视网膜干细胞
阅读：824发布：2020-05-11
专利汇可以提供视网膜干细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及从 视网膜 的终端缘或锯齿缘区域中分离的干细胞，用于分离所述干细胞的方法，以及它们在 治疗 影响眼睛的 疾病 和其它病理状态中的用途。，下面是视网膜干细胞专利的具体信息内容。
1.一种分离的视网膜干细胞，其中，所述分离的视网膜干细胞分离自出生后的哺乳动物视网膜的终端缘区域和/或锯齿缘区域。
2.根据权利要求1所述的分离的视网膜干细胞，分离自包括所述终端缘区域和/或所述锯齿缘区域的视网膜区域；优选地，由所述终端缘区域和/或所述锯齿缘区域构成；更优选地，基本上由所述终端缘区域和/或所述锯齿缘区域构成；最优选地，仅由所述终端缘区域和/或所述锯齿缘区域构成，并且不是分离自视网膜的其它区域。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的分离的视网膜干细胞，所述分离的视网膜干细胞为未分化的和多能的；优选地，所述分离的视网膜干细胞是多能的并且能分化成所有不同类型的神经视网膜细胞。
4.一种用于从出生后的哺乳动物中分离视网膜干细胞的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)从受试者的眼睛中解离出全部或部分的终端缘和/或锯齿缘，
(b)在培养基中培养所解离出的终端缘和/或锯齿缘，导致包含视网膜干细胞的细胞球和/或小细胞群(簇)的形成，
(c)将所得到的细胞球和/或细胞簇置于含胰蛋白酶和透明质酸酶的培养基中，(d)用一种或多种抑制剂阻断上述酶，和
(e)从所得到的细胞球和/或细胞簇中分离得到的视网膜干细胞。
5.一种使用如权利要求4所定义的方法获得的分离的视网膜干细胞。
6.一种药物组合物，包含：
如权利要求1～3中任一项所定义的分离的视网膜干细胞或通过如权利要求4所定义的方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代；及
至少一种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，用于注射到玻璃体中。
8.如权利要求1～3中任一项所定义的分离的视网膜干细胞或使用如权利要求4所定义的方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代，用作药物。
9.如权利要求1～3中任一项所定义的分离的视网膜干细胞或使用如权利要求4所定义的方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代，用于治疗眼睛病理状态或疾病。
10.根据权利要求9所述的用于所述用途的分离的视网膜干细胞，其中，待治疗的眼睛病理状态或疾病包括色素性视网膜炎、黄斑病变、糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变和视网膜营养性萎缩中的一种或多种。
视网膜干细胞
技术领域
背景技术
[0002] 视网膜或眼睛的疾病或损伤可能引起视力丧失。例如，感染过程如巨细胞病毒感染视网膜可导致视野丧失、视力下降和失明。炎症过程如葡萄膜炎也可影响视网膜，并可导致视力下降。视网膜的癌症，例如视网膜母细胞瘤，也会使视力恶化。其它疾病可能是由于与年龄相关的黄斑病变造成的。许多不同的遗传疾病，如色素性视网膜炎，导致视网膜损伤和失明以及其它类型的视网膜退行性病变(视网膜营养性萎缩)。视网膜的物理损伤也可能是由视网膜脱落引起的，导致视网膜退行性病变和失明。
[0003] 可用于治疗由视网膜损伤引起的视力丧失的疗法仍然有限。
[0004] 上述疗法通常需要进行外科手术和/或组织移植，从而使受影响的受试者暴露于不良反应的风险中，这在组织移植的情况中可包括对异物产生反应和对移植物发生排斥的风险。此外，许多可用的疗法不是治愈或矫正潜在的疾病，而是简单地治疗或掩盖这些疾病的症状。因此仍然需要新疗法来治疗影响眼睛的疾病和其它病理状态，并且特别需要能够有效且永久矫正这些疾病或病理状态的疗法。也需要能够最大限度减少不良反应发生率的疗法。
[0005] 终端缘(ora terminalis)和锯齿缘(ora serrata)尽管紧密相连，但它们是视网膜的不同部分，参见图1。“锯齿缘”(“锯齿状(serrata)”来自拉丁语，意思是“封闭的(closed)”)是功能性视网膜和终端缘(“终端(terminalis)”来自拉丁语，意思是“末端部分”)之间的连接。终端缘是视网膜最偏离中心的边缘(Holden等人，Retinal Magnification Factor at the Ora Terminalis:A Structural Study of Human and Animal Eyes,Vision Res.27:1229-1235,1987)；终端缘排列在锯齿缘的前面且在睫状体平坦部(pars plana)的后面，其是葡萄膜的一部分。终端缘和锯齿缘是成人神经视网膜的生发部分，并且是用于覆盖整个推定神经视网膜的胚胎神经上皮生发层的幸存的残留物。
[0006] 鱼类、两栖类和鸟类的终端缘和锯齿缘是各出版物中描述的增殖区。在鱼类和两栖类动物中，神经发生在胚胎期之后并不停止，而是在动物的整个生命过程中继续活动。例如，Amato等人，Retinal stem cells in vertebrates:parallels and divergences,Int.T.Dev.Biol.48:993-1001,2004)；Cerveny等人，Continued Growth and Circuit Building in the Anamniote Visual System,Develop.Neurobiol.72:328-345,2012)中已经描述了从鱼类或两栖类动物的终端缘中分离的干细胞和从鸟类的锯齿缘中分离的干细胞。
[0007] 在放大研究的背景下，还在哺乳动物和鸟类物种中广泛研究了在邻近终端缘的视网膜区边缘处的区域。取人的锯齿缘和猿、猫、鸽子、奶牛和猪的终端缘的解剖学测量值，分别作为计算锯齿缘和终端缘的放大因子的基础。在人和猿的眼睛中，已经发现在视网膜区的极外围区域的放大远远小于后极部；在猫、兔、大鼠和小鼠中，有较低的下降；在鸽子、灰林鸮和椋鸟中，放大与极外围区域和后极部处的非常相似(Holden等人，Retinal Magnification Factor at the Ora Terminalis:A Structural Study of Human and Animal Eyes,Vision Res.27:1229-1235,1987)。
[0008] 已知成年哺乳动物的视网膜中存在视网膜干细胞；具体而言，已经在视网膜色素上皮细胞的睫状缘(参见US 6,117,675和Coles等人，PNAS 101(44):15772-15777,2004)和神经视网膜层(参见WO 01/58460)中发现了视网膜干细胞。
[0009] 但是，还从未描述过从成年哺乳动物的终端缘和锯齿缘中分离出干细胞。
发明内容
[0010] 目前使用视网膜干细胞的治疗不足以在视网膜细胞受损时恢复丧失的视力，因此视网膜干细胞的潜在临床应用仍然非常高。
[0011] 在解剖学上，使用在功能性视网膜中更深入地分离的细胞作为干细胞来源的可能性较低。
[0012] 令人惊讶地是，本申请人已经从成年哺乳动物的视网膜的终端缘和锯齿缘区域中分离出了视网膜干细胞。本申请人分离出的干细胞能够产生用于成年哺乳动物的整个生命过程的多能细胞，并且是功能性视网膜的预传代。
[0013] 根据本发明的终端缘视网膜干细胞(OTRSC)和锯齿缘视网膜干细胞(OSRSC)能够以类似于在树(其通过围绕其树干圆周的成层的圆环状细胞来生长)中发生的方式，在神经视网膜干细胞中生长和生发。所述OTRSC和OSRSC能够经受视网膜细胞的更换，以及在健康成年人和患视网膜疾病的人类中的再生长。
[0014] 前述US 6,117,675和Coles等人(2004)描述了从哺乳动物视网膜的睫状缘区域(即距离终端缘和锯齿缘非常远的区域)中分离的视网膜干细胞；此外，其中描述的视网膜细胞是祖细胞，因此是单能的并且只能产生生成单一类型分化的神经视网膜细胞的后代。
[0016] 相比之下，本发明描述的视网膜干细胞分离自解剖学上清楚的区域，即分别分离自成年哺乳动物视网膜的终端缘和锯齿缘区域，并且是多能的。
[0017] 因此，本发明的第一目的是一种分离的视网膜干细胞，其中所述视网膜干细胞分离自出生后的哺乳动物视网膜的终端缘和/或锯齿缘区域。
[0018] 本发明的第二目的是一种用于从出生后的哺乳动物中分离视网膜干细胞的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
[0019] (a)从受试者的眼睛中解离出全部或部分的终端缘和/或锯齿缘，
[0020] (b)在培养基中培养所解离出的终端缘和/或锯齿缘，导致包含视网膜干细胞的细胞球和/或小细胞群(簇)的形成，
[0021] (c)将所得到的细胞球和/或细胞簇置于含胰蛋白酶和透明质酸酶的培养基中，[0022] (d)用一种或多种抑制剂阻断上述酶，和
[0023] (e)从所得到的细胞球和/或细胞簇中分离得到的视网膜干细胞。
[0024] 本发明的第三目的是一种使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞。
[0025] 本发明的第四目的是一种药物组合物，其包含：
[0026] -如上定义的或使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代，和[0027] -至少一种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
[0028] 本发明的第五目的是如上定义的分离的视网膜干细胞或使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代，用作药物。
[0029] 本发明的第六目的是上述定义的分离的视网膜干细胞或使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代，用于治疗眼睛病理状态或疾病。
[0030] 本发明的第七目的是上述定义的分离的视网膜干细胞或使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代，在生产用于治疗眼睛病理状态或疾病的药剂中的用途。
[0031] 本发明的第八目的是一种用于治疗受试者的眼睛病理状态或疾病的方法，该方法包括以下步骤：向需要所述治疗的所述受试者给药有效量的如上定义的分离的视网膜干细胞或利用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代。
[0032] 定义
[0033] 从终端缘(ora terminalis)分离的视网膜干细胞在本文中被称为“终端缘视网膜干细胞”或“OTRSC”。
[0034] 所述OTRSC分离自从出生后生命的第一阶段开始，并持续到，有时超过，八十多年生命这一段时期的哺乳动物的眼睛中。
[0035] 从锯齿缘(ora serrata)分离的视网膜干细胞在本文中被称为“锯齿缘视网膜干细胞”或“OSRSC”。所述OSRSC分离自从出生后生命的第一阶段开始，并持续到，有时超过，八十多年生命这一段时期的哺乳动物的眼睛中。
[0036] 如本文所用，术语“分离(isolate)”是指这些细胞从它们的天然组织或它们的环境中的物理分离或选择。同样，术语“分离(isolating)”通常是指例如根据细胞的特征或根据一种或多种细胞或生物标志物的表达，从一群细胞(例如神经球)中物理分离或选择出一种或多种细胞。
[0037] 如本文所用，术语“哺乳动物”是指哺乳动物类的任何成员：人，非人的灵长类动物如黑猩猩和其它猿种；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪；宠物，如兔子、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。
[0038] 如本文所用，术语“未分化的”是指尚未分化或发育成一类特化细胞的细胞；干细胞是未分化的。未分化的干细胞保持分化成一种或多种类型特化细胞(例如神经视网膜的细胞)的能力。
[0039] 如本文所用，术语“多能(的)”或“多潜能(的)”是指能够产生一后代的细胞，该后代生成它们所定位的组织的每种主要类型的分化细胞。成人干细胞是多能的，并且能够只产生功能衍生物。例如，成年视网膜干细胞是多能的，因此能够分化成一种或多种特化的神经视网膜细胞(例如无长突细胞，水平/撤光型(off)双极细胞，感光杆状细胞，杆状细胞的外盘蛋白质，米勒(Muller)星形胶质细胞/神经胶质，RPE，色素细胞，未分化的和米勒(Mueller)神经胶质细胞，RPC和无长突细胞，RPC和双极杆细胞)。
[0040] 如本文所用，术语“单能(的)”是指仅能产生一种类型的细胞并且也被称为前体细胞的细胞。
[0041] 如本文所用的，术语“后代”是指衍生自多能干细胞的特化细胞。
[0042] 在确定了受试者患有可受益于使用下述化合物治疗的疾病或有害病症之后，可将治疗有效量的根据本发明第一目的的分离的视网膜干细胞给药予受试者。医学或临床人员可以将上述“确定”作为诊断受试者中疾病或病理状态的一部分。所述化合物还可以用于预防这些病症，其可被看做降低受试者患一种或多种病症的可能性。
[0043] 如本文所用，“治疗有效量”是指足以实现预期目的的量。在实现预期效果的基础上，确定有效量在所述领域专家的技能范围之内。有效量取决于以下因素，包括但不限于受试者的尺寸，和/或影响受试者的疾病或有害病症进展的程度。有效量还取决于化合物以单剂量或者随着时间周期性地给药予受试者的事实。根据本发明第一目的的分离的视网膜干细胞经设计用于治疗受试者。如本文所用，术语“受试者”包括哺乳动物和非哺乳动物。
[0044] 哺乳动物的例子包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人、非人的灵长类动物如黑猩猩和其它猿种；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪；宠物，如兔子、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟类、鱼类等。如本文所理解的，所述受试者可处于从出生后第一阶段到超过八十多年生命的一段时间。
[0045] 如本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“经治疗的(treated)”包括治愈或消除病理学障碍以获得治疗益处，其中治疗益处理解为根除或改善待治疗的潜在障碍。此外，通过根除或改善与潜在障碍相关的一种或多种生理症状来达到治疗益处，以便尽管患者仍可能受到潜在障碍的影响，但可观察到患者的改善。
[0047] 除非另有明确说明，否则在说明书和权利要求书中使用的冠词“一(a)”和“一(an)”必须理解为包括复数引用。除非另有说明或者从上下文中可以得出，否则如果一组中的一个、多于一个或所有成员存在于、用于给定产品或过程中，或以其它方式与给定产品或过程相关联，则认为满足包括该组中的一个或多个成员“或”在该组中的一个或多个成员之间的权利要求书或说明书。本发明包括这样的实施方式，其中该组中恰有一个成员存在于、用于给定产品或方法中，或以其它方式与给定产品或方法相关联。本发明还包括这样的实施方式，其中该组中多于一个或全部成员存在于、用于给定产品或方法中，或以其它方式与给定产品或过程相关联。此外，应该理解的是，除非另有说明，或者对于在本领域具有普通经验的人员来说可能由此产生矛盾或不一致情况是显而易见的，否则本发明包括所有的变化、组合和排列，其中将一项或多项所列权利要求中的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等引入到同类权利要求的另一从属权利要求中(或相关的，任何其它权利要求)。当要素以列表的形式(以马库什组或者类似的格式)表示时，应该理解的是，该要素的子组也进行了描述，并且可以从该组中去除任一要素或多个要素。还应该理解的是，通常当将本发明或本发明的各方面描述为包括特定要素、特征等时，本发明或其各方面的某些实施方式由或基本上由所述要素、特征等组成。为了简单起见，在每种情况下没有具体指出这些实施方式。人们也可以理解，本发明的任何实施方式或方面可以被明确地从权利要求书中排除掉，而不管在说明书中是否指明特定排除这一事实。附图说明
[0048] 图1是眼睛的矢状图的详细视图，其清楚地示出了锯齿缘、终端缘和视网膜睫状缘的相应位置。
具体实施方式
[0049] 本发明提供了以下事实的证据：眼睛的组织，特别是出生后哺乳动物视网膜的终端缘和锯齿缘区域的色素和非色素上皮层含有视网膜干细胞。
[0050] 本文所述的终端缘视网膜干细胞(OTRSC)和锯齿缘视网膜干细胞(OSRSC)是多能的，并且是从视网膜的解剖学上清楚的区域中分离出来的，因此可以与US 6,117,675和Coles等人(2004)中描述的从睫状缘区域(平坦部和睫状冠，葡萄膜部)分离的视网膜干细胞区分开，该从睫状缘区域分离的视网膜干细胞是祖细胞，因此是单能的。
[0051] 前述WO 01/58460描述了从哺乳动物神经视网膜组织的解剖学上不清楚的区域中分离的视网膜干细胞；在该专利申请中未提及从视网膜的终端缘和锯齿缘区域的分离。
[0052] 本发明的第一目的是一种分离的视网膜干细胞，其中，所述视网膜干细胞分离自出生后的哺乳动物视网膜的终端缘区域和/或锯齿缘区域。
[0053] 在根据本发明的第一目的的实施方式中，所述视网膜干细胞分离自包括所述终端缘区域和/或锯齿缘区域的视网膜区域；优选地，所述视网膜干细胞分离自由所述终端缘区域和/或锯齿缘区域构成的视网膜区域；更优选地，所述视网膜干细胞分离自基本上由所述终端缘区域和/或锯齿缘区域构成的视网膜区域；最优选地，所述视网膜干细胞分离自仅由所述终端缘区域和/或锯齿缘构成的视网膜区域，并且不是分离自视网膜的其它区域。
[0054] 如本文所用，表述“基本上”表示从中分离视网膜干细胞的视网膜区域的75％以上，优选80％以上，85％以上，90％以上，95％以上由终端缘和/或锯齿缘构成。
[0055] 如本文所用，表述“仅由”表示从中分离视网膜干细胞的视网膜区域的96％以上，优选99％以上由终端缘和/或锯齿缘构成。
[0056] 在根据本发明第一方面的实施方式中，所述OTRSC和/或OSRSC分离自色素或非色素上皮层；优选地，OTRSC和/或OSRSC分离自色素层。
[0057] 在根据本发明第一目的的另一实施方式中，所分离的OTRSC和/或所述OSRSC是神经干细胞。
[0058] 在根据本发明的第一目的的实施方式中，所述OTRSC和/或OSRSC分离自受试者的任何生命周期期间，或者分离自在某些情况下从死亡的受试者中(例如，所述OTRSC和/或OSRSC在受试者死亡后约一小时、二小时、三小时、四小时、六小时、八小时、十二小时、二十四小时、三十六小时、四十八小时或七十二小时内分离)。优选地，所述受试者是人类受试者。
[0059] 优选地，所述OTRSC和/或OSRSC分离自从出生后早期阶段，并且持续到，在某些情况下持续到的八十多年生命这一段时期的人类受试者。
[0060] 在根据本发明第一目的的实施方式中，所述OTRSC和/或OSRSC是未分化的和多能的；优选地，所述OTRSC和/或OSRSC是多能的，并且能够分化成所有不同类型的神经视网膜细胞。
[0061] 在根据本发明第一目的的另一实施方式中，所述OTRSC和/或OSRSC不是祖细胞。在根据本发明第一目的的另一实施方式中，所述OTRSC和/或OSRSC不是单能的。
[0062] 本发明的第二主题是一种从出生后的哺乳动物中分离视网膜干细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0063] (a)从受试者的眼睛中解离出全部或部分的终端缘和/或锯齿缘，
[0064] (b)在培养基中培养已经解离的所述终端缘和/或锯齿缘，导致包含视网膜干细胞的细胞球和/或细胞群(簇)的形成，
[0065] (c)将所得到的细胞球和/或所得到的细胞簇置于含胰蛋白酶和透明质酸酶的培养基中，
[0066] (d)用一种或多种抑制剂阻断上述酶，和
[0067] (e)从所述细胞球和/或所得到的细胞簇中分离所得到的视网膜干细胞。
[0068] 在根据本发明第二目的的实施式中，所述受试者是人类哺乳动物，例如供体或尸体。
[0069] 在根据本发明第二目的的另一实施方式中，所述培养基包含一种或多种外源性生长因子；在另一实施方式中，所述培养基不包含外源性生长因子。
[0070] 在根据本发明第二目的的实施方式中，通过使用常规手段(如移液)，以约1:500或至少1:500的频率，从相应的所得到的球体和/或从细胞簇中分离出OTRSC和/或OSRSC。
[0071] 本发明的第三目的是一种使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞。
[0072] 本发明的第四目的是一种药物组合物，该药物组合物包含：
[0073] -如上定义的或使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代；和[0074] -至少一种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
[0076] 在根据本发明第四目的的实施方式中，所述药物组合物可以通过吸入给药；在另一实施方式中，所述药物组合物利用玻璃体内注射来给药。
[0077] 在根据本发明第四目的的实施方式中，所述药物组合物是溶液或悬浮液，优选适用于眼内给药，更优选适用于玻璃体内给药；在玻璃体内给药的情况下，所述组合物可以包含平衡盐溶液或杜氏(Dulbecco)磷酸缓冲盐溶液。
[0078] 优选地，根据本发明的第四目的，所述药物组合物是含本发明的分离的细胞和/或其后代的水性组合物，其中本发明的分离的细胞和/或其后代以每0.5μl至少约10,000个细胞的浓度悬浮于平衡盐溶液中。
[0079] 优选地，根据本发明的第四目的，所述药物组合物经设计用于在玻璃体中注射。
[0080] 制备根据本发明的药物组合物的方法和对药学上可接受的载剂和/或赋形剂的选择，例如在L.William,Remington:The Science and Practice of Pharmacy.Twentieth 20 Edition,Mack Publishing Company.Easton,PA,(2000)中进行了详细的描述。
[0081] 本发明的第五目的是如上定义的分离的视网膜干细胞或者使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或它们的后代，用作药物。
[0082] 本发明的第六目的是如上定义的的分离的视网膜干细胞或者使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或它们的后代，用于治疗眼睛病理状态或疾病。
[0083] 本发明的第七目的在于如上定义的分离的视网膜干细胞或者使用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或它们的后代，在生产用于治疗眼睛病理状态或疾病的药剂中的用途。
[0084] 本发明的第八目的是一种用于治疗受试者的眼睛病理状态或疾病的方法，其包括以下步骤：向需要所述治疗的所述受试者给药有效量的如上定义的分离的视网膜干细胞或利用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或它们的后代。
[0085] 在根据本发明的第六、第七和第八个目的的实施方式中，待治疗的眼睛病理状态或疾病包括但不限于色素性视网膜炎、黄斑病变、糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变和视网膜营养性萎缩(retinal dystrophies)。
[0086] 在根据本发明第八目的的实施方式中，所述受试者是哺乳动物，优选人类，更优选人类青少年。
[0087] 在根据本发明第八目的的实施方式中，所述治疗方法包括以下步骤：通过注入玻璃体内，来给药根据本发明的分离的细胞或利用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或它们的后代。
[0088] 在根据本发明第八目的的实施方式中，所述治疗方法包括根据本发明的分离的细胞或利用上述方法获得的分离的视网膜干细胞，和/或其后代，在受试者中的自体移植；在本实施方式中，从受试者中分离出所述分离的细胞(OTRSC和/或OSRSC)，进行培养，然后移植或返回至同一受试者，从而最小化或消除对异物的不良反应的风险。
[0089] 或者，在根据本发明第八目的的另一个实施方式中，从供体(例如哺乳动物的尸体)中分离出所述OTRSC和/或OSRSC，随后(例如通过注射到玻璃体内)移植或给药予受试者以治疗眼睛病理状态或疾病。
[0090] 实验部分
[0091] 实施例1
[0092] 在本实验中，从人眼的终端缘中分离出视网膜干细胞。
[0093] 使用形成克隆球体的测定法来解离和培养终端缘，其中干细胞形成克隆性衍生的球体。
[0094] 应注意的是，干细胞仅分离自在解剖学上低于巩膜角膜边缘并且实际上位于终端缘内的组织中。这些细胞以大约1:500的频率分离出来。
[0095] 然后，将活检的组织放入含有胰蛋白酶和透明质酸酶的管子中，并在37℃的水浴中孵育15分钟。然后，利用抑制剂阻断上述酶，随后通过精密移液进行机械分离，分离成单个的视网膜干细胞。然后在血球计数室中对细胞进行计数，通过离心得到沉淀块，并重悬浮于Dulbecco磷酸(DPBS)缓冲盐溶液中，以达到每0.5μl约10,000个细胞的浓度。
[0096] 根据之前描述的相同的程序，从人眼的锯齿缘中分离出视网膜干细胞。
[0097] 实施例2
[0098] 在本实验中，评估了分离的终端缘视网膜干细胞(OTRSC)的体外增殖、长期自我更新和潜在的分化；使用了球体形成测定法和单层测定法。
[0099] 将从终端缘获得的单个的原代细胞以每孔一个细胞的密度铺在96孔板上，以便能够测试分离的OTRSC是否能够增殖以形成克隆性衍生的球体。OTRSC产生含有色素和非色素细胞的克隆球体。使用单球传代测定法，将原代球体解离并重新接种，各球体表现出自我更新的能力，每个单一球体在随后的每次传代中均产生一个或多个新球体。人眼睛的终端缘区域含有视网膜干细胞，证明其符合体外生长因子，其与从兔眼睛的终端缘分离出的视网膜干细胞的相似。
[0100] 将克隆球体在分化条件下铺板并评估它们后代的分化潜能。所述球体产生了所有不同的视网膜类型(例如感光细胞)，从而证明了分离出的OTRSC的多能性，该分离出的OTRSC通过来源于神经视网膜的生发区而被天然设计为转化成光感受器。
[0101] 通过遵循与上述相同的程序，研究了锯齿缘视网膜干细胞(OSRSC)的体外增殖、长期自我更新以及分化潜能。
[0102] 实施例3
[0103] 在本实验中，评估了分离出的OTRSC及其后代在体内的潜能。
[0104] 将含有OTRSC的解离的球形人视网膜细胞移植到成年兔的眼睛中。为了使OTRSC及其后代可视化以将它们移植到宿主兔的眼睛中，制备了含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒构建体。使用慢病毒颗粒感染OTRSC，其进而发育成绿色荧光球体。
[0105] 然后，将绿色荧光球体分离成单独的细胞，并以每1μl 20,000个细胞的浓度重新悬浮于平衡的Hank盐溶液中。随后，利用玻璃体内注射，以每0.5μl约10,000个细胞移植到成年兔眼睛的玻璃体腔中，其中成年兔先前已经用丙美卡因滴剂进行了局部麻醉。这些OTRSC通过使用颊给药的移液管来注射，经屏障修饰，以确保宿主兔子的OTRSC不被污染。然后将宿主兔子的眼睑重新放置在一起，被唤醒的动物返回它们的笼子中。移植后30天，处死兔子，摘除眼球并固定在4％PFA(膦酰甲酸)中；在Bright低温恒温器上将眼睛切成14μm的切片。然后在荧光显微镜下观察眼睛切片，以揭示EGFP阳性细胞，即OTRSC及其后代的存在。
[0106] 通过遵循与上述相同的程序，评估了分离的OSRSC及其后代的体内潜能。
[0107] 实施例4
[0108] 在本实验中评估了从猪和兔子的眼睛中分离的OTRSC在体外的分化潜能。
[0109] 如实施例1中所述分离出OTRSC，然后如实施例2中所述评估它们的分化潜能。
[0110] 从OTRSC球体中迁移出的一定百分比的细胞甚至在三周后仍然保持为未分化状态，而分化细胞大部分是感光细胞。
[0111] 上述实验证明，哺乳动物的终端缘和锯齿缘是以体外增殖、长期自我更新和分化潜能为特征的，真正的视网膜干细胞的沃源。
[0112] 前面的实验进一步证明，OTRSC、OSRSC和各自的后代能够在体外存活、迁移、整合和分化成神经视网膜的细胞，特别是分化成光感受器(即视杆细胞和视锥细胞)，因此支持了OTRSC和/或OSRSC在治疗眼睛疾病或病理状态中的有用性。
[0113] 此外，实施例2中描述的实验证明，在球体形成测定中，每个球体来源于单个细胞，这暗示睫状缘中的罕见的色素细胞是未分化的干细胞。球体中的大部分色素细胞是视网膜色素上皮细胞的祖细胞。
[0114] 人类神经视网膜显示了，它含有与从兔眼睛中分离的视网膜祖细胞类似的视网膜祖细胞，确保支持了成年哺乳动物的眼睛可含有在先衍生的视网膜干细胞的想法。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 视网膜假体 | 2020-05-11 | 339 |
| 用于视网膜光疗的系统和方法 | 2020-05-11 | 271 |
| 自供能电子视网膜 | 2020-05-13 | 598 |
| 视网膜辨识模块 | 2020-05-12 | 417 |
| 视网膜凹式渲染 | 2020-05-12 | 884 |
| 中心凹视网膜假体 | 2020-05-11 | 744 |
| 视网膜保护片 | 2020-05-12 | 303 |
| 视网膜假体 | 2020-05-11 | 920 |
| 人工视网膜系统及人工视网膜晶片 | 2020-05-12 | 243 |
| 人工视网膜系统 | 2020-05-11 | 418 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈