药学诊断
阅读：541发布：2023-01-15
专利汇可以提供药学诊断专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 部分地涉及选择性癌症 治疗 方案 ，该方案是基于分析编码PI3K的催化性p110α亚单位的859 位置 处的谷 氨 酰胺的核酸中存在或不存在突变。，下面是药学诊断专利的具体信息内容。
1.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含基于个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，向该个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
2.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
c)分析来自该个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺；及
d)基于该试样于859位置处具有谷氨酰胺，向该个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
3.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
a)基于试样于PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，向该个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或b)基于该试样于PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处不具有谷氨酰胺，向该个体选择性施用治疗有效量的不同PI3K抑制剂化合物。
4.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
分析来自该个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺；及
选择性施用：
i)基于该试样于在859位置处具有谷氨酰胺，向该个体施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或
ii)基于该试样于859位置处不具有谷氨酰胺，向该个体施用治疗有效量的不同PI3K抑制剂化合物。
5.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
d)分析来自该个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺；
e)其后基于该个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，挑选出个体，以便进行(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗；及
f)其后基于该个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，向该个体施用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
6.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
a)测定来自该个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺，其中在859位置处存在谷氨酰胺表示该个体对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗有反应的可能性增加；及
b)其后基于来自该个体的试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，挑选出个体，以便进行使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗。
7.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含基于该个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有编码谷氨酰胺的核酸序列，向该个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
8.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
a)分析来自该个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位中存在或不存在核酸序列突变，其中该突变引起PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生氨基酸取代；及
b)基于该核酸序列试样在859位置处无突变且编码谷氨酰胺，向该个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
9.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
a)基于该个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有编码谷氨酰胺的核酸序列，向该个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或
b)基于该个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有不编码谷氨酰胺的核酸序列，向该个体选择性施用治疗有效量的不同PI3K抑制剂化合物。
10.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
分析来自该个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位中存在或不存在核酸序列突变，其中该突变引起该PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生氨基酸取代；及
选择性施用：
i)基于该核酸序列编码PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺，向该个体施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或ii)基于该核酸序列在PI3K的催化性p110α亚单位中于859位置处具有突变且不编码谷氨酰胺，向该个体施用治疗有效量的不同PI3K抑制剂化合物。
11.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
a)分析来自该个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位中存在或不存在核酸序列突变，其中该突变引起该PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生氨基酸取代；
b)其后基于来自该个体的试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处无突变且编码谷氨酰胺，挑选出个体，以便进行使用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗；及
c)其后向无所述突变的个体施用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
12.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
a)分析来自该个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位中存在或不存在核酸序列突变，其中该突变引起该PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生氨基酸取代，其中该核酸序列中不存在突变指示该个体对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗有反应的可能性增加；及
b)其后基于来自该个体的试样在该核酸序列中无突变以使该核酸序列在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺，挑选出个体，以便进行使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗。
13.一种选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包含：
分析获自患有癌症的个体的核酸试样在编码PI3K多肽的催化性p110α亚单位的核酸分子中存在突变，该突变引起所编码的催化性p110α亚单位的859位置处谷氨酰胺发生取代；
其后选择性施用：
a)基于该核酸在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺，向该个体施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或b)基于该核酸在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处不编码谷氨酰胺，向该个体施用治疗有效量的不同PI3K抑制剂化合物。
14.一种对个体进行基因分型的方法，该方法包含检测遗传变体，该遗传变体在PI3K的经编码催化性p110α亚单位的859位置处产生氨基酸变体，其中在859位置处无变体时是指示应向该个体施用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)。
15.一种对个体进行基因分型的方法，该方法包含检测在获自该个体的PI3K基因的催化性p110α亚单位中2575-2577位置处不存在或存在CAA，其中存在CAA指示该个体对(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)有反应的可能性增加。
16.如前述权利要求中任一项的方法，其中该癌症是选自由成胶质细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌及骨髓瘤组成的组。
17.如前述权利要求中任一项的方法，其中该试样是肿瘤试样。
18.如权利要求17的方法，其中该肿瘤试样是新鲜冷冻试样或石蜡包埋组织试样。
19.如权利要求1至6及14中任一项的方法，其中该检测可藉由免疫分析、免疫组织化学、ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹、HPLC及质谱实施。
20.如权利要求7至13及15中任一项的方法，其中编码PI3K的催化性p110α亚单位的核酸分子中存在或不存在突变可藉由选自由以下组成的组的技术检测：RNA印迹、聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、基于TaqMan的分析、直接测序、动态等位基因特异性杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、引物延伸分析、寡核苷酸连接酶分析、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相层析、高分辨率熔融分析、DNA失配结合蛋白分析、 毛细管电泳、DNA印迹。
21.如权利要求7至12或15的方法，其中该检测步骤包含对PI3K的催化性p110α亚单位基因或其一部分进行测序。
22.一种用于产生可传输形式的信息以预测患有癌症的患者对使用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的治疗的反应性的方法，该方法包含：
a)测定个体对于该患者对使用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲
基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的治疗有反应的可能性是否增加，其中基于在PI3K的催化性p110α亚单位基因的859位置处具有谷氨酰胺，该个体的可能性增加；及
b)在实体或非实体介质形式上记录该测定步骤的结果用于传输。
23.一种用于产生可传输形式的信息以预测患有癌症的患者对使用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的治疗的反应性的方法，该方法包含：
a)测定个体对于该患者对使用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲
基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的治疗有反应的可能性是否增加，其中基于核酸序列在PI3K的催化性p110α亚单位基因的859位置处编码谷氨酰胺，该个体的可能性增加；及
b)在实体或非实体介质形式上记录该测定步骤的结果用于传输。
24.一种用于测定肿瘤是否对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗有反应的试剂盒，该试剂盒包含提供一或多种用于检测在PI3K基因座中存在突变的探针或引物及使用说明书。
25.一种用于预测患有癌症的个体是否将受益于使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗的试剂盒，该试剂盒包含：
c)多种用于测定在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在突变的试剂；及d)使用说明书。
药学诊断
[0001] 本公开内容要求于2012年3月29日提交的美国临时专利申请案第61/617284号及于2013年2月22日提交的美国临时专利申请案第61/767,848号的优先权，其公开内容的全文各自以引用方式并入本文中。【技术领域】
[0003] 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)包括脂质激酶家族，所述脂质激酶催化磷酸根转移至肌醇脂质的D-3′位置以产生磷酸肌醇-3-磷酸酯(PIP)、磷酸肌醇-3,4-二磷酸酯(PIP2)及磷酸肌醇-3,4,5-三磷酸酯(PIP3)，所述PIP、PIP2及PIP3进而藉由使含有普列克底物蛋白同源(pleckstrin-homology)、FYVE、Phox及其他磷脂结合结构域的蛋白质对接至经常在质膜处的多种信号转导复合物而在信号转导级联中充当第二信使(Vanhaesebroeck 等 人，Annu.Rev.Biochem70:535(2001)；Katso 等 人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17:615(2001))。在两种1类PI3K中，1A类PI3K是由与调节亚单位组成型相关联的催化p110亚单位(α、β、δ同种型)组成的异源二聚体，该调节亚单位可为p85α、p55α、p50α、p85β或p55γ。1B类子类具有一个家族成员，即由与两个调节亚单位的p101或p84的一种相关联的催化p110γ亚单位组成的异源二聚体(Fruman等人，Annu Rev.Biochem.67:481(1998)；Suire等人，Curr.Biol.15:566(2005))。p85/55/50亚单位的模块化结构域包括结合在活化受体及胞质酪胺酸激酶上特定序列文本中的磷酸酪胺酸残基的Src同源(SH2)结构域，从而可使1A类PI3K活化并定位。在一些情况下，由结合肽及非肽配体的多种谱的G蛋白偶联受体直接活化1B类以及p110β(Stephens等人，Cell89:105(1997))；Katso等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17:615-675(2001))。因此，所得的I类PI3K磷脂产物将上游受体与下游细胞活性(包括增殖、存活、趋化、细胞输送、运动、代谢、发炎及过敏反应、转录及转译)联系在一起(Cantley等人，Cell 64:281(1991)；
Escobedo及Williams,Nature 335:85(1988)；Fantl等人，Cell 69:413(1992))。
Escobedo及Williams,Nature 335:85(1988)；Fantl等人，Cell 69:413(1992))。
[0004] PIP3将Akt(即病毒致癌基因v-Akt的人类同源物的产物)募集至质膜，其中其用作对生长及存活而言重要的许多细胞内信号转导途径的节点(Fantl等人，Cell 69:413-423(1992)；Bader 等 人，Nature Rev.Cancer 5:921(2005)；Vivanco 及Sawyer,Nature Rev.Cancer 2:489(2002))。PI3K的异常调节，经常经由Akt活化延长存活，是人类癌症中的最流行事件之一且已显示在多种水平发生。肿瘤抑制基因PTEN在肌醇环的3′位置处使磷酸肌醇去磷酸化且藉此拮抗PI3K活性，该基因在多种肿瘤中功能性缺失。在其他肿瘤中，p110α同种型PIK3CA及Akt的基因扩增，且在若干人类癌症中已证实其基因产物的蛋白质表达增加。此外，已在人类癌症中阐述用于上调p85-p110复合物的p85α的突变及易位。最后，活化下游信号转导途径的PIK3CA体细胞错义突变已在多种人类癌症中以大频率阐述(Kang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:802(2005)；Samuels等人，Science 304:554(2004)；Samuels等人，Cancer Cell 7:561-573(2005))。这些观察显示，磷酸肌醇-3激酶及此信号转导途径的上游及下游组份的失调是与人类癌症及增殖疾病相关的最常见失调之一(Parsons等人，Nature 436:792(2005)；Hennessey等人，Nature Rev.Drug Disc.4:988-1004(2005))。
[0005] 愈来愈多的证据表明，患者的遗传特性对患者对治疗性治疗的反应性具有决定性。由于适于患有癌症的个体的多种疗法，故影响(例如)对特定药物的反应的遗传因素的测定可用于为患者提供个性化治疗方案。所述个性化治疗方案提供使对患者的益处最大化同时使可与替代及较不有效治疗方案相关的有关副作用最小化的潜能。因此，业内需要识别可用于预测患者是否可能对特定治疗疗法有反应的因素。【发明内容】
[0006] 本发明是基于以下发现：识别PI3K的催化性p110α亚单位中的859位置处编码氨基酸的核酸可用于挑选出患有癌症的可能对使用治疗有效量的α-同种型特异性PI3K抑制剂化合物(例如(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺))或其药学上可接受的盐的治疗有反应的个体。特定而言，发现患有癌症的个体的试样中PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺残基(在本文中亦称作Q或Gln)变化可用于挑选出对使用α-同种型特异性PI3K抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗是否有反应的个体。可藉由直接分析个体的生物试样的目标物(例如，mRNA、cDNA、蛋白质等)实施测定步骤。
[0007] 在一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括基于个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，向个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0008] 在另一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0009] a)分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺；及
[0010] b)基于试样于859位置处具有谷氨酰胺，向个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0011] 在又一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0012] a)基于试样于PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，向个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或[0013] b)基于试样于PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处无谷氨酰胺，向个体选择性施用治疗有效量的除(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)外的不同PI3K抑制剂化合物。
[0014] 在另一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0015] 分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺；及
[0016] 选择性施用：
[0017] i)基于试样于859位置处具有谷氨酰胺，向个体施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或
[0018] ii)基于试样于859位置处无谷氨酰胺，向个体施用治疗有效量的除(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)外的不同PI3K抑制剂化合物。
[0019] 在又一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0020] a)分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺；
[0021] b)其后基于个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，挑选出可以(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗的个体；及[0022] c)其后基于个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，向个体施用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0023] 在另一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0024] a)测定个体的生物试样中PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺，其中在859位置处存在谷氨酰胺指示个体对使用PI3Kα亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗有反应的可能性增加；及
[0025] b)其后基于个体的试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，挑选出可以PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗的个体。
[0026] 在另一方面，本发明包括选择患有癌症的个体进行治疗的方法，该方法包括测定个体的生物试样中PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺，其中在859位置处存在谷氨酰胺指示个体对使用PI3Kα亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗有反应的可能性增加。
[0027] 在另一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括基于个体具有在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺的核酸序列，向个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0028] 在又一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0029] a)分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位的2575-2577位置处与参考序列相比存在或不存在核酸序列突变；及
[0030] b)基于核酸序列试样无突变且859位置处编码谷氨酰胺，向个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0031] 在又一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0032] a)基于个体具有在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺的核酸序列，向个体选择性施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或
[0033] b)基于个体具有在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处不编码谷氨酰胺的核酸序列，向个体选择性施用治疗有效量的不同PI3K抑制剂化合物。
[0034] 在又一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0035] 分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位中存在或不存在核酸序列突变，其中突变引起PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生氨基酸取代；及
[0036] 选择性施用：
[0037] i)基于核酸序列在PI3K的催化性p110α亚单位中的859位置处编码谷氨酰胺，向个体施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或[0038] ii)基于核酸序列在PI3K的催化性p110α亚单位中于859位置处具有突变且不编码谷氨酰胺，向个体施用治疗有效量的不同PI3K抑制剂化合物。
[0039] 在又一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0040] a)分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位中存在或不存在核酸序列突变，其中突变引起PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生氨基酸取代；
[0041] b)其后基于个体的试样无突变且在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺，挑选出可以(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗的个体；及
[0042] c)其后向无突变的个体施用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0043] 在另一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0044] a)分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位中存在或不存在核酸序列突变，其中突变引起PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生氨基酸取代，其中核酸序列中不存在突变指示个体对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗有反应的可能性增加；及[0045] b)其后基于个体的试样在核酸序列中无突变以使核酸序列在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺，挑选出可以PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗的个体。
[0046] 在又一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括：
[0047] 分析自患有癌症的个体获得的核酸试样在编码PI3K多肽的催化性p110α亚单位的核酸分子中存在突变，其引起被编码的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生取代；
[0048] 其后选择性施用：
[0049] a)基于核酸在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺，向个体施用治疗有效量的(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；或[0050] b)基于核酸在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处不编码谷氨酰胺，向个体施用治疗有效量的不同PI3K抑制剂化合物。
[0051] 在另一方面，本发明包括选择患有癌症的个体进行治疗的方法，该方法包括分析自患有癌症的个体获得的核酸试样在编码PI3K多肽的催化性p110α亚单位的核酸分子中存在突变，其引起被编码的催化性p110α亚单位的859位置处的谷氨酰胺发生取代，其中在859位置处存在谷氨酰胺指示个体对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗有反应的可能性增加。
[0052] 在又一方面，本发明包括对个体进行基因分型的方法，该方法包括检测在被编码的PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处产生氨基酸变体的遗传性变型，其中在859位置处无变体指示应向该个体施用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)。
[0053] 在又一方面，本发明包括对个体进行基因分型的方法，该方法包括检测在自该个体获得的PI3K基因的催化性p110α亚单位中2575-2577位置处不存在或存在CAA，其中存在CAA指示个体对(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)有反应的可能性增加。
[0054] 在如本文所述的本发明方法中，癌症亦可为任何癌症，包括成胶质细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌及骨髓瘤。试样通常是肿瘤试样且可为新鲜冷冻试样或石蜡包埋组织试样。
[0055] 在如本文所述的本发明方法中，可藉由业内已知的任何方法(例如免疫分析、免疫组织化学、ELISA、流式细胞术、Western印迹法、HPLC及质谱)实施检测谷氨酰胺或变体氨基酸的方法。另外，在如本文所述的本发明方法中，检测编码PI3K的催化性p110α亚单位的核酸分子中的突变的方法包括聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、基于TaqMan的分析、直接测序、动态等位基因特异性杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、引物延伸分析、寡核苷酸连接酶分析、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相层析、高分辨率熔融分析、DNA错配结合蛋白分析、 或毛细管电泳。
[0056] 本发明进一步包括产生可传输形式的信息以预测患有癌症的患者对(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的治疗的反应性的方法，该方法包含：
[0057] a)测定个体对于患者对使用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)治疗有反应的可能性是否增加，其中基于在PI3K的催化性p110α亚单位基因的859位置处具有谷氨酰胺，则个体具有增加的可能性；及
[0058] b)在实体或非实体介质形式上记录测定步骤的结果用于传输。
[0059] 在另一方面，本发明包括产生可传输形式的信息以预测患有癌症的患者对(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的治疗的反应性的方法，该方法包括：
[0060] a)测定个体对于患者对使用(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)治疗有反应的可能性是否增加，其中基于核酸序列在PI3K的催化性p110α亚单位基因的859位置处编码谷氨酰胺，则个体具有增加的可能性；及
[0061] b)在实体或非实体介质形式上记录测定步骤的结果用于传输。
[0062] 在又一方面，本发明包括用于测定肿瘤是否对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗有反应的试剂盒，该试剂盒包含提供一或多种用于检测在PI3K基因座中存在突变(SEQ ID NO:2的核酸2575-2577)的探针或引物及使用说明书。
[0063] 在另一方面，本发明包括用于预测患有癌症的个体是否将受益于PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗的试剂盒，该试剂盒包含：
[0064] a)若干用于测定在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在编码变体的突变的试剂；及
[0065] b)使用说明书。
[0066] 在如本文所述的本发明方法中，PI3K抑制剂是业内的任何已知PI3K α亚单位抑制剂。具体而言，化合物可为(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐；下文亦显示为式(A)
[0067]
[0068] 或其药学上可接受的盐。
[0069] 在另一方面，本发明包括测定肿瘤是否对PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗有反应的试剂盒，该试剂盒包含提供一或多种用于检测在PI3K基因的催化性p110α亚单位中于859位置处存在或不存在编码变体的突变的探针或引物。【附图说明】
[0070] 图1绘示显示PI3K野生型(wt)的ATP活化动力学曲线(米氏常数(Michaelis constant)(Km)＝60±6μM)及PI3Kα Q859A突变体的ATP活化动力学曲线(Km＝72±8μM)的图。
[0071] 图2显示呈现PI3K野生型(wt)及PI3Kα Q859A突变体的抑制曲线的图。【具体实施方式】
[0072] 本发明是基于以下发现：在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺的核酸序列中存在或不存在突变可用于测定患者对利用α-同种型特异性PI3K抑制剂化合物(例如(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺))或其药学上可接受的盐的疗法有反应的可能性。特定而言，发现来自患者试样且编码野生型PI3K的催化性p110α亚单位(即在859位置处具有谷氨酰胺)的核酸序列对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)治疗更可能有反应。与此相比，来自患者试样且在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有编码变体的突变(即在859位置处编码除谷氨酰胺外的氨基酸，例如丙氨酸)的核酸序列对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)治疗较不可能有反应。该患者应以替代癌症疗法治疗，该替代癌症疗法是(例如)不同的PI3K抑制剂(诸如本文所用不同类型的PI3K抑制剂应为不是(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)，及可为(但不限于)经化学治疗或替代PI3K抑制剂疗法(例如可选择性抑制除α形式的PI3K亚单位外的同种型的抑制剂或可抑制多于一种PI3K亚单位的同种型的抑制剂)治疗。
[0073] 在本发明方法的一些实施方式中，可藉由分析生物试样的基因组序列、核酸产物、多肽产物或等效遗传标记来检测在PI3K的催化性p110α亚单位中的859位置处编码谷氨酰胺的核酸序列中存在或不存在突变。
[0074] 在一个实施例中，本发明包括对来自个体的试样进行基因分型。对于基因分型而言，在PI3K基因的催化性p110α亚单位的一个等位基因或两个等位基因中测定在859位置处编码谷氨酰胺的核苷酸特征。关于PI3K基因的催化性p110α亚单位，突变发生在一个或两个等位基因中的PI3K基因的催化性p110α亚单位的核苷酸2575-2577处。基因型可为纯合子或杂合子的。在本发明方法中，视情况而定，859位置处的核酸序列或蛋白质的特性测定可与野生型蛋白序列(GeneID：5290；编码(例如)NCBI登录号NP_006209.2；SEQ ID NO:1的蛋白质)或DNA序列(SEQ ID NO:2)或野生型核酸序列(mRNA；NCBI参考序列编号NM_006218.2)或基因组DNA(NCBI参考序列编号NG_012113.1)相比较。PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处的变体(即除谷氨酰胺外的氨基酸)是指编码蛋白质的PI3K基因序列的催化性p110α亚单位中的遗传突变所产生的参考(野生型)蛋白序列859位置处的变化。在一个实施方式中，变体可为859位置处的丙氨酸。
[0075] 因此，本发明提供预测患有表达PI3K的癌症的患者对利用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的疗法呈现有益反应的可能性的方法。用以该评定的患者个体包括：1)患有表达PI3K的癌症且尚未经历任何癌症治疗的患者；2)患有表达PI3K的癌症且已经经历癌症完全或部分切除，例如在临床上可能的程度内经历手术移除癌性组织的患者；及3)患有表达PI3K的癌症且经除PI3K抑制剂治疗方案外的治疗方案治疗的患者。
[0076] 在本发明方法中，分析试样中在PI3K基因PIK3CA的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在编码谷氨酰胺的突变。在一个实施例中，突变会引起PI3K基因PIK3CA的人类催化性p110α亚单位中于859位置处谷氨酰胺取代为丙氨酸/变为丙氨酸(Q859A)[基因ID：5290；编码(例如)NCBI登录号NP_006209.2(SEQ ID NO:1)的蛋白质]。
[0077] 在一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在谷氨酰胺；及基于试样在859位置处具有谷氨酰胺，向个体选择性施用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0078] 在另一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在编码变体的突变；及基于个体的试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处无突变，向个体选择性施用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0079] 在另一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括分析个体的生物试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在编码变体的突变；其后基于个体的试样在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处无突变(即，核酸序列编码谷氨酰胺)，挑选出可以PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗的个体；及由于个体无突变，向个体施用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0080] 在又一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括测定个体的生物试样中在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在或不存在编码变体的突变，其中存在突变指示个体对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗无反应的可能性增加；及其后基于个体的试样在PI3K的p110α亚单位的催化性p110α亚单位的859位置处无突变，挑选出可以PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗的个体。
[0081] 在再一方面，本发明包括利用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括基于个体在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处存在谷氨酰胺(Q)，向个体施用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0082] 在再一方面，本发明包括选择性治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括分析自患有癌症的个体获得的核酸试样在PI3K多肽的催化性p110α亚单位的2575-2577位置处在核酸分子中存在一或多个突变；及其后基于个体不存在序列突变且在PI3K的被编码的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺，向个体选择性施用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0083] 在又一方面，本发明包括用于治疗癌症的PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐，其特征在于基于患者在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，向该患者施用治疗有效量的该化合物或其药学上可接受的盐。
[0084] 在又一方面，本发明包括用于治疗癌症的PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐，其特征在于基于患者选自在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺和在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处不具有谷氨酰胺的在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有谷氨酰胺，向该患者施用治疗有效量的该化合物或其药学上可接受的盐。
[0085] 在又一方面，本发明包括用于治疗癌症的PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐，其特征在于基于患者在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处具有编码谷氨酰胺的核酸，向该患者施用治疗有效量的该化合物或其药学上可接受的盐。
[0086] 在又一方面，本发明包括用于治疗癌症的PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐，其特征在于基于患者具有选自在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺的核酸和在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处不编码谷氨酰胺的核酸的在PI3K的催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺的核酸，向该患者施用治疗有效量的该化合物或其药学上可接受的盐。
[0087] PI3K抑制剂
[0088] 使用本文所揭示方法评定的患者是视为用于PI3K抑制剂治疗的患者。根据本发明，患有表达PI3K的催化性p110α亚单位的野生型形式的肿瘤的患者更可能对使用PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的治疗有反应。
[0089] 本文所用术语“PI3K α亚单位抑制剂”是可抑制PI3K的催化性p110α亚单位的分子。应了解，与抑制包括β及/或δ及/或γ亚型的其他亚型的能力相比，PI3K α亚单位抑制剂可选择性抑制α亚型PI3K。
[0090] WO2010/029082阐述特定2-甲酰胺环氨基脲衍生物，发现其具有有利的药理特性且显示与其他类型相比针对PI3-激酶α亚型的改良选择性。适于本发明的特定2-甲酰胺环氨基脲衍生物、其制备及含有其的合适制剂阐述于WO2010/029082中。在如本文所述的本发明方法中，PI3K α亚单位抑制剂可为化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。本发明中所用的PI3K α亚单位抑制剂是式(A)化合物[0091]
[0092] 或其药学上可接受的盐。此化合物特别阐述于WO2010/029082中。此化合物的合成作为实施例15阐述于WO2010/029082中。
[0093] 本文所述PI3K α亚单位抑制剂化合物可为试剂本身、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的酯、以及立体异构物、对映异构物、外消旋混合物及诸如此类。
[0094] 试样的制备
[0095] 本发明尤其提供用于检测编码PI3K的催化性p110α亚单位的氨基酸859的核酸序列的身份的分析。若核酸编码野生型氨基酸谷氨酰胺，则指示应对个体加以选择并用PI3K α亚单位抑制剂化合物加以治疗(如上文所述)。然而，若核酸具有突变且编码变体氨基酸，即编码除谷氨酰胺外的氨基酸，则个体不应用PI3K α亚单位抑制剂化合物治疗(如上文所述)。
[0096] 该方法可包括检测体液(例如血液(例如，血清或血浆)骨髓、脑脊液、腹膜液/胸膜液、淋巴液、腹水、浆液、痰、泪液、粪便及尿)或组织(例如肿瘤组织)中的突变。肿瘤组织可为新鲜组织或石蜡包埋组织。
[0097] 如本文所用“个体”是指人类或动物，包括所有哺乳动物，例如灵长类(尤其高级灵长类)、绵羊、狗、啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)、天竺鼠、山羊、猪、猫、兔及牛。在较佳实施方式中，个体是人类。在另一个实施方式中，个体是实验动物或适用作疾病模型的动物。
[0098] 体液试样可使用业内已知的任何方法自个体获得。业内熟知自体液试样提取细胞DNA的方法。通常用洗涤剂使细胞裂解。在细胞裂解后，使用各种蛋白酶自DNA移除蛋白质。随后用酚提取DNA，沉淀于醇中并溶解于水性溶液中。自体液试样提取无细胞DNA的方法亦为业内已知。通常自细胞分离体液试样中的无细胞DNA，沉淀于醇中并溶解于水性溶液中。
[0099] 实体瘤试样通常可为藉由活检或手术切除自患有癌症的个体获得的细胞或组织的测试试样。可藉由针吸活检移除细胞或组织的试样。为此，经由皮肤插入附接至注射器的细针并插入目标组织中。通常使用超声或计算机断层摄影(CT)成像将针引导至目标区域。在将针插入组织中时，利用注射器产生真空，以便可经由针抽吸细胞或流体且收集于注射器中。亦可藉由切取活检或核心活检移除细胞或组织的试样。为此，自目标区域移除圆锥形、圆柱形或极少组织。通常使用CT成像、超声或内镜引导此类型活检。更具体而言，可藉由切除活检或手术切除移除整个癌性病灶。在本发明中，测试试样通常是作为手术切除的部分移除的细胞试样。
[0100] 举例而言，组织的测试试样亦可储存于(例如)RNAlater(Ambion；Austin Tex.)中或急骤冷冻并储存于-80℃下，以稍后使用。亦可用固定剂(例如甲醛、多聚甲醛或乙酸/乙醇)固定活检组织试样。可将固定组织试样包埋于蜡(石蜡)或塑料树脂中。可将包埋组织试样(或冷冻组织试样)切割成薄切片。亦可自固定或蜡包埋组织试样提取RNA或蛋白质。
[0101] 用于根据本发明治疗的表达PI3K的癌症包括癌症或细胞增殖疾病，例如由PI3K介导的肿瘤及/或癌细胞生长。疾病可包括显示PI3Kα过表达或扩增、PIK3CA的体细胞突变或PTEN的种系突变或体细胞突变或用于上调p85-p110复合物的p85α的突变及易位的那些。具体而言，癌症包括(例如)肉瘤、肺癌、枝气管癌、前列腺癌、乳癌(包括散发性乳癌及考登病(Cowden disease)患者)、胰腺癌、胃肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌瘤、结肠直肠腺瘤、甲状腺癌、肝癌、肝内胆管癌、肝细胞癌、肾上腺癌、胃癌(stomach，gastric)、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肾盂癌、膀胱癌、子宫体癌、子宫颈癌、阴道癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、食道癌、白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴细胞白血病、髓样白血病、脑癌、脑癌瘤、口腔及咽癌、喉癌、小肠癌、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、黑色素瘤、绒毛状结肠腺瘤、赘瘤形成、上皮特征赘瘤形成、淋巴瘤、乳腺癌瘤、基细胞癌瘤、鳞状细胞癌瘤、光化性角化病、肿瘤疾病(包括实体瘤)、头或颈肿瘤、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、髓样化生性骨髓纤维化及沃尔登斯特伦疾病(Walden-stroem disease)。
[0102] 本发明方法并不限于癌症且可包括其他病况或病症(例如PI3K介导的病况或病症)，例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、髓样化生性骨髓纤维化、哮喘、COPD、ARDS、吕弗勒氏症候群(Loffler′s syndrome)、嗜酸性粒细胞肺炎、寄生性(具体而言后生动物)感染(包括热带嗜酸粒细胞增多症)、枝气管肺曲霉菌病、结节性多动脉炎(包括丘-施二氏症候群(Churg-Strauss syndrome))、嗜酸性肉芽肿、由药物反应引发的影响气道的嗜酸性细胞有关的病症、牛皮癣、接触性皮炎、特应性皮炎、斑秃、多形红斑、疱疹样皮炎、硬皮病、白癜风、超敏性脉管炎、荨麻疹、大疱性类天疱疮、红斑狼疮、天疱疮、获得性大疱性表皮松解、自体免疫性血液病症(例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红血球贫血及特发性血小板减少症)、全身性红斑狼疮、多软骨炎、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener granulomatosis)、皮肌炎、慢性活动型肝炎、重症肌无力、史蒂文斯-约翰逊症候群(Steven-Johnson syndrome)、特发性口炎性腹泻、自体免疫性炎性肠病(例如溃疡性结肠炎及克罗恩氏病(Crohn′s disease))、内分泌眼病、格雷夫斯氏病(Grave′s disease)、结节病、肺泡炎、慢性超敏性肺炎、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬变、葡萄膜炎(前葡萄膜炎及后葡萄膜炎)、间质肺纤维化、牛皮癣关节炎、肾小球肾炎、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、深部静脉血栓形成、中风、心肌梗塞、不稳定型心绞痛、血栓栓塞、肺栓塞、溶血栓性疾病、急性动脉缺血、外周血栓形成性阻塞、及冠脉疾病、再灌注损伤、视网膜病变(例如糖尿病性视网膜病变或高压氧诱导的视网膜病变)及特征在于眼内压升高或眼房水分泌的病况(例如青光眼)。
[0103] 检测
[0104] 本发明方法包括检测在PI3K基因的人类p110α亚单位的859位置处编码氨基酸谷氨酰胺的核酸序列中存在或不存在突变。在一个实施例中，此方法包括检测859位置处编码突变氨基酸的核酸以预测患者对PI3K药物治疗的反应。由于PI3K的催化性p110α亚单位的突变通常在DNA水平发生，故本发明方法可基于基因组DNA、以及转录物(mRNA、cDNA)及蛋白质本身的突变的检测。
[0105] 本文所述的PI3K催化性p110α亚单位突变可藉由业内任何已知方法检测。在阐述本发明的PI3K催化性p110α亚单位突变中，突变包括存在于野生型序列中的859位置处的谷氨酰胺(Q)氨基酸的任何氨基取代，例如，取代可为谷氨酰胺(Q)取代为丙氨酸(A)。另外，为方便起见，本文中提及的PI3K催化性p110α亚单位突变是基因的有义链。然而，如由熟习此项技术者所认识，含有该基因的核酸分子可为互补双链分子且因此在提及有义链上的特定位点时亦是指互补反义链上的相应位点。亦即，可提及任一链上的相同突变位点且寡核苷酸可经设计以与任一链在含有多形及/或突变位点的目标区域处特异性杂交。
因此，本发明亦包括与本文所述基因组变体的有义链互补的单链多核苷酸及突变。
因此，本发明亦包括与本文所述基因组变体的有义链互补的单链多核苷酸及突变。
[0106] 可使用许多不同技术来识别核酸序列是否编码PI3K的催化性p110α亚单位中的859位置处的突变，包括单链构象多态性(SSCP)分析、藉由变性高效液相层析(DHPLC)的异源双链分析、直接DNA测序及计算方法(Shi等人，Clin Chem A1U6AA12(2001))。最常见方法目前包括杂交、引物延伸及裂解方法。该等方法中的每一种必须连接至适当检测系统。
检测技术包括荧光偏振(Chan等人，Genome Res.9:492-499(1999))、焦磷酸盐释放的发光检测(焦磷酸测序)(Ahmadiian等人，Anal.Biochem.280:103-10(2000))、基于荧光共振能量转移(FRET)的裂解分析、DHPLC及质谱(Shi,Clin Chem 47:164-172(2001)；美国专利第
6,300,076 Bl号)。
检测技术包括荧光偏振(Chan等人，Genome Res.9:492-499(1999))、焦磷酸盐释放的发光检测(焦磷酸测序)(Ahmadiian等人，Anal.Biochem.280:103-10(2000))、基于荧光共振能量转移(FRET)的裂解分析、DHPLC及质谱(Shi,Clin Chem 47:164-172(2001)；美国专利第
6,300,076 Bl号)。
[0107] 在一个实施方式中，使用自动分析仪(例如，PCR仪或自动测序机)测定在PI3K的催化性p110 α亚单位的2575至2577位(在859位置处编码Gln的密码子)处存在或不存在突变。熟习此项技术者熟知所有该等方法。
[0108] 在特别优选实施方式中，可使用INVADERTM技术(自Third Wave Technologies公司，Madison,Wisconsin USA获得)检测突变。在此分析中，特异性上游“侵入物”寡核苷酸及部分重迭下游探针在结合至互补DNA模板时一起形成特定结构。此结构经识别且在特定位点处由Cleavase酶切割，从而释放探针寡核苷酸的5′片(flap)。此片段随后关于包含于反应混合物中的合成二级靶标及二级荧光标记信号探针用作“侵入物”寡核苷酸。这藉由Cleavase酶引起二级信号转导探针特异性裂解。在此二级探针(经能够荧光共振能量转移的染料分子标记)裂解时产生荧光信号。Cleavase相对于由重迭DNA序列或片形成的结构具有严格要求，且因此，可用于特异性检测在下游DNA链上的裂解位点的上游紧挨的单碱基对错配。Ryan D等人，Molecular Diagnosis 4(2):135-144(1999)及Lyamichev V等人，Nature Biotechnology 17:292-296(1999)，亦参见美国专利第5,846,717号及第6,001,567号。
[0109] 本发明进一步包括含有寡核苷酸探针及引物的组合物，该等寡核苷酸探针及引物经设计以特异性杂交至在催化性p110α亚单位的859位置处编码谷氨酰胺或变体多肽或毗邻突变位点的核酸序列。可使用任何寡核苷酸引导的扩增方法使含有目标突变的区域扩增，该方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)(美国专利第4,965,188号)、连接酶链反应(LCR)(Barany等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA 88:189-193(1991)；已公开PCT专利申请案WO 90/01069)及寡核苷酸连接分析(OLA)(Landegren等人，Science241:1077-1080(1988))。在该等方法中用作引物或探针的寡核苷酸应特异性杂交至含有多形/突变位点或与其毗邻的核酸的区域。通常，寡核苷酸的长度介于10与35个核苷酸之间且较佳长度介于15与30个核苷酸之间。最佳地，寡核苷酸是20至25个核苷酸长。寡核苷酸的精确长度依赖于熟习此项技术者常规考虑且实践的许多因素。
[0110] 可用于使含有859位置处的催化性p110α亚单位突变的区域扩增的其他已知核酸扩增程序包括基于转录的扩增系统(美国专利第5,130,238号、EP 329,822、美国专利第5,169,766号、已公开PCT专利申请案WO 89/06700)及等温方法。(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396(1992))。
[0111] 可在扩增之前或之后使用业内已知的若干基于杂交的方法中的一种分析催化性p110α亚单位的859位置处的突变。通常，利用等位基因特异性寡核苷酸实施该等方法。等位基因特异性寡核苷酸可用作被不同方式标记的探针对，其中该对的一个成员显示与靶标序列的一个变体完美匹配且另一成员显示与不同变体完美匹配。较佳地，该组的成员在杂交至所检测多形或突变位点中的每一者时彼此的熔融温度在5℃内且更佳2℃内。可利用存于溶液中的两个实体实施等位基因特异性寡核苷酸至靶标多核苷酸的杂交，或在寡核苷酸或靶标多核苷酸共价或非共价连接至固体载体时可实施该杂交。连接可藉由(例如)抗体-抗原相互作用、多-L-Lys、链霉抗生物素或抗生物素-生物素、盐桥、疏水相互作用、化学连接、UV交联、烘烤等介导。等位基因特异性寡核苷酸可在固体载体上直接合成或在合成后连接至固体载体。适用于本发明检测方法的固体载体包括由硅、玻璃、塑料、纸及诸如此类制得的基材，其可形成(例如)孔(如在96孔板中)、载玻片、片、膜、纤维、芯片、盘及珠粒。固体载体可经处理、涂布或衍生化以有利于等位基因特异性寡核苷酸或靶标核酸的固定。
[0112] 亦可使用业内已知的方法分析于催化性p110亚单位的859位置处具有谷氨酰胺或于催化性p110亚单位的859位置处具有取代的多肽，该等方法是例如放射性免疫分析或酶联免疫分析、竞争性结合酶联免疫分析、质谱、定点照护(point of care)技术/平台、斑点印迹、蛋白质印迹、层析(较佳高效液相层析(HPLC))或诸如此类。可使用标记抗体、其结合部分或其他结合配偶体。抗体可为单克隆或多克隆来源，或可以生物合成方式产生。结合配偶体亦可为天然分子或以合成方式产生。使用业内所述的标准蛋白质检测方法测定复合蛋白质的量。免疫分析设计、理论及方案的详细综述可参见业内的多个文本，包括Practical Immunology,Butt,W.R.编辑，Marcel Dekker,New York,1984。
[0113] 本发明分析中可使用多种不同标记，包括连接至抗体的直接标记，例如荧光或发光标签、金属、染料、放射性核素及诸如此类。间接标记包括业内熟知的多种酶，例如碱性磷酸酶、过氧化氢酶及诸如此类。在一步分析中，固定靶标蛋白质(即，于859位置处具有谷氨酰胺的催化性p110亚单位)并与标记抗体一起培育。标记抗体结合至固定靶标分子。在洗涤以移除未结合分子后，分析试样标记的存在。向定点照护格式及手持物中纳入多种免疫组织化学方法，其皆可用于测定蛋白质的存在。
[0114] 本发明亦涵盖对蛋白质或多肽具有特异性的固定抗体的使用。可将抗体固定至多种固体载体(例如磁力或层析基质粒子、分析场所(例如微量滴定孔)的表面、固体基材材料(例如塑料、尼龙、纸)片及诸如此类)上。可藉由在固体载体上以阵列涂布抗体制备测试条。随后可将此测试条浸入测试试样中并经由洗涤及检测步骤处理以产生可量测信号(例如彩色斑点)。
[0115] 在两步分析中，固定靶标蛋白质(例如，于859位置处具有谷氨酰胺的催化性p110亚单位)可与未标记抗体一起培育。随后将未标记抗体复合物(若存在)结合至对未标记抗体具有特异性的第二经标记抗体。洗涤试样并分析标记的存在。用于标记抗体的标记物的选择将根据应用而变。然而，熟习此项技术者可易于测定标记物的选择。
[0116] 斑点印迹由熟习此项技术者常规实践以使用抗体作为探针检测期望蛋白质(Promega Protocols and Applications Guide，第2版，1991，第263页，Promega公司)。使用斑点印迹装置将试样施加至膜。将标记探针与膜一起培育，且检测蛋白质的存在。
[0117] 熟习此项技术者熟知蛋白质印迹分析(Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,1989，第3卷，第18章，Cold Spring Harbor Laboratory)。在蛋白质印迹中，藉由SDS-PAGE分离试样。将凝胶转移至膜。将膜与标记抗体一起培育用于检测期望蛋白质。
[0118] 施用及药物组合物
[0119] PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐可以治疗有效量经由任何业内已知的常见且可接受的模式单独或与一或多种治疗剂组合施用。治疗有效量可根据疾病的严重程度、个体的年龄及相对健康状况、所用化合物的效能及其他因素而广泛变化。对于上述用途，所需剂量当然会根据施用模式、拟治疗的特定病况及期望效果变化。
[0120] 一般而言，将满意的结果指定为以约0.03mg/kg至约100.0mg/kg/体重(例如约0.03至约10.0mg/kg/体重)的化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的日剂量全身获得。较大型哺乳动物(例如人类)的指定日剂量在约0.5mg至约3g(例如约5mg至约1.5g)化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐的范围内，其可方便地以(例如)多达一天四次的分开剂量或以延迟形式施用。适用于经口施用的单位剂型包含约0.1mg至约500mg(例如约1.0mg至约500mg)化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐。
[0121] 如本文所述PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐可以药物组合物形式藉由任何常规途径，具体地，经肠，例如，经口，例如以片剂或胶囊形式，或肠胃外，例如以可注射溶液或悬浮液形式，局部，例如以洗剂、凝胶、软膏或乳霜形式，或以经鼻或栓剂形式施用。可藉由混合、制粒或涂布方法以常规方式制造包含呈游离形式或药学上可接受的盐形式的本发明的PI3K α亚单位抑制剂化合物以及至少一种药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物。举例而言，口服组合物可为包含活性成份及以下物质的片剂或明胶胶囊：a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素及/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐及/或聚乙二醇；对于片剂亦有c)黏结剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠及或聚乙烯吡咯烷酮；(若需要)d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾混合物；及/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂及甜味剂。可注射组合物可是水性等渗溶液或悬浮液，且栓剂可由脂肪乳液或悬浮液制备而成。
[0122] PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐可经灭菌及/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐及/或缓冲剂。此外，其亦可含有其他治疗上有价值的物质。用于经皮应用的适宜制剂包括带有载剂的有效量的本发明化合物。载剂可包括可吸收的药学上可接受的溶剂，以辅助穿过宿主皮肤。举例而言，经皮装置可呈绷带形式，其包含背衬部件、含有该化合物(视情况带有载体)的储液器、(视情况)用于以受控且预定速率经长时期将该化合物递送至宿主皮肤的速率控制屏障以及将该装置固定至皮肤上的构件。亦可使用基质经皮制剂。用于局部应用(例如用于皮肤及眼睛)的适宜制剂较佳是此项技术中熟知的水性溶液、软膏、乳霜或凝胶。此可含有增溶剂、稳定剂、增渗剂、缓冲剂及防腐剂。
[0123] 数据
[0124] 在实施需要测定在PI3K的p110催化性亚单位的2575-2577位置处存在或不存在核酸突变的任何本发明所述方法中，测定存在或不存在核酸突变且可将结果告知医师或遗传咨询师或患者或其他研究者。特定而言，可将该结果编制成可传输形式的信息，可将该信息传送或传输至其他研究者或医师或遗传咨询师或患者。该形式是可以变化的且可是实体或非实体的。该结果可以描述性报告书、图表、照片、图解、影像或任一其他视觉形式来体现。举例而言，PCR产物的凝胶电泳的影像可用于解释该等结果。显示存在或不存在变体的图表亦用于指示测试结果。该等报告书及视觉形式可记录于实体介质(例如纸、计算机可读介质(例如软磁盘、压缩盘等))、或非实体介质(例如，呈因特网或内部网络上的电子邮件或网址形式的电子介质)上。另外，结果亦可以声音形式记录且经由任一适宜介质(例如模拟或数字电缆线路、光纤电缆等)，经由电话、传真、无线移动电话、因特网电话及诸如此类传输。所有该等形式(实体及非实体)均可构成“可传输形式的信息”。因此，关于测试结果的信息及数据可在世界任何地方产生且可传输至不同位置。举例而言，在国外实施基因分型分析时，可以上述可传输形式产生并编制关于测试结果的信息及数据。由此，可将呈可传输形式的测试结果输入美国。因此，本发明亦涵盖产生含有关于个体中的p110催化结构域的859位置处是否发生突变的数据的可传输形式的信息的方法。此形式的信息可用于预测患者对PI3K抑制剂的治疗的反应性、基于该信息选择治疗过程及基于该信息选择性治疗患者。
[0125] 试剂盒
[0126] 本发明进一步提供用于测定在PI3K基因的人类催化性p110α亚单位的2575-2577位置处是否存在突变的试剂盒。该等试剂盒可用于选择将特别受益于经PI3K α亚单位抑制剂化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受的盐治疗的患者。试剂盒可包含可用于检测PI3K基因的人类催化性p110α亚单位的859位置处的突变的引物及/探针。试剂盒可进一步包含核酸对照、缓冲剂及使用说明书。
[0127] 熟习此项技术者可知许多类似于或等效于本文所述那些的方法及材料，其可用于实践本发明。实际上，本发明决不会受限于所述方法及材料。出于本发明的目的，下文对以下术语进行定义。
[0128] 实施例
[0129] 实施例1：用于具有p85同种型1的催化性p110α野生型及突变Q859A的克隆及表达的材料及方法
[0130] DNA操作及质粒：使用标准分子生物技术构建所述质粒。所有酶均是自Roche Diagnostics及New England BioLabs获得。使用GenElute PCR纯化试剂盒(Clean-up kit)(Sigma)纯化DNA片段或自制备型琼脂糖凝胶利用Nucleospin Extract II(Macherey-Nagel)分离。于室温下利用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)实施DNA-连接1至4小时且将其转入大肠杆菌DH5 α(Invitrogen)。利用QIAprep 8 Miniprep试剂盒(QIAGEN)或GenElute HP Plasmid Midiprep试剂盒(Sigma)纯化质粒DNA。所有程序均是如各自手册中所述实施。
[0131] 制备质粒His-Nativ hPI3k-α/p85 pDUAL Consensus。对于此结构物，藉由PCR自由Matthias Wymann(Institute of Biochemistry,University of Freibourg)提供的质粒使用表1中所示GATEWAY兼容性引物使含有牛PI3-K p110α同种型(RefSeq NM_174574.1)的整个开放阅读框的牛3243 bp DNA片段扩增。简言之，正向引物PI3Ka_FOR_GATE含有BamH I限制位点(单底线)、Kozak识别位点(双下划线)及GATEWAY克隆所需的attB1序列(斜体)，而反向引物PI3_Ka_REV_GATE含有Hind III限制位点(单底线)及attB2GATEWAY序列(斜体)。使用高保真度铂Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)遵循制造商的方案实施PCR扩增。
[0132] 表1：用于牛PI3-Kα PCR扩增的引物
[0133]
[0134] 在PCR后，使用30％ PEG 8000、30mM MgCl2纯化片段以移除attB引物二聚体，且将其转至GATEWAY入门载体pDONOR 201中。简言之，将4μL pf PCR产物(10ng/μL)与2μL反应混合物、1μL pDONOR 201(150ng/L)、2μL BP Clonase及1μL TE混合并于室温下培育60分钟，之后添加2μL蛋白酶K(2μg/μL)。随后将试样于37℃下再培育60分钟且随后使用其转化DH5α感受态细胞。随后藉由限制酶分析识别阳性重组PI3-Kα pDONOR质粒并进行序列验证(SOLVIAS)。随后将2μL新鲜制备的PI3-Kα pDONOR与2μL pDEST
20(150ng/μL)、2μL反应混合物、2μL LR Clonase及2μL TE混合。在DH5α感受态细胞转化前，于室温下如上文所述培育试样以产生GST-PI3-Kα pDEST 20。
20(150ng/μL)、2μL反应混合物、2μL LR Clonase及2μL TE混合。在DH5α感受态细胞转化前，于室温下如上文所述培育试样以产生GST-PI3-Kα pDEST 20。
[0135] 随后使用含有Spe I及Hind III(下划线)侧翼位点(表2)的基因特异性寡核苷酸，由GST-PI3-Kα pDEST 20扩增含有GST-PI3-Kα的整个开放阅读框的3933 bp PCR产物且如上文所述连接至p50pFastBac DUAL中。
[0136] 表2：用于GST-PI3-Kα PCR扩增的引物
[0137]
[0138] 随后藉由限制消化分析并进行序列验证(SOLVIAS)确认含有GST-PI3-Kα及经截短p85衔接蛋白(bovGST-PI3-Kα/p85 pFastbac DUAL)的阳性重组质粒。
[0139] 牛PIK3CA(p110α)及人类PIK3R1(p85α同种型1)的RefSeq登录号分别是NM_174574.1及NM_181523。
[0140] 藉由测序经由Solvias AG,Basel确认源自PCR的所有构建体的一级序列。
[0141] PCR扩增：利用MJ-Research DNA Engine PTC-200热 循环仪 在具 有Pwo Master(Roche)的100μl总体积中实施PCR-扩增。
[0142] 自1ng质粒pCMV6_XL5::p85α同种型1(目录编号TC11320,Origene)以500nM最终浓度的任一引物、1×主混合物、5％DMSO及以下引物，使全长衔接蛋白p85α(PIK3R1，1-724aa)扩增：p85upnew：5’-CCGCGGATCCACCATGAGTGCTGAGGGGTACCAG-3’(SEQ ID NO:7)，及p85do：5’-GCCGGAATTCTCATCGCCTCTGCTGTGCATATAC-3’(SEQ ID NO:8)。循环参数是：
94℃，2分钟；(94℃，15秒；53℃，30秒；72℃，60秒)10；(72℃，60秒+5秒/循环)19；72℃，
7分钟。
94℃，2分钟；(94℃，15秒；53℃，30秒；72℃，60秒)10；(72℃，60秒+5秒/循环)19；72℃，
7分钟。
[0143] 引物p85upnew及p85do分别在N末端及C末端处引入BamHI及EcoRI的限制酶位点。
[0144] 克隆：
[0145] pFastBac1中的p85 α同种型1(PI3KR1)的克隆
[0146] 利用BamHI及EcoRI切割杆状病毒载体pFastBac1(Invitrogen)及扩增的p85α同种型1DNA并进行凝胶纯化。于室温下实施连接1小时且转化感受态大肠杆菌DH5α细胞以获得质粒pFastBac::p85α同种型1。
[0147] pFastBac1中的催化性p110 α(PIK3CA)的克隆
[0148] 利用BamHI及HindIII消化质粒His-Nativ hPI3k-α p85 pDUAL。自琼脂糖凝胶纯化所得片段并于室温下连接至经相同限制酶切割的pFastBac1中达2至4小时。转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞中，从而产生质粒pFastBac::p110α。
[0149] 诱变
[0150] 利用QuikChange II定点诱变试剂盒(Stratagene(目录编号200523)及寡核苷酸p110Q859Aup
[0151] (5’-GAAATTCTCACACTATAATGGCTATTCAGTGTAAAGGAGGCCTG-3’)(SEQ ID NO:9) 及p110Q859Ado
[0152] (5’-CAGGCCTCCTTTACACTGAATAGCCATTATAGTGTGAGAATTTC-3’)(SEQ ID NO:10)遵循制造商的方案实施诱变以产生PI3Kα(p110α)突变Q859A。
[0153] 蛋白质表达：
[0154] (a)病毒产生及蛋白质表达
[0155] 藉由在大肠杆菌DH10 Bac(Invitrogen)中移位产生重组杆状病毒DNA。自单菌落分离杆粒DNA且随后转染至Sf9细胞中。根据Bac-至-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)的手册，在补充有10％FCS的TC-100培养基(Cambrex)中实施转染、扩增及噬菌斑分析。6
藉由标准噬菌斑分析测定病毒效价。在振荡烧瓶中，由1×10 个细胞/ml开始，在补充有
0.5×青霉素/链霉素溶液(Sigma)的ExCell-420培养基(JRH Biosciences有限公司)进行表达。
藉由标准噬菌斑分析测定病毒效价。在振荡烧瓶中，由1×10 个细胞/ml开始，在补充有
0.5×青霉素/链霉素溶液(Sigma)的ExCell-420培养基(JRH Biosciences有限公司)进行表达。
[0156] 为在表达期间重构催化性亚单位p110及衔接蛋白p85的活性全酶，同时用两种病毒共感染Sf9细胞。使蛋白质于27℃下遵循如别处所述的TIPS方案在100ml培养基中表达72h(例如，Erdmann等人(2010)，J.Biomol.Tech.；21(1):9-17)。改变p110对p85的相对共感染比率且最佳共感染比率是1:1。藉由检验全细胞裂解物藉由蛋白质印迹可视化蛋白质表达。PI3Kα蛋白质的溶解性较高(85-90％可溶)。
[0157] 蛋白质纯化：
[0158] 自杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞纯化重组蛋白质。将来自一份100ml发酵液的8
约1.5×10 个细胞重新悬浮于12ml裂解缓冲液(50mM Tris pH＝7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1％Triton X-100、10％甘油、6μl核酸酶(Benzonase)(25U/μl)、1×完全蛋白酶抑制剂(Roche)、1mM活化原钒酸钠)中并藉由超音波处理进行破坏(Branson数字超音波仪W-450D，总共3分钟，在冰/乙醇浴中(脉冲30秒，在脉冲之间冷却1分钟)。
藉由以14000x g离心(Sorvall离心机RC5-B，SS-34转子，11000rpm，于4℃下45分钟)移除细胞碎片且将上清液转移至新管。
约1.5×10 个细胞重新悬浮于12ml裂解缓冲液(50mM Tris pH＝7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1％Triton X-100、10％甘油、6μl核酸酶(Benzonase)(25U/μl)、1×完全蛋白酶抑制剂(Roche)、1mM活化原钒酸钠)中并藉由超音波处理进行破坏(Branson数字超音波仪W-450D，总共3分钟，在冰/乙醇浴中(脉冲30秒，在脉冲之间冷却1分钟)。
藉由以14000x g离心(Sorvall离心机RC5-B，SS-34转子，11000rpm，于4℃下45分钟)移除细胞碎片且将上清液转移至新管。
[0159] 对于p110α/p85α的组氨酸亲和力标签纯化，使用附接至 探查器FPLC系统的1ml His-Trap HP Ni-琼脂糖柱(目录编号17-5247-01，GE Healthcare)。将柱用25mM Tris-HCl pH 7.5、0.5M NaCl平衡，且将澄清裂解物以0.5ml/min的流速装载超级环(superloop)。在用10CV 25mM Tris-HCl pH＝7.5、0.5M NaCl、25mM咪唑洗涤后，将结合蛋白质用50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、125mM、150mM、250mM及500mM咪唑的逐步咪唑梯度洗脱。经由离心利用Amicon Ultra-15旋转柱将所洗脱蛋白质浓缩约10倍，且在添加甘油至最终30％(v/v)后，分成等分试样且在液氮中快速冷冻。
[0160] 一式双份地利用BCA蛋白质分析试剂盒(目录编号23227，Pierce)在微量滴定板中遵循与试剂盒一起提供的方案测定蛋白质浓度。
[0161] 酶 分析的材料及方法
[0162] 磷酸肌醇3-激酶(PI3-激酶或PI3K)同源时间分辨( )分析试剂 盒 是 购 自Upstate(现 为 Millipore公 司，Billerica,MA,USA)。PIP2及PiP3 是购 自 Avanti Polar Lipids(Alabaster,Alabama,USA)，微 板(microplates) 是 购 自Greiner(Frickenhausen,Germany；目录编号781207)。所有其他试剂均是购自Sigma(St Louis,MO,USA)。
[0163] 基本上如Sugita等人，(2008),Biochem.Biophys.Res.Commun.377(3):941-5所述实施酶同源时间分辨荧光( )分析(来自Upstate(现为Millipore公司，Billerica,MA,USA)。将PI3Kα(0.25-1.5ng)在室温下于含有10mM MgCl2、30μM ATP、
20μM1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1′-肌-醇-4′,5′-双磷酸盐)(铵盐)(PIP2)、150mM NaCl、5mM(dl-二硫苏糖醇)DTT及25mM Tris/HCl(pH 7.5)的20μl缓冲液中在384孔白色板中培育60分钟。针对抑制研究藉由添加ATP(30μM)且针对ATP动力学(0-200μM ATP)藉由添加PI3Kα起始激酶反应。
20μM1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1′-肌-醇-4′,5′-双磷酸盐)(铵盐)(PIP2)、150mM NaCl、5mM(dl-二硫苏糖醇)DTT及25mM Tris/HCl(pH 7.5)的20μl缓冲液中在384孔白色板中培育60分钟。针对抑制研究藉由添加ATP(30μM)且针对ATP动力学(0-200μM ATP)藉由添加PI3Kα起始激酶反应。
[0164] 在二甲基亚砜(DMSO)及缓冲剂(最终浓度：2.5％DMSO)中连续稀释PI3K抑制剂(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(下文为“化合物I”)。藉由添加HTRF试剂根据制造商的说明书停止激酶反应。密封板以防止蒸发并于室温下在黑暗中保持16小时。使用Tecan的 多标记读数器(来自Tecan集团有限公司，
Switzerland)以时间分辨荧光模式(激发滤光器：340nm；发射滤光器1：620nm；发射滤光器2：665nm；色镜：二向色2；延迟时间：150μs；积分时间：500μs；10次快闪)对板进行读数。
Switzerland)以时间分辨荧光模式(激发滤光器：340nm；发射滤光器1：620nm；发射滤光器2：665nm；色镜：二向色2；延迟时间：150μs；积分时间：500μs；10次快闪)对板进行读数。
[0165] 根据下式测定HTRF信号：
[0166] HTRF信号＝10000×(665nm下的发射/620nm下的发射)。
[0167] HTRF信号以PIP3依赖性方式逐渐减少且标准化为利用30μM1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1′-肌-醇-3′,4′,5′-三磷酸盐)(铵盐)(PIP3)获得的最大减少％。利用PIP3(EC50＝200nM)制备标准曲线且使用其根据下式计算藉由激酶反应产生的PIP3的量：
[0168] [PIP3]＝EC50×(100-y)/y
[0169] 其中y代表标准化HTRF信号且EC50代表标准曲线中50％信号下的PIP3浓度。ATP及PIP2消耗从不超过5％。
[0170] 藉由非线性回归利用Michaelis-Menten等式拟合ATP动力学且利用4参数对数等式拟合化合物I抑制曲线。使用 (ID Business Solutions,Guildford,UK)的总体拟合函数来使所有重复实验总体拟合。
[0171] 结果：
[0172] 使用上述材料及方法，该等实验证实PI3Kα的ATP活化动力学，如图1中所示及通过化合物I的PI3Kα野生型(wt)及Q859A突变的抑制，如图2中所示。
[0173] 图1提供PI3K野生型(wt)的14个实验的平均值±标准误差(S.E.)(米氏常数(Km)＝60±6μM)及PI3Kα Q859A突变体的5个实验的平均值±标准误差(Km＝72±8μM)。如此处图1中所概述，PI3K野生型(wt)及PI3Kα Q859A突变体证实PI3Kα的类似ATP活化动力学。
[0174] 图2提供PI3K野生型(wt)的10个实验及PI3Kα Q859A突变体的7个实验的平均值±标准误差(S.E.)。如此处图2中所概述，PI3Kα中的Q859A的突变与野生型(IC50＝8.4±1.0nM)相比IC50显著增加至122±28nM。IC50为122±28nM的此14.5倍增加明显证实，PI3Kα中的Q859的突变是评定化合物I在施用时的功效的关键残基。
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