增强细胞、组织、器官和生物的存活力的方法、组合物和制造品
专利汇可以提供增强细胞、组织、器官和生物的存活力的方法、组合物和制造品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 氧 拮抗剂和其它活性化合物用于在体内细胞、组织和/或器官或在整个 生物 中诱导停滞或预停滞，以及用于增强它们的存活 力 的用途。本发明包括用于在任意这些 生物材料 中增强存活力和获得停滞或预停滞，以便保藏和/或保护它们的组合物、方法、制造品和仪器。在特定的实施方案中，还存在使用所述的活性化合物用于器官移植、高体温、 伤口愈合 、出血性休克、旁路外科手术的心麻痹、神经变性、低体温和癌症的 治疗 方法和仪器。，下面是增强细胞、组织、器官和生物的存活力的方法、组合物和制造品专利的具体信息内容。
1.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述生物 物质提供有效量的至少一种活性化合物。
2.权利要求1的方法，其中所述活性化合物是氧拮抗剂。
3.权利要求1的方法，其中将所述物质暴露于活性化合物。
4.权利要求1的方法，其中所述活性化合物是硫属化物。
5.权利要求1的方法，其中所述活性化合物具有式I或式IV的 化学结构。
6.权利要求5的方法，其中将所述物质暴露于式I或式IV的化 学结构的前体。
7.权利要求1的方法，其中给所述物质提供活性化合物的组合。
8.权利要求1的方法，其中在所述物质中的损伤、疾病发作或 进展、或出血之前、期间或之后，给所述物质提供所述活性化合物。
9.权利要求8的方法，其中所述损伤包括出血。
10.权利要求9的方法，其中所述损伤来自外部的物理源。
11.权利要求8的方法，其中在损伤之前或者在疾病的发作或进 展之前提供所述活性化合物。
12.权利要求8的方法，其中所述损伤或疾病与所述物质的代谢 或温度的降低相关。
13.权利要求12的方法，其中所述损伤是外科手术。
14.权利要求11的方法，其中在损伤或者疾病的发作或进展期 间或之后不提供所述活性化合物。
14.2.权利要求的方法，其中在疾病的进展期间提供所述活性化合 物。
14.3.权利要求14.2的方法，其中所述疾病是地中海贫血、镰状细 胞病或囊性纤维化。
15.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物， 该化合物的量和所述提供的持续时间足以减少CO2放出的至少25％。
16.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物， 该化合物的量和所述提供的持续时间不会引起该物质进入停滞。
17.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物， 该化合物的量和所述提供的持续时间保护该物质免于损害或死亡，其 中所述损害或死亡是由损伤或疾病的发作或进展引起的。
18.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物， 该化合物的量和所述提供的持续时间足以增加该物质在损伤或疾病的 发作或进展之后进入停滞的速率。
19.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物， 该化合物的量和所述提供的持续时间足以在损伤或疾病的发作或进展 之后防止CO2放出的进一步降低。
20.权利要求11的方法，其中给所述物质提供所述活性化合物， 该化合物的量和所述提供的持续时间足以引起该物质进入停滞。
21.权利要求1的方法，其中在低氧或缺氧条件下或在暴露于低 氧或缺氧条件之前，给所述物质提供所述活性化合物。
22.权利要求21的方法，其中在无所述活性化合物时，所述的 低氧或缺氧条件将损害所述物质。
22.4.权利要求22的方法，其中在暴露于低氧或缺氧条件期间，不 将所述物质暴露于所述活性化合物。
23.权利要求21的方法，其中给所述物质提供气体、半固态液 体、液体或固体形式的所述活性化合物。
24.权利要求23的方法，其中给所述物质提供至少一种气体形 式的所述活性化合物。
25.权利要求23的方法，其中给所述物质提供至少一种半固态 液体形式的所述活性化合物。
26.权利要求23的方法，其中给所述物质提供至少一种液体形 式的所述活性化合物。
27.权利要求26的方法，其中将所述活性化合物在所述液体中 起泡。
28.权利要求26的方法，其中将所述活性化合物溶解于所述液 体中。
29.权利要求1的方法，其中依次提供至少两种活性化合物。
30.权利要求1的方法，其中一起提供至少两种氧拮抗剂。
31.权利要求1的方法，其中将所述物质暴露于所述氧拮抗剂之 一持续约30秒至30天的一段时间。
32.权利要求7的方法，其中所述组合包括氧拮抗剂，该氧拮抗 剂具有选自以下组的至少一种的化学式：
a)具有式I的化合物；
b)具有式II的化合物；
c)具有式III的化合物；
d)具有式IV的化合物；
或其盐或前体。
33.权利要求32的方法，其中所述组合包含多于一种的来自相 同组的活性化合物。
34.权利要求32的方法，其中至少一种活性化合物来自组a)。
35.权利要求32的方法，其中至少一种活性化合物是硫属化物 或硫属化物盐。
36.权利要求35的方法，其中至少一种活性化合物包含硫。
37.权利要求35的方法，其中至少一种活性化合物包含硒。
38.权利要求35的方法，其中至少一种活性化合物是硫属化物 盐。
39.权利要求38的方法，其中所述硫属化物盐选自由Na2S、 NaHS、K2S、KHS、Rb2S、Cs2S、(NH4)2S、(NH4)HS、BeS、MgS、 CaS、SrS和BaS组成的组。
40.权利要求33的方法，其中所述组合包含多于一种来自组a) 的活性化合物。
41.权利要求40的方法，其中所述氧拮抗剂的组合包含CO2。
42.权利要求32的方法，其中至少一种活性化合物来自组b)。
43.权利要求42的方法，其中所述活性化合物具有式II(a)、式 II(b)或式II(c)的化学式。
44.权利要求32的方法，其中至少一种活性化合物来自组c)。
45.权利要求44的方法，其中所述活性化合物具有式III(a)、 式III(b)、式III(c)、式III(d)、式III(e)、式III(f)、式 III(g)或式III(h)的化学式。
46.权利要求1的方法，其中通过吸入、注射、导管插入、浸渍、 灌洗、灌注、局部应用、吸收、吸附或经口施用，给所述生物物质提 供所述活性化合物。
47.权利要求1的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜 内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、鞘 内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、瘤内、肌内、腹膜内、眼内、 皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、表面、 局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌 注、经由导管或经由灌洗施用至所述生物物质，给所述生物物质提供 所述活性化合物。
48.权利要求1的方法，该方法包括将所述生物物质暴露于受控 制的温度和/或压力环境。
49.权利要求48的方法，其中将所述生物物质暴露于受控制的 温度环境。
50.权利要求49的方法，其中所述生物物质达到非-生理学的核 心温度。
51.权利要求50的方法，其中将所述生物物质暴露于低于约20 ℃的受控制的温度环境。
52.权利要求49的方法，其中在提供一种或多种活性化合物之 前和/或同时，将所述生物物质暴露于受控制的温度环境。
53.权利要求1的方法，其中一种或多种活性化合物包含能将一 种或多种活性化合物靶向至线粒体的阳离子结构。
54.权利要求1的方法，其中所述生物物质要被保藏。
55.权利要求54的方法，其中所述生物物质包括血小板。
56.权利要求54的方法，其中所述生物物质要被移植。
57.权利要求1的方法，其中所述生物物质有缺血-再灌注损伤 的风险。
58.权利要求57的方法，其中在所述生物物质内诱导了心麻痹。
59.权利要求1的方法，其中所述生物物质是有出血性休克风险 的生物。
60.权利要求1的方法，该方法进一步包括鉴定需要处理的生物 物质。
61.权利要求1的方法，该方法进一步包括监测所述生物物质的 来自所述活性化合物的毒性。
62.权利要求1的方法，其中以药物组合物的形式将所述活性化 合物提供给所述生物物质。
63.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质 提供有效量的i)活性化合物或活性化合物的组合和ii)低氧条件。
64.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质 提供有效量的组合物，该组合物具有一种或多种具有式II的化合物、 或其盐或前体。
65.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质 提供有效量的组合物，该组合物具有一种或多种具有式III的化合物、 或其盐或前体。
66.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质 提供有效量的组合物，该组合物具有一种或多种具有式IV的化合物、 或其盐或前体。
67.用于增强生物物质的存活力的方法，该方法包括给所述物质 施用有效量的具有式I、式II、式III和/或式IV的化合物、或其盐或 前药。
68.用于防止或减少在不利条件下对生物物质的损害的方法，该 方法包括给所述生物物质提供有效量的活性化合物，其中防止或减少 了损害。
69.用于产生生物的保藏的原种的方法，该方法包括将所述生物 暴露于有效量的选自以下组的一个或多个化合物：
a)具有式I的化合物；
b)具有式II的化合物；
c)具有式III的化合物；
d)具有式IV的化合物；
或其盐或前药。
70.用于可逆地抑制生物中的代谢的方法，该方法包括给所述生 物物质提供有效量的活性化合物，该活性化合物不是鱼藤酮。
71.权利要求69的方法，该方法进一步包括将所述生物暴露于 低氧条件。
72.权利要求69的方法，其中所述生物是蝇类、鱼类、蛙类或 其胚胎。
73.用于在生物中诱导睡眠的方法，该方法包括给所述生物提供 有效量的活性化合物，其中该有效量小于可在该生物中诱导停滞的量。
74.用于麻醉生物物质的方法，该方法包括给所述物质提供有效 量的活性化合物，其中该有效量小于可在该生物中诱导停滞的量。
75.保护生物物质免受损伤、疾病的发作或进展、或死亡的方法， 该方法包括在所述损伤、疾病的发作或进展、或死亡之前，给所述物 质提供有效量的活性化合物，其中该有效量小于可在该生物物质中诱 导停滞的量。
76.权利要求75的方法，其中所述生物物质正在出血。
77.防止生物流血至死的方法，该方法包括给所述流血的生物提 供有效量的活性化合物来防止死亡。
78.权利要求77的方法，其中所述生物进入出血性休克。
79.用于在生物物质中诱导停滞的方法，该方法包括：
a)鉴定其中期望停滞的生物物质；以及
b)给该生物物质提供有效量的至少一种有效量的活性化合物来 诱导体内生物物质的停滞。
80.权利要求79的方法，其中给所述的生物物质提供有效量的 不同活性化合物的组合。
81.药学上可接受的制剂中的药物组合物，它包含至少一种含有 活性化合物的混合物。
82.权利要求81的药物组合物，其中所述活性化合物是氧拮抗 剂。
83.权利要求82的药物组合物，其中所述氧拮抗剂是直接的氧 拮抗剂。
84.权利要求82的药物组合物，其中所述氧拮抗剂是H2S。
85.权利要求84的药物组合物，该药物组合物包含有效剂量的 H2S，当施用给患者时，提供10μM至10mM的Cmax或稳态血浆浓 度。
86.权利要求81的药物组合物，其中所述活性化合物具有式I、 式II、式III、式IV的结构、或其盐或前体。
87.权利要求81的药物组合物，其中所述活性化合物是硫属化 物。
88.权利要求72的药物组合物，其中所述硫属化物是H2S或者 其盐或前体。
89.权利要求66的药物组合物，其中所述组合物是液体。
90.一种制造品，它包含包装材料和包含在该包装材料中的活性 化合物，其中所述包装材料包含显示所述活性化合物可以用于在体内 生物物质中诱导停滞的标签。
91.权利要求90的制造品，它包含药学上可接受的稀释剂。
92.权利要求91的制造品，其中所述活性化合物在第一个密封 的容器中提供，并且所述药学上可接受的稀释剂在第二个密封的容器 中提供。
93.权利要求92的制造品，它进一步包含用于混合所述活性化 合物和所述稀释剂的说明书。
94.权利要求91的制造品，其中所述活性化合物被重构用于在 体内的生物物质中诱导停滞。
95.权利要求90的制造品，它进一步包含缓冲剂。
96.权利要求90的制造品，其中所述活性化合物具有式I、式 II、式III、式IV的化学结构、或其盐或前药。
97.权利要求90的制造品，其中所述活性化合物是氧拮抗剂。
98.权利要求90的制造品，其中所述活性化合物是硫属化物。
99.权利要求98的制造品，其中所述硫属化物是H2S或者其盐 或前体。
100.权利要求90的制造品，其中所述标签显示所述氧拮抗剂可以 用于在需要这种处理的患者中诱导停滞。
101.一种制造品，它包含包装在一起的以下物质：活性化合物、 关于使用该活性化合物的说明书，其包括：(a)鉴别需要停滞处理的 体内组织；和(b)给所述的体内生物物质施用有效量的所述活性化 合物。
102.一种制造品，它包含含有活性化合物的医用气体和标签，该 标签包含关于在生物物质中诱导停滞的细节或用法和施用。
103.用于将活性化合物递送至需要停滞处理的组织位点的试剂 盒，包含：
适合于形成针对组织位点的密封包裹物的覆盖物；
含有氧拮抗剂的容器；以及
在所述伤口覆盖物中的进口；
其中所述含有活性化合物的容器与所述进口连通。
104.权利要求103的试剂盒，它进一步包含位于所述覆盖物中的 出口，其中该出口与负压源连通。
105.权利要求104的试剂盒，其中安置所述出口，使之与负压源 流体连通。
106.权利要求105的试剂盒，它进一步包含柔性导管，该导管连 通所述出口和负压源。
107.权利要求106的试剂盒，它进一步包含一个罐，该罐与所述 出口和负压源之间流体连通。
108.权利要求107的试剂盒，其中所述罐是可拆卸的罐。
109.权利要求106的试剂盒，其中含有活性化合物的所述容器与 所述入口气体连通。
110.权利要求104的试剂盒，其中所述容器含有气态活性化合物。
111.权利要求106的试剂盒，其中所述容器含有液化气体活性化 合物。
112.权利要求111的试剂盒，它进一步包含气化器，该气化器与 含有活性化合物的所述容器和入口之间连通。
113.权利要求106的试剂盒，它包含返回出口，该出口与含有所 述活性化合物的容器连通。
114.权利要求103的试剂盒，其中所述活性化合物是一氧化碳、 二氧化碳或硫化氢。
115.权利要求103的试剂盒，其中所述组织包括伤口位点。
116.权利要求103的试剂盒，其中所述覆盖物包括弹性材料。
117.权利要求116的试剂盒，它进一步包含覆盖所述覆盖物边缘 的压敏粘合剂。
118.权利要求103的试剂盒，其中所述负压源是真空泵。
119.用于将氧拮抗剂递送至生物物质的方法，该方法包括使用权 利要求103的试剂盒。
120.用于筛选候选活性化合物的方法，该方法包括：
a)将斑马鱼胚胎暴露于物质；
b)测量所述胚胎的心率；
c)将存在所述物质时胚胎的心率与没有该物质时的心率比较， 其中心率的降低鉴定该物质为候选活性化合物。
121.权利要求120的方法，其中通过计算心跳的次数测量所述胚 胎的心率。
122.权利要求120的方法，其中在测量心率的同时，在解剖显微 镜下观察所述斑马鱼胚胎。
123.权利要求120的方法，它进一步包括
d)将小鼠暴露于所述候选活性化合物并测定以下参数中的一种 或多种：
i)核心体温；
ii)氧消耗；
iii)运动力；或
iv)二氧化碳产生。
124.权利要求120的方法，其中所述化合物具有式I或式IV的结 构。
125.用于筛选候选活性化合物的方法，该方法包括：
a)将线虫暴露于物质；
b)测定以下细胞呼吸因素中的一种或多种：
i)核心体温；
ii)氧消耗；
iii)运动力；或
iv)二氧化碳产生；
c)将存在所述物质时线虫的细胞呼吸因素与没有该物质时的细 胞呼吸因素比较，其中所述特征的减少鉴定该物质为候选活性化合物。
126.权利要求125的方法，其中测定运动力。
127.权利要求125的方法，该方法进一步包括鉴定所述物质。
128.权利要求124的方法，其中所述化合物具有式I或式IV的结 构。
129.保护哺乳动物免于遭受由外科手术引起的细胞损害的方法， 该方法包括在外科手术之前给所述哺乳动物提供足以诱导该哺乳动物 进入预停滞的量的硫化氢。
130.权利要求129的方法，其中所述外科手术选自选择性外科手 术、计划的外科手术或急救外科手术。
131.权利要求129的方法，其中静脉内施用硫化氢。
132.权利要求129的方法，其中通过吸入施用硫化氢。
133.权利要求129的方法，其中所述外科手术是心肺外科手术。
134.保护哺乳动物免于遭受由疾病或不利医学状况引起的细胞损 害的方法，该方法包括在所述疾病发作或进展之前给所述哺乳动物提 供足以诱导该哺乳动物进入预停滞的量的硫化氢。
135.权利要求134的方法，其中所述疾病或不利的医学状况选自： 出血性休克、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、心搏停止、新生儿低 氧/局部缺血、缺血性再灌注损伤、不稳定型心绞痛、血管成形术后、 动脉瘤、外伤和失血。
136.用于在受试者中诱导呼吸暂停的方法，该方法包括给所述受 试者施用有效量的硫化氢。
137.权利要求136的方法，其中所述受试者在流血或有流血的风 险。
138.权利要求137的方法，该方法进一步包括从所述受试者中获 得血液样品。
139.权利要求138的方法，该方法进一步包括评价所述血液样品 的硫化氢暴露。
140.权利要求136的方法，该方法进一步包括鉴定需要处理的受 试者。
140.3.权利要求136的方法，其中给所述患者提供超过3,000 ppm的硫化氢。
140.4.权利要求136的方法，其中给所述患者提供硫化氢持续 大约5分钟或更短时间。
140.5.权利要求140.4的方法，其中给所述患者提供超过3,000 ppm的硫化氢持续大约5分钟或更短时间。
140.6.权利要求140.5的方法，其中给所述患者提供硫化氢持 续大约3分钟或更短时间。
141.用于治疗患者中出血性休克的方法，该方法包括提供有效量 的硫化氢。
142.权利要求141的方法，其中使用喷雾器给所述患者提供硫化 氢。
143.权利要求141的方法，其中给所述患者提供超过3,000ppm 的硫化氢。
144.权利要求141的方法，其中给所述患者提供硫化氢持续大约 5分钟或更短时间。
145.权利要求144的方法，其中给所述患者提供超过3,000ppm 的硫化氢持续大约5分钟或更短时间。
146.权利要求145的方法，其中给所述患者提供硫化氢持续大约 3分钟或更短时间。
147.权利要求141的方法，其中连续地给所述患者提供硫化氢。
148.权利要求141的方法，其中给所述患者提供单剂量的硫化氢。
149.权利要求141的方法，其中给所述患者提供多剂量的硫化氢。
1.发明领域
本发明总的来说涉及细胞生物学和生理学领域。更特别地说，本 发明涉及用于增强细胞、组织、器官和生物的存活力(survivability) 和/或减少对它们的损伤的方法、组合物和仪器，特别是在不利条件下 (包括但不限于缺氧或无氧状态)，使用一种或多种物质(包括与氧 竞争的物质)。在某些实施方案中，本发明包括通过使受试者暴露于 可以实现其所述的目标的氧拮抗剂、保护性代谢剂或在本文讨论的其 它化学化合物，或其前体(统称为“活性化合物”)，来治疗、预防和 诊断疾病和病症的方法、组合物和仪器。
2.相关技术的描述
Stasis是一个拉丁文术语，意思是指“停滞”。在活组织中停滞的 背景中，停滞的最常见形式涉及用于移植或复置的组织的保存。典型 地，将这类组织浸没于生理流体(例如盐水)中，并置于冷环境下以减 少导致细胞损伤的生化过程。这种停滞是不完全的并且不能长时间依 赖。事实上，器官移植和肢体复置的成功与器官或肢体脱离完整生物 的时间负相关。
停滞的一种更极端的形式涉及使整个生物处于通俗上所称的“滞 生”状态。尽管仍然主要认为是在科幻小说的领域内，但当富人寻求在 死后被冷藏，期望未来的医学突破将允许他们复活并治愈他们的致命 疾病时，产生了坏名声。据说，自1967年第一次尝试以来已有一百多 人被冷藏，并且一千多人已经与几个组织之一(例如Alcor Life Extension Foundation)做好了人体冷藏的法律和财务安排。这类方法 涉及施用抗-局部缺血药物、低温保存和用冷悬(cryosuspension)流 体灌注整个生物的方法。还没有证实这种形式的生物停滞是可逆的。
如在本文描述的组合物、方法或制造品所涉及的在生物物质中诱 导停滞的效用的特征是，整体或部分地诱导或开始停滞，随后一段时 期保持停滞，然后回复至正常或接近正常的生理状态，或本领域技术 人员认为是好于从未进行停滞的生物物质的状态的状态的状态。也可 以将停滞定义为非上述含义(what it is not)。生物停滞不是以下状 态中的任何一种：睡觉、昏迷、死亡、被麻醉或癫痫大发作(grand mal seizure)。
存在许多在暴露于低温条件(通常是处于冷水浸没中)后，从明 显脉搏和呼吸停止生还的个体的报道。尽管科学家未完全理解，从这 种情况生存的能力有可能源自所谓的“哺乳动物潜水反射”。这种反射 被认为刺激迷走神经系统，迷走神经系统控制肺、心脏、喉以及食道， 以便保护生命器官。据推测，冷水刺激皮肤上的神经受体引起血液分 流到大脑并分流到心脏，并离开皮肤、胃肠道和四肢。同时，保护性 反射性心搏徐缓，或心搏减缓，节约了体内减少的氧供应。不幸地是， 这种反射的表现不是在所有人中都是相同的，并且被认为是仅在冷水 浸没案例的10-20％中的因素。
不完全依赖或根本不依赖低温和/或氧的组合物和方法可能适用 于器官保存领域，以及组织或细胞保存。目前用低温保存细胞和组织， 通常是处于基本上低于冰冻的温度，例如在液氮中。然而，依赖温度 可能引起问题，因为用于产生这种低温的仪器和试剂在需要时可能不 容易获得，或者它们可能需要替换。例如，组织培养细胞通常在盛有 液氮的罐中保存一段时间；然而，这些罐通常要求装置中的液氮定期 更换，否则液氮会耗尽并且不能保持温度。而且，由于冻/融过程，会 发生对细胞和组织的损伤。因此，需要改良的技术。
而且，控制受到创伤例如截肢术和低温的整个生物中的细胞和生 理性代谢的能力的缺乏是医学领域中的一个关键缺点。另一方面，上 面讨论的轶事证据强烈地提示，如果正确理解和管制，有可能在细胞、 组织和整个生物中诱导停滞。因此，对用于特别是在创伤性条件下控 制代谢过程的改良方法存在着巨大的需要。
发明概要
因此，本发明提供在位于生物中的细胞、组织和器官中或从生物 中得到的细胞、组织和器官中，以及在生物本身中诱导停滞的方法、 组合物、制造品和仪器。这些方法、组合物、制造品以及仪器可用来 保护生物物质，以及用于预防、治疗或诊断生物中的疾病和病症。而 且，这些方法本身可直接诱导停滞，或者它们可以通过本身不诱导停 滞，而是通过增强生物物质响应损伤或疾病状况进入停滞的能力，例 如通过减少获得停滞所需的损伤或疾病的时间或水平，来间接起作用。 这种状况可称为预停滞(pre-stasis)。这种应用以及其它用途的细节 在下面描述。
本发明部分基于使用据测定具有保护功能，并因而用作保护剂的 化合物的研究。此外，涉及不同化合物的研究的总体结果表明，具有 可利用的电子供体中心的化合物在诱导停滞或预停滞中是特别有效 的。而且，这些化合物诱导可逆的停滞，意味着它们对特殊的生物物 质不是那么有毒性而导致该物质死亡或分解。进一步考虑本发明可用 于增强可能要接受或处于不利条件下的生物物质的存活力和/或预防 或减少对其的损伤。
在特别的实施方案中，本发明的方法用于在损伤(例如创伤性损 伤)后或疾病发作或进展后，在生物物质，例如细胞、组织、器官和/ 或生物中诱导停滞或预停滞，以便保护生物物质在治疗损伤或疾病前、 期间或之后免受与损伤或疾病相关的伤害。在另外的实施方案中，本 发明的方法用于在接受损伤事件(例如选择性外科手术)前或疾病发 作或进展前在生物物质中诱导或促进停滞或预停滞，以便保护所述生 物物质免受与不利条件如损伤或疾病相关的伤害。这类方法通常称为 用活性化合物“预处理”。预处理包括其中在生物物质受到不利条件(例 如，损伤或疾病的发作或进展)前和期间，以及之前、期间和之后提 供给该生物物质活性化合物的方法，以及其中仅在生物物质受到不利 条件之前提供给该生物物质活性化合物的方法。
根据本发明的方法的不同实施方案，停滞可以通过用自身直接诱 导停滞的活性化合物处理生物物质来诱导，或可替代地，通过用本身 不诱导停滞，而是，促进或增强生物物质响应另外的刺激，例如，但 不限于损伤、疾病、缺氧、过量出血或用另外的活性化合物处理而达 到停滞所需的能力或降低这样所需的时间的活性化合物处理生物物质 来诱导。
在特别的实施方案中，用活性化合物的处理诱导“预停滞”，预停 滞指生物物质必须过渡而达到停滞的代谢减退的状态。预停滞的特征 是生物材料内的新陈代谢减少的幅度小于定义为停滞的幅度。为了用 活性化合物获得停滞，生物物质有必要必须通过逐级的代谢减退的状 态过渡，在代谢减退的状态中生物物质中氧消耗和CO2产生的减少低 于两倍。这样一种连续过程(其中代谢或细胞呼吸通过活性化合物减 少至低于两倍的程度)可以描述为“预-停滞”状态。
在停滞包括CO2产生或O2消耗减少两倍(即减少至50％或更少) 时，用本领域技术人员已知的方法直接测量生物物质中的这些参数(其 中检测到低于2倍的减少)表示预停滞。因此，血液中的二氧化碳和 氧水平以及本领域技术人员熟悉的其它代谢率的标记的某些测量，包 括但不限于血pO2、VO2、pCO2、pH和乳酸水平，可用于本发明中 监测预停滞的开始或进展。当代谢活动的指标，例如经由细胞呼吸的 CO2产生和O2消耗，与正常状态相比减少小于两倍时，预停滞可能与 至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的 CO2放出减少相关，所述的CO2放出指CO2从肺释放的量。而且，在 多个实施方案中，预停滞的特征是代谢活动的一个或多个指标的减少， 所述的减少与正常生理状态相比少于或等于1％、2％、5％、10％、 15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或49％。在另外的实施 方案中，预停滞的特征在于其响应另一个刺激(其中该另一个刺激可 包括用相同活性剂的延长治疗)而增强或促进进入停滞的能力，或其 增强生物物质的存活力或保护生物物质免受由损伤、疾病的发作或进 展，或出血，特别是可以导致不可逆的组织损伤、出血性休克或致死 的出血而导致的损伤的能力。
虽然在此通过举例明确说明的本发明方法可能涉及诱导“停滞”， 但应该理解，这些方法可以很容易适用于诱导“预停滞”，并且这种诱 导预停滞的方法是本发明考虑的。而且，用于诱导停滞的相同活性化 合物也可以用于诱导预停滞，这可通过将它们以低于诱导停滞所使用 的剂量提供给生物物质和/或将它们提供给生物物质的时间短于用于 诱导停滞的时间来实现。
在某些实施方案中，本发明涉及将生物物质暴露于一定量的试 剂，以便实现生物物质的停滞。在一些实施方案中，本发明涉及用于 在体内生物物质中诱导停滞的方法，该方法包括：a)鉴定其中停滞是 期望的生物；以及，b)将所述生物暴露于有效量的氧拮抗剂或其它 活性化合物用于在体内生物物质中诱导停滞。在生物物质中诱导“停 滞”表示该物质是活的，但其具有以下一个或多个特征：由生物物质产 生的二氧化碳的速率或量减少至少两倍；由生物物质消耗的氧的速率 或量减少至少两倍(即50％)；以及运动或活动力降低至少10％(仅 适用于运动的细胞或组织，例如精细胞或心脏或四肢，或当在整个生 物中诱导停滞时)(统称为“细胞呼吸指标”)。在本发明的某些实施 方案中，考虑生物物质氧消耗的速率有约、至少约或最多约2-、3-、 4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、25-、30-、35-、40-、45-、 50-、60-、70-、80-、90-、100-、150-、200-、250-、300-、350-、400-、 450-、500-、600-、700-、800-、900-、1000-、1100-、1200-、1300-、 1400-、1500-、1600-、1700-、1800-、1900-、2000-、2100-、2200-、 2300-、2400-、2500-、2600-、2700-、2800-、2900-、3000-、3100-、 3200-、3300、3400-、3500-、3600-、3700-、3800-、3900-、4000-、 4100-、4200-、4300-、4400-、4500-、5000-、6000-、7000-、8000-、 9000-或10000-倍或更多的减少，或可源于其中的任何范围。可替代地， 考虑本发明的实施方案可以用约、至少约或至多约50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99％或更多的生物物质氧消耗速率的降低来讨论。考虑可以采用任何 用于测量氧消耗的测定法，并且典型的测定法将涉及利用封闭的环境 并且测量放入环境中的氧和一段时间后环境中剩下的氧之间的差。进 一步考虑可以测量二氧化碳产生来测定生物物质氧消耗的量。因此， 可能存在二氧化碳产生的降低，这对应于上面所讨论的氧消耗的降低。
在本发明的方法中，停滞或预停滞是暂时的和/或可逆的，这表 示生物物质在稍后的某一时间点不再体现停滞的特征。在本发明的一 些实施方案中，施用不适合作为氧拮抗剂的化合物而不是氧拮抗剂。 考虑关于氧拮抗剂所讨论的方法可以适用于作为氧拮抗剂任何化合 物、保护性代谢剂、具有式I、II、III或IV结构的化合物、在此讨论 的任何其它化合物，或其盐或前体。实现本发明的任何方法并且适格 作为氧拮抗剂、保护性代谢剂的化合物、具有式I、II、III或IV结构 的化合物、或其盐或前体将认为是“活性化合物”。在特别的实施方案 中，停滞的诱导是期望的，在该情形中，化合物可以称为“活性停滞化 合物”。考虑在本发明的一些实施方案中，方法通过诱导停滞来实现。 例如，治疗方法可能涉及诱导停滞，在这种情形中活性化合物是活性 停滞化合物。特别考虑，在其中讨论活性化合物的实施方案中，本发 明包括，并且可能限于氧拮抗剂。
在本发明的某些实施方案中，生物物质用一种活性化合物处理， 该活性化合物本身不诱导停滞(至少在提供的水平上和/或时间期间上 不诱导停滞)，而是诱导生物物质进入具有治疗好处的预停滞状态， 并且增强生物物质响应其它刺激，例如损伤、疾病状态，或用其它活 性化合物或如果更长时间或以更大剂量用相同的活性化合物处理而达 到停滞的能力。
术语“生物物质”指任何活的生物材料(在优选的实施方案中为哺 乳动物的生物材料)，包括细胞、组织、器官和/或生物，以及它们的 任意组合。考虑停滞可以在生物的部分(例如细胞、组织和/或一个或 多个器官)中诱导，不管那部分是保持在所述生物内还是从该生物中 移出，或者让整个生物处于停滞状态。而且，在细胞和组织方面考虑 到，同源和异源细胞群体可以是本发明实施方案的主题。术语“体内生 物物质”指在体内，即仍位于生物内或连接在生物上的生物物质。而且， 术语“生物物质”将理解为术语“生物材料”的同义词。在某些实施方案 中，考虑将一个或多个细胞、组织或器官与生物分离。术语“分离的” 可用于描述这种生物物质。考虑可在分离的生物物质中诱导停滞。
需要停滞的生物或其它生物物质是其中生物的全部或部分的停 滞可以产生直接或间接的生理学好处的生物或生物物质。例如，有出 血性休克风险的患者可以认为需要停滞，或者将进行冠状动脉旁路手 术的患者可以受益于保护心脏免于局部缺血/再灌注损伤。其它应用在 整个本申请中讨论。在一些案例中，基于表明可通过进行停滞来预防 或治疗的病状或疾病，或病状或疾病的风险的一种或多种检测、筛选 或评估，来鉴定或确定生物或其它生物物质需要停滞。可替代地，考 虑患者医学史或家族医学史(询问患者)可以得到生物或其它生物物 质需要停滞的信息。本领域技术人员显而易见的是，本发明的一个应 用将是通过诱导停滞来减少生物材料的总体的能量需求。
可替代地，生物或其它生物物质将需要活性化合物来增强存活 力。例如，患者可能需要对损伤或疾病的治疗或在此讨论的任何其它 应用。基于在前面的段落中讨论的方法，例如通过考虑患者的医学史 或家族医学史，他们可能被确定为需要增强存活力或治疗。
术语“氧拮抗剂”指在氧被需要氧来活着的生物物质(“氧-利用性 生物物质”)利用这方面与氧竞争的物质。氧是产生生物物质可容易利 用的能量的主要来源的多种细胞过程通常使用或需要的。氧拮抗剂有 效地减少或消除可被氧-利用性生物物质利用的氧的量，和/或可被氧- 利用性生物物质使用的氧的量。在一个实施方案中，氧拮抗剂可直接 实现其氧拮抗作用。在另一个实施方案中，氧拮抗剂可间接实现其氧 拮抗作用。
直接的氧拮抗剂与分子氧竞争结合至具有氧结合位点或氧结合 能力的分子(例如，蛋白质)。如药理学或生物化学领域所知的，拮 抗作用可以是竞争性的、非竞争性的或反竞争性的。直接的氧拮抗剂 的实例包括但不限于，一氧化碳(CO)，其与氧竞争结合至血红蛋白 和结合至细胞色素c氧化酶。
在缺少对氧结合至氧结合性分子的直接竞争时，间接的氧拮抗剂 影响氧的可利用性或递送至使用氧来产生能量(例如在细胞呼吸中) 的细胞。间接的氧拮抗剂的实例包括但不限于，(i)二氧化碳，其通过 称为博尔(Bohr)效应的过程，减少血红蛋白(或其它球蛋白，如肌 红蛋白)结合至氧-利用性动物的血或血淋巴中的氧的能力，因而减少 了递送至生物的氧-利用性细胞、组织和器官的氧的量，因而减少了氧 对利用氧的细胞的可利用性；(ii)碳酸酐酶抑制剂(Supuran等，2003， 将其通过全文引入作为参考)，其通过抑制肺或其它呼吸器官中二氧化 碳的水合作用，增加了二氧化碳的浓度，因而减少了血红蛋白(或其 它球蛋白，如肌红蛋白)结合至氧-利用性动物的血或血淋巴中的氧的 能力，因而减少了递送至生物的氧-利用性细胞、组织和器官的氧的量， 因而减少了氧对利用氧的细胞的可利用性；以及(iii)结合氧并屏蔽 氧与氧结合性分子结合或使氧不可用于与氧结合分子结合的分子，包 括但不限于氧螯合剂、抗体等。
在一些实施方案中，氧拮抗剂既是直接氧拮抗剂又是间接氧拮抗 剂。实例包括但不限于，直接竞争氧结合至细胞色素C氧化酶并且也 能够结合并抑制碳酸酐酶的酶促活性的化合物、药物或试剂。因此， 在一些实施方案中，氧拮抗剂抑制或减少细胞中发生的细胞呼吸的量， 例如通过结合细胞色素C氧化酶上的位点，该位点否则将会结合氧。 细胞色素C氧化酶特异性结合氧并然后将其转化为水。在一些实施方 案中，与细胞色素C氧化酶的这种结合优选是可释放的和可逆结合(例 如具有至少10-2、10-3或10-4M的体外解离常数Kd，且具有不大于10-6、 10-7、10-8、10-9、10-10或10-11M的体外解离常数Kd)。在一些实施 方案中，通过测量ATP和/或二氧化碳输出量来评价氧拮抗剂。
术语“有效量”表示可以获得所述结果的量。在本发明的某些方法 中，“有效量”是，例如，在需要停滞的生物物质中诱导停滞的量。在 其它方法中，“有效量”是，例如，在需要停滞或需要增强的存活力的 生物物质中诱导预停滞的量。在另外的实施方案中，“有效量”可以指 增加生物或其它生物物质的存活力的量。这可以基于与未经处理的生 物物质或用不导致存活力的不同的不同剂量或方案处理的生物物质比 较或预先比较来确定(或假定)。
应该理解，当在组织或器官中诱导停滞时，有效量是通过组织或 器官的细胞呼吸的集合量确定的、在组织或器官中诱导停滞的量。因 此，例如，如果在暴露于特定量的某种氧拮抗剂或其它活性停滞化合 物后，心脏氧消耗的水平(心脏的细胞的集合)降低至少约2倍(即 50％)，应该理解该特定量是在心脏中诱导停滞的有效量。类似地， 在生物中诱导停滞的试剂的有效量是，就停滞的一种特定参数的共同 的或总的水平而论来评估的量。也应该理解，当在生物中诱导停滞时， 有效量是通常诱导整个生物的停滞的量，除非只靶向生物的特殊部分。 而且应该理解，有效量可以是本身足以诱导停滞的量，或者其可以是 与其它试剂或刺激，例如另一种活性化合物、损伤或疾病状态组合而 足以诱导停滞的量。
有效量的特定化合物的概念，在一些实施方案中，涉及有多少可 利用的氧能被生物物质利用。通常，当在缺少任何氧拮抗剂存在下存 在约100,000ppm或更少氧时(室内空气具有约210,000ppm氧)， 可以诱导停滞。氧拮抗剂用来改变多少氧是可有效利用的。在10ppm 的氧浓度时，诱导了滞生。因此，由于氧拮抗剂与氧结合生物物质中 必需的氧代谢性蛋白质的竞争效应，尽管生物物质暴露的实际氧浓度 可能高于、甚至大大高于10ppm，可以诱导停滞。换而言之，有效量 的氧拮抗剂降低有效氧浓度至存在的氧不可被利用的点。当氧拮抗剂 的量减少有效氧浓度低于氧结合至必需的氧代谢性蛋白质的Km时(即 相当于10ppm的氧)，就将发生这种情况。因此，在一些实施方案中， 氧拮抗剂减少氧的有效浓度约或至少约2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、 9-、10-、15-、20-、25-、30-、35-、40-、45-、50-、60-、70-、80-、 90-、100-、150-、200-、250-、300-、350-、400-、450-、500-、600-、 700-、800-、900-、1000-、1100-、1200-、1300-、1400-、1500-、1600-、 1700-、1800-、1900-、2000-、2100-、2200-、2300-、2400-、2500-、 2600-、2700-、2800-、2900-、3000-、3100-、3200-、3300、3400-、 3500-、3600-、3700-、3800-、3900-、4000-、4100-、4200-、4300-、 4400-、4500-、5000-、6000-、7000-、8000-、9000-或10000-倍或更多， 可源于其中的任何范围。可替代地，考虑本发明的实施方案可就有效 氧浓度的减少来讨论，所述的有效氧浓度减少是约、至少约或至多约 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、 95、96、97、98、99％或更多，或可源于其中的任何范围。应该理解， 这是表示细胞呼吸降低的另一种方式。
而且，在一些实施方案中，停滞可以通过生物的核心体温的降低 间接测量。考虑在本发明的方法中可以观测到核心体温降低约、至少 约或至多约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50_或更多，或可源于其中的任何范围。在本发明的一 些实施方案中，可以诱导低体温，例如中度低体温(至少10_降低) 或重度低体温(至少20_降低)。
而且，有效量可以表示为在对暴露时间长度进行合格鉴定或未进 行合格鉴定下的浓度。在一些实施方案中，通常考虑，为了诱导停滞 或达到本发明的其它声明的目标，将生物物质暴露于氧拮抗剂或其它 活性化合物约、至少约或至多约5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60秒、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、 7天、1、2、3、4、5周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20年或更多年，以及可源于其中的任意组合或范围。进一步 考虑，时间的量可以是不确定的，其取决于施用氧拮抗剂或其它活性 化合物的原因或目的。此后，生物物质可继续暴露于氧拮抗剂或其它 活性化合物，或者，在本发明的其它实施方案中，生物物质可以不再 暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物。后面的这个步骤可以通过从在其 中期望停滞的生物物质存在中除去或有效除去氧拮抗剂或其它活性化 合物来完成，或者可将生物物质从含有氧拮抗剂或其它活性化合物的 环境移出生物物质来完成。而且，可给生物物质连续地(暴露无间断 的一段时间)、间歇性地(在多个时期暴露)或周期性地(按规律在 多个时期暴露)暴露或提供任何活性化合物。基于这种不同，活性化 合物的剂量可以相同或者它们可以变化。在某些实施方案中，通过每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分钟、1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月、1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年或可 源于其中的任何范围，提供给生物物质或暴露生物物质以活性化合物 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，来周期性地提供活性化合物。
而且，在本发明的一些实施方案中，将生物物质暴露于或给生物 物质提供活性化合物持续的一段时间，其中“持续”表示至少约2小时 的一段时间。在其它实施方案中，可将生物物质以持续的方式暴露于 或给生物物质提供活性化合物超过一天。在这种情况中，以连续持续 的方式给生物物质提供活性化合物。在某些实施方案中，可持续地、 间歇性地(在多个时期暴露)或周期性地(以重复有规律的方式暴露) 将生物物质暴露于或给生物物质提供活性化合物约2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12或更多小时(或可源于其中的任何范围)、2、3、 4、5、6、7天和/或1、2、3、4、5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12月和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20或更多年(或可源于其中的任何范 围)。
在一些实施方案中，可在特别的损伤、创伤或治疗(例如外科手 术)、不利条件或其它相关事件或情况之前和期间；之前、期间和之 后；期间和之后；或仅在其之后将生物物质暴露于或给其提供活性化 合物。这种暴露可以是或可以不是持续的。
以这些不同的方式施用的活性化合物的剂量可以相同或者它们 可以变化。
而且，在某些实施方案中，可以以认为是“低”的水平以连续持续 的方式提供活性化合物，“低”的水平表示小于引起代谢柔性例如可见 CBT、心率或者CO2或O2消耗或产生下降的量的水平。
在某些实施方案中，在不利生理分支例如呼吸暂停(“在其过程 中呼吸明显减少以致于受试者进行10％或更少次数的呼吸的时间 段”)、缺少可观察到的骨骼肌运动、张力障碍和/或机能亢进前，将 生物物质暴露于或给其提供超过先前理解为最大耐受剂量的量的活性 化合物，例如代谢剂。这样的量可能特别与在本发明的一些实施方案 中增加存活力，例如，用于增加在不利条件(例如将从出血性休克诱 导死亡的那些条件)下存活的机会相关。
本发明活性化合物可以诱导一种生理状态，增强需要存活力增强 的生物中的存活力，并且包含一组可观察到的响应有效剂量的活性化 合物的生理变化，所述的变化可以包括呼吸过度、呼吸暂停和伴随的 或随后的丧失神经肌肉紧张性或运动的自主控制以及持续心脏跳动中 的一种、多种或全部。也可能观察到暂时的且可测量的动脉血颜色变 化。呼吸过度指快速的浅呼吸。呼吸暂停指呼吸停止或如上描述的减 少。
在某些实施方案中，受试者变为呼吸暂停，这表现为呼吸停止和 随后在短时间后的窒息性(apnic)呼吸。在大鼠中，这在约20秒后 发生。因此考虑，在暴露于活性化合物后，诱导成呼吸暂停的受试者 可以表现出0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10％的呼吸次数。其后， 受试者可以具有偶尔的呼吸，这可以认为是窒息性呼吸。在本发明的 某些实施方案中，呼吸暂停持续直至受试者不再暴露于活性化合物。
在本发明的一些实施方案中，有效量可以表示为LD50，LD50指“半 数致死剂量”，其表示施用的杀死半数动物群体(引起50％死亡率) 的剂量。而且，在另外的实施方案中，有效量可以不依赖于生物物质 的重量(“重量不依赖的”)。例如，在啮齿动物和人中，在不利生理 效应出现前，H2S气体的LD50是约700ppm。而且，在本发明的一些 实施方案中，增加的存活力通常指存活更长，这是本发明的一个实施 方案。
本发明也涉及用于在生物中诱导呼吸暂停的方法，该方法包括施 用给生物有效量的活性化合物。在某些实施方案中，生物也不表现出 由所述活性化合物引起的任何骨骼肌运动。特别考虑，生物可以是哺 乳动物，包括人。在另外的实施方案中，有效量超过被认为是致死浓 度的量。在进一步的实施方案中，浓度可以是致死量，然而暴露的时 间可以是约、至少约或至多约10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60秒、1、2、3、4、5分钟或更久(或可源于其中的任何范围或 在本公开内容中指定的其它时向期限)。在特别的实施方案中，哺乳 动物暴露于至少约600ppm的活性气体化合物，例如H2S。
而且，在某些实施方案中，存在鉴定需要处理的动物的步骤。在 另外的实施方案中，存在观察生物中的呼吸暂停的步骤。在更进一步 的实施方案中，方法涉及从生物获取血液样品和/或评估该生物的血液 的颜色。已经观察到，暴露于H2S改变了来自哺乳动物的血液的颜色； 颜色从鲜红色变成较暗的红酒颜色，并然后变为砖红色。评估颜色可 以通过目测完成而不需仪器或机器，而在另外的实施方案中，可以使 用仪器，例如分光光度计。而且，可以从生物获得血液样品，并且可 以在其上进行其它类型的分析。可替代地，可能不需要血液样品，而 是可以无需样品来评价血液。例如，可采用照射IR或可见光透过手 指的改良的脉搏血氧计来监测血液的颜色变化。
在某些实施方案中，将生物物质暴露于有效量的不会导致停滞或 预停滞的活性化合物。在一些实施方案中，在存在活性化合物时，可 能没有氧消耗或二氧化碳产生的减少的迹象。
在另外的实施方案中，可将生物在睡眠时暴露于活性化合物。而 且，如上面讨论的，暴露可以是有规律的，例如每天(表示每天暴露 至少一次)。
特别考虑，在一些实施方案中通过喷雾器将活性化合物提供给受 试者。这可以用本发明的任何实施方案应用。在某些案例中，将喷雾 器用于处理出血性休克。在进一步的实施方案中，将活性化合物作为 单次剂量提供给受试者。在特定的案例中，单次剂量或多次剂量是将 在受试者中诱导呼吸暂停的剂量。在一些实施方案中，给予受试者至 少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、 10,000、11,000、12,000或更多ppm的H2S气体。暴露时间可以是在 此讨论的任何时间，包括约或约至多10、9、8、7、6、5、4、3、2、 1、0.5、0.1分钟或更短(或可源于其中的任何范围)。
在进一步的实施方案中，在暴露于活性化合物后生物物质的代谢 率可能改变。在某些实施方案中，在暴露于活性化合物后生物物质的 RQ比率(CO2产生/O2消耗)改变。这可以在初次暴露或反复暴露后 或在急性暴露后发生。在一些实施方案中，暴露后RQ比率降低。所 述的降低可以是约、至少约或至多约5、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80％或更多，或可源于此的任何 范围的降低。所述的降低可以是O2消耗增加、相对于O2消耗CO2 产生的减少的结果。
在一些实施方案中，在暴露于活性化合物的生物物质中观察不到 生理变化，除了其RQ比率在暴露后改变外。因此，在本发明的一些 实施方案中，方法涉及测量受试者中RQ比率的变化。这可以在暴露 于活性化合物之前和/或之后发生。
因此，在本发明的一些实施方案中，诱导了停滞，并且本发明方 法中的进一步步骤是保持相关的生物物质处于停滞状态。这可以通过 将该生物物质继续暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物和/或将该生物 物质暴露于非生理温度或其它氧拮抗剂或其它活性化合物来完成。可 替代地，可将生物物质置于防腐剂或溶液中，或将其暴露于含氧正常 或含氧量低的条件。考虑，可将生物物质保持于停滞状态约、至少约 或至多约30秒、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、 7天、1、2、3、4、5周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20或更多年以及可源于其中的任何组合或范围。而且考虑， 除了改变温度外或代替改变温度，可以进行环境的其它改变，例如压 力改变或实现冷冻保护或深低温保藏环境(例如含有甘油的环境)。
应该理解，关于整个动物的“停滞”和关于细胞或组织的“停滞”可 能需要不同的停滞时间长度。因此，对于人受试者，例如进行外科手 术治疗、恶性体温过高治疗的受试者或创伤患者，通常考虑至多12、 18或24小时的停滞时间。对于非人动物受试者，例如为了商业目的 而运输或保存的非人动物，考虑2或4天、2或4周或更长的时期的 停滞。
术语“暴露”是根据其通常意义使用的，用于表示让生物物质接受 氧拮抗剂或其它活性化合物。在一些实施方案中，这可以通过让生物 物质与氧拮抗剂或活性化合物接触来完成。在其它实施方案中，这通 过让生物物质与可以是或可以不是氧拮抗剂的活性化合物接触来完 成。在体内细胞、组织或器官的情形中，“暴露”可以进一步意指“揭开” 这些物质以便其可以与氧拮抗剂或其它活性化合物接触。例如，这可 以通过外科手术完成。暴露生物物质于氧拮抗剂或其它活性化合物可 以通过在拮抗剂中或与拮抗剂(包括浸没)孵育、用拮抗剂灌注或注 入、用氧拮抗剂或其它活性化合物注射生物物质，或将氧拮抗剂或其 它活性化合物应用于生物物质来完成。而且，如果整个生物的停滞是 理想的，考虑吸入或摄入氧拮抗剂或其它活性化合物，或任何其它途 径的药物施用来使用氧拮抗剂或其它活性化合物。而且，术语“提供” 是根据其通常且普通的含义来意指“供给”。考虑，可将化合物以一种 形式提供给生物物质并可通过化学反应将其转化为它作为活性化合物 的形式。根据本发明，术语“提供”包含术语“有效量”背景下的术语“暴 露”。
在一些实施方案中，将有效量表征为氧拮抗剂或其它活性化合物 的亚致死剂量。在诱导细胞、组织或器官(不是整个生物)的停滞的 情况中，“亚致死剂量”表示单次施用少于一半的将引起至少大部分生 物物质中的细胞在施用24小时内死亡的氧拮抗剂或活性化合物的量 的氧拮抗剂或活性化合物。如果期望整个生物的停滞，则“亚致死剂量” 表示单次施用少于一半的将引起该生物在施用24小时内死亡的氧拮 抗剂的量的氧拮抗剂或活性化合物。在一些实施方案中，将有效量表 征为氧拮抗剂或活性化合物的近致死(near-lethal)剂量。类似地， 在诱导细胞、组织或器官(不是整个生物)的停滞的情况中，“近致死 剂量”表示单次施用25％以内的将引起至少大部分细胞在施用24小时 内死亡的抑制剂的量的氧拮抗剂或活性化合物。如果期望整个生物的 停滞，则“近致死剂量”表示单次施用25％以内的将引起该生物在施用 24小时内死亡的抑制剂的量的氧拮抗剂或活性化合物。在一些实施方 案中，通过施用预定量的氧拮抗剂或活性化合物至生物物质来施用亚 致死剂量。特别考虑，这可以用任何活性化合物来实现。
而且考虑，在一些实施方案中，将有效量表征为氧拮抗剂或其它 活性化合物的超致死剂量。在诱导细胞、组织或器官(不是整个生物) 的停滞的情况中，“超致死剂量”表示单次施用至少1.5倍(1.5x)的将 引起至少大部分生物物质中的细胞在施用24小时内死亡的活性化合 物的量的活性化合物。如果期望整个生物的停滞，则“超致死剂量”表 示单次施用至少1.5倍的将引起该生物在施用24小时内死亡的活性化 合物的量的活性化合物。特别考虑，超致死剂量可以是约、至少约或 至多约1.5x、2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、 80x、90x、100x、150x、200x、250x、300x、400x、500x、600x、700x、 800x、900x、1000x、1100x、1200x、1300x、1400x、1500x、1600x、 1700x、1800x、1900x、2000x、3000x、4000x、5000x、6000x、7000x、 8000x、9000x、10,000x或更多，或可源于其中的任何范围的将引起至 少大部分生物物质中的细胞(或整个生物)在施用24小时内死亡的活 性化合物的量。
提供给生物物质的活性化合物的量可以是约、至少约、或至多约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、 180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、 300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、 420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、 530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、 650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、 770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、 890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000mg、 mg/kg或mg/m2或可源于其中的任何范围。可替代地，所述的量可表 示为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、 160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、 280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、 400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、 510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、 630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、 750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、 870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、 990、1000mM或M或可源于其中的任何范围。
在一些实施方案中，有效量是通过单独监测施用的氧拮抗剂或其 它活性化合物的量，或与监测以下参数的组合监测该量来施用的：监 测氧拮抗剂或其它活性化合物施用的持续时间、监测生物物质对施用 氧拮抗剂或其它活性化合物的生理反应(例如脉搏、呼吸、疼痛反应、 运动或活动力、代谢参数如细胞能量产生或氧化还原状态等)，和减 少、中断或停止施用所述化合物，当测量到所述反应变化的下限或上 限时，等等。而且，在本发明的任何方法中可以额外地采用这些步骤。
处于停滞状态或已经经受停滞的组织可以在许多应用中使用。例 如，它们可以用于输注或移植(治疗性应用，包括器官移植)；用于 研究目的；用于筛选检测来鉴别、表征或生产诱导停滞的其它化合物； 用于检测从其获得组织的样品(诊断应用)；用于保存或防止对将要 放回组织来源的生物中的组织的损伤(预防性应用)；和用于保存或 防止在运输或存储过程中对它们的损伤。这类应用以及其它用途的细 节在下面描述。术语“分离的组织”表示组织不位于生物内。在一些实 施方案中，组织是器官的全部或部分。术语“组织”和“器官”是根据它 们的通常和普通的意义使用的。尽管组织由细胞组成，应该理解，术 语“组织”指形成确定类型的结构材料的类似细胞的集合体。而且，器 官是特殊类型的组织。
本发明涉及用于在分离的组织中诱导停滞的方法，该方法包括： a)鉴定其中期望停滞的组织；以及b)将该组织暴露于有效量的氧拮 抗剂来诱导停滞。
本发明的组合物、方法和制造品可用于生物物质上，该生物物质 将被转移回到生物物质来源的(自体的)供体生物或不同的接受(异 源的)受试者中。在一些实施方案中，生物物质直接从供体生物获得。 在另一些实施方案中，在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物前，将生 物物质置于培养物中。在一些情况中，生物物质从在取出该生物物质 前实施了体外膜式人工氧合法的供体组织获得，体外膜式人工氧合法 是一种实施来帮助保存生物物质的技术。而且，方法包括将其中诱导 了停滞的生物物质施用或移植至活的接受生物。
在一些实施方案中，将要取回并然后移植的器官或组织暴露于氧 拮抗剂或其它活性化合物，同时仍然在供体受试者中。考虑在一些案 例中，将供体的脉管系统用于将器官或组织暴露于氧拮抗剂或其它活 性化合物。如果心脏仍然搏动或者泵、导管或注射器可用于施用氧拮 抗剂或其它活性化合物至脉管系统中来递送至器官或组织，可以进行 这种方法。
本发明的方法也涉及在分离的组织中诱导停滞，包括用氧拮抗剂 或产生低氧条件的活性停滞化合物孵育组织有效量的时间，用于该组 织进入停滞。
处于停滞状态或已经进行停滞的细胞可以在许多应用中使用。例 如，它们可以用于输注或移植(治疗性应用)；用于研究目的；用于 筛选检测来鉴别、表征或生产诱导停滞的其它化合物；用于检测从其 获得细胞的样品(诊断应用)；用于保存或防止对将要放回细胞来源 的生物中的细胞的损伤(预防性应用)；和用于保存或防止在运输或 存储过程中对细胞的损伤。这种应用以及其它用途的细节在下面描述。
本发明涉及用于在与生物分离的一种或多种细胞中诱导停滞的 方法，该方法包括：a)鉴定其中期望停滞的细胞；以及b)将所述细 胞暴露于有效量的氧拮抗剂或其它活性停滞化合物来诱导停滞。
考虑细胞可以是任何利用氧的细胞。细胞可以是真核或原核的。 在某些实施方案中，细胞是真核的。更特别地是，在一些实施方案中， 细胞是哺乳动物细胞。考虑用于本发明的哺乳动物细胞包括但不限于 来自以下的那些细胞：人、猴、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、猪、 狗、猫、白鼬、奶牛、绵羊和马。
而且，本发明的细胞可以是二倍体，但在一些案例中，细胞是单 倍体(性细胞)。而且，细部可以是多倍体、非整倍体或无核细胞。 细胞可以来自特殊的组织或器官，例如来自以下的组织或器官：心、 肺、肾、肝、骨髓、胰、皮肤、骨、静脉、动脉、角膜、血、小肠、 大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、子宫和脐带。而且， 细胞也可以表征为以下细胞类型之一：血小板、髓细胞、红血球、淋 巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、 骨骼肌细胞、内分泌细胞、神经胶质细胞、神经元、分泌细胞、屏障 功能细胞、收缩细胞(contractile cell)、吸收细胞、粘膜细胞、缘细 胞(来自角膜)、干细胞(全能性、多能性(pluripotent)或多潜能 性(multipotent))、未受精的或受精的卵母细胞或精细胞。
本发明也提供用于通过减少目标生物物质中的代谢需求、需氧 量、温度或它们的任意组合，来增加在不利条件下生物物质的存活力 和/或减少对其损伤的方法、组合物和仪器。在本发明的一些实施方案 中，生物物质的存活力通过提供给它有效量的保护性代谢剂来增强。 该试剂通过防止或减少对生物物质的损伤、阻止全部或部分的生物物 质死亡或衰老，和/或延长全部或部分的生物物质的寿命来增强存活 力，相对于不暴露于该试剂的生物物质。可替代地，在一些实施方案 中，试剂延长组织和/或生物的存活，否则所述的组织和/或生物在没 有该试剂时则将不会存活。
考虑，“保护性代谢剂”是能够可逆地改变暴露于或与其接触的生 物物质的新陈代谢或增强该生物质的存活力的物质或化合物。
在某些实施方案中，保护性代谢剂在受处理的生物物质中诱导停 滞；同时，在另外的实施方案中，保护性代谢剂本身不直接在受处理 的生物物质中诱导停滞。保护性代谢剂以及其它活性化合物可以增强 生物物质的存活力和/或减少对它的损伤而本身在所述生物物质中不 诱导停滞，而是通过减少细胞呼吸和对应的代谢活动至少于约50％的 氧消耗或二氧化碳产生的降低的程度。而且，这类化合物可以引起生 物物质响应损伤或疾病状态而更加快速、容易或有效地进入或达到停 滞，例如通过诱导生物物质达到预停滞状态。
存活力包括当物质处于不利条件-即，在可能有对生物物质不利 的和不可逆的损害或损伤的条件下时的存活力。不利的条件包括但不 限于：当环境中氧浓度降低时(低氧或无氧，例如在高海拔或在水下)； 当生物物质不能接收那些氧时(例如在缺血时)，这可以由以下因素 引起：i)由于血管阻塞(例如，心肌梗塞和/或中风)引起的减少血液 流向器官(例如，心脏、脑和/或肾脏)，ii)在心脏/肺旁路手术过程中 发生的体外血液分流(例如，其中心脏或脑组织由于心肺旁路手术而 受到损伤的“泵头(pumphead)综合征”)或iii)由于创伤引起的失 血(例如，出血性休克或手术)；体温过低，其中生物物质经受低于生 理学的温度，这是由于暴露于冷的环境或由于生物材料的低温状态， 这样其不能维持足够的生物材料的氧合；高温，其中生物材料经受超 过生理学的温度，这是由于暴露于热环境或例如由恶性发热引起的生 物材料的高温状态；过量重金属的病状，例如铁障碍(遗传性的以及 环境性的)如血色素沉着症、获得性铁超负荷、镰状细胞性贫血、青 少年血色病、饮食性血铁质沉着症、地中海贫血症、迟发性皮肤卟啉 症、高铁成红细胞性贫血、缺铁性贫血和慢性病性贫血。考虑，保护 性代谢剂是本发明某些实施方案中的氧拮抗剂。也考虑，在某些其它 实施方案中，氧拮抗剂不是保护性代谢剂。在本发明的其它实施方案 中，一种或多种化合物可用于增加或增强生物物质的存活力；可逆地 抑制生物物质的代谢和/或活性；减少生物物质的需氧量；减少或防止 在不利条件下对生物物质的损伤；防止或减少对生物物质的损害或损 伤；防止生物物质的老化或衰老，以及提供如整个申请中描述的关于 氧拮抗剂的治疗好处。考虑，涉及诱导停滞的实施方案也可应用于这 些其它实施方案。因此，关于停滞讨论的任何实施方案可根据这些其 它实施方案实施。
用于诱导停滞的活性化合物或任意这些其它实施方案可以导致 或提供它们的预期效果，在一些实施方案中，仅在它们在生物物质的 环境中时提供预期效果(即没有持续的效果)和/或它们可以提供这些 效果超过该生物物质不再暴露于它们后的24小时。而且，当使用活性 化合物的组合时，这也可以是这种情况。
在某些实施方案中，将生物物质暴露于一定量的氧拮抗剂或其它 活性化合物，其减少生物物质产生二氧化碳的速率或量至少2倍，而 且是约、至少约或至多约3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、 25-、30-、35-、40-、45-、50-、100-、200-、300-、400-、500-倍或更 多，或可源于其中的任何范围。可替代地，考虑本发明的实施方案可 以用约、至少约或至多约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多、或可源于其中 的任何范围的生物物质产生二氧化碳的速率或量的减少来讨论。在更 进一步的实施方案中，将生物物质暴露于一定量的氧拮抗剂或其它活 性化合物，其减少生物物质消耗氧的速率或量至少2倍，而且是约、 至少约或至多约3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、25-、30-、 35-、40-、45-、50-、100-、200-、300-、400-、500-倍或更多，或可源 于其中的任何范围。可替代地，考虑本发明的实施方案可以用约、至 少约或至多约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99％或更多，或可源于其中的任何范 围的生物物质消耗氧的速率或量的减少来讨论。在更进一步的实施方 案中，将生物物质暴露于降低至少10％，而且降低约、至少约、或至 多约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、99或100％或可源于其中的任何范围的运动或活动力的 量氧拮抗剂或其它活性化合物。和其它实施方案一样，这些特征和参 数与任何一种诱导进停滞状态的生物物质相关。因此，如果在生物的 心脏诱导停滞，这些参数将根据心脏而不是整个生物来评估。关于生 物，大概8倍量级的氧消耗的减少是一种称为“冬眠”的停滞。而且， 在本申请中应该理解，约1000-倍量级的氧消耗的减少可以认为是“滞 生”。应该理解，涉及停滞的本发明实施方案可以根据需要，在冬眠或 滞生水平上完成。应该理解“-倍减少”减少的量有关；例如，如果非冬 眠动物消耗800单位的氧，则冬眠动物消耗100单位的氧。
而且，在本发明的一些实施方案中，提供了方法用于减少细胞呼 吸，所述的细胞呼吸可以是或可以不是与达到停滞所需的一样高。在 本发明的方法中提供了约、至少约或至多约1、2、5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或 100％的氧消耗的减少。这也可以以任何细胞呼吸指标来表示和评估。
考虑可将生物物质暴露于一种或多种氧拮抗剂或其它活性化合 物多于一次。考虑，可将生物物质暴露于一种或多种活性化合物1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次，这表示当将生物物质暴露多 次时，其间有间歇期(就暴露于活性化合物来说)。
也考虑，可在有害损害或疾病状态的开始或进展之前、期间、之 后或它们的任意组合施用活性化合物。在某些实施方案中，用活性化 合物预处理生物物质足以增强存活力和/或减少有害损害或疾病损害 引起的损伤。将预处理定义为在有害损害或疾病损害开始或检出前， 将生物物质暴露于活性化合物。预处理之后，可以在伤害开始时或接 近时终止暴露，或在伤害开始之后继续暴露。
在某些实施方案中，将包括预先暴露于活性化合物(即预处理) 的方法用于处理这样的状况，在该状况中有害损害或疾病损害是1)预 定的或预先选择的，或2)预先预测有可能发生的。符合条件1的实 例包括但不限于，其中可能自发地或由操作导致出现失血的大外科手 术、其中血液的氧合作用可能受损害或其中血液的血管递送可能减少 (如在安装冠状动脉旁路嫁接(CABG)手术的环境中)的心肺旁路 手术，或在将供体器官移出用于输送和移植进需要器官移植的接受者 前处理器官供体中。符合条件2的实例包括，但不限于，其中损伤或 疾病发展的风险是固有的医学病症(例如在不稳定的心绞痛、血管成 形术后、出血性动脉瘤、出血性中风，大的创伤后或失血)，或其中 风险可以用医学诊断检测诊断的医学病症。
当暴露在有害损害或疾病损害开始或检测后发生来获得治疗效 果时，暴露于活性化合物可以增强存活力或减少损伤。暴露于活性化 合物可以是短暂的或长期的。暴露持续时间可以仅为达到停滞活动或 预停滞的指标(例如，血pCO2、pO2、pH、乳酸或硫血红蛋白水平 或体温)所需的时间一样长，或可以更长。在某些实施方案中，暴露 在生物受到创伤性损伤(包括医源性和/或非医源性损伤)后发生，并 且用于在整个生物或其中受损伤的组织中诱导停滞或预停滞，以便在 治疗前、治疗期间和/或治疗之后，防止损伤，例如局部缺血和再灌注 损伤或使其最小化。
在一个实施方案中，本发明包括保护哺乳动物免于遭受由手术 引起的细胞损伤的方法，其包括提供给哺乳动物足以诱导哺乳动物在 手术前进入预停滞的量的硫化氢或其它活性化合物。手术可以是可选 择的、经计划的或急救外科手术，例如心肺外科手术。硫化氢可以通 过本领域中可利用的任何手段，包括，例如由静脉内或通过吸入来施 用。
在另一个实施方案中，本发明包括保护哺乳动物免于遭受由疾病 或不利医学状况引起的细胞损伤的方法，其包括提供给哺乳动物足以 诱导哺乳动物在疾病或不利的医学状况开始或进展前进入预停滞或停 滞的量的硫化氢或其它活性化合物。该实施方案可用于多种不同疾病 和不利的医学状况，包括，例如不稳定的心绞痛、血管成形术后、动 脉瘤、出血性卒中或休克、创伤或失血。
在特别的实施方案中，本发明涉及通过提供给哺乳动物足以防止 动物出血死亡的量的硫化氢或其它活性化合物，来防止生物，例如哺 乳动物出血死亡或遭受由出血引起的不可逆的组织损伤的方法。在某 些其它的实施方案中，生物可以进入失血性休克，但不会由于过量出 血死亡。术语“流血”和“失血”可交换使用来指血液从血管的任何流出。 其包括但不限于，内出血和外出血、由损伤(其可能来自内部源或来 自外部物理源，例如来自枪击、刺伤、物理创伤等)引起的出血。
而且，本发明的另外实施方案涉及防止由失血或其它对细胞或组 织氧合作用的缺少，例如缺少足够的血液供应引起的死亡或不可逆的 组织损伤。这可以是例如，实际的血液丧失引起，或可能是由防止细 胞或组织得到灌注(例如再灌注损伤)、引起血液至细胞或组织的阻 碍、局部或整体地降低生物中的血压、减少血液中携带的氧的量或减 少血液中氧携带性细胞的数目的状况或疾病的结果。可能涉及的状况 和疾病包括但不限于，血凝块和栓塞、囊肿、生长(growth)、肿瘤、 贫血(包括镰状细胞性贫血)、血友病、其它血凝固疾病(例如，冯·威 利布兰德病，ITP)和动脉粥样硬化。这些状况和疾病也包括由于损 伤、疾病或状况，对细胞或组织产生基本低氧或无氧状况的那些。
在一些案例中，将亚致死总剂量或非致死总剂量施用给生物物 质。如上面讨论的，关于在不是整个生物的生物物质中诱导停滞，“亚 致死总剂量”表示多次施用活性化合物的量，其总体少于将引起至少大 部分细胞在一次施用的24小时内死亡的活性化合物的量的一半。在其 它实施方案中，将有效量表征为氧拮抗剂或其它活性化合物的近致死 剂量。同样，“近致死总剂量”表示多次施用氧拮抗剂或其它活性化合 物的量，其在将引起至少大部分细胞在一次施用的24小时内死亡的活 性化合物的量的25％内。而且，“超致死总剂量”表示多次施用活性化 合物的量，其至少为将引起至少大部分细胞(或整个生物)在一次施 用的24小时内死亡的活性化合物的量的1.5倍。考虑可以施用多次剂 量以便在整个生物中诱导停滞。“亚致死总剂量”、“近致死总剂量”和 “超致死总剂量”的定义可以基于前面讨论的用于整个生物中停滞的单 独剂量来推断。
可将生物物质暴露于多于一种氧拮抗剂或其它活性化合物或与 其接触。可将生物物质暴露于至少一种活性化合物，包括2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更多氧拮抗剂或其它活性化合物，或可源于其中的 任何范围。对于多种活性化合物，术语“有效量”指活性化合物的总量。 例如，可将生物物质暴露于第一种活性化合物并然后将其暴露于第二 种活性化合物。可替代地，可将生物物质同时或以重叠的方式暴露于 多于一种的活性化合物。此外，考虑可将多于一种活性化合物包含或 混合在一起，例如包含或混合于生物物质暴露的单个组合物中。因此 考虑到，在一些实施方案中，在本发明的组合物、方法和制造品中采 用活性化合物的组合。
可通过吸入、注射、导管插入、浸渍、灌洗、灌注、局部应用、 吸收、吸附或经口施用，给生物物质提供或将其暴露于活性化合物。 而且，可以通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关 节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、鞘内、玻璃体内、阴道内、 直肠内、表面、瘤内、肌内、腹膜内、眼内、皮下、结膜下、囊内、 经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、表面、局部、通过吸入、通过 注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注、经由导管或经由灌 洗施用至生物物质，给生物物质提供或将其暴露于活性化合物。
本发明的方法和装置涉及保护剂，该保护剂在一些实施方案中是 氧拮抗剂。在更进一步的实施方案中，氧拮抗剂是还原剂。而且，氧 拮抗剂可被表征为硫属化物化合物。应该理解，活性化合物也可以是 保护剂。而且，只要其实现本发明的目标，任何硫属化物化合物都可 以认为是活性化合物，而不管其是否是氧拮抗剂。
在某些实施方案中，硫属化物化合物包括硫，而在另外的实施方 案中，其包括硒、碲或钋。在某些实施方案中，硫属化物化合物含有 一种或多种暴露的硫化物基团。考虑，这种硫属化物化合物含有1、2、 3、4、5、6或更多的暴露的硫化物基团，或可源于其中的任何范围。 在特别的实施方案中，这种含硫化合物是CS2(二硫化碳)。
而且，在本发明的一些方法中，通过将细胞暴露于具有以下化学 结构(称为式I)的还原剂在细胞中诱导停滞：
其中X是N、O、Po、S、Se或Te；
其中Y是N或O；
其中R1是H、C、低级烷基、低级醇或CN；
其中R2是H、C、低级烷基、低级醇或CN；
其中n是0或1；
其中m是0或1；
其中k是0、1、2、3或4；以及，
其中p是1或2。
术语“低级烷基”和“低级醇”是根据它们的通常意义使用的，并且 符号是用于指化学元素的符号。这种化学结构将称作“还原剂结构”， 并且具有这种结构的任何化合物将称为还原剂结构化合物。在另外的 实施方案中，在还原剂结构中k是0。而且，在其它实施方案中，R1 和/或R2基团可以是胺或低级烷基胺。在其它实施方案中，R1和/或 R2可以是短链醇或短链酮。而且，R1和R2可以是线性或支链的桥和/ 或该化合物可以是环状化合物。在更进一步的实施方案中，X也可以 是卤素。术语“低级”意思是指1、2、3、4、5或6个碳原子或可源于 其中的任何范围。而且，R1和/或R2可以是其它小有机基团，包括C2-C5 酯、酰胺、醛、酮、羧酸、醚、腈、酐、卤化物、酰基卤、硫化物、 砜、磺酸、亚砜和/或硫醇。关于R1和/或R2，明确地考虑这些取代。 在某些其它的实施方案中，R1和/或R2可以是短链形式的上面讨论的 小有机基团。“短链”表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12 个碳分子，或可源于其中的任何范围。
考虑在一些案例中，所述的还原剂结构化合物可以是硫属化物化 合物。在某些实施方案中，硫属化物化合物具有烷基链，其含有暴露 的硫属化物。在另外的实施方案中，所述的硫属化物化合物具有一旦 为生物物质吸收则变得暴露的硫属化物。在这方面，所述的硫属化物 化合物类似于作为氧拮抗剂的前药。因此，在将生物物质暴露于所述 硫属化物化合物后，该化合物上的一个或多个硫、硒、氧、碲、钋或 116号元素(ununhexium)分子变得可以利用。在该情况中，“可利 用”表示硫、硒、氧、碲、钋或116号元素将保持负电荷。
在某些实施方案中，硫属化物是盐，优选是其中硫属元素是-2氧 化态的盐。本发明的实施方案包含的硫化物盐包括但不限于，硫化钠 (Na2S)、硫氢化钠(NaHS)、硫化钾(K2S)、硫氢化钾(KHS)、 硫化锂(Li2S)、硫化铷(Rb2S)、硫化铯(Cs2S)、硫化铵((NH4)2S)、 硫氢化铵((NH4)HS)、硫化铍(BeS)、硫化镁(MgS)、硫化钙(CaS)、 硫化锶(SrS)、硫化钡(BaS)等。类似地，本发明的实施方案包含， 但不限于对应的硒化物和碲化物盐。特别考虑，本发明包括具有可药 用载体或制备为可药用制剂的含有硫属化物盐(是盐的硫属化物化合 物)的组合物。在进一步的实施方案中，还原剂结构化合物选自H2S、 H2Se、H2Te和H2Po。在一些案例中，式(I)的还原剂结构具有是S 的X。在另外的案例中，X是Se，或X是Te，或X是Po，或X是O。 此外，在一些实施方案中，还原剂结构中的k是0或1。在某些实施 方案中，还原剂结构化合物是二甲亚砜(DMSO)、二甲硫醚(DMS)、 一氧化碳、甲硫醇(CH3SH)、巯基乙醇、硫氰酸盐、氰化氢、甲硫 醇(MeSH)或CS2。在特殊的实施方案中，氧拮抗剂是H2S、H2Se、 CS2、MeSH或DMS。这些分子的大小量级的化合物是特别考虑的(即， 在它们的分子量平均值的50％内)。
在某些实施方案中，采用含有硒的化合物例如H2Se。在本发明 的一些实施方案中，H2Se的量可以在十亿分之1-1000份的范围内。 进一步考虑，在含硫化合物的内容中讨论的任何实施方案可以用含硒 的化合物实现。这包括用对应的硒原子替代含硫分子中的一个或多个 硫原子。
本发明的进一步方面包含由式IV表示的化合物：
其中：
X是N、O、P、Po、S、Se、Te、O-O、Po-Po、S-S、Se-Se或Te-Te；
n和m独立地是0或1；以及
其中R21和R22独立地是氢、卤素、氰基、磷酸酯、硫基、烷基、 链烯基、炔基、烷氧基、氨基烷基、氰基烷基、羟基烷基、卤代烷基、 羟基卤代烷基、烷基磺酸、硫代磺酸、烷基硫代磺酸、硫代烷基、烷 硫基、烷基硫代烷基、烷基芳基、羰基、烷基羰基、卤代烷基羰基、 烷基硫代羰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、烷基氨基硫代羰基、卤代 烷基羰基、烷氧基羰基、氨基烷硫基、羟基烷硫基、环烷基、环烯基、 芳基、芳氧基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、磺酸、磺酸烷基酯、 硫代硫酸酯或磺酰氨基；以及
Y是氰基、异氰基、氨基、烷基氨基、氨基羰基、氨基羰基烷基、 烷基羰基氨基、脒基、胍、肼基、酰肼、羟基、烷氧基、芳氧基、杂 芳氧基、环烷氧基、羰基氧基、烷基羰基氧基、卤代烷基羰基氧基、 芳基羰基氧基、羰基过氧基、烷基羰基过氧基、芳基羰基过氧基、磷 酸酯、烷基磷酸酯、磺酸、磺酸烷基酯、硫代硫酸酯、硫代次磺酰基、 磺酰胺、-R23R24，其中R23是S、SS、Po、Po-Po、Se、Se-Se、Te或 Te-Te，以及R24是如在此关于R21的定义，或者Y是
其中X、R21和R22是如在本文中定义的。
而且，考虑在本发明的一些实施方案中，给生物物质提供前体化 合物，这些前体化合物通过暴露于生物物质，例如通过化学或酶促手 段而变成式I或IV化合物的活性形式。而且，可将化合物作为该化合 物的盐、以游离基的形式或带负电荷、带正电荷或带多个电荷的形式 提供给生物物质。一些化合物既符合式I又符合式IV结构，并且在该 情形中，短语“式I或式IV”的使用无意于暗示排除这类化合物。
在某些实施方案中，由式I或式IV的结构确定的化合物也被表 征为氧拮抗剂、保护性代谢剂或其前体、前药或盐。进一步考虑，所 述的化合物本身不必表征或本身证明为用于本发明的化合物，只要其 实现本发明的一个特殊的方法。在一些其它的实施方案中，化合物可 以认为是硫属化物化合物。特别考虑，在本发明的方法、组合物和仪 器中，由式I或式IV的结构确定或在本公开内容中提出的任何化物可 代替氧拮抗剂使用或与氧拮抗剂组合使用；类似地，关于具有式I或 式IV的任意结构所讨论的或在本公开中另外提出的任意实施方案可 以代替氧拮抗剂使用或与氧拮抗剂组合使用。而且，由式I或式IV的 结构确定或在本公开内容中陈述的任何化物可以与在此描述的任何氧 拮抗剂或任何其它活性化合物组合。也考虑，在本发明的方法、组合 物和其它制造品中，这些化合物的任意组合可以一起、连续(重叠或 不重叠)和/或以重叠的连续方式(开始施用一种化合物并且在其完成 之前，又开始施用另一化合物)提供或配制，来获得在此陈述的期望 效果。
在某些实施方案中，提供了多于一种具有式I或式IV结构的化 合物。在某些实施方案中，采用具有相同式(即式I或式IV)结构的 多种不同化合物，而在另外的实施方案中，当采用多种不同化合物时， 它们来自不同的式。
在特别的实施方案中，考虑使用多种活性化合物，其中一种化合 物是二氧化碳(CO2)。考虑在一些实施方案中，至少一种其它化合 物也是式I和/或是IV化合物。在某些案例中，将二氧化碳与H2S或 H2S前体组合提供给生物物质(一起、连续或以重叠的连续方式)。
生物物质可以暴露的二氧化碳的量是约、至少约或至多约2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30％或更多，或可源于其中 的任何范围。在某些实施方案中，所述的量用ppm表示，例如约、至 少约或至多约350、400、500、600、700、800、900、1000、1100、 1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、 2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、 3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、 4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、 7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、 16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、 25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、 34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、 43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000、60000、 70000、80000、90000、100000、110000、120000、130000、140000、 150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、 230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000 或更多ppm，或可源于其中的任何范围，以及以摩尔当量表示。考虑 这些浓度可应用于气体形式的任何其它活性化合物。
在其它实施方案中，特别考虑活性化合物是硫化钠、硫代甲醇钠、 巯乙胺、硫氰酸钠、巯乙胺-S-磷酸钠盐或四氢噻喃-4-醇。在另外的实 施方案中，活性化合物是二甲亚砜、硫代乙酸、硒脲、2-(3-氨丙基)- 氨基乙硫醇-二氢-磷酸酯、2-巯基-乙醇、巯基乙醚(thioglycolicether)、 硒化钠、甲亚磺酸钠、硫脲或二甲硫醚。特别考虑，这些化合物或在 此讨论的包括任何具有式I、II、III或IV的化合物在内的任何其它化 合物可以以约、至少约或至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、 129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、 141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、 153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171，172、173、174、175、176、 177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、 201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、 213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、 237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、 249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、 261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、 273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、 285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、 297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、 309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、 321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、 333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、 345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、 357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、 369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、 381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、 393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、 405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、 417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、 429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、 441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、 453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、 465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、 477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、 489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、 501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、 513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、 525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、 537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、 549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、 561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、 600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、 1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、 2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、 3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、 4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、 5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、 6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、 7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、 8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、 9700、9800、9900、10000mM或mmol/kg(生物物质)或可源于其中 的任何范围的量提供给或施用至生物物质。
特别考虑，由名称或结构确定的活性化合物的任意子集可用于方 法、组合物和制造品中。也特别考虑，可以放弃这些化合物的任意子 集，其不构成本发明的实施方案。本发明也涉及含有治疗上有效量的 一种或多种活性化合物的药物组合物。当然，将这类药物组合物配制 成可药用组合物。例如，所述的组合物可以包括可药用稀释剂。
在某些实施方案中，药物组合物含有有效剂量的活性化合物，以 在施用给患者时，提供Cmax或稳态的活性化合物血浆浓度，以产生 治疗上有效的好处。在某些实施方案中，要达到的Cmax或稳态血浆 浓度是约、至少约或至多约0.01、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、 100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、 220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、 340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、 450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、 570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、 690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、 810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、 930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、 7000、8000、9000、10000(M或更多，或可源于其中的任何范围。在 某些实施方案中，例如对于H2S，期望的Cmax或稳态血浆浓度是在 约10μM至约10mM之间、约100μM至约1mM之间或约200μM 至约800μM之间。可以考虑合适的手段并评估已经在血液中的化合 物，例如硫的水平。
在某些实施方案中，药物组合物提供有效剂量的H2S，以在施用 给患者时提供在约10μM至约10mM之间、约100μM至约1mM之 间，或约200μM至约800μM之间的Cmax或稳态血浆浓度。在给予 硫化氢与给予硫化物盐的关系方面，在典型的实施方案中，该盐的给 药是基于施用与H2S的给药大概相同的硫当量。将考虑合适的手段并 用来评估已经在血液中的硫的水平。
在某些实施方案中，组合物含有气体形式的一种或多种上面指定 的活性化合物。在另一实施方案中，组合物包含一种或多种这些化合 物的盐。在一个特别的实施方案中，药物组合物包含气体形式的式I 或IV或式I或IV的盐。在本发明的一些方面特别考虑H2S的气体形 式或盐。考虑提供给生物物质的气体的量是约、至少约或至多约5、 10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、 240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、 360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、 480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、 600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、 720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、 840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、 960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、 1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、 2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、 3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、 4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、 12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、 21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、 30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、 39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、 48000、49000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、110000、 120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、 200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、 280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、 360000、370000、380000、390000、400000或更多ppm，或可源于其 中的任何范围。可替代地，气体的有效量可表示为关于在生物物质暴 露的空气中的浓度，为约、至少约或至多约0.001、0.002、0.003、0.004、 0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、 0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99或100％，或可源于其中的任何范围。而且， 考虑到对于一些实施方案，提供给生物物质的气体的量是约、至少约 或至多约十亿分之5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、 70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、 320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、 440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、 560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、 680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、 800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、 920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、 1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、 2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、 3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、 4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、 9000、10000份(ppb)或可源于其中的任何范围。在特别的实施方案中， 提供给生物物质的硒化氢的量是在该量级大小上。
在本发明的一些实施方案中，药物组合物是液体。如在别处讨论 的，组合物可以是具有溶解或鼓泡进该组合物中的相关化合物的液体。 在一些情形中，药物组合物是医用气体。根据美国食品和药品管理局， “医用气体”是这样的气体：该气体是联邦食品、药品及化妆品法(“法 案”)(21U.S.C.§321(g))的§201(g)(1)含义内的药品，并且根据该法 案的§503(b)(1)(A)(21U.S.C.§353(b)(1)(A))，要求处方配药。这样， 这些医用气体需要合适的FDA标签。医用气体包括至少一种活性化合 物。
本发明进一步包含仪器和制造品，其包含包装材料和包含于包装 材料内的活性停滞化合物，其中包装材料包含表明其可以用于在体内 的生物物质中诱导停滞的标签。
在一些实施方案中，仪器或制造品进一步包含药用稀释剂。在特 别的其它实施方案中，仪器或制造品具有缓冲剂。所述的活性化合物 在第一种密封的容器中提供，而所述的可药用稀释剂在第二种密封的 容器中提供。在其它实施方案中，所述装置或物品进一步具有用于混 合活性化合物和稀释剂的说明书。此外，可将活性化合物重构来实现 本发明的任何方法，例如用于在体内的生物物质中诱导停滞。考虑任 何标签将具体说明要获得的结果和化合物用于需要该结果的患者的应 用。
本发明也涉及制造品，其包括包装在一起的以下物质：活性化合 物、使用所述活性停滞化合物的说明书，所述说明书包括：(a)鉴别 需要停滞处理的体内组织；和(b)施用有效量的活性化合物至所述 的体内生物物质。
在本发明的进一步实施方案中，存在含有医用气体的制造品，其 包括活性化合物和标签，标签包括用于在生物物质中诱导停滞或用于 本发明的任何其它方法的细节或用法和施用。
本发明也涉及试剂盒和使用这些试剂盒的方法。在一些实施方案 中，存在用于递送活性化合物至需要停滞处理或要求保护的发明的任 何其它处理的组织位点的试剂盒，所述的试剂盒包括：覆盖物(drape)， 适用于对组织位点形成密封的包(envelope)；含有氧拮抗剂的容器； 以及覆盖物中的一个入口，其中含有活性化合物的该容器与该入口连 通。在某些实施方案中，试剂盒在覆盖物中包括一个出口，其中该出 口与负压源连通。在一些情形中，该覆盖物包含弹性材料和/或具有覆 盖该覆盖物边缘的压敏粘合剂。可以让该出口与负压源处于流体连通， 所述的负压源可以是或可以不是真空泵。在出口和负压源之间也可以 有柔性导管连通。在一些实施方案中，试剂盒包括一个小罐(canister)， 其可以是可拆卸的或可以不是可拆卸的，与出口和负压源之间流体连 通。考虑容器包含与入口进行气体连通的活性化合物。在某些实施方 案中，容器包括是气体或液化气体的活性化合物。试剂盒也可以包含 与含有氧拮抗剂的容器和入口之间连通的蒸发器。而且，其可以具有 与含有活性化合物的容器连通的回流出口。
在特别的实施方案中，试剂盒中的活性化合物是一氧化碳、二氧 化碳、H2Se和/或H2S。在某些实施方案中，试剂盒或方法应用的组织 位点受到伤害。
而且，通常应该理解，在此作为氧拮抗剂讨论的任何化合物可以 以前药的形式提供给生物物质，这表示生物物质或该生物物质环境中 的其它物质将前药变成其活性形式，即变成氧拮抗剂。考虑术语“前体” 涵盖被认为是“前药”的化合物。
氧拮抗剂或其它活性化合物可以是或可以作为气体、半固体液体 (例如凝胶或糊)、液体或固体提供。考虑可将生物物质暴露于多于 一种这类活性化合物和/或多于一种状态的该活性化合物。而且，可配 制活性化合物用于特殊的施用模式，如在此讨论的。在某些实施方案 中，活性化合物是在用于静脉内递送的可药用制剂中。
在某些实施方案中，活性化合物是气体。在特别的实施方案中， 气体活性化合物包括一氧化碳、二氧化碳、氮气、硫、硒、碲或钋， 或其混合物。而且，特别考虑，活性化合物是气体形式的硫属化物化 合物。在一些实施方案，活性化合物是在含有多于一种气体的气体混 合物中。在一些实施方案中，其它气体是无毒的和/或非活性气体。在 一些实施方案中，其它气体是惰性气体(氦、氖、氩、氪、氙、氡或 118号元素(ununoctium))、氮气、一氧化二氮、氢气或其混合物。 例如，非活性气体可以简单地是构成“室内空气”的混合物，其为氮气、 氧气、氩和二氧化碳，以及痕量的其它分子例如氖、氦、甲烷、氪和 氢气的混合物。尽管典型的样品可能含有约78％的氮气、21％的氧气、 0.9％的氩和0.04％的二氧化碳，但每种气体的精确量是变化的。考虑 在本发明的环境中，“室内气体”是含有约75-约81％的氮气、约18- 约24％的氧气、约0.7至约1.1％的氩以及约0.02％-约0.06％的二氧 化碳的混合物。可以在施用或暴露于生物物质前，首先将气体活性化 合物用无毒性和/或非反应性气体稀释。额外地或可替代地，可在施用 或暴露于生物物质前将任何气体活性化合物与室内空气混合，或可将 化合物施用或暴露于室内空气中的生物物质。
在一些情形中，气体混合物也含有氧气。在本发明的其它实施方 案中，活性化合物气体与氧气混合形成氧气(O2)混合物。特别考虑 的是其中所述氧气混合物中氧气的量少于该混合物中所有其它气体的 总量的氧气混合物。
在一些实施方案中，活性化合物是一氧化碳，并且一氧化碳的量 大约等于或超过氧气混合物中氧气的任何量。在特别的实施方案中， 将一氧化碳用于无血生物物质。术语“无血生物物质”指其氧合作用不 依赖于、或不再依赖于脉管系统的细胞和器官，例如用于移植的器官。 优选地，气氛将是100％的CO，但是对本领域技术人员明显的是， CO的量可以用不是氧的气体平衡，使得可利用的氧的量减少至阻止 细胞呼吸的水平。在该方面，一氧化碳与氧的比率优选是85∶15或更 高、199∶1或更高或399∶1或更高。在某些实施方案中，该比率是约、 至少约或至多约1∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1、60∶1、 65∶1、70∶1、75∶1、80∶1、85∶1、90∶1、95∶1、100∶1、110∶1、120∶1、 130∶1、140∶1、150∶1、160∶1、170∶1、180∶1、190∶1、200∶1、210∶1、 220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1、300∶1、 310∶1、320∶1、330∶1、340∶1、350∶1、360∶1、370∶1、380∶1、390∶1、 400∶1、410∶1、420∶1、430∶1、440∶1、450∶1、460∶1、470∶1、480∶1、 490∶1、500∶1或更多，或可源于其中的任何范围。
在更进一步的实施方案中，上面的数字适合于一氧化碳与氧和一 种或多种其它气体的混合物的比率。在一些情形中，考虑所述的其它 气体是非活性气体，例如氮气(N2)。因此，在本发明的其它实施方 案中，上面的数字应用于可用于本发明的方法和仪器的一氧化碳与氧 气和氮气的组合(O2/N2)的比率。因此，应该理解可能存在或可能不 存在其它气体。在一些实施方案中，CO：氧气的比率用一种或多种其 它气体(非一氧化碳和非氧气)平衡。在特别的实施方案中，CO：氧 气的比率用氮气平衡。在更进一步的实施方案中，CO的量是CO相 对于室内空气的比率，如由上面的数字描述的。
在一些情形中，一氧化碳的量是相对于氧气的量，而在另外的情 形中，其为绝对量。例如，在本发明的一些实施方案中，氧气的量是 以“百万分之份数(ppm)”为单位，其为在20℃和一个大气压的标准 温度和压力下的一百万份空气中氧气体积份数的测量，其中气体体积 的平衡用一氧化碳补足。在这方面，以每百万用一氧化碳平衡的氧气 的份数计，一氧化碳与氧气的量是相关的。考虑生物物质暴露或孵育 的气氛可以是至少百万分之0、50、100、200、300、400、500、1000 或2000(ppm)的用一氧化碳平衡的氧气，并且在一些情形中是用与 非毒性和/或非活性气体混合的一氧化碳平衡的氧气。术语“环境”指生 物物质的直接环境，即其直接接触的环境。因此，生物物质必须直接 暴露于一氧化碳，密封的一罐一氧化碳与生物物质处于相同室内并且 认为是在根据本发明的“环境”中孵育是不充分的。可替代地，气氛可 以以kPa表示。通常认为在1个大气压下1百万份数＝101kPa。在本 发明的实施方案中，生物物质在其中孵育或暴露的环境是约、至少约 或至多约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、 0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、 0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、 0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、 0.5、0.90、0.95、1.0kPa或更多O2，或可源于其中的任何范围。如上 描述的，这些水平可以用一氧化碳和/或其它非毒性和/或非活性气体 平衡。而且，气氛可以用以kPa为单位的CO水平定义。在某些实施 方案中，气氛是约、至少约或至多约1、5、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、101、101.3kPa CO或可源于其中的任何范围。在特别的实施方案中，分压是约或至 少约85、90、95、101、101.3kPa CO或可源于其中的任何范围。
在本发明的实施方案中，样品孵育或暴露于一氧化碳的时间量也 可以不同。在一些实施方案中，将样品孵育或暴露于一氧化碳约、至 少约或至多约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多分钟 和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24小时，和/或1、2、3、4、5、6，7、 8、9、10或更多天。
在一些实施方案中，本发明涉及含有一种或多种活性化合物的组 合物和制造品。在某些实施方案中，组合物具有一种或多种作为气体 的这些活性化合物，使该气体在组合物中鼓泡，使得在将生物物质暴 露于该组合物时该组合物提供化合物至该生物物质。这些化合物可以 是凝胶剂、液体或其它半固体物质。在某些实施方案中，溶液具有作 为通过它鼓泡的气体的氧拮抗剂。考虑气体中鼓泡的量将提供合适量 的化合物至暴露于该溶液的生物物质。在某些实施方案中，鼓泡进入 溶液中的气体的量是有效提供给生物物质的量的约、至少约或至多约 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、100倍或更多倍，或可源于其中的任何范围。
在本发明的一些实施方案中，将生物物质暴露于密闭容器中的气 体。在一些案例中，密闭容器可以保持特殊的环境或按所期望的调节 环境。所述的环境指生物物质暴露的氧拮抗剂的量和/或该环境的温 度、气体组成或压力。在一些情形中，在暴露于氧拮抗剂或其它活性 化合物之前、期间或之后，将生物物质置于真空下。而且，在其它情 形中，在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物后将生物物质暴露于含氧 正常的环境。在某些实施方案中，本发明包括用于诱导停滞或保护生 物物质免受损伤或免于疾病的方法，该方法包括提供一种活性化合物 给生物物质，联合提供另一种诱导停滞的活性化合物或环境条件给该 生物物质。这种联合处理以任何顺序，例如同时或连续发生。在某些 实施方案中，将一种活性化合物提供给生物物质，并将该生物物质随 后置于缺氧条件下例如，5％的O2下，或将其随后暴露于递增缺氧的 条件下，例如5％O2、随后4％O2、3％O2、2％O2、1％O2或无O2 条件，或这些条件的任意次序组合的条件下。
而且，在其它实施方案中，含有生物物质的环境循环至少一次至 不同量或浓度的氧拮抗剂或其它活性化合物，其中量或浓度的差异是 至少一个百分数的差别。环境可以在一种或多种量或浓度的氧拮抗剂 或其它活性化合物之间来回循环，或其可以逐渐增加或降低那种化合 物的量或浓度。在一些情形中，不同的量或浓度是在约0和99.9％的 生物物质最初暴露的氧拮抗剂或其它活性化合物的量或浓度之间。考 虑，量和/或浓度的差异是约、至少约或至多约0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多，或可 源于其中的任何范围。
本发明的方法也可以包括让生物物质处于受控温度环境下的步 骤。在某些实施方案中，将生物物质暴露于是“非生理温度环境”的温 度，该温度指生物物质在其中不能存活多于96小时的温度。受控温度 环境可以具有约、至少约或至多约-210、-200、-190、-180、-170、-160、 -150、-140、-130、-120、-110、-100、-90、-80、-70、-60、-50、-40、 -30、-20、-10、-5、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、 139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、 163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、 175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、 187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、 199、200℃或更高，或可源于其中的任何范围的温度。也可以将生物 物质暴露于室温下的氧拮抗剂或其它活性化合物，室温表示在约20℃ 和约25℃之间的温度。此外，考虑生物物质达到所讨论的任何量或量 的范围的核心温度。
考虑可让生物物质在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物之前、期 间或之后接受非生理温度环境或受控温度环境。此外，在一些实施方 案中，让生物物质接受非生理温度环境或受控温度环境约一分钟至约 一年之间的一段时间。时间量可以是约、至少约或至多约30秒、1、2、 3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月、1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年以及 可源于其中的任何组合或范围。而且，也可以有相对于降低的温度而 增加环境温度的步骤。
而且，考虑可以在其中温度受到控制的过程期间改变或循环所述 的温度。在一些实施方案中，在将生物物质置于具有氧拮抗剂或其它 活性化合物的环境前，可首先将它的温度降低，而在另外的实施方案 中，可以通过将生物物质置于低于其温度的、具有活性化合物的环境 中，将该生物物质冷却。生物物质和/或环境可以逐渐冷却或加热，这 样生物物质或环境的温度开始处于一种温度，但然后达到另一温度。
本发明的方法也可以包括让生物物质处于受控压力环境下的步 骤。在某些实施方案中，将生物暴露于低于该生物物质通常所处的压 力的压力下。在某些实施方案中，让生物物质接受“非生理压力环境”， 其指生物物质在其中不能存活多于96小时的压力。受控压力环境可以 具有约、至少约或至多约10-14、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、 10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、0.2、0.3、0.4或0.5个大气 压或更大，或可源于其中的任何范围的压力。
考虑可让生物物质在暴露于活性化合物之前、期间或之后接受非 生理压力环境或受控压力环境。此外，在一些实施方案中，让生物物 质接受非生理压力环境或受控压力环境约一分钟至约一年之间的一段 时间。时间量可以是约、至少约或至多约30秒、1、2、3、4、5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5周、1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年，以及可源于其 中的任何组合或范围。
而且，考虑可以在其中压力受到控制的过程期间改变或循环所述 的压力。在一些实施方案中，在将生物物质置于具有活性化合物的环 境前，可首先将其暴露的压力降低，而在另外的实施方案中，在暴露 于活性化合物后将生物物质置于压力下。压力可以逐渐降低，这样环 境的压力开始处于一种压力，但随后在10、20、30、40、50、60秒、 1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24小时和/或1、2、3、4、5、6、7天或更久， 或可源于其中的任何组合或范围内达到另一种压力。在某些实施方案 中，方法包括调节环境的氧水平或将生物材料从具有氧的环境移走。 可操作地是，将生物材料暴露于其中氧气减少或缺少的环境中，可模 拟将生物物质暴露于氧拮抗剂。考虑在本发明的一些实施方案中，在 其中生物物质的环境是缺氧或无氧的条件下，将生物物质暴露于或给 其提供活性化合物，如下面进一步详细描述的。这可以是有意的或无 意的。因此，在本发明的一些实施方案中，有意将生物物质置于无氧 或低氧的环境中或置于造成无氧或低氧的环境中。在其它实施方案中， 生物物质处于由无意的情况引起的这种条件下，例如，如果生物物质 是处于局部缺血或潜在缺血状况下时。因此，考虑在一些情形中，在 缺少活性化合物时缺氧或无氧条件将损伤所述物质。
在本发明的某些方法中，也存在评估在其中诱导停滞的生物物质 中的氧拮抗剂和/或氧化磷酸化水平的步骤。而且，在本发明的一些实 施方案中，存在评估生物物质中通常发生的细胞代谢的水平的步骤。 在一些情形中，测量生物物质中活性化合物的量和/或评估生物物质中 温度的降低。而且，在本发明的一些方法中，评价一种或多种治疗效 果的程度。
在某些其它实施方案中，活性化合物和/或环境变化(温度、压 力)对生物物质的任何毒性效果受到监测或控制。考虑可以通过改变 活性化合物的水平、量、持续时间或频率和/或生物物质暴露的环境的 变化来控制毒性。在某些实施方案中，所述的改变是减少，而在某些 其它实施方案中，所述的改变是增加。考虑熟练的技术人员知道许多 评价生物物质中的毒性效果的方法。
本发明方法的其它可选步骤包括鉴定合适的活性化合物；诊断患 者；在施用或给患者开活性化合物前，考虑患者的历史和/或对患者进 行一种或多种检测。
本发明的组合物、方法和制造品可用于将被转移回到生物物质来 源的(自体的)供体生物中或不同的接受(异源的)受试者的生物物 质上。在一些实施方案中，生物物质直接从供体生物获得。在另一些 实施方案中，在暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物前将生物物质置于 培养物中。在一些情况中，生物物质从在取出该生物物质前实施了体 外膜式人工氧合法的供体组织获得，体外膜式人工氧合法是一种实施 来帮助保存生物物质的技术。而且，方法包括将其中诱导了停滞的生 物物质给予或移植至活的接受生物。
本发明的方法也涉及在体内的生物物质中诱导停滞，包括用氧拮 抗剂或产生低氧条件的其它活性化合物孵育生物物质有效量的时间， 用于使该组织进入停滞。
此外，本发明的其它实施方案包括减少体内生物物质中的氧需求 的方法，该方法包括让生物物质与有效量的氧拮抗剂或其它活性化合 物接触，以减少它们的氧需求。考虑氧需求相对于不暴露于或不再暴 露于氧拮抗剂或其它活性化合物的生物物质细胞或来自生物物质的代 表性细胞样品的氧需求量，减少约、至少约或至多约1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99或100％，或可源于其中的任何范围。
本发明的其它方面涉及用于保藏体内生物物质的方法，该方法包 括暴露体内生物物质于有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物，来体内 保藏生物物质。
本发明也涉及延缓或减少生物上或在生物内的创伤的影响的方 法，该方法包括暴露有创伤风险的生物物质于有效量的氧拮抗剂或其 它活性化合物。
在本发明的其它方面，存在用于在患者中治疗或预防出血性休克 的方法，该方法包括暴露患者于有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。 可替代地，在一些实施方案中，方法防止由出血和/或出血性休克引起 的患者中的致死率。在这类防止患者出血死亡或防止出血患者中的致 死率的方法中，步骤包括暴露患者于有效量的氧拮抗剂或其它活性化 合物。在某些实施方案中，特别考虑氧拮抗剂是硫属化物化合物例如 H2S。
也包括用于减少生物中的心率的方法作为本发明的部分。这类方 法涉及用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触生物样品或生物。
本发明的一个实施方案涉及在哺乳动物中诱导冬眠的方法，该方 法包括用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触哺乳动物。
在另一个实施方案中，存在麻醉生物的方法，该方法包括将在其 中期望麻醉的生物物质暴露于有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。 考虑所述的麻醉可以类似于局部或全身麻醉。
本发明进一步包括保护哺乳动物不受放射治疗或化疗伤害的方 法，该方法包括在放射治疗或化疗前或期间，用有效量的氧拮抗剂或 其它活性化合物接触所述哺乳动物。关于局部施用癌疗法，特别考虑 也可将氧拮抗剂或其它活性化合物局部施用至受到影响的器官、组织 和/或细胞。在某些实施方案中，方法可用于防止或减少化疗患者中的 脱发。考虑这样的患者可能已经接受了化疗或是化疗的候选人。在特 别的情形中，考虑将活性化合物作为局部用凝胶提供给患者，应用于 预期出现或存在脱发的地方。
本发明也覆盖减少生物物质的氧需求，这意思是指生物物质存活 需要的氧的量得以减少。这可以通过提供有效量的一种或多种活性化 合物来达到。通常知道特殊的生物物质需要多少氧来存活，这也取决 于时间、压力和温度。在本发明的某些实施方案中，与不存在有效量 的活性化合物时生物物质的需求比较，生物物质的氧需求减少约、至 少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或可源于其中 的任何范围。
在另外的实施方案中，存在治疗患者中的过度增生性疾病(例如 癌)的方法，该方法包括用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触 哺乳动物并让哺乳动物接受过热疗法。
虽然本发明的方法可以应用于保藏用于移植的器官，但本发明的 其它方面涉及接受者生物。在一些实施方案中，存在在哺乳动物中抑 制器官移植的排斥的方法，该方法包括提供哺乳动物有效量的氧拮抗 剂或其它活性化合物。
可通过采用氧拮抗剂或其它活性化合物在生物中完成温度调节。 在一些实施方案中，存在治疗具有低体温的受试者的方法，该方法包 括(a)用有效量的氧拮抗剂接触受试者，并然后(b)让受试者接受 高于受试者的环境温度。在其它实施方案中，本发明包括治疗具有高 体温的受试者的方法，该方法包括(a)用有效量的氧拮抗剂或其它活 性化合物接触受试者。在一些情形中，高体温的治疗也包括(b)让 所述的受试者接受至少低于受试者的温度约20℃的环境温度。如上面 讨论的，暴露受试者于非生理或受控温度环境可以用于另外的实施方 案中。考虑该方法通常可以用活性化合物完成。
在一些情形中，本发明涉及用于在进行旁路手术的患者中诱导心 麻痹的方法，该方法包括施用该患者有效量的氧拮抗剂或其它活性化 合物。考虑施用可以是心脏局部，以便保护它。
本发明的其它方面涉及用于在患者中预防出血性休克的方法，该 方法包括施用给患者有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。
而且，存在用于在生物中促进伤口愈合的方法，该方法包括施用 给生物或创伤以有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。
而且，本发明覆盖用于在哺乳动物中预防或治疗神经变性的方 法，该方法包括施用给哺乳动物有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物。
本发明也涵盖减少生物物质的氧需求，这意思是指生物物质存活 需要的氧的量得以减少。这可以通过提供有效量的一种或多种活性化 合物来实现。通常知道特殊的生物物质需要多少氧来存活，这也取决 于时间、压力和温度。在本发明的某些实施方案中，与不存在有效量 的活性化合物时生物物质的需求比较，生物物质的氧需求减少约、至 少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或可源于其中 的任何范围。
本发明另外的实施方案涉及用于预防脱发，例如由化疗引起的脱 发的方法，该方法通过施用给已经或将进行化疗的患者有效量的至少 一种活性化合物。
在其中保护生物物质免受损伤或进一步损伤的情形中，考虑可在 初次损伤(创伤或外伤或变性)发生后约、至少约或至多约30秒、1、 2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟、1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24小时、1、2、3、4、5、6、7天、1、2、3、4、5 周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多 年和可源于其中的任意组合或范围内，将生物物质暴露于氧拮抗剂。 因而在本发明另外的实施方案中，方法包括任何损伤、创伤、外伤或 变性的初始评估。
在本发明的某些实施方案中，存在用于治疗受到血液学障碍影响 的患者的方法，血液学障碍意思是指影响任何造血细胞或组织的疾病、 障碍或病状。实例包括镰状细胞病和地中海贫血病。因此，在一些实 施方案中，存在用有效量的活性化合物治疗患有镰状细胞病和地中海 贫血病的患者的方法。在其它实施方案中，存在用于通过施用或提供 有效量的活性化合物来增强患有囊性纤维化病(CF)的患者的存活力 的方法。在本发明的其它方法中，存在用于在受试者中治疗氰化物中 毒的方法，该方法包括施用有效量的活性化合物。在某些实施方案中， 所述的化合物是H2S。
本发明的其它方面涉及用于保藏一种或多种与生物分离的细胞 的方法，该方法包括用有效量的氧拮抗剂或其它活性化合物接触细胞 以保藏一种或多种细胞。除了上面以及该申请其它地方讨论的细胞和 细胞类型，考虑到特别考虑将虾胚用于本发明。
而且，在本发明的一些实施方案中，存在用于保藏血小板的方法。 使用本公开内容的技术，减少或消除了现有技术的缺点。涉及血小板 和氧还原的实施方案有广泛的应用，包括但不限于将受益于长期保存 血小板的任何应用。
在一个实施方案中，氧还原技术可在试剂盒中体现。例如，Becton Dickinson提供的目前以产品号261215销售的试剂盒利用在这里描述 的选择技术。该试剂盒包括无氧发生器(例如氢气发生器)、钯催化 剂、无氧指示器和不透气、可密封的“BioBag”，上面的组分(与不透 气的口袋中的血小板一起)置于其中并密封。
在本发明的其它实施方案中，存在通过提供有效量的活性化合 物，可逆地抑制细胞和/或生物的代谢的方法。特别考虑鱼藤酮不是该 方法或可能本发明的其它方法中采用的化合物。而且，也考虑在一些 实施方案中，排除鱼藤酮作为活性化合物。类似地，考虑可排除一氧 化氮作为活性化合物。
在本发明的其它实施方案中，提供方法用于通过提供有效量的活 性化合物，增强生物物质响应损伤或疾病进入停滞的能力，从而保护 生物物质免受损害或损伤，因此增强生物物质的存活。相关的实施方 案包括通过提供有效量的活性化合物，让物物质准备或引发生物物质 响应损伤或疾病进入停滞的方法。其它相关的实施方案包括诱导生物 物质进入预停滞，因而保护生物物质免于损害或损伤的方法。例如， 用少于诱导停滞所需的剂量的活性化合物处理或用活性化合物处理少 于诱导停滞所需的时间，使得生物物质能响应损伤或疾病而更容易或 更完全地达到停滞的有利状态，而不用该活性化合物处理时，生物物 质将在其达到保护性水平的停滞，例如足以赋予生物物质抵抗致死性 缺氧的水平前死亡或遭受损害或损伤。
某些损伤和疾病状态引起生物物质降低其代谢作用和/或温度至 可能不达到停滞的程度。例如，缺氧、局部缺血和失血都降低了可利 用并且提供给利用氧的生物物质的氧的量，因而减少了生物物质细胞 中氧利用，减少了源于氧化磷酸化作用的能量产生，并因而降低了产 热，导致低体温。取决于有害伤害或疾病伤害开始或进展后的严重性 或经历的时间，“停滞”可能已实现或可能没有实现。用活性化合物处 理降低了诱导停滞的阈值(即达到停滞所需的损害的严重性或持续时 间)，或其可以增加或增效致伤性刺激或疾病刺激来在处于有害条件 下的生物物质中诱导停滞，其中所述的有害条件假如不用于活性化合 物处理，将不会导致停滞。活性化合物的这种活性通过将有害刺激或 疾病刺激单独诱导停滞的效果(大小、动力学)与其中将生物物质预 先暴露、同时暴露、之后暴露或它们的任意组合暴露于活性化合物的 那些效果比较来测定。例如，如本专利申请的实施例11中描述的，在 暴露于缺氧(5％O2)前，将小鼠预先暴露于空气中的150ppm H2S， 引起CO2产生大约降低2倍。随后，在缺氧过程中，经预处理的小鼠 中的CO2产生降低约50倍。相比之下，虽然在对照的、未用H2S处 理的小鼠中CO2产生也下降，但不能达到小鼠的缺氧存活力，可能是 因为在达到停滞前小鼠就死了。
在本发明其它方面，存在用于在生物中诱导睡眠的方法，该方法 包括将生物暴露于有效量的活性化合物，其中所述的有效量小于可在 生物中诱导停滞的量。术语“睡眠”是根据其在医学方面中通常且普通 的意义使用。睡眠区别于无意识的其它状态，无意识状态也考虑为可 用本发明的方法获得的状态。
本发明也涉及用于麻醉生物物质的方法，该方法包括暴露该物质 于有效量的活性化合物，其中所述的有效量小于可在生物物质中诱导 停滞的量。
在上面讨论的方法中，可减少少于可在生物物质中诱导停滞的量 的有效量的持续时间和/或量。所述的减少可以是诱导停滞的量的百分 之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99或可源于其中的任何范围的量的减少。 减少可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1、2、3、 4、5、6、7天、1、2、3、4、5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12个月或可源于其中的任何范围的持续时间的减少。可替代 地，所述的减少可以是关于提供给生物物质的总有效量，其可以是相 对于在所述物种和/或大小的生物中诱导停滞的总有效量，百分之1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、 95、96、97、98、99或可源于其中的任何范围的减少。
特别考虑本发明可用于保藏用于消费或实验室研究的生物，例如 蝇类、蛙类、鱼类、小鼠、大鼠、狗、虾以及它们的胚胎。
本发明的方法可以涉及使用维持生物物质在其中放置或暴露的 环境的仪器或系统。本发明包括一种仪器，在该仪器中提供氧拮抗剂 或其它活性化合物，特别是作为气体。在一些实施方案中，所述的仪 器包括具有容纳生物物质的样品室的容器，其中该容器连接至含有氧 拮抗剂的气体供给。特别考虑该容器可以是坚固的或者其可以是柔性 的，例如袋子。
在一些实施方案中，本发明是用于保藏细胞的仪器，该仪器包括： 具有体积不大于775升的样品室的容器；与该样品室进行流体连通的 第一个气体供应，第一个气体供应包括一氧化碳。在进一步的实施方 案中，该仪器也包括调节样品室内温度的冷却单元，和/或调节样品室 内的氧拮抗剂或其它活性化合的量或样品室内的溶液中的氧拮抗剂或 其它活性化合物的量的气体调节器。
考虑可以有用于第二种或额外的气体的气体供应或用于氧拮抗 剂或其它活性化合物的第二种或额外的气体供应。第二种气体供应可 以与样品室相连或者其可以与第一种气体供应相连。如上讨论的，额 外的气体可以是非毒性和/或非活性气体。
在本发明的一些实施方案中气体调节器是所述仪器的一部分。可 以使用一个、两个、三个或更多个气体调节器。在一些情形中，气体 调节器调节从第一个气体供应提供给样品室的气体。可替代地，其调 控从第二种气体供应提供给样品室或第一种气体供应的气体，或存在 既用于第一种又用于第二种气体供应两者的调节器。进一步考虑可以 程序控制任何气体调节器来控制供应样品室和/或其它气体供应的气 体的量。所述的调节可以是或可以不是对于指定的一段时间。可以有 气体调节器，对于直接或间接与样品连接的任何气体供应，其可以是 或可以不是可程序控制的。在一些情形中，气体调节器是通过电子程 控的。
在一些情形中，样品室内的压力和/或温度可以分别用压力调节 器或温度调节器调节。和气体调节器一样，这些调节器可以是可通过 电子程控的。本发明的仪器也可以具有冷却和/或加热单元以获得上面 讨论的温度。该单元可以或可以不是通过电子程控的。
在其它实施方案中，所述仪器包括一个有轮车(wheeled cart)， 容器放置在上面，或其可以具有一个或多个把柄。
特别考虑，本发明包括用于细胞、组织、器官以及甚至整个生物 的仪器，其中该仪器具有：具有样品室的容器；与样品室流体连通的 第一种气体供应，第一种气体供应包括氧拮抗剂或其它活性化合物； 可电子程控的气体调节器，其调节从第一种气体供应供给样品室的气 体。
在一些实施方案中，所述仪器也具有配置来在样品室内提供真空 的结构。
而且，考虑本申请中所述的任何氧拮抗剂或其它活性化合物与本 发明的仪器一起使用。在特别的实施方案中，可以用该仪器施用一氧 化碳。在其它情形中，可以施用硫属化物化合物或具有还原剂结构的 化合物。在更进一步的实施方案中，用所述仪器施用活性化合物。在 特别的实施方案中，本发明涵盖一种装置或其用途。在某些实施方案 中，该装置是单次剂量递送装置。在其它实施方案中，该装置是吸入 器或喷雾器。在更进一步的实施方案中，其它装置包括，但不限于注 入装置，例如笔、泵例如输注泵，或贴片。而且，考虑这些装置可以 是或可以不是单次剂量递送装置。
此外，本发明涉及筛选测定法。在一些实施方案中，筛选候选物 质作为氧拮抗剂或活性化合物，特别是包括保护性代谢剂的能力。这 可以用在此描述的任何测定法，例如通过测量二氧化碳输出来完成。 可进一步表征或检测经鉴定体现出氧拮抗剂或其它活性化合物特性的 任何物质。而且，考虑可以施用这种物质至生物物质来诱导停滞或随 后生产该物质。
在某些实施方案中，存在用于活性化合物，包括活性停滞化合物 的筛选方法。此外，筛选方法可以用于氧拮抗剂或用于可实现在此讨 论的方法的任何其它化合物。在一些实施方案中，存在筛选方法，该 方法包括a)将斑马鱼胚暴露于物质；b)测量该胚的心率；c)将存 在该物质时胚胎的心率与不存在该物质时的心率比较，其中心率的减 少，例如减少50％或更多，鉴定该物质为候选活性化合物。除了斑马 鱼胚，考虑也可以使用其它非人的生物，例如鱼、蛙类、蝇类、虾或 它们的胚。在进一步的实施方案中，通过计数心跳数测量胚的心率。 在一些情形中，这可以通过在解剖显微镜下观察胚来完成。
其它筛选实施方案包括：a)暴露线虫于物质；b)测定以下细胞 呼吸因素的一种或多种：i)核心体温；ii)氧消耗；iii)活动力；或 iv)二氧化碳产生；c)将存在该物质时线虫的细胞呼吸因素与不存在该 物质时的细胞呼吸因素比较，其中所述特征的减少鉴定该物质为候选 活性化合物。在本发明的一些方法中，特别考虑测定线虫的活动力。
在一些实施方案，所述方法首先涉及鉴定合适的筛选物质。在某 些实施方案中，所述的物质将是硫属化物化合物、还原性物质或具有 式I或式IV的结构，或在此讨论的任何其它化合物。
进一步考虑，随后的筛选可以在被认为是比用于初步筛选或初始 筛选的那些更高级或更复杂的生物中进行。因此，考虑将在这些其它 生物中检测一种或多种细胞呼吸因素以进一步评价候选化合物。在某 些实施方案中，随后的筛选涉及使用小鼠、大鼠、狗等。
考虑在本发明的筛选方法中，可使用许多不同的生物或生物物质 (其它细胞或组织)，并且可以测定许多不同的细胞呼吸因素。而且， 考虑在本发明的一些实施方案中，同时进行多次这类筛选。
当然应该理解，为了将物质认为是候选活性化合物(或氧拮抗剂， 或停滞诱导剂或保护性代谢剂等)，该物质在测定法中不可以杀死生 物或细胞并且效果必须是可逆的(即改变的特征需要恢复至其暴露于 所述物质前的水平)。
当然应该理解，任何处理方法可用于制备用于治疗或抵抗特定疾 病或状况的药物。这包括但不限于用于治疗出血性或血液学休克、伤 口和组织损伤、高体温、低体温、神经变性、脓毒症、癌和创伤的药 物的制备。而且，本发明包括但不限于，制备用于治疗防止死亡、休 克、创伤、器官或组织排斥、癌症疗法引起的损伤、神经变性以及伤 口或组织损伤的药物。
如上面讨论的，生物的停滞不是以下状态中的任何一种：睡眠、 昏迷、死亡、麻醉或癫痫大发作。然而，考虑在本发明的一些实施方 案中，这类状态是使用本发明到方法、组合物和制造品的期望目标。 关于本发明的一方面讨论的任何实施方案也应用于本发明的其它方 面。而且，可以合并实施方案。
涉及“暴露”生物物质于活性化合物的任何实施方案也可以实施， 使得给生物物质提供活性化合物或施用活性化合物给生物物质。术语 “提供”是根据其通常且普通的意义使用的。“供应或提供来使用”(牛 津英语字典)，就患者来说，其可以指处方特殊的活性化合物或直接 将其施用给患者的医生或其它医务人员进行的行为。
在实施例部分中的实施方案应该理解为可应用于本发明所有方 面的本发明实施方案。
权利要求书中术语“或”的使用是用于表示“和/或”除非明确指明 是仅指备选物或备选物相互排斥，尽管本公开内容支持仅指备选物和 “和/或”的定义。
在整个本申请中，术语‘大约“用于表示包括用于测定该值的设备 或方法的误差的标准偏差的值。在与术语“大约”结合使用的数值的上 下文中讨论的任何实施方案中，特别考虑可以省略术语大约。
根据长期存在的专利法，单词“a”和“an”，当在权利要求书或说 明书中与单词“包含”结合使用时，指一个或多个，除非具体指出。
从下面的详述中，本发明的其它的目标、特征和优势将变得显而 易见。然而应该理解，尽管显示了本发明的特定实施方案，该详述和 特定实施例仅以举例说明的方式给出，因为从该详述来看在本发明的 精神和范围内的各种改变和修正对本领域的技术人员将变得显而易 见。
附图简述
下面的附图构成了本说明书的一部分并且包含在内以进一步证 明本发明的某些方面。可以通过参考这些附图中的一个或多个，结合 在此提供的具体实施方案的详细描述来更好的理解本发明。
图1人角质形成细胞在暴露于100％CO时存活。细胞用倒置相 差显微镜肉眼观察。通过台盼蓝染色判断的活角质形成细胞数的定量， 台盼蓝染色是细胞死亡的的指示物。
图2.在缺氧时存活力的不连续性。在野生型胚中，在暴露于无 氧(纯N2)、中度缺氧((0.01kPa O2、0.05kPa O2或0.1kPa O2)或 轻度缺氧24小时后评估到成虫期的存活力。所有数据点是至少3个独 立试验的结果，并且将不能解释的蠕虫从总数中除去。
图3.一氧化碳保护免受缺氧伤害。在野生型胚中暴露于纯一氧化 碳、0.05kPa O2/N2或0.05kPa O2/CO 24小时后，评估到成年期的存 活力。所有数据点是至少3个独立试验的结果，并且将不能解释的蠕 虫从总数中除去。
图4A当小鼠暴露于硫化氢时，代谢率在身体核心温度前降低。 小鼠暴露于80ppm(在X轴上的0分钟时)导致在少于5分钟内CO2 产生(黑线)降低大约3倍。这在动物的核心温度朝环境温度降低(灰 线)之前。
图4B暴露于硫化氢的小鼠的温度。每条线表示暴露于80ppm 的H2S或室内空气的个体小鼠的核心体温的连续测量。垂直轴上的数 字是摄氏温度。在横轴上，数字反映以小时为单位的时间。试验在进 行6小时后，记录了恢复。起始点是在1:00，6小时处理结束是约7:00。
图5暴露于80ppm硫化氢引起小鼠的核心体温逼近环境温度。 在时间0:00开始，开启气体，温度降低。在时间6:00，气氛换回至室 内空气。三角形表示通过无线电遥测术测定的小鼠的核心体温。这在 时间0:00时为大约39℃。菱形表示环境温度，其在试验最初的3小 时中从23℃降到13℃，并随后从6:00时再次上升接近23℃，在约 9:00时稳定。
图6身体核心温度下降的速度取决于给予小鼠的硫化氢的浓度。 所有的线表示由无线电遥测术测定的单个小鼠的核心体温。接受20 ppm和40ppm H2S的小鼠表现出小的核心温度降低。暴露于60ppm 诱导了从大约4:00开始的温度的大幅下降。暴露于80ppm的小鼠表 现出了从大约2:00开始的温度的大幅下降。
图7最低的核心体温。记录的暴露于80ppm硫化氢的小鼠的最 低核心体温是10.7℃。三角形表示通过无线电遥测术测定的小鼠的核 心体温，其在时间0时从大约39℃开始。菱形表示以大约23℃开始 的环境温度，并且在试验的中点时降低至低于10℃，之后其然后再次 上升接近室温。
图8A适应温和温度的小鼠内源性硫化氢水平增加。灰色的直方 图(左边的两条)表示适应4℃的两只单独小鼠的内源性H2S浓度； 黑色的直方图(右边的两条)表示适应30℃的两只单独小鼠的内源性 H2S浓度。硫化氢浓度通过GC/MS测定。
图8B环境温度对依赖硫化氢的温度下降的影响。由于暴露于硫 化氢引起的核心温度下降的速率依赖适应温度。在1:00时将小鼠暴露 于气体。三角形表示通过无线电遥测术测定的适应12℃的小鼠的核心 温度。正方形表示适应30℃的动物的核心体温。
图9是说明根据本发明实施方案的呼吸气体递送系统的方块图。
图10是说明根据本发明实施方案的呼吸气体递送系统的示意图。
图11是说明根据本发明进一步的实施方案的呼吸气体递送系统 的示意图。
图12是说明根据本发明实施方案的操作的流程图。
图13是说明根据本发明实施方案的组织处理气体递送系统的示 意图。
图14是说明根据本发明实施方案的操作的流程图。
图15代谢抑制保护线虫免于低体温诱导的死亡。暴露于冷温 (4℃)的线虫在24小时后不能存活。然而，如果在低体温期间保持 无氧条件(并且在其之前和之后保持1小时)，大比例的线虫存活。
图16短的CO2预处理导致最长的无氧存活。将成年蝇类暴露于 100％CO2持续标明的时间，通过用N2冲洗造成气氛为缺氧，并然后 将试管密封。22小时后，将试管向室内空气开放。在给存活力打分前， 让蝇类恢复24小时。
图17CO2不同程度地增强了缺氧存活。将成年蝇类在低-流量试 验中造成缺氧，直接在室内空气中(不进行预处理)，或在暴露于100％ 的CO210分钟后。在指定的时间后，将试管向室内空气开放。在给 存活力打分前，让蝇类恢复24小时。
图18向CO中加50ppm H2S增加了幸免于缺氧的蝇类的比 率。将成年蝇类在低-流量试验中造成缺氧，直接在室内空气中(不进 行预处理)，或在暴露于用CO平衡的50ppm H2S后。
图19是用于将氧气从血小板中除去的示例性系统和根据本公开 内容的实施方案的方案的示意图。
图20A-B显示了暴露于硫化氢的大鼠(A)和暴露于二氧化碳的 小鼠(B)的核心温度的变化。
图21显示了用于测定活性化合物的浓度的分步试验计划的气体 矩阵(matrix)。
图22A-B显示了可用于递送或施用活性化合物的负压装置。
图23在5％的氧气中小鼠的存活。将小鼠或者在暴露于5％O2 前暴露于30分钟的室内空气(对照；黑线；n＝9)或者在暴露于5％O2 前暴露于10分钟的室内空气，然后暴露于20分钟150ppm H2S(实 验；红线；n＝20)，并测量它们存活的长度。在60分钟时终止试验， 并且如果动物仍然存活(在实验中的都存活，而在对照组中的没有一 只存活)，将它们放回它们的笼中。
图24H2S增加了在致死的氧张力下的存活。图显示了在图23中 描述的试验结果。x-轴显示了小鼠在低氧张力下存活的以分钟为单位 的时间。黑色直方图显示了当H2S不存在时的存活时间，而浅色直方 图显示了存在H2S的存活时间。在后面的组中，在氧气分压降低至5％ 和2.5％之间前，将小鼠暴露于150ppm H2S。测量存活时间并且在所 有H2S处理组中存活时间至少为60分钟。
图25在5％氧气中的小鼠的代谢率。将小鼠在暴露于5％O2前， 暴露于10分钟的室内空气，随后暴露于20分钟的150ppm H2S。代 谢率通过CO2的输出测量。在暴露前CO2输出为大约2500ppm，在 暴露于20分钟的H2S后则代谢率降低大约2倍，并且在暴露于5％O2 几个小时后，CO2输出已经降低大约50倍，从暴露前的水平降低至大 约50ppm。在6小时时，将小鼠放回至室内空气并让其恢复。该数据 来自在图23(实验组)中所包括的小鼠之一。
图26暴露于100ppb H2Se的小鼠。该图显示了以分钟为单位的 向H2Se的暴露(x-轴)伴随核心体温的下降(在右边显示的摄氏温度 用显示逐渐下降的线画出)，并伴随着呼吸的降低(在左边显示的ppm CO2用显示降低的锯齿线画出)。
图27暴露于10ppb H2Se的小鼠。该图显示了以分钟为单位的 向H2Se的暴露(x-轴)伴随核心体温的下降(在右边显示的摄氏温度 用显示逐渐下降的线画出)，并伴随着呼吸的降低(在左边显示的ppm CO2用显示降低的锯齿线画出，在暴露5分钟时出现最低点)。
图28H2S预处理增强小鼠在低氧条件下的存活。将小鼠在暴露 于5％O2(5％)、4％O2(4％)、5％O21小时然后暴露于4％O2(4％ +1小时5％)或5％O21小时然后暴露于3％O2(3％+1小时5％) 前，暴露于30分钟的室内空气(无PT)或暴露于10分钟的室内空气 随后暴露于20分钟的150ppm H2S(PT)，并测量它们的存活时间长 度。在60分钟时终止试验，并且如果动物仍然存活则将其放回它们的 笼中。
图29在转换至致死的低氧期间CO2的产生。在小鼠中测量在转 换至5％O2或4％O2时CO2产生的变化，所述的小鼠暴露于室内空 气30分钟(无PT)，或暴露于室内空气10分钟后暴露于150ppm H2S 20分钟(PT)。而且，测量了分步转换至5％O21小时，随后转换 至4％O2时CO2产生的变化。画出了CO2产生变化的百分比，同时 标出了标准误差。
图30在暴露于100％一氧化碳(CO)时人角质形成细胞的存活。 用倒置相差显微镜肉眼检察细胞。通过台盼蓝染色判断的活角质形成 细胞数的定量，台盼蓝染色是细胞死亡的的指示物。
图31长期暴露于低水平的H2S导致秀丽隐杆线虫(C.elegans) 中的抗热性。与单独在室内空气中饲养的同胞相比，适应在室内空气 中含有大约50ppm H2S的环境的线虫显著地对升高环境温度至35℃ 的致死效应更有抗性。
图32长期暴露于低水平的H2S增加了秀丽隐杆线虫的寿命。适 应于室内空气中含有大约50ppm H2S的环境的线虫与未受处理的对 照比较具有更长的寿命。
图33斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠中暂时的核心温度降 低的实例。暴露于与室内空气混合的0.03％硫化氢的大鼠(灰色/虚线) 或暴露于15％二氧化碳/8％氧/77％氦的大鼠(黑色/实线)的核心温度 测量。在本试验中，在处理阶段环境室的温度是10℃。当气体还回为 室内空气时，将环境室的温度恢复至室温(22℃)。在每种情形中， 这是核心温度开始上升时的时间点(对于黑色/实心线为大约2小时， 而对于灰色/虚线是大约7.4小时)。
图34在5℃环境温度下在室内空气中，在暴露于1.2ppm的硒 化氢2小时10分钟期间的小鼠核心体温。
图35在10℃的环境温度下，在环境室中暴露于室内空气期间的 大鼠核心体温。黑线描述了大鼠的核心体温。灰线描述了环境温度。
图36在7℃的环境温度下暴露于80％氦气20％氧气的大鼠的核 心体温。时间在X轴上以小时为单位描述。总的暴露时间是大约5小 时(从9:15AM至2:15PM)。没有看见核心体温显著下降。
图37在7℃的环境温度下，在暴露于15％的二氧化碳、20％的 氧气和75％的氦期间大鼠的核心体温。暴露的时间大约是2小时。在 温度开始上升的时间点(在标记为38512.6的点后不久)开始，将大 鼠暴露于室内空气。在将大鼠暴露于室内空气期间，将环境温度恢复 至室温。
图38在7℃的环境温度下，暴露于15％的二氧化碳、8％的氧气 和77％的氦气的大鼠核心体温。暴露时间大约是4小时。灰线描述了 环境温度。黑线描述了核心温度。在环境和核心温度上升的时间点是 气体转换为室内空气时的时间点。
图39暴露于二氧化碳/氦气/氧气的狗的核心温度。虚线是当气 体放开(大约24分钟)和关闭(大约55分钟)时的核心温度。图40. 暴露于增加浓度的二氧化碳的狗的核心温度。虚线表示对气体进行改 变的时候。在大约63分钟时，将气体从室内空气改变为室内空气中 9％的二氧化碳。在大约85分钟时，将气氛从室内空气中9％的二氧 化碳改变为室内空气中12％的二氧化碳。在大约115分钟时，将气氛 从室内空气中12％的二氧化碳改变为室内空气中15％的二氧化碳。该 试验在大约135分钟时结束。
图41.在筛选方法中采用的仪器。
图42每天暴露于硫化氢4小时进行至少1周的动物和暴露于缺 少硫化氢的相同条件的对照动物的氧消耗(灰色直方图)和二氧化碳 产生(黑色直方图)。
图43每天暴露于硫化氢4小时进行至少1周的动物(H2S 2900 和H2S 2865)和暴露于缺少硫化氢的相同条件的对照动物(2893和 2894)的呼吸商。
说明性实施方案的描述
I.停滞
在“停滞”或“滞生”中，细胞、组织或器官或生物(统称为“生物 物质”)是活的，但是细胞分裂、发育进展所必需的细胞功能和/或代 谢状态减缓或甚至停止。该状态在许多情况中是期望的。停滞本身可 以用作保藏方法，或可以诱导它作为深低温保藏方案的一部分。可以 保藏生物物质用于例如研究用途、用于运输、用于移植、用于治疗性 处理(例如离体疗法)以及用于预防外伤发作。关于整个生物的停滞 具有类似用途。例如，如果生物已经进入停滞，可以有助于生物的运 输。这可能通过减少或除去应激或物理损伤，减少对生物的物理和生 理损伤。这些实施方案在下面进一步详细讨论。停滞可以通过降低生 物物质对氧气的需要并因而降低了血流量而是有益的。这可以延长可 将生物物质从维持生命的环境分离并暴露于诱导死亡的环境的时间周 期。
虽然已经报道了从相对长时间的意外性低体温中恢复(Gilbert 等，2000)，最近已经有兴趣于有意诱导生物中的滞生。(任何参考 文献的讨论不应理解为承认该参考文献构成现有技术。事实上，在此 讨论的一些参考文献就优先权申请来说不是现有技术)。已经研究了 受控制的过热疗法，以及施用冷的溶液流至主动脉中(Tisherman， 2004)、诱导心搏停止(Behringer等，2003)或一氧化氮诱导的滞 生(Teodoro等，2004)。
停滞的生物不同于于处于全身麻醉的生物。例如，暴露于室内空 气的轻度停滞的生物(2倍到5倍之间的细胞呼吸的降低)将开始战 栗，而处于麻醉的生物将不会。而且，预期轻度停滞的生物对脚趾挤 压有反应，而处于麻醉的生物没有反应。因此，停滞与处于通常实践 的麻醉状态不是相同的事情。
CO2产生是与生物的代谢作用相关的细胞呼吸的直接标志。这可 能与“CO2放出”不同，CO2放出指肺呼出的CO2的量。某些活性化合 物，例如，硫化氢，可以抑制肺中的碳酸酐酶活性，这抑制了碳酸转 化为CO2以及其从肺部血液的释放，因而表现出伴随的CO2放出的减 少，而没有相应的细胞CO2产生的降低。
本发明基于观察到某些类型的化合物在生物物质中有效地诱导 可逆的停滞。其它的专利申请讨论了停滞的诱导，包括以下申请：美 国专利申请10/971,576、10/972,063和10/971,575；美国专利申请 10/971,576；美国专利申请10/972,063；和美国专利申请10/971,575， 将所有这些申请在此通过引入作为参考。
A.体温调节
温血动物中的停滞将影响体温调节。体温调节是所谓的“温血”动 物的一个特性，其使得生物保持相对恒定的核心体温，甚至是当暴露 于显著改变的(冷的或热的)环境温度时。通过诱导停滞控制体温调 节的能力是本发明的一个方面，并且允许类似于上面讨论的那些用途。
体温调节可以通过将生物、四肢或分离的器官或组织置于其温度 可以控制的室/装置内来促进。例如，类似于高压仓的温室或腔室类设 备可以容纳整个生物并且可以连接至可调节温度的设备。也考虑更小 的装置例如毯子、套筒、套袖(cuff)或手套(glove)(例如AVAcore Technologies，Palo Alto，CA的CORE CONTROL冷却系统，美国 专利6,602,277)。这种室/装置可用于增加或降低环境温度。
B.生物物质
考虑用于本发明的生物物质包括源于无脊椎动物和脊椎动物(包 括哺乳动物)的材料；生物材料包括生物。除了人以外，本发明还可 用于兽医或农业重要的哺乳动物，所述的哺乳动物包括来自以下类型 的那些：犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、绵羊、鼠科动 物、猪科动物、山羊、啮齿动物、兔类动物、狼科动物和熊。本发明 还延伸至鱼类和鸟类。其它实例在下面公开。
而且，生物物质的类型不同。其可以是细胞、组织或器官以及不 同的组合物、方法和仪器有关的生物。将非临时美国专利申请 10/971,576、10/972,063和10/971,575在此通过全文引入作为参考。
在一些实施方案中，生物材料是或包含细胞。考虑细胞可以是任 何利用氧的细胞。细胞可以是真核或原核的。在某些实施方案中，细 胞是真核的。更特别地是，在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。 考虑用于本发明的哺乳动物细胞包括但不限于来自以下的那些细胞： 人、猴、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、猪、狗、猫、白鼬、奶牛、 绵羊和马。
而且，本发明的细胞可以是二倍体，但在一些案例中，细胞是单 倍体(性细胞)。而且，细胞可以是多倍体、非整倍体或无核细胞。 细胞可以来自特殊的组织或器官，例如来自以下组织或器官的细胞： 心、肺、肾、肝、骨髓、胰、皮肤、骨、静脉、动脉、角膜、血、小 肠、大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、子宫和脐带。 而且，细胞也可以被表征为以下细胞类型之一：血小板、髓细胞、红 血球、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平 滑肌细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞、神经胶质细胞、神经元、分泌 细胞、屏障功能细胞、收缩细胞、吸收细胞、粘膜细胞、缘细胞(来 自角膜)、干细胞(全能性、多能性或多潜能性)、未受精的或受精的 卵母细胞或精细胞。
1.不同的来源
下面是可从中获得生物物质的来源的实例：本发明的实施方案包 括但不限于这些实例。
a.哺乳动物
在本发明的某些方面，哺乳动物是单孔目、有袋目、食虫目、岩 鼠目(Macroscelidia)、皮翼目、翼手目、攀兽目(Scandentia)、 灵长目、贫齿目、鳞甲目、管齿目、兔形目、啮齿目、鲸目、食肉目、 长鼻目、蹄兔目、海牛目、奇蹄目或偶蹄目。
单孔目的实例包括针鼹科(例如针鼹属类)和鸭嘴兽科(例如鸭 嘴兽)。有袋目的实例包括负鼠科(例如负鼠类)、小科 (Microbiotheriidae)(例如Monito del Monte)、新袋鼠科(例如新袋 鼠类)、袋鼬科(例如袋鼬类)、袋食蚁兽科(例如袋食蚁兽)、袋狼科(例 如袋狼)、袋狸科(例如袋狸类)、兔袋狸科(例如兔袋狸类)、袋鼹科(例 如袋鼹类)、袋貂科(例如袋貂类)、袋鼯科(例如浣熊类、袋鼯类)、鼯 科(例如矮小负子袋鼠(Pygmy Possums))、袋鼠科(例如袋鼠类、小 袋鼠类)、蜜貂科(例如蜂蜜负子袋鼠(Honey Possum))、袋熊科(例如 袋熊类)和树袋熊科(例如树袋熊类)。
食虫目包括，例如，沟齿鼩科(例如沟齿鼠类)、马岛猬科(例如无 尾猬、獭鼩)、金鼹科(例如金鼹类)、刺猬科(例如刺猬、鼠猬)、鼩鼱 科(例如鼩鼱)和鼹鼠科(例如鼹鼠、麝鼹)。岩鼠目目包括岩鼠科(例如 象鼩)。攀兽目包括树鼩科(例如树鼩)。皮翼目包括飞狐科(例如 斑鼯猴)。翼手目包括如下科：狐蝠科(例如果蝠、飞狐)、鼠尾蝠科(例 如鼠尾狐)、凹脸蝠科(例如猪鼻蝙蝠或大黄蜂蝙蝠)、鞘尾蝠科(例如鞘 尾蝠)、夜凹脸蝠科(例如凹脸蝠)、巨耳蝠科(例如假吸血蝠)、菊头蝠 科(例如菊头蝠)、兔唇蝠科(例如，斗牛狗蝠、鱼人蝠(Fisherman Bats))、髯蝠科、叶口蝠科(例如新世界叶鼻蝠(New World Leaf-Nosed Bats))、长腿蝠科、烟蝠科、盘翼蝠科、吸足蝠科、蝙蝠科(例如， 普通(Common)蝙蝠)、短尾蝠科(例如，短尾蝠)、以及皱鼻蝠科(例 如，皱鼻蝠)。
灵长目包括下列科：狐猴科(例如狐猴)、鼠狐猴科(例如，小嘴 狐猴)、大狐猴科(例如，大狐猴、被绒毛狐猴)、指猴科(例如，指狐猴)、 懒猴科(例如，懒猴，婴猴、丛猴)、眼镜猴科(例如，眼镜猴)、卷尾猴 科(例如新大陆猴、绒猴、绢毛猴)、长臂猿科(例如长臂猿)、猩猩科(例 如，猿)、以及人科(例如，人类)。
贫齿目的实例包括食蚁兽科(例如，食蚁兽)、树懒科(例如，三趾 树懒)、二趾樹懶科(例如，二趾树懒)、以及犰狳科(例如犰狳)。鳞甲 目的实例包括穿山甲科(例如，穿山甲)。管齿目的实例包括土豚科(例 如，土豚)。兔形目的实例包括鼠兔科(例如，鼠兔)和兔科(例如野兔和 兔)。
啮齿目包括下列科：山河狸科(例如，山河狸(Mountain Beavers))、松鼠科(例如，松鼠、土拨鼠、花栗鼠)、囊鼠科(例如， 囊鼠)、异鼠科(例如，袋小鼠(Pocket Mice)、更格卢鼠(Kangaroo Rats))、河狸科(例如，河狸)、鳞尾松鼠科(例如，鳞尾松鼠)、跳兔 科(例如，跳鼠)、鼠科(例如，大鼠和小鼠)、睡鼠科(例如，睡鼠)、荒 漠睡鼠科(例如，沙漠睡鼠)、林跳鼠科(例如，跳鼠(Jumping Mice))、 跳鼠科(例如，跳鼠)、豪猪科(例如，旧世界豪猪(Old World Porcupines))、美洲豪猪科(例如，新世界豪猪)、豚鼠科(例如，豚鼠、 巴塔哥尼亚野兔(Maras))、水豚科(例如，水豚)、花背豚鼠科(例如， 长尾豚鼠)、驼鼠科(例如，无尾刺豚鼠)、刺豚鼠科(例如，刺豚鼠)、 毛丝鼠科(例如，毛丝鼠、兔鼠)、硬毛鼠科(例如，硬毛鼠)、河狸鼠科 (例如，河狸鼠)、梳鼠科(例如，Tuco-Tucos)、八齿鼠科(例如，齿鼠 (Octodonts)、八齿鼠)、华毛鼠科(Abrocomidae)(例如南美栗鼠)、 棘鼠科(Echimyidae)(例如，刺鼠(Spiny Rat))、藤鼠科 (Thryonomyidae)(例如，甘蔗鼠(Cane Rat))、岩鼠科(Petromyidae) (例如，非洲岩石鼠(African Rock Rat))、滨鼠科(Bathyergidae)(例 如，Mole Rat)、以及栉趾箭猪科(例如，栉趾箭猪)。
鲸目(Cetacea)目包括如下科：亚河豚科(Iniidae)(例如亚马 逊江豚(Amazon Popoise))、白鱀豚科(Lipotidae)、恒河豚科 (Platanistidae)、普河豚科(Pontoporiidae)、喙鲸科(Ziphiidae) (例如，突吻鲸(Beaked Whales))、抹香鲸科(Physeteridae)(例 如，抹香鲸(Sperm Whales))、一角鲸科(Monodontidae)(例如， 白鲸(Beluga Whale)、一角鲸(Narwhal))、海豚科(Delphinidae) (例如，海豚(Marine Dolphin)、虎鲸(Killer Whale))、鼠海豚科 (Phocoenidae)(例如，海豚(Porpoises))、须鲸科(Balaenopteridae) (例如，鲸)、露脊鲸科(Balaenidae)(例如，脊美鲸(Right Whale))、 以及灰鲸科(Eschrichtiidae)(例如，灰鲸(Gray Whale))。
食肉目(Carnivora)包括如下科：犬科(Canidae)(例如，狗、 狐、狼、豺、丛林狼)、熊科(Ursidae)(例如，熊)、浣熊科(Procyonidae) (例如，浣熊、长吻浣熊、蜜熊、小熊猫)、大熊猫科(Ailuropodidae) (例如，大熊猫)、鼬科(Mustelidae)(例如，鼬、臭鼬、獾、水獭)、 灵猫科(Viverridae)(例如，灵猫香、香猫)、獴科(Herpestidae)(例 如，猫鼬)、土狼科(Protelidae)(例如，土狼)、鬣狗科(Hyaenidae) (例如，鬣狗)、猫科(Felidae)(例如，猫)、海狮科(Otariidae)(例 如，突耳海豹(Eared Seal)、海狮)、海象科(Odobenidae)(例如， 海象)、以及海豹科(Phocidae)(例如，无耳海豹(Earless Seal))。
长鼻目(Proboscidea)包括科：象科(Elephantidae)(例如，象)。 蹄兔目(Hyracoidea)包括蹄兔科(Procaviidae)(例如，蹄兔)。海 牛目(Sirenia)包括儒艮科(Dugongidae)(例如，儒艮)和海牛科 (Trichechidae)(例如，海牛)。奇蹄目(Perissodactyla)包括马科 (Equidae)(例如，马、驴、斑马)、貘科(Tapiridae)(例如，貘)、 以及犀科(Rhinocerotidae)(例如，犀牛)。偶蹄目(Artiodactyla) 包括如下科：猪科(Suidae)(例如，猪、野猪)、西貒科(Tayassuidae) (例如，西貒)、河马科(Hippopotamidae)(例如，河马)、驼科 (Camelidae)(例如，骆驼、美洲驼羊、小羊驼)、鼷鹿科(Tragulidae) (例如，hevrotains)、麝科(Moschidae)(例如，麝鹿)、鹿科(Cervidae) (例如，鹿、麋鹿、驼鹿)、长颈鹿科(Giraffidae)(例如，长颈鹿、霍 加狓)、叉角羚科(Antilocapridae)(例如，叉角羚)、以及牛科(Bovidae) (例如，牛、绵羊、羚羊、山羊)。
b.爬行类动物
在一些实施方案中，生物材料是爬行动物或源自爬行动物。爬行 动物可以是龟鳖目、侧颈龟亚目、有鳞目、喙头目或鳄目。龟鳖目的 爬行动物可以是，例如两爪鳖科、鳄龟科(例如，甲鱼)、海龟科(例如， 蠵龟、海龟)、泥龟科(例如，棱皮龟)、龟科(例如，锦龟、黄腹滑龟、 水龟、蜗牛龟、箱龟)、动胸龟科(例如，麝香龟)、晰蜴科(Saurotypidae)、 陆龟科(例如象陆龟、沙漠地鼠龟、阿尔达布拉陆龟、欧洲陆龟、赫曼 陆龟)、鳖科(例如，中华鳖、刺鳖)或平胸龟科。侧颈龟亚目的爬行动 物可以是，例如蛇颈龟科(例如，蛇颈龟)或侧颈龟科(例如，沼泽侧颈 龟)。
有鳞目的爬行动物可以是，例如鬣蜥科(例如冠毛树蜥、松狮蜥、 印度吸血动物(Bloodsucker)、叙利亚刺尾蜥)、蜓科 (Chamaeleontdidae)(例如，变色龙)、美洲鬣蜥科(例如，安乐蜥、 皇冠鬣蜥、普通有领蜥蜴、鬣鳞蜥、冠状角蜥、黑叩壁蜥、细强棱蜥、 雄性侧边斑点蜥蜴)、壁虎科(例如，蛤蚧)、鳞脚蜥科、美洲蜥蜴科(例 如，鞭尾蜥、树栖蜥)、蜥蜴科(例如，捷蜥蜴、单眼晰蜴、胎生蜥蜴、 壁虎、长尾蜥蜴)、黄蜥科、石龙子科(例如，石龙子属)、非洲蜥蜴科(例 如，看日蜥)、双足蜥科、异蜥科、蛇蜥科(例如，鳞脚蜥、短吻鳄 (Alligator)晰蜴，褐蛇蜥、脆蛇蜥)、毒蜥科(例如，毒蜥)、婆罗蜥 科、巨蜥科(例如，巨蜥)、细盲蛇科、盲蛇科、异盾盲蛇科、筒蛇科(例 如，管蛇)、Uropeitidae、闪鳞蛇科、蚺科(例如，蚺、水蟒、岩蟒)、 瘰鳞蛇科(例如，爪哇瘰鳞蛇)、游蛇科(例如，红树林蛇、翠绿林神蛇、 滑蛇、食卵蛇、南非树蛇、捕鼠蛇、艾斯库拉普蛇、四纹蛇、东方锦 蛇、吻突蝣蛇、猪鼻蛇、王蛇、(Montpelier)蛇、草蛇、游蛇、 乌蛇、藤蛇、龙骨背(Keelback)蛇)、眼镜蛇科(例如，致死毒蛇、 金环蛇、窄头眼镜蛇、珊瑚蛇、眼镜蛇、铜头蛇、鼓腹毒蛇)、蝰科(例 如，毒蛇、右蝰蛇(Right Adders)、响尾蛇、链侏响尾蛇、蝰蛇)、 海蛇科(例如，海蛇(Sea Brait))、蚓蜥科(例如，蛇蜥)、双足蚓蜥科 或短头蚓蜥科(例如，打洞(Burrowing)晰蜴)。
喙头目的爬行动物可以是，例如楔齿蜥科(例如，楔齿蜥)。鳄 目的爬行动物可以是，例如鼍科(例如，鳄鱼、凯门鳄属)、鳄科(例如， 鳄鱼)或长吻鳄科(例如，食鱼鳄)。
c.两栖动物
本发明的生物材料可以是两栖动物或源自两栖动物。两栖动物可 以是，例如蛙或蟾蜍。蛙或蟾蜍可以是，例如节蛙科(例如，赖歇节蛙)、 尾蟾科(例如，尾蟾)、短头蟾科(例如，金蛙和盾(shield)蟾蜍)、蟾 蜍科(例如，真(true)蟾蜍)、附蛙科(例如，玻璃蛙和叶蛙)、箭毒蛙 科(例如，箭毒蛙)、盘舌蟾科(例如，欧洲铃蟾)、沼蟾科(例如，鬼(ghost) 蛙)、铲鼻蛙科(例如，铲鼻蛙)、雨蛙科(例如，新大陆树蛙)、非洲树 蛙科(例如，非洲树蛙)、滑跖蟾科(例如，新西兰蛙)、细趾蟾科(例如， 新热带区蛙frogs)、角蟾科(例如，南亚蛙)、姬蛙科(例如，姬娃 (microhylid frogs))、龟蟾科(例如，澳洲蛙)、锄足蟾科(例如，锄足 蟾)、合附蟾科(例如，斑点铲足蟾)、负子蟾科(例如，无舌蛙)、多指 节蟾科(例如，怪(paradox)蛙)、蛙科(例如，栖岸蛙和其(true)蛙)、 树蛙科(例如，新大陆树蛙)、尖吻蟾科(例如，达尔文蛙)、异舌穴蟾科 (例如，泥(burrowing)蟾蜍)、塞舌蛙科(例如，Seychelle蛙)、有尾 目(例如，蝾螈)或蚓螈目(例如，蚓螈)。
两栖动物可以是蝾螈。蝾螈可以是，例如钝口螈科(例如，钻地 蝾螈)、两栖鲵科(例如，两栖螈属)、隐腮鲵科(例如，大鲵和毕氏隐鳃 鲵)、陆巨螈科(例如，剑陆巨螈)、小鲵科(例如，亚洲蝾螈)、无肺螈 科(例如，无肺螈)、洞螈科(例如，美洲蝾螈和斑泥螈)、急流螈科(例 如，急流(torrent)蝾螈)、蝾螈科(例如，东方蝾螈和蝾螈)或鳗螈科 (例如，sirens)。可替代地，两栖动物可以是蚓螈。蚓螈可以是，例如 真蚓科(例如，真蚓)、鱼螈科(例如，亚洲有尾蚓螈)、吻蚓科(例如， 新热带区有尾蚓螈)、蠕蚓科(例如，非洲蚓螈)、盲游蚓科(例如，水生 蚓螈)或盲尾蚓科(例如，印度蚓螈)。
d.鸟类
本发明的生物材料可以是鸟或可源自鸟。鸟可以是，例如雁形目 (例如，水鸟)、雨燕目(例如，巨峰鸟和雨燕)、夜鹰目(例如，夜鸟)、 雉科(例如，岸边鸟(shorebirds))、鹳形目(例如，鹳)、鼠鸟目(例 如，鼠鸟)、鸽形目(例如，鸽和鸠鸽)、佛法僧目(例如，翠鸟)、凤冠 雉目(例如，稚冠雉、凤冠雉、冠雉、冢雉)、鹃形目(例如，杜鹃、麝 雉、蕉鹃)、隼形目(例如，灰色昼夜鸟)、鸡形目(例如，鸡样鸟)、潜 鸟目(例如，潜鸟)、鹤形目(例如，骨顶鸡、鹤、秧鸡)、雀形目(例如， 栖木(perching)鸟)、鹈形目(例如，鹈鹕)、红鹳目(例如，火烈鸟)、 啄木鸟科(例如，啄木鸟)、鸊鹈目(例如，鸊鷉)、信天翁目(例如，管 鼻海鸟)、鹦形目(例如，鹦鹉)、企鹅目(例如，企鹅)、鹗形目(例如， 枭)、鸵形目(例如，食火鸡(cassowaires)、鸸鹋，几维，鸵鸟、美 洲鸵)、形目(例如，鹬鸵)、咬鹃目(例如，咬鹃)或三趾鹑目(例如， 三趾鹑)。
e.鱼类
本发明的生物材料可以是鱼或可源自鱼。鱼可以是，例如鲟形目 (例如，匙吻鲟、匙鱼(oonfishes)和鲟鱼)、多鳍鱼目(例如，多鳍鱼 (bichirs)、多鳍鱼(birchers)、肉鳍鱼(lobed-finned pike)和芦 苇鱼(reed fishes))、铡汉鱼目(例如，绿锦鱼和月银汉鱼)、颔针氩 目(例如，鱼和颌针鱼)、金眼鲷目、遮目鱼目、齿鲤目(例如，鳉鱼)、 豹鲂鮄目(例如，豹鲂鮄)、剌鱼目(例如，海龙和刺鱼)、鲻形目(例如， 鲻)、海蛾鱼目(例如，巨口鱼和海蛾)、鲈形目(例如，河鲈样(perch-like) 鱼)、鲽形目(例如，比目鱼、鲽和舌鳎)、鲉形目(例如，蝎子鱼和杜父 鱼)、奇金眼鲷目、合鳃鱼目(例如，黄鳝)、鲀形目(例如，箱鲀、豚鱼、 鳞魨、河豚、扳机鱼和箱魨)、海鲂目(例如，豚鼻鱼、海鲂和鲂)、银 汉鱼总目、鲱形目(例如，凤尾鱼和青鱼)、仙女鱼目、北梭魚目、鳗 鲡目(例如，鳗)、海鲢目(例如，阿邦鱼(arpons))、背棘鱼目(例如， 刺鳗和背棘鱼)、咽囊鱼目、月鱼目(例如，月鱼和细尾带鱼)、脂鲤目(例 如，野兔鱼(leporins)和水虎鱼)、鲤形目(例如，鲦鱼、胭脂鱼、斑 马鱼)、鼠鱚目(例如，遮目鱼和壳耳鱼(shellears))、裸背电鳗目、 鲇形(例如，鲶鱼)、鲑鲈目(Aphredoderiforme)(例如，洞穴鱼和 河鲈)、蟾鱼目、鳕形目(例如，鳕和鳕鱼)、喉盘鱼目、鮟鱇目(例如， 鮟鱇)、鼬鳚目、鲑鲈目(例如，鲑鲈)、须鳂目(例如，须鳂)、鲸口鱼 目、栉鱤目、狗鱼目(例如，荫鱼和狗鱼)、胡瓜鱼目(例如，水珍鱼和 胡瓜鱼)、鲑形目(例如，鲑鱼)、灯笼鱼目(例如，灯笼鱼(Latern Fishes))、 辫鱼目、巨口鱼目、弓鳍鱼目(例如，弓鳍鱼)、半椎鱼目(例如，雀鳝)、 海龙目(例如，海龙和海马)、单鳔肺鱼目(例如，澳洲肺鱼)、双鳔肺鱼 目(例如，美洲肺鱼和非洲肺鱼)或腔棘鱼目(例如，腔棘鱼)。
f.无脊椎动物
生物材料可以是无脊椎动物或源自无脊椎动物。无脊椎动物可以 是，例如，多孔动物门(例如，海绵)、刺胞动物门(例如，水母、水螅、 海葵、僧帽水母和珊瑚)、扁形动物门(例如，叶状软体蜗虫，包括涡 虫、吸虫和绦虫)、线虫动物门(例如，圆虫，包括轮虫和线虫)、软体 动物门(例如，软体动物、蜗牛、蛞蝓、章鱼、鱿鱼)、环节动物门(例 如，分节的蠕虫，包括蚯蚓、水蛭和海洋蠕虫)、棘皮动物门(例如， 海星、海参、沙钱、海胆)、帚虫动物门(例如，帚虫类)、缓步动物门(例 如，缓步类)、棘头动物门(例如，棘头虫)、栉水母门(例如，栉水母) 或节肢动物(例如，蜘蛛、甲壳动物、多足类、唇足类、昆虫类)。
节肢动物可以是，例如鞘翅目(例如，甲虫)、双翅目(例如，蝇)、 膜翅目(例如，蚂蚁、蜜蜂、黄蜂)、鳞翅目(例如，蝴蝶、蛾)、长翅目 (例如，蝎蛉)、广翅目、脉翅目(例如，草蜻蛉及相关的动物)、蚤目(例 如，跳蚤)、捻翅目(例如，寄生性昆虫和捻翅虫)、毛翅目(例如，石蚕 蛾)、虱目(例如，吸吮虱)、半翅目(例如，半翅目长虫和它们的相关动 物)、食毛目(例如，咬虱)、啮虫目(例如，啮虫)、缨翅目(例如，牧草 虫)、直翅目(例如，蝗虫、蝉)、革翅目(例如，蠼螋)、网翅目、纺足 目(例如，足丝蚁)、蛩蠊目、螳螂竹节目(例如，斛士(gladiators))、 _翅目(例如，石蝇)、缺翅目(例如，绝翅目(zorapterans))、蜉蝣目 (例如，蜉蝣)、蜻蜓目(例如，蜻蜓和豆娘)、竹节虫目(例如，竹节虫)、 缨尾目(例如，蛀虫)、石蛃亚目、弹尾目(例如，雪蝇(snow flies)和 跳虫)、唇足亚纲(例如，唇足类)、倍足亚纲(例如，多足类)、蜥脚类(例 如，少足纲、纲(pauropodans)和前殖孔类)、综合纲(例如，假 蜈蚣(pseudocentipedes)和综合纲(symphylans))、软甲亚纲(例如， 螃蟹、磷虾、丸虾、河虾)、颚足纲、鳃足亚纲(例如，鳃足动物)、头 虾纲、介形亚纲(例如，介形亚纲动物)、桨足纲、鳃尾纲、蔓足亚纲(例 如，藤壶)、蛛形纲(例如，蛛形类，包括鞭蛛、蜘蛛、盲蜘蛛、盲蜘、 微型蝎(microscorpions)、书蝎(book scorpions)、伪蝎、假蝎、 蝎子、避日虫、日蜘蛛和尿蛛(uropygids))、肢口纲(例如，鲎)或海 蛛纲(例如，海蜘蛛)。
g.真菌
本发明的生物材料可以是真菌或可源自真菌。真菌可以是，例如 子囊菌门(子囊菌)、担子菌门(珊瑚菌)、壶菌门(壶菌)、半知菌门或接 合菌门。真菌可以是根霉属(Rhizopus)、水玉霉属(Pilobolus)、 节丛孢属(Arthrobotrys)、曲霉菌属(Aspergillus)、异水霉属 (Allomyces)、壶菌属(Chytridium)、蘑菇属(Agaricus)、捕蝇 蕈属(Amanita)、丝膜菌属(Cortinarius)、链孢霉属(Neurospora)、 羊肚菌属(Morchella)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、 念珠菌属(Candida)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或麦角菌 属(Ergot)。在特别的实施方案中，真菌可以是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albicans)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。
h.植物
本发明的生物材料可以是植物或可源自植物。植物可以是苔藓植 物(例如，藓类、苔类、金鱼藻)、石松植物(例如，石松类、扁叶石松)、 木贼纲植物(例如，木贼类)、蕨类植物(例如，蕨类)、苏铁纲植物(例 如，苏铁类)、麻藤类(例如，买麻藤属、麻黄属、千岁兰属)、针叶 植物(例如，松柏类)、银杏类植物(例如，银杏)或有花植物(例如，显 花植物)。有花植物可以是单子叶植物或双子叶植物。单子叶植物的非 限制性实例包括小麦、玉米、裸麦、水稻、草坪草、高粱、粟、甘蔗、 百合、鸢尾、龙舌兰、芦荟、兰科植物、凤梨科植物和棕榈科植物。 双子叶植物的非限制性实例包括烟草、番茄、马铃薯、大豆、向日葵、 苜蓿、芸苔、玫瑰、拟南芥、咖啡树、柑橘类水果、豆、苜蓿和棉花。
i.原生生物
本发明的生物材料可以是原生生物或可源自原生生物。原生生 物可以是红藻门(例如，红藻)、褐藻门(例如，褐藻、海藻)、绿藻门(例 如，绿藻)、裸藻门(例如，裸藻)、粘菌门(例如，粘菌)、卵菌纲(例 如，水霉、霜霉、马铃薯疫病)或硅藻门(例如，硅藻)。
j.原核生物
在本发明的某些方面，生物材料是原核生物或源于原核生物。在 某些实施方案中，原核生物是古细菌(archaebacteria)。古细菌可以 是例如泉古菌门(Euryarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)、 初古菌门(Korarchaeota)或纳古菌门(Nanoarchaeota)。在某些方 面，泉古菌门是杆菌纲(Halobacteria)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、 甲烷球菌纲(Methanococci)、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、甲 烷叠球菌科(Methanosarcinae)、甲烷火菌纲(Methanopyri)、古球 状菌纲(Archeoglobi)、热原体纲(Thermoplasmata)或热球菌纲 (Thermococci)。古细菌具体的非限制性实例包括：嗜热古菌 (Aeropyrum pernix)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、 死海盐盒菌(Halobacterium marismortui)和嗜酸热原体 (Thermoplasma acidophilum)。
在某些实施方案中，原核生物是真细菌(Eubacteria)。真细菌 可以是例如，放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、 拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿色硫细菌(Green sulfur bacteria)、 衣原体门(Chlamydiae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门 (Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、 脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门 (Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、纤维杆菌门 (Fibrobacteres)/酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、 梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝 化螺旋菌门(Nitrospirae)、杂食细菌门(Omnibacteria)、浮霉菌 门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门 (Spirochaetes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)或热袍菌 门(Thermotogae)。放线菌门的非限制性实例包括放线菌属 (Actinomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属 (Corynebacterium)、弗兰克菌属(Frankia)、细球菌属(Micrococcus)、 单孢丝菌属(Micromonospora)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、丙 酸菌属(Propionibacterium)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。放 线菌的具体实例包括麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分 支杆菌(Mycobacterium tuberculosise)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、痤疮丙 酸杆菌(Propionibacterium acnes)和马红球菌(Rhodococcus equi)。
产水菌门的非限制性实例包括产水菌属(Aquifex)、 Hydrogenivirga、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、氢杆菌 (Hydrogenobaculum)、Thermocrinis、Hydrogenothermus、 Persephonella、Sulfurihydrogenibium、巴氏丝菌属(Balnearium)、 除硫杆菌属(Desulfurobacterium)和热弧菌属(Thermovibrio)。厚 壁菌门的非限制性实例包括牙胞杆菌属(Bacilli)、梭菌属(Clostridia) 和柔膜菌(Molecutes)的细菌。厚壁菌门的具体实例包括：无害李 斯特氏菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色酿脓葡萄 球菌(Staphylococcus aureus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、产气 荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)、生殖器支原体 (Mycoplasma genitalium)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、 肺支原体(Mycoplasma pulmonis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、变形链球菌 (Streptococcus mutans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和粪肠 球菌(Enterococcus faecalis)。
衣原体门/疣微菌门的非限制性实例包括细菌例如沙眼衣原体 (Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、 鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)。异常球菌-栖热菌门的非限制性 实例包括异常球菌属和栖热菌属。
变形菌门是革兰氏阴性细菌。变形菌门的非限制性实例包括埃希 杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、弧菌属(Vibrio)、 立克次体属(Rickettsia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、布鲁氏杆 菌属(Brucella)、根瘤菌属(Rhizobium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、 博尔德氏杆菌(Bordetella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、Buchnera、 耶尔森菌属(Yersinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属 (Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、 巴斯德菌属(Pasteurella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、军团杆 菌属(Legionella)、Mannheimia、柯克斯体属(Coxiella)、气单胞 菌属(Aeromonas)、土拉菌属(Francisella)、莫拉菌属(Moraxella)、 假单胞菌属(Pseudomonas)、弯曲菌属(Campylobacter)和螺杆菌 属(Helicobacter)。变形菌门的具体实例包括：康氏立克次氏体 (Rickettsia conorii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、地 方性斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、牛埃里希体(Ehrlichia bovis)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、羊流产布氏 杆菌(Brucella melitensis)、根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)、脑膜 炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitides)、副百日咳博代氏(杆)菌 (Bordetella parapertussis)、百日咳博代氏(杆)菌(Bordetella pertussis)、鼻疽伯克氏菌(Burkholderi mallei)、类鼻疽伯克氏菌 (Burkholderi pseudomallei)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、 大肠杆菌(Escherichia coli)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肠结肠炎耶 尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、 弗氏志贺氏菌(Shgella flexneri)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、 志贺痢疾杆菌(Shigella dysenterica)、流感(嗜血)杆菌(Haemophilus influenzae)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、放线 共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、胸膜肺炎放 线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、睡眠嗜血杆菌 (Haemophilus somnus)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、曼氏溶血杆菌(Mannheimia haemolytica)、霍乱弧 菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、 伯纳特氏立克次氏体(Coxiella burnetii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、土拉热弗朗 西丝氏菌(Francisella tularesis)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单 胞菌(Pseudomonas putida)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) 和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)。
螺旋体门的非限制性实例包括短螺旋体科(Brachyspiraceae)、 钩端螺旋体科(Leptospiraceae)和螺旋体科(Spirochaetaceae)的细 菌。螺旋体门的具体实例包括博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和 梅毒螺旋体(Treponema pallidum)。
2.不同类型的生物物质
本发明的方法和仪器可应用于生物。可以诱导生物的停滞或可以 诱导生物的细胞、组织和/或器官内的停滞。考虑用于本发明方法和仪 器的、可以在其中诱导停滞的生物物质仅限于包含利用氧来产生能量 的细胞的范围。
可以在包括心、肺、肾、肝、骨髓、胰、皮肤、骨、静脉、动脉、 角膜、血、小肠、大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、 子宫和脐带在内的细胞、组织或器官中诱导停滞。
而且，可以在以下类型的细胞中诱导停滞：血小板、髓细胞、红 血球、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平 滑肌细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞、神经胶质细胞、神经细胞、分 泌细胞、屏障功能细胞、收缩细胞、吸收细胞、粘膜细胞、缘细胞(来 自角膜)、干细胞(全能性、多能性或多潜能性)、未受精的或受精的 卵母细胞或精细胞。
此外，可以在植物或植物的部分，包括果实、花、叶、茎、种子、 插条中诱导停滞。植物可以是农业、药用或观赏植物。在植物中停滞 的诱导可以增强整株植物或植物的部分的储藏期或病原体抗性。
本发明的方法和仪器可以用于诱导体内生物物质的停滞。这可用 于保护和/或保藏生物物质或生物自身或用于预防对它们或整个生物 的损害或损伤。
3.测定法
停滞可以通过许多方式，包括通过定量生物样品消耗的氧的量、 样品产生的二氧化碳的量(细胞呼吸的间接测量)或通过表征运动力 来测量。
为了测定氧消耗的速率或二氧化碳产生的速率，将生物物质置于 具有两个开口(用于气体输入和输出)密封的腔室内。将气体(室内 空气或其它气体)以给定流速通入所述腔室内并流出出口以在该腔室 内维持大约1个大气压。在暴露于该腔室之前和之后，将该气体通过 二氧化碳检测器和或氧气检测器来测量(每秒)该气体混合物中每种 化合物的量。比较随时间变化的这些值得到氧消耗或二氧化碳产生的 速率。
II.氧拮抗剂和其它活性化合物
本发明涉及方法、组合物和制造品，所述的方法、组合物和制造 品涉及一种或多种可作用于生物物质以至于产生许多效应的试剂，所 述的效应包括，但不限于，诱导停滞、增强或增加存活力、可逆地抑 制代谢、诱导细胞或生物的代谢和活性、减少氧需求、减少或防止损 伤、防止缺血型损伤、防止老化或衰老，和/或获得多种在此讨论的治 疗性应用。在某些实施方案中，所述的试剂适格作为“活性化合物”。
在一些实施方案中，所述的试剂是氧拮抗剂，其可以直接或间接 起作用。氧代谢是需氧后生动物生命的一个基本要求需氧呼吸负责 多数动物中绝大多数的能量产生，并也用于维持进行重要的细胞反应 必须的氧化还原电位。在低氧时，降低的氧利用度导致在电子传递链 最终步骤中电子到分子氧的无效转移。这种无效既导致需氧能量产生 的降低和又导致破坏性自由基产生的增加，这主要是由于在复合物III 处电子的过早释放以及通过细胞色素氧化酶形成的O2-(Semenza， 1999)。有限的能量供应和自由基损伤可以干扰基本的细胞过程，例 如蛋白质合成和细胞膜极性的维持(Hochachka等，1996)，并且将 最终导致细胞死亡。
在其它实施方案中，所述试剂是保护性代谢剂。代谢通常理解为 指生命所需要的(细胞或生物中)化学过程；它们涉及多种反应来维 持能量产生和合成(合成代谢)和分解(分解代谢)复杂分子。
在本发明的某些实施方案中，活性化合物具有如在此描述的式I 或IV列出的化学结构，或是式I或IV的前体。
在此描述了多种化学结构和化合物。以下定义应用于用于描述在 此讨论的这些结构和化合物的术语：
“烷基”，在单独使用或在其它术语例如“芳基烷基”、“氨基烷基”、 “硫代烷基”、“氰基烷基”和“羟基烷基”中使用时，指具有一个至大约 20个碳原子的直链的或分支的基团。术语“低级烷基”指C1-C6烷基基 团。如在此使用的，术语烷基包括用羟基、卤素(例如F、Cl、Br、I)、 卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、氰基、异氰基、羧基(-COOH)、 烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、 巯基、烷硫基、硫氧基(sulfoxy)、磺酰基、芳基磺酰基、烷基磺酰 基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环基、杂环烷基、酰氨基 (amidyl)、烷基亚氨羰基、脒基、胍基(guanidono)、肼基、酰肼、 磺酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)等基团取代的那些基 团。这些基团的实例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、 正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。
“羟基烷基”指用一个或多个羟基基团取代的、如在此定义的烷基 基团。羟基烷基基团的实例包括但不限于羟甲基、2-羟乙基、2-羟丙 基、3-羟丙基、2-羟丁基、3-羟丁基、4-羟丁基、2，3-二羟基丙基、1-(羟 甲基)-2-羟乙基、2，3-二羟基丁基、3，4-二羟基丁基和2-(羟甲基)-3-羟 丙基等。
“芳基烷基”指基团R′R-，其中烷基基团“R”用芳基基团“R′”取 代。芳基烷基基团的实例包括但不限于苄基、苯乙基、3-苯基丙基等。
“氨基烷基”指基团H2NR′-，其中烷基基团用氨基基团取代。这 种基团的实例包括氨甲基、氨乙基等。“烷基氨基烷基”指用烷基氨基 基团取代的烷基基团。
“烷基磺酰氨基”指附加至如在此定义的烷基的磺酰氨基 (-S(O)2-NRR′)。
“硫烷基”指其中烷基用一个或多个巯基取代。“烷基硫烷基”指其 中烷基用一个或多个烷硫基取代。实例包括但不限于甲基硫甲基、乙 基硫异丙基等。“芳基硫烷基”指其中如在此定义的烷基用一个或多个 芳硫基取代。
“羧基烷基”指基团-RCO2H，其中烷基基团用羧基取代。实例包 括但不限于羧甲基、羧乙基、羧丙基等。
“亚烷基”指桥连烷基基团。
术语“链烯基”指不饱和的、无环烃基，因为其含有至少一个双键。 这种链烯基含有大约2至大约20个碳原子。术语“低级链烯基”指C1-C6 链烯基基团。如在此使用的，术语链烯基团包括用烷基基团取代的那 些基团。合适的链烯基团的实例包括丙烯基、2-氯丙烯基、丁烯-1-基、 异丁烯基、戊-1-烯-1-基、2-2-甲基-1-丁烯-1-基、3-甲基-1-丁烯-1-基、 己-2-烯-1-基、3-羟己-1-烯-1-基、庚-1-烯-1-基和辛-1-烯-1-基等。
术语“炔基”指不饱和的、无环烃基，因为其含有一个或多个三键， 这种基团含有大约2至大约20个碳原子。术语“低级炔基”指C1-C6 炔基基团。如在此使用的，术语炔基包括用烷基基团取代的那些基团。 合适的炔基基团的实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁-1-炔-1- 基、丁-1-炔-2-基、戊-1-炔-1-基、戊-1-炔-2-基、4-甲氧基戊-1-炔-2- 基、3-甲基丁-1-炔-1-基、己-1-炔-1-基、己-1-炔-2-基、己-1-炔-3-基、 3，3-二甲基-1-丁炔-1-基等。
“烷氧基”指基团R′O-，其中R′是如在此定义的烷基基团。实例 包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丙氧基、叔丁氧 基等。“烷氧基烷基”指用一个或多个烷氧基取代的烷基基团。实例包 括但不限于甲氧基甲基、乙氧基乙基、甲氧基乙基、异丙氧基乙基等。
“烷氧羰基”指基团R-O-C(O)-，其中R是如在此定义的烷基基团。 烷氧羰基基团的实例包括但不限于甲氧羰基、乙氧羰基、仲-丁氧羰基、 异丙氧羰基等。烷氧硫代羰基指R-O-C(S)-。
“芳基”指由一个单独的环或一个或多个稠合的环组成的单价芳 香碳环基团，稠合环中的至少一个环在性质上是芳香的，其可任选被 一个或多个，优选一个或两个以下取代基取代，除非另外指出，例如： 羟基、卤素(例如F、Cl、Br、I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、 烷硫基、氰基、羧基(-COOH)、烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、 氨基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、巯基、烷硫基、硫氧基、磺酰基、 芳基磺酰基、烷基磺酰基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环 基、杂环烷基、酰氨基、烷基亚氨基、脒基、胍基、肼基、酰肼、磺 酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)。可替代地，芳环的两 个邻接原子可以用亚甲二氧基或亚乙二氧基取代。芳基基团的实例包 括但不限于苯基、萘基、联苯基、茚满基、二苯二丁对蒽二酚基、叔 丁基苯基、1，3-苯并间二氧杂环戊烯基等。
“芳基磺酰氨基”指附加至如此处定义的芳基的、如此处定义的磺 酰氨基。
“硫芳基”指用一个或多个巯基取代的芳基。
“烷基氨基”指用一个或两个烷基基团取代的氨基基团。实例包括 单取代的N-烷基氨基基团和N，N-二烷基氨基基团。实例包括N-甲氨 基，N-乙氨基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、N-甲基，N-乙基 -氨基等。
“氨基羰基”指基团H2NCO-。“氨基羰基烷基”指一个或多个氨基 羰基基团取代的如此处定义的烷基基团。
“酰氨基”指RCO-NH-，其中R是H或如此处定义的烷基、芳基 或杂芳基。
“亚氨基羰基”指4个共价键位点中的两个与亚氨基共有的碳基。 这种亚氨基羰基基团的实例包括，例如，C＝NH、C＝NCH3、C＝NOH 和C＝NOCH3。术语“烷基亚氨基羰基”指用烷基取代的亚氨基。术语 “脒基”指键合至亚氨基羰基基团的两个可利用键之一的、经取代或未 经取代的氨基。这种脒基基团的实例包括，例如，NH2-C＝NH、 NH2-C＝NCH3、NH-C＝NOCH3和NH(CH3)-C＝NOH。术语“胍基”指如 上面定义的键合至氨基的脒基，其中所述的氨基可键合至第三个基团。 这种胍基基团的实例包括，例如NH2-C(NH)-NH-、 NH2-C(NCH3)-NH-、NH2-C(NOCH3)-NH-和 CH3NH-C(NOH)-NH-。术语“肼基”指-NH-NRR′，其中R和R′独立 地是氢、烷基等。“酰肼”指-C(＝O)-NH-NRR′。
术语“杂环基”指饱和的和部分饱和的含杂原子的环形基团，其具 有4到15个环成员，在此称为“C4-C15杂环基”，环成员选自碳、氮、 硫和氧，其中至少一个环原子是杂原子。杂环基基团可以含有一个、 两个或三个环，其中这种环可以以悬垂的方式连接，或可以稠合。饱 和的杂环基团的实例包括含有1至4个氮原子的饱和3至6元杂单环 基团[例如吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基等]；含有1至2个 氧原子和1至3个氮原子的饱和的3至6元杂单环基团[例如吗啉基]； 含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的饱和的3至6元杂单环基团[例 如噻唑烷基等]；部分饱和的杂环基团的实例包括二氢噻吩、二氢吡喃、 二氢呋喃和二氢噻唑。杂环基团的非限制性实例包括2-吡咯啉基、3- 吡咯啉基、吡咯烷基(pyrrolindinyl)、1，3-二氧戊环基、2H-吡喃基、 4H-吡喃基、哌啶基、1，4-二_烷基、吗啉基、1，4-二噻烷基、硫代吗 啉基等。这种杂环基团可以任选用基团如取代基，例如羟基、卤素(例 如F、Cl、Br、I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、氰基、 羧基(-COOH)、烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨基、烷基 氨基、脲(--NHCONHR)、巯基、烷硫基、硫氧基、磺酰基、芳基磺酰 基、烷基磺酰基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环基、杂环 烷基、酰氨基、烷基亚氨基羰基、脒基、胍基、肼基、酰肼、磺酰基 钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)取代。
“杂芳基”指具有一个或多个环，优选一个到三个环的单价芳香环 基团，每个环有4到8个原子，在环内整合了一个或多个杂原子，优 选一个或两个(选自氮、氧或硫)，所述杂芳基可任选用一个或多个， 优选一个或两个选自以下的取代基取代，除非另外指出，例如：羟基、 卤素(例如F、Cl、Br、I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫 基、氰基、羧基(-COOH)、烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨 基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、巯基、烷硫基、硫氧基、磺酰基、 芳基磺酰基、烷基磺酰基、磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环 基、杂环烷基、酰氨基、烷基亚氨基羰基、脒基、胍基、肼基、酰肼、 磺酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基钠(-RSO3Na)。杂芳基的实例包括 但不限于咪唑基、_唑基、噻唑基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡啶 基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻喃基、苯 并咪唑基、苯丙_唑基、苯并噻唑基、苯并吡喃基、吲唑基、吲哚基、 异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、二氮杂萘基、苯磺酰基-噻吩基等。
“杂芳氧基”指连接至氧基的杂芳基基团。这种基团的实例包括， 但不限于，2-硫代苯氧基、2-嘧啶氧基、2-吡啶氧基、3-吡啶氧基、4- 吡啶氧基等。
“杂芳氧基烷基”指用一个或多个杂芳氧基取代的烷基基团。这种 基团的实例包括2-吡啶氧基甲基、3-吡啶氧基乙基，4-吡啶氧基甲基 等。
“环烷基”指由一个或多个环，典型地一个或两个环组成的单价饱 和的碳环基团，每个环有3个到8个碳，所述环烷基可通常用一个或 多个以下取代基取代，除非另外指出：羟基、卤素(例如F、Cl、Br、 I)、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、氰基、羧基(-COOH)、 烷氧羰基(-COOR)、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基、脲(--NHCONHR)、 巯基、烷硫基、硫氧基、磺酰基、芳基磺酰基、烷基磺酰基、磺酰氨 基、芳基磺酰氨基、杂芳基、杂环基、杂环烷基、酰氨基、烷基亚氨 基羰基、脒基、胍基、肼基、酰肼、磺酰基钠(-SO3Na)、磺酰烷基 钠(-RSO3Na)。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、 3-乙基环丁基、环戊基、环庚基等。“环烯基”指具有3至10个碳原子 和一个或多个碳-碳双键的基团。典型的环烯基基团具有3至7个碳原 子。实例包括环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基等。“环烯基 烷基”指其中此处所定义的烷基被一个或多个环烯基取代的基团。
“环烷氧基”指连接至氧基的环烷基基团。实例包括但不限于环己 氧基、环戊氧基等。
“环烷氧基烷基”指用一个或多个环烷氧基取代的烷基基团。实例 包括环己氧基乙基、环戊氧基甲基等。
“亚磺酰基”指-S(O)-。
“磺酰基”指-S(O)2-，其中“烷基磺酰基”指用烷基基团取代的磺酰 基RSO2-，芳基磺酰基指连接至磺酰基的芳基。“磺酰氨基”指 -S(O)2-NRR′。“磺酸”指-S(O)2OH。“磺酸酯”指-S(O)2OR，其中R是 基团例如磺酸烷基酯中的烷基。
“硫基”指-S-。“烷硫基”指RS-，其中巯基基团用烷基R取代。 实例包括甲硫基、乙硫基、丁硫基等。“芳硫基”指R′S-，其中硫基用 如此处定义的芳基取代。实例包括但不限于苯硫基等。实例包括但不 限于苯硫甲基等。“烷基硫代磺酸”指基团HO3SR′S-，其中烷硫基用磺 酸基团取代。
“硫代次磺酰基”指-S-SH。
“酰基”，在单独或组合时，指键合至选自例如以下基团的羰基或 硫代羰基：羟基(hydrido)、烷基、链烯基、炔基、卤代烷基、烷氧 基、烷氧基烷基、卤代烷氧基、芳基、杂环基、杂芳基、烷基亚磺酰 烷基、烷基磺酰烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、烷硫 基、芳硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳烷氧基、芳硫基和烷 硫基烷基。“酰基”的实例是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、 邻苯二甲酰基、丙二酰基、烟酰基等。
术语“酰硫基”和“酰基二硫基”分别指RCOS-和RCOSS-基团。
术语“硫代羰基”指含有以双键连接至硫原子的碳的化合物和部 分，-C(＝S)-。“烷基硫代羰基”指其中硫代羰基用如此处定义的烷基基 团R取代而形成单价基团RC(＝S)-。“氨基硫代羰基”指用氨基取代的 硫代羰基，NH2C(＝S)-。
“羰基氧基”指-OCOR。
“烷氧羰基”指-COOR。
“羧基”指-COOH。
对于具有立体异构体的那些化合物，考虑其其所有的立体异构 体，包括顺式/反式几何异构体、非对映体和单独的对映异构体。
A.一氧化碳
一氧化碳(CO)是无色、无臭和无味的气体，其可以对动物， 包括人是有毒的。根据疾病控制中心，每年有多于450人意外地死于 一氧化碳。
它可以对其血液携带氧来维持其生存的生物是有毒性的。它可以 通过经由正常呼吸进入肺并代替血流中的氧而是有毒的。中断正常的 氧供应危害心脏、脑的功能以及身体的其它生命机能。然而，正在研 究将一氧化碳用于医学应用(Ryter等，2004)。
在百万分之50份(ppm)的量时，一氧化碳对暴露于它的人不 表现出症状。然而，在200ppm时，在2到3小时内，一氧化碳可以 引起轻度的头疼；在400ppm时，在1到2小时内，其可以引起额痛， 这可以在3小时内变得分别广泛；并且在800ppm时，其可以在45 分钟内引起头昏眼花、恶心和/或抽搐，并且使受试者在2小时内无感 觉。在大约1000ppm的水平，生物可以在暴露多于大约1-2分钟后死 亡。
由于众所周知的和充分证明了的一氧化碳对生物的毒性效应，因 而可将一氧化碳用于诱导活生物样品的停滞和/或帮助其保藏是令人 惊奇和意外的。因而考虑可将一氧化碳用于在分离的生物物质，例如 无血液的生物物质中诱导停滞(由于一氧化碳具有的对血红蛋白的效 应，其为与涉及诱导停滞的途径不同的途径)。
除了暴露于一氧化碳来诱导停滞或来限制或防止由停滞诱导剂 引起的任何损伤，本发明考虑可将一氧化碳与有助于生物材料的保藏 和/或移植/嫁接过程的试剂或方法组合使用。
B.硫属化物化合物
含有硫属元素(元素周期表第6族中的那些)的化合物(但是氧 化物除外)通常被称为“硫属化物”或“硫属化物化合物”(在此可相互 交换使用)。这些元素是硫(S)、硒(Se)、碲(Te)和钋(Po)。 普通的硫属化物除了其它元素外，还含有S、Se和Te的一种或多种。 硫属化物包括元素形式例如S和Se的微粉化的和/或纳米粒化的粒子。 可采用硫属化物化合物用作还原剂。
本发明人，尽管不受以下理论约束，认为硫属化物诱导细胞中的 停滞，以及允许调节动物中的核心体温的能力源于这些分子结合至细 胞色素氧化酶。这样一来，硫属化物抑制或降低了氧化磷酸化的活性。 硫属化物阻断自发的体温调节，即允许“温血”动物的核心体温可通过 控制环境温度来操纵的能力，被认为源于与上面列出的相同的机制- 结合至细胞色素氧化酶，并阻断或降低氧化磷酸化的活性。硫属化物 可以以液体以及气体形式提供。
硫属化物对哺乳动物可以是有毒性的，并且在一些水平上是致死 的。根据本发明，预期硫属化物的水平不应该超过合适环境中的致死 水平。硫属化物的致死水平可以例如在每种硫属化物的物质安全资料 表(Material Safety Data Sheets)中，或从可从美国政府的职业安全 与卫生管理局(OSHA)获得的信息表中找到。
虽然一氧化碳和硫属化物化合物都可以通过用作氧拮抗剂来诱 导停滞，它们具有不同的毒性效应，该效应与它们诱导停滞的能力是 分离的。而且，因为细胞色素氧化酶的不同亲和性，介导停滞效应所 需的浓度是不同的。细胞色素氧化酶对氧的亲和性与对一氧化碳的亲 和力比较是约1∶1，而对H2S的亲和力与对氧的亲和力比较表现在约 300∶1的量级上。这影响了使用停滞诱导浓度会观察到什么毒性效应。 因此，考虑硫属化物化合物特别适合用于在整个生物中诱导生物物质 的停滞和诱导整个生物的停滞。
也可以证明在撤除硫属化物前提供额外的刺激给生物物质是有 用的。特别是，预想可在移除硫属化物源前让动物接受增加的环境温 度。
1.H2S和其它含硫的化合物
硫化氢(H2S)是一种通常与石油化学和天然气体、污水、纸浆、 鞣革和食品加工相联系的潜在毒性气体。在细胞水平上的主要效应表 现为细胞色素氧化酶或其它氧化酶的抑制，导致细胞低氧。暴露于极 端水平(500ppm)导致暴脱和无意识(所谓的“击倒”效应)，然后 恢复。暴露后的效果可能持续多年，并且包括协调不能、记忆丧失、 运动功能障碍、人格改变、幻觉和失眠。
然而，多数的H2S接触在远低于这种急性毒性水平下发生。然而， 通常关心长期在亚急性水平上的接触。存在一些报道指出，在慢性的 低水平H2S暴露后，持久性的平衡能力和记忆的损伤以及改变的感觉 运动功能可能在人中发生。Kilburn和Warshaw(1995)；Kilburn (1999)。其他人已经报道，在围产期从妊娠到生产后21天每天暴露大 鼠于低的(20或50ppm)H2S 7小时，导致脑内浦肯野细胞的具有减 少的树状分歧(reduced aborization)的更长的树状分支。与相对低 水平的H2S相关的其它神经缺损包括改变的脑神经递质浓度和改变的 神经反应，例如增加的海马иEEG活动。
在暴露于中等水平的H2S的大鼠中研究了行为毒性。结果显示， 在暴露结束后H2S立即抑制了辨别回避反应(Higuchi和Fukamachi， 1997)，并且还干扰了大鼠学习诱饵诱导的辐射臂状迷宫任务(baited radial arm maze task)的能力(Partlo等，2001)。在另一个使用80 ppm H2S围产期研究中，在暴露的大鼠幼崽中没有发现神经病理学效 应或改变的运动活动、被动回避或声响惊恐反应(coustic startle response)。Dorman等，(2000)。最后，Struve等，(2001)在连续的 5天每天通过多种水平的气体，让大鼠暴露于H2S 3小时。观察到在 暴露于80ppm或更高的H2S后，运动活动、水迷宫表现和体温的显 著减少。总起来看，这些报道表明，H2S可以对哺乳动物组织的生物 化学具有多种效应，但是关于行为没有明显的反应模式。
一旦溶解于血浆中，H2S将参与一系列化学反应。所述的化学反 应是：(1)分子H2S解离形成硫氢根离子(bisulfide ion)，(2)硫氢 根离子解离形成硫离子，以及(3)水的自电离。反应在下面给出：
利用pH 7.4时平衡常数K1＝1.039E-07、K2＝6.43E-16和Kw＝ 1.019E-14，计算得到的不同物质相对于总S浓度的量是大约23％的 H2S和77％的HS-，而S2-的量趋向于0。
本发明人利用与气相色谱法和质量特异性检测偶联的萃取烷基 化(extractive alkylation)技术来定量硫化氢(根据Hyspler等，2002 改编)。这种方法包括首先与150μL由5mM的苯扎氯铵(BZK) 组成的反应缓冲液一起加入50μL血液、血清或组织提取液样品于饱 和的硼酸盐缓冲液中，所述的样品已经稀释于氮净化了的脱氧水中至 1mg/mL的浓度。首先将100μL乙酸乙酯中的15μM的4-氯-苄基甲 硫醚(4CBMS)溶液加入其中，然后加入100μL甲苯中的20mM的 五氟苄基溴(PFBBr)溶液。然后密封这种溶液并在55℃下伴随旋转 或振摇孵育2小时。在该孵育期后，然后加入200μL饱和的KH2PO4 溶液，并且移出有机相并根据Hyspler等，2002中描述的方法，通过 气相色谱法和质量特异性检测来分析。然后将这些测量值与用上面描 述的相同的方法，以已知的标准浓度(在氮净化了的脱氧水中制备， 范围为1μM-1mM的Na2S)开始而产生的标准曲线比较，以便测定 内源性的硫化氢水平。为了分析结合的和/或氧化的硫化物水平，应用 相同的方法，除了使用了变性/还原反应缓冲液外，所述的缓冲液由具 有1％的氢氧化四乙铵(TEAH)的5mM BZK和饱和的硼酸盐缓冲 液中的1mM的盐酸三(2-羧乙基)-膦(TCEP)组成，而不是上面描述 的反应缓冲液。
考虑根据本发明使用的典型的硫化氢水平包括大约1至大约150 ppm、大约10至大约140ppm、大约20至大约130ppm和大约40 至大约120ppm或其当量的经口、静脉内或经皮肤剂量。其它有关的 范围包括大约10至大约80ppm、大约20至大约80ppm、大约10至 大约70ppm、大约20至大约70ppm、大约20至大约60ppm和大约 30至大约60ppm或其等效的经口、静脉内或经皮肤剂量。也考虑， 在给定时间段内对于给定的动物，应该减少硫属化物气氛来避免受试 者中可能致死的硫属化物的积累。例如，80ppm的初始环境浓度可以 在30分钟后减少至60ppm，随后在1小时(40ppm)和2小时(20 ppm)时进一步减少。
a.H2S前体
本发明也涉及使用可以在某些条件下，例如在暴露于生物物质时 或暴露不久后，产生H2S的化合物和试剂。考虑这种前体在发生一种 或多种酶促或化学反应时产生H2S。
3.其它硫属化物
在某些实施方案中，还原剂结构化合物是二甲亚砜(DMSO)、 二甲硫醚(DMS)、甲硫醇(CH3SH)、巯基乙醇、硫氰酸、氰化氢、 甲硫醇(MeSH)或CS2。在特殊的实施方案中，氧拮抗剂是CS2、 MeSH或DMS。这些分子的大小量级的化合物是特别考虑的(即，在 它们的分子量的大约50％内)。
设想对于诱导停滞有用的其它化合物包括，但不限于以下结构， 这些结构的许多可容易获得并且对本领域技术人员是已知的(通过 CAS号确定)：104376-79-6(头孢曲松钠盐)；105879-42-3；1094-08-2 (盐酸二乙异丙嗪)；1098-60-8(盐酸三氟丙嗪)；111974-72-2；113-59-7； 113-98-4(青霉素G K+)；115-55-9；1179-69-7；118292-40-3； 119478-56-7；120138-50-3；121123-17-9；121249-14-7；1229-35-2； 1240-15-9；1257-78-9(乙二磺酸甲哌氯丙嗪盐)；128345-62-0；130-61-0 (盐酸甲硫哒嗪)132-98-9(青霉素V K+)；13412-64-1(双氯青霉素Na+水 合物)；134678-17-4；144604-00-2；146-54-3；146-54-5(盐酸氟非纳嗪)； 151767-02-1；159989-65-8；16960-16-0(促肾上腺皮质激素片段1-24)； 1982-37-2；21462-39-5(盐酸氯林霉素)；22189-31-7；22202-75-1； 23288-49-5(普罗布考)；23325-78-2；24356-60-3(头孢吡硫)；24729-96-2 (克林霉素)；25507-04-4；26605-69-6；27164-46-1(头孢唑啉Na+)； 2746-81-8；29560-58-8；2975-34-0；32672-69-8(苯磺酸美索达嗪)； 32887-01-7；33286-22-5((+)-顺式-盐酸地尔硫_)；33564-30-6(头孢西 丁钠)；346-18-9；3485-14-1；3511-16-8；37091-65-9(苯咪唑青霉素钠)； 37661-08-8；3819-00-9；38821-53-3(头孢雷定)；41372-02-5；42540-40-9 (头孢孟多甲酸酯钠)；4330-99-8(异丁嗪半-(+)-酒石酸盐)；440-17-5(二 盐酸三氟比拉嗪)；4697-14-7(替卡西林二钠)；4800-94-6(羧苄基青 霉素双钠)；50-52-2；50-53-3；5002-47-1；51481-61-9(西咪替丁)； 52239-63-1(6-丙基-2-硫尿嘧啶)；53-60-1(盐酸丙嗪)；5321-32-4； 54965-21-8(丙硫咪唑)；5591-45-7(替沃噻吨)；56238-63-2(头孢呋肟 钠)；56796-39-5(头孢美唑钠)；5714-00-1；58-33-3(盐酸异丙 嗪)；58-38-8；58-39-9(羟哌氯丙嗪)；58-71-9(头孢噻吩钠)；59703-84-3(哌 拉西林钠)；60-99-1(马来酸左美丙嗪盐)；60925-61-3；61270-78-8； 6130-64-9(青霉素G普鲁卡因盐水合物)；61318-91-0(氯苄硫咪唑硝 酸盐)；61336-70-7(三水合阿莫西林)；62893-20-3(头孢哌酮钠)； 64485-93-4(头孢噻肟钠)；64544-07-6；64872-77-1；64953-12-4(拉 塔头孢霉素钠)；66104-23-2(培高利特甲磺酸盐)；66309-69-1； 66357-59-3(盐酸雷尼替丁)；66592-87-8(Cefodroxil)；68401-82-1； 69-09-0(盐酸氯丙嗪)；69-52-3(氨苄青霉素钠)；69-53-4(氨苄青霉素)； 69-57-8(青霉素G钠)；70059-30-2；70356-03-5；7081-40-5；7081-44-9(氯 唑西林钠H2O)；7177-50-6(萘夫西林钠H2O)；7179-49-9；7240-38-2(苯 唑西林钠H2O)；7246-14-2；74356-00-6；74431-23-5；74849-93-7； 75738-58-8；76824-35-6(法莫替丁)；76963-41-2；79350-37-1； 81129-83-1；84-02-6(丙氯拉嗪马来酸氢盐)；87-08-1(苯氧甲基青霉 酸)；87239-81-4；91-33-8(苄噻嗪)；91832-40-5；94841-17-5；99294-94-7； 154-42-7(6-硫鸟嘌呤)；36735-22-5；536-33-4(乙硫异烟胺)；52-67-5(D- 青霉胺)；304-55-2(内消旋-2，3-二巯基丁二酸)；59-52-9(2，3-二巯 基+丙醇)6112-76-1(6-巯嘌呤)；616-91-1(N-乙酰基-L-半胱氨酸)； 62571-86-2(卡托普利)；52-01-7(螺内酯)和80474-14-2(丙酸氟替卡松)。 考虑作为对于停滞可能有用的其它化合物包括具有式I或IV的化学结 构的那些。
C.其它拮抗剂或活性化合物和相关的环境条件
1.低氧和缺氧
低氧是一种普通的天然应激并且存在数种十分保守的反应，其促 进细胞适应低氧环境。为了抵偿低氧中需氧能量产生能力的降低，细 胞必须增加无氧能量产生或降低能量需求(Hochachka等，1996)。 这两种反应的实例在后生动物中是普通的并且利用的特殊反应通常取 决于可提供给细胞的氧的量。
在轻度低氧中，氧化磷酸化作用仍然部分活跃，所以一些需氧能 量产生是可能的。对这种情况的细胞反应(其部分通过可诱导低氧的 转录因子HIF-1介导)是通过上调涉及无氧能量产生的基因，例如糖 酵解酶和葡萄糖转运蛋白来补足减少的需氧能量产生(Semenza， 2001；Guillemin等，1997)。这种反应也促进了防止自由基诱导的 损伤的抗氧化剂例如过氧化氢酶(catylase)和过氧化物歧化酶的上调。 因此，在轻度低氧中细胞能维持接近含氧正常水平的活动。
在极端形式的低氧(称为“无氧”-在此定义为＜0.001kPa O2)中 -氧化磷酸化作用停止并因而产生能量的能力显著降低。为了在这种 环境中存活，细胞必须通过减少细胞活动来降低能量需求(Hochachka 等，2001)。例如，在剥夺了氧的海龟肝细胞中，细胞限制活动例如 蛋白质合成、离子通道活性和合成代谢途径的定向反应导致ATP需求 减少94％(Hochachka等，1996)。在斑马鱼(Danio rerio)胚中， 暴露于无氧导致心搏、运动、细胞周期进展和发育进展的完全停止 (Padilla等，2001)。类似地，秀丽隐杆线虫通过进入滞生而对无氧 发生反应，在滞生中，所有可观察到的运动，包括细胞分裂和发育进 展停止(Padilla等，2002；Van Voorhies等，2000)。秀丽隐杆线虫 可以保持滞生24小时或更久，并且一旦回到含氧量正常，将恢复高的 存活力。这种反应使得丽隐杆线虫能通过减少在能量方面消耗大的过 程的比率并防止损伤、不可撤销的事件(例如非整倍状态)的发生而 在低氧应激下存活(Padilla等，2002；Nystul等，2003)。
一个最近发现的反应是由血红素加氧酶-1进行的低氧诱导一氧 化碳的产生(Dulak等，2003)。内源性产生的一氧化碳可以激活信 号级联反应，该级联反应通过抗细胞凋亡(Brouard等，2003)和抗 炎性(Otterbein等，2000)活性来减轻低氧损伤，并且通过灌注外源 性的一氧化碳在移植模型中可获得类似的细胞保护效果(Otterbein 等，2003；Amersi等，2002)。在更高的浓度下，一氧化碳与氧竞争 结合至含有铁的蛋白质，例如线粒体细胞色素和血红蛋白(Gorman 等，2003)，可是还没有研究在低氧中这种活性可能具有的细胞保护 效果。
尽管存在对抗低氧损伤的这些复杂的防御机制，低氧仍然常常是 一种损伤性应激。例如，哺乳动物具有血红素加氧酶-1和HIF-1两者， 并且一些证据提示滞生在哺乳动物中也是可能的(Bellamy等，1996； Alam等，2002)。然而，由于创伤例如心脏病发作、中风或失血导 致的低氧性损伤是死亡的一个主要原因。幸免于低氧应激的两种基本 策略(保持活跃或滞生)的局限性的理解受这样的事实阻碍：其是基 于在多种条件下的多种系统中进行的研究。
当正常生理水平的氧没有供应至细胞或组织时，出现“低氧”。“含 氧量正常”指所讨论的特殊细胞类型、细胞状态或组织的正常生理水平 的氧。“缺氧”是没有氧。“低氧条件”是导致细胞低氧的那些条件。这 些条件依赖于细胞类型，和取决于组织或器官内的细胞的特殊结构或 位置以及细胞的代谢状况。为了本发明的目的，低氧条件包括其中氧 浓度是或低于正常大气状况的条件，其少于20.8、20、19、18、17、 16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、 0％；可替代地，这些数字可以代表在1个大气压(101.3kPa)下的 气氛的百分比。0百分比的氧浓度定义了缺氧条件。因此，低氧条件 包括缺氧条件，尽管在一些实施方案中，实施不少于0.5％的低氧条件。 如在此使用的，“含氧量正常的条件”等同于大约20.8％或更高的氧浓 度。
获得低氧或缺氧的标准方法是充分确立的，并且包括使用依赖于 化学催化剂来从其中除去氧的环境室。这类室可以从例如BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)商业获得，其为GASPAK Disposable Hydrogen+Carbon Dioxide Envelopes或BIO-BAG环境室。可替代 地，氧可以通过用非氧气体，例如氮气交换室内的空气来耗竭。氧浓 度可以例如用FYRITE氧分析仪(Bacharach，Pittsburgh PA)测定。
考虑本发明的方法可使用暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物和 与室内空气比较改变氧浓度的组合。而且，含有生物物质的环境的氧 浓度可以是约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％， 或可源于其中任何范围。而且，考虑浓度的变化就与室内空气或与对 照环境相比的降低或增加来说可以是任何上面的百分比或范围。
D.线粒体靶向试剂
在一些方面本发明的实施方案考虑选择性靶向线粒体以便增强 活性。这种选择性的线粒体靶向已经通过缀合试剂至亲脂性三苯基_ 阳离子来实现，三苯基_阳离子通过跨越线粒体内膜的大电位(150 至-180mv)驱动，很容易穿过脂双层并且在线粒体基质内蓄积大约 1000倍。已经制备了维生素E和辅酶Q两者的类似物并用于成功地 靶向线粒体。(Smith等，1999；Kelso等，2001；Dhanasekaran等， 2004)。已经制备了硫醇，溴化丁基三苯_(thibutyltriphosphonium bromide)(在下面显示)并用于靶向线粒体，其在线粒体中蓄积数 百倍(Burns等，1995；Burns & Murphey，1997)。
这种缀合物看起来是活性化合物的合适候选物。除了游离的硫醇 试剂，硫代次磺酰基取代的化合物(H-S-S-R)可能是有用的。考虑 在一些实施方案中，所述的试剂具有以下结构：
其中Z是P或N；
R1、R2和R3是芳基、杂芳基、烷基芳基、环烷基或烷基(合适 的是苯基、苄基、甲苯基、吡啶基、环己基、C3-C10烷基，任选经卤 化)；
R4是-R5SR6，其中R5是C1-C10烷基，R6是H或SH、SO3H或 PO3H。
III.停滞的检测
多种可用于诱导停滞的化合物可用多种不同的检测法进行初始 地评价。停滞可以通过许多方式，包括通过定量生物样品消耗的氧的 量、样品产生的二氧化碳的量(细胞呼吸的间接测量)或通过表征能 动性来测量。
为了测定氧消耗的速率或二氧化碳产生的速率，将生物物质置于 具有两个开口(用于气体输入和输出)密封的腔室内。将气体(室内 空气或其它气体)以给定流速通入所述腔室内并流出出口以在该腔室 内维持大约1个大气压。在暴露于该腔室之前和之后，将该气体通过 二氧化碳检测器和或氧气检测器来测量(每秒)该气体混合物中每种 化合物的量。比较随时间变化的这些值，得到氧消耗或二氧化碳产生 的速率。
已经建立了其它筛选方法来鉴定候选的活性停滞化合物。可以采用这 些筛选方法及其变体作为本发明的一部分或用于实现本发明的方面。
A.使用斑马鱼的测定法
用于停滞诱导剂的筛选测定法用48小时大的斑马鱼(D.rerio) 胚胎建立。这些胚是透明的，允许人用具有4-20倍透镜的解剖显微镜 观察心搏和导致的血液流入沿背面的主血管中并流入尾部。这些动物 中的心率是生物代谢活动的一个指标，这样心率的减少表示代谢的减 少。将胚胎从它们的卵外壳解剖出来并在平底聚苯乙烯组织培养板中 的每个孔分配5个，并且在1mL标准鱼水中孵育。所述的鱼水由每5 加仑1茶匙Instant Ocean(人造海水混合物，Aquarium Systems公 司)构成。将氯化钙调整至150ppm并且将碳酸氢钠调整至～100ppm。 该水的电导率是900微西门子，pH是约6.5-7.4。硫化氢溶液通过将 用室内空气平衡的硫化氢的混合物以每分钟100立方厘米的速度在含 有150mL鱼水的烧瓶中鼓泡60-90分钟。据估计这足以获得饱和的 或近饱和的或大部分饱和的硫化氢溶液。基于在1个大气压和室温下 已知的硫化氢在pH 7的林格氏溶液中的溶解度，据估计鱼水含有大 约0.1摩尔硫化氢。将鱼暴露于硫化氢溶液并在随后的24小时通过计 数每分钟的心搏次数来监测它们的心率。对照鱼(仅暴露于鱼水)具 有每分钟大约160-200次搏动的心搏次数，这在24小时的观察期间没 有显著改变。到暴露于含有硫化氢的鱼水后2-3小时，心搏次数减少 大约一半至每分钟60-80次搏动。到4小时，心搏次数进一步减少， 包括一些实例的心搏次数为0或每分钟仅几次。在暴露5小时后，用 正常的鱼水替换硫化氢溶液，并让胚胎在28摄氏度下恢复过夜。到起 始暴露于硫化氢后24小时，经处理过并经冲洗的动物表现出每分钟 160-200次搏动的正常心率。由于硫化氢引起了心搏的休眠，在一些 情形中引起了停止，随后恢复到常态，认为硫化氢已经通过该筛选测 定法的标准鉴定为停滞诱导剂或其它活性化合物。
B.使用线虫的测定法
用线虫(秀丽隐杆线虫)建立筛选测定法。线虫在4摄氏度下不 能很好的存活，这样在该温度下24小时，它们全部死亡。将蠕虫在将 它们暴露于4摄氏度下16小时之前，在室温下暴露于含有Y％一氧 化碳的气氛X分钟。与全都死亡的预先暴露于室内空气的对照蠕虫比 较，一氧化碳处理的蠕虫在暴露于低温后以高的存活力存活。由于一 氧化碳是一种已知的线虫和新生儿包皮角质形成细胞中的停滞诱导 物，线虫测定法能够在蠕虫预平衡于停滞诱导物或其他活性化合物中 时，通过它们增加暴露于致死性低温的蠕虫的存活力的能力鉴定诱导 停滞的化合物。
IV.治疗或预防性应用
A.创伤
在一些实施方案中，本发明可用于治疗遭受或易遭受损伤的患 者。创伤可由外部伤害(例如烧伤、伤口、切除伤、枪击伤，或手术 创伤)内部伤害(例如导致循环急剧下降的中风或心脏病发作)或由 于非-侵入性应激(例如暴露于低温或辐射)而引起的循环下降引起。 在细胞水平上，创伤常常导致细胞、组织和/或器官暴露于低氧，从而 导致诱导程序化细胞死亡，或“细胞凋亡”。系统性地，创伤导致诱导 了一系列的生化过程，例如凝固、炎症、低血压，并可引起休克，如 果休克持续，则其可导致器官机能障碍、不可逆的细胞损害和死亡。 生物学过程是设计用来防卫躯体以免于创伤性伤害；然而它们可导致 一连续事件，这些事件证明是有害的，并在一些情况下是致命的。
因此，本发明考虑让组织、器官、四肢和甚至整个生物进入停滞， 作为保护它们免于创伤的有害作用的手段。在其中医学看护不容易获 得的特定情况中，体内或离体诱导停滞，可替代地，结合降低组织、 器官或生物的温度，可为受试者“争取时间”，给受试者提供医学看护， 或运送受试者去接受医学看护。本发明还考虑了用于通过防止/延缓可 导致延缓的创伤愈合和组织再生的生物学过程来诱导组织再生和创伤 愈合的方法。关于这一点，在其中存在对肢体或生物有大的伤口的情 况中，体内或离体诱导停滞，可替代地，结合降低组织、器官或生物 的温度可通过管理抑制愈合和再生的生物学过程来帮助创伤愈合和组 织再生过程。
除了下面论述的创伤愈合和出血性休克，可实施本发明方法来预 防或治疗创伤例如心跳停止或中风。本发明对于来自急救外科手术操 作，例如开胸术、剖腹术和脾横切的损伤风险具有特别的重要性。
1.伤口愈合
在许多情况下，伤口和组织损害是难治疗的或需要过多的时间来 愈合。实例是慢性开放性创伤(糖尿病性足溃疡和3&4期压迫性溃 疡)、急性和创伤性伤口、皮瓣和移植物，以及亚急性创伤(即，裂 开的切口)。这也可应用于其它组织损伤，例如来自烟/热气吸入的烧 伤和肺损伤。
先前的试验显示冬眠可保护对抗损伤(例如，脑中的pin’s)， 因此它可能具有愈合效果。因此，该技术可用于通过让组织进入更加 代谢控制的环境来控制创伤愈合过程。更特别地，细胞或组织保持停 滞的时间长短可根据损伤而变化。在本发明的一些实施方案中，将生 物物质暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或至多约30 秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分 钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天；1、2、 3、4、5周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长。
2.血液学休克(出血性休克)
休克是一种在延迟干预时迅速进展的危及生命的状态。休克是其 中不存在充分的灌注来维持器官组织的生理需要的状态。这是深度的 血液动力学和代谢紊乱状态，其特征为循环系统不能维持对生命器官 的充分灌注。它可能由血容量不足(低血容量性休克)、心脏功能不 足(心源性休克)或血管舒缩紧张性不足所致，也称为分布性休克(神 经原性休克、败血症性休克、过敏性休克)。这通常导致患者迅速死 亡。许多病症，包括脓毒症、失血、自身调节受损和自主紧张性丧失 可产生休克或类似休克的状态。预期本发明能预防休克的所有上述状 态的不利效果，并维持经历这种休克的生物物质的生命。
在出血性休克中，失血超出了身体补偿和提供充分的组织灌注和 氧合的能力。这通常归因于创伤，但还可以由自发性出血(例如胃肠 道出血、分娩)、手术和其它原因引起。最常见地是，临床出血性休 克是由伴随不连续的突发(precipitating)事件的急性出血事件引起。 较不不常见地是，出血性休克可在有亚急性失血的慢性病症中见到。
出血的生理补偿机制包括最初的外周和肠系膜血管收缩来使血 液流回中枢循环。这随后通过进行性心搏过速来加强。侵入性监测可 显示心脏指数增加、氧输送(即DO2)增加，以及组织的氧消耗(即 VO2)增加。乳酸水平、酸-碱状态和其它标记也可提供有用的生理状 态指标。年龄、用药和共发病因素都可能影响患者对出血性休克的响 应。
出血性休克中的补偿机制失败可导致死亡。没有干预时，在严重 的出血性休克中观察到典型三峰分布的死亡。最初的死亡峰由于即刻 放血而在出血数分钟内发生。另一个峰由于进行性失代偿而在1至数 小时后发生。第三个峰由于脓毒症和器官衰竭而在数天至数周后发生。
在美国，意外伤害是年龄为1和44步之间的人中死亡率和发病 率的主要原因。在2001年，157,078名居民由于伤害而发生死亡。这 些人中，64.6％归为意外死亡，19.5％是自杀，12.9％为谋杀，2.7％未 确定意图，以及0.3％涉及法律干预或战争行动。伤害性死亡的主要原 因是机动车辆交通事故、火器和跌倒。大比例这些死亡事故起因于外 伤引起的大量失血，导致出血性休克。
在大多数外伤性损伤事件中，到达医院急诊室的患者通过急诊医 师处理并无需进行手术或外伤科(trauma service)护理而出院。然而， 有严重损伤的患者需要在损伤发生后的“黄金时间”内稳定，以提高存 活的机会并使伤残最小化。
由于多数休克事件是归因于事故导致的损伤，院前急救 (pre-hosiptal care)对于患者的存活是关键性的。院前急救包括快速 评估、稳定以及迅速运送到合适的中心进行评估和确定的护理。在患 有休克综合征的所有患者中，维持开放的气道、充分的呼吸和充分的 循环是急救治疗的主要聚焦点。评估是必需的，因为就诊者状况的变 化表明休克综合征的进展。早期干预对使组织和器官的损害最小化和 使永久性残疾最小化是至关重要的，并且早期确定主要的临床原因是 关键性的。治疗集中在纠正休克综合征的原因和减缓进展。静脉内输 入和流体复苏(通常为IV盐水)是标准的，可是，关于这一点存在 一些争论。迅速逆转血容量过低可能增加出血、移动部分形成的血块 以及稀释凝固因子。
一旦到急诊室，则集中于使生命器官的灌注和氧合最佳化。潜在 的出血的诊断和处理必须迅速实施并与处理休克同时进行。休克存在 两个主要阶段：早期代偿阶段和进行性阶段。考虑本发明的实施方案 可应用于处于任一阶段或这两个阶段的患者。
当低血容量性休克由大量出血所致时，选择的替代流体是全血或 浓缩(packed)的红细胞。拟晶体溶液将会暂时提高循环容量，但患 者还需要红细胞替代物来运送氧到组织。休克的管理集中在流体管理、 酸-碱平衡，以及提高心肌收缩。也应该处理休克的潜在原因以便减小 休克综合征的进展。在小鼠中诱导全身冬眠，则存在整体的代谢状态 的立即下降(通过CO2放出测量)。这是可逆的，并且小鼠似乎正常 发挥功能，甚至是在反复的暴露后。因此，本发明涉及用H2S(或其 它氧拮抗剂或其它活性化合物)诱导整个躯体冬眠状态，来保存患者 的生命器官和生命。这将使得能运送至受控制的环境(例如，手术)， 在该环境中可解决休克的最初原因，并然后患者以受控制的方式恢复 正常机能。对此适应症，称为“黄金时间”的损伤后的第一时间对成功 的结果至关重要。在该时间段稳定患者是主要目的，并将患者运送到 病危护理机构(例如，急诊室、手术室等)，在那里损伤可得以适当 解决。因此，将患者保持处于停滞以使得能达到该目的，并解决直接 的问题，例如休克的源、补充失血，以及重建内环境稳定是理想的。 虽然这将会有很大不同，但在多数情况下，将保持停滞的时间的量是 在损伤后约6-约72小时之间。在本发明的一些实施方案中，将生物 物质暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或至多约30秒； 1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天或更长，以 及其中的任意范围或组合。
致死性出血和导致休克并最终死亡的生理事件的生物学未完全 了解。然而，存在一些机制，通过该机制H2S可减少缺血性低氧的致 死效果。硫化氢抑制细胞色素C氧化酶并可通过抑制该酶3来减少需 氧量。需氧量减少可减少低氧水平的有害作用，包括减少代谢性酸中 毒。此外，组织巯基水平在休克过程中减少(Beck等，1954)。外来 的H2S可防止这种低硫化物(hyposulfidic)状态并维持硫的内环境稳 定。
硫化氢在动物中自然产生并显示出有效的生物活性(Kamoun， 2004)。多数蛋白质含有二硫化物连接的半胱氨酸残基，并且从游离 的巯基到二硫化物的可逆转变可调节特定的酶活性(Ziegler，1985)。 此外，硫化物是负电性的并表现出对过渡金属的高亲和力。含有过渡 金属原子的蛋白质，例如细胞色素氧化酶可深受H2S的影响。并且最 后，H2S代谢成含有还原的硫的其它分子增加了可表现特定的生物活 性的硫醇的数量。除了(或者可能由于)这些潜在的作用模式，H2S 可对心肺系统、神经内分泌系统、免疫系统和/或止血系统施加作用， 该作用最后证明在损伤和疾病中是有利的。
Mark B.Roth、Mike Morrison和Eric Blackstone在2006年4 月20日申请的、标题为“Methods，compositions and articles of manufacture for treating shock”的美国临时申请描述了对休克的治疗 并因此通过引用作为参考。
B.低体温
在又一个实施方案中，本发人建议用本发明来处理极度低体温的 患者。本发明的方法和组合物可用于在需要低体温的哺乳动物中诱导 低体温。低体温可以是轻度、中度或深度的。轻度低体温包括使核心 体温达到低于哺乳动物的正常核心体温约0.1-5摄氏度。哺乳动物的 正常核心体温通常在35和38摄氏度之间。中度低体温包括使核心体 温达到低于哺乳动物的正常核心体温约5-15摄氏度。深低体温包括使 核心体温达到低于哺乳动物的正常核心体温约15-37摄氏度。
轻度低体温在本领域已知为在非人哺乳动物和人中都是治疗上 有用和有效的。轻度低体温的治疗益处已经在人临床试验中，在关于 医院外心搏停止方面观察到。与有正常体温，或缺少轻度低体温的护 理的标准比较，将人在心搏停止时暴露于轻度低温导致生存优势和改 善的神经学结果(Bernard等，2002；The Hypothermia After Cardiac Arrest Study Group等，2002)。
本发明的方法和组合物可具有优于本领域已知的其它方法的优 势，用于在哺乳动物或人中诱导轻度、中度或深度低体温，所述的其 它方法包括，但不限于将受试者包裹在冰中，或用循环冷空气或液体 的“致冷帷罩”包裹受试者。在这些情形中，受试者抵抗降低核心体温 低于正常体温并试图通过战栗来产生热量。颤栗，以及其中产生的体 热可通过，例如减慢用标准的低体温诱导方法实现的核心体温降低的 速度，而对达到轻度低体温具有负面影响。因此，接受治疗水平的低 体温的人也用抑制颤栗(通过阻断神经肌接点处的神经传递)的药物 处理(Bernard等，2002)。
在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物与本领域已知的侵 入性方法或医疗器械组合在哺乳动物或人中诱导治疗性的低体温。这 种侵入性方法和装置包括，但不限于可插入需要低体温的受试者的脉 管系统的柔性探针或导管，其中导管的温度调节至低于受试者的正常 体温，导致与导管接触的血液冷却。冷却的血液随后引起哺乳动物的 核心体温下降。通过结合来自监测哺乳动物核心体温的热电偶监测的 反馈，可调节导管的温度以便维持预先指定的核心体温。这种用于达 到并维持轻度或中度低体温的医疗器械，在本领域中称为血管内温度 疗法，是本领域已知的并例如在www.innercool.com和 www.radiantmedical.com上有描述。
所述方法提供，给极度低体温的患者施用或让其暴露于氧拮抗剂 或其它活性化合物，然后在以控制的方式撤除氧拮抗剂或其它活性化 合物时让其逐渐恢复到正常温度。以这种方式，氧拮抗剂或其它活性 化合物缓冲了受试者体内的生物系统，以便它们可逐渐开始而不冲击 (或伤害)受试者。
在一个实施方案中，将会给予遭受低体温的受试者经口或静脉内 剂量的氧拮抗剂或其它活性化合物。由于受试者潜在的非-反应性和在 一段时间内提供受控制的剂量的能力，静脉内供给是优选的。可替代 地，如果可利用，氧拮抗剂或其它活性化合物可以以气态提供，例如 利用用于吸入的面罩或甚至是可容下整个受试者的密闭室。
理想地，在实现任何变化之前，将要稳定患者的心率、呼吸和温 度。一旦稳定，周围环境温度将会再次逐渐上升。这可容易地通过将 受试者从低温条件下移出完成。温度更受调节的增加可通过这样实现： 添加连续层的衣物或毯子、利用热度逐渐增加的热包裹物，或如果可 能，将受试者置于其温度可逐渐增加的室内。
优选在温度增加过程中监测受试者的生命体征。而且，结合增加 温度，将氧拮抗剂或其它活性化合物从受试者的环境中去除。热和氧 拮抗剂(或其它活性化合物)的处理都在合适的终点停止，该终点由 监测情况的医务人员判断，但在任何情况下该终点是在受试者的温度 和其它生命体征恢复到正常范围时。建议在停止处理后持续监测至少 24小时的一段时间。
C.高体温
在可由遗传、感染、药物或环境原因引起的某些情况下，患者可 以放松内环境稳定的体温调节，导致严重的不可控制的发热(高体温)。 这可导致死亡或长期的发病，尤其是脑损害，如果它没有得到适当控 制。
吸入80ppm H2S的小鼠立即经历冬眠。这包括在环境温度下降 低于室温时不能调节它们的体温。因此，该技术可用于在某些高体温 的状态中控制全身的体温。这将可能包括通过吸入或灌注入血液供给 施用H2S(或其它氧拮抗剂或活性化合物)来诱导冬眠状态。让患者 处于停滞下约6-约24小时之间将是有用的，在这段时间内发热源可 得到解决。在本发明的一些实施方案中，让患者暴露于氧拮抗剂或其 它活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、 20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 小时；1、2、3、4、5、6、7天或更长，以及其中的任意范围或组合。
这可与一些全身体温调节(冰浴/毯子/冷却系统)组合。
D.心麻痹和冠心病
在一些实施方案中，本发明可用作用于治疗冠心病(CHD)(包 括用于心脏旁路手术(CABG)的心麻痹)的溶液。
CHD由动脉粥样硬化引起，动脉粥样硬化是提供富氧血液给心 肌的动脉狭窄和硬化。由于动脉内壁或内衬上斑块的积累，动脉变硬 且变得狭窄。流向心脏的血液由于斑块使冠状动脉变窄而减少。这减 少了对心肌的氧供应。这可表现为：1)心绞痛，其为在心脏未获得足 够的血液时发生的胸痛或不适；2)心脏病发作，其可在血块突然切断 对心脏部分的大部分或全部血供应时发生，并且心肌中没有接受到足 够的携氧血液的细胞开始死亡，可能导致对心肌的永久性损害；3)心 力衰竭，其为在心脏不能有效地把血液泵至身体其它部分时发生；心 律不齐，其为心搏的正常节律的改变。
自1990年以来，更多的人死于CHD而不是任何其它原因。每年 有3.8百万的男性和3.4百万的女性死于CHD。在2002年，仅在美国 就有超过500,000个人直接死于心脏病。尽管提高了存活率，但在美 国四分之一的男性，以及三分之一的女性仍然在认可第一次心脏病发 作的一年内死亡。
CHD的医学治疗包括药物治疗来降低心脏病发作、心力衰竭和 中风的风险，同时改变重要的生活方式来防止冠状动脉中脂肪沉积的 进一步积累。但是，也常常需要某些类型的外科手术干预。
约三分之一的CHD患者将经历冠状动脉血管成形术和支架术 (stenting)。在气囊血管成形术过程中，采用顶端气囊 (balloon-tipped)导管将斑块推回动脉壁以使得能提高动脉中的血流 量。冠状动脉支架术通常伴随有血管成形术操作。支架是提供支架支 撑受损害的动脉壁的小的线网金属管，其减少血管在血管成形术后再 次闭合(再狭窄)的可能性。在美国，每年实施接近1百万次气囊血 管成形术。不是所有的患者都能用该技术治疗；这类患者必须进行心 脏手术。Michaels等，2002。
约10％的CHD患者将进行冠状动脉旁路嫁接术(CABG)手术。 患有严重的左总冠状动脉狭窄或阻塞的患者，或者患有涉及两条或三 条冠状动脉的疾病的那些患者通常被认为是旁路手术的候选人。在 CABG中，外科医生用来自身体另一部分的健康血管(动脉或静脉) 建立环绕冠状动脉的闭塞部分的绕路(或旁路)。在给定的手术中， 患者通常接受1至5根旁路。在该过程中，通常让心脏处于麻痹状态， 称为心麻痹(CP)，在该过程中心肺机人工地维持循环。患者在手术 过程中处于全身麻痹，其一般持续3-6个小时。
大约13％的所有患者将由于与CABG相关的原因而在30天内 再次进入医院。Hannan等，2003；Mehlhorn等，2001。再次住院的 主要原因之一是心力衰竭，可能是由于手术过程中的缺血性损害。因 此，要做许多工作来提高在心脏没有得到正常灌流的期间对心肌的保 护。
心脏手术的最近进展已集中于优化心麻痹参数，期待能防止手术 后的心室机能障碍并改善总的结果。Cohen等，1999。
将心麻痹溶液灌流通过血管和心脏的室并导致其固有的搏动停 止，同时维持器官的存活力。心麻痹(心脏的麻痹)在打开心脏手术 过程中、在获取、运输和保存用于心脏移植手术的供体心脏过程中是 期望的。
早期的心麻痹技术采用冷拟晶体溶液来起始并保持手术期间的 心搏停止。然而，已经清楚，血液性心脏麻痹促进了交叉钳过程中的 有氧心肌代谢并减少了厌氧乳酸的产生。而且，血液性心脏麻痹提高 携氧能力，增加心肌耗氧量并保持心肌的高能磷酸储备。多种不同的 心麻痹液是可利用的，并且使用心麻痹溶液的不同技术是本领域已知 的。例如，心麻痹溶液通常具有不同量的钾、镁，以及多种其它微量 成分。有时，将药物添加入心麻痹溶液中以帮助肌肉松弛和防止局部 缺血。当前方法还包括补充了合适的电解质，例如谷氨酸-天冬氨酸的 仅为血液的制剂。通常使用的溶液的具体实例是St Thomas医院溶液、 威斯康星大学溶液、Stanford溶液和Bretschneider溶液。其它新发展 的溶液的实例包括含有腺苷、胰岛素或L-精氨酸的先前提及的溶液。 改变使用心麻痹溶液时的温度也同样具有有利的效果。
连续的退行性心麻痹与间断的顺行性心麻痹的组合可在交叉钳 释放后减少心肌乳酸产生，保持ATP储备，并提高代谢恢复。温热(29 ℃)心麻痹减少心脏麻痹性停止过程中的乳酸和酸的产生，并提高手 术后的心室功能。需要至少200mL/分钟的心麻痹液流速来洗出有害 的代谢终产物并改善心室功能。目前已充分清楚，心麻痹处理的未来 方向将涉及使用心麻痹添加剂来进一步改善保护效果。例如，已试图 固定使用腺苷的缺血预调节的有利效果。类似地，已采用胰岛素心麻 痹以便通过刺激早期术后有氧代谢来增强心室效能。最后，已经证明 L-精氨酸、一氧化氮供体在试验研究中是有利的，并代表用于增强手 术中的心肌保护的进一步选择。心麻痹补充的将来益处有可能在具有 弱的心室功能的高危人群中观察到，对于所述的高危人群目前的保护 技术是不够的。目前的高危患者的发生率稳定增加，并且这些病例， 以及随后发生的并发症，给卫生保健系统增加了不成比例的负担。因 此，该领域的改善大有希望发展这一领域中的护理。
尽管通过当前用于诱导心麻痹的方法提供了保护效果，但仍然存 在对心肌某些程度的缺血-再灌注损伤。在心脏旁路手术过程中的缺血 -再灌注损伤导致差的效果(发病率和死亡率两者)，尤其是由于已经 削弱的心脏状态。心肌缺血导致厌氧型心肌代谢。无氧代谢的终产物 迅速导致酸中毒、线粒体机能障碍和肌细胞坏死。几乎立即发生高能 磷酸的损耗，10分钟内丧失了50％的ATP储备。收缩性减少在1至 2分钟内发生，缺血性肌挛缩和不可逆的损伤在30-40分钟的常温(37 ℃)缺血后发生。
再灌注损伤是一种众所周知的在冠状循环恢复后的现象。再灌注 损伤的特征为异常的心肌氧化性代谢。除了在缺血过程中产生的结构 改变，再灌注可产生细胞毒性的氧自由基。这些氧自由基通过氧化肌 纤维膜的磷脂并从而破坏膜的完整性，而在再灌注损伤的发病机理中 发挥重大作用。氧化的游离脂肪酸释放进冠状静脉血中，并且是心肌 膜的磷脂过氧化的标记。鱼精蛋白诱导补体激活，其激活了中性粒细 胞。活化的中性粒细胞和其它白细胞是氧自由基和其它细胞毒性物质 的另外来源。
本发明提供了用于诱导心麻痹的方法和组合物，这将在旁路手术 过程中提供对心脏更好的保护。在某些实施方案中，本发明提供了含 有溶解于溶液中或作为气体在溶液中鼓泡的H2S(或另一种活性化合 物)的心麻痹溶液。在一些实施方案中，本发明进一步包含至少第一 种装置，例如导管或插管，用于导入合适剂量的心麻痹溶液至心脏。 在某些方面，本发明进一步包含至少第二种装置，例如导管或插管， 用于将心麻痹溶液从心脏移出。
旁路手术通常持续3-6个小时，然而，并发症和多血管的CABG 可延长持续时间为12个小时或更长。考虑心脏在手术过程中应该保持 停滞。因而，在本发明的一些实施方案中，让心脏暴露于氧拮抗剂或 其它活性化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个小时或更长，以及其 中的任意范围或组合。
E.减少由癌治疗引起的损伤
癌是世界上工业化国家中死亡率的首要原因。治疗癌的最常规方 法是通过施用细胞毒性剂给癌患者(或组织的离体处理)，这样所述 药剂对癌细胞具有比对正常细胞更大的致死效应。剂量越高或者药剂 的致死性越强，将会越有效；然而，出于同样原因，这类药剂到那种 程度上对正常细胞更有毒性的(并且有时是致命的)。因此，化学治 疗和放射治疗通常表征为严重的副作用，一些副作用是危及生命的， 例如口腔溃疡、吞咽困难、口干、恶心、腹泻、呕吐、疲劳、出血、 脱发和感染、皮肤刺激以及能量损耗(Curran，1998；Brizel，1998)。
最近的研究表明，暂时和可逆的降低核心体温，或“低体温”可导 致对抗癌的改善。最近发现28℃的低体温可减少小鼠中的辐射、阿霉 素-和顺铂-诱导的毒性。这些药物/治疗的抗癌活性在施用给低温的 (cooled)动物时没有受损；相反，活性得以增强，尤其是顺铂的活 性得以增强(Lundgren-Eriksson等，2001)。基于该研究以及其它 公开的研究，本发明者提出核心温度的进一步降低将有利于癌患者。 因此，本发明考虑使用氧拮抗剂或其它活性停滞化合物来诱导癌患者 正常组织的停滞，从而减少化学治疗或放射治疗对那些组织的潜在影 响。这也允许使用更高剂量的化学治疗和放射治疗，从而增强这些治 疗的抗-癌效果。
考虑实际上任何过度增生疾病，包括良性和恶性瘤形成、非肿瘤 性过度增生疾病、瘤前病症和癌前期病变的治疗。这类疾病包括再狭 窄、癌、多重耐药性癌、原发性银屑病和转移性肿瘤、血管发生、类 风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、湿疹和继发性内障，以及口腔毛 状白斑、支气管发育异常、原位癌和上皮内增生。特别地，本发明旨 在治疗人的癌包括前列腺癌、肺癌、脑癌、皮肤癌、肝癌、乳癌、淋 巴样系统癌、胃癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、骨癌、骨髓癌、胃肠 癌、头与颈癌、子宫颈癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、肾癌、肾上腺癌、 心脏癌、结肠癌和血癌。也考虑治疗涉及上皮细胞和内皮细胞的癌。
通常，设计化学疗法和放射疗法来减小肿瘤大小、减少肿瘤细胞 生长、诱导肿瘤细胞调亡、减少肿瘤脉管系统、减少或防止转移、降 低肿瘤生长速度、加速肿瘤细胞死亡，以及杀死肿瘤细胞。本发明的 目标并无不同。因此，考虑将本发明的氧拮抗剂(或其它活性化合物) 组合物与第二种有效治疗过度增生性疾病的抗-癌药剂(第二种药剂) 组合。“抗-癌”剂能够负面地影响受试者中的癌，例如通过杀死癌细胞、 诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞的生长速度、减少转移瘤的发生率或数 量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供给、 增强对抗癌细胞或肿瘤的免疫应答、防止或抑制癌进展，或延长患有 癌的受试者的寿命。
第二种抗-癌剂包括生物剂(生物疗法)、化学治疗剂和放射治 疗剂。更一般地，这些其它的组合物以有效杀死或抑制癌细胞或肿瘤 细胞增殖，同时减少或最小化第二种药剂对正常细胞的影响的组合剂 量提供。该方法可以涉及将细胞与氧拮抗剂(或其它活性化合物)和 第二种药剂同时接触或暴露。这可通过这样实现：将细胞与单一的包 括这两类药剂的组合物或药理学制剂接触，或通过将细胞在同一时间 与两种不同的组合物或制剂接触或暴露，其中一种组合物含有氧拮抗 剂而另一组合物含有第二种药剂。
可替代地，氧拮抗剂(或其它活性化合物)治疗可在第二种药剂 治疗之前或之后，间隔时间为数分钟至数周。在其中其它药剂和表达 构建体分开施用给细胞的实施方案中，通常应该确保有效时段不会在 每次递送时间之间终止，这样药剂和表达构建体将仍然能够对细胞发 挥有利的联合作用。在这类情况下，考虑可将细胞与这两种用药程式 接触，相互之间在约12-24小时内，更优选相互之间在约6-12小时内。 然而，在一些情况中，延长有效治疗的时间，其中在各自的施用之间 有数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8) 的时间间隔可能是理想的。在某些实施方案中，设想将生物物质保持 停滞约2-和约4小时之间，同时实施癌治疗。在本发明的一些实施方 案中，让生物物质暴露于氧拮抗剂或其它活性化合物约，至少约，或 至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55分钟；1、2、3、4、5、6个小时或更长，以及其中的任意范 围或组合。
可采用多种组合；活性化合物是“A”而第二抗-癌剂，例如放射治 疗剂或化学治疗剂是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
将本发明的氧拮抗剂或其它活性化合物施用给患者将按照用于 实施化学疗案的一般方法，如果有毒性的话，考虑化合物的毒性。预 期应该根据需要重复治疗周期。还应考虑，多种标准疗法以及外科手 术干预可与上面描述的抗-癌疗法联合应用。进一步考虑，对于多种活 性化合物，可应用所考虑的使用活性化合物和非活性化合物(例如化 学治疗)的任何联合治疗。
1.化学疗法
癌疗法也包括多种用基于化学和放射的治疗的联合疗法。联合化 疗包括，例如顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树 碱、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、 更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依 托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、 吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)、 5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤)、Temazolomide(DTIC 的含水形式)、或前述药物的任意类似物或衍生变体。化学疗法与生 物疗法的组合称为生化疗法。
2.放射疗法
导致DNA损伤并已广泛利用的其它因素包括通常称为γ-射线、 X-射线的那些，和/或直接递送放射性同位素至肿瘤细胞。其它形式的 DNA损伤因素也被考虑，例如微波和紫外线照射。很有可能，所有这 些因素实现对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复，以及染色体的 装配和维持的广范损伤。X射线的剂量范围从长时间周期(3至4周) 的50-200伦琴的日剂量，到2000-6000伦琴的单剂量。放射同位素的 剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和 类型，以及赘生细胞的吸收。
术语“接触”和“暴露”，在应用于细胞时，在此用于描述将本发明 的组分(例如，低氧的抗肿瘤化合物)或者化学治疗剂或放射治疗剂 递送至靶细胞或将其放置直接与靶细胞并列的方法。在联合疗法中， 为了实现细胞杀死或停滞，可将两种制剂以有效用于杀死细胞或防止 其分裂的组合剂量递送给细胞。
3.免疫疗法
通常，免疫治疗学依赖于使用免疫效应器细胞和靶向并破坏癌细 胞的分子。免疫效应器可以是，例如对肿瘤细胞表面上的某些标记特 异性的抗体。抗体独自可用作治疗的效应器，或者它可以募集其它细 胞来实际实现细胞杀死。抗体也可与药物或毒素(化学治疗剂、放射 性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并仅用作靶 向剂。可替代地，效应器可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶相互作 用的表面分子的淋巴细胞。多种效应器细胞包括细胞毒性T细胞和 NK细胞。
免疫疗法还可用作联合疗法的一部分。用于联合疗法的一般方法 在下面论述。在免疫治疗的一方面，肿瘤细胞必须具有一些受靶向作 用的标记，即不存于大多数其它细胞上。存在许多肿瘤标记并且任意 的这些标记可在本发明范围内适合用于靶向。普通的肿瘤标记包括癌 胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸 酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、 PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一 个备选方面是具有免疫刺激效应的抗癌效应。也存在免疫刺激分子， 包括：细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、г-IFN；趋化因 子例如MIP-1、MCP-1、IL-8；以及生长因子例如FLT3配体。将免 疫刺激分子作为蛋白质或用基因送递与肿瘤抑制物例如mda-7组合已 显示增强了抗肿瘤效果(Ju等，2000)。
如先前论述的，当前正研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂 (例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物)(美国专利5,801,005、美 国专利5,739,169、Hui和Hashimoto，1998、Christodoulides等，1998)、 细胞因子疗法(例如，干扰素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF)(Bukowski 等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)、基因疗法(例如 TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca， 1998；美国专利5,830,880和美国专利5,846,945)和单克隆抗体(例如 抗神经节苷脂GM2、抗-HER-2、抗-p185)(Pietras等，1998；Hanibuchi 等，1998)。赫赛汀(曲妥单抗)是阻断HER2-neu受体的嵌合(鼠- 人)单克隆抗体。它具有抗-肿瘤活性并已经批准用于恶性肿瘤的治疗 (Dillman，1999)。使用赫赛汀和化学疗法的癌的联合疗法已显示比 单独的疗法更有效。因此，考虑一种或多种抗-癌疗法可与在此描述的 抗-肿瘤疗法一起使用。
F.神经变性
本发明可用于治疗神经变性疾病。神经变性疾病的特征为神经元 组织的变性，并通常伴随有记忆丧失、运动功能丧失，以及痴呆。关 于痴呆疾病，智力和更高的综合认知能力随时间变得越来越受损。据 估计约15％的65岁或更年长的人略微至中度痴呆。神经变性疾病包 括帕金森病、原发性神经变性疾病、亨廷顿氏舞蹈病、中风和其它低 氧或缺血性过程、神经外伤、代谢诱导的神经学损伤、脑性发作产生 的后遗症、出血性休克、继发性神经变性疾病(代谢性的或毒性的)、 阿尔茨海默氏病、其它记忆障碍或血管性痴呆、多梗塞性痴呆、路易 体痴呆或神经变性痴呆。
有证据显示，生物的健康，并且尤其是神经系统的健康取决于氧 化和还原状态之间的循环，其与昼夜节律密切相关。也就是说，在清 醒过程中对身体产生的氧化应激在睡眠过程中循环至还原性环境。认 为这是为什么睡眠对健康非常重要的一大原因。某些神经变性疾病状 态，例如亨廷顿舞蹈病和阿尔茨海默氏病，以及正常的衰老过程与该 循环模式中的不协调相关。还存在一些证据，即脑的H2S水平在这些 状态下减少(Eto等，2002)。
本发明可用于调节和控制氧化和还原状态之间的循环，例如用以 防止或逆转神经变性疾病和过程的影响。控制昼夜节律可具有其它应 用，例如，用于在从一个时区旅行到另一个时区后调节这些循环模式， 以便适应新的时区。此外，已显示总体上代谢活性降低与年老的动物 和人的健康相关。因此，本发明还将可用于抑制总的代谢功能来增加 老年人的寿命和健康。考虑这种类型的处理将可能每天在晚上，在睡 眠过程中实施约6-10个小时。这可能需要在数月至数年的长时间内每 天进行处理。
G.衰老
此外，在某些停滞状态下，包括但不限于其中生物物质处于滞生 状态下的状态，衰老本身可在生物物质处于所述状态时的时段内受到 充分或完全地抑制。因此，本发明可抑制生物物质的衰老，关于延长 生物物质将正常生存的时间量和/或从生命的一个发育阶段进展到另 一发育阶段。
H.血液病
大量血液疾病和病症可用本发明的组合物和方法解决。这些疾病 包括，但不限于地中海贫血和镰状细胞性贫血。
1.地中海贫血
正常的血红蛋白含有两条б和两条в珠蛋白多肽(蛋白质)链， 每条结合含铁的血红素环。地中海贫血是这样一组病症：该疾病中存 在б和в链的不平衡，导致不成对的链沉淀在通常脆弱的红细胞膜上， 导致细胞破坏。这导致严重的贫血以至于骨髓试图通过设法产生更多 的红细胞来补偿。不幸地是，由于不成对的链的毒性，该过程效率非 常低，导致髓隙的大量扩张并且血液生成扩散到身体的其它部分。这 以及贫血导致主要的毒性。存在几种关于不成对的珠蛋白链为什么有 如此损伤性的模型，但是多数表明，由连接至不成对的珠蛋白链的铁 产生的增加的自由基对红细胞的早期破坏来说是重要的。因此，可减 少来自这些自由基的氧化损伤的任何干预能延长红细胞的寿命，改善 贫血，导致减少对生产红细胞的需求，并减少来自髓隙扩张和散布的 损伤。
据估计每年超过30,000名患有严重的地中海贫血的儿童出生，其 中据估计在发达国家生活的大多数活到了他们的20多岁，而在第三世 界国家(在那里生活着大多数的患者)中多数在年轻儿童时死亡。基 于在这里介绍的其它模型体系中的当前结果，预期将患有地中海贫血 的动物暴露于硫化物将增加它们的红细胞经受氧化损伤的能力，导致 红细胞存活延长。
2.镰状红细胞病
正常的血红蛋白(HbA)含有两条б和两条в珠蛋白多肽(蛋白 质)链，每条结合含铁的血红素环。镰状红细胞病(SCD；也称为镰 状细胞性贫血)是其中突变的в链导致血红蛋白改变(HbS)的一类 疾病。一旦脱氧，HbS可聚合(结晶)并沉淀，损伤通常脆弱的红细 胞膜，导致细胞破坏和贫血、红细胞(RBC)减少。此外，具有聚合 的HbS的细胞改变了形状(镰状)并变得有粘性，并且激活了导致血 流凝固和阻滞的机制。这可导致周围组织的低氧损害，导致疼痛、器 官机能障碍和最终过早死亡。在患者中观察到含硫的抗氧化剂的储量 的减少。而且，氧化损害和增加的活性氧类(ROS)与结晶、RBC膜 损害和与血流量不足相关的组织损害有关。硫化物与“补给”抗氧化剂 储备，并且潜在地使氧化损害最小化有关。有理由认为硫化物可防止 在镰状细胞病理学的几个阶段的问题。此外，鉴于氧拮抗剂在其它系 统中抵抗低氧的能力，暗示着它应该也保护遭受由这种疾病状态引起 的不利条件的动物和人。
每年有超过120,000名儿童生来具有SCD。发达国家中的患者现 在活到了他们的40多岁和50多岁，然而具有极大的关于疼痛和器官 损害的问题，包括中风、肺、心和皮肤问题。在第三世界国家(在那 里生活着大多数的患者)，大多数在年轻儿童时死亡。我们的假设是， 将患有SCD的动物并且最终是患有SCD的人暴露于硫化物，将导致 健康改善。
IV.保藏应用
本发明可用于为运输和/或储藏目的保藏或保存多种生物物质， 包括细胞、组织、器官，以及整个生物。在某些实施方案中，保藏生 物物质以便防止来自不利条件的损害。
在本发明的实施方案中，生物物质可暴露于活性化合物约，至少 约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、 5、6、7天；1、2、3、4、5周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12个月；或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20或更多年，以及可源于其中的任意组合或范 围。考虑可将活性化合物用于诱导停滞，并考虑可将其它物质用于维 持停滞并将它们保藏任意的有意义的一段时间。可替代地，考虑可将 活性化合物用于诱导和/或维持停滞。这可与其它因素(例如压力和/ 或温度的环境变化)组合。
1.细胞
如上面论述的，考虑将多种细胞用于本发明。考虑可将该细胞在 本发明的方法、装置和组合物中保藏。
a.血小板
在某些实施方案中，本发明可在血小板的保藏方面得到应用。血 小板是在出血位置的血块形成中起至关重要作用的小的细胞片段(～ 红细胞的一1/3大小)。止血通过这样实现：粘附至血管壁，释放凝 固化学物质，形成血块以堵塞血管壁和/或狭窄的血管中的裂口。正常 的血小板计数在150,000-400,000计数/μL之间。输注血小板浓缩液用 于不同的适应症，例如：1)防止由于血小板减少的出血；2)在出血患 者中用于维持血小板计数大于50,000；3)用以解决血小板功能异常， 所述的血小板功能异常是先天性的或归因于用药、脓毒症、恶性肿瘤、 组织创伤、产科并发症、体外循环或器官衰竭例如肝或肾脏疾病。
每单位的血小板平均含有0.8-0.85×1011个血小板。血小板浓缩 液还含有约60mL的血浆(凝血因子)以及少量的红细胞和白细胞。 在储藏过程中血小板单位必须维持在室温(20℃-24℃)下并摇动。 它们可在血站(Blood Center)储存至多5天。由于血小板的变质， 以及微生物污染的风险，更长时间的储存目前是不可能的。目前存在 两种血小板的来源：
1)混合的随机供体血小板浓缩液从通过离心全血单位而采集的 血小板制备。可将至多8个单位的血小板(每个单位来自不同的供体) 混合进一个袋中用于输注。血小板在混合后4小时失效。所有单位来 自相同的ABO型。如果ABO兼容的血小板不可获得，则可替换为 ABO不兼容的血小板，有非常小的风险。通常成人剂量是4-6单位的 混合随机的供体血小板。
2)单采血液成分术血小板，从单个供体收集，是以标准(相当 于～4个混合单位)大小和“大的”(相当于～6个混合单位)大小制备的。 单采血液成分术血小板浓缩物含有200-400mL的血浆。它们可收集 为随机的单位(随机的单采血液成分术血小板)或可为特定接受者从 家族成员或自愿的HLA兼容的“定向”供体获得。单采血液成分术血 小板在处理而从血站释放后4小时失效。
血小板储存提出了在全血或其它成分的储存中未发现的问题。虽 然全血、红细胞和白细胞可在4℃下储存数周，但血小板在冷藏中将 聚集并然后沉积。因此，储存血小板的标准方法是在室温下，约20-24 ℃，伴随轻微搅动。甚至在这些条件下，血小板仅可保存5天，然后 需要将它们丢弃。这种过期问题导致美国医院每年约$500百万的收入 损失。如果可获得储存期的适度延长，约90％的该损失可避免。
血小板储存的另一问题是细菌污染。污染主要归因于在静脉切开 放血术过程中来自皮肤的葡萄球菌，或者归因于供体菌血症。血小板 的细菌污染代表了用任何输血操作都有最大的感染风险。
影响血小板的存活力的重要因素是pH的调节。按照目前普遍接 受的方法储存的几乎所有的血小板单位都显示pH从它们约7.0的初 值降低。这种降低主要归因于通过血小板糖酵解产生乳酸，并在较小 程度上归因于来自氧化磷酸化作用的CO2的积累。随着pH下降，血 小板改变形状，从圆盘状变成球状。如果pH下降低于6.0，血小板的 形态学和生理学的不可逆改变使得它们在输液后没有活力。因此，血 小板保藏的一个重要目标是防止这种pH降低。以前认为，血小板必 须储存在氧可渗透的容器中，因为糖酵解在氧可获得性受到限制时受 到刺激(参见，例如美国专利5,569,579)。然而，本发明证明了储存 的血小板的存活力可通过将它们储存在缺氧环境中而得以延长。
本发明提供了增加储存的血小板的存活时间并减少细菌污染的 方法和组合物。在一个实施方案中，本发明提供了可密封的、氧不可 渗透的容器，将血小板置于该容器中。在密封后，厌氧发生器(例如， 具有钯催化剂的硼氢化钠片)将容器中的大气氧转化为水。该容器还 含有一个指示器，其指示氧张力的水平。一旦处于缺氧条件下，血小 板也可在较低的温度下储存。
血小板可悬浮并储存于血浆或本领域已知的任意血小板储存溶 液中。例如，美国专利4,828,976和4,447,415公开了多种通常使用的 适合血小板储存的溶液。
典型地，将血小板储存于来自供体的血浆中并以那种形式施用。
通常，本发明由一个密封的环境(容器、罐、不可渗透的袋或室) 组成，在该环境中氧张力可降低至低于1％(10,000ppm)并更特别 是在10-100ppm的范围，或更小。该环境中的气氛氧气减少可通过本 领域已知的许多方法实现。例如，减少气氛中的氧气可通过产生氢气 (有或无催化剂)与氧气化合产生水实现。可催化其它反应来将氧气 与其它化合物，例如碳化合而产生二氧化碳，等等。同样，氧气可通 过将室内的所有空气转换成含有不包括氧的任意气体组合的气体来取 代。此外，氧气可通过将该室置于真空下，除所有气体而除去。可替 代地，氧气可通过用与氧竞争的另一种气体或化合物，例如CO来竞 争。也可利用除去氧和竞争剩余的氧的组合。该装置还可包含测量氧 气浓度的手段以确保获得合适的厌氧状态。例如，氧浓度可用基于亚 甲蓝的厌氧指示剂测量，所述的亚甲蓝在没有氧时从蓝色变成无色。 可替代地，可使用测氧计或其它测量氧的装置。
所述的装置还包括一些手段来将血小板包含于密闭的环境中，这 样可将氧从含有血小板的溶液中除去，以及从血小板它们自身除去。 这样的实例是让血小板处于透气的袋中，该袋置于密闭的环境中。血 小板也可保持于密闭环境内的敞开的容器中。可替代地，可将血小板 直接置于不可渗透的、密闭的容器/袋中。
来自Becton Dickinson的Bio-BagTM(商品号261215)是可密封 的、氧-不可渗透的容器的一个实例，其可用于产生缺氧环境用于血小 板的储存。Bio-Bag，其为出售用于分离厌氧细菌的试剂盒，包括一个 可密封的、不透气袋子、厌氧指示剂、厌氧发生器(氢气发生器)和 钯催化剂。透气的袋中的血小板将密封于Bio-Bag内来保存。
Bio-Bag中的厌氧发生器是通过添加水而激活的装置，水通过一 系列的通道到达滤纸纱条(wick)。该纸条延缓和调节水引入进所述 的片室中，提供氢气的控制释放。产生气体的片由硼氢化钠组成。从 该反应中释放出的氢气与密闭容器中的气氛氧化合产生水。该反应通 过容器中的钯催化。
Puget Sound Blood Center(PSBC)采用标准化的一组体外试验， 独立地评估了在无氧条件下保存的血小板在第0天、第5天和第8天 的状态。结果表明，在无氧条件下保存直到8天的血小板表现与在标 准条件下保存的血小板一样好，或更好。正在进行的研究是重复该实 验，并将观测时间延长到13天。
本领域中的那些技术人员将熟悉用于测定血小板功能的方法。例 如，如美国专利6,790,603中描述的，血小板功能可通过如下因素测定： (1)响应激活-诱导激动剂的攻击，内部蛋白质在细胞膜上的表达；(2) 在受激动剂攻击时聚集的能力；以及(3)三磷酸腺苷的分泌。可导致 血小板功能激活的激动剂的实例包括凝血酶、肾上腺素、ADP和胶原。
内部蛋白质的表达可通过将分子与荧光染料缀合，之后在荧光细 胞分类器中分选而测量。通常，优选使用两种单克隆抗体，一种结合 构成型表达的细胞表面分子，而另一种结合只在激活后表达的细胞表 面分子。每种单克隆抗体与不同颜色的染料缀合，所述染料可通过荧 光分光光度法区分。构成型表达的细胞表面分子的一个非限制性实例 是GPIIbIIIa；在激活后表达的细胞表面分子的一个非限制性实例是 血小板选择蛋白(P-selectin)。产生蛋白质的单克隆抗体是本领域熟 知的。美国专利No.5,470,738是一个产生对抗GPIIIa的单克隆抗体 的方法的实例。另一种抗-血小板单克隆抗体是对抗GP IV的单克隆 抗体，如由美国专利No.5,231,025公开的。抗体也可从公司例如 Becton-Dickinson(Philadelphia)商业购买。
血小板功能的另一个参数是在激动剂攻击时聚集的能力。血小板 悬液是稠密的和乳白色的。聚集和随后的聚集物的沉降可通过肉眼评 估，或用密度计测量。
然而血小板功能的另一种量度是ATP的分泌。能很好发挥作用 的血小板能够分泌ATP，而已经被活化的细胞或已在其它方面丧失功 能的细胞不能分泌ATP。
2.细胞培养
本发明可扩展到保护培养物中的细胞，其否则可能死亡或被诱导 调亡。在本发明的背景中，将细胞在培养之前和/或培养时暴露于活性 化合物。可以根据本发明培养的细胞包括可最后放回到生理学环境中 的那些细胞，即用于随后移植的那些细胞。这些细胞包括，但不限于 骨髓、皮肤细胞和上皮细胞。同样，一些可移植的细胞将非常受益于 在培养物中的扩展，从而增加可引入至宿主中的材料的量。特别考虑 将来自胃肠道的上皮细胞作为可受益于暴露于活性化合物的细胞。
此外，本发明延伸到了肿瘤细胞的培养。已知肿瘤细胞的培养可 导致表型的改变，并在某些情况下导致死亡。这使得肿瘤细胞的组织 培养试验非常不可预测。
一般的细胞培养技术是本领域那些技术人员熟知的。这种知识的 实例可在Shaw(1996)和Davis(1994)中找到，将它们两者在此通过引 入作为参考。传统的细胞培养技术的一般信息和修改也可在美国专利 5,580,781中找到，将其通过引入作为参考。此外，用于培养皮肤细胞 的技术在美国专利6,057,148中描述，将其通过引入作为参考。考虑将 给这些技术，以及本领域那些技术人员已知的其它技术补充含有一种 或多种活性化合物的培养基，或灌注流体和/或气体形式的活性化合 物。
E.细胞、组织和器官的保藏
在本发明的某些实施方案中，期望保藏生物物质，以便尽可能地 防止死亡或分解对该物质的损害。尽管第一次成功的肾移植在1954 年完成并且第一次心脏和肝移植在1967年实施，但每年，成千上万的 需要器官移植的人死亡。由于种种原因，他们需要心脏、肺、肾和肝。 此外，存在可使用胰脏或角膜的患者。虽然存在对器官供体的持续需 要，但提供器官给需要器官移植的那些患者另一重大障碍是当前的器 官保藏技术的限制。例如，普遍认为人的心脏必须在4小时内运送， 为了随后的移植有任何机会成功。Rager，2004(见下表)。
最长的冷缺血时间
器官 保藏时间 心脏和肺 肝 肾 胰脏 小肠 4-6小时 12-24小时 48-72小时 12-24小时 12小时
而且，在最初的30天内，移植的心脏的器官移植失败的主要原 因是缺血-再灌注损伤。
器官获得和保藏、组织配型，以及免疫抑制是成功的实体器官移 植的主要因素。器官获得操作的技术方面允许多个团队一起工作以从 单个供者获得所有有用的器官。平均来说，从单个已故供体获得3.6 个器官。
保藏实体器官取决于原位进行的快速血管内冷却，之后切除器 官，将器官在冰冷的保藏流体中保存并迅速运送至接受者的医院。冷 缺血时间是器官在冰上而没有血流的时间长度。最长的冷缺血时间限 制了在器官恢复和器官移植之间可经过的时间量(表5)。2％-10％ 的匹配的且获得的器官由于拖延了缺血时间而不能使用，这取决于器 官的类型。类似地，约10-20％的获得的器官由于弱的器官功能和/或 感染(不包括HIV/CMV/肝炎)而不能使用。
当前的保藏技术包括利用冰冷的溶液，其包括电解质、抗氧化剂、 氢离子缓冲液和糖。Punch等，2001。适合的组织配型取决于所有器 官的血型匹配(例如，血型A、B或O)。免疫抑制方案通常包括三 种药物：糖皮质激素例如强的松、抗代谢药例如硫唑嘌呤或麦考酚酯， 以及神经钙蛋白抑制剂例如环孢菌素或他克莫司。
两种最频繁使用的用于保藏/运送心脏用以移植的方法是低温储 藏和持续灌注法。在前一种方法中，将心脏停止，从供者体内移出， 然后迅速冷却并冷藏运输。在后一种方法中，通常采用下列步骤：1)搏 动性流动；2)低温；3)膜氧合，以及4)含有二者的灌注液。
为了改善成功移植的前景，已经发展了用于更好的保藏用于移植 的器官的技术。已经出现了两个发展的一般领域，一个是保藏溶液领 域，而另一个是器官容器领域。
在某些方面，例如移植，创伤愈合的不利结果可削弱或阻止移植 组织的正常移入。在本发明背景下，设想将供献的组织和接受的组织 在移植前用氧拮抗剂或其它活性化合物处理，如上文中有关创伤愈合 所讨论的，致力于抑制生物学过程例如炎症、调亡和其它损害移入组 织的创伤愈合/移植后事件。
F.生物
这类生物可用于研究目的，例如试验小鼠(小鼠堆积(banking))， 或用于消费，例如鱼。在这些情况下，考虑停可无限期维持停滞。而 且，停滞可在植物或植物的部分(包括果实、花、叶、茎、种子、插 条)中诱导。植物可以是农作物、药用植物或观赏性植物。在植物中 诱导停滞可增加整个植物或植物部分的储存期或病原体抗性。因此， 在本发明的实施方案中，将生物或其部分暴露于氧拮抗剂或其它活性 化合物约，至少约，或至多约30秒；1、2、3、4、5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55分钟；1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小 时；1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4、5周；1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12个月；或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年，以及可源于其 中的任意组合或范围。
G.保藏剂
已公开了多种保藏溶液，在运送器官时将器官用保藏溶液包围或 用保藏溶液灌注。一种最普遍使用的溶液是ViaSpan_(Belzer UW)， 其伴随冷藏使用。这类溶液或这类溶液的成分的其它实例包括St. Thomas溶液(Ledingham等，J.Thorac.Cardiobasc.Surg. 93：240-246，1987)、Broussais溶液、UW液(Ledingham等，Circulation 82(Part 2)IV351-8，1990)、Celsior溶液(Menasche等，Eur.J.Cardio. Thorax.Surg.8：207-213，1994)、Stanford University溶液和B20溶 液(Bernard等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.90：235-242，1985)， 以及在美国专利6,524,785、6,492,103、6,365,338、6,054,261、5,719,174、 5,693,462、5,599,659、5,552,267、5,405,742、5,370,989、5,066,578、 4,938,961和4,798,824中描述和/或要求保护的那些。
除了溶液，还已知其它类型的材料用于运输器官和组织。这些包 括凝胶状的或其它半固体的材料，例如如在美国专利5,736,397中描述 的那些。
一些用于器官保藏的系统和溶液特别涉及在所述溶液或系统中 灌注氧，以将器官暴露于氧，因为人们相信将器官或组织维持在氧合 的环境中可提高存活力。参见Kuroda等，(Transplantation 46(3)： 457-460，1988)和美国专利6,490,880、6,046,046、5,476,763、5,285,657、 3,995,444、3,881,990和3,777,507。据认为剥夺氧长于4小时的分离的 心脏丧失了活力并因为缺血/再灌注损伤而不可在接受者中使用。见美 国专利6,054,261。
而且，多数(如果不是全部的话)用于器官保藏和移植的溶液和 容器涉及低温(温度低于室温，通常接近但不会低于0℃)，其已被 称为“所有有用的器官和组织保藏方法的基石”。美国专利6,492,103。
为了改善成功移植的前景，已经发展了用于更好的保藏用于移植 的器官的技术。已经出现了两个发展的一般领域，一个是保藏溶液领 域，而另一个是器官容器领域。
而且，多数(如果不是全部的话)用于器官保藏和移植的溶液和 容器涉及低温(温度低于室温，通常接近但不会低于0℃)，其已被 称为“所有有用的器官和组织保藏方法的基石”。美国专利6,492,103。
在器官移植领域中，据认为某些条件与器官的状态以及对成功移 植的预后相关：1)使细胞肿胀和水肿最小化；2)防止细胞内酸中毒； 3)使缺血性损害最小化；以及4)在再灌注过程中提供用于再生高能磷 酸化合物和ATP的底物。器官移植中的缺血性/再灌注损伤是尤其有 问题，因为采集的器官从身体内移出，与血源分离，并因而在长时间 内失去氧和营养物(美国专利5,912,019)。实际上，现今在移植中最 关键的问题之一是移植物功能延迟(DGF)的相对高发生率，这归因 于手术后的急性管状坏死。当前的方法依然在这些领域中经历困难， 这突出了本发明的重要性。
然而，本发明可与其它保藏组合物和方法联合使用。如在美国专 利5,952,168、5,217,860、4,559,258和6,187,529(特别将其通过引入 作为参考)中论述的，可以保藏生物材料，例如用于长期保存可移植 的或可置换的器官。
可给予细胞、组织/器官，或尸体增强或维持用于移植的器官的 状态的化合物。这种方法和组合物包括在美国专利5,752,929和 5,395,314中描述的那些。
此外，本发明的方法可包括除了暴露于氧拮抗剂或其它活性化合 物以外，还将生物物质暴露于保藏溶液，例如所论述的那些。
考虑，用于活的和将用作活材料的生物样品的任何药剂或溶液必 须是可药用的或药理学上可接受的。短语“可药用”或“药理学上可接受 的”指在施用给人时不会产生过敏性反应或类似的不利反应的分子实 体和组合物。含有作为活性成分的蛋白质的含水组合物的制备是本领 域充分了解的。通常，这类组合物可制备成液体溶液剂或混悬剂；也 可制备成适合在使用前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
可监测用于移植的器官以评估它们的状态，尤其关于用作移植物 的状态。这种方法在美国专利5,699,793中描述。
可在接受器官移植后将大量药物施用给患者以促进恢复进程。这 些药物包括减少或抑制对抗供献的器官的免疫应答的化合物和药剂。
此外，正在不断研究另外的药物并将其用于器官移植，例如在美 国专利6,552,083(包含N-(3，4-二甲氧基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸的抑 制剂)和6,013,256(结合IL-2受体的抗体，例如人源化抗-Tax抗体) 中描述的那些。
H.保藏仪器和应用
用于运输器官和组织的系统或容器通过这些年也得以发展。任意 的这些实施方案可与本发明的仪器组合，所述的本发明仪器允许使用 氧拮抗剂或其它活性化合物。
大多数涉及用于实现例如在美国专利4,292,817、4,473,637和 4,745,759中描述的那些的冷却系统，其采用用冷却液体的主动制冷， 所述冷却液体被泵出通过该系统。已设计了几种复杂的装置，其包含 多个室或双容器，例如美国专利5,434,045和4,723,974所描述的。
一些组成了其中一种仪器设计用于灌注保藏溶液中的器官或组 织的系统，如美国专利6,490,880、6,100,082、6,046,046、5,326,706、 5,285,657、5,157,930、4,951,482、4,502,295和4,186,565中描述的。
一些用于器官保藏的系统和溶液特别涉及在该溶液或系统中灌 注氧，以将器官暴露于氧，因为人们相信将器官或组织维持在氧合的 环境中可提高存活力。参见Kuroda等，(Transplantation 46(3)：457-460，1988)和美国专利6,490,880、6,046,046、5,476,763、 5,285,657、3,995,444、3,881,990和3,777,507。据认为剥夺氧长于4 小时的分离的心脏丧失了活力并因为缺血/再灌注损伤而不可在接受 者中使用。见美国专利6,054,261。
而且，在本发明的一些实施方案中，存在用于保藏血小板的方法， 如上面提及的。使用本公开内容的技术，减少或消除了现有技术的缺 点。涉及血小板和氧减少的实施方案有广泛的应用，包括但不限于将 受益于较长期保存血小板的任何应用。
在一个实施方案中，氧减少技术可在试剂盒中体现。例如，Becton Dickinson提供的目前销售产品号为261215的试剂盒利用在这里描述 的选择技术。该试剂盒包括厌氧发生器(例如氢气发生器)、钯催化 剂、厌氧指示器和不透气、可密封的“BioBag”，上面的组分(与透气 口袋中的血小板一起)置于其中并密封。
该示例性试剂盒中的厌氧发生器通过添加水激活，水通过一系列 的通道到达滤纸条。该纸条延缓和调节水引入进所述的片室中，提供 氢气的控制释放。产生气体的片包括硼氢化钠。从该反应中释放出的 氢气与密闭容器中的气氛氧化合产生水。该反应通过容器中的钯催化。
在一个更一般性的方面，本公开内容的技术可用任意数量的密封 环境(例如，容器如罐、不可渗透的袋，或室)实施，在该密封环境 中氧张力可减少。在一个实施方案中，容器和/或血小板或者相关溶液 中的氧水平可减少至低于约1％(约百万分之10,000份)。在另一实 施方案中，氧可减少至约百万分之10-100份的范围，或更少。在又一 实施方案中，氧可减少至表示容器和/或血小板或相关溶液中的氧减少 的任何百分比值。在优选的实施方案中，容器是不透气的，以及可密 封的。本领域中一般技术人员将理解，“透气的”不一定意味着绝对或 100％水平的不渗透性。相反，“不透气的”应该如它在本领域中所表 示的来解释，表示例如能够保持少于10ppm(相对于室内空气的梯度， 通常为210,000ppm)的气氛至少4天。通常，可商业获得的袋子在6 周或更长的时间内是不可渗透的。
容器可在有关的减少氧的元件置于其内时密封。减少该环境中的 气氛氧可通过产生氢气(有或无催化剂)与氧化合产生水实现。可催 化其它反应来将氧与其它化合物，例如碳组合产生二氧化碳。其它反 应和组合对于本领域一般技术人员来说将是显而易见的。同样，氧气 可通过将室内的气体转换成含有不包括氧气的任意气体组合的气体来 取代。另外，氧气可通过将容器置于真空中除去，所述真空足以除去 气体并尤其足以除去氧气而达到期望的、减少的水平。可替代地，氧 气可通过用与氧竞争的另一种气体或化合物，例如CO来竞争。可利 用除去氧气和竞争剩余的氧气的组合。
在不同的实施方案中，可用装置测量氧水平以确保已经达到合适 的厌氧状态。可使用基于亚甲蓝的厌氧指示剂，所述的亚甲蓝在没有 氧时从蓝色变成无色。可替代地，可使用可商业获得的测氧计(例如 机械和/或电子测量计)或其它测量氧的机制。
在不同的实施方案中，将血小板装在密封的环境中，这样可将氧 从含有血小板的溶液，以及从血小板它们自身除去。例如，可将透气 袋中的血小板置于密封的环境中。其它非限制性的实例可以具有一个 敞开的容器在密封的环境内来装盛血小板。可替代地，可将血小板包 含于一个不可渗透的、密封的容器(例如，袋)中并整合有除氧装置。
在一个实施方案中，本发明涉及其中将血小板和溶液引入不透气 的容器中的方法。该容器是密封的。将氧气从容器或从血小板和溶液 中除去。考虑将透气的袋中的约，至少约，或至多约20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99或100％，或在此可引出的任意范围的氧气除去。
该方法还可包括标明在除去氧后容器内剩余的氧气水平。容器内 的氧可减少至约百万分之10,000份或更少。容器内的氧可减少至约百 万分之10-100份之间的水平。引入血小板可涉及将盛有血小板和溶液 的透气容器加进不透气的容器中。引入血小板可涉及将血小板和溶液 放进可密封的、柔性的袋子，或可密封的、刚性的室中。密封容器可 涉及使用粘合剂，密封容器可在给定的方法的任何阶段发生。
去除氧可涉及将氧从容器中抽出，并且这种抽吸可涉及用低真空 泵和/或涡轮泵抽吸。去除氧可涉及将氢气引入容器中，其与氧化合产 生水。氢可通过化学反应引入。化学反应可以被催化。去除氧可涉及 使用产生气体的片将氢气引入容器中。可将水加至含有硼氢化钠的产 生气体的片来产生氢气。这种水可以以延时的和受调节的方式加入。 例如，可使用滤纸条。水可通过一个或多个通道引入至滤纸条。钯可 催化产生氢气的化学反应。去除氧可涉及将与氧结合的一种或多种试 剂引入进容器中。可将CO引入进容器中，其与氧键合形成CO2。去 除氧气可涉及用一种或多种气体置换氧气。
标出剩余氧的水平可涉及利用在无氧时变色的亚甲蓝指示剂。可 替代地，可使用测氧计。标出容器内剩余氧的水平可涉及显示血小板 或溶液中的剩余氧的水平。
在一个实施方案中，本发明涉及其中将血小板和溶液引入不透气 的容器中的方法。该容器是密封的。氢气通过加入水至硼氢化钠的化 学反应产生。该化学反应通过与氢化合形成水来除去血小板和溶液中 的氧。标明在除氧后容器内的剩余氧的水平。
该化学反应可用钯催化。水的加入可涉及使用滤纸芯。
在一个实施方案中，本发明涉及用于将氧从血小板和溶液中除去 的系统。该系统包括：(a)一个可密封的、不透气的容器、(b)一个还 原氧的发生器，以及(c)氧指示器。配置该可密封的、不透气的容器并 调整尺寸以便接受血小板和溶液。将还原氧的发生器与该容器连接并 设计用于通过抽吸或化学反应来除去血小板和溶液中的氧。将氧指示 器与容器连接并设计用于标明在除氧后容器内的氧水平。
该容器可以是可密封的、柔性的袋。还原氧的发生器可包括氢气 发生器，其设计来产生氢气用于与氧化合而产生水。氢气发生器可包 括产生气体的物质，其在与一种试剂化合时产生氢气。这种产生气体 的物质可包括硼氢化钠片，而所述试剂可包括水。氢气发生器还可包 括钯催化剂。系统还可包括设计来通过控制化学反应的一种或多种成 分的引入，来延缓或调节该化学反应的构件。例如，该构件可包括延 缓和调节化学反应的芯。
在一个实施方案中，本发明涉及包含氢气发生器、不透气的可密 封容器、以及氧指示器的试剂盒。
氢气发生器可包括产生气体的物质，其在与一种制剂化合时产生 氢气。这种产生气体的物质可包括硼氢化钠片，而所述试剂可包括水。 试剂盒还可包含钯催化剂。试剂盒也可包含设计来延缓或调节产生氢 气的化学反应的芯。
如上论述的，本发明的方法可涉及使用一种仪器或系统，所述仪 器或系统维持生物物质置于其中或暴露于其中的环境。本发明包括其 中提供活性化合物(尤其作为气体)的仪器。在一些实施方案中，该 仪器包括具有用于装盛生物物质的样品室的容器，其中该容器与含有 活性化合物的气体的供应源连接。特别考虑该容器可以是固体容器或 者它可以是柔性的，例如袋子。
在一些实施方案中，本发明是用于保藏细胞的仪器，该仪器包含： 具有容积不超过775升的样品室的容器，以及与该样品室流体通讯的 第一种气体供应源，该第一种气体供应源包括一氧化碳。在其它实施 方案中，该仪器还包括一个调节样品室内温度的冷却装置和/或气体调 节器，该气体调节器调节室内的活性化合物的量或调节室内的溶液中 的活性化合物的量。
考虑，可存在第二种或额外气体的气体供应源，或用于活性化合 物的第二种或额外气体供应源。第二种气体供应源可与所述样品室连 接，或者它可与第一种气体供应源连接。额外的气体(如上论述的) 可以是无毒的和/或非活性气体。
在本发明的一些实施方案中，气体调节器是所述仪器的一部分。 可采用一个、两个、三个或更多个气体调节器。在一些情形中，气体 调节器调节由第一种气体供应源供应给样品室的气体。可替代地，它 调节由第二种气体供应源供应给样品室或第一种气体供应源的气体， 或可存在用于第一种和第二种气体供应源两者的调节器。进一步考虑， 可程序化任何气体调节器来控制供应给样品室和/或另一种气体供应 源的气体的量。调节可以进行或可以不进行指定的一段时间。可以有 一个气体调节器，对于直接或间接与样品连接的任何气体供应源，其 可以是或可以不是可程序控制的。在一些情形中，气体调节器是电子 程控的。
在一些情形中，所述室内的压力和/或温度可以分别用压力调节 器或温度调节器调节。和气体调节器一样，这些调节器可以是可电子 程控的。本发明的仪器也具有冷却和/或加热装置以获得上面讨论的温 度。该装置可以是或可以不是电子程控的。
在其它实施方案中，所述仪器包括一个有轮车，容器放置在上面， 或其可以具有一个或多个手柄。
特别考虑本发明包括用于细胞的仪器，其中该仪器具有：具有样 品室的容器；与样品室流体通讯的第一种气体供应源，该第一种气体 供应源包括活性化合物；以及可电子程控的气体调节器，其调节由第 一种气体供应源供应给样品室的气体。
在一些实施方案中，所述仪器也具有配置来在样品室内提供真空 的结构。
而且，考虑本申请案中描述的任何氧拮抗剂用本发明的仪器使 用。在特定的实施方案中，一氧化碳可用该仪器施用。在其它情形中， 可以施用硫属化物化合物或具有还原剂结构的化合物。
图19是一个实例性系统的示意图并体现了上面论述的概念，该 系统用于将氧从血小板和溶液中除去。透气的袋子1920可置于可密封 的不透气的容器1904中。不透气的容器1904可与还原氧的发生器 1906连接。在一个实施方案中，还原氧的发生器1906可包围可密封 的不透气的容器1904。在不同的实施方案中，还原氧的发生器1906 可采用不同的形式。例如，它可以是泵(例如，低真空泵和/或涡轮泵) 或氢气发生器。与还原氧的发生器1906有关的可以是一个或多个元件 如芯或其它延缓机制。与可密封的不透气的容器1904连接的是传感器 1908和调节器1910。在一个实施方案中，传感器1908可以是测氧计， 其可采取多种形式。在其它的实施方案中，传感器1908可以是温度或 压力计。当然，可使用多于一个的传感器。在一个实施方案中，调节 器1901可以是温度或压力调节器。例如，调节器1901可以是加热或 冷却装置用以调节可密封的不透气的容器1904内的温度。
v.诊断应用
亚硫酸盐在含硫氨基酸的正常代谢过程中，由体内的所有细胞产 生。亚硫酸盐氧化酶除去，并因而调节了亚硫酸盐的水平。这些酶的 不同活性将导致不同水平的亚硫酸盐以组织特异性方式放出。在上面 描述的实例中，对于低氧条件下的实体瘤，亚硫酸盐可以更高的水平 产生，用以通过减少代谢状态以及抑制免疫监督来为肿瘤细胞提供局 部的保护状态。因此，测量亚硫酸盐水平并将其加入作为对几种疾病 状态例如实体瘤的诊断的一部分是有利的。此外，由于我们建议利用 亚硫酸盐用于多方面的应用，所以采用某些类型的成像或其它监测方 法遵循这一建议将是有用的。
使用当前的技术(例如HPLC)测量血清中的亚硫酸盐水平以获 得总的亚硫酸盐水平是可能的。值得研究使亚硫酸盐成像的可能性。 可替代地，蛋白组学方法可使得能了解在某些疾病状态下可怎样改变 参与亚硫酸盐代谢的酶的调节，使得该方法能用于诊断。
VI.筛选应用
在更进一步的实施方案中，本发明提供了用于鉴定以类似于诱导 停滞的方式起作用的氧拮抗剂和分子以及其它活性化合物的方法。在 一些情形中，所寻找的氧拮抗剂或活性化合物在低氧或缺氧环境中在 降低核心体温或保留存活力方面类似硫属化物化合物起作用，如果不 存在氧拮抗剂或其它活性化合物，则所述低氧或缺氧环境将会杀死生 物物质。这些测定法可包括对候选物质的大型库的随机筛选；或者， 该测定法可用于集中在根据着眼于如下性质而选择的特殊类型的化合 物上：该性质被认为使得它们更有可能作为氧拮抗剂或活性化合物起 作用，提供一种候选活性化合物；
(a)将该候选活性化合物与生物物质混合；
(b)测量氧拮抗剂处理的特征性的一种或多种细胞反应；以及
(c)将所述的一种或多种反应与不存在候选活性化合物情况下 的生物物质的反应比较。
测定法可用分离细胞、组织/器官或完整的生物进行。
当然将要理解，本发明的所有筛选方法本身是有用的，尽管事实 上可能不会发现有效的候选物。本发明提供了用于筛选这类候选物的 方法，不只是发现它们的方法。然而，还应理解，候选活性化合物可 根据一种或多种测定法鉴定为有效的活性化合物，这意指候选活性化 合物似乎具有一些充当活性化合物的能力，例如通过在生物物质中诱 导停滞。在一些实施方案中，筛选包括使用本公开内容中的实施例或 别处描述的测定法来鉴定调节剂。而且，除了在该部分中描述的方法 以外或代替在该部分中描述的方法，可检测候选活性化合物作为氧拮 抗剂或作为具有活性化合物性质的另一种化合物(例如保护性代谢剂 或治疗性物质)的活性。在上文中提供了筛选方法的一些实施方案。
可以进一步表征或测定有效的活性化合物。此外，有效的活性化 合物可在体内动物或动物模型(如下文中所讨论的)中使用，或可在 其它的体内动物或动物模型中使用，所述的其它动物或动物模型可以 涉及相同物种的动物或不同的动物物种。
此外，考虑到，根据本发明的实施方案鉴定的活性化合物还可在 筛选后被生产。同样，根据本发明方法，尤其是关于治疗或预防的实 施方案，可以将生物物质暴露于有效的活性化合物或与之接触。
A.活性化合物
如在此使用的，术语“候选活性化合物”指可通过例如，改变核心 体温来在生物物质中诱导停滞的任何分子。候选活性化合物可以是蛋 白质或其片段、小分子、甚或是核酸分子。还可以从各种商业来源、 被认为符合有用药物的基本标准的小分子库获得候选活性化合物，以 致力于“暴力”鉴定有用的化合物。筛选这些库，包括组合产生的库(例 如肽库)，是筛选大量相关(和不相关的)化合物的活性的快速且有 效的方法。组合方法本身还有助于通过产生活性的、然而在别的方面 不期望的化合物的模建的第二代、第三代和第四代化合物，来迅速发 展潜在的药物。
候选活性化合物可以包括天然存在的化合物的片段或部分，或以 已知化合物的活性组合形式被发现，其否则是无活性的。有人提出， 从天然来源例如动物、细菌、真菌、植物源(包括叶和树皮)和海产 样品分离的化合物可作为候选物检测，检测潜在有用的药用物质的存 在。应该理解，要筛选的药用物质还可源于化学组分或人造化合物或 者用它们合成。因此，应该理解，通过本发明鉴定的候选活性化合物 可以是从已知抑制剂或刺激剂开始，通过合理药物设计而设计的肽、 多肽、多核苷酸、小分子抑制剂或任何其它化合物。
其它合适的活性化合物包括反义分子、siRNA、核酶和抗体(包 括单链抗体)，它们各自对靶分子是特异性的。这类化合物在本文件 中的其它地方更详细地描述。例如，结合至翻译起始位点或转录起始 位点，或剪接点的反义分子将会是理想的候选抑制剂。
除了最初鉴定的活性化合物，本发明人还考虑制备其它结构相似 的化合物以模拟活性化合物结构的关键部分。这类化合物(其可包括 肽调节剂的肽模拟物(peptidomimetics))可以以与起始活性化合物 相同的方式使用。
B.体内测定法
体内测定涉及多种动物模型的使用。由于它们的大小、容易处理， 以及有关它们的生理和遗传组成的信息，小鼠是优选的实施方案。然 而，其它动物也合适，包括大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、沙土鼠、土拨鼠、 小鼠、猫、狗、绵羊、山羊、猪、奶牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂 猿和狒狒)。鱼也可考虑用于体内测定法，线虫也一样。调节剂的测 定可用源自任意这些物种的动物模型进行。
在这类测定法中，将一种或多种候选物质施用给动物，并且与惰 性载体(阴性对照)和H2S(阳性对照)比较，所述候选物质诱导停 滞、降低核心体温，或赋予生物物质在低氧或缺氧环境条件下存活的 能力的能力鉴定调节剂。用试验化合物处理动物将涉及将该化合物， 以合适的形式，施用给动物。候选化合物(气体或液体)的施用可通 过能用于临床或非-临床目的的任何途径，包括但不限于经口、经鼻(吸 入或气溶胶)、经颊或甚至是局部施用。或者，施用可以通过气管内 滴注法、支气管滴注法、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注 射或静脉内注射进行。特别考虑的途径是全身性静脉注射、通过血液 或淋巴供给的局部施用，或直接施用至受影响的部位。
VII.施用模式和药物组合物
硫属化物、氧拮抗剂或活性化合物的药物组合物的有效量通常定 义为足以可检测地改善、减小、最小化或限制目标病症的程度的量。 可采用更严格的定义，包括疾病的消除、根除或治愈。
A.施用
自然地，硫属化物或其它活性化合物的施用途径将随要处理的病 症的部位和性质而变化，并包括例如，吸入、皮内、经皮肤、肠胃外、 静脉内、肌内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、瘤内、灌注、 灌洗、直接注射，以及经口施用和制剂。如下面详述的，活性化合物 可作为医用气体通过吸入或插管法施用，作为注射用液体剂通过血管 内、静脉内、动脉内、脑室内(intracerobroventicular)、腹膜内、 皮下施用、作为局部用液体剂或凝胶剂、或固体口服剂型施用。
而且，所述量可以根据生物物质的类型(细胞类型、组织类型、 生物的属和种等)和/或其大小(体重、表面积等)变化。通常是生物 越大，剂量就越大。因此，用于小鼠的有效量通常将比用于大鼠的有 效量低，用于大鼠的有效量通常将低于用于狗的有效量，用于狗的有 效量通常将低于用于人的有效量。硫化氢在人体内实现停滞的有效浓 度取决于剂型和施用途径。对于吸入法，在一些实施方案中，有效浓 度在连续递送50ppm至500ppm的范围内。对于静脉内施用，在一 些实施方案中，有效浓度在连续递送的每千克体重0.5至50毫克的范 围内。
类似地，施用时间的长度可以根据生物物质的类型(细胞类型、 组织类型、生物的属和种等)和/或其大小(体重、表面积等)改变， 并且将会部分取决于剂型和施用途径。在特殊的实施方案中，提供活 性化合物约或至少30秒钟、1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分 钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6 小时、8小时、12小时、24小时或长于24小时。活性化合物可以单 次剂量或多剂量施用，施用的剂量之间的时间量不同。
在移植的情形中，本发明可在手术前和或手术后使用以使得宿主 或嫁接材料休眠。在具体的实施方案中，外科手术位置可注射或灌注 含有硫属化物的制剂。所述的灌注可手术后继续，如通过让导管植入 于手术位置处。
B.可注射的组合物和制剂
用于递送本发明的氧拮抗剂或其它活性化合物的优选方法是吸 入法、静脉内注射、特殊区的灌注和经口施用。然而，在此公开的药 物组合物可备选如美国专利5,543,158、美国专利5,641,515和美国专 利5,399,363(将每篇在此特别通过全文引入作为参考)中描述的，经 肠胃外、皮内、肌内、经皮肤或甚至是腹膜内施用。
活性化合物的溶液可在适当与表面活性剂(例如羟丙纤维素)混 合的水中制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在 油中制备。在一般的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂用以防 止微生物的生长。适合注射施用的药物形式包括无菌含水溶液或分散 体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂(美国专利 5,466,468，特别在此通过全文引入作为参考)。在所有情形中，所述 的形式必须是无菌的，并且应该是流动到容易进行注射的程度。在制 造和储存条件下其必须是稳定的，并且必须将其防腐以防止微生物如 细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如 甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物和/或植物油的溶 剂或分散介质。适当的流动性可例如通过用包衣如卵磷脂、在分散的 情形中通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活化剂来维持。对微 生物作用的预防可通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯类、 氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情形中，将优选包 括等渗剂，例如糖或氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过在该组 合物中使用延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
对于以含水溶液的肠胃外施用，例如，如有必要应该适当地缓冲 该溶液并用足够的盐水或葡萄糖首先赋予该液体稀释剂等渗性。这些 特殊含水溶液特别适合静脉内、肌内、皮下、瘤内和腹膜内施用。就 此而论，根据本公开内容，可使用的无菌含水介质将是本领域那些技 术人员已知的。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗的NaCl溶液中， 并加到1000ml皮下输注流体中或在建议的输注位点处注入(参见例 如，“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版，1035-1038和 1570-1580页)。剂量的一些变化必然会根据受治疗的受试者的状况 发生。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的合适剂 量。此外，对于人施用，制剂应该符合如FDA生物制品标准办公室 (Office of Biologics standards)要求的无菌性、致热原性、一般安全 性和纯度标准。
无菌注射用溶液通过这样制备：将需要量的活性化合物与需要的 上文中列举的各种其它成分一起掺入合适的溶剂中，之后过滤灭菌。 通常，分散体通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中制备，所述 载体含有基本分散介质和所需的来自上面列举的其它那些成分。在用 于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情形中，优选的制备方法是真 空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性物质加上任何来自其事先 无菌-过滤的溶液的额外所需成分的粉末。
如在此使用的，“载体”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、赋 形剂、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和延缓吸收的试剂、 缓冲液、载体溶液、混悬液、胶体等。这种介质和试剂用于药学活性 物质的用途在本领域中是熟知的。除了与活性成分不相容的任何常规 介质或制剂外，考虑将它们用于治疗性组合物中。辅助的活性成分也 可掺入该组合物中。
短语“可药用”或“药理学上可接受的”指在施用给人时不会产生 过敏反应或类似的不利反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活 性成分的含水组合物的制备是本领域中充分了解的。通常，这类组合 物可制备成可注射剂，作为液体溶液剂或混悬剂；也可制备成适合在 注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
C.静脉内用制剂
在一个实施方案中，本发明的活性化合物可配制用于肠胃外施用 (例如静脉内、动脉内)。在其中活性化合物在室温下是气体的情况 下，考虑含有已知和期望浓度的气体分子的溶液剂，所述气体分子溶 解于用于肠胃外施用的液体或溶液中。活性化合物溶液的制备可通过 例如，让气体与溶液接触(例如，鼓泡或注入)以使该气体分子溶解 于溶液中完成。本领域中的那些技术人员将认识到，溶解于溶液中的 气体的量将取决于许多变量，包括(但不限于)气体在液体或溶液中 的溶解度、液体或溶液的化学组成、它的温度、它的pH、它的离子 强度，以及气体的浓度和接触程度(例如，鼓泡或注入的速率和持续 时间)。活性化合物在用于肠胃外施用的液体或溶液中的浓度可采用 本领域那些技术人员已知的方法确定。活性化合物在液体或溶液中的 稳定性可通过在制备或生产氧拮抗剂溶液后，在不同的时间间隔后测 量溶解的氧拮抗剂的浓度而测定，其中与起始浓度比较氧拮抗剂浓度 的减少表示活性化合物的损失或化学转化。
在一些实施方案中，含有硫属化物化合物的溶液剂通过将盐形式 的硫属化物溶解于无菌水或盐水(0.9％氯化钠)中以产生可药用的静 脉内剂型来生产。可缓冲静脉内液体剂型来达到某种pH，以增强硫 属化物化合物的溶解度或影响硫属化物化合物的电离状态。在硫化氢 或硒化氢的情形中，本领域那些技术人员已知的许多盐形式的任意一 种可满足需要，包括但不限于钠、钙、钡、锂或钾。在另一优选的实 施方案中，将硫化氢或硒化氢溶解于无菌磷酸盐缓冲盐水中，并用盐 酸调节pH为7.0以获得可静脉内或动脉内施用给受试者的已知浓度 的溶液剂。
考虑在一些实施方案中，到本发明的药物组合物是关于活性化合 物饱和溶液。该溶液可以是任意可药用制剂，其中大多数是熟知的， 例如林格氏溶液。在特定实施方案中，活性化合物的浓度是约，至少 约或至多约0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、 0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、 1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、 2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、 4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0M或更大，可源于 其中的任何范围(在标准温度和压力下(STP))。对于H2S，例如， 在一些实施方案中，浓度可以是约0.01至约0.5M(在STP下)。特 别是考虑，上述浓度可应用于独立地或一起位于溶液中的一氧化碳和 二氧化碳。
此外，当施用是静脉内施用时，考虑可使用下列参数。流速约， 至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100gtts/分钟或μgtts/分 钟，或可源于其中的任何范围。在一些实施方案中，溶液的量通过体 积(取决于溶液的浓度)来说明。时间的量可以是约，至少约或至多 约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分钟；1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24小时；1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4、5 周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或可源于其 中的任何范围。
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、 290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、 410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、 520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、 640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、 760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、 880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、 1000ml或升，或其中的任何范围的体积可以总体施用或在单独的一 段时间内施用。
在一些实施方案中，用于肠胃外施用的活性化合物的溶液剂在其 中氧已在将液体或溶液与活性化合物接触之前被除去了的液体或溶液 中制备。某些氧拮抗剂，尤其某些硫属化物化合物(例如硫化氢、硒 化氢)在存在氧时，由于它们与氧进行化学反应的能力，导致它们的 氧化和化学转化而是不稳定的。可使用本领域已知的方法将氧从液体 或溶液中去除，所述的方法包括(但不限于)施加负压(真空除气) 于液体或溶液，或将溶液或液体与引起氧结合或“螯合”的试剂接触， 有效地将它从溶液中除去。
在另一个实施方案中，用于肠胃外施用的氧拮抗剂或其它活性化 合物的溶液剂可在气密性容器中储存。当已将氧预先从溶液中除去以 限制或防止氧拮抗剂或其它活性化合物氧化时，这尤其是期望的。此 外，在气密性容器中储存将会抑制氧拮抗剂气体或其它活性化合物从 液体或溶液中挥发，使得溶解的氧拮抗剂的恒定浓度得以维持。气密 性容器是本领域那些技术人员已知的，并包括(但不限于)含有不透 气的构建材料的“静脉内用袋”，或密封的玻璃瓶。为了防止暴露于气 密性储存容器中的空气，可在封闭前将惰性气体，如氮或氩引入容器 中。
D.局部用制剂及其用法
本发明的方法和组合物可用于在皮肤和口腔粘膜的浅层中诱导 停滞，所述的皮肤和口腔粘膜的浅层包括(但不限于)口和舌的毛囊 细胞、毛细管上皮细胞和上皮细胞。用于治疗癌的放射治疗和化学治 疗会损伤毛囊和口腔粘膜中的正常细胞，分别导致不期望的，仅致虚 弱的癌治疗的副作用、脱发和口腔粘膜炎。在提供血液给毛囊的毛囊 细胞和/或脉管细胞中诱导停滞可减慢、限制或防止伴随放射治疗和化 学治疗的对毛囊细胞的损伤和导致的脱发，或其它脱发症、男性型秃 发、女性型脱发，或毛发从其通常存在的皮肤区域的其它缺失。在口 腔上皮细胞和间质细胞中诱导停滞可减慢、限制或防止对内衬在口、 食道和舌的细胞的损伤，以及导致的口腔粘膜炎的疼痛状况。
在某些实施方案中，局部施用活性化合物。这通过将该活性化合 物配制成乳剂、凝胶剂、糊剂或漱口剂，并将该制剂直接施用至需要 暴露于活性化合物的区域(例如，头皮、口、舌、喉)实现。
本发明的局部用组合物可通过选择合适的载体配制成油剂、乳 剂、洗剂、软膏剂等。合适的载体包括植物油或矿物油、白凡士林(白 软石蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和高分子量醇(大于C12)。优 选的载体是活性成分在其中能溶解的那些载体。也可以包括乳化剂、 稳定剂、保湿剂和抗氧化剂，以及赋予颜色或芳香的试剂，如果需要 的话。另外，透皮渗透增强剂可用于这些局部用制剂中。这类增强剂 的实例可在美国专利3,989,816和4,444,762中找到。
乳剂优选用矿物油、自乳化的蜂蜡和水的混合物配制，在该混合 物中掺合了溶解于小量油(例如杏仁油)中的活性成分。这种乳剂的 典型实例是含有约40份的水，约20份的蜂蜡、约40份的矿物油和约 一份的杏仁油的乳剂。
软膏剂可通过将植物油(如杏仁油)中的活性成分溶液与温和的 软石蜡混合，并让该混合物冷却而配制。这种软膏剂的典型实例是按 重量计含有约30％的杏仁油和约70％的白软石蜡的软膏剂。
洗剂可通过将活性成分溶解于合适的高分子量的醇(例如丙二醇 或聚乙二醇)中来方便地制备。
可经直肠使用的可能的药物制剂包括，例如栓剂，其由一种或多 种活性化合物与栓剂基质的组合组成。合适的栓剂基质是例如，天然 的或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，使用由活性化合物与基质的组 合组成的明胶直肠用胶囊也是可能的。可能的基质材料包括例如，液 体甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃。
E.固体剂型
药物组合物包括其中活性化合物被俘获或隐蔽于能达到晶态、固 态的多孔载体构架中的固体剂型。具有气体储存能力的这种固体剂型 是本领域已知的，并可以以可药用形式生产(例如，Yaghi等，2003)。 这种药物组合物的一个特殊优势和硫属化物化合物(如，硫化氢、一 氧化碳、硒化氢)有关，硫属化物化合物处于它们的游离形式时在某 些浓度下对一些哺乳动物可能有毒性。在某些实施方案中，所述的化 合物可配制用于经口施用。
F.灌流系统
用于细胞的灌流系统可用于将组织或器官暴露于液体或半固体 形式的活性化合物。灌流指连续的溶液流穿过细胞群或从细胞群上流 过。这意味着与连续流动培养相反，细胞滞留于培养物中，所述的连 续流动培养用分离培养基(withdrawn media)来洗出细胞(例如恒化 器)。灌流使得能更好地控制培养环境(pH、pO2、营养水平、活性 化合物水平等)，并且是一种显著增加培养物内用于细胞附着的表面 积的利用的方法。
开发灌流技术用以模拟其中持续给细胞以血液、淋巴或其它体液 的体内细胞环境。不灌流生理营养液，培养物中的细胞经历被喂养和 饥饿的交替阶段，从而限制了它们生长和代谢潜能的充分表现。在本 发明范围中，灌流系统还可用于给细胞灌注氧拮抗剂用以诱导停滞。
本领域的那些技术人员熟悉灌流系统，并且存在许多可商业获得 的灌流系统。在本发明中可采用这些灌流系统的任意一种。灌流系统 的一个实例是使用无纺布的床基体的灌流填充床反应器(CelliGenTM， New Brunswick Scientific，Edison，NJ；Wang等，1992；Wang等， 1993；Wang等，1994)。简而言之，该反应器包括用于培养锚着依存 性细胞和非锚着依存性细胞两者的改良反应器。反应器设计为具有提 供内部再循环的装置的填充床。优选地，将纤维基体载体置于反应器 容器内的篮中。该篮的顶部和底部都有孔，让培养基能流过篮。特别 设计的叶轮提供培养基再循环通过纤维基体占据的空间以确保均一提 供营养物和除去废物。这同时确保了可忽略量的总细胞群悬浮于培养 基中。篮和再循环的组合还提供氧合培养基无气泡地流过纤维基体。 纤维基体是具有10μm至100μm“孔”径的无纺布，提供了很大的内容 量，孔容量相当于单个细胞容量的1至20倍。
灌流填充床反应器具有几个优点。具有纤维基体载体，保护细胞 免受来自搅动和起泡的机械应激。自由的培养基流过篮提供给细胞最 佳调节水平的氧、pH和营养物。产物可不断地从培养基中移出，并 且采集的产物是无细胞的并可在低-蛋白质培养基中产生，这可促进接 下来的纯化步骤。该技术在WO 94/17178(1994年8月4日，Freedman 等)中有详细解释，其因此将其通过全文引入作为参考。
CellcubeTM(Corning-Costar)模块为基质附着细胞的固定和生长 提供了大的苯乙烯(styrenic)表面积。它是整体包封的无菌一次性使 用装置，其具有一系列的平行培养平板，培养平板连接而在相邻平板 间产生薄的密封的层流空间。
CellcubeTM模块具有彼此对角相对并帮助调节培养基的流量的入 口和出口。在开始的数天生长过程中，通常将培养物在起始接种后通 过包含于系统内的培养基来饱和。在起始接种和培养基灌流开始之间 的时间量取决于接种的接种物中细胞的密度和细胞生长速率。循环的 培养基中营养物浓度的测量是培养物状态的一个好的指标。当确定了 程序后，有可能有必要监测多种不同灌流速率的营养物组合物，以确 定最经济的和生产性的操作参数。
其它可商业获得的灌流系统包括，例如CellPerf_(Laboratories MABIO International，Tourcoing，法国)和Stovall Flow Cell(Stovall Life Science，Inc.，Greensboro，NC)。
培养物的生产阶段的时间选择和参数取决于特殊细胞系的类型 和用途。许多培养物需要不同于培养物生长阶段所需的培养基来用于 生产。在传统的培养中，从一个阶段向另一个阶段的转换很可能需要 多个洗涤步骤。然而，灌流系统的优点之一是提供多个操作阶段之间 温和转换的能力。灌流系统还可促进从生长阶段向通过氧拮抗剂诱导 的停滞(static)阶段转换。同样，灌流系统可促进通过用例如生理营 养培养基替换含有氧拮抗剂的溶液，从停滞阶段向生长阶段转换。
G.导管
在某些实施方案中，导管用于将活性化合物提供给生物。特别重 要的是施用这样一种药剂至心脏或脉管系统。通常，将导管用于该目 的。Yaffe等，2004在关于滞生内容中特别论述了导管，虽然在该出 版物之前导管的使用就是普遍已知。
H.气体的递送
1.呼吸系统
一种典型的气体递送系统100在图9中说明。递送系统100适合 递送可以吸入的气体(包括活性剂)至受试者的呼吸系统。气体递送 系统100包含一个或多个气体源102。
每个气体源102中的每一个连接至调节器104和流量计106。气 体递送系统100还包含活性剂源107、任选的汽化器108、排出口控制 器110、清除器(scavenger)112，和警报/监测系统114。递送系统 100可包含通常在麻醉递送仪中使用的某些元件。例如，麻醉递送仪 通常包含一个高压回路、一个低压回路、一个呼吸回路和一个清除回 路(scavenging circuit)。如在图10-11中描述的，可提供一个或多个 气体源102、汽化器108、出口控制器110、清除器112和/或警报/监 测系统114作为具有高压、低压、呼吸和/或清除回路的装置的部分， 并且这些元件可类似于在麻醉递送仪中通常使用的那些。麻醉递送仪 例如在美国专利4,034,753、4,266,573、4,442,856和5,568,910中描述， 因此将这些专利的内容通过全文引入作为参考。
气体源102可通过压缩气体罐提供；然而，应该理解，气体源 102可以是气体源或可转化成气体的液体源。例如，汽化器108可用 于使液化气体源汽化。调节器104包含降低每个气体源102的气压的 阀。减压气体随后通过其中一个流量计106，该流量计测量并控制来 自每个相应气体源102的气体的流量。
气体源102可以是用于递送活性剂107的载气。可选择载气用以 提供给被递送了来自源107的活性剂的受试者一个期望的环境。例如， 如果活性剂作为可吸入的气体递送给患者，则载气可包括足够量的氧、 一氧化二氮或空气来满足患者的需要。可使用其它惰性气体或活性气 体。
在一些实施方案中，气体源102之一包括活性剂源107。来自源 107的活性剂可以是通过汽化器108汽化的液化气源，或者该活性剂 可以是气体源，例如在高压下的压缩气体。活性剂可与气体源102中 一个或多个混合。排出口控制器110控制提供给受试者的气体混合物 的量。
清除器112是将提供给受试者的气体清除和/或通风换气的装置 或系统。例如，如果来自源107的活性剂作为可吸入的气体提供给患 者，则清除器112可用于去除吸入剂(例如活性剂)、未使用的氧和 呼出的二氧化碳的废气。
警报/监测系统114包括在递送系统100中的一个或多个位置监测 气体流量和/或气体含量的传感器。例如，可在来自源107的活性剂作 为可吸入的气体提供给患者时监测氧的流量或流量，以确保载气包含 对于患者足够的氧。警报/监测系统114还包含一个用户界面，该用户 界面经设定用以提供声音或视觉报警信号或者监测给递送系统100的 使用者的信息，例如视屏显示、光或声报警。可设定警报/监测系统114 在满足预定条件时通知使用者和/或提供关于气体水平的信息。
关于图10，系统100A包含一个高压回路116、低压回路118、呼 吸回路120和清除回路122。
高压回路116包括压缩气体源102，其连接至调节阀104b、104a。 调节阀104a控制从每个气体源102流出的气体的量，并且可以打开调 节阀104b用以例如通过提供通向周围气氛的开口来增加气体的压力。
低压回路118包括流量计106、活性剂源107和汽化器108。来 自气体源102的气体混合物由流量计106提供，其控制来自气体源102 的每种气体的量。如在图10中说明的，活性剂源107是液体。活性剂 源107通过汽化器汽化并加入至气体混合物中。
呼吸回路120包括排出口控制器110、两个单向阀124、126以及 吸收器128。清除回路122包括阀112a、储蓄器112b和排出口112c。 受试者130接收来自排出口控制器110的气体混合物并且产生的气体 通过清除回路122通风换气。更特具体地说，排出口控制器110控制 通过单向阀124递送给受试者130的气体混合物的量。呼出气体流过 单向阀126到达阀112a并到达储蓄器112b。过量气体通过清除器112 的排出口112c排出。一些气体可以再循环并流过吸收器128并进入呼 吸回路120中。吸收器128可以是用于减少呼出气体中的二氧化碳气 体的二氧化碳吸收罐。在该构造中，呼出的氧和/或活性剂可再循环和 再使用。
一个或多个传感器S可在系统100A中的不同位置加入。传感器 S感知和/或监测系统100A中的气体。例如，如果其中一个气体源102 是氧，则其中一个传感器S可以是经设定并置于适当位置用于监测系 统100A中的氧，以便患者接受合适量氧的氧传感器。传感器S与警 报/监测系统114通讯(见图9)。如果不期望的或危险的气体水平出 现在系统100中，则警报/监测系统114可警告系统100A的使用者以 便可以采取适当的措施，例如增加提供给受试者130的氧水平或让受 试者130脱离递送系统100A。
关于图11，显示了系统100B，其中活性剂源107连接至两个调 节阀104b、104a。如果活性剂源107是液化气源，则提供任选的汽化 器108来使液化气源汽化。如果活性剂源107是气体的(如高压气体)， 那么可省略汽化器108。来自源107的活性剂在低压回路118中以由 流量计106控制的量与其它气体源102混合。低压回路118包括气体 储蓄器109，其容纳在气体混合物流向呼吸回路120时任何溢出的气 体混合物。应该理解，活性剂源107和/或任何气体源102可作为液化 气源提供给汽化器。在图11中说明的系统100B的元件基本上与上文 中描述的关于图10的那些元件相同，并将不会另外描述。
可采用系统100、100A、100B实施的，根据本发明的实施方案 的方法在图12中说明。提供了一个或多个可吸入的气体源的混合物 (202部件)。可吸入的气体源可如有关图9-11描述的从气体源102 获得。将预定量的活性剂加入气体混合物(204部件)中，例如有关 图9-11中的活性剂源107所显示的。将气体混合物施用给受试者120 (306部件)。将呼出气体例如通过清除器112来通风换气和/或再循 环(208部件)。虽然图12的方法是相对于图9-11的系统100、100A、 100B来描述的，但应该理解任何合适的系统或装置可用于完成图12 中的步骤。
2.减压递送系统
气体递送系统300的实施方案相对于图13来说明。气体递送系 统300放置在受试者302上。气体递送系统300特别适合递送气体混 合物中的活性剂给受试者302的组织，例如创伤组织。
系统300包括一个减压室304，其具有覆盖受试者302的处理区 域的遮蔽物306。该减压室304通过泵出口310a连接至真空泵310。 减压室304包括进气孔308a和排出口308b，其依次连接至活性剂源 307。控制器320连接至活性剂源307和真空泵310。减压室和真空泵 系统在美国专利5,645,081和5,636,643中论述，因此将其内容通过全 文引入作为参考。
设置减压室304来围住受试者302的区域以提供流体密封的或气 密性罩，来实现用减压或负压以及活性剂源307对该区域的处理。压 力室304可用覆盖物(未显示)，例如柔性的、带粘性的、流体不可 渗透的聚合物薄片贴在受试者302上。该覆盖物可具有一个粘性背衬， 其用于环绕受处理区域的边缘覆盖住皮肤，并用于提供通常气密性的 或流体密封的密封并用于固定室304于适当的位置。
遮蔽物306位于受试者302的处理区域上。例如，如果受试者302 的处理区域包括伤口，则该遮蔽物306可位于伤口之上用以防止其过 度生长。可调节遮蔽物306的大小和结构以适合个体的处理区域，并 且其可用多种多孔材料形成。该材料应该是充分多孔的以使得氧及任 何其它气体，例如来自活性剂源307的气体能到达处理区域。例如， 遮蔽物306可以是开室聚合物泡沫的形式，如聚氨酯泡沫塑料，其是 充分多孔的以使得气体能流至处理区域和/或自处理区域流出。可使用 厚度和硬度不同的泡沫塑料，但如果患者在治疗过程中必须躺在该装 置上，则为了患者的舒适使用海绵材料可能是理想的。该泡沫塑料还 可进行打孔以增强气流并减轻系统300的重量。遮蔽物306可切割成 合适的形状和大小以适合在处理区域内，或可替代地，遮蔽物306可 足够大来与周围的皮肤重叠。
真空泵310提供了一个抽吸源于减压室304中。活性剂源307为 减压室304提供了一定量活性剂。控制器320通过真空泵310控制施 加于减压室304的真空的量以及通过活性剂源307控制供给室304的 活性剂的量。
应该理解，控制器320可以充分恒定的方式、循环地、或采用多 种波动或模式或它们的任意组合施加真空和/和活性剂。在一些实施方 案中，活性剂通过活性剂源307提供，备选用真空泵310的真空泵出 作用提供。也就是说，控制器320在活性剂源307失活时可替代地激 活真空泵310，然后在真空泵310失活时激活活性剂源307。减压室 304中的压力允许波动。在其它实施方案中，基本恒定的压力通过真 空泵310维持，并且活性剂源307提供充分恒定量的活性剂给在减压 环境中的室304。在一些实施方案中，基本恒定的压力通过真空泵310 维持，而活性剂的量以周期性方式变化。在其它实施方案中，减压室 304中的压力通过真空泵310来发生波动，并且由源307提供的活性 剂的量也波动。真空泵310和产生的室304中压力的波动，或者由源 307提供的活性剂的量的波动可以是周期性的或非周期性的。
可用系统300进行的根据本发明的实施方案的方法在图14中得 以说明。室304位于受试者302的处理区域(402部件)上。室304 中的压力通过真空泵310(404部件)来减少。将预定量的来自活性剂 源307的活性剂施加至室(406部件)。虽然图14的方法是相对于图 12中的系统300描述的，但应该理解，任何合适的系统或装置都可用 于实施图14中的步骤。例如，排出口308b可以省略，并且活性剂可 通过单个进气孔308a供应给室304。其它气体也可例如用单个进气孔 或一个进气孔和一个排出口来加入至室304中，如相对于活性剂源307 和进气孔308a及排出口308b来说明的。在一些实施方案中，真空泵 310连接至泵310和室304之间用于收集来自处理区域的渗出物的另 外的收集容器，例如，如美国专利5,636,643中描述的。
在一些实施方案中，负压气体递送系统500，如图22A中说明的， 包含于容器502中的一个活性氧拮抗剂源，容器502通过导管508， 经过进气孔506连接至盖层504。该盖层相对于组织位点510(可能是 伤口位置)形成密封的封袋。在一些实施方案中，该盖层具有通过导 管516与负压源514连通的排出口512。在一些实施方案中，废物罐 518，其可以是可拆卸的废物罐，与排出口和负压源之间连通。在一些 实施方案中，回路排出口520通过导管522与容器502连通。在一些 实施方案中，如图22B中显示的，汽化器524被插入容器502和遮盖 物504之间的连通物中。
导管可以是柔性的，并且可适合为类似塑料的材料软管。负压源 514，其可适合为真空泵，在一些实施方案中通过导管516与排出口 512进行流体通讯，用于促进流体排出，如本领域已知的。在一些实 施方案中，废物罐518位于真空下，通过流体通讯来收集排出的流体。 优选地，将一个过滤器(未显示)，其可以是疏水性膜滤器，插入废 物罐和负压源之间，用来防止吸入废物罐中的排出流体的污染。在一 些实施方案中，盖层504含有弹性材料，因此其可在负压源的间歇性 操作过程中适应组织位点区域上的压力变化。在一些实施方案中，盖 层的边缘覆盖有压敏胶粘剂，其可以是丙烯酸系粘合剂，用于将盖层 密封于组织位点上。
如图12和图22A-B中说明的负压气体递送系统300和500可用 于处理不同区域用于治疗，并尤其用于处理伤口。可采用系统300处 理的伤口包括受感染的开放性创伤、褥疮、裂开的切口、部分厚度烧 伤，以及多种已连接了皮瓣或移植物的损伤处。对伤口的治疗可这样 进行：将气体递送系统如先前显示和描述的固定于治疗位置，减压室 304内维持基本上持续减少或周期性减少的压力，并以基本上持续或 周期性的方式提供活性剂给室304直到伤口达到期望的改善状况。选 择的改善状况的状态可包括形成足以用于附着皮瓣或移植物的肉芽组 织、减少伤口处的微生物感染、阻止或逆转烧伤穿透、伤口的闭合、 皮瓣或移植物与下面的损伤的组织整合、伤口的完全治愈、或适于给 定类型的伤口或伤口综合征的其它改善或治愈阶段。尤其在使用结合 了遮蔽物在伤口上或伤口中的气体递送系统时，气体递送系统在治疗 过程中可周期性地改变，例如以48小时的间隔改变。该方法可用0.01 至0.99大气压范围的负压或减压来实践，或者该方法可用0.5至0.8 大气压之间范围的负压或减压来实践。用于在伤口上使用该方法的时 间周期可以是至少12小时，但是可例如延长至1天或数天。不存在该 方法的使用超过它则不再有效的上限；该方法可增加闭合的速度一直 到伤口确实闭合时。多种类型的伤口的令人满意的治疗可通过利用相 当于比大气压低约2至7Hg的减压来完成。
以间歇或周期性的方式提供减压给气体递送系统，例如如上文中 描述的，可用于在存在活性剂时治疗伤口。间歇或周期性提供减压给 气体递送系统可通过手动或自动控制真空系统来实现。在这种间歇性 减压处理中的周期比，即“工作”时间与“不工作”时间的比率可以低到 1∶10或高达10∶1。典型的比率是约1∶1，其通常以交替进行的5分钟 的减压提供和不提供的间隔来完成。
合适的真空系统包括能够提供至少0.1磅抽吸力给伤口，或至多 3磅的抽吸力，或至多14磅抽吸力的任何抽吸泵。该泵可以是能够提 供所需抽吸力的任何适合医疗目的的普通抽吸泵。泵和减压装置中间 连接的导管的尺寸由该泵提供操作所需的抽吸力水平的能力控制。1/4 英寸直径的导管可以是合适的。
本发明的实施方案还包括处理受损组织的方法，其包括在选择的 时间内且以选择的量值(其足以减少伤口处的细菌密度)施用负压至 伤口和施加活性剂的步骤。开放性创伤几乎总是受有害细菌污染。一 般而言，每克组织105个细菌生物的细菌密度认为是受感染的。一般 认为在这种感染水平，移植的组织将不会附着于伤口上。这些细菌必 须在伤口闭合之前，通过伤口宿主的天然免疫应答或通过一些外部方 法杀死。施用负压和活性剂至伤口可减少伤口的细菌密度。人们相信， 这种作用可能是由于细菌与负压环境的不相容或伤口区域的血流量增 加与暴露于活性剂的组合，因为血液给它带来了细胞和酶来破坏细菌。 根据本发明的实施方案的方法可用于将伤口处的细菌密度减少至少一 半。在一些实施方案中，其可用于将细菌密度减少至少1,000倍或至 少1,000,000倍。
本发明的实施方案还包括处理烧伤的方法，该方法包括以预定的 负压和在足以抑制全厚度烧伤形成的时间内施加负压和活性剂至一定 区域上的烧伤的步骤。部分厚度烧伤是具有死组织的表面层和下面的 停滞层的烧伤，通常受到充分感染，这样它将在24-48小时内转变成 全厚度烧伤，即其中所有表皮结构都受到破坏的烧伤。施加负压和一 定量的活性剂至伤口可防止感染变得充分严重而导致下面的表皮结构 破坏。压力施用的大小、模式和持续时间可随个体伤口变化。
本发明的实施方案还包括用于增强活组织附着至伤口的方法，该 方法包括下面的步骤：首先连接活组织至伤口以形成伤口-组织复合 体，然后施加选择的大小的负压或减压以及一定量的活性剂至区域上 的伤口-组织复合体，所述的负压或减压以及活性剂的量足以促进上皮 和皮下组织迁移至该复合体，让负压和暴露于活性剂保持足以促进伤 口闭合的选择的周期。活组织附着至伤口是可采取多种形式的普通方 法。例如，一种普通技术是利用“皮瓣”，即其中将来自伤口邻近区域 的皮肤组织的三面分离但保持在第四面上连接，然后将其移至伤口上 的技术。另一种经常使用的技术是开放性皮肤移植，其中皮肤与另一 皮肤表面完全分离并移植到伤口上。施加负压和活性剂至伤口-移植物 复合体减少了该复合体中的细菌密度并增加了至伤口的血流量，从而 改善了移植组织的附着。
I.其它仪器
在本发明的某些实施方案中，补充本发明的用于治疗将会遭受或 已经遭受外伤的患者的方法以外部操纵患者的核心体温的能力是期望 的。在这点上，患者的核心体温可以结合本发明的方法，通过侵入性 或非侵入性途径操纵。用于操作核心体温的侵入性方法包括，例如， 利用心肺泵来加热或冷却患者的血液，从而升高或降低患者的核心体 温。操纵核心体温的非侵入性途径包括将热传递进或转移出患者身体 的系统和仪器。
J.其它的递送装置或仪器
在一些实施方案中，考虑方法或组合物将涉及特定的递送装置或 仪器。在此论述的任何方法可用用于递送或施用的任何装置，包括但 不限于在这里论述的那些装置完成。
对于局部施用本发明的活性化合物，可将本发明的活性化合物配 制成溶液剂、凝胶剂、软膏剂、乳剂、混悬剂等，如本领域熟知的。 全身用制剂可包括设计用于通过注射或输注，例如皮下、静脉内、肌 内、鞘内或腹膜内注射施用的那些制剂，以及设计用于透皮肤、透粘 膜、经口或经肺施用的那些制剂。
对于经口施用，本发明的活性化合物将被配制成用于通过受治疗 患者经口摄取的片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、流体剂、凝胶剂、糖浆 剂、於浆剂、混悬剂等，或经口的液体制剂，例如悬浮剂、酏剂和溶 液剂。
对于口腔施用，组合物可采取以常规方式制备的片剂、锭剂等形 式。其它的粘膜内递送可通过栓剂或鼻内递送。
对于通过吸入直接施用至肺部，本发明的化合物可通过多种不同 的装置方便地递送至肺部。例如，
定量吸入器(MDI)：可将使用含有合适的低沸点推进剂(如二氯 二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体) 的气罐的定量吸入器(“MDI”)用于直接递送本发明的化合物至肺部。 MDI装置可从许多供应商获得，例如3M Corporation(例如网址 3m.com/us/healthcare/manufacturers/dds/pdf/idd_valve_canister_bro chure.pdf-)、来自阿凡斯(Aventis)的Nasacort(例如网址 products.sanofi-aventis.us/Nasacort_HFA/nasacort_HFA.html-63k-)、保尔 因海姆(Boehringer Ingelheim)，(例如网址 boehringer-ingelheim.com/corporate/home/download/r_and_d2003.pdf)、来 自弗斯特实验室(Forest Laboratories)的Aerobid(例如网址 frx.com/products/aerobid.aspx)、葛兰素-威尔康(Glaxo-Wellcome)(例 如网址www.gsk.com/research/newmedicines/newmedicines pharma.html上) 以及先灵保尔(Schering Plough)，(网址 www.schering-plough.com/schering_plough/pc/allergy_respiratory.jsp)。
干粉吸入器(DPI)：DPI装置通常采用一种机制例如气体喷出 来在容器内形成干粉的雾状物，其随后可由患者吸入。DPI装置也是 本领域熟知的并且可从许多出售者购买到，包括，例如来自先灵公司 (Schering Corporation)的Foradil aerolizer，(例如， www.spfiles.com/piforadil.pdf)、来自葛兰素-威尔康的Advair Diskus (例如，www.us.gsk.com/products/assets/us_advair.pdf-)。最受欢迎的 变体是多剂量DPI(″MDDPI″)系统，其使得能递送多于一个的治疗剂 量。MDDPI装置可从多个公司获得，例如来自阿斯捷利康 (AstraZeneca)的Plumicort Turbuhaler(例如， www.twistclickinhale.com/)、葛兰素威尔康(例如， www.us.gsk.com/products/assets/us_advair.pdf-)以及先灵保尔，例如， www.schering-plough.com/schering_plough/pc/allergy_respiratory.jsp)。 进一步考虑可改变这类装置，或在此论述的任何其它装置用于单剂量 施用。
电流体力学(Electrohydrodynamic)(EHD)气溶胶递送：EHD 气溶胶装置利用电能使液体药物溶液剂或混悬剂气雾化(参见例如 Noakes等，美国专利No.4,765,539、Coffee，美国专利No.4,962,885、 Coffee，PCT申请，WO 94/12285、Coffee，PCT申请，WO 94/14543、 Coffee，PCT申请，WO 95/26234、Coffee，PCT申请，WO 95/26235、 Coffee，PCT申请，WO 95/32807)。EHD气溶胶装置可比现有的肺 部递送技术更有效地递送药物至肺部
雾化器：雾化器通过利用，例如超声能形成可容易吸入的细微粒 子，从液体药物制剂中产生气溶胶。雾化器的实例包括由 Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd.提供的装置(参见Armer 等，美国专利No.5,954,047；van der Linden等，美国专利No. 5,950,619；van der Linden等，美国专利No.5,970,974)、由阿凡斯提 供的吸入雾化器方案(Intal nebulizer solution)(例如， www.fda.gov/medwatch/SAFETY/2004/feb_PI/Intal_Nebulizer_PI.pdf )。
为了通过吸入直接施用气体至肺部，可采用目前可从市场上获得 的用于递送氧的多种递送方法。例如，可采用复苏器，例如急救袋(参 见，美国专利Nos.5,988,162和4,790,327)。急救袋由连接至面罩的 柔性的挤压袋组成，其由医师使用来将空气/气体引入进受害者肺中。
便携式的、手提式药物递送装置能够通过雾化器产生适合患有呼 吸道疾病的患者吸入的雾化剂。此外，这种递送装置提供了一种手段， 其中吸入剂的剂量可由医师或医生远程监测和根据需要来改变。参见 美国专利No.7,013,894。本发明的化合物的递送可通过用于递送补充 气体给人，结合监测人的换气的方法来完成，两者都未使用密封的面 罩(例如在美国专利No.6,938,619中描述的)完成。在呼吸疗法过程 中使用了用于有效分配氧或其它气体的气动氧保存装置，这样只有患 者呼吸的最初一部分含有氧或其它治疗气体(参见美国专利No. 6,484,721)。使用在患者开始吸入时启动的气体递送装置。将尾气流 在初始的吸入定时期间后递送给患者，以防止气体脉冲递送至患者。 以这种方式，气体仅在吸入的开始部分期间递送给患者，防止气体递 送只会填充患者肺部的气道。通过有效地利用氧，在患者是流动的时 候使用的圆柱瓶的氧将会持续更长时间，并且可以更小且更容易运送。 通过气动式递送气体给患者，不用电池或电子设备。
在此描述的所有装置可具有排气系统来结合或中和本发明的化 合物。
本发明化合物的经皮肤施用可通过固定在患者皮肤上的含药装 置或药贴实现。药贴允许包含于药贴内的药用化合物通过皮肤层吸收 并进入患者的血流中。这类药贴是可商业获得的，如来自Glaxo Smithkline的Nicoderm CQ药贴 (www.nicodermcq.com/NicodermCQ.aspx)以及例如来自 Ortho-McNeil Pharmaceuticals的Ortho Evra(www.ortho- mcneilpharmaceutical.com/healthinfo/womenshealth/products/orthoe vra.html)。透皮药物递送减小了与药物注射和静脉内药物施用相关 的疼痛，以及与这些技术相关的感染风险。透皮药物递送还避免了施 用药物的胃肠道代谢，减小了肝脏对药物的消除，并提供了施用药物 的持续释放。透皮药物递送也由于施用的相对容易性和药物的持续释 放而增强了患者对用药法的顺应性。
药贴的其它改变形式包括超声药贴，其用材料设计而使得能传送 超声通过药贴，实现了存储于药贴中的药物的递送，并可与超声药物 递送方法结合使用(见美国专利No.6,908,448)。瓶中的药贴(美国 专利No.6,958,154)包括一种流体组合物，例如在一些实施方案中的 喷雾剂，其可作为流体施用至表面上，但随后干燥而在宿主的表面形 成覆盖元件，例如药贴。如此形成的覆盖元件具有无粘性的外表面覆 盖物和在下面的帮助药贴粘着在基质上的粘性表面。
另一种药物递送系统包含一个或多个球状半导体聚集体 (aggregation)并促进储存在贮器中的药物的释放。第一个聚集体用 于感知和记忆，而第二个聚集体用于控制方面，例如用于泵送和分配 药物。该系统可以长期与远程控制系统通讯，或以本地动力独立地操 作，用于基于患者的需求、在系统控制下定时释放，或依照测量标记 的递送来递送药物。参见美国专利No.6,464,687。
泵和输注装置：输注泵或灌注器(perfusor)将流体、药物或营 养物输注入患者的循环系统中。输注泵可以非常可靠且便宜的方式施 用流体。例如，它们每小时可施用少至0.1mL的注射液(对滴注来说 太少)，每分钟注射液，患者要求的重复的一次性剂量注射，直到每 小时的最大数量(例如在患者控制的镇痛中)，或其容量随一天的时间 变化的流体。不同类型的输注装置已在美国专利和商标局受理的下面 专利申请中有描述。这些包括但不限于美国专利No.7,029,455、美国 专利No.6,805,693、美国专利No.6,800,096、美国专利No.6,764,472、 美国专利No.6,742,992、美国专利No.6,589,229、美国专利No. 6,626,329、美国专利No.6,355,019、美国专利No.6,328,712、美国专 利No.6,213,738、美国专利No.6,213,723、美国专利No.6,195,887、 美国专利No.6,123,524和美国专利No.7,022,107。此外，输注泵还可 从Baxter International公司 (www.baxter.com/products/medication_management/infusion_pump s/)、Alaris Medical Systems (www.alarismed.com/products/infusion.shtml)以及从B Braun Medical公司(www.bbraunusa.com/index.cfm？ uuid＝001AA837D0B759A1E34666434FF604ED)获得。
氧/气体一次性剂量递送(bolus delivery)装置：这种用于递送 气体给慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的装置可从Tyco Healthcare (www.tycohealth-ece.com/files/d0004/ty_zt7ph2.pdf)获得。它也可 用于递送本发明的化合物。上述装置是成本有效的、重量轻的、不显 眼的和可携带的。
瓶中的药贴(美国专利No.6,958,154)包括一种流体组合物，例 如在一些实施方案中的喷雾剂，其可作为流体施加至表面，但随后干 燥而在宿主的表面形成覆盖元件，例如药贴。如此形成的覆盖元件具 有无粘性的外表面覆盖物和在下面的帮助药贴粘着在基质上的粘性表 面。
可植入的药物递送系统：另一种药物递送系统包含一个或多个球 状半导体集合体并促进储存在贮器中的药物的释放。第一个聚集体用 于感知和记忆，而第二个聚集体用于控制方面，例如用于泵送和分配 药物。该系统可以长期与远程控制系统通讯，或以本地动力独立地操 作，用于基于患者的需求、在系统控制下定时释放，或依照测量标记 递送来递送药物。参见美国专利No.6,464,687。
在该部分中讨论的每个引用的专利和网址的内容在此通过引入 作为参考。
VIII.联合治疗
本发明的化合物和方法可用于许多治疗和诊断应用领域。为了增 加用本发明的组分(例如氧拮抗剂或其它活性化合物)治疗的有效性， 将这些组分与在治疗那些疾病和病症中有效的其它药剂(第二治疗) 组合是理想的。例如，治疗中风(抗中风治疗)通常包括抗血小板剂 (阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、噻氯匹啶)、抗凝血剂(肝素、 华法林)或血栓溶解剂(组织纤维蛋白溶酶原激活剂)。
可采用不同的组合，例如活性化合物如H2S是“A”而第二治疗是 “B”。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
施用本发明的氧拮抗剂和/或其它活性化合物给生物物质将会按 照用于施用那些特殊的第二治疗的一般方案，若有毒性，则考虑氧拮 抗剂(或其它活性化合物)治疗的毒性。预期将根据需重复治疗周期。 还考虑，可将多种标准的疗法，以及外科手术干预与所描述的疗法联 合应用。
IX.实施例
包括下列实施例用以说明本发明的优选实施方案。本领域的那些 技术人员应该理解，在接下来的实施例中公开的技术代表由本发明者 发现的技术在本发明实践中很好的发挥作用，并因此可认为构成了用 于其实践的优选方式。然而，本领域的那些技术人员根据本公开内容 应该理解，在所公开的特殊实施方案中可进行许多改变并且其仍然获 得类似或相似的结果而不会背离本发明的精神和范围。
实施例1：
线虫在一氧化碳中的保藏
大气含有210,000ppm的氧气。暴露于低水平的氧，或低氧中导 致人的细胞损害和死亡。在线虫(秀丽隐杆线虫)中，在100ppm和 1000ppm之间的氧浓度也是致命的。通过严格地研究线虫对一系列的 氧张力的反应，发现低于10ppm和高于5000ppm的氧浓度是不会致 命的。在用氮气平衡的10ppm氧气中，线虫进入可逆的滞生状态， 其中在光学显微镜下可观察到生存状态的所有方面都停止(Padilla 等，2002)。在5000ppm(用氮气平衡)和更高的氧浓度中，线虫正 常地进展通过它们的生活周期。在寻找保护线虫免受低氧性损害的药 物中，试验了一氧化碳。
为了获得特定的气氛条件，使用了下列装置：尖端具有锁紧装置 (locking device)例如LUER-LOK的玻璃注射器管，注射器管的大 的开口用定制的钢(custom-machined steel)和橡胶配件密封产生气 密性密封，将该注射器管通过锁紧装置锁至环境室的进气口上，所述 的环境室具有一个进气口和一个出气口，每个口装有锁紧装置例如 LUER-LOK配件。将确定的气体通过首先让气体从压缩罐(Byrne Specialty Gas，Seattle，WA)内排出通过充满双蒸馏水的洗气瓶(500 ml Kimex)来增湿并提供给环境室。洗气瓶经过一个气体流量计与环 境室连接。气体流量计用于在整个24小时孵育期间提供调节的70cc/ 分钟的流量通过人工环境室。
为了检测诱导的、可逆的停滞是否能在秀丽隐杆线虫中实现，收 集2-细胞秀丽隐杆线虫胚、L3幼虫或成体线虫并将其在室温下暴露于 有效的100％CO环境中、100％N2环境中、含有用一氧化碳平衡的 500ppm氧气的环境中，或暴露于含有用氮气平衡的100、500或1000 ppm氧气的环境中。将线虫用微分干涉相差显微镜观察术(也称为 Nomarski光学器件)显像。采集图像并用NIH image和Adobe Photoshop 5.5分析。胚长约50μm。
这些试验的结果显示，100％一氧化碳是不致命的且诱导了可逆 的滞生。线虫不能幸存于用氮气平衡的500ppm氧气中，可是，用一 氧化碳平衡的500ppm氧气处理的那些线虫进入了滞生并得以存活。 参见下文：
实施例2：
人皮肤在一氧化碳中的保藏
一氧化碳是对人是非常有毒的，因为其强烈地与氧气竞争结合 至血红蛋白，血红蛋白是分配氧至组织的主要分子。无血红蛋白的线 虫对一氧化碳有抵抗力并且甚至也通过该药物防止低氧损害，这个事 实提示了这样的可能性：一氧化碳将在其中不存在血液的情况中的人 组织中，例如在组织移植物或无血的外科手术区，防止低氧损害。为 了检验这种假设，使用了人皮肤。
获取三块人包皮用于该目的。将包皮组织保存于含有胰岛素、 EGF(0.1ng/ml)、氢化可的松(0.5mg/ml)和牛垂体萃取物(约50 微克/ml蛋白质)的角质形成细胞生长培养基(KGM)中。将包皮在 PBS中漂洗，并去除过量的脂肪组织。将每块包皮样品分成2等块。 将每块置于分开的容器中，所述容器装有具有24mg/ml分散酶II(来 自Bacillus Polymyxa EC 3.4.24.4：Roche Diagnostics Corp.， Indianapolis，IN)的PBS溶液。将一个容器(装有在含有分散酶II 的PBS中的包皮块)置于通风橱中的一个潮湿的室内。将另一个容器 (具有在含有分散酶II的PBS中的另一半包皮块)置于相同通风橱 中的充满湿润的100％CO的环境室内。这两个样品都在室温下维持 24小时。用于建立确定的气氛条件的方法与实施例1中使用的那些一 致。
在暴露于常氧(normoxia)或100％CO中24小时后，按照Boyce 等(1983；1985；每个在这里通过全文引入作为参考)描述的方法从包 皮中分离出角质形成细胞。简而言之，将来自每块包皮样品的表皮移 到含有PBS的新鲜器皿中。将表皮在室温下于3ml 0.05％胰蛋白酶、 1mM EDTA中孵育5分钟之前切碎和均化，以使基底细胞与表皮分 离。孵育后，加入6ml 400μg/ml(微克/ml)的大豆胰蛋白酶抑制剂、 1mg/ml的BSA，并将样品以900RPM离心。弃去每个样品的上清液 并将样品沉淀颗粒再悬浮于10ml的KGM中。将每个样品分入两个 10cm的平板中，每个平板含有5ml KGM和100μl的HEPES pH 7.3 (N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)。将平板在37℃的充满95％室内空 气、5％二氧化碳的恒温箱中孵育5天。
采用倒置相差显微镜肉眼检查细胞。暴露于常氧中的所有三个角 质形成细胞群显示很小生长或未生长。暴露于100％CO中的所有三 个角质形成细胞群显示显著生长。量化三块包皮中的两块的活角质形 成细胞数的定量(通过集落形成判断)。见图1。
表1-集落形成的定量
包皮 气氛 集落总数 1 100％CO 542个集落(它们中的多数非常大) 1 常氧 2个集落(都小) 2 100％CO 780个集落(它们中的多数非常大) 2 常氧 0个集落
实施例3：
用线虫进一步保藏试验
下面实施例含有的信息重叠和扩充了实施例1中公开的信息。
A.材料和方法
环境室和装置。缺氧试验用由W.Van Voorhies设计的定制气氛 室(Van Voorhies等，2000)进行。该室是一个安装有定制的钢塞子 的30mL玻璃注射器(Fisher#14-825-10B)，所述钢塞衬套有两个合 成橡胶(viton)o型环以确保密封。该钢塞是钻通的，并在外部面上 具有一个钢引诱锁(lure lock)，以便能连接上运载压缩气体的软管。 确定的气体混合物以恒定的压力和流速从压缩罐递送至该室中，气体 首先通过旋转流量计(Aalborg，流量管号032-41ST)或质流控制器 (Sierra Instruments#810)以监测流速，然后通过装有250ml水的 500ml洗气瓶(Fisher#K28220-5001)以使气体水合。采用1/4”OD 尼龙(Cole-Parmer#P-06489-06)或FEP(Cole-Parmer#A-06450-05) 管，并且管和调节器之间以及管和旋转流量计之间的连接用黄铜 John-Guest-型接头(Byrne Gas)实现。所有的其它连接用微流快速 连接接头(Cole-Parmer#A-06363-57，#A-06363-52)或标准的引诱接 头(Cole-Parmer#A-06359-37，#A-06359-17)完成。
线虫在低氧下的存活力。将Bristol株N2持续维持在20℃下， 注意确保该群体不会饿死。选择对数期的成体秀丽隐杆线虫放入玻璃 平板上的一滴含有100μg/ml氨苄西林、15μg/ml四环素和200μg/ml 链霉素的无菌水中。将成体用保险刀片剁碎并用细口吸量管(mouth pipet)拣选2-细胞胚胎。将30-60个2-细胞胚胎转移至填充3ml M9 中的1％琼脂糖的小型玻璃舟皿(定制以适合气氛室，Avalon Glass Works，Seattle WA)中。随后将该玻璃舟皿置于潮湿的室中2小时 以使胚胎成熟，然后置于环境室中。将环境室在室温下以70cc/分钟 持续灌注纯的N2(等级为4.5)、100ppm O2/N2、500ppm O2/N2、1000 ppm O2/N2或5000ppm O2/N224小时。在暴露后，将含有胚胎的琼脂 糖块从舟皿中切出，并让胚胎面朝上置于用大肠杆菌(OP50)接种的 中等大小的NGM平板上。在暴露后将胚胎评估孵化24小时，并将孵 化的L1’s转移至NGM平板的表面，并随后进入成年期。将不能解释 的动物从总体中除去。所有气体由Byrne Gas(Seattle，WA)提供。 保证纯N2含有少于10ppm的杂质，并证明所有O2/N2混合物为±2％ 的氧气含量(例如，证明100ppm的O2/N2含有98ppm和102ppm 之间的O2)。百万分之份数与kPa转化是基于在1个大气压下一百万 份＝101kPa。
线虫在基于一氧化碳的气氛中的存活力。从如上描述的持续维 持的Bristol N2和hif-2(ia04)株收获30-60个胚胎。将环境室在室温下 以70cc/分钟持续灌注纯的CO(CP级)或500ppm O2/CO 24小时。 为了达到2500ppm O2/CO或2500ppm O2/N2，将5000ppm O2/N2以 1∶1的比例与纯的CO或与纯的N2混合，用两个质流控制器(Sierra Instruments 810)来精确监测流量。在整个24小时的暴露过程中，将 每种气体以50cc/分钟递入三通阀(Cole-Parmer#A-30600-23)，然 后将得到的混合物通过洗气瓶并进入环境室中。所有气体由Byrne Gas(Seattle，WA)提供。证明500ppm O2/CO混合物为±2％的氧 含量并含有7000ppm N2以确保在压缩罐的使用过程中为一致的 O2/CO比例。
细胞生物学分析。为了测定在基于氮气的气氛中的发育进展的 程度(表2)，让2-细胞胚胎暴露于如上描述的多种程度的低氧，并 立即拍照，或在潮湿的室中的12小时恢复阶段后拍照。为了测定胚胎 是否在基于一氧化碳的气氛中停止，将2-细胞胚胎在室内空气中成熟 2小时，并立即拍照或将其置于100％一氧化碳或0.05kPa O2/CO中 24小时并在暴露后立即拍照。在所有情形中，通过将胚胎置于薄的1％ 琼脂糖垫上的盖玻片下并在Zeiss axioscope上观察来进行DIC显微镜 检查。然后用RS Image和Adobe Photoshop软件获取照片。
B.结果
以前已报道HIF-1是在轻度低氧(0.5kPa O2(Padilla等，2002) 和1kPa O2(Jiang等，2001))中的秀丽隐杆线虫中所需的，并且已知 滞生在缺氧(＞0.001kPa O2)中是可能的(Padilla等，2002)。为了 精确地确定这些反应每种活跃的范围，在暴露于轻度低氧和缺氧之间 的多种氧张力24小时后测定野生型秀丽隐杆线虫胚胎的存活力。暴露 于缺氧的胚胎进入了如以前报道的滞生，并从而在暴露中幸存，具有 高的存活力。在0.5kPa O2中的胚胎在整个暴露过程中保持生机，并 也得以幸存，具有高的存活力。然而，暴露于轻度低氧和缺氧之间的 中间范围的氧张力(0.1kPa O2至0.01kPa O2)的胚胎令人惊讶地是 未得以幸存(图2)。
胚胎在暴露于这种中等范围的低氧过程中没有孵化，表明它们没 有成功地完成HIF-1介导的反应。为了确定它们是否出现停滞，检测 了在该中间范围内胚胎是否在暴露过程中停止了胚形成。在致死性氧 张力中的胚胎没有停止胚形成，并且氧气量增加与胚胎的发育进展程 度增加相关(表2)。再氧合后，这些胚胎大多数未能孵化并且孵化 了的那些胚胎中许多作为异常的L1s停止。这些数据显示，这种中间 范围的低氧是一种独特的应激，其中氧水平既不足够高来促进持续的 活力也不足够低来诱导滞生。
基于这些发现，假定如果一氧化碳(一种氧结合的竞争性抑制剂) 能够在存在低水平氧时诱导滞生，则它将会提供保护对抗这种致死范 围的低氧。为了检验这种可能性，首先测定了秀丽隐杆线虫胚胎在多 种浓度的一氧化碳中的存活力。尽管高水平的一氧化碳在一些系统中 可以具有毒性作用，人们发现秀丽隐杆线虫胚胎显著地耐受广范围的 一氧化碳张力。实际上，秀丽隐杆线虫胚胎可经受住持续暴露于101 kPa CO(100％CO)中24小时还具有高的存活力(81.5％的幸存到 成年期，图3。)值得注意的是，在101kPa CO中，胚胎在暴露过程 中没有进展通过胚形成，表明它们进入了滞生。为了检验一氧化碳是 否能在存在致死性氧张力时保护胚胎，测定了暴露于用一氧化碳平衡 的0.05kPa O2中的胚胎的存活力。与暴露于用N2平衡的0.05kPa O2 中的胚胎(其中大多数未存活)比较，这些胚胎以96.2％的存活力恢 复到成年期(图3)。而且，类似于用101kPa CO处理的胚胎，用一 氧化碳平衡的0.05kPa O2中的胚胎停止了胚形成，表明它们进入了滞 生。因此，一氧化碳可通过诱导滞生来在存在致死性氧张力时保护免 受低氧损害。
为了进一步研究可通过过量一氧化碳保护的氧张力范围，将缺乏 HIF-1功能的胚胎(hif-1(ia04)株)用于解决免受低氧损害的保护在轻 度低氧中是否也是可能的。在检测用氮气平衡的0.1kPa O2和1kPa O2之间的多种氧张力后，发现对HIF-1的最大需求是在下地用氮气平 衡的0.25kPa O2中。在该气氛下，野生型胚胎正常进展完成了发育并 显示出高的存活力，但hif-1(ia04)胚胎未能完成胚形成并显示100％ 的致死率(表3)。因此，检验了一氧化碳是否能保护0.25kPa O2中 的hif-1(ia04)胚胎。在用一氧化碳平衡的0.25kPa O2中，野生型和 hif-1(ia04)胚胎进入了滞生并在该暴露中以高的存活力幸存(分别为 78.7％和84.0％幸存到成年期)(表3)。因此，通过一氧化碳诱导 滞生在高达0.25kPa O2的氧张力时是可能的，并且甚至在缺乏HIF-1 功能时一氧化碳也能保护对抗轻度低氧。
表2-低氧中发育进展的定量
气氛 范围内的胚胎 百分比 胚形成的范围(2-细 胞 阶段后的分钟数) N
＞0.001kPa O2/N2 100％±0.0 20-40分钟 35 0.01kPa O2/N2 92.9％±6.0 40-80分钟 115 0.05kPa O2/N2 97.7％±2.0 100-140分钟 108 0.1kPa O2/N2 91.4％±1.3 300-340分钟 60
将野生型2-细胞胚胎置于多种程度的低氧中24小时，并对它们 发展完成胚形成的程度打分。暴露于含有增加量的氧气的气氛中导致 进展完成胚形成的增加。测定了在给定的20-40分钟范围内胚形成中 停止的胚胎的百分数。数据是3个独立试验的结果。
表3-一氧化碳保护hif-1胚胎对抗轻度低氧
0.25kPa O2/N2 n 0.25kPa O2/CO N N2 94.2％±1.2 49 18.7％±21.9 109 hif-1(ia04) 0.0％±0.0 68 83.9％±13.8 108
在野生型和hif-1(ia04)胚胎中，在暴露于24小时的0.25kPa O2/N2 或0.25kPa O2/CO后检测了到达成年期的存活力。所有数据点都是至 少3个独立试验的结果并将不能解释的蠕虫从总体中除去。
线虫响应低体温的存活力。
线虫的存活力也是温度敏感性的，在暴露于低温(4℃；图15) 24小时后群体100％死亡。然而，如果线虫在温度降低之前通过平衡 进入缺氧状况(＜10ppm氧)下1小时来诱导停滞，则大比例的线虫 在暴露于4℃下24小时后幸存(图15)。在该实验中，线虫在低体 温期间保持停滞，并在它们已恢复到室温后保持停滞1小时。无氧条 件(纯N2)、生长状况和存活力测量在下面描述。
实施例4：
小鼠中核心体温和呼吸的降低
A.材料和方法
遥测装置的植入。根据厂商提供的标准方法，给雌性C57BL/6J 小鼠(Jackson Laboratories-Bar Harbor，Maine)植入遥测装置 (PDT-4000HR E-Mitter-MiniMitter Inc.-Bend，OR)。让小鼠恢 复数周以使得体温和心率信号稳定。小鼠的核心体温、心率和运动由 遥测装置持续监测并用VitalView软件(由MiniMitter提供)记录。 环境温度用HOBO(Onset Computer Corp.-Pocasset，MA)监测， 并且数据用BoxCar软件(由Onset Computer Corp.提供)分析。
小鼠暴露于受调节的气氛下。将每只小鼠暴露于1L/分钟的(a) 含500ppm H2S平衡的氮气(Byrne Specialty Gas-Seattle， Washington)与室内空气混合(使用来自Aalborg-Orangeburg，New York的3通道气体分配(proportioner)计)而达到终浓度为80ppm 的H2S和17％的O2的气氛，或(b)氮气与室内空气混合而达到终 浓度为17％的O2的气氛。H2S和O2的测量用Innova GasTech GT 系列的手提式气体监测器(Thermo Gas Tech-Newark，California) 进行。
在暴露于受调节的和未受调节的气氛中试验之前和该过程中， 将小鼠置于包含一个玻璃笼(具有饮用水，没有食物)的充气室内， 所述玻璃笼安装有来自Cole-Parmer(Vernon Hills，Illinois)的FEP 管的输入管和输出管，用于导入和排出气氛。用Dow Corning硅酮真 空油酯(Sigma-St.Louis，Missouri.)将该笼用盖密封。来自每个笼 的气体通过排出管排出进入化学通风橱。为了确保该系统是气密性的， 将GasTech GT手提式监测器用于检测泄漏。
呼吸测量法。在一些实验中，氧的消耗通过使用按照厂商说明书 使用的PA-10a O2分析器(Sable Systems)测量。类似地，动物产生 的二氧化碳采用按照厂商说明书使用的LI-7000 CO2/H2O分析器 (Li-Cor公司)监测。将这些设备放置与环境室放置在一条直线上， 这样它们从气体输入管和输出管中取样检验。
环境温度的调节。将小鼠在Shel Lab低温按昼夜进行光照的恒温 箱(Sheldon Manufacturing公司-Cornelius，Oregon)中圈养，为小 鼠调节温度和光周期(8AM开灯，8PM关灯)。将小鼠暴露于如上 描述的受调节的气氛中。当小鼠暴露于受调节的气氛中时，将恒温箱 内部温度降低至期望的温度，例如至10℃或15℃。将小鼠维持在受 调节的气氛中并处于降低的温度下6小时。将充气室中的气氛替换成 室内空气，并让小鼠回到正常的室温(22℃)并让其恢复。
B.结果
基线数据。为了测定小鼠对亚致死剂量的硫化氢的反应，本发 明者首先通过在一周期间记录来自恒温箱中的四只植入有无线电收发 机的小鼠的数据来确定核心温度、心率和运动的基线，所述恒温箱保 持在环境温度下并充满室内空气。基线数据证明，小鼠具有昼夜节律， 活动高峰在灯刚熄灭后的晚间，以及在灯刚亮之前的清晨。核心温度 从它们活动期间高的37℃到它们不活动期间低的33.5℃之间变化。 心率从它们活动期间的750bpm(每分钟搏动)到它们不活动期间的 250bpm之间变化。心率可能与核心温度相关联(温度更高则心率更 高)。同样，总的运动活动在晚间和黎明前不久最高。
小鼠暴露于室温下的受调节的气氛。将小鼠暴露于硫化氢的第 一次试验包括首先将小鼠置于恒温箱中保持于27℃下的充气室内1 小时。1小时后，将该室充满如上一般性描述的80ppm，并将恒温箱 的温度在实验过程中降低至18℃。虽然没有检测到心率和总的运动活 动的立即改变，但观察到核心温度显著降低。让实验进行90分钟，在 这段时间内，核心温度降低至28.6℃-比在上面描述的基线研究中记 录的四只小鼠的任意一只的最低温度低5度。在该室充满室内空气后 的恢复期间，本发明者注意到，动物最初是相对不动的(容易捕捉)； 然而在60分钟内，它已恢复到正常范围的核心温度和活动。将第二只 小鼠暴露于相同的试验方案中；然而这一次80ppm的充气操作3小 时。在这段时间内，本发明者注意到，心率明显地从600bpm降低为 250bpm，总的运动活动显示为几乎无活动，并且核心温度降到18.6 ℃。
呼吸变化伴随核心温度降低。将小鼠暴露于80ppm H2S也导致 代谢率降低，代谢率是通过测量氧消耗和二氧化碳产生测定的。例如， 已同时测量了核心温度和二氧化碳产生的小鼠证明，二氧化碳产生的 迅速减少先于动物的核心温度降低(图4A)。二氧化碳产生减少大约 3倍在暴露于H2S后约5分钟确定了一个新的基线。
表4显示了来自同时测量暴露于室内空气下的小鼠的O2和CO2 浓度的实验的结果，所述室内空气中的CO2已被净化(因此对照为0 值)，含有或不含H2S(80ppm)。该测量在15分钟的期间进行， 小鼠处于0.5L密封的环境室中，气氛流速为500cc/分钟。氧的消耗 通过用当小鼠不存在时的对照中减去当小鼠存在时的氧浓度获得。同 样，二氧化碳的产生通过用当小鼠不存在时的对照中减去当小鼠存在 时的二氧化碳浓度获得。RQ代表呼吸商，并且等于产生的二氧化碳 和产生的氧的比率。该结果证明，在存在H2S的情况下氧消耗降低2-3 倍，以及二氧化碳的产生也降低3-4倍。呼吸商的变化反映了在存在 或没有H2S的情况下，小鼠的氧消耗和二氧化碳产生的不同。
表4-H2S暴露抑制了小鼠的呼吸
小鼠的存 在 H2S的存在 [O2] ppm [CO2] ppm RQ - - 207,000 0 + - 203,600 2800 消耗、产生 3,400 2800 0.82 - + 166,200 0 + + 164,900 750 消耗、产生 1300 750 0.58
停滞的不同参数(氧消耗减少、二氧化碳产生减少或活动性减少) 可通过多种多样的测定法和技术评价。例如，测量施用了H2S的小鼠 中诱导停滞的可能最容易的方法是通过观察它们的呼吸。的确，这包 含了所有三个参数，因为其表示了减少的氧消耗、二氧化碳产生和活 动性。在标准条件下的室内空气中的正常小鼠将会每分钟约呼吸200 次。如果施用了80ppm的H2S给小鼠，并将核心温度降低至15℃， 则呼吸降低至少每分钟约1-10次呼吸之间的数量级。实际上，在这些 条件下观察到小鼠在长于1小时的时期内没有呼吸，表明深水平的停 滞是可达到的。因此，这代表了细胞呼吸(即，氧消耗和二氧化碳产 生)至少约1-20倍的减少。
小鼠在降低的环境温度下暴露于受调节的气氛中。为了开始确定 硫化氢减少小鼠活动的能力的极限，本发明者进行了几个试验，试验 中使用无遥测装置的小鼠，之后通过暴露携带遥测装置的小鼠来获得 数据。第一个试验是让无遥测装置的小鼠在10℃的降低的箱内温度下 接受80ppm H2S的受调节的气氛，基本上是如上文在材料和方法中 描述的，除了在暴露于气体和降低环境温度之前将小鼠于27℃下置于 充气室中1小时以外。无遥测装置的小鼠在该处理中表现良好，并在 从充气室移出后约90分钟内恢复活动。接受相同条件的有遥测装置的 小鼠也表现良好，并显示减少核心温度至约12.5℃。本发明者不能准 确测定该温度，因为该电子设备在15.3℃时不工作。因此，温度降至 12.5℃是基于不工作之前的下降斜率和在电子设备不工作后动物呆在 室内的时间的估计值。
由于仪器的限制，本发明者接下来基本上如上描述的，在具有含 有约80ppm硫化氢的受调节的气氛，或具有室内空气的充气室中， 检测了4只具有遥测装置的小鼠每只6小时。恒温箱的温度在试验起 始时(暴露于受调节的气氛中，或小鼠暴露于室内空气的时间0时) 减少至恒定的15℃。在6小时的周期结尾时，如上文中一般性描述的， 将小鼠恢复至室内空气的气氛和22℃的环境温度。在依赖于利用80 ppm硫化氢的所有4只小鼠中核心体温明显下降(图4B)。也存在 与体温降低相关的心率和总的运动活动的明显降低。将小鼠供养4周， 动物的行为没有明显的改变。
实施例5
关于减少辐射损伤的鼠研究
A.科学基本原理
虽然辐射损伤模型方面可以并已经在细胞培养物中得以评价，但 检测试验药物影响损伤和愈合过程的能力需要包括受影响的所有反应 系统。在目前，实现它的唯一途径是在完整动物中。本发明者提出将 小鼠用于这种研究作为最合适的模型。已选择C57BL/6小鼠用于研 究，因为这种品系的小鼠容易对辐射肺部损伤敏感，该品系耐受的辐 射水平已确定，并且本发明者近来已显示H2S降低了该小鼠品系的核 心温度。
按照该方案设计了两个一致的试验。每个试验将会研究H2S-诱导 的低体温对辐射诱发的肺部损伤的发展的效力。每组10只小鼠将会暴 露于四个实验条件(H2S/17.5Gy胸部照射、H2S/无胸部照射、无 H2S/17.5Gy胸部照射，或者无H2S/无胸部照射)之一，然后持续13 周。每组12只动物将会类似地暴露并持续26周(增加的n是抵偿在 病程后期出现的死亡率增加所需的。)
对于这些试验，方差分析(ANOVA)将会用作用于数据分析的 统计模型。4组完全交叉和随机化的二因素ANOVA(接受H2S或没 有接受H2S的受照射小鼠或未受照射的小鼠)和两个时间间隔(13或 26周)将会用于分析支气管肺泡灌洗炎症细胞数和总的蛋白质浓度以 及肺的羟脯氨酸水平的暂时性变化。假定80％的检验效能、5％的显 著性和双尾检验，每个损伤组、干预组和时间点的组合的5只存活小 鼠将允许组平均值之间的可检测差异大于或等于潜在的组内标准差的 1.7倍。预期组内标准差等于约25％。因此，在这些试验中对照值的 35-50％炎症细胞数或肺部胶原含量的改变应该是可辨别的。
H2S的暴露和胸部照射将在线性加速器装置中的SLU AHR中进 行。在尸体剖检时支气管肺泡灌洗和肺的获得将会在AHR小鼠尸体 剖检室中进行。支气管肺泡灌洗细胞计数和蛋白质浓度以及肺的羟脯 氨酸含量的测量将会在另一个实验室(D3-255)中进行。野生基因型 C57BL/6小鼠将会接受17.5Gy的胸部照射。小鼠将用阿佛丁 (Avertin)腹膜内麻醉，将其置于单独的布质小鼠约束装置 (restrains)中，并通过线性加速器以3Gy/分钟的剂量率用8.5Gy 照射通过经校准仅靶向胸部的两个侧面区域(总的胸部剂量为17.5 Gy)。
B.方案
麻醉。野生基因型C57BL/6小鼠将会因气管内施用异氟烷而麻 醉。麻醉深度将通过对触觉刺激的反应的呼吸速率监测。阿佛丁的腹 膜内注射(0.4-0.7ml/小鼠i.p.)将用于麻醉用于胸部照射步骤的动物。 麻醉深度将通过呼吸速率和对触觉刺激的反应监测。
暴露于硫化氢。将小鼠置于与先前用于小鼠的充气室类似的密封 的有机玻璃充气室(IR1606)中。该室将具有两个口(输入口和输出 口)。将含有用室内空气平衡的H2S(80ppm)的气体以每分钟1升 的速率通入该室内。采用具有从输出通风口延伸到房间的排气通风口 的软管的室内通风系统将气体从室内排出。
危险试剂的施用。用线性加速器，以17.5戈瑞的总剂量在小鼠处 于充气室内时照射小鼠。该照射剂量将会在小鼠中诱导亚急性肺部损 伤，其进展成纤维变性。小鼠不会是放射性的，否则会使工作人员或 其它动物遭受损伤。由于该照射，不需要特殊监测、抑制或处理。
预定的安乐死。在胸部照射后约13和26周后，让动物通过深度 麻醉(采用阿佛丁0.4-0.7ml i.p.)安乐死，之后通过下腔静脉刺破放 血。实施支气管肺泡灌洗用于测定炎症细胞数、分类计数和洗出液蛋 白质浓度。移出肺和食道组织用于组织学评价和胶原含量分析。
垂死的动物。胸部照射与小鼠的有限死亡率相关，15％的小鼠在 照射后10周死亡而50％的小鼠在照射后22周死亡。研究者将每天监 测动物的不良作用(起初每天2-3次，直到它们表现稳定，然后每天 一次直到疾病开始进展，在该时间点发明者将会恢复到每天观察多 次)。如果动物体重减轻、不再整饰、表现出严重的呼吸性窘迫，和/ 或笨拙的或明显减少的活动，则将它用阿佛丁过量进行安乐死。当实 践时，将会对这些不定期安乐死的动物实施支气管肺泡灌洗和组织收 集用于组织学。
胸部照射应该会产生肺部损伤，其本身是不疼痛的但其本身可表 现为呼吸速率增加、轻度食欲丧失、轻度体重减轻和/或不再整饰(第 10周)。研究者和动物设施工作人员将每天监测动物的这种不良作用。 如果动物看起来不摄食，则会提供柔软的食物和流体支持。如果察觉 到动物处于疼痛中，则根据需要施用布托啡诺(0.2mg/kg i.p.)或丁 丙诺啡(1.0mg/kg bid s.q.)止痛。如果动物表现出痛苦并且治标性措 施没有导致改善，则立即使其安乐死。在预定的尸体剖检时收集肺和 食道组织用于组织病理学评价和胶原含量分析。
照射后的管理。为了使转播任何病原体给所述设施的其余部分的 风险最小化，并且为了在它们某种程度上无免疫应答时保护这些动物， 对这些动物的所有管理工作每天将会最先进行(在实验室中的任何其 它动物之前)并将会在生物安全室中进行。为了使外来感染的风险最 小化，小鼠将使用高压消毒的笼子和床具。而且，它们将喂养已经经 照射杀死病原体的标准啮齿动物食物。
野生基因型C57BL/6小鼠将会接受17.5Gy的胸部照射。小鼠将 通过腹膜内使用阿佛丁麻醉，置于独立的布质小鼠约束装置中并移进 与先前用于小鼠的充气室类似的密封的有机玻璃充气室(IR1606)中。 该室将具有两个口(输入口和输出口)。将含有用室内空气平衡的H2S (80ppm)的气体以每分钟1升的速率通入该室内。采用具有从输出 通风口延伸到房间的排气通风口的软管的室内通风系统将气体从室内 排出。一旦进入充气室，通过线性加速器以3Gy/分钟的剂量速率用 8.5Gy照射小鼠通过经校准仅靶向胸部的两个侧面区域(总的胸部放 射剂量为17.5Gy)。在完成胸部照射后，将动物放回它们受监测的微 隔离笼中直到从麻醉状态中恢复。
预定的尸体剖检。在照射后第13周将对一组动物进行尸体剖检， 以评估损伤的炎性阶段。在第26周将对第二组动物进行安乐死，以评 估损伤的纤维变性阶段。将动物用阿佛丁麻醉，然后放血。将肺用1000 μl PBS灌洗并将洗出液保持在冰上用于总细胞计数和分类细胞计数。 然后采集右肺用于羟脯氨酸含量分析，并将左肺在25-30cm压力下通 过气管灌注10％的NBF。将食道、气管、左肺和心脏浸入10％的 NBF中并送到FHCRC组织学共享资源实验室(FHCRC)用于加工 和病理学评价。
胸部照射应该会产生肺部损伤，其本身是不疼痛的但本身可表现 为呼吸速率增加、轻度食欲丧失、轻度体重减轻和/或不再整饰(第10 周)。研究者和动物设施工作人员将每天监测动物的这种不良作用。 如果动物看起来不摄食，则会提供柔软的食物和流体支持。如果察觉 到动物处于疼痛中，则根据需要施用布托啡诺(0.2mg/kg i.p.)或丁 丙诺啡(1.0mg/kg bid s.q.)止痛。如果动物表现出痛苦并且治标性措 施没有导致改善，则立即通过CO2窒息使其安乐死。
主要的问题可能是食道炎(导致食物和水的摄取减少)和呼吸功 能不全(减少氧摄取)。本发明者将会每天检查这些动物2-3次直到 确信它们是稳定的且表现良好，在这时本发明者可降低检查频率至每 天一次，直到疾病开始进展，在该时间点恢复到每天检查多次。支持 性护理将以多种方式提供。如果动物动物不能很好地摄食或饮水(表 现为体重减轻和理毛行为问题)，本发明者将会提供柔软的食物并试 用流体补充物(乳酸林格氏溶液，1-2ml/小鼠，采用小孔针(＞20G) 皮下注射，每天1-2次)。如果察觉到动物处于疼痛中，则根据需要 施用布托啡诺(0.2mg/kg i.p.)或丁丙诺啡(1.0mg/kg bid s.q.)止痛。 如果动物表现出痛苦并且治标性措施没有导致改善，则立即通过CO2 窒息使其安乐死。如果动物在胸部照射时经历显著疼痛或痛苦，将通 过CO2窒息使动物安乐死。
第三个实验是基本上如上描述的，让有遥测装置的小鼠在10.5℃ 的降低的室内温度下遭受80ppm H2S的受调节的气氛。在该实验过 程中，用肉眼观察小鼠并通过网络摄像机纪录它的活动，并如上描述 的纪录遥测测量结果。将小鼠暴露于80ppm H2S的受调节的气氛中， 并将室内的温度降低至恒定的10.5℃。在约6小时的周期结尾时，通 过将室内温度设定为25℃来给室内施加热量。让小鼠在受调节的H2S 气氛中升温直到小鼠的核心温度处于17℃和18℃之间，在该时间点 后，将受调节的气氛替换成室内空气。在受调节的气氛中小鼠的核心 体温明显降低至10.5℃，伴随总的运动活动明显降低。呼吸率降低至 通过肉眼观察不可检测到的速率约1小时15分钟。在室升温后，在小 鼠的核心体温达到14℃时观察到弱的呼吸。在升温阶段，当核心体温 升高至17℃和18℃之间，并且小鼠显示有呼吸和活动时，将受调节 的气氛替换成室内空气。正常的活动和呼吸在核心体温恢复到25℃时 完全明显。与未经处理的动物比较，小鼠没有显示出行为上的明显变 化。
实施例6：
细胞和哺乳动物研究
A.犬科动物研究
犬科动物研究将用狗进行，所述的狗经手术植入了遥测装置以 监测它们的核心体温。将在存在或缺少亚致死剂量的硫化氢时研究动 物10小时。在该期间，将通过遥测技术持续监测它们的生命体征。环 境温度也将降低至15℃30分钟，用以确定这对动物的核心体温是否 具有任何影响。
该程序将用2组狗，每组2只(总共4只)进行。由于遥测装 置的花费，本发明者将连续地进行这些试验。如果来自第一组的结果 表明假设是错误的，则将用第二组的两只狗重复该研究。如果来自第 二组的结果不支持假设，则将放弃该项目。
毒理学研究表明，当H2S水平高于人的OSHA极限(10ppm) 时，以前已证明，大鼠和小鼠在90天内每天6小时、每周5天暴露于 80ppm的H2S中显示未观察到不利作用。这包括在处理结束时对肠、 肺、心、肝、肾或其它器官进行肉眼检查和组织病理学检查。根据本 发明者的知识，没有有关将狗暴露于硫化氢中的信息可利用。
用H2S操作的关键问题是不要超过已公开了关于将啮齿类动物 暴露于硫化氢中并未发现有害作用的研究的其它人所描述的剂量(80 ppm)。在气体科学中存在相当多的经验可以利用，并且本发明者能 够递送处方剂量的气体给小鼠。采取了许多预防措施用以确保动物和 研究人员都不会受到伤害。这些预防措施包括持续监测气体混合物， 警报设置为OSHA极限并且灵敏度为1ppm，以及能够按照说明书混 合和递送气体而不会泄漏进或出系统的多种装置。
该方案的时间线在表5中给出。
表5-试验的时间线
天 活动 细节 -1 手术前 将实施CBC/化学；狗将在下午禁食，但 允许自由饮水。 0 手术 在手术前一天下午贴上芬太尼透皮药贴 用于排空前(preemptive)镇痛。外科手术 前安装头部导管；乙酰丙嗪、丁丙诺啡、格 隆溴铵进行术前用药；用氯胺酮：地西泮或 异丙酚诱导使得能插管；通过异氟烷和氧维 持麻醉。让狗背侧躺着并修剪腹部/手术准备 和消毒盖布。监测脉搏、呼吸率、潮气末二 氧化碳、吸入的麻醉剂百分比，SpO2每15 分钟或更频繁地实施和记录。将在手术过程 中和手术之后进行流体支持。一旦狗稳定并 为该程序进行了适当准备，将实施腹部正中 线剖腹术，从尾部开始到脐部并朝尾部延伸 5-10cm。将一个无菌发射器放进腹膜腔中。 检查放置位置以确保发射器能够自由移动； 冲力(momentum)将被替换掉，并且腹膜 腔的闭合将以3层进行。狗将被监测直到将 它除去管子，能够经受温度调节并用胸部躺 着。每天监测狗的切口部位、腹部(通过触 诊和超声，如果指明的话)、食欲、温度(手 术后的最初3-5天)、重量和活动。
7 确定基线 该日期是柔性的。只有这一步骤是经批 准进行的。四只动物将置于接收器设备上 (这不涉及将动物从它们的笼子中移出并 将在AHR中进行)，并确定所有这四只动 物的生命体征的基线。 8 暴露于H2S 动物将被转移至将进行测定的房间中， 在那里将它们将放入具有封入的气氛的有 食物和水的笼中。在确定基线后，四只动物 中的两只将接受浓度为80ppm的H2S。在 暴露10小时后，气氛将恢复至室内空气温 度并且将动物放回它们的笼中。暴露于H2S 将每周重复一次，以开始确定任意数据集是 否是可重复的。
B.人的血小板
为了检验使用氧化磷酸化抑制剂可用于使人受益这一想法，本 发明者在人组织中诱导滞生状态以保护它们免于致死性暴露于氧。在 中试试验中，本发明者将人皮肤置于100％的CO环境中。本发明者 观察到，24小时后在CO中的皮肤细胞的存活比室内空气中的那些皮 肤细胞好100倍。这些结果是非常令人兴奋的：它们证明了氧化磷酸 化抑制剂可能在人组织中有效。
另一组试验证明了诱导滞生对血小板的保护效应。将一单位的 血小板分成两半。将第一半保存于标准储藏条件下，标准储藏条件包 括将血小板恒定摇动地保存在室温下(22-25℃)。将另一半置于用 标准方法除去了氧的缺氧环境(＜10ppm氧气)中。在第0天、第5 天和第8天比较这两组血小板。在一组5个不同的体外检测中，在无 氧条件下保存的血小板表现与标准条件下保存的那些一样好或更好， 所述的表现包括集聚能力、细胞形态学、膜联蛋白-V染色(磷脂酰丝 氨酸翻转至外膜上作为早期细胞调亡标记)等。这表明，控制代谢活 动，特别是氧化磷酸化作用可通过除去氧完成，并在长时期的停滞过 程中对细胞功能具有保护效应。
硫化氢能和CO一样结合细胞色素C氧化酶，并在需要时终止 氧化磷酸化。它在阻碍氧化磷酸化中如此有效，以至于人如果在含有 0.1％硫化氢的气氛中吸了一口气，他们应不要吸另一口。否则，他们 会立即跌倒在地-在工业背景中通常称为“击倒”的事件。这似乎也是可 逆的，因为如果迅速移到新鲜空气中(并且跌倒未受损伤)，这些个 体有时可复苏并继续生活而不会有神经学上的问题。这是一种这样的 物质，其不仅在我们的世界中是普通的，实际上，甚至在我们自身的 细胞中产生，而且是不实现氧递送的有效的可逆的氧化磷酸化抑制剂。
C.鼠研究
用H2S诱导类似冬眠的状态。根据定义，恒温动物维持核心体 温高于环境温度10-30℃。对于这些动物做到这一点，它们必须从通 过氧化磷酸化产生的能量产生热量。氧化磷酸化中末端的酶复合体是 细胞色素c氧化酶。由于硫化氢抑制该复合体(Petersen，1977；Khan 等，1990)，本发明者预测将恒温动物暴露于硫化氢将防止这类动物 维持其核心体温高于环境温度。
为了检验这个假设，本发明者要持续监测恒温动物(小鼠)的 核心体温和活动水平。植入小鼠腹膜内的遥测装置可完成这两种事情， 并且具有不会由于处理小鼠而给读数引入偏差的优势(Briese，1998)。 另外，它们可在暴露于硫化氢气体过程中远程监测小鼠。先前已显示， 对于暴露持续达到10周，百万分之80份(ppm)的硫化氢剂量对是 小鼠无害的(CIIT 1983；Hays，1972)。因此，对于这些试验，本发 明者采用80ppm的硫化氢剂量来检验我们的假设。产生含有80ppm 硫化氢的气氛不是小事。随着时间过去，存在氧时，硫化氢将被氧化 成硫酸盐。为此，为了使本发明者能持续将小鼠暴露于含有80ppm 硫化氢的气氛中，本发明者不断地将室内空气与一罐用氮气平衡的 500ppm的硫化氢混合。
核心温度控制的表征
将小鼠暴露于80ppm H2S使其核心温度降低至高于环境温度约 2摄氏度(图5)。该作用是高度可重复的，因为暴露于80ppm硫化 氢6小时的7只小鼠的平均核心体温遵循类似的模式(图5)。在13℃ 的环境温度中，这7只小鼠的最低平均核心体温是15℃。在气氛被转 换成只含有室内空气的气氛时，所有这些小鼠在复温后成功地恢复。 作为对照，本发明者用氮气代替硫化氢并发现核心体温没有实质降低。
虽然这些小鼠表面上看起来正常(尽管核心体温和呼吸率暂时 降低)，本发明者进行了一组行为试验来排除这样的可能性：暴露于 硫化氢气体、核心体温急剧下降、呼吸率降低，或这些效应的组合引 起了神经学上的损伤。所有试验在暴露于硫化氢之前和之后对小鼠实 施。这些行为试验选自由Mouse Models for Human Disease consortium发展的SHIRPA方法(Rogers等，1997)。在暴露于气体 后，在小鼠中不存在可检测到的行为差异。据此，本发明者做出结论， 进入类似冬眠的状态不是有害的。
H2S剂量的初步优化。上面的试验描述了80ppm硫化氢对小鼠 核心体温的影响。为了确定足以丧失体温调节的硫化氢浓度，本发明 者将小鼠暴露于一系列的硫化氢浓度(20ppm、40ppm、60ppm和 80ppm)(图6)。虽然20ppm和40ppm的硫化氢足以导致小鼠的 核心体温下降，但这与使用60ppm和80ppm的硫化氢所观察到的下 降比较是较小的。根据该试验，本发明者得出结论：产热作用的丧失 直接取决于提供给小鼠的硫化氢的浓度。对剂量范围和硫化氢的药物 动力学的这一初步研究强调了需要更全面的分析。
低核心温度界限的初步确定。本发明者还有兴趣建立对核心体 温范围和小鼠在该状态下允许的时间长短两者的耐受的更完全理解。 上述试验显示，本发明者可在需要时重复地降低小鼠的核心体温至 13-15℃。此外，小鼠似乎可耐受该处理数小时。采用相同的方案， 在降低环境温度时，本发明者成功地使小鼠的核心体温达到10.7℃ (图7)。进一步尝试将核心体温降至更低，以及更长的时间将在将 来进行。尽管是初步的，这些结果证明，存在显著范围的小鼠生物学 容许的核心体温，并且该范围可通过因暴露于硫化氢中而丧失体温调 节来探究。
内源性H2S水平的调节。众所周知哺乳动物细胞内源性地产生 硫化氢(Wang 2002)。由于这种化学物质在细胞中动态地产生，理 解在不同条件下的基础水平是极其重要的，因为这可显著地影响外部 施用的硫化氢的药物动力学。为了解决我们的研究的这一重要方面， 本发明者已开始检测小鼠中的内源性硫化氢水平。本发明者采用与气 相色谱法和质量特异性检测联合的萃取烷化技术来定量硫化氢 (Hyspler等，2002)。用该方法，本发明者观察了未受干扰的小鼠 中的硫化氢水平。图8A显示该小鼠体内存在显著量的硫化氢。另外， 硫化氢水平似乎取决于小鼠的环境温度。具体而言，当小鼠在冷的环 境中时，它们减少了内源性硫化物水平并且，在小鼠位于暖和的环境 温度下时，它们增加了内源性硫化物水平。据此，本发明者得出结论： 小鼠响应环境温度而调节它们的硫化物水平。
内源性水平的变化影响H2S的效力。因为环境温度改变小鼠体 内硫化物的内源性水平，本发明者假定，一旦暴露于外来的硫化氢， 环境温度可能影响核心体温的改变。让小鼠适应低温～12℃，产生了 持久的稳定水平，本发明者在核心温度开始下降后观察到这一稳定水 平(图8B)。因此，这表明这种对寒冷的适应使得小鼠更耐受硫化氢 气体的作用引起的核心躯体冷却。然而，让小鼠在暴露于气体之前适 应暖和的热中性(thermoneutral)温度消除了该稳定水平。事实上， 常温小鼠在暴露于硫化氢时比适应寒冷的小鼠更迅速得多的冷却(图 8B)。这些数据表明，小鼠体内硫化氢的内源性水平对外来的硫化氢 的效力有直接影响。
H2S保护小鼠免受低氧影响。正常室内空气含有约21％的氧。在 小鼠模型中研究停滞对低氧的保护效应的初步试验中，暴露于80ppm 硫化氢的小鼠幸存于11分钟5.2％的氧中，并且3周后，小鼠依然表 现良好。以前公开的工作显示，90％的以这种方式暴露而没有硫化氢 的这些动物(C57Bl)不能存活(Zhang等，2004)。该试验包括将 小鼠预平衡于80ppm H2S中3小时，然后如上面实验中描述的使腔 室中的氧张力降低。如上描述的使用相同的流速(即0.5L腔室中为 500cc/mL)。熟悉该领域的那些人已很好地确定，如果一组小鼠暴露 于4％的氧中，则100％将在15分钟内死亡。然而，其中在氧张力减 少至4％过程中施用了H2S的小鼠在这些低氧条件下仍保持有活力， 甚至持续延长时间(直到1小时)。小鼠在恢复后似乎未受这些条件 的影响，并且在24小时后试验时有活力并能正常反应。该试验与上面 的实验不同，不同之处是小鼠在低氧暴露结束时仍保持在H2S中直到 氧张力恢复到正常水平(21％O2)。
实施例7
另外的动物研究
A.保护以免受不利条件影响
进行该试验用以检测在‘类似冬眠’状态中小鼠在其中它通常会死 亡的条件下存活的能力。不利条件是低氧，对其有文献声称小鼠 (C57BL6/J雄性)可在5％的氧气中最多存活20分钟(Zhang等， 2004)。
如表6中显示的，试验包括将小鼠暴露于80ppm(除非另外说明) 的H2S中持续所示时间，之后减少室中的氧张力，然而依然在H2S下。 记录暴露于低氧的时间(如下说明的)并测定小鼠的存活力。
将小鼠短时间暴露于H2S(至少为80ppm)中较不成功地保护小 鼠免于低氧，但有至少一只小鼠在H2S中仅8分钟后就可幸存于50 分钟的低氧暴露下。此外，观察到暴露于90ppm H2S中仅10分钟的 小鼠在5％的氧气条件下可存活更长时间，尽管它最后会死亡。
将小鼠暴露于80ppm H2S中更长时间对保护小鼠免于低氧直到1 小时有强烈的效果。
表6
环境温度 在暴露于低氧前在 H2S中的时间 氧％ 在低氧中 的时间 结果 20℃ 5小时 5.20％ 11分钟 存活 20℃ 5.5小时 5.00％ 25分钟 存活 20℃ 5小时 5.00％ 60分钟 存活 20℃ 5小时 4％ 28分钟 存活 24℃ 无H2S 5％ 14分钟 死亡 24℃ 同时发生 5.10％ 10分钟 死亡 24℃ 8分钟 5％ 20分钟 死亡 24℃ 8分钟 4.00％ 8分钟 死亡 24℃ 8分钟 4.50％ 23分钟 死亡 30℃ 8分钟 4.50％ 6分钟 死亡 24℃ 10分钟(90ppm) 5％ 56分钟 死亡 24℃ 8分钟 5.00％ 50分钟 存活
B.增强缺氧耐受性
1.背景
研究了将二氧化碳(CO2)和硫化氢(H2S)增强复杂的后生动物 果蝇(Drosophila melanogaster)在缺氧下存活的用途。这些试验表 明，这些物质，尤其是H2S可增加成体果蝇的缺氧耐受性。
秀丽隐杆线虫胚胎通过进入滞生来在缺氧(＜10ppm O2)下幸 存，并且发育可在0.5％的O2中进行。然而，存在10倍范围的致死 性氧气浓度(0.01-0.1％O2)。此外，用一氧化碳阻止氧利用可防 止胚胎的低氧损害。因此，如果不存在足够的氧为有效的生物活动所 利用，则更好是不具有(或使用)任何氧。
在更复杂的后生动物中，细胞氧浓度不一定与环境的氧水平相 同。在秀丽隐杆线虫中，氧通过扩散递送给组织。然而，在高等生物 中存在结合氧以便运输氧至组织的蛋白质，例如血红蛋白。因此，当 环境的氧水平下降时，在细胞中可能存有残留的氧。
大多数生物不能幸免于暴露于环境缺氧。一种可能性是细胞水平 上的残留的氧是有毒性的，相当于在秀丽隐杆线虫胚胎中观察到的致 死性的氧范围。在该情况中，如果残留的氧被去除或变得不可利用， 则缺氧下的存活应该会增加。CO2促进O2从血红蛋白中释放并且H2S 是一种有效的氧化磷酸化抑制剂。
2.材料和方法
基本的实验方案。将成体蝇引入35mL带有气密性橡皮塞的由玻 璃制成的管(Balsh管)中。这通常通过这样完成：用CO2将蝇麻醉， 将果蝇组移入有食物的瓶中恢复至少2小时，然后将它们转移进Balsh 管中。为了交换Balsh管中的气体环境，将2个18号针插入橡皮塞中， 并让气体以100mL/分钟吹入一个注射针中。为了防止干燥，气体在 通过Balsh管之前通过使之通过10mL水鼓泡来增湿。在试验开始前 将起泡器中的水用气体平衡至少20分钟。
对于“停止-流动(stopped-flow)”试验，气体交换在密封试管之 前进行60分钟。对于“慢-流(low-flow)”试验，气流在整个实验过程 中是持续的。CO2来自室内来源(100％)，并且缺氧环境通过用100 ％氮气(N2)吹出室内空气建立。在将气氛从CO2转换成N2时，注 意防止将室内空气引入该系统中。
在缺氧处理后，通过充入室内空气20分钟将氧气再次引入Balsh 管中。然后除去橡胶塞并用石蜡膜将一个食物瓶倒置于Balsh管顶部。 如果果蝇恢复活动则将其评价为活的。在缺氧处理结束后至少18小时 时对存活力进行评价。在2周后，如果食物瓶中含有幼虫和/或蛹，则 认为蝇是能育的。
3.结果
在暴露于缺氧前用CO2处理。如果成体蝇首先用CO2预处理，则 它们表现出更高的缺氧存活率。在停止-流动试验中缺氧暴露19小时 后，用CO2预处理30或90分钟的成体果蝇分别显示54％或28％的 存活。在暴露于缺氧而未经CO2预处理或暴露于CO2而接下来没有暴 露于缺氧的对照中没有观察到幸存者。此外，如果果蝇在缺氧暴露20 分钟后还立刻暴露于CO2，则用CO2预处理没有蝇幸存于缺氧暴露。
短时间暴露于CO2中足以增强缺氧的存活。在22小时缺氧暴露 的停止-流动试验中，如果在转换成氮气气氛前施用CO20.5-5分钟， 则存活的蝇的比例最高(图16)。因此，对于随后的实验，标准方案 是在暴露于缺氧之前用CO2处理10分钟。在使用该方案的慢-流试验 中，6％的成体果蝇在20小时的缺氧暴露中幸存，并且这种存活需要 CO2预处理。
试验表明，在CO2处理和建立N2环境之间防止重新引入O2是重 要的。当用于湿润气体的起泡器中的水在吹出CO2之前不用N2平衡 时，在这些试验中没有果蝇幸存于13小时的缺氧暴露，无论N2是以 10、50或100mL/分钟引入。在这些条件下，CO2气氛用N2/O2混合 物吹洗出来，其中N2/O2混合物是由O2溶解于水中产生的。
进行一系列的慢-流试验用以确定与未经预处理的比较，CO2暴 露进行的缺氧暴露的时间，每种条件一式两份进行检测(图17)。在 这些数据中，倾向是CO2预处理导致更大的存活。一个重要说明是， 这些试验偏离了标准方案，不同之处是将果蝇用CO2麻醉并转移至 Balsh管中，并在开始CO2处理前仅允许恢复10-20分钟(除了试验2 的第18小时的时间点)。
实施了几个其它试验，其没有为用CO2预处理是否是有利的提供 信息。例如，在一个试验中，在具有10分钟CO2预处理阶段的慢-流 试验中在缺氧17、22和24小时后未观察到存活者。然而，在其它试 验中，许多果蝇在17小时后幸存。这可以说明，在某些案例中其它因 素影响了结果，例如成体的年龄、昼夜节律或室温的改变。在另一个 比较停止-流动方案和慢-流方案的试验中，没有蝇幸存于17或19.5 小时的缺氧暴露；然而，在这种情况下，霉菌污染可能促进了果蝇的 死亡。
在缺氧暴露前用H2S处理。在预处理方案中包括H2S更显著地增 强了成体蝇在缺氧下幸存的能力。在一系列类似于图17中显示的那些 的试验中，加入50ppm H2S至CO2预处理中(H2S/CO2)增加了在处 理中幸存的果蝇的比例(图18)。这些蝇看起来是健康的，并且在暴 露后产生了后代。然而，在类似的试验中，在H2S/CO2中10分钟后 没有蝇幸存于18、20、25或30小时的缺氧中。这种差异的原因不清 楚。与H2S处理的有利影响相符，在15小时的缺氧暴露后，50％的 用H2S预处理的果蝇幸存，而未暴露于H2S的对照果蝇没有恢复。在 该试验中，将果蝇用CO2处理10分钟，然后用H2S/CO2处理10分钟， 随后用N2/H2S处理10分钟，最后用N2处理持续慢-流试验的持续时 间。
H2S-依赖性的缺氧存活增加不要求CO2处理。25％的在造成缺氧 18.5小时前用室内空气中的50ppm H2S处理的果蝇得以幸存。如果 在建立缺氧环境之前增加暴露于H2S/CO210分钟，则存活的果蝇的比 例不受影响。在其中果蝇在缺氧暴露前仅用CO处理的对照实试中， 只有11％的果蝇恢复。
施用H2S的时间似乎对增加缺氧存活是重要的。如果H2S在整个 缺氧暴露过程中(20小时)存在，则没有果蝇复原，无论H2S在CO2 预处理过程中存在与否。然而，如果50ppm H2S存在于CO2预处理 中，并随后在建立缺氧环境时除去，则35％的果蝇存活。在平行试验 中，在用CO2(无H2S)预处理10分钟后6％的暴露于缺氧的果蝇幸 存。
用幼虫和胚胎的初步试验。在用CO和含有HS的CO处理后， 增加的缺氧的存活也在胚胎和幼虫中观察到。在暴露于缺氧24小时 后，7个蛹由一组0-19小时大的胚胎形成。然而，在用CO2预处理10 分钟的配对的池中观察到20个蛹。类似地，暴露于24.5小时缺氧中 的幼虫只有在它们经CO2或H2S/CO2预处理时才可在再氧合时恢复活 动。0-24小时大的胚胎在18.5小时的缺氧暴露中幸存并发育至成虫期， 无论用CO2或H2S/CO2预处理与否。
缺氧过程中的冷处理。降低环境温度可延长成体果蝇可幸存于缺 氧暴露的时间长度。在室温下，在停止-流动方案中没有果蝇幸存于 15.5小时的缺氧暴露中，但20％的保持4℃下同时保持缺氧的那些果 蝇得以恢复。类似地，转换至4℃下的缺氧并随后移至室温下16.5小 时的果蝇没有存活。然而，在16.5小时并甚至在40小时后，在整个 暴露过程中保持在4℃的果蝇得以恢复并且是可育的。在建立缺氧环 境之前用CO2预处理在这些试验中没有显著的差异。
实施例8：
核心体温的下降
在大鼠和小鼠两者中，研究显示利用H2S和CO2，可减少代谢输 出量，表现为核心体温降低。图20A-B显示，在时间0当首先施加 H2S或CO2时，动物的核心体温开始下降。6小时后，当除去H2S或 CO2时，体温开始恢复正常。显然更大的哺乳动物需要更多的H2S来 影响新陈代谢。
预示性的实施例9：
气体矩阵
为了测定提供控制哺乳动物中代谢柔性的最大能力的定制的混 合气氛中每种成分气体的浓度，可实施下列试验。气体包括氧气(O2)、 氮气(N2)、二氧化碳(CO2)、硫化氢(H2S)和氦(He)。在H2S 可能会减少线粒体中的需氧量的同时，CO2可进一步减少需氧量。另 外，已发现核心体温的降低对减少新陈代谢来说是必需的。因此，氦 气以其高的热容量，可提供简单且非侵入性的冷却方法。此外，用100 ％的O2，常氧的20.95％的氧气可维持于其中其它成分组成少于总量 的79.05％的任何气体混合物中。并且最后，将氮气用于平衡该混合 物至100％。
这些试验描述了一种渐进的方法来首先在小鼠然后在大鼠，随后 在狗中单一和组合检测气体。该气体矩阵的目标是发展一个在其上以 逻辑次序用多个变量研究的基础。该实验设计在图21中描述。
该气体矩阵的特征之一是：它表明试验将只会在前面的试验(通 过箭头连接)完成时才进行。混合试验在没有首先优化成分气体时将 不会在任何动物模型中实施。此外，气体或气体混合物在未首先在小 鼠中优化剂量时将不在大鼠中使用，并且未首先在大鼠中优化前将不 在狗中使用。因此，它显示了用单一气体到多种气体混合物(从顶部 右边到底部左边阅读)以及从小鼠到大鼠到狗(从顶部左边到底部右 边阅读)的实验进展。小鼠将总是首先用于测定提供对代谢柔性的最 佳控制的成分气体的浓度。一旦用小鼠测定了气体的最有效剂量，相 同的试验将在大鼠中进行。同时，将用小鼠测定下一种气体或气体混 合物。一旦浓度在大鼠中确定，将在狗中检验该气体。下表提供了稍 微不同的方式来观察气体矩阵并确定试验顺序：
顺序 小鼠 大鼠 狗 1 H2S+CO2 CO2 2 He/O2 H2S+CO2 CO2 3 H2S+CO2+He He/O2 H2S+CO2 4 H2S+CO2+He He/O2 5 H2S+CO2+He
程序1.二氧化碳(CO2)
小鼠：研究发现15％的CO2在小鼠中提供了对代谢柔性的控 制。然而，鉴于我们混合能力的局限性，我们不能够检验更高的浓度。 这一观念不再正确，并且我们可检验直到80％的CO2浓度。因此， 我们将从15％的CO2开始并以5％的增量增加至40％，然后以10％ 的增量增加至80％。动物将暴露6小时。小鼠将用375ml的玻璃室 来暴露，在其中将给动物提供水并且预混合气体气氛将以每分钟500 毫升的速率流入其中。这些玻璃室将包含于一个恒温箱内以便可控制 环境温度。该表提供了我们的高-浓度CO2试验的框架，但可能需要另 外的实验来更好地理解效应。小鼠可在多个实验中使用，但我们将不 会比每周一次还要频繁地使用一个动物。此外，动物可在随后的试验 中用作它们自身的对照。
％CO2 15 20 25 30 35 40 50 60 70 79 ％O2 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 ％N2 64 59 54 49 44 39 29 19 9 0
将监测新陈代谢(O2消耗和核心体温)和活动。在15％的CO2 下，潮气量增加但呼吸率保持不变。小鼠未表现出“气喘”。增加CO2 浓度应该增强麻醉效应。
这些试验将在恒温箱中进行，以便我们可随后降低环境温度至10 ℃用以检测核心体温和代谢输出量之间的关系。
大鼠：大鼠中的实验将用3％的CO2和21％的O2平衡的氮气环 境开始。这被认为是血碳酸正常，因为它是CO2的呼出浓度。从3％ 开始，我们将以2％的增量增加至15％。该增加可在单个的基线试验 中进行，在所述基线试验中我们增加CO2浓度直到我们观察到新陈代 谢的改变。新陈代谢将通过测量O2消耗和核心体温监测。一个试验中 的单个大鼠可用于测定这种最小CO2剂量。在随后的试验中，其中将 检测6小时的CO2暴露的效应，单个大鼠将用于仅一种CO2剂量(即， 在试验过程中水平将不会改变)。大鼠可用于多个实验；它们每周使 用将不多于一次。将用2,800ml玻璃容器来使动物暴露，玻璃容器中 将提供水并且预混合气体将以每分钟3升的速率流入其中。该表显示 了利用大鼠的最初的CO2试验的结构，但需要其它试验来充分研究效 应。
％CO2 3 5 7 9 11 13 15 ％O2 21 21 21 21 21 21 21 ％N2 76 74 72 70 68 66 64
从15％到80％，试验将如用小鼠实施的进展(15％-40％为5％ 的增量，40％-80％为10％的增量)。将监测新陈代谢和行为。一旦 确定用于大鼠的CO2的有效剂量，将降低环境温度以研究新陈代谢是 否如用H2S进行的通过核心温度降低来进一步减少。这些试验将在恒 温箱中进行，该恒温箱将在试验开始和实验过程中提供冷却以及在试 验结束时加热。
在完成大鼠的CO2研究后，将知道大鼠是否需要比小鼠更多的 CO2(对H2S来说是正确的)，或相同的，或更少的CO2用于减少它 们的新陈代谢。了解这一关键的异速增长(allometric)趋势将为狗中 的有效CO2剂量提供更好的假定。
小鼠和大鼠中这些程序的中止点将是O2消耗减少99％或CO2产 生减少99％。
狗：用于狗的实验设计将与用于大鼠和小鼠的相同(采用10升/ 分钟的流速)。试验将用3％的CO2开始并增加直到观察到生理反应。 用麻醉面罩将狗暴露于混合气体，在暴露前这些狗已预先适应该麻醉 面罩。将监测O2消耗和核心体温。相同的一只或两只狗可用于这些试 验。
程序2.硫化氢和二氧化碳(H2S+CO2)
通过混合H2S和CO2，我们将寻求这两种气体的协同效应。即， H2S和CO2能否一起使用来与更高浓度的单种气体一样深度地减少新 陈代谢。在最初的试验中，使用小鼠，将使用20ppm的H2S并且滴 定入CO2达到15％(或在程序1中确定的其它浓度)。一只动物可 用于改变CO2的浓度而同时保持H2S恒定。其次，我们将使用40ppm H2S并加入CO2达到15％。第三，我们将使用80ppm H2S并让CO2 达到15％。这些试验中的每一个可使用一只动物。将监测O2消耗、 核心体温，以及行为。在表中列出的试验为研究H2S+CO2混合物的效 应提供了基础，并且将需要其它试验来理解效应。
试验 O2％ H2S ppm CO2％ 1 21 20 5-10-15 2 21 40 5-10-15 3 21 80 5-10-15
一旦测定了有效的混合物，将降低环境温度用以研究优化的气体 混合物是否可与低的核心体温起协同剂作用来进一步降低代谢率。在 这些温度依赖性试验中，混合物中的气体的浓度将不改变。再一次， 一只动物可用于多个实验，每周每只动物不多于一个试验程序。
使用大鼠和狗的试验将采用相同的方法实施。用于大鼠和狗的 CO2浓度将在程序1中优化，但假定它们将在5％和15％之间。对于 狗，高的H2S浓度大于400ppm但尚未测定。
程序3氦(He)
氦是一种有效的热消散器；它的热传导比氮气大6倍。它已在许 多哺乳动物包括大鼠、狗和人中使用以促进冷却。它是无毒的、便宜 的，并且易于处理。期望将氦与其它气体一样，用于与氧气的80％/20％ 混合物(He-O2)中，用来通过呼吸作用增强导热性。提出了5个预 备试验来分析He-O2对新陈代谢和行为的影响。将采用广泛使用的标 准的80％-20％混合物。也将检测含有60％He的混合物，用以更好 地反映我们将在方案5中使用的最小量的He-O2混合物，在方案5中 我们混合了H2S、CO2和He。
试验 动物 温度 He-O2-N2 1 小鼠 23℃ 80-20-0 2 小鼠 10℃ 80-20-0 3 小鼠 23℃ 60-20-20 4 小鼠 10℃ 60-20-20 5 大鼠 23℃ 80-20-0 6 大鼠 10℃ 80-20-0 7 大鼠 23℃ 60-20-20 8 大鼠 10℃ 60-20-20 9 狗 23℃ 80-20-0 10 狗 23℃ 60-20-20
将监测氧消耗、二氧化碳产生、核心体温和行为用以了解用He-O2 是否可诱导其它气体具有的相同效应。
程序4：氧气(O2)
减少氧浓度可降低核心体温已由Gellhorn和Janus在1936年用 豚鼠显示。期望首先在小鼠中，然后在大鼠中，并最后在狗中重现这 些试验，用以研究降低的O2浓度是否减少新陈代谢。
小鼠：提出了其中小鼠将暴露于低至6％的减少的O2浓度的实 验。试验将以5％的增量进展。将测定O2消耗、CO2产量、核心体温， 以及行为。如果观察到指示极度低氧的惊厥行为，则将O2恢复至21 ％。下表提供了该O2试验的概要。暴露时间是在预混合气体流入其中 的控制室(有水)中进行6小时。由于存在低氧预处理的证据，四只 单独的动物用于这四个实验。
试验 ％O2 ％N2 1 21 79 2 16 84 3 11 89 4 6 94
一旦已确定O2分压和新陈代谢之间的关系，可能重要的是在冷 的环境中重复该实验。这些试验将完全如前面的试验实施，只是恒温 箱的温度将降低至10℃。
大鼠：期望采用大鼠实施先前用小鼠实施的相同的实验。如果观 察到表示极度低氧的惊厥行为，将O2浓度恢复至21％。
狗：如果在小鼠和/或大鼠中观察到氧张力减少和代谢率减少 之间正相关，则期望用狗来实施相同的一系列试验。
程序5：硫化氢、二氧化碳、氦和氧气(H2S+CO2+He+O2)
这些试验是该气体矩阵的目标；以确定提供对新陈代谢最强 (robust)和可逆的控制的、与优化的环境温度组合的O2、CO2、H2S 和He的混合物。因此，将在前面程序中确定的单种气体的浓度用作 基础，测定这四种气体的混合物以找到对代谢柔性提供最佳控制的混 合物。O2、CO2和H2S将相对于彼此改变，同时氦将用于平衡该混合 物。在下面显示的小鼠试验中，在O2和H2S保持恒定的同时改变CO2； 将改变氦用以维持恒定的流量。我们将采用相同的包括氧消耗和核心 体温的代谢测定法。一只动物可用于多个实验。小鼠将暴露6小时。 然后采用更低的环境温度重复这些试验，用以了解采用该气体混合物 降低的核心体温会影响新陈代谢多少。
小鼠：
O2 H2S CO2 He 试验 浓度％ 浓度ppm 浓度％ 平衡 1 21 20 5-10-15 2 21 40 5-10-15 3 21 80 5-10-15 4 16 20 5-10-15 5 16 40 5-10-15 6 16 80 5-10-15 7 11 20 5-10-15 8 11 40 5-10-15 9 11 80 5-10-15 10 9 20 5-10-15 11 9 40 5-10-15 12 9 80 5-10-15 13 6 20 5-10-15 14 6 40 5-10-15 15 6 80 5-10-15
大鼠：在了解了用于小鼠的最佳气体混合物是什么后，将用大鼠 进行与用小鼠实施的那些一样的实验，除了H2S浓度是100、200和 300ppm以外。将处理大鼠6小时。
狗：使用狗的试验将与使用小鼠和大鼠的那些试验一致。浓度 将开始于300ppm并转到要测定的浓度。一个动物可用于多个实验但 每周不多于一次。小鼠和大鼠将处理6小时，狗将处理2小时。
预示性实施例10：
人中硫化氢剂量的选择
可通过多种剂型和施用途径的任意一种，包括但不限于吸入气体 形式或静脉内施用硫化氢溶液，施用硫化氢给动物或人来诱导停滞。 描述了用于确定足以在需要停滞的整个生物中诱导停滞的硫化氢的剂 型和施用途径的方法。将试验生物(例如大鼠、狗、猪、猴)暴露于 增加浓度的作为一次性剂量间歇性或连续性施用的硫化氢，并且在多 个时间点移出血液样品(0.5mL)的同时监测生理状态，包括但不限 于核心体温、氧消耗、二氧化碳产生、心率、血压、呼吸率、血液PH 值、运动和觉醒状态。将存在于源自试验动物血液的血浆中的硫化氢 浓度用本领域已知的方法测量，包括，但不限于X衍生、Y萃取，以 及使用气相色谱法和质谱测定法的定量。
在试验动物中通过特殊给药方案产生的硫化氢的稳态血浆水平 与试验动物中在不同程度上实现停滞的相关性，确定了足以在试验动 物中诱导停滞的硫化氢的有效剂量。用于在需要停滞的人中诱导停滞 的有效剂量通过确定在其中诱导停滞的条件下，在人中获得与在试验 动物中获得的相同的硫化氢的稳定血浆浓度的硫化氢的剂量、施用途 径和给药方案测定。硫化氢在人体内实现停滞的有效浓度取决于剂型 和施用途径。对于吸入法，在一些实施方案中，有效浓度在连续递送 50ppm至500ppm的范围内。对于静脉内施用，在一些实施方案中， 有效浓度在连续递送每千克体重0.5至50毫克的范围内。
在每种情形中的范围表征为用增加的硫化氢的剂量获得的增加 的停滞程度。足以导致在医院外遭受心搏停止以及心博复苏和恢复时 无意识的人的核心体温持续的、12-24小时降低3-5摄氏度至32-34摄 氏度的硫化氢的剂量，预计相对于未暴露于硫化氢的类似的人具有显 著的生存优势，如Bernard等2002中描述的。
实施例11：
动物的预处理研究
实施例7中显示的研究证明，用H2S预先且持续的处理雄性 C57Bl/6小鼠可增强它们在5％的氧气或4％的氧气的低氧条件下存 活的能力。
为了测定在低氧条件下单独用H2S预处理对存活力的影响(在低 氧过程中没有持续暴露于H2S)，将小鼠在暴露于5％O2(5％)、4 ％O2(4％)、1小时5％的O2后为4％的O2(4％+1小时5％) 或1小时5％的O2后为3％的O2(3％+1小时5％)之前，暴露于 30分钟的室内空气下(未经预处理)，或者暴露于10分钟的室内空 气下之后暴露于20分钟室内空气中的150ppm硫化氢(预处理)， 并测定它们的存活时间。试验在60分钟时终止，并将仍然活着的动物 放回到它们的笼中。如图23中显示的，在预暴露于室内空气中的150 ppm H2S 20分钟的一组动物中的所有小鼠都幸存于随后5％O2的暴 露，而只暴露于室内空气的所有对照动物都在暴露于5％O215分钟 内死亡。因此，将小鼠预暴露于H2S在该小鼠中建立了使得能长时间 幸存于其它情况下为致死性低氧的生理状态。在H2S预处理的小鼠中 观察到的保护作用远远超过了已知的已在文献中报道的全身低氧预处 理的保护效应，在所述的文献中在5％O2中的存活力只延长了2倍 (Zhang等，2004)。虽然在图23中未显示，一些H2S预处理的小 鼠能够在5％O2中存活长于4小时，并能够恢复而没有显著的运动或 行为缺陷。
为了确定H2S预处理是否增强对甚至更低的氧张力的存活力，将 小鼠暴露于更低的O2浓度。如图24中显示的，H2S预处理大大地增 强了在存在5％的O2的情况下的存活。比较而言，在存在4％O2时， H2S预处理仅较小地增加了存活。然而，如果将H2S预处理的小鼠暴 露于逐步减少的O2水平，这样它们首先经预处理然后暴露于5％的 O21小时，随后暴露于4％的O2或3％的O2，它们的存活时间增强 至与它们在H2S预处理后暴露于5％的O2时观察到的相同的水平(图 28)。因此，预暴露于H2S建立了一种其中小鼠可幸存于超过80％的 氧张力的逐级减少(21％的常氧减少为3％的O2)生理状态。而且， 在一些试验中，在H2S预处理后逐级减少氧张力显示，小鼠可在低至 2.5％的氧张力中存活1小时。
这些数据和在实施例7中描述的那些证明，暴露于H2S具有药理 学效应，其中在其它情况下为致死性低氧中的存活率得以很大提高。 关于这一点，H2S的药理学效应取决于暴露于H2S的剂量水平和持续 时间、本领域的技术人员可改变以获得最佳的对致死性低氧的存活力 的参数。本领域的技术人员将理解，也可改变施用途径(例如，吸入 对肠胃外施用)来在哺乳动物中获得期望的致死性低氧耐受的效果。 另外，所述的药理学效应可在H2S暴露局限于预处理或扩展到低氧期 间时观察到。同样，可改变暴露于H2S相对于致死性低氧开始的时间 选择，用以使提高的存活力最大化。这些数据符合这样的假设：由用 活性化合物(如氧拮抗剂)预处理导致的需氧量减少使得能幸存于在 其它情况下对动物是致死性的供氧减少。
为了表征在通过H2S处理产生的增强的对致死性低氧的存活力的 环境中存在的新陈代谢变化，在暴露于H2S过程中并然后H2S处理终 止以及随后暴露于5％的O2的过程中，测量小鼠的CO2产生。CO2 产生的变化在图25中显示。测量暴露于室内空气30分钟(未经预处 理)或室内空气10分钟后暴露于150ppm H2S 20分钟(预处理)的 小鼠中在转换为5％O2或4％O2时CO2产生的变化。此外，测量了 在逐步过渡至5％的O21小时，之后转换为4％的O2时CO2产生的 变化。这些试验的结果在图29中提供。
CO2产生在H2S预处理的最初5-10分钟内减少了约2至3倍，表 明在用室内空气中的150ppm H2S预处理20分钟期间，在小鼠中诱 导了停滞。然而，动物的O2消耗和核心体温在H2S预处理过程中没 有显著改变(数据未显示)，表明在暴露于H2S过程中，小鼠中建立 了使得对致死性低氧的存活力提高的生理状态而不是停滞。这种状态 可表征为生物材料内的新陈代谢减少的大小低于定义为停滞的大小。 为了用活性化合物获得停滞，生物物质有必要必须过渡通过其中生物 物质中的氧消耗和CO2产生减少低于2倍的逐级代谢减退状态。这种 其中新陈代谢或细胞呼吸通过活性化合物减少至低于两倍的程度的连 续状态被描述为“预-停滞”状态。在图25中显示的、在H2S预处理终 止和诱导致死性低氧后对CO2产生的连续监测证明，CO2产生减少约 50倍，说明停滞是在暴露于致死性低氧过程中获得的。在暴露于致死 性低氧过程中，伴随的小鼠中O2消耗的减少以及活动性的强烈衰减进 一步支持这样的观测结果：随后在暴露于致死性低氧过程中获得停滞。
测量了与在H2S预处理后或未经预处理后转换为5％O2或4％ O2的低氧条件相关的CO2产生的变化。如在图28中显示的，在没有 H2S预处理时暴露于5％的O2的小鼠或在存在H2S预处理的情况下暴 露于4％的O2的小鼠表现出CO2产生大量减少。相比而言，与在H2S 预处理后的新基线水平比较，随后暴露于5％O2或者在5％O2之后 暴露于4％O2的经H2S预处理的小鼠在CO2产生方面未显示出任何 明显改变。这些结果证明了代谢活动减少与死亡之间的相关性，所述 死亡与在没有H2S预处理时暴露于5％O2，或者有H2S预处理时暴 露于4％O2相关。此外，这些数据证明，在H2S预处理后暴露于5％ 的O2，或从5％的O2逐步减少为4％的O2没有导致代谢活动的额外 减少。为了总结这些结果，在从常氧转变为致死性低氧时发生的CO2 放出的减少在用H2S预处理过的小鼠中是迟缓的。从常氧转变为致死 性低氧导致CO2放出减少40％，但用H2S预处理，它本身导致CO2 放出减少50-60％而达到一个新的，更低的基线，防止了在转变成致 死性低氧时CO2放出的任何进一步减少。这些数据证明，单独用H2S 预处理防止了通常与转变为致死性低氧相关的代谢活动的额外减少， 从而提高了在低氧条件下的存活。此外，这些数据支持了这样一个模 型，其中将生物物质预先暴露于活性化合物足以增强存活力和/或减少 来自损伤或疾病损害的伤害。
实施例12：
硒化氢在降低的浓度下降低小鼠的核心体温
以前已在文献中报道，大于1ppm的H2Se对动物是致命的。试 验按照实施例4中描述的材料和方法进行，除了使用甚至比H2S更低 浓度的H2Se。使用的H2Se具有来自来源罐的氮气中20ppm的初始 浓度，然后将其用室内空气稀释成约十亿分之10份或100份(ppb)。 然后将动物暴露于该混合物。
两只小鼠暴露于100ppb H2Se少于10分钟。图26显示了由一只 小鼠中的呼吸表明的，核心体温降低以及代谢活动减少3倍。
H2Se的浓度甚至进一步减少至10ppb。暴露于10ppb H2Se的小 鼠也经历了核心体温和呼吸的减少(图27)。
此外，基于用于评估使用H2S的可逆性的实验(Blackstone等， 2005，因此将其通过引入作为参考)，H2Se的效果表现为完全可逆的。
实施例13：
硫化氢保护对抗致死性出血
实施例7和11中显示的研究证明，用硫化氢(H2S)处理小鼠增 强了它们在5％的氧或4％的氧的低氧条件下生存的能力。为了确定 H2S处理是否也可用于减少与更加在临床上有关的缺血性低氧急性损 伤模型相关的死亡率和/或组织损伤，在受控制的致死性出血过程中用 H2S处理大鼠，所述的致死性出血减少了提供给组织的氧并导致死亡 (Blackstone等，2005)。在该研究中，用H2S处理的大鼠幸存于致 死性失血并完全恢复。
将大鼠在受控制的致死性出血(失血60％)过程中用H2S处理。 在手术植入导管和恢复后，将血液在40分钟内从有意识的动物体内移 出。将与室内空气混合的少量(300ppm)H2S在开始放血后20分钟 (即在失血30％后)施用给受处理的动物。在放血结束时将动物放回 到没有H2S的室内空气中。在放血结束后3小时，将存活的动物静脉 内施用流出的血液体积的乳酸林格氏溶液。
大多数(6/7)H2S处理的大鼠幸存于出血和3小时的休克期并完 全恢复(表7)。这些存活的大鼠没有一只在恢复后表现出行为或功 能缺陷。一只H2S处理的大鼠在出血结束后174分钟死亡。所有未经 处理的动物在出血结束后82分钟内死亡；未经处理的动物的平均存活 时间是35+/-26分钟。采用双尾费歇尔(Fishers)精确T-检验，p值 是0.0047。
在最初的20分钟出血(在失血30％之前)中，大鼠增加了呼吸 率和潮气量用以补偿由于失血而减少的携氧能力。这种通气的增加导 致了呼吸的二氧化碳产生(VCO2)的减少(表7)。在失血60％后， H2S处理的和未经处理的动物都表现出VCO2减少。动脉血乳酸增加而 pCO2、碳酸氢盐([HCO3-])、pH和碱过剩减少(表7)。因此出血导 致具有呼吸性代偿的代谢性酸中毒。然而，在H2S处理的大鼠中，这 些变化在大小上是较小的，表示代谢性酸中毒的降低。此外，在H2S 处理的动物中，VCO2在出血后没有继续减少。在未经处理的动物中， VCO2稳定地减少直到动物停止呼吸。H2S施用显示防止了休克反应发 展至死亡。
表7.使用H2S的大鼠出血模型的存活和生理学
H2S处理的 未经处理的 存活 完全恢复 到非幸存者死亡的时间 85.7％(6/7) 174(1/7) 0％(0/7) 35+/-26 ml/kg/分钟的CO2产生(VCO2)： 出血前 出血中间 出血结束 25+/-4 20+/-2 16+/-2 26+/-6 21+/-3 11+/-3
出血后15分钟 17+/-3 7+/-5 mmHg的血液CO2含量(pCO2) 出血前 出血结束 45+/-6 35+/-6 44+/-3 21+/-3 mmol/L的血液碳酸氢根含量([HCO3-]) 出血前 出血结束 32+/-3 21+/-3 30+/-1 12+/-3 血液pH 出血前 出血结束 7.46+/-0.03 7.41+/-0.02 7.45+/-0.02 7.35+/-0.06 mmol/L的血液碱过剩 出血前 出血结束 8+/-2 -5+/-4 6+/-1 -14+/-3 mmol/L的血液乳酸 出血前 出血结束 1.4+/-0.5 6.6+/-1 1.2+/-0.2 11+/-3
实施例14：
在出血过程中短期暴露于硫化氢的益处
重275-350克的雄性斯普拉-道来氏大鼠在每个试验前一周购自 Charles River Laboratories并让其适应。在试验当天，将导管手术植 入右股动脉和静脉中。导管在肩胛骨后面引出。给大鼠在手术后施用 丁丙诺啡并让其恢复。
将抗凝血药物肝素(80-100单位)以一次性剂量静脉内施用，用 以降低血液的凝固能力并增强出血。在施用肝素后，将意识不受限制 的大鼠单独地置于带有玻璃盖的2.75升结晶皿中。将导管、温度探针 和气体采样管通过在盖中央的钻孔。温度保持大致恒温(27+/-2℃)。
出血模型定义为在40分钟流血过程中移出60％的总的体内血 液。血液用蠕动泵移出。为了确定构成60％的总的体内血液的量，将 大鼠称重并且血量用下列方程计算：(0.06X体重)+0.77(Lee等， (1985))。
让处理组接受暴露于含有硫化氢的室内空气(试验动物)，或含 有氮气的室内空气(对照动物)，所述空气通过热质流控制器(Sierra Instruments)以每分钟3升的速率施用。
将硫化氢(H2S)(20,000ppm，用氮气平衡)(Byrne Specialty Gas)稀释进室内空气中达到用于处理的2000ppm浓度。将血液以计 算出的速率经由股动脉导管移出。将血液在它移出时称重。在20分钟 (或在40分钟放血的50％时)后，将试验动物暴露于含有2000ppm 硫化氢的室内空气中。该暴露在动物显示呼吸暂停和张力障碍时终止。 暴露于硫化氢(H2S)的平均时间长一般为1和2分钟之间。室内的 最大H2S浓度估计为在1000和1500ppm之间。当观察到呼吸暂停和 张力障碍时，让动物接受暴露于室内空气中。试验动物在暴露后20 至30秒内恢复有规律的呼吸模式。将对照动物以与试验动物一样的速 率放血，但不接受用硫化氢处理。对照动物在试验过程中未显示呼吸 暂停或张力障碍。
代谢率通过测量CO2产生测定(Licor Li7000)。收集温度和CO2 数据(ADI PowerLab)。测量动脉血值(I-Stat血液化学分析仪)。 在放血后，将动物置于笼中3小时并观察。在3小时结束时，随意提 供乳酸盐林格溶液给幸存的大鼠。对于未幸存的动物，在动物停止呼 吸和CO2产生停止时宣布死亡时间。在复苏后，将大鼠转移至具有食 物和水的干净的笼中，并在30℃下圈养约16小时。手术移出导管， 并允许动物在转移回到群体中之前于30℃下恢复数小时。行为和功能 试验选自SHIRPA方案中描述的一组试验(Rogers等，1997)。
在这些试验中，在出血过程中经硫化氢(H2S)处理的动物8只 中有7只(88％)幸存于出血。未接受处理的两只对照动物在3小时 的观察期间死亡。
实施例15：
来自实施例2的额外结果
如上面实施例2中论述的，将人包皮用于评估细胞和组织在一氧 化碳中的保藏。最终评估了总共8块人包皮(实施例2报道了3块)。 有活力的角质形成细胞数用台盼蓝评估(表8和图30)。这显示一氧 化碳暴露增加了活细胞的数目。
表8.采用台盼蓝(tb)染色法检测从暴露于室内空气(RA)
或CO 24小时的包皮中分离的角质形成细胞的存活力。
RA CO 活的(tb-) 死亡的(tb+) 活着的 分数 活的 (tb-) 死亡的 (tb+) 活着的 分数 SUM 0 1 0 0 7 0 1 0 9 3 1 0 0 34 1 2 1 42 0.00 0.50 0.17 0.00 0.33 0.00 0.18 10 4 10 5 49 24 3 1 106 1 4 3 1 42 6 3 1 61 0.91 0.50 0.77 0.83 0.54 0.80 0.50 0.50 0.63
未处理的 CO #恢复 的细胞 51 167 活着的比例 0.18 0.63 t检验0.000883884
实施例16：
低水平长期H2S暴露增加存活力
使用实施例1中描述的方法和仪器，将秀丽隐杆线虫线虫暴露于 低水平的H2S(＜100ppm)。适应于这种处理的线虫显示出增加的寿 命和对热应激的抗性，然而，不存在如诱导停滞具有的代谢活动可辨 别的减少。
在线虫中，不能进行有氧代谢(通过减少周围的氧浓度或加入 CO)导致诱导滞生或停滞(参见实施例1)。然而，滞生不能通过将 它们暴露于室内空气中＜100ppm的H2S诱导。在大于100ppm剂量 时，H2S可导致暴露的线虫群体相当大的致死率。有趣地是，即使在 其中大多数蠕虫被H2S杀死的情况中，幸存的那些表现正常并且显然 没有受该物质伤害。在约50ppm H2S中生长的蠕虫完成胚形成，发 展至性成熟并以与在没有H2S的环境中饲养的同胞相同的速率生产后 代。比较而言，在其中代谢率降低的氧浓度(低于3.5％O2)中，所 有这些过程都减慢了。此外，在H2S中饲养的蠕虫产生了与室内空气 中的对照相同的数量的后代，表明不存在来自这些条件的有害作用。 这些数据表明，H2S没有减少秀丽隐杆线虫在这些条件下的代谢活动。
在H2S中生长的线虫比在单独的室内空气中的年龄匹配的对照更 抗热应激。在该测定法中，将在50ppm H2S中饲养的蠕虫在H2S中 暴露于高温，并且将在室内空气中饲养的蠕虫暴露于室内空气。因此， H2S-诱导的对应激的抵抗力与代谢活动减少不相关。然而，这种对热- 应激的抵抗力需要线虫适应H2S环境。在室内空气中饲养并在H2S中 暴露于热-应激的蠕虫比如果它们在室内空气中暴露更快速地死亡。在 H2S中饲养的蠕虫并在室内空气中暴露于热应激的蠕虫比在室内空气 中饲养的对照存活得更好的范围内，对H2S的适应是持续的。另外， 适应无毒的低浓度H2S(例如50ppm)的蠕虫可对抗对未适应的蠕虫 是致死性的更高浓度的H2S。
这些数据与如下数据一致：短暂暴露于H2S的果蝇随后能比未经 处理的对照更好地幸存于缺氧(参见，实施例7和实施例11)。保护 免受热应激(在蠕虫中)和缺氧应激(在果蝇中)表明，H2S能够增 强在可能在临床上遇到的多种不利的或应激状态下的存活力。
适应50ppm H2S的蠕虫与等基因的未经处理的对照比较具有增 加的寿命(图32)。这与如下想法一致：它们处于通常更耐受与衰老 相关的多种应激的状态下。实际上，在H2S中生长的老年蠕虫比未经 H2S处理的相似年龄的那些蠕虫看起来更强健和健康。此外，在比较 来自处于寿命中期的每种群体的蠕虫时，这也是正确的(即，室内空 气对照和H2S-处理的蠕虫在时间上不是年龄相匹配的，但其中每个群 体的50％已死亡这一点是相匹配的)。因此，适应于H2S可减慢秀 丽隐杆线虫中与衰老相关的慢性细胞损害。
实施例17：
气体矩阵试验的实施
采用改变的气体环境在小鼠、大鼠和狗中评估代谢柔性。三个参 数用于定义新陈代谢的这种减少，包括通过呼吸测量法测量的二氧化 碳产生、氧消耗的改变，以及如用遥测术测量的核心温度的改变。在 用小鼠和大鼠的试验中，将动物置于具有一个气体输入口和一个气体 出口的密封室中。对于狗，将面罩置于动物的口鼻部，该面罩连接有 两根软管(输入口和输出口)。用于每种动物的气体流速：小鼠-每分 钟500cc，大鼠—每分钟2升，以及狗为每分钟40升。每种气氛通过 稀释入室内空气而从压缩气体构建，除非另外注明。对于大鼠和小鼠 试验，在暴露于试验气体过程中环境温度是7-10℃。对于狗，环境温 度是室温(22℃)。
表9：构建用于检测小鼠、大鼠和狗中的代谢柔性
的气体环境的描述。
小鼠 大鼠 狗 硫化氢 硒化氢 磷化氢 二氧化碳 H2S+CO2 CO2+低O2 CO2+低O2+He +77％ 有0.01％ 有0.0001％ 无0.016％ 有15％ 有0.01％+15％ 有15％+8％ 有15％+8％+77％ 有0.03％ 有0.003％ N/D 有15％ N/D 有15％+8％ 有15％+8％+77％ 无0.85％ N/D N/D 无9％ N/D N/D 有9％+15％
表9显示了每种气体的量，其作为室内空气气氛的百分比给出， 除非另外说明。在6小时处理过程中，如通过二氧化碳产生或氧消耗 判断的，代谢率大于5倍的抑制迹象通过“有”描述；“无”(这些值减 少或低于5倍的减少像这样描述)；“N/D”表示试验未进行。在狗试 验(二氧化碳+低的氧+氦)中温度在30分钟的暴露过程中下降约1.5 ℃。这样的温度降低认为是明显的，因为狗为12kg并且在室内空气 中的动物的广泛的基线记录过程中未观察到这样的温度下降。
暴露于多种构建的气氛的动物显示出代谢柔性，所述的代谢柔性 由接近环境温度的核心体温(CBT)的改变来证明(图33-40)。图 33证明了暴露于含有15％CO2、8％O2和77％He的气氛的大鼠与 在类似条件下暴露于300ppm H2S的大鼠比较具有加速的代谢抑制。 图34证明在暴露于1.2ppm H2Se的小鼠中CBT显著降低。在10℃ 的环境温度下暴露于室内空气的大鼠未显示CBT的显著降低(图35)。 在7℃下暴露于80％He、20％O2的大鼠也未显示CBT显著降低(图 36)。在7℃的环境温度下暴露于15％CO2、20％O2、65％He的 气氛的大鼠显示CBT显著降低(图37)。同样，图38显示在7℃下 暴露于15％CO2、8％O2、77％He的气氛的大鼠中CBT显著降低。 CBT的显著降低也在暴露于9％CO2、20％O2、71％He的气氛的 狗中得到证明(图39)。该降低的幅度较低，可能是因为该动物较大 尺寸和对热扩散的限制。在暴露于不同浓度的CO2的狗中观察到类似 的降低。
实施例18：
化合物的筛选
实施了化合物筛选来鉴定能够导致小鼠中皮下温度可逆的降低 的试验化合物。随后检测了所鉴定的试验化合物它们提供保护免受致 死性低氧(与21％的O2平衡的氮气环境的典型环境相对比，在4％ 的O2时测量的)的能力。整个筛选程序包括3个步骤：
1)第一步(1°)筛选以测定将引起试验小鼠的皮下温度可测降低 的试验化合物的最小有效剂量；
2)第二步(2°)筛选以测定温度降低的可逆性，如通过在处理后 24小时具有正常行为且在24小时或更少时间内恢复到正常皮下温度 的试验小鼠定义；以及
3)第三步(3°)筛选以与在相同的低氧条件下未经处理的对照受 试者相比，评估试验小鼠幸存于致死性低氧(4％O2)的能力。
这些研究中使用的小鼠是5-6周大的、颈静脉插管(JVC)的雄 性C57BL/6小鼠(Taconic)，其背部植有皮下RFID温度传感器 (IPTT-300，Bio Medic Data Systems，Inc.(BMDS))并允许其恢 复至少24小时。用1或5ml的Luer-Lok注射器(Becton Dickinson) 和输注泵(Harvard Apparatus)，通过留置导管输注试验化合物来给 小鼠给药。来自BMDS的DAS-6008数据采集模块通过发射应答器 (transponder)记录小鼠的皮下温度，并且将该数据输入计算机的电 子表格并绘制相对于时间的图。
第一步(1°)筛选：
对于第一步筛选，试验化合物的输注液以被认为是最大优化的浓 度的浓度制备。用NaOH或HCl将pH调节至6-8，用氯化钠将渗透 性调节至250-350mOsm，并且施用的试验化合物的总剂量(mg)除 以试验受试者的体重(kg)不会超过它公开的在小鼠中的mg/kg LD50 的400％。
将小鼠置于具有不透明壁的高的玻璃底容器中，并通过颈静脉输 注。试验化合物用分步方案输注，输注速率在2小时过程中增加(表 10)。
表10.试验化合物的输注分步方案
时间(分钟) 输注速率(微升/分钟) 输注的微升数 总输注的微升数 0-20 20-40 40-60 60-80 80-100 100-120 0.8 1.6 3.2 6.3 12.7 25.4 15.875 31.75 63.5 127 254 508 15.875 47.625 111.125 238.125 492.125 1000.125
在输注过程中，每3-5分钟读取小鼠的皮下温度，并记录小鼠行 为的任何改变。第一步筛选的结果显示了试验化合物是否具有降低皮 下温度至33℃或更低的能力，并表明了降低皮下温度所需的有效剂 量，所述的所需有效剂量是通过第一次观察到稳定的温度降低时试验 化合物的输注速率测量的。
第二步(2°)筛选：
引起小鼠的皮下温度降低至33℃或更低的试验化合物在第二步 筛选中进行检测。在第二步筛选中，将小鼠以第一步筛选中测定的有 效输注速率的50％的速率，输注试验化合物60分钟。在输注过程中， 通过每3-5分钟进行测量来监测小鼠的皮下温度。如果皮下温度在最 初的60分钟内没有降低，则将输注速率加倍并继续输注另外的60分 钟。当小鼠的皮下温度降低至33℃或更低时，立刻停止输注，并通过 测量皮下温度和观察小鼠的行为来评估小鼠的恢复。在处理后24小时 观察和记录小鼠的温度和行为。第二步筛选的结果确定试验化合物是 否导致了皮下温度的可逆降低而没有致死现象。
第三步/致死性低氧(3°)筛选：在第三步筛选中，将小鼠以第二 步筛选中确定的速率输注试验化合物。每3-5分钟测量小鼠的皮下温 度直到它减少至33℃，如在第二步筛选中。停止输注并将小鼠与对照 小鼠一起立即转移至含氧量低(4％O2)的室内，所述对照小鼠输注 载体(盐溶液，148mM，渗透性＝300)或未经处理。将该密闭的玻 璃室以连续流动的空气和氮气灌注，以达到期望的4％O2的低氧气 氛。如果小鼠在低氧气氛中存活了60分钟，将其转移回室内空气下， 并通过记录皮下温度和通过行为观察来监测它的恢复24小时。
对照小鼠通常在6-15分钟内死亡。
用硫化钠(有效剂量为0.79mmol/kg)、硫代甲醇钠(有效剂量 为4.61mmol/kg)或硫氰酸钠(有效剂量为4.67mmol/kg)输注的小 鼠幸存于暴露于致死性低氧60分钟。用巯乙胺(有效剂量7.58 mmol/kg)输注的小鼠在致死性低氧中存活了45分钟；用巯乙胺-S- 磷酸钠盐输注的小鼠在致死性低氧中存活了31分钟；并且用四氢噻喃 -4-醇输注的小鼠在致死性低氧中存活了15分钟。将这些存活率与对 照小鼠的存活率比较，所述对照小鼠通常在低氧环境下于6-15分钟内 死亡。
比较而言，在第一步筛选中确定为具有降低体温能力的一些其它 试验化合物没有保护动物对抗致死性低氧。硫代乙酸、硒脲和硫代磷 酸S-(2-((3-氨丙基)氨基)乙基)酯都降低了体温，但没有提高在低氧下 的存活。2-巯基-乙醇、巯基乙和2-巯基乙醚都降低了体温，但在有效 降低温度的剂量下是有毒性的。硫脲、二甲硫醚、硒化钠、甲亚磺酸 钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸在该研究中给出的最高剂量下没有降低皮下 温度。排除了二甲基亚砜，因为有效剂量(10％DMSO)太高而被认 为不能用于药用目的。
这些研究确定，发展的筛选程序可成功地用于鉴定能够保护遭受 致死性低氧的动物的化合物。另外，该研究的结果表明，鉴定的化合 物，以及将用本程序鉴定的其它化合物可用于保护患者免受低氧导致 的损伤以及缺血性损伤。
实施例19：
每天暴露于活性化合物
生理学上适应用硫化氢(H2S)长期处理的能力以及适应需要的 时间已在小鼠中得以检测。适应定义为，在动物暴露于室内空气中的 80ppm硫化氢进行长期处理时，没有显示核心体温的降低(大于4 ℃)。长期处理定义为在六周内每周4天，每天4小时暴露于室内空 气中的80ppm硫化氢。
在这些研究中使用的小鼠是5-6周大的雄性C57BL/6小鼠或雄性 C129小鼠。将遥测装置在试验前植入小鼠的体腔用以记录核心温度。
将小鼠(每次处理8只)在具有分开的用于每只小鼠的室的树脂 玻璃盒中，暴露于流速为每分钟10升的硫化氢。检测500cc玻璃碗 中的动物的二氧化碳产生和氧消耗具有每分钟0-5升的流速。
在一周期间，平均起来小鼠适应了硫化氢暴露。适应定义为当动 物暴露于室内空气中的80ppm硫化氢4小时时，没有显示核心温度 的降低(大于4℃)。没有显示核心温度降低的小鼠被认为具有对硫 化氢的生理适应。产生了适应的用硫化氢处理的小鼠在与未经处理的 对照小鼠比较时，显示了相比于二氧化碳产生(vCO2)，氧消耗(vO2) 增加(图42)。适应H2S的小鼠显示较低的呼吸商(RQ比率)，呼 吸商被定义为vCO2/vO2的比率或产生的二氧化碳与消耗的氧的比 (图43)。
实施例20：
对地中海贫血的应用
基于在这里介绍的其它模型体系中的当前结果，预期具有血液学 障碍(地中海贫血)的动物的红细胞，当用硫化物处理它们时，将具 有增加的抵抗氧化损害的能力，导致延长的红细胞存活。将进行下面 的试验来确认用活性化合物的处理可以保护患有地中海贫血的动物免 于氧化损害。
在第一系列试验中，患有地中海贫血的动物将通过长期暴露于活 性化物来治疗。在确定基线的初始试验后，将按照下面总结的方案开 始治疗。如果红细胞生成或红细胞存活得以改善，可能早在1-2周内 观察到效果，因为地中海贫血红细胞的半衰期估计为4-7天。我们将 在两周时观察涂片并获得网织红细胞计数，并在另外两周后开始更广 泛的研究。如果在小鼠中检测到红细胞的改善(通过提高的网织红细 胞计数和血涂片鉴定)，该研究将继续直到观察到用于每月一次的研 究中的metrics中的稳态。该研究具有预计的一年的最终终点。在一 年时，将完成红细胞存活研究，并且将处死动物。如果没有观察到改 善，暴露将继续一直到另外一年，那时将完成存活研究并处死动物。
方案1：
1)动物将进行初始试验。
2)在初始研究后1周内，同样地圈养动物，并且：
A)暴露于80ppm H2S 8小时/天；
B)不暴露；或者
C)给予具有0.25％二甲硫醚(DMSO)的水，并允许随意饮用 (来自先前研究的估计值暗示小鼠将消耗5-10cc/天/小鼠，具有 2.5-25微克/天DMSO含量，使用每只小鼠18g的平均体重，消耗估 计为700-1,400ug/kg/天)。
在第二系列试验中，将按照下面总结的方案，测定用活性化合物 处理的子宫内(in utero)效果。
方案2：
1)受孕后3天，怀孕的母鼠(Plugged dam)将在下面组之一中接 受处理：
A)暴露于80ppm H2S 8小时/天；
B)不暴露；或者
C)给予具有0.25％二甲硫醚(DMSO)的水，并允许随意饮用 (来自先前研究估计值暗示小鼠将消耗5-10cc/天/小鼠，具有2.5-25 微克/天DMSO含量。使用每只小鼠18g的平均体重，消耗估计为 700-1,400ug/kg/天)。
2)将允许怀孕的母鼠自然生产，并在生产后不久鉴定幼崽的基因 型并且将其处死用于详细的分析。
将在这些试验的整个过程中监测试验动物，如下面指出的。
监测：
1)初始研究：
1.网织红细胞计数；
2.血涂片；
3.脾和骨骼的计算机断层摄影(CT)；
4.O2消耗和CO2产生；
5.体重；
6.硫化物代谢产物和
7.血细胞比容(60μl血液总量)。
2)在两周时：网织红细胞计数和血涂片(5μl血液)。
3)每月一次的研究：
1.网织红细胞计数；
2.脾和骨骼的计算机断层摄影；
3.O2消耗和CO2产生；
4.体重；和
5.硫化物代谢产物(抽取的血液少于30μl)。
4)在处死前一个月：红细胞存活研究。
5)处死和详细的体外分析。
实施例21：
对于镰状细胞性贫血的应用
为了检验这种假设，将使用镰状细胞性贫血(SCD)的小鼠模型， 在该小鼠模型中品系经改造而使得其不再表达小鼠Hba和Hbb，但表 达人HBA和HBB(Patsy，等，1997)。其模拟在患有镰状细胞性贫 血的人中发现的基因、血液学和组织病理学特征，包括不可逆的镰状 化的红细胞、贫血和多器官病理学。显著百分比的镰状细胞小鼠不会 存活到成年期。
使用该小鼠模型，将检测多种试剂和含有硫化物的化合物对抗 SCD的效力。暴露将是急性的和慢性的，并且动物将在出生时或在子 宫内暴露。对于子宫内暴露的幼崽存活到出生或存活到成年期将是测 量效力的一个终点。表型效果将通过网织红细胞计数、血细胞比容和 红细胞(RBC)半衰期测量(与野生型对照比较，其对于SCD通常 少20倍)来评价。
实施例21：
氰化物暴露试验
该实施例显示，当小鼠暴露于室内空气中的80ppm氰化物时， 它们逐渐减少它们的核心体温至约34℃。
这些代谢柔性研究的一个目标是鉴定可以减少氧消耗和保护动 物免受低氧损伤的化合物。先前，已经证明硫化氢(H2S)，一种有 效的氧消耗的抑制剂，可以减少代谢和保护小鼠和大鼠免于低氧损伤。 氰化氢(HCN)在许多方面类似于H2S，并且我们想用我们的代谢输 出量的测定法来了解其是否可以用于调节代谢。像H2S，HCN广泛用 于工业化学合成并且在许多生物系统(包括人)中发现了它。不知道 HCN是否仅仅是碳-氮代谢的副产物或者其是否具有特殊的生物学活 性。像H2S，HCN被认为通过与含有过渡金属的蛋白质例如氧化酶和 脱氢酶反应来起作用。HCN不与血红蛋白的成分强烈反应。
在人中，NIOSH IDLH(立即危害生命和健康的)值是50ppm。 OSHA PEL(可允许的暴露极限)TWA(8小时的时间加权平均值) 是10ppm。对于大鼠的LC50是143ppm 60分钟。
为了测量HCN对代谢的影响，将小鼠暴露于增加浓度的HCN(开 始为1ppm)。测量或评估氧气(O2)消耗、二氧化碳(CO2)产生、 核心体温(BCT)和行为。HCN的浓度以10ppm的增量增加直到观 察到对代谢的影响或动物看起来显示出痛苦的迹象。将对代谢的影响 定义为上面描述的任何测定值在少于10分钟内10％的变化。
发现当小鼠在室温下暴露于室内空气中的80ppm的氰化物时， 它们逐渐降低它们的核心温度至大约34℃。这不同于使用80ppm硫 化氢所见的降低，在使用80ppm硫化氢时核心温度降低至大约28℃。 而且，与暴露于硫化氢(大约2小时)比较，在暴露于氰化物的小鼠 中核心温度的恢复十分缓慢(大约14小时)。
检验了这样的假设：在氰化物中，缓慢的恢复(通过核心温度判 断)可以通过短暂的暴露于80ppm的硫化氢来救援。这是基于这样 的想法：一种保守的酶即硫氰酸生成酶(以及其它类似的酶)可能使 用硫化氢和氰化物来产生相对低毒性的物质硫氰酸。已经显示了硫氰 酸生成酶可以使用氰化物和硫代硫酸盐来产生硫氰酸。(Chen 1933)此 外，静脉内施用硫代硫酸盐是美国用于治疗氰化物中毒的护理标准。 发现在暴露于氰化物后恢复核心体温的时间通过用硫化氢短暂处理而 减少。这些结果提示，硫化氢暴露可被用于治疗其中患者遭受氰化物 中毒的状况。
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根据本公开内容，可以制备和执行所有在此公开和要求保护的 组合物和方法而不需要过度试验。虽然本发明的组合物和方法是根据 优选的实施方案来描述，对本发明的那些技术人员来说明显的是，可 以对所述的组合物和方法进行改变，以及在在此描述的方法的步骤或 步骤的顺序中进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更特别 地是，将明显的是可以用在化学和生理学两者上都相关的某些物质替 代在此描述的物质，同时将获得相同或类似的结果。对本领域技术人 员明显的所有该类似的取代和修饰被认为在由附带的权利要求定义的 本发明的精神、范围和概念内。
发明背景
本申请涉及都于2005年4月20日提交的美国临时专利申请 60/673,037和60/673,295，以及2005年8月31日提交的美国临时专利 申请60/713,073、2005年10月28日提交的美国临时专利申请 60/731,549和2006年1月26日提交的美国临时专利申请60/762,462， 通过参考将它们全文并入本文。
按照来自国立普通医学科学研究院(National Institute of General Medical Sciences，NIGMS)基金资助号GM048435，政府可能拥有本 发明中的权利。
参考文献
通过引用特别将下面的参考文献(在它们提供对在此列出的那些 的示例性的过程或其它细节的补充的程度上)并入本文中。
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