专利汇可以提供应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及辣根过 氧 化物酶提取纯化的方法,尤其涉及一种应用单克隆 抗体 亲和 吸附 技术从辣根中提取纯化辣根过氧化物酶的方法。应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法,该方法采用针对辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和 力 的单克隆抗体与载体填料的藕联物,通过亲和层析的方法从辣根中提取、纯化辣根过氧化物酶。本发明采用单克隆抗体亲和吸附纯化HRP,不但节约时间,节约成本,而且不会产生很多废弃物,而且,与传统方法相比,酶的活性将大大提高,符合环境友好型和社会节约型社会建设需求。经此技术提取纯化的HRP产品质优价廉,将具有更强的市场竞争力,也符合技术发展对HRP越来越高的品质要求,因此,本发明将取代传统的沉淀纯化方法。,下面是应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法专利的具体信息内容。
1.应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法,其特征在于:该 方法采用针对辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体与载 体填料的藕联物,通过亲和层析的方法从辣根中提取纯化辣根过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法,其特征在于该方法的步骤如下:
①采用上样缓冲液匀浆辣根,离心去除沉淀;
②将上清夜加入到单克隆抗体与载体填料的藕联物亲和填料,室温孵育10~ 60分钟;
③采用上样缓冲液洗掉非结合杂蛋白;
④采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物酶HRP,并迅速用中和缓 冲液中和,得到所述的辣根过氧化物酶HRP。
3.根据权利要求2所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法,其特征在于:上样缓冲液采用PBS7.2;洗脱缓冲液采用0.05M甘氨 酸-盐酸缓冲液,PH2.7;中和缓冲液采用1M Tris-Cl,PH8.0。
4.根据权利要求3所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法,其特征在于:步骤④采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物 酶HRP的温度为20℃。
5.根据权利要求1或2所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物 酶的方法,其特征在于:载体填料采用琼脂糖凝胶4B、琼脂糖或免疫磁珠。
6.根据权利要求5所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法,其特征在于:载体填料采用琼脂糖凝胶4B。
7.根据权利要求1或2所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物 酶的方法,其特征在于:针对辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和力单克 隆抗体的选取方法由高亲和力单抗筛选和单抗对酶封闭活性测试组成。
8.根据权利要求7所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法,其特征在于高亲和力单抗筛选方法如下:
①市场采购针对HRP的特异性单抗;
②用包被缓冲液50mM碳酸盐,PH9.6,将特异性单抗按照不同浓度, 100μL/孔,包被于96孔酶标板中,4℃过夜;
③用PBS/Tween-20,洗板后,将HRP溶液分别加入包被特异性单抗孔和 空白孔,100μL/孔,37℃孵育30分钟;
④再次洗涤后,加入即用型3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB,显色液 II,室温反应10分钟,每孔加100μL终止液2M H2SO4终止反应,通 过酶标仪读取450nm吸光值OD450;
⑤比较不同的特异性单抗的OD450,选取相同实验条件下,OD450较高的单 抗进行抗体对酶封闭活性测试。
9.根据权利要求7所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法,其特征在于单抗对酶封闭活性测试方法如下:
①用包被缓冲液50mM碳酸盐,PH9.6,将特异性单抗按照不同浓度, 100μL/孔,包被于96孔酶标板中,4℃过夜;
②抗体对酶封闭活性测试也在96孔酶标板中进行,分别在包被特异性 单抗和空白酶标孔中滴加5μl HRP溶液;
③然后滴加100μl即用型TMB显色液II,室温反应10分钟,终止液 2M H2SO4终止反应,通过酶标仪读取450nm吸光值OD450;
④选取相同实验条件下OD450较高的单克隆抗体。
本发明涉及辣根过氧化物酶提取纯化的方法,尤其涉及一种应用单克隆抗 体亲和吸附技术从辣根中提取纯化辣根过氧化物酶的方法。
技术背景
过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC 1.11.1.7),通常来 源于辣根(Armoracia rusticana)(生长于欧洲和亚洲部分地区的多年生草本植 物),因此称辣根过氧化物酶,该酶是临床检验试剂中的常用酶,不但用于 多个生化检测项目,也广泛运用于免疫类实验检测等,过氧化物酶作为免疫 类显色体系的关键成分,对实验结果和相关产品质量的影响至关重要。
辣根过氧化物酶HRP比活性高,性质稳定,分子量小,所以被广泛地应 用于生命科学的各个领域。HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由 无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由至少 15同功酶(A1-A3,B1-B3,C1,C2,D,E1-E6)组成,其中以辣根过氧化物酶 C(HRP C)含量最高;HRP分子量为40,000,等电点为PH3~9(酸性(A型), 中性(B和C型),碱性(D和E型)),酶催化的最适PH因供氢体不同而稍 有差异,但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP 的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm/ OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值 应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。
早在80年前,HRP已经被纯化,并且被广泛应用在生物学各个领域;传统 的生产HRP的方法多是用硫酸铵和乙醇沉淀,这种方法不但产生大量废料污染 环境,酶的回收率低,纯度低,而且酶的活性在纯化过程也大大降低;在很多 情况下,HRP需要通过亲和吸附或者色谱分离技术进一步纯化,曾经有学者分别 用刀豆蛋白A(Con A)和苯氧肟酸(BHA)色谱技术纯化HRP,但是不能有效 避免蛋白质的非特异性结合问题(HRP是一种糖蛋白),生产的HRP纯度不高。
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