所述测量采用如图1所示的低相干性相散干涉计10。输入 光12由上方的激光束产生，所述输入光具有基频和优选的二次 谐波。光源14可以是低相干性的Ti:蓝宝石激光器，所述激光 器产生波长为800nm的150fs的光脉冲。所述二次谐波由标准 频率倍增器产生。上方的光束在分光镜16处被分为两个部分。 其中一部分光束通过带有反射镜M2的干涉计的信号臂，穿过 浑浊介质18两次。另一部分光束穿过补偿器(装满水的容器)15 并从在参考臂的参考反射镜M1处反射。所述参考反射镜M1以 匀速度20移动并引起了返回光束的多普勒相移。重新结合后的 光束应用二向色镜DM将波长分开，并分别由光电探测器D1和 D2测量。结果产生的两光波长外差信号被测量并被16-bit 100kHz的A/D转换器24数字化，该数字信号通过数据处理器 26被处理和存储。根据所述多普勒相移，每一数字化的信号围 绕其中心外差频率为带通的。被滤波掉的信号通过希耳伯特变 换，得到了各自的相位Ψ1(基频)和Ψ2(二次谐波)。相对相 位技术已用来测量材料的分布和空气的折射率分布。
传统的干涉计中，如光波长的一小部分的微小的光程的改 变都会极大的改变测得的相位值；因此，没有独立的消除信号 不稳定性的方法，相位测量就不能直接得到物理上的相关的信 息。然而，可以看到本发明的干涉计的信号臂或参考臂的不稳 定的长度都将分别通过k1Δx和k2Δx，使相位Ψ1和Ψ2，产生改 变，其中k1和k2为光束的基频和二次谐波的自由空间波数。由 于k2为k1的两倍，不稳定的影响可以通过从Ψ2中减去两倍的 Ψ1被完全消除。注意到当一波长为另一波长的整数倍的时候， 这样的消除才是有可能的。这样的操作得到，ΔLk2，k1，即在干 涉计中的两光波长的光程差，其具有极高的灵敏度：
${\mathrm{\Delta L}}_{k_2,k_1}=\frac{{\psi }_2-2\psi }{k_2},---\left(1\right)$
在如下的试验中，光程差的灵敏度达到约5nm，或相应于 关于二次谐波光的约9×10-2rad的相位差。
在其中一个优选的实施方式中，穿过一个由在水中的散射 聚苯乙烯构成的10mm厚的浑浊介质的光的相位可以被测量。 具有同样厚度的充满水的透明容器在这里作了相位补偿。注意 到，由于弹道光穿过了盖透明容器两次，有效厚度L为20mm。 给定尺寸的聚苯乙烯微球逐步的加入到信号臂的透明容器中， 并测量出光程差的变化。所述微球的体积数值η从8×10-6到3 ×10-3。微球的相对折射率与水的相比，在800nm时为1.2，在 400nm时为1.23。每个光程差的测量值用来得到在透明容器中 两不同波长光的微小的相速度变化：Δv2/v2-Δv1/v0。其中
$\frac{\Delta v_2}{v_0}-\frac{\Delta v_1}{v_0}=\frac{\Delta L_{k_2,k_1}}{n_{0}L},---\left(2\right)$
其中v0为光在水中传播速度，n0为水的折射率。注意到由 于对计算来说没有影响(只有极小的影响)，水的离差和混浊度 的二阶校正被忽略不计。本系统可以测量小到107的2成数的相 速度差的改变。这样的测量是在微球持续的从10nm到10mm的 半径改变下得到的。附图2中的数据点示出了作为散射体尺寸 函数的微小相速度差。
弹道光通过浑浊介质的传输特性可以由一个复杂的折射率 公式表示ncx＝n-in′。所述弹道光场，E(L)，(其中L为在浑浊 介质中的传输距离)可以被写为一个复杂的入射场的幂指数的 衰减，E(0)：
$E\left(L\right)=E\left(0\right)e^{{-\mathrm{ikn}}_{\mathrm{ex}}L}=E\left(0\right)e^{-\mathrm{ikn}(n-{\mathrm{in}}^{\prime })L},---\left(3\right)$
其中k为环境介质的波数。折射率部分可以由S(0)项表 示，散射函数的评估在输入光的前向作出。
$n=1+\frac{2\mathrm{\pi N}}{k^3}\mathrm{Im}\left(s\left(0\right)\right),---\left(4a\right)$
$n^{\prime }=\frac{2\mathrm{\pi N}}{k^3}\mathrm{Re}\left(s\left(0\right)\right),---\left(4b\right)$
其中N为每体积中散射体的个数。
折射率的虚数部分由于散射与公知的弹道光衰减联系起 来，并被广泛的进行了研究。注意到由光学定律决定的，甚至 对于非吸收的微粒来说，衰减发生于前向。然而，散射体对于 折射率实数部分的影响就不能很快的测量得到；传统方法中， 引起可测量的n的改变需要很大的N值，以至于几乎没有弹道 光可被探测到。本发明的干涉计提供了非常灵敏的测量装置， 使得我们巧妙的避开这一问题。由此，我们就可以研究散射函 数中的虚数部分精细的变化。
为了阐明球形对于折射率(或相当于与之关联的相速度) 的作用，研究相对于环境介质折射率为m，半径为α的球体的van de hulst散射表示法。在这样的表示法中，直射的光线被引导穿 过一种球形散射体，并假定不会在进入和出射时发生偏离。这 在散射体的尺寸比光波长大并且它们的折射率差别很小时，是 相当正确的。然而，它给出了一种非常重要的物理理解，如下 所示，描述了大大的超越了限定的显著的特征。对于一种波长 的光来说，所述van de hulst表示法示出了微小相速度改变的如 下形式：
$\frac{\mathrm{\Delta v}}{v_0}=1-n=-\frac{3\eta }{2a^3{k}^3}{\left(\mathrm{ka}\right)}^2(\frac{\sin \rho }{{\rho }^2}-\frac{\cos \rho }{\rho }),---\left(5\right)$
其中ρ＝2kα(m-1)为标准化散射体尺寸，(m-1)为散射 体与环境介质间的相对折射率差。应用van de hulst表示法的Δ v/ηv0的曲线图标在附图3中示出。作为比较，基于Mie理论的 精确的计算同样在表中示出。
根据散射体的属性不同，图3显示了三种弹道光传播的不 同状态。应用van de hulst表示法来进行逐一的分析：
I.ρ＜＜1-如松散介质的浑浊介质。
在这个界限中，方程(5)简化为：
                                          (6)
        Δv＝-ηv0(m-1)
在这种情况下，相速度的变化仅仅取决于当前小散射体中 松散材料折射率的改变。从另一方面开来，当穿过散射体的相 滞后很小时，由折射率差决定的相速度最终的结果为完全改变。
II.ρ≈1-没有简化。
在这种状态下，方程(5)不能被简化。随着ρ的变化，相 速度发生振荡。最终的相速度的改变极大程度上依赖于前向散 射光是否与输入光同相或异相。注意到，不论散射体决计有比 水高的折射率，对于ρ值还是有不规则的相速度增长。在这种情 况下，所述介质的有效折射率通过附加具有更高折射率的材料 来减小。
III.ρ＞＞1-相速度与浑浊度无关。
在这一界定下，方程(5)被简化为：
                                          (7)
            Δv_0
所述相速度与当前混浊度无关。光子学模型仅仅给出了这 一状态时的完全描述。在物理学的理解上，我们知道当ρ很大时， 传输光线的相位随着与球面中心距离的增加而迅速的变化。最 终结果为传输光线的平均相变为0。
上述描述都是基于单波长弹道光的传播特性。基于两种不 同波长光的相速度差，所述第三种状态可以清楚的看到(图2)。 由van de hulst表示法计算预测得出的相速度变化和由Mie理论 得到的精确的结果同样在附图2中示出。虽然是近似的，然而van de hulst表示法还是与测量数据很好的吻合。
两不同波长的相速度差显示了一种附加的现象，该现象不 在单波长特性中，出现了引人注意的反色散区域(相对于水)。 奇特的是，该反色散是由附加的适当尺寸的正色散散射体产生 的。这一效应归因于从波长标定的ρ中产生的相速度剖面图的转 换。注意到上述的谈论并不取决于异常相速度的增长。
通过扫描基频/二次谐波，相速度差剖面图的区别特征使得 在多分散的介质中获得精确的散射体尺寸分布成为可能。由基 于相位测量得到的极度灵敏性确保了高精确度。所述方法补充 了有关基于强度的测量细胞核尺寸分布技术，即一种重要的生 物细胞组织中癌症前期的变化指示器。这种情况下，得到基于 穿过标本的弹道光的相位改变的图象信息。这里所述的相位测 量方法同样可以成为成像技术的基础，所述成像技术为传统相 差显微镜(PCM)。比较于PCM，通过应用导弹光得到的细胞 组织不同类型的信息，其中测量量源于散射光。本发明的性能 在色散的和微弱散射的细胞组织中应用优于PCM。
在如附图4所示的一个本发明的干涉计28的实施方式中， 显微物镜O3和O4定焦于如切离的细胞组织采样上的光束，其 具有约7μm的波长的FWHM，然而，将返回光路于进入光路 交叠对准是很困难的，这样降低了分别率约10微米。通过应用 高能物镜和精确对准，可以得到更精细的分别率。参考反射镜 以匀速1mm/s移动，在返回光速产生多普勒相移。如前所述， 两个复合光束重结合起来，并由二向色分光镜反射镜分开它们 的波长部分，该由光电探测器分别测量。
为了阐明本发明的灵敏性，通过在水中加小量DNA，测量折 射率分布的改变。所述测量通过替换显微物镜(O1和O2)，和在 透明容器中的非常稀释的鲱鱼测试DNA采样(0.014％体积浓度) 完成。在本特定的实施例中，所述透明容器的厚度为10nm，使得 系统中的两次通过的设置为L＝20mm。所述补偿器30和与其关 联的物镜(O3和O4)相应的由包含水的透明容器替换。基于十 次独立测量，测得的折射率分布为(2.27±0.04)×10-6。
已有技术提供了定性的测量使得像中吸收和相移作用难分 开。本发明提供了定量测定相移的方法。而且，已有技术依赖 于对比目标的散射与非散射光之间的微小相移，而本发明直接 测量与目标折射关联的非散射光的微小相移。其结果为基于干 涉技术探测到的非散射光远比散射光有效。因此，本发明的方 法可应用于没有或几乎没有散射时而需要定量分析的情况。
作为举例说明，比较已有的相差技术和本发明的方法测量 夹在两玻片中的一滴水和一滴DNA溶液(1.0％体积浓度)。两 玻片间的间隔为170μm。可以清楚的看到，如图5中已有的相 差技术产生较差的像，而应用PDM可以很容易的区分所述两个 液滴并提供了该DNA溶液的折射率分布。相反，已有的相差技 术产生的像就很难将二者区分开来。令人感兴趣的是，本实验 测得的折射率分布(1.3±0.2)×10-4，不同于基于浓度率，从透 明容器的测量推导的1.6×10-4。所述数值的不同由基于散射体尺 寸大小的折射率造成，即浓度。由此，在较高浓度时，作为散 射体的DNA集合的构成有效的改变了折射率。
进一步举例说明使用本发明的相散方法对脑细胞组织采样 的成像。用显微薄片切片机从冷冻的脑细胞组织块制备16μm 厚的采样。该采样从阿滋海默氏症(脑组织退行性疾病)的病 人尸体解剖中获得。应用一滴甘油(丙三醇)保持采样的湿润。 图6A示出了应用相差(上)和相散(中)从相同采样中得到的 图象。比较看来，从相邻的薄层着色的采样仍可从下面的图中 看出。由此可见，由于脑组织细胞微弱的散射，相差成像仅仅 显示了灰质和白质间细微的差别。比较而言，使用本发明的方 法，由于上述两种细胞组织的生物构成的差别，可以得到上述 两者间非常清楚可见的差别。
通过反向散射几何学，应用相散方法同样还可以提供3D成 像。该方法提供了活体内位置的层析的相散像。该技术对由微 小的生物差别而表现出来的折射率的变化特别灵敏。然且，同 时测量外差信号的振幅和相位，得到折射率的实部和虚部，这 样就得到了所述采样的扫描数据的更完整的组合。
如图6B所示，左上图示出了成像的结构图，下方的图示出 了分别由800nm和400nm进行OCT成像的图，可以看到，两个 图难以区分凝胶与水。右上图示出了所述结构的相差图，光线反 射回来之后，在低波段区可以清楚的限定出凝胶与水的边界。
由此，通过对基频/二次谐波的光谱扫描，可测量得到精细 的细胞组织的散射尺寸分布。由于基于相位的测量对散射体尺寸 的折射率决定的光谱变化很敏感，该尺寸特征远远超过了现行的 三维象素分辨率。本方法补充了相对基于强度产生细胞组织尺寸 分布和细胞核的染色质的的三维像的技术，所述尺寸分布和细 胞核核染色质提供了非常重要的细胞组织的早期癌变的信息。
在本发明的第一实施方式中，两种不同波长的光需要源自 一个低相干性的光源。例如，毫微微秒Ti:蓝宝石激光源及其二 次谐波发生器。另一个实施例为，提供两个适当波长的超冷光 二极管。在这一实施例中，两个波长的光穿透同样的扫描深度 并被散射/反射而返回。它们的相对相位在两光分别与各自的参 考臂部分干涉形成外差信号后被测量。
在如附图7所示的优选实施方式中，该方式为3D成像系统 50，其中只一个波长的光需要由低相干性光源52产生。第二波 长的光由相干性的连续波光源54(CW)(或其他相干光源)产 生。另外需要该光源的相关波长大于扫描的总深度。
这样的情况下，光源从目标的显性的反射/散射表面60的反 射部分64与从参考臂返回的那部分光发生干涉，产生连续的基 于目标细胞组织68的深度方向测量的外差信号。使用上述相同 的方法，该相位可以通过应用两光束中低相干性的那部分光而 被消除不稳定的噪声。所述两光束中低相干性的那部分光穿过 被扫描的深度而被反射/散射返回。该返回光与从参考臂返回的 那部分光发生干涉而形成连续的外差信号。在上述应用两个低 相干性光源的成像系统的实施方式中，两不同波长的光束通过 并被所述细胞组织反射和/或散射。
附图8所示的实施方式为一个应用光纤的系统200，该系统 结合本发明前述的光散射分光镜系统，通过光纤进行光信号的 传送和接收。一光源提供了包含至少两种波长λ1，λ2的光束 202，该光束202耦合进入邻近的光纤204。一光束分路器206 结合在光纤系统中，将光束分为两部分进入光纤206和210中， 光束分别通过透镜216和214。第一部分光由向220方向的移 动反射镜220反射经过光纤210和212返回。第二部分光被导 向细胞组织218上，被细胞组织218散射后经由208和212返 回。二向色反射镜230将两波长(λ1，λ2)的光分离后，分别由 探测器240和242探测。该外差探测系统250和252如前图1 所示的系统来进行处理。这里所述的系统可以与标准内窥镜结 合使用，来提供检查到的人体内的内腔和细胞组织诊断信息。
虽然本发明由这里所述的优选实施方式表示出来，本领域 普通技术人员可以理解，在不偏离本发明权利要求的范围内， 本发明在形式和细节上可以有很多不同的改变。
相关申请
本申请是继2000年6月9日提交的美国申请No.09/591,297 的部分继续申请。上述申请给出的全部教导都通过在此引述而 合并于本文。
政府支持
本申请由国家健康协会的Grant Nos.P41-RR02594，1F32 RR05075-01和1F32 CA80345-01以及国家科学基金的Grant No.9708265CHE全部和部分支持。政府拥有本发明的某些特定 权益。