抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法及其应用
阅读：806发布：2023-01-20
专利汇可以提供抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种抗小鼠MXRA7单克隆 抗体 的制备方法及其应用，抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2017142的杂交瘤细胞株产生，制备方法包括以下步骤：（1）用带有酶切位点的引物扩增MXRA7 蛋白质 编码基因，并将其克隆到原核表达载体中，经菌体表达纯化融合蛋白质；（2）用纯化的融合蛋白质作为 抗原 免疫小鼠，制备阳性杂交瘤细胞，将阳性细胞打到小鼠 腹腔 中获得小鼠腹 水 ，将腹水进行纯化获得单克隆抗体；（3）纯化MXRA7单克隆抗体并验证其特异性。通过本发明的方法制备的MXRA7蛋白质单克隆抗体效价高、 稳定性 好、特异性强，可用于免疫学检测，从而为全方位探究MXRA7蛋白质功能提供了可靠便利的研究工具。，下面是抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法及其应用专利的具体信息内容。
1. 一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2017142的杂交瘤细胞株分泌产生；
所述制备方法包括以下步骤：
（1）以化学合成的MXRA7蛋白质编码基因SEQ ID NO.3为模板，使用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2对模板进行扩增获得两端带有酶切位点的鼠MXRA7蛋白质编码基因，并将其克隆到原核表达载体pCold-SUMO中构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细胞；
（2）将感受态细胞进行培养表达，得到SUMO-MXRA7融合蛋白，并对SUMO-MXRA7融合蛋白；
（3）将纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白免疫Balb/c 小鼠后，测定小鼠血清效价，取其脾脏制备脾细胞悬液；将同系的SP2/0细胞与小鼠脾细胞融合制备SP2/0杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的SP2/0杂交瘤细胞；
（4）采用体外细胞培养法培养步骤（3）所述的阳性SP2/0杂交瘤细胞，将该阳性细胞打到小鼠腹腔中获得小鼠腹水，将腹水进行纯化获得鼠单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中上游引物含有扩增出带KpnI酶切位点的片段GGTACC、下游引物含有扩增出带BamHI酶切位点的片段GGATCC，使用上游引物和下游引物对质粒进行PCR扩增完毕后，取5μLPCR产物，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，将剩余PCR产物利用PCR clean试剂盒进行纯化，将回收产物用KpnI、BamHI进行双酶切，酶切结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；使用KpnI、BamHI双酶切系统对表达载体pCold-SUMO进行双酶切，使其成为线性片段，酶切结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；使用T4 DNA连接酶，将酶切后的MXRA7编码基因与pCold-SUMO质粒的凝胶回收产物在16℃条件下进行连接反应3h，将连接产物转化DH5a感受态，涂板后，次日，挑取单克隆菌落，进行菌落PCR后进行凝胶电泳，筛选出阳性菌落克隆；提取阳性菌落的重组表达质粒，并将其转入BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达，纯化后获得SUMO-MXRA7融合蛋白。
3. 根据权利要求2所述的一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将所述BL21(DE3)感受态细胞接入含浓度为50μg/mL Amp的LB培养液中，37℃过夜培养；吸取50μL过夜培养物接入5mL含浓度为50μg/mL Amp的LB培养液中，37℃ 200rpm振荡培养至OD600为0.6-0.7；加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.5mM，16℃诱导24小时，将菌液进行离心并收集上清液，将收集的上清液用镍柱NTA树脂进行柱层析纯化，得到纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白。
4.权利要求1 3任一项所述的制备方法制备的抗小鼠MXRA7单克隆抗体在生物检测中~
的应用。
抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法及其应用
技术领域
背景技术
[0002] MXRA7是一种位于小鼠第11号染色体上的单拷贝基因，其编码氨基酸的分子量约为20KDa。该基因最初是2002年Walker等通过生物信息学分析时发现有8条cDNA总是跟一组与基质重建相关的基因（主要包括Mmps，Timps等）共同表达，于是将这8条cDNA依次命名为MXRA1～8。目前为止，虽然某些成员已被成功克隆并进行了功能研究，但仍没有关于MXRA7的任何功能性研究报道。本课题组近年来证实该基因具有以下特性：（1）该基因在多种肿瘤组织及正常组织中表达有区别；过表达MXRA7明显抑制小鼠前列腺癌细胞的增殖及肿瘤的发生、转移，提示MXRA7不但可作为肿瘤标记物，本身还可抑制肿瘤的发生发展，可能成为理想的肿瘤靶向治疗分子；（2）该基因敲除后影响组织修复能力；（3）同时该基因与血管新生、免疫重建等有密切关联。因此制备以小鼠MXRA7为靶点的单克隆抗体，对进一步探究MXRA7的生理病理功能有重要意义。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体SZ181的制备方法，SZ181是根据实验室的抗体库进行的编号，该抗体由Balb/c小鼠的杂交瘤细胞株SP2/0-MXRA7分泌产生，，并证明所述单克隆抗体SZ181可用于检测小鼠各组织内MXRA7蛋白质的表达，为小鼠MXRA7功能研究提供了有用的工具。
[0004] 为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，由保藏编号为CCTCC NO:C2017142的杂交瘤细胞株分泌产生；
所述MXRA7单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）以化学合成的MXRA7蛋白质编码基因SEQ ID NO.3为模板，使用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2对模板进行扩增获得两端带有酶切位点的鼠MXRA7蛋白质编码基因，并将其克隆到原核表达载体pCold-SUMO中构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细胞；
（2）将感受态细胞进行培养表达，得到SUMO-MXRA7融合蛋白，并对SUMO-MXRA7融合蛋白进行纯化；
（3）将纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白免疫Balb/c 小鼠后，测定小鼠血清效价，取其脾脏制备脾细胞悬液；将同系的SP2/0细胞与小鼠脾细胞融合制备SP2/0杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的SP2/0杂交瘤细胞；
（4）采用体外细胞培养法培养步骤（3）所述的阳性SP2/0杂交瘤细胞，将该阳性细胞打到小鼠腹腔中获得小鼠腹水，将腹水进行纯化获得鼠单克隆抗体。
所述MXRA7单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）以化学合成的MXRA7蛋白质编码基因SEQ ID NO.3为模板，使用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2对模板进行扩增获得两端带有酶切位点的鼠MXRA7蛋白质编码基因，并将其克隆到原核表达载体pCold-SUMO中构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细胞；
（2）将感受态细胞进行培养表达，得到SUMO-MXRA7融合蛋白，并对SUMO-MXRA7融合蛋白进行纯化；
（3）将纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白免疫Balb/c 小鼠后，测定小鼠血清效价，取其脾脏制备脾细胞悬液；将同系的SP2/0细胞与小鼠脾细胞融合制备SP2/0杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的SP2/0杂交瘤细胞；
（4）采用体外细胞培养法培养步骤（3）所述的阳性SP2/0杂交瘤细胞，将该阳性细胞打到小鼠腹腔中获得小鼠腹水，将腹水进行纯化获得鼠单克隆抗体。
[0005] 本发明所述的一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，所述步骤（1）中上游引物含有扩增出带KpnI酶切位点的片段GGTACC、下游引物含有扩增出带BamHI酶切位点的片段GGATCC，使用上游引物和下游引物对质粒进行PCR扩增完毕后，取5μLPCR产物，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，将剩余PCR产物利用PCR clean试剂盒进行纯化，将回收产物用KpnI、BamHI进行双酶切，酶切结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；使用KpnI、BamHI双酶切系统对表达载体pCold-SUMO进行双酶切，使其成为线性片段，酶切结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；使用T4 DNA连接酶，将酶切后的MXRA7编码基因与pCold-SUMO质粒的凝胶回收产物在16℃条件下进行连接反应3h，将连接产物转化DH5a感受态，涂板后，次日，挑取单克隆菌落，进行菌落PCR后进行凝胶电泳，筛选出阳性菌落克隆；提取阳性菌落的重组表达质粒，并将其转入BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达，纯化后获得SUMO-MXRA7融合蛋白。
[0006] 本发明所述的一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法中，将所述BL21(DE3)感受态细胞接入含浓度为50μg/mL Amp的LB培养液中，37℃过夜培养；吸取50μL过夜培养物接入5mL含浓度为50μg/mL Amp的LB培养液中，37℃ 200rpm振荡培养至OD 600为0.6-0.7；加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度0.5mM，16℃诱导24小时，将菌液进行离心并收集上清液，将收集的上清液用镍柱NTA 树脂进行柱层析纯化，得到纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白。
[0007] 本发明所述的抗小鼠MXRA7的单克隆抗体SZ181在生物检测中的应用：1、收集小鼠各正常组织，制作石蜡切片，验证所述MXRA7单克隆抗体SZ181对小鼠正常组织中表达的MXRA7蛋白的检测效果。
[0008] 2、提取小鼠各正常组织的总蛋白，并对所提取的总蛋白进行Western blot 试验，验证所述鼠抗鼠MXRA7单克隆抗体SZ181对小鼠各组织中表达的MXRA7蛋白的检测效果。
[0009] 3、收集MXRA7过表达的小鼠肝癌细胞Hepa1-6-MXRA7及对照细胞，利用流式细胞术，验证所述鼠抗鼠MXRA7单克隆抗体SZ181对小鼠肝癌细胞中表达的HCRCN81蛋白的检测效果。
[0010] 实验结果表明，本发明所述鼠抗鼠MXRA7单克隆抗体SZ181对小鼠正常组织和细胞中所表达的MXRA7天然蛋白均具有检测作用，可作为进一步研究小鼠MXRA7功能的重要工具。
[0011] 有益效果：本发明首次制备了SP2/0-MXRA7杂交瘤细胞，并提供了一种新型鼠抗鼠MXRA7单克隆抗体SZ181，该抗体能够检测小鼠组织中MXRA7蛋白表达的存在与否，并证实该抗体可应用于蛋白免疫印迹、免疫组化和流式细胞术，为全方位探究MXRA7蛋白功能提供了可靠便利的研究工具；同时该抗体还可识别大鼠MXRA7蛋白，为MXRA7蛋白在不同物种间的比较研究提供了可能。生物保藏说明
杂交瘤细胞株MXRA7 于2017 年08月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:C2017142。
附图说明
杂交瘤细胞株MXRA7 于2017 年08月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:C2017142。
附图说明
[0012] 图1 PCR扩增带相应酶切位点的MXRA7目的片段的琼脂糖凝胶电泳图，图中各泳道为：1、Marker，2、PCR产物。
[0014] 图3 SUMO-MXRA7融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中的诱导表达及纯化后的SDS-PAGE图，图中各泳道为：1、Marker，2、未诱导表达的纯化液，3、诱导表达的纯化液，4、菌体裂解沉淀，5、菌体裂解上清，6、流穿液，7、Binding Buffer，8、Elute Buffer。
[0015] 图4 质谱结果显示纯化后的融合蛋白比对结果为MXRA7蛋白。其中Top score显示其与MXRA7序列一致。
[0016] 图5 抗体效价及特异性检测结果图。图A，ELISA检测SZ181的抗体效价，抗体对应的稀释倍数为1600-102400倍，每二倍比依次稀释，阴性对照为小鼠IgG蛋白。图B，Western blot检测SZ181的识别特异性。其中泳道1：纯化的SUMO-MXRA7融合蛋白；泳道2：WT小鼠的肝组织蛋白。图C，Western blot检测SZ181识别位点位于MXRA7一号外显子。其中泳道1：对照组为GST蛋白；泳道2：纯化的GST-MXRA7外显子1蛋白；泳道3：纯化的GST-MXRA7外显子2-4蛋白。图D，SUMO-MXRA7融合蛋白对SZ181识别位点竞争抑制实验，其中泳道1：对照组为WT小鼠的肝组织蛋白；泳道2：等量的小鼠肝组织蛋白与一抗及25 μg Sumo-MXRA7蛋白共同孵育；泳道3：等量的小鼠肝组织蛋白与一抗及50 μg SUMO-MXRA7融合蛋白共同孵育。
[0017] 图6 抗体检测大鼠组织中MXRA7表达的Western blot图。
[0018] 图7 抗体检测小鼠组织中MXRA7表达的Western blot图。其中图A是一次典型的Western blot图，图B是两次结果的灰度统计分析柱状图。
[0019] 图8 抗体检测小鼠组织中MXRA7表达的免疫组化图。
[0020] 图9 抗体检测小鼠细胞中MXRA7表达的免疫荧光图。
[0021] 图10 抗体检测小鼠细胞中MXRA7表达的流式细胞术图。
具体实施方式
[0022] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0023] 实施例1小鼠MXRA7的原核重组表达质粒的构建本发明为了获得亲和力高、特异性好的单克隆抗体，首先在原核生物中表达免疫抗原MXRA7蛋白。以化学合成的MXRA7蛋白质编码基因SEQ ID NO.3为模板（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成），扩增带KpnI及BamHI酶切位点的目的片段，上游引物SEQ ID NO.1中含有KpnI内切酶酶切位点（GGTACC），下游引物SEQ ID NO.2中含有BamHI内切酶酶切位点（GGATCC）。（KpnI 和BamHI，购自Takara）
利用PCR技术对MXRA7蛋白质编码基因SEQ ID NO.3片段进行扩增，具体反应体系及反应条件如下：
10× PCR Buffer 2 μL
dNTP (各2.5mM) 1.6 μL
cDNA模板 2 μL
正向引物(10 mM) 0.5 μL
反向引物(10 mM) 0.5 μL
rTaq（5U/μL） 0.2 μL
H2O 13.2 μL
总体体积（μL） 20 μL
反应条件：（1）94℃预变性5 min；（2）94℃变性30s ；（3）55℃退火30s；（4）72℃延伸
30s，共30个循环，72℃延伸5 min。
利用PCR技术对MXRA7蛋白质编码基因SEQ ID NO.3片段进行扩增，具体反应体系及反应条件如下：
10× PCR Buffer 2 μL
dNTP (各2.5mM) 1.6 μL
cDNA模板 2 μL
正向引物(10 mM) 0.5 μL
反向引物(10 mM) 0.5 μL
rTaq（5U/μL） 0.2 μL
H2O 13.2 μL
总体体积（μL） 20 μL
反应条件：（1）94℃预变性5 min；（2）94℃变性30s ；（3）55℃退火30s；（4）72℃延伸
30s，共30个循环，72℃延伸5 min。
[0024] 反应完毕后，取5μL的PCR产物，行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，检查扩增结果；将剩余PCR产物利用PCR clean试剂盒进行纯化，将回收产物利用KpnI、BamHI进行双酶切，具体反应条件如下。反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，从图中看出，500bp左右分子量的DNA片段处为目的基因片段，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。
[0025] 使用KpnI、BamHI双酶切系统对表达载体pCold-SUMO进行双酶切，使其成为线性片段，反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，检查酶切结果并使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。
[0026] 利用T4DNA连接酶（购自Takara），将MXRA7编码基因与pCold-SUMO质粒的凝胶回收产物进行连接，在16℃的条件下进行连接反应3h，将连接产物转化DH5a感受态细胞，涂板后，次日挑取单克隆菌落，进行菌落PCR后进行凝胶电泳，根据阳性扩增筛选阳性克隆。
[0027] 菌落PCR 体系：10× PCR Buffer 2 μL
dNTP (各2.5mM) 1.6 μL
cDNA模板 2 μL
正向引物(10 mM) 0.5 μL
反向引物(10 mM) 0.5 μL
rTaq（5U/ μL） 0.2 μL
H2O 13.2 μL
总体积 20 μL
将鉴定为阳性的克隆，送去测序，测序结果比对图如图2所示，其中A序列表示测序结果序列、B序列表示SEQ ID NO.3序列、C序列表示比对结果，从比对结果可以看出，显示连接成功且无突变，表达载体构建成功。
dNTP (各2.5mM) 1.6 μL
cDNA模板 2 μL
正向引物(10 mM) 0.5 μL
反向引物(10 mM) 0.5 μL
rTaq（5U/ μL） 0.2 μL
H2O 13.2 μL
总体积 20 μL
将鉴定为阳性的克隆，送去测序，测序结果比对图如图2所示，其中A序列表示测序结果序列、B序列表示SEQ ID NO.3序列、C序列表示比对结果，从比对结果可以看出，显示连接成功且无突变，表达载体构建成功。
[0028] 实施例2 SUMO-MXRA7融合蛋白的原核表达1) 提取鉴定为阳性克隆的菌落的质粒，并将提取的质粒转化感受态细胞BL21(DE3)；
2) 将感受态细胞BL21(DE3)接入含Amp (50μg/mL)的LB培养液中，37℃过夜培养；
3) 吸取50μL过夜培养物接入5mL含Amp (50μg/mL)的LB培养液中，37℃ 200rpm振荡培养至OD600=0.6-0.7；加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃诱导24小时，将菌液进行离心并收集上清液；同时将不加入IPTG诱导的菌液作为空白对照。
2) 将感受态细胞BL21(DE3)接入含Amp (50μg/mL)的LB培养液中，37℃过夜培养；
3) 吸取50μL过夜培养物接入5mL含Amp (50μg/mL)的LB培养液中，37℃ 200rpm振荡培养至OD600=0.6-0.7；加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃诱导24小时，将菌液进行离心并收集上清液；同时将不加入IPTG诱导的菌液作为空白对照。
[0029] SUMO-MXRA7融合蛋白的纯化条件：1）装树脂：取一个空柱，加入3mL镍柱NTA 树脂进行预装柱，待保存液下降至树脂表面时，依次用3倍柱体积灭菌双蒸水清洗，并用3倍柱体积1×Binding Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑，pH8.4)平衡柱床；
2）柱层析纯化
1、待1×Binding Buffer降至树脂表面时，加入含重组蛋白的抽提上清，重复上样2-3次，保留过柱后的溶液；
2、加入10倍柱体积的1×Binding Buffer，并保留过柱后的溶液；
3、加入8倍体积的1×Washing Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，60mM咪唑，pH8.4)，洗脱未能结合到树脂上的杂蛋白，并保留过柱后的洗涤液；
4、加入6倍柱体积的1×Elute Buffer(10mM Tris-HCl，250mM NaCl，300mM咪唑，pH8.4)，将结合到树脂上的目的蛋白洗脱下来，并用1.5mL的洁净EP管收集洗脱液，得到诱导表达的纯化液；
将未诱导的菌液用同样的方法进行柱层析纯化，得到未诱导表达的纯化液；
用8%的SDS-PAGE凝胶电泳对未诱导表达的纯化液、诱导表达的纯化液、菌体裂解沉淀、菌体裂解上清、流穿液、Binding Buffer、Elute Buffer进行分析，从图3中得出，在诱导表达的纯化液中得到了纯度较高的分子量为50KD左右的重组蛋白。
2）柱层析纯化
1、待1×Binding Buffer降至树脂表面时，加入含重组蛋白的抽提上清，重复上样2-3次，保留过柱后的溶液；
2、加入10倍柱体积的1×Binding Buffer，并保留过柱后的溶液；
3、加入8倍体积的1×Washing Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，60mM咪唑，pH8.4)，洗脱未能结合到树脂上的杂蛋白，并保留过柱后的洗涤液；
4、加入6倍柱体积的1×Elute Buffer(10mM Tris-HCl，250mM NaCl，300mM咪唑，pH8.4)，将结合到树脂上的目的蛋白洗脱下来，并用1.5mL的洁净EP管收集洗脱液，得到诱导表达的纯化液；
将未诱导的菌液用同样的方法进行柱层析纯化，得到未诱导表达的纯化液；
用8%的SDS-PAGE凝胶电泳对未诱导表达的纯化液、诱导表达的纯化液、菌体裂解沉淀、菌体裂解上清、流穿液、Binding Buffer、Elute Buffer进行分析，从图3中得出，在诱导表达的纯化液中得到了纯度较高的分子量为50KD左右的重组蛋白。
[0030] 并通过质谱检测纯化后的重组蛋白，将结果比对分析得出其最高分对应的蛋白序列为MXRA7蛋白（图4），确认该重组蛋白为目的蛋白MXRA7蛋白质，该重组蛋白含有SUMO标签。
[0031] 实施例3 抗小鼠MXRA7单克隆抗体SZ181的产生与纯化鉴定将实施例2表达纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白免疫6-8周龄Balb/c雌性小鼠，具体免疫方案如下表1 所示。
[0032] 表1 免疫小鼠用量及方案免疫次数 首次免疫 二次免疫 三次免疫 四次免疫 五次免疫 六次免疫
免疫日期 0d 14d 28d 42d 56d 73d
免疫剂量 30μg/只 30μg/只 30μg/只 30μg/只 40μg/只 50μg/只
免疫佐剂 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 弗氏不完全佐剂 弗氏不完全佐剂 弗氏不完全佐剂 无免疫方法 皮下及肌肉 皮下及肌肉 皮下及肌肉 皮下及肌肉 皮下及肌肉 腹腔注射第三次加强免疫后一周，即免疫第35天，眼静脉丛采血，用ELISA 法检测小鼠血清效价。经过免疫的小鼠血清效价大多在1:105左右，效价偏低，继续第四、五次免疫。第五次免疫后一周，即免疫第63天，眼静脉丛采血检测抗血清效价可达1:106，本发明选取效价高的小鼠进行下一步细胞融合。具体检测步骤如下：
包被：CBS稀释SUMO-MXRA7融合蛋白抗原至10μg/mL，100μL/well，37℃孵育2h；
封闭：1%明胶180μL/well，37℃孵育2h；
反应条件：梯度稀释含MXRA7的抗血清100μL/well 37℃水浴1h→100μL/well工作浓度(1:5000稀释)羊抗鼠IgG-HRP 37℃水浴1h→100μL/well TMB显色10min→50μL/well 1M盐酸终止反应→酶标仪测OD450值。
免疫日期 0d 14d 28d 42d 56d 73d
免疫剂量 30μg/只 30μg/只 30μg/只 30μg/只 40μg/只 50μg/只
免疫佐剂 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 弗氏不完全佐剂 弗氏不完全佐剂 弗氏不完全佐剂 无免疫方法 皮下及肌肉 皮下及肌肉 皮下及肌肉 皮下及肌肉 皮下及肌肉 腹腔注射第三次加强免疫后一周，即免疫第35天，眼静脉丛采血，用ELISA 法检测小鼠血清效价。经过免疫的小鼠血清效价大多在1:105左右，效价偏低，继续第四、五次免疫。第五次免疫后一周，即免疫第63天，眼静脉丛采血检测抗血清效价可达1:106，本发明选取效价高的小鼠进行下一步细胞融合。具体检测步骤如下：
包被：CBS稀释SUMO-MXRA7融合蛋白抗原至10μg/mL，100μL/well，37℃孵育2h；
封闭：1%明胶180μL/well，37℃孵育2h；
反应条件：梯度稀释含MXRA7的抗血清100μL/well 37℃水浴1h→100μL/well工作浓度(1:5000稀释)羊抗鼠IgG-HRP 37℃水浴1h→100μL/well TMB显色10min→50μL/well 1M盐酸终止反应→酶标仪测OD450值。
[0033] 细胞融合：融合前10天复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，用含15% FBS（胎牛血清）的DMEM培养基进行培养，确保融合时，细胞生长状态良好。融合前一天，取4周龄大小的Balb/c小鼠，摘除眼球放血后，颈椎脱臼法处死，取小鼠腹腔的巨噬细胞作为饲养细胞铺96孔板。融合当天，首先收集生长状态良好的SP2/0 细胞备用，然后无菌条件下，分离免疫小鼠的脾脏，置于200目的不锈钢筛网中，轻轻研磨获得单个脾细胞悬液，PBS洗涤两遍，将细胞悬于
20mL DMEM中。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 与脾细胞按照1：3的比例混合，1000rpm 离心5min后弃尽上清，用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀成糊状。37℃条件下，1min 内滴加1mL
37度预热的50%浓度的PEG溶液介导融合，融合结束后，加入37℃预温的无血清DMEM培养基终止，最后离心去上清，加入HAT 培养基重悬，混匀后滴加在含有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，37℃、5%CO2培养。
20mL DMEM中。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 与脾细胞按照1：3的比例混合，1000rpm 离心5min后弃尽上清，用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀成糊状。37℃条件下，1min 内滴加1mL
37度预热的50%浓度的PEG溶液介导融合，融合结束后，加入37℃预温的无血清DMEM培养基终止，最后离心去上清，加入HAT 培养基重悬，混匀后滴加在含有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，37℃、5%CO2培养。
[0034] 单克隆细胞株筛选：待融合细胞布满1/3-1/4培养孔时（培养基颜色呈黄色），即可吸取培养上清，用ELISA 法筛选阳性孔。适时更换培养基并根据细胞的生长状态及时按已建立的阳性克隆的筛选方法进行复筛。选择呈单个克隆生长、形态良好、抗体效价高的细胞继续亚克隆；扩大培养并及时液氮冻存。
[0035] 腹水制备及抗体纯化：取8周龄大小的雌性Balb/c小鼠，按0.4mL/只的量腹腔注射液体石蜡（Pristane）3 5d后按照1×107细胞/只的量腹腔注射杂交瘤细胞，同时另一侧腹~腔再次注入Pristane和不完全弗氏佐剂的等体积混合物0.2mL/只，轻轻按摩小鼠腹部，使杂交瘤细胞分散于腹腔中。7 10d后观察小鼠腹部，收取腹水，对腹水常规处理去除纤维蛋~
白后，过Protein G亲和层析柱，甘氨酸-盐酸（pH2.8）洗脱，用pH9.0的Tris溶液调节pH至
7.0，分装于-80℃保存。
白后，过Protein G亲和层析柱，甘氨酸-盐酸（pH2.8）洗脱，用pH9.0的Tris溶液调节pH至
7.0，分装于-80℃保存。
[0036] 单克隆抗体效价及其亚型的测定：利用ELISA方法对纯化的抗MXRA7单克隆抗体SZ181的效价进行鉴定。包被：PBS稀释MXRA7蛋白至0.1μg/mL，50μL/well，37℃孵育8h；封闭条件：1%明胶200μL/well，37℃孵育2h；反应条件：梯度稀释SZ181 100μL/well 37℃孵育1h→100μL/well工作浓度羊抗鼠IgG-HRP(1:5000稀释)，37℃水浴1h→100μL/well TMB显色10min→50μL/well 1M盐酸终止反应→酶标仪测OD450值，如图5（A）所示，测得其效价约为
1:102400。
1:102400。
[0037] 利用抗体小鼠抗体鉴定试纸（购自罗氏）对其Ig 类及亚类进行鉴定，显示该单克隆抗体为IgG1，κ型。
[0038] 抗MXRA7单克隆抗体特异性鉴定：利用免疫印迹（蛋白阻断）实验检测单克隆抗体的特异性。在0.5g小鼠肝脏中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液1mL，用组织匀浆仪匀浆后，冰上孵育15min。离心后取上清，进行BCA蛋白定量。同时原核表达并纯化的SUMO-MXRA7融合蛋白一起进行蛋白定量。加入SDS loading buffer煮样后，取20μg蛋白样品在10%的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到PVDF 膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2h后，将膜用1:1000稀释的抗MXRA7单克隆抗体SZ181 4℃孵育过夜，PBST洗膜3遍后，再与HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育1h，PBST洗膜3遍后，用ECL化学发光液检测抗体反应。如图5（B）所示，泳道1的检测样本是SUMO-MXRA7融合蛋白，泳道2的检测样本是WT小鼠的肝组织蛋白，从图中可以看出，该抗体既可以识别SUMO-MXRA7融合蛋白又可以识别小鼠肝组织蛋白。以分别表达MXRA7一号外显子和2-4号外显子融合蛋白的大肠杆菌裂解液作为检测目标物进行Western blot检测，从图5（C）中得出，Western blot检测SZ181识别位点位于MXRA7一号外显子上。位点竞争实验中，在一抗孵育的同时向抗体中加入不同浓度的SUMO-MXRA7融合蛋白进行阻断，其余步骤按常规进行，结果如图5（D）所示，50μg/mL的SUMO-MXRA7融合蛋白可以完全阻断SZ181与目的蛋白的结合。
[0039] 抗MXRA7单克隆抗体抗体SZ181交叉反应性：取大鼠的不同组织（心、小肠、皮肤）来源的蛋白，BCA定量后，加入1×SDS loading buffer煮样后，取20μg 蛋白样品在10%的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到NC膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2h后，将膜用1:1000稀释的抗MXRA7单克隆抗体SZ181 4℃孵育过夜，PBST洗膜3遍后，再与HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育1h，PBST洗膜3遍后，用ECL化学发光液检测抗体反应，结果如图6所示，该抗体可以用于识别大鼠的小肠、皮肤中的MXRA7蛋白。提取人过表达MXRA7的细胞系THP-MXRA7及SH1-MXRA7及对照细胞的蛋白，Western blot未检测到目的条带，表明该抗体无法识别人组织中的MXRA7蛋白。
[0040] 实施例4 MXRA7单克隆抗体SZ181的应用检测1、Western blot应用检测
取小鼠的不同组织来源的蛋白，BCA定量后，加入1×SDS loading buffer煮样后，取20μg 蛋白样品在10%的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到NC膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2h后，将膜用1:1000稀释的抗MXRA7单克隆抗体SZ181 4℃孵育过夜，PBST洗膜3遍后，再与HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育1h，PBST洗膜3遍后，用ECL化学发光液检测抗体反应，结果如图7所示，MXRA7在小鼠不同组织中表达情况不一致，其中在小肠、脾中表达量较高。其中图A是其中一次典型的Western blot图，图B是两次结果的灰度统计分析。
取小鼠的不同组织来源的蛋白，BCA定量后，加入1×SDS loading buffer煮样后，取20μg 蛋白样品在10%的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到NC膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2h后，将膜用1:1000稀释的抗MXRA7单克隆抗体SZ181 4℃孵育过夜，PBST洗膜3遍后，再与HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育1h，PBST洗膜3遍后，用ECL化学发光液检测抗体反应，结果如图7所示，MXRA7在小鼠不同组织中表达情况不一致，其中在小肠、脾中表达量较高。其中图A是其中一次典型的Western blot图，图B是两次结果的灰度统计分析。
[0041] 2、免疫组织化学应用检测常规方法制作小鼠组织的石蜡切片，抗原修复并用H2O2处理后，用正常山羊血清工作液室温封闭20min。将抗MXRA7单克隆抗体SZ181用0.1%的BSA 1：100稀释后滴加到组织切片上，4℃孵育过夜，第二天将过夜片放37℃温箱孵育1h，PBS洗3遍，每次3min；将HRP标记的羊抗鼠二抗工作液滴加到切片上，37℃孵育30min，PBS洗3遍，每次3min；
DAB显色后，常规方法复染、脱水、透明，封片，结果如图8所示，抗体SZ181在小鼠的脾和肺中存在阳性信号，在肝中无明显阳性信号。
DAB显色后，常规方法复染、脱水、透明，封片，结果如图8所示，抗体SZ181在小鼠的脾和肺中存在阳性信号，在肝中无明显阳性信号。
[0042] 3、免疫荧光应用检测将过表达MXRA7的小鼠肝癌细胞株Hepa1-6-MXRA7的细胞制成细胞爬片，用0.5%Triton-X处理后，用1% BSA室温封闭30min。将抗MXRA7单克隆抗体用0.1%的BSA 1：100稀释后滴加到细胞爬片上，4℃孵育过夜。第二天将过夜片用PBS洗3遍，每次3min；将Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠二抗工作液滴加到切片上，37℃孵育 30min，PBS 洗3遍，每次
3min；DAPI室温染色5 min，PBS 洗3遍，每次3min。加入封片剂封片后，激光共聚焦显微镜观察。免疫荧光结果显示（图9），抗体SZ181具有良好的结合活性，能特异性检测的小鼠细胞的MXRA7，并且红色信号定位在细胞质中。
3min；DAPI室温染色5 min，PBS 洗3遍，每次3min。加入封片剂封片后，激光共聚焦显微镜观察。免疫荧光结果显示（图9），抗体SZ181具有良好的结合活性，能特异性检测的小鼠细胞的MXRA7，并且红色信号定位在细胞质中。
[0043] 4、流式应用检测将过表达MXRA7的小鼠肝癌细胞株Hepa1-6-MXRA7及对照细胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化后，将细胞重选于含1% FBS的PBS中，并调整浓度至5x105/mL，加入纯化好的抗MXRA7单克隆抗体（或同型对照抗体）至终浓度1μg/mL，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，加入FITC 标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体，再次4℃避光孵育30 min，用PBS洗涤2次，重悬细胞于500μL PBS中，流式细胞仪（beckman fc 500）上机检测，检测结果证实转染MXRA7，使Hepa1-6细胞高表达MXRA7；此外MXRA7单克隆抗体SZ181还证实MXRA7在Hepa1-6细胞中表达位置位于细胞内，而非细胞膜表面，如图10所示。
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