鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用
阅读：784发布：2023-01-16
专利汇可以提供鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种鼠抗人C1orf109单克隆 抗体 及其制备方法与应用，属于生命科学技术领域。技术方案为：利用人胚肾细胞扩增C1orf109基因；制备重组表达载体PET28a-C1orf109；转化大肠杆菌；诱导获得C1orf109蛋白；免疫BALB/c小鼠，细胞融合；接种BALB/c小鼠，制备腹 水 ，提取并纯化得到鼠抗人C1orf109单克隆抗体。本发明提供的鼠抗人C1orf109单克隆抗体，可与C1orf109蛋白特异性结合，具有高 亲和性 和高特异性。可以检测人源调控细胞死亡的C1orf109蛋白的诱导细胞死亡的同源区序列，与多克隆抗体相比，显著提高了C1orf109蛋白免疫检测的特异性和可靠性。，下面是鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种鼠抗人C1orf109单克隆抗体，其特征在于：来源于人HEK293细胞C1orf109基因的编码序列，包括C1orf109蛋白四种变异体的同源区，所述同源区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述鼠抗人C1orf109单克隆抗体的制备方法，其特征在于：
步骤一、提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA，通过逆转录PCR的方法将总RNA逆转录成cDNA，以该cDNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对，通过PCR扩增得到C1orf109基因；
步骤二、采用双酶切连接体系，将步骤一得到的C1orf109基因连接到带有His标签pET28a质粒，得到重组表达载体pET28a-C1orf109；
步骤三、将步骤二得到的重组表达载体pET28a-C1orf109转化大肠杆菌BL21感受态细胞，筛选阳性克隆；
步骤四、步骤三所得阳性克隆IPTG诱导原核体外表达系统，获得C1orf109蛋白多肽，并纯化获得C1orf109蛋白；
步骤五、将步骤四得到的纯化C1orf109蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合，获得能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞株；
步骤六、将步骤五获得的能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取并纯化得到鼠抗人C1orf109单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤二所述双酶切连接体系，使用的酶是T4连接酶。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤四所述纯化，具体为：
(1)15000rpm，4℃15min离心，取沉淀；取50mL菌体重悬Buffer I重悬沉淀，15000rpm，4℃15min离心，重复此步骤，3-4次，最终取沉淀；所述菌体重悬Buffer I含25mM Tris-HCl、
2M尿素、2％Triton X-100、50mM NaCl、3mM DTT、1mM EDTA，pH8.0；
(2)取50mL重悬Buffer II重悬步骤(1)所得沉淀，并于4℃15000rpm 15min，取沉淀；所述重悬Buffer II含25mM Tris-HCl、1-0.5M NaCl、0.05mM TCEP；
(3)取30mL重悬Buffer II重悬步骤(2)所得沉淀，再将其加入Buffer Ⅲ中溶解5h，所述Buffer Ⅲ含25mM Tris-HCl、50mM NaCl、2M尿素、0.05mM TCEP，pH 8.0；
(4)将该溶解液于15000rpm 4℃离心40min,取上清；
(5)将上清加入Ni-co柱；
(6)洗柱：加入50mL洗脱Buffer；所述洗脱Buffer含25mM Tris-HCl、50mM NaCl、15mM咪唑、0.05mM TCEP、8M尿素，pH 8.0；
(7)洗脱：加5mL洗脱Buffer，孵育25min后收集，之后再用2mL洗脱Buffer洗脱并收集。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤五所述细胞融合，具体操作为：取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，加入促融合剂，使细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的细胞个数比为1:5-1:10。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述促融合剂为聚乙二醇，使用的分子量为4000，质量浓度为50％。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤六所述纯化方法为Protein A亲和层析法，具体操作为Protein A亲和柱用PBS平衡，取抗小鼠腹水过柱，PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/L pH 2.5的甘氨酸-HCl溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液。
9.一种权利要求1所述鼠抗人C1orf109单克隆抗体在C1orf109蛋白检测中的应用。
鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生命科学技术领域，具体涉及发明一种鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
[0002] C1orf109(chromosome 1open reading frame 109)是前期研究中通过生物信息技术、RACE(RapidAmplification ofcDNAEnds)技术获得的一个功能未知基因，该基因定位于人1号染色体短臂3区4带3亚带(1p34.3)，此区域是一个细胞增殖与细胞周期调控相关基因密集区。根据NCBI中相关序列信息的提示，C1orf109由于可变剪接以及基因插入等原因可以产生多个长度不同的转录本。主要的四种转录本编码蛋白的氨基酸长度分别为203、218、265、280，分子量分别为22.3kDa，23.9kDa，29.1kDa和30.8kDa。通过分析预测其等电点为5.44，无N端信号肽，具有多个潜在的磷酸化位点并具有糖基化等翻译后修饰。
[0003] 研究证实，C1orf109的四种转录本中存在第一外显子的变异和四-五外显子之间的可变剪切，结果造成编码的氨基酸1-62位的有或无以及羧基端的变异。280转录本的第63位至215位氨基酸残基区为四个转录本的同源区。同时研究还显示C1orf109的280转录本在多种上皮细胞中维持低水平的表达，但当其在细胞内高表达时可以诱导细胞死亡。四种转录本在细胞内分布呈多样性，203，218和265转录本在细胞核和细胞质中均有分布，在细胞核内呈点状分布，在细胞核周围呈现弥散样分布。而280转录本绝大部分分布于细胞核中，提示其可能发挥转录调控的作用。
[0004] 目前，国外相关生物公司已经有商品化C1orf109多克隆抗体，但经过western实验验证均不能有效识别内源性C1orf109蛋白。本课题组尝试利用原核表达的C1orf109蛋白与佐剂乳化后通过皮下注射的方法免疫家兔后，采血分离血清经纯化后得到兔源多克隆抗体，但是依然无法有效识别内源性C1orf109蛋白。并且，由于C1orf109存在多个转录本的情况，给抗体的识别造成了较大的困难。鉴于C1orf109的生物学功能并没有完全得到揭示，因此获得具有较高特异性的C1orf109单克隆抗体对于后续的科学研究具有重要意义。
发明内容
[0005] 为解决上述问题，本发明针对C1orf109四种转录本的同源区，提供了一种高亲和性的、可用于科学研究中检测C1orf109表达的小鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用。
[0006] 本发明所述鼠抗人C1orf109单克隆抗体可与C1orf109蛋白特异性结合，与多克隆抗体相比，显著提高了C1orf109蛋白免疫检测的特异性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤细胞和组织中C1orf109不同转录本的检测。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：
[0008] 首先，本发明所提供的鼠抗人C1orf109单克隆抗体，来源于人HEK293细胞C1orf109基因的编码序列，包括C1orf109蛋白四种变异体的同源区，所述同源区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0009] 其次，本发明提供的上述鼠抗人C1orf109单克隆抗体制备方法如下：
[0010] 步骤一、提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA，通过逆转录PCR的方法将总RNA逆转录成cDNA，以该cDNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对，通过PCR扩增得到C1orf109基因；
[0011] 步骤二、采用双酶切连接体系，将步骤一得到的C1orf109基因连接到带有His标签pET28a质粒，得到重组表达载体pET28a-C1orf109；
[0012] 步骤三、将步骤二得到的重组表达载体pET28a-C1orf109转化大肠杆菌BL21感受态细胞，筛选阳性克隆；
[0013] 步骤四、步骤三所得阳性克隆IPTG诱导原核体外表达系统，获得C1orf109蛋白多肽，并纯化获得C1orf109蛋白；
[0014] 步骤五、将步骤四得到的纯化C1orf109蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合和筛选，获得能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞株；
[0015] 步骤六、将步骤五获得的能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取并纯化得到鼠抗人C1orf109单克隆抗体。
[0016] 步骤二所述双酶切连接体系，使用的酶是T4连接酶。
[0017] 步骤四所述纯化，具体为：
[0018] (1)15000rpm，4℃15min离心，取沉淀；取50mL菌体重悬Buffer I重悬沉淀，15000rpm，4℃15min离心，重复此步骤，3-4次，最终取沉淀；所述菌体重悬Buffer I含
25mMTris-HCl、2M尿素、2％Triton X-100、50mM NaCl、3mM DTT、1mM EDTA，pH 8.0；
25mMTris-HCl、2M尿素、2％Triton X-100、50mM NaCl、3mM DTT、1mM EDTA，pH 8.0；
[0019] (2)取50mL重悬Buffer II重悬步骤(1)所得沉淀，并于4℃15000rpm 15min，取沉淀；所述重悬Buffer II含25mM Tris-HCl、0.5M NaCl、0.05mM TCEP；
[0020] (3)取30mL重悬Buffer II重悬步骤(2)所得沉淀，再将其加入BufferⅢ中溶解5h，所述BufferⅢ含25mM Tris-HCl、50mMNaCl、2M尿素、0.05mM TCEP，pH 8.0；
[0021] (4)将该溶解液于15000rpm 4℃离心40min,取上清；
[0022] (5)将上清加入Ni-co柱；
[0023] (6)洗柱：加入50mL洗脱Buffer；所述洗脱Buffer含25mM Tris-HCl、50mM NaCl、15mM咪唑、0.05mM TCEP、8M尿素，pH 8.0；
[0024] (7)洗脱：加5mL洗脱Buffer，孵育25min后收集，之后再用2mL洗脱Buffer洗脱并收集。通过SDS-PAGE检测纯化后蛋白纯度达到95％以上。
[0025] 步骤五所述细胞融合，具体操作为：取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，加入促融合剂，使细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。所述SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的细胞个数比为1:5-1:10。所述促融合剂为聚乙二醇，使用的分子量为4000，质量浓度为50％。
[0026] 步骤六所述纯化方法为ProteinA亲和层析法，具体操作为ProteinA亲和柱用PBS平衡，取抗小鼠腹水过柱，PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LpH 2.5的甘氨酸-HCl溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液。
[0027] 步骤五所述免疫BALB/c小鼠，需要在三次免疫后，经过加强免疫。
[0028] 上述制备方法制备的单克隆抗体，通过SDS-PAGE检测抗体的纯度，纯化后抗体纯度在95％以上；采用ELISA滴度测定单抗的效价，单抗的滴度均在1:10000以上(见表1)[0029] 表1 C1orf109单克隆抗体ELISA检测结果
[0030]
[0031] 最后，本发明还提供了上述鼠抗人C1orf109单克隆抗体在C1orf109蛋白检测中的应用。
[0032] 利用上述抗体对多种肺癌、乳腺癌和正常细胞进行western检测，从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的C1orf109单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的C1orf109蛋白具有高识别能力，可用于科研实验中检测C1orf109蛋白。
[0033] 有益效果：
[0034] (1)本发明提供的鼠抗人C1orf109单克隆抗体，可与C1orf109蛋白特异性结合，具有高亲和性和高特异性。可以检测人源调控细胞死亡的C1orf109蛋白的诱导细胞死亡的核心肽段序列。本发明所述单克隆抗体与多克隆抗体相比，显著提高了C1orf109蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
[0035] (2)所述的鼠抗人C1orf109蛋白单克隆抗体采用亲和层析纯化，其纯度达到95％以上。
[0037] 图1.C1orf109原核表达产物经过亲和纯化后SDS-PAGE电泳结果；
[0038] 图2.C1orf109多转录本示意图；
[0039] 图3.C1orf109单克隆抗体用于检测肿瘤细胞内源性C1orf109蛋白的印迹杂交结果；
[0040] 图4.IPTG诱导原核体外表达系统与操作流程示意图。
具体实施方式
[0041] 实施例1鼠抗人C1orf109单克隆抗体的制备
[0042] 步骤一、提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA，通过逆转录PCR的方法将总RNA逆转录成cDNA，以该cDNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对，通过PCR扩增得到C1orf109基因；
[0043] 所述RNA提取，使用的试剂盒为Invitrogen公司TRIZOL RNA提取试剂；所述逆转录，使用的试剂盒为TaKaRaPrimeScriptTMRT Reagent Kit Lot#AK4802。
[0044] PCR体系为50μL
[0045] PCR程序为95℃5min,95℃10s 60℃5s,72℃1min 72℃5min,4℃45min 30cycles[0046] PCR扩增后回收产物C1orf109基因片段大小为609bp。
[0047] 步骤二、采用双酶切连接体系，将步骤一得到的C1orf109基因连接到带有His标签pET28a质粒，得到重组表达载体pET28a-C1orf109；
[0048] 使用的核酸内切酶是EcoRI和XhoI。
[0049] 酶切体系为20μL。
[0050] 酶切条件为37℃1h。
[0051] 酶切C1orf109基因和pET28a质粒后回收片段大小分别为609bp和5300bp[0052] 连接体系为20μL。
[0053] 连接条件为22℃1h。
[0054] 步骤三、将步骤二得到的重组表达载体pET28a-C1orf109转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆；
[0055] 所述筛选阳性克隆，具体操作为：将转化之后37℃活化1h的DH5α涂布在含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜，次日可见平板上有单克隆菌落，之后挑取2-3个菌落于液体LB培养基中活化后1h后接种到含有氨苄抗性的LB培养基中培养过夜，次日提取重组质粒，测序。
[0056] 步骤四、步骤三所得测序正确的pET28a-C1orf109转化转化大肠杆菌BL21感受态，次日挑取克隆，于液体LB培养基中活化后1h后接种到含有氨苄抗性的LB培养基中培养过夜至OD＝0.8，之后通过IPTG诱导获得C1orf109蛋白多肽，并纯化获得C1orf109蛋白；
[0057] 所述IPTG诱导原核体外表达系统与操作流程如图4所示：
[0058] (1)转化：取重组体质粒1-2μL加入感受态细胞中，冰上孵育30min之后42℃热激60s，取出后冰上放置5min，之后加入1mL LB培养基37℃150rpm活化1h，之后取出8000rpm离心2min，收集菌体去上清加入1mL LB重悬，从中取出100μL涂板，37℃过夜。
[0059] (2)诱导表达：挑去单克隆菌于1mL LB中活化2h，之后加入3mL带抗性的LB培养基中培养2h后加入IPTG 25℃150rpm培养20h。
[0060] (3)鉴定表达：收集步骤2中的菌体，超声破碎离心取上清(对照组为不加IPTG诱导组)，SDS-PAGE检测表达量，western-blot确认目的蛋白。
[0061] (4)扩大培养：挑去单克隆菌于1mL LB中活化2h，之后加入3mL带抗性的LB培养基中220rpm培养过夜，之后将10mL菌液加入1L带抗性的LB培养基中37℃220rpm2h，[0062] 之后加入150μL IPTG(终浓度0.5mM)25℃150rpm 20h。
[0063] (5)取出步骤4中3mL菌液离心后，去培养基，加入loadingbuffer煮样后SDS-PGAE。
[0064] (6)步骤4中的菌液8000rpm离心，吸出剩余LB，在沉淀中加入30mL(25mM Tris pH8.01-0.5M NaCl)重悬和300μL溶菌酶(终浓度0.1mg/mL)室温消化30min，之后超声破碎(30％功率，6次)。4℃15000rpm离心40min，弃上清。
[0065] 步骤四所述纯化，具体为：
[0066] (1)15000rpm，4℃15min离心，取沉淀；取50mL菌体重悬Buffer I重悬沉淀，15000rpm，4℃15min离心，重复此步骤，3-4次，最终取沉淀；所述菌体重悬Buffer I含25mM Tris-HCl、2M尿素、2％Triton X-100、50mM NaCl、3mM DTT、1mM EDTA，pH 8.0；
[0067] (2)取50mL重悬Buffer II重悬步骤(1)所得沉淀，并于4℃15000rpm 15min，取沉淀；所述重悬Buffer II含25mM Tris-HCl、1-0.5M NaCl、0.05mM TCEP；
[0068] (3)取30mL重悬Buffer II重悬步骤(2)所得沉淀，再将其加入BufferⅢ中溶解5h，所述BufferⅢ含(25mM Tris-HCl、50mM NaCl、2M尿素、0.05mM TCEP，pH8.0；
[0069] (4)将该溶解液于15000rpm 4℃离心40min,取上清；
[0070] (5)将上清加入Ni-co柱；
[0071] (6)洗柱：加入50mL洗脱Buffer；所述洗脱Buffer含25mM Tris-HCl、50mM NaCl、15mM咪唑、0.05mM TCEP、8M尿素，pH 8.0；
[0072] (7)洗脱：加5mL洗脱Buffer，孵育25min后收集，之后再用2mL洗脱Buffer洗脱并收集。
[0073] 通过SDS-PAGE检测纯化后蛋白纯度达到95％以上。
[0074] 步骤五、将步骤四得到的纯化C1orf109蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合和ELISA筛选，获得能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞株；
[0075] 步骤五所述细胞融合，具体操作为：取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，加入促融合剂，使细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。所述SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的细胞个数比为1:5。所述促融合剂为聚乙二醇，使用的分子量为4000，质量浓度为50％。
[0076] 步骤五所述免疫BALB/c小鼠，需要在三次免疫后，再经过加强免疫。
[0077] 步骤五具体操作为：
[0078] 动物免疫，采血测试和评价：
[0079] 选用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠5只，按照预先制订的免疫方案进行三次免疫注射。
[0080] 首次免疫。纯化的重组蛋白C1orf109(用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
[0081] 二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白C1orf109(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
[0082] 三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白C1orf109(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
[0083] 三次免疫后7、10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合；
[0084] 三次免疫后一周尾静脉采血分离血清用ELISA测抗体效价，选择抗体效价最高的小鼠加强免疫。
[0085] 加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50μg腹腔注射。3天后取脾脏融合。细胞融和，筛选，阳性克隆扩增：
[0086] 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨制备脾细胞悬液。将准备好的SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合(细胞个数比1:5)，并加入质量浓度为50％的促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。
[0087] 用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以纯化的C1orf109蛋白(10μg/mL)包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。甩掉包被液，加入200μL 5％的脱脂奶粉，37℃封闭1小时后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100μL(阴性对照为PBS 100μL)，37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μL，室温静置5分钟，加终止液50μL。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗C1orf109杂交瘤细胞株。
[0088] 将选出的阳性杂交瘤细胞株克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。
[0089] 步骤六、将步骤五获得的能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取并纯化得到鼠抗人C1orf109单克隆抗体。
[0090] 单克隆抗体的大量制备与纯化：
[0091] 将上述获得的杂交瘤细胞株接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。
[0092] 单克隆抗体C1orf109的纯化：采用ProteinA亲和层析法。首先制备ProteinA亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗C1orf109的小鼠腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LpH 2.5的甘氨酸-HCl溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95％以上。步骤六所述纯化方法为ProteinA亲和层析法，具体操作为：取含有本抗体的小鼠腹水(参照1mLProteinA约结合14mg抗体计算)将小鼠腹水于4℃10000rpm离心20分钟，去除碎片。上清再经0.45μm滤膜过滤去除未沉降的杂质蛋白，再用10mM的NaOH调节上清的pH值至7.0。ProteinA亲和层析柱使用0.1M PB磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行平衡，充分去除乙醇和杂质，平衡至OD280<0.01。将处理过的样本液以流速
1mL/min过柱，保持样本温度与柱床温度一致。然后对纯化柱进行洗涤和洗脱，保留待检样本。纯化后样本进行检测分析。
1mL/min过柱，保持样本温度与柱床温度一致。然后对纯化柱进行洗涤和洗脱，保留待检样本。纯化后样本进行检测分析。
[0093] 直接ELISA法测定纯化抗体的滴度：以纯化的C1orf109蛋白(10μg/mL)包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。甩掉包被液，加入200μL 5％的脱脂奶粉，37℃封闭l小时后，洗涤3次，将纯化的抗体按1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800进行稀释，以每孔100μL加入酶标板中(阴性对照为PBS 100μL)，37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μL，室温静置5分钟，加终止液50μL。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上。
[0094] 实施例2C1orf109单克隆抗体用于检测肿瘤细胞内源性C1orf109蛋白
[0095] 首先在60mm细胞培养皿中，利用含有10％血清的DMEM培养基进行HeLa、A375和293T细胞的培养，在细胞汇合率达到70％左右时，进行细胞收获和蛋白的提取，将培养基吸出后，在各皿中加入100μL的RIPA细胞裂解液(150mM NaCl,1％NP-40,1％sodium deoxycholate,0.1％SDS,25mM Tris-HCl pH 7.6)置于冰上，利用细胞刮在尽量短时间内将细胞刮下并转移到1.5mL EP管中，在冰上裂解30min，期间涡旋震动4-5次，然后在4℃
12000rpm离心10min，吸取上清后转移到新的EP管中，利用Lowry法进行蛋白定量后，加入25μL的5x loadingbuffer混匀，在95℃加热10min即可进行蛋白电泳检测。根据蛋白定量的结果，在预制的SDS-PAGE胶内加入蛋白marker和适量的蛋白裂解液，安装好蛋白电泳系统后以120V恒压进行电泳直到蛋白marker完全分散开即可停止。将PAGE胶取下浸入转膜液中，准备大小合适的PVDF膜，利用甲醇激活后，按照顺序夹紧滤纸PVDF膜和PAGE胶后插入到转膜槽内，加入转膜液连接好转膜装置，100V恒压转膜60min左右。取出转好的PVDF膜，置于
10％脱脂牛奶中封闭1h，用TBST洗净PVDF膜后，加入适当比例稀释的C1orf109内源性抗体，在4℃摇床孵育过夜。第二天将膜取出后，利用TBST洗膜3次，每次10min，将非特异性结合的抗体充分洗去。加入1:5000稀释的山羊抗鼠荧光标记二抗在室温孵育1h，再利用TBST洗膜3次，每次10min。最后利用可识别荧光标记蛋白的western-blot扫描仪进行western显影。结果如图3所示，内源性C1orf109蛋白分子量在35kDa和40kDa蛋白marker之间，说明C1orf109单克隆抗体可特异性识别三种细胞系的内源性C1orf109蛋白。
12000rpm离心10min，吸取上清后转移到新的EP管中，利用Lowry法进行蛋白定量后，加入25μL的5x loadingbuffer混匀，在95℃加热10min即可进行蛋白电泳检测。根据蛋白定量的结果，在预制的SDS-PAGE胶内加入蛋白marker和适量的蛋白裂解液，安装好蛋白电泳系统后以120V恒压进行电泳直到蛋白marker完全分散开即可停止。将PAGE胶取下浸入转膜液中，准备大小合适的PVDF膜，利用甲醇激活后，按照顺序夹紧滤纸PVDF膜和PAGE胶后插入到转膜槽内，加入转膜液连接好转膜装置，100V恒压转膜60min左右。取出转好的PVDF膜，置于
10％脱脂牛奶中封闭1h，用TBST洗净PVDF膜后，加入适当比例稀释的C1orf109内源性抗体，在4℃摇床孵育过夜。第二天将膜取出后，利用TBST洗膜3次，每次10min，将非特异性结合的抗体充分洗去。加入1:5000稀释的山羊抗鼠荧光标记二抗在室温孵育1h，再利用TBST洗膜3次，每次10min。最后利用可识别荧光标记蛋白的western-blot扫描仪进行western显影。结果如图3所示，内源性C1orf109蛋白分子量在35kDa和40kDa蛋白marker之间，说明C1orf109单克隆抗体可特异性识别三种细胞系的内源性C1orf109蛋白。
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