判断所述被检物质具有毒性。另外，将步骤1中的测量值与(步骤2)中的阳性对照的测量值进行比较，当步骤1中的细胞损伤的程度相同或更高时，可以判断所述被检物质具有毒性。
[0825] 得到的神经视网膜组织可以直接用作毒性/药效评价用试剂。通过将神经视网膜组织进行分散处理(例如：胰蛋白酶/EDTA处理或木瓜蛋白酶处理)，将得到的细胞使用FACS或MACS筛选，由此也可以得到高纯度的神经视网膜祖细胞。另外，神经视网膜组织中包含的视细胞前体细胞(S视锥细胞前体细胞，L视锥细胞前体细胞，M视锥细胞前体细胞，或视杆细胞前体细胞)也可以，经过最终的成熟而使其分化为表达视色素的视细胞(S视锥细胞，L视锥细胞，M视锥细胞，或视杆细胞)而用作毒性/药效评价用试剂。
[0826] 实施例
[0827] 以下，结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
[0828] 实施例1(使用了人ES细胞的包含视网膜组织的细胞聚集体的制备例和视网膜组织的切取方法)
[0829] 将敲入CRX::Venus的人ES细胞(源自KhES-1；Nakano，T.et a1.CellStem Cell 2012，10(6)，771-785)按照“Ueno，M.et al.PNAS 2006，103(25)，9554-9559”及“Watanabe，K.et al.Nat Biotech 2007，25，681-686”中记载的方法培养。对于用于培养人ES细胞的培养基，使用了在DMEM/F12培养基(Sigma)中添加了20％KSR(Knockout TM Serum
Replacement；Invitrogen)，0.1mM 2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺、1x非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific公司，11140050)，7.5ng/ml bFGF的培养基。
Replacement；Invitrogen)，0.1mM 2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺、1x非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific公司，11140050)，7.5ng/ml bFGF的培养基。
[0830] 对包含发育早期阶段的视网膜组织的细胞聚集体而言，将“Kuwahara et a1.Nat Commun 2015，19(6)，6286-”中记载的方法改良一部分而制备。即，将经培养的上述ES细胞，使用TrypLE Express(Invitrogen)分散为单个之后，将分散为单个的人ES细胞以使为每孔9x103细胞的方式悬浮于细胞非黏附性的96孔培养板(Sumilon Spheroid plate，SUMITOMO BakeLite公司)中的100μL的无血清培养基中，使其迅速地形成聚集体后，于37℃，5％CO2进行培养。对于此时的无血清培养基，使用了在F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合液中添加了10％KSR，450μM 1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，5mg/mL BSA，20μM Y27632的无血清培养基。在悬浮培养开始后的第6天添加最终浓度1.5nM的BMP4继续悬浮培养。将孔内的培养液的半量每隔3或4天更换为不添加BMP信号转导途径作用物质的上述培养基。将悬浮培养开始后第18天的包含视网膜组织的细胞聚集体在包含3μM CHIR99021及5μM SU5402的无血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加了1％N2补充剂的培养基)中悬浮培养4天，即到悬浮培养开始后第22天。然后，将包含视网膜组织的细胞聚集体继续悬浮培养至用于适当分析等。对这期间的培养液，使用下述[1]～[3]示出的血清培养基在5％CO2条件下培养。
[0831] [1]从悬浮培养开始后第22天到第38天：在DMEM/F12培养基中添加了10％胎牛血清，1％N2补充剂，及100μM牛磺酸的培养基(以下称为A培养基)。
[0832] [2]从悬浮培养开始后第38天到第60天：将A培养基和在Neurobasal培养基中添加了10％胎牛血清，2％B27补充剂，200mM谷氨酰胺及100μM牛磺酸的培养基(以下称为B培养基)以1∶3的比率混合的培养基。
[0833] [3]悬浮培养开始后第60天以后：B培养基。
[0834] 另外，将细胞聚集体中的不是视网膜组织的大部分由目测确认后适当使用镊子切除，从包含视网膜组织的细胞聚集体中切取视网膜组织，使用于适当分析。将在悬浮培养开始后第35天从包含视网膜组织的细胞聚集体切取的视网膜组织的例子示于图1a、b。进一步，之后，利用荧光显微镜(Biorevo BZ-9000，Keyence)观察依照上述的培养方法培养的包含视网膜组织的细胞聚集体时，到悬浮培养开始后第42天在几乎全部视网膜组织中可观察到被敲入的CRX::Venus所显现的绿色荧光(图1c、d)。由此，可以确认到第42天出现了视细胞前体细胞。
[0835] 实施例2
[0836] 实施例2示出的包含视网膜组织的细胞聚集体通过在实施例1记载的方法中，分别以下述的方式加入T3或为背侧化信号转导物质的BMP4或者环巴胺-KAAD而制备。
[0837] [1]-T3组(图2a)；如实施例1记载的那样进行培养，培养到悬浮培养开始后第74天。
[0838] [2]+T3组(图2b)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第38天到悬浮培养结束进一步添加60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第69天。
[0839] [3]+T3+BMP组(图2c)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天，第38天到悬浮培养结束进一步分别添加0.15nM的BMP4和60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第69天。
[0840] [4]+T3+环巴胺-KAAD组(图2d)；使用实施例1中记载的培养液从悬浮培养开始后第22天，第38天到悬浮培养结束进一步分别添加500nM的环巴胺-KAAD和60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第69天。
[0841] 将在以上的条件下培养的包含视网膜组织的细胞聚集体利用荧光显微镜(Biorevo BZ-9000，Keyence)观察时，与-T3组的视网膜组织相比，敲入的CRX::Venus显现的绿色荧光在+T3组的视网膜组织中确认到更多(图2a，b)。进一步，与+T3组的视网膜组织相比，敲入的CRX::Venus显现的绿色荧光在+T3+BMP组及+T3+环巴胺-KAAD组的视网膜组织中确认到更加多(图2c，d)。
[0842] 根据这些可知，T3等甲状腺激素信号转导途径作用物质有使视网膜组织中的视细胞前体细胞增加的作用。进一步，可知与甲状腺激素信号转导途径作用物质单独发挥作用的情况相比，在甲状腺激素信号转导途径作用物质和背侧化信号转导物质组合作用的情况下，有进一步使视细胞前体细胞增加的作用。
[0843] 实施例3
[0844] 实施例3示出的包含视网膜组织的细胞聚集体通过在实施例1记载的方法中，分别以下述的方式加入100nM的9-顺式视黄酸，T3或背侧化信号转导物质(BMP4)而制备。
[0845] [1]-T3组(图3a)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第38天到悬浮培养结束进一步添加100nM的9-顺式视黄酸，培养到悬浮培养开始后第74天。
[0846] [2]+T3组(图3b)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第38天到悬浮培养结束进一步添加100nM的9-顺式视黄酸和60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第74天。
[0847] [3]+T3+BMP组(图3c)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天进一步添加0.45nM的BMP4，从悬浮培养开始后第38天添加100nM的9-顺式视黄酸和60nM的T3到悬浮培养结束，培养到悬浮培养开始后第74天。
[0848] 将在以上的条件下培养的包含视网膜组织的细胞聚集体利用荧光显微镜(Biorevo BZ-9000，Keyence)观察时，与-T3组的视网膜组织相比，敲入的CRX::Venus显现的绿色荧光在+T3组的视网膜组织中确认到更多(图3a，b)。进一步，与+T3组的视网膜组织相比，敲入的CRX::Venus显现的绿色荧光在+T3+BMP组的视网膜组织中确认到更加多(图
3c)。
3c)。
[0849] 根据这些可知，甲状腺激素信号转导途径作用物质有使视网膜组织中的视细胞前体细胞与9-顺式视黄酸的有无无关地增加的作用。进一步，可知与甲状腺激素信号转导途径作用物质单独发挥作用的情况相比，在甲状腺激素信号转导途径作用物质和背侧化信号转导物质组合作用的情况下，有使视细胞前体细胞与9-顺式视黄酸的有无无关地进一步增加的作用。
[0850] 实施例4
[0851] 实施例4示出的包含视网膜组织的细胞聚集体通过在实施例1记载方法中，分别以下述的方式加入T3或背侧化信号转导物质(BMP4)而制备。
[0852] [1]-T3组(图4a，图4e，图4i)；使用实施例1中记载的培养液，不添加任何地培养到悬浮培养开始后第75天。
[0853] [2]+T3组(图4b，图4f，图4j)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第38天到悬浮培养结束进一步添加60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第71天。
[0854] [3]+T3+BMP组(图4c，图4g，图4k)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天，第38天到悬浮培养结束进一步分别添加0.15nM的BMP4和60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第71天。
[0855] [4]+T3+环巴胺-KAAD组(图4d，图4h，图41)；使用实施例1中记载的培养液从悬浮培养开始后第22天，第38天到悬浮培养结束进一步分别添加500nM的环巴胺-KAAD和60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第71天。
[0856] 将利用以上条件培养的包含视网膜组织的细胞聚集体进行利用4％多聚甲醛固定后制备的冷冻切片，进行了使用CRX，TRβ2(TRb2)抗体的免疫染色，或将细胞核染色的DAPI染色。使用荧光显微镜进行观察的结果，与-T3组的视网膜组织相比，在+T3组的视网膜组织中确认到更多为视细胞前体细胞的CRX阳性细胞(图4a，b)。另外，对异位性CRX阳性细胞而言，与-T3组的视网膜组织相比，在+T3组的视网膜组织中，除了在胎儿期的视网膜组织中原本有视细胞前体细胞存在的顶端面(视细胞层，外核层)及成神经细胞层以外的区域，即从神经视网膜祖细胞层跨神经节细胞层的区域(成神经细胞层的基膜侧的区域)中也存在，以与原本有视细胞前体细胞存在的顶端面(视细胞层，外核层)及成神经细胞层为同程度的比例，确认到了异位性CRX阳性细胞(图4a，b)。
[0857] 进一步，在+T3+BMP4组及+T3+环巴胺-KAAD组的视网膜组织中，与+T3组的视网膜组织同样地确认到许多异位性CRX阳性细胞的基础上，整体而言确认到更加多的CRX阳性细胞(图4b，c，d)。
[0858] 根据这些可知，与实施例2，3中所示的同样，甲状腺激素信号转导途径作用物质有使悬浮培养开始后第70天前后的视网膜组织的视细胞前体细胞增加的作用。另外，可知与甲状腺激素信号转导途径作用物质单独发挥作用的情况相比，在甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质组合作用的情况下，可以使视细胞前体细胞进一步增加。进一步，可知在从神经视网膜祖细胞层跨神经节细胞层的区域中，也异位性地出现由于甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质的组合而增加的视细胞前体细胞。
[0859] 另外，在任一条件下培养的视网膜组织中，此时的CRX阳性细胞中均包含了表达TRβ2的细胞，即视锥细胞前体细胞(图4i，j，k，1)。对这些在发育早期出现的视锥细胞前体细胞而言，与视细胞前体细胞同样地，与-T3组的视网膜组织相比，在+T3组的视网膜组织中确认到更多(图4i，j)。另外，与视细胞前体细胞同样地，在-T3组的视网膜组织中，在从神经视网膜祖细胞层跨神经节细胞层的区域中几乎没有确认到在发育早期出现的视锥细胞前体细胞，但在+T3组的视网膜组织中，在从神经视网膜祖细胞层跨神经节细胞层的区域确认到许多异位性在发育早期出现的视锥细胞前体细胞(图4i，j)。另一方面，在+T3+BMP4组及+T3+环巴胺-KAAD组的视网膜组织中，显示了与+T3组的视网膜组织相同的倾向的基础上，整体而言确认到更加多的在发育早期出现的视锥细胞前体细胞(图4j，k，l)。
[0860] 根据这些可知，T3等甲状腺激素信号转导途径作用物质有使悬浮培养开始后第70天前后的视网膜组织的在发育早期出现的视锥细胞前体细胞增加的作用。另外，可知与甲状腺激素信号转导途径作用物质单独发挥作用的情况相比，在甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质组合作用的情况下，有使更加多的在发育早期出现的视锥细胞前体细胞增加的作用。进一步，可知在从神经视网膜祖细胞层跨神经节细胞层的区域中，也异位性地出现由于甲状腺激素信号转导途径作用物质，或甲状腺激素信号转导途径作用物质和背侧化信号转导物质的组合而增加的在发育早期出现的视锥细胞前体细胞。
[0861] 实施例5
[0862] 实施例5示出的包含视网膜组织的细胞聚集体通过在实施例1记载方法中，分别以下述的方式加入T3或背侧化信号转导物质而制备。
[0863] [1]-T3组(图5a，图5g，图5m)；使用实施例1中记载的培养液，不添加任何地培养到悬浮培养开始后第191天。
[0864] [2]+T3组(图5b，图5h，图5n)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第38天到第130天进一步添加60nM的T3，之后培养到悬浮培养开始后第188天。从第130天到第
188天使用了实施例1所述的B培养基。
188天使用了实施例1所述的B培养基。
[0865] [3]+BMP组(图5c，图5i，图50)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天到第100天进一步添加0.15nM的BMP4，之后培养到悬浮培养开始后第191天。从第100天到第191天使用了实施例1所述的培养基[3]。
[0866] [4]+T3+BMP组(图5d，图5j，图5p)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天到第100天分别进一步添加0.15nM的BMP4，从悬浮培养开始后第38天第130天添加60nM的T3，之后培养到悬浮培养开始后第188天。从第130天到第188天使用了实施例1所述的培养基[3]。
[0867] [5]+环巴胺-KAAD组(图5e，图5k，图5q)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天到第100天进一步添加500nM的环巴胺-KAAD，之后培养到悬浮培养开始后第191天。从第100天到第191天使用了实施例1所述的培养基[3]。
[0868] [6]+T3+环巴胺-KAAD组(图5f，图51，图5r)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天到第100天分别进一步添加500nM的环巴胺-KAAD，从悬浮培养开始后第38天第130天添加60nM的T3，之后培养到悬浮培养开始后第188天。从第130天到第188天使用了实施例1所述的培养基[3]。
[0869] 将利用以上条件培养的包含视网膜组织的细胞聚集体利用4％多聚甲醛固定后制备冷冻切片，进行了使用PAX6抗体、CHX10抗体的免疫染色，或将细胞核染色的DAPI染色。需要说明的是，认为在生物体视网膜中，PAX6阳性/CHX10阳性细胞为神经视网膜祖细胞，PAX6强阳性/CHX10阴性细胞为神经节细胞，水平细胞，无长突细胞中的任一种细胞。另外，认为PAX6阴性/CHX10强阳性细胞为双极细胞。
[0870] 使用荧光显微镜进行观察，结果对在包含视网膜组织的细胞聚集体中包含的PAX6阳性/CHX10阳性细胞而言，在任一条件下都同样地被确认到，没有确认到明显的差异。在-T3组，+BMP组或+环巴胺-KAAD组，即在不添加T3的组中，在认为大概是包含神经节细胞层的内核层的基膜侧的区域确认到许多PAX6强阳性/CHX10阴性细胞(图5a，c，e)。另外，在认为是内核层的顶端面侧的区域中确认到许多PAX6阴性/CHX10强阳性细胞(图5g，i，k)。另一方面，在+T3组，+T3+BMP组或+T3+环巴胺-KAAD组，即添加了T3的组的视网膜组织中，与没有添加的组相比，PAX6强阳性/CHX10阴性细胞，PAX6阴性/CHX10强阳性细胞的比例均明显降低了(图5b，d，f，h，j，1)。
[0871] 根据这些可知，T3等甲状腺激素信号转导途径作用物质使PAX6强阳性/CHX10阴性细胞（神经节细胞、无长突细胞、水平细胞中的任一种细胞)及PAX6阴性/CHX10强阳性细胞(双极细胞)的比例明显降低。因此可知，作为包含视细胞前体细胞的移植用视网膜组织在再生医疗中有用。需要说明的是，在成熟到可见穆勒细胞的程度的悬浮培养开始后第188天～第191天这样的阶段中，在悬浮培养开始后约70天之时或约100天之时这样的阶段中确认到的BRN3阳性细胞，即神经节细胞死亡，几乎确认不到。一方面，在无长突细胞中表达的钙视网膜蛋白(Calretinin)阳性细胞，在水平细胞中表达的钙结合蛋白阳性细胞，LIM1阳性细胞等与PAX6强阳性/CHX10阴性细胞同样地，其比例发生了降低。
[0872] 实施例6
[0873] 实施例6示出的包含视网膜组织的细胞聚集体通过在实施例1记载方法中，分别以下述的方式加入T3或背侧化信号转导物质(BMP4或者环巴胺-KAAD)而制备。
[0874] [1]-T3组(图6a，图6e，图6i、图6m)；使用实施例1中记载的培养液，不添加任何地培养到悬浮培养开始后第191天。
[0875] [2]+T3组(图6b，图6f，图6j，图6n)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第38天到第130天进一步添加60nM的T3，之后培养到悬浮培养开始后第192天。从第130天到第192天使用了实施例1所述的培养基[3]。
[0876] [3]+T3+BMP组(图6c，图6g，图6k，图6o)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天到第100天分别进一步添加0.15nM的BMP4，从悬浮培养开始后第38天第130天添加60nM的T3，之后培养到悬浮培养开始后第188天。从第130天到第188天使用了实施例1所述的培养基[3]。
[0877] [4]+T3+环巴胺-KAAD组(图6d，图6h，图61，图6p)；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天到第100天分别进一步添加500nM的环巴胺-KAAD，从悬浮培养开始后第38天到第130天添加60nM的T3，之后培养到悬浮培养开始后第193天。从第130天到第193天使用了实施例1所述的培养基[3]。
[0878] 将利用以上条件培养的包含视网膜组织的细胞聚集体利用4％多聚甲醛固定后制备冷冻切片。对制备的冷冻切片使用GFP抗体，NRL抗体，RXR-γ(RXRg)抗体进行免疫染色，或将细胞核染色的DAPI染色。GFP阳性细胞为表达在CRX基因位点中敲入的荧光蛋白质Venus的视细胞前体细胞。另外，一般而言认为NRL阳性细胞为视杆细胞(或视杆细胞前体细胞)，RXR-γ阳性细胞在视细胞(或视细胞前体细胞)中为视锥细胞(或视锥细胞前细胞)。使用荧光显微镜进行观察，结果与-T3组相比，在+T3组，+T3+BMP组，+T3+环巴胺-KAAD组中，在视网膜组织中包含的细胞中，视细胞前体细胞的比例都是明显升高了(图6a，b，c，d)。另一方面，在-T3组的外核层(视细胞前体细胞的核集聚的层)的基膜侧中，存在许多认为不是视细胞前体细胞的细胞，即实施例5所述的PAX6强阳性/CHX10阴性细胞等的细胞的细胞核，但在+T3组，+T3+BMP组，+T3+环巴胺-KAAD组中，都为这样的细胞明显减少，在该区域中存在的细胞被置换为了异位性视细胞前体细胞(图6a，b，c，d，m，n，o，p)。进一步，与-T3组相比，在+T3组，+T3+BMP组，+T3+环巴胺-KAAD组中，都为在CRX::Venus阳性的视细胞前体细胞中，RXR-γ阳性且NRL阴性的视锥细胞前体细胞增加了(图6a，b，c，d，e，f，g，h，i，j，k，1)。
[0879] 实施例7
[0880] 使用图像分析软件(ImageJ)测定了利用实施例4记载的方法制作的视网膜组织中包含的CRX阳性细胞数及，CRX阳性细胞中的TRβ2阳性细胞数，示出结果(图7)。另外，作为对照组也制备了在+BMP4组，+环巴胺-KAAD组等仅添加了背侧化信号转导物质，没有添加60nM的T3时的包含视网膜组织的细胞聚集体，同样地进行了测定。测定的结果，在对照组中没有加入T3的组中有约10.6％为CRX阳性细胞，与此相对，在+BMP4组，+环巴胺-KAAD组中，分别有17.0％，14.1％为CRX阳性细胞。与此相对，在对照组中在加入T3的组中有22.8％，在将T3和背侧化信号转导物质组合的组，即除了T3以外添加了BMP4的组，除了T3以外添加了环巴胺-KAAD的组中，分别有29.1％，30.7％为CRX阳性细胞。另外，在对照组中没有加入T3的组中有约6.8％为CRX阳性且TRβ2阳性细胞，与此相对，在+BMP4组，+环巴胺-KAAD组中，分别有10.8％，8.1％为CRX阳性且TRβ2阳性细胞。与此相对，在+T3组中有11.3％，在T3和背侧化信号转导物质组合组，即除了T3以外添加了BMP4的组，在除了T3以外添加了环巴胺-KAAD的组中，分别有16.0％，15.0％为CRX阳性且TRβ2阳性细胞。
[0881] 实施例8
[0882] 使用图像分析软件(ImageJ)测定了利用实施例5记载的方法制作的视网膜组织中包含的PAX6阴性/CHX10强阳性细胞(双极细胞)或PAX6强阳性/CHX10阴性细胞(神经节细胞、无长突细胞、水平细胞中的任一种细胞)，示出结果(图8)。在对照组，+BMP组或+环巴胺-KAAD组中且没有添加T3的组中，分别有8.03％，15.49％，8.65％为PAX6阴性/CHX10强阳性细胞。与此相对，在+T3组中有4.29％，在T3和背侧化信号转导物质组合的组，即+T3+BMP4组，+T3+环巴胺-KAAD组中，分别有8.50％，4.38％为PAX6阴性/CHX10强阳性细胞。另一方面，在对照组，+BMP组或+环巴胺-KAAD组中且没有添加T3的组中，分别有32.54％，24.60％，24.50％为PAX6强阳性/CHX10阴性细胞。与此相对，在+T3组中有13.83％，在T3和背侧化信号转导物质组合的组，即+T3+BMP4组，+T3+环巴胺-KAAD组中，分别有9.78％，8.65％为PAX6强阳性/CHX10阴性细胞。
[0883] 实施例9
[0884] 使用图像分析软件(ImageJ)测定了利用实施例6记载的方法制作的视网膜组织中包含的CRX::Venus阳性细胞(视细胞前体细胞)，CRX::Venus阳性细胞中的RXR-γ阳性细胞且NRL阴性细胞(视锥细胞前体细胞)或CRX::Venus阳性细胞中的NRL阳性细胞(视杆细胞前体细胞)，示出结果(图9)。另外，作为对照组也制备了在+BMP4组，+环巴胺-KAAD组等没有添加60nM的T3时的包含视网膜组织的细胞聚集体，同样地进行了测定。测定的结果，在对照组，+BMP组或+环巴胺-KAAD组中且没有添加T3的组中，分别有35.5％，37.7％，41.7％为CRX阳性细胞。与此相对，在+T3组中有53.4％，在T3和背侧化信号转导物质组合的组，即+T3+BMP4组，+T3+环巴胺-KAAD组中，分别有57.9％，66.6％为CRX阳性细胞。另一方面，在对照组，+BMP组或+环巴胺-KAAD组中且没有添加T3的组中，分别有22.7％，31.3％，30.2％为CRX阳性细胞中的RXR-γ阳性细胞且NRL阴性细胞。与此相对，在+T3组中有44.1％，在T3和背侧化信号转导物质组合的组，即+T3+BMP4组，+T3+环巴胺-KAAD组中，分别有54.2％，57.5％为CRX阳性细胞中的RXR-γ阳性细胞且NRL阴性细胞。进一步，在对照组，+BMP组或+环巴胺-KAAD组中且没有添加T3的组中，分别有12.8％，6.1％，11.5％为CRX阳性细胞中的NRL阳性细胞。与此相对，在+T3组中有9.4％，在T3和背侧化信号转导物质组合的组，即+T3+BMP4组，+T3+环巴胺-KAAD组中，分别有3.7％，9.1％为CRX阳性细胞中的NRL阳性细胞。
[0885] 实施例10
[0886] 实施例10示出的包含视网膜组织的细胞聚集体通过在实施例1记载方法中，分别以下述的方式加入T3或背侧化信号转导物质而制备。
[0887] [1]-T3组；使用实施例1中记载的培养液，不添加任何地培养到悬浮培养开始后第100～105天。
[0888] [2]+T3组；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第38天添加60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第100～105天。
[0889] [3]+T3+BMP组；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天到第100天添加0.15nM的BMP4，进一步从悬浮培养开始后第38天到培养完毕添加60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第100～105天。
[0890] [4]+T3环巴胺-KAAD组；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天到第100天添加500nM的环巴胺-KAAD，进一步从悬浮培养开始后第38天到培养完毕添加60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第100～105天。
[0891] 将利用以上条件培养的包含视网膜组织的细胞聚集体利用4％多聚甲醛固定后制备冷冻切片，进行使用抗CRX抗体、Ki67抗体的免疫染色，或将细胞核染色的DAPI染色，将使用荧光显微镜观察的结果示于图中(图10，左)。观察的结果可知，与-T3组的视网膜组织相比，视细胞前体细胞的CRX阳性细胞在+T3组的视网膜组织中明显增加了。特别是，与-T3组相比，在顶端面存在的视细胞前体细胞层的厚度在+T3组中为约2、3倍的厚度。另外，这些结果在+T3+BMP4组，+T3+环巴胺-KAAD组中也相同。另外，在悬浮培养开始后100天前后的阶段的神经视网膜组织中也确认到了存在为Ki67阳性的增殖性的神经视网膜祖细胞的层，即成神经细胞层。与-T3组的视网膜组织相比，在+T3组的视网膜组织中，除了在胎儿期的视网膜组织中原本有视细胞前体细胞存在的顶端面(视细胞层，外核层)以外，即在有Ki67阳性的神经视网膜祖细胞存在的成神经细胞层、所述成神经细胞层的基膜侧的神经节细胞层中也可确认到许多异位性视细胞前体细胞，可知包含异位性视细胞前体细胞。另外，这样的结果在+T3+环巴胺-KAAD组中也相同。另一方面，虽然在+T3+BMP4组中也确认到，但在+T3+BMP4组中没有确认到+T3组、+T3+环巴胺-KAAD组程度的这样的异位性视细胞前体细胞，启示在该分化阶段中，视细胞前体细胞的出现变得少于+T3组、+T3+环巴胺-KAAD。
[0892] 接下来，将使用图像分析软件(ImageJ)测定了利用同样的条件制备的神经视网膜组织内包含的CRX阳性细胞的比例的结果示于图中(图10、右)。其结果可知，在-T3组，+T3组，+T3+BMP4组，及+T3+环巴胺-KAAD组的神经视网膜组织中包含的CRX阳性细胞的比例分别为17.1％，30.0％，42.9％，及50.1％，CRX阳性细胞的包含比例以-T3组，+T3组，+T3+BMP4组，+T3+环巴胺-KAAD组的顺序提高。
[0893] 根据这些可知，甲状腺激素信号转导途径作用物质有使悬浮培养开始后第100天前后的视网膜组织视细胞前体细胞增加的作用。另外，可知与甲状腺激素信号转导途径作用物质单独发挥作用的情况相比，在甲状腺激素信号转导途径作用物质及背侧化信号转导物质组合作用的情况下，可以使视细胞前体细胞进一步增加。
[0894] 将这些实施例的结果综合考虑，则可知甲状腺激素信号转导途径作用物质使不需要的细胞的比例明显降低的基础上，使外核层的基膜侧也出现异位性视细胞前体细胞，进一步将视细胞前体细胞的比例明显提高。即，可知利用甲状腺激素信号转导途径作用物质，可制备作为再生医疗中使用的医药品有用的移植用视网膜组织。
[0895] 另外，可知在与背侧化信号转导物质组合而使甲状腺激素信号转导途径作用物质发挥作用的情况下，同样地使不需要的细胞的比例明显降低，将视细胞前体细胞的比例明显提高的基础上，将视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的包含比例进一步提高。可知特别是在背侧化信号转导物质为BMP4的情况下，可制备视细胞前体细胞中几乎不存在视杆，而视锥的比例特别高的区域。另外，可知在背侧化信号转导物质为SHH信号转导途径抑制物质的环巴胺-KAAD的情况下，与背侧化信号转导物质为BMP4的情况相比，可制备认为是移植时不需要的细胞的双极细胞的比例不提高，而视锥的比例高的视网膜组织。即，可知在与背侧化信号转导物质组合而使甲状腺激素信号转导途径作用物质发挥作用的情况下，可制备作为移植到黄斑部，或黄斑部的中央部的移植用视网膜组织有用的药品组合物。
[0896] 实施例11
[0897] 通过在实施例1，4，5，6，10记载的方法中，分别以下述的方式加入T3或背侧化信号转导物质而制备细胞聚集体。结果示于图11。需要说明的是，在图11中，+T3组表示添加了T3的组，+T3+BMP4组为除了T3以外，BMP4添加了的组，+T3+环巴胺-KAAD组为除了T3以外添加了环巴胺-KAAD的组，以使得T3为60nM，BMP4为0.15nM，环巴胺-KAAD为500nM的方式添加到培养基中。
[0898] [1]+T3组；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第38天添加60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第69天，第104天或第188天。需要说明的是，对T3而言，最长添加到悬浮培养开始后约第130天进行培养。
[0899] [2]+T3+BMP组；使用实施例1记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天起添加0.15nM的BMP4，进一步从悬浮培养开始后第38天起添加60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第69天，105天，或第188天～第192天。需要说明的是，对BMP4而言添加而培养到悬浮培养开始后约第100天，对T3而言到悬浮培养开始后约第130天。
[0900] [3]+T3+环巴胺-KAAD组；使用实施例1中记载的培养液，从悬浮培养开始后第22天添加500nM的环巴胺-KAAD，进一步从悬浮培养开始后第38天添加60nM的T3，培养到悬浮培养开始后第69天，第105天，或第188天。需要说明的是，对环巴胺-KAAD而言添加而培养到悬浮培养开始后约第100天，对T3而言到悬浮培养开始后约第130天。
[0901] 将利用以上条件培养的包含视网膜组织的细胞聚集体用荧光显微镜(Biorevo BZ-9000，Keyence)观察，获得图像。其结果可知，在细胞聚集体中具有空洞，形成了上皮结构。进一步，可知包含长轴方向的直径大而且超过2mm的(图11-1)。
[0902] 进一步，对同样进行而培养到悬浮培养开始后第188天的包含视网膜组织的细胞聚集体，利用4％多聚甲醛固定后制备冷冻切片，进行了使用抗GFP抗体的免疫染色，使用荧光显微镜进行观察(图11-2)。观察的结果可知，被抗GFP抗体染色的CRX::Venus阳性细胞，即，视细胞前体细胞在细胞聚集体的表面连续而有规律的排列。即，可知这些细胞聚集体在从悬浮培养起第188天中也不包含莲座样结构，为具有连续的上皮结构的视网膜组织。进一步根据该图可知，可确认到许多异位性视细胞前体细胞，不仅在顶端面附近的视细胞层(外核层)。
[0903] 进一步，对同样进行而培养到悬浮培养开始后第70天时，第100天时，第190天时的包含视网膜组织的细胞聚集体用荧光显微镜(Biorevo BZ-9000，Keyence)观察，获得图像。使用分析软件(Image J)对获得的图像测定了长轴的直径。绘出了使用测定的数据而将平均值(图11-3，左侧的图)及个别的包含视网膜组织的细胞聚集体的长轴的直径作图的图(图11-3，右侧的图)。分析了平均值的结果可知，任一阶段的包含视网膜组织的细胞聚集体中都以平均计为1.1mm以上的大小。另外，根据作图的图可知，1.0mm以上的包含视网膜组织的细胞聚集体有大半，也可容易地确认到1.5mm以上的包含视网膜组织的细胞聚集体。另外，可知在包含视网膜组织的细胞聚集体中，长轴的直径较大的那些达到3.0mm附近(2.93mm)。需要说明的是，作图的图内记载的数值表示各自的细胞聚集体的长轴的直径的大小。
[0904] 工业实用性
[0905] 利用本发明的制备方法，能够实现提供使神经视网膜组织中包含的视细胞前体细胞的比例增大，且将无长突细胞、神经节细胞等不需要的细胞的比例降低的适于移植的视网膜组织。另外，本发明的视网膜组织可用作药物组合物。
[0906] 本申请以在日本申请的日本特愿2017-177188(申请日：2017年9月14日)为基础，并将其内容全部包含于本说明书中。
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