构象动力肽
阅读：163发布：2021-02-26
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1.一种针对能够展现出与淀粉样蛋白生成性疾病有关的构象变化的靶蛋白的肽探针，其中所述肽探针是肽或肽模拟物，其(i)由10至50个氨基酸残基组成，其包含作为参照序列变体的氨基酸序列，所述参照序列由所述靶蛋白的β-片层形成区的氨基酸序列组成，(ii)能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者，并(iii)在结合靶蛋白后经历产生可检测信号的构象变化，其中
所述变体序列相对于所述参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除，使得(A)所述变体序列的无规卷曲/α-螺旋构象比由所述参照氨基酸序列组成的探针在氧化环境中更稳定；和/或
(B)无规卷曲/α-螺旋构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离与β-片层构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离不同；和/或
(C)所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后比所述参照序列更有效地采用β-片层构象；和/或
(D)所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序的构象；和/或
(E)所述变体序列的β-片层结构在热力学上没有所述参照序列的β-片层结构强；
和/或
(F)所述变体序列比所述参照序列具有升高的稳定性和/或降低的反应性；和/或(G)所述变体序列比所述参照序列具有升高的亲水性和/或在水溶液中的溶解度；和/或
(H)所述变体序列比所述参照序列具有额外的Aβ结合基序；和/或
(I)所述变体序列具有增强的形成聚集体的能力。
2.权利要求1的肽探针，其中所述肽探针在N端、C端、这两端、或者在所述肽在结合靶蛋白后经历构象变化时产生信号的一个或多个位置处用可检测标记物来标记。
3.权利要求1-2中任一项的肽探针，其中所述肽探针用两种或更多种标记物来标记，其中在所述肽探针结合靶蛋白时所述肽探针上的两种或更多种标记物间的距离与在所述肽探针未结合靶蛋白时的所述距离不同。
4.权利要求1-3中任一项的肽探针，其中在所述肽探针结合靶蛋白时由所述可检测标记物产生的所述信号与在所述肽探针未结合靶蛋白时产生的所述信号不同。
5.权利要求3的肽探针，其中所述肽探针用可检测标记物对来标记，所述可检测标记物对选自受激子对、FRET对和荧光团/猝灭剂对。
6.权利要求5的肽探针，其中所述肽探针用受激子对来标记，并在所述肽探针展现出β-片层构象时发射受激子信号。
7.权利要求2-6中任一项的肽探针，其中所述可检测标记物包含芘模块。
8.权利要求5的肽探针，其中所述肽探针用FRET对来标记，并在所述肽探针展现出β-片层构象时发射荧光共振转移(FRET)信号。
9.权利要求8的肽探针，其中所述FRET对选自下组：DACIA-I/NBD、Marina蓝/NBD、丹酰/Trp、和EDANS/FAM。
10.权利要求5的肽探针，其中所述肽探针用荧光团/猝灭剂对来标记，且其中所述荧光团信号在所述肽探针展现出β-片层构象时被猝灭。
11.权利要求10的肽探针，其中所述荧光团/猝灭剂对选自下组：芘/Dabcyl、EDANS/Dabcyl和FAM/Dabcyl。
12.权利要求1-11中任一项的肽探针，其中所述一个或多个氨基酸添加、替代或删除是在所述参照序列的内部部分做出的。
13.权利要求1-12中任一项的肽探针，其中所述一个或多个氨基酸添加、替代或删除是在所述参照序列的N端或C端做出的。
14.权利要求1-13中任一项的肽探针，其中变体序列进一步包含在C端添加的赖氨酸残基。
15.权利要求1-14中任一项的肽探针，其中所述变体序列包含用抗氧化的残基替换甲硫氨酸残基。
16.权利要求15的肽探针，其中所述甲硫氨酸残基用丙氨酸残基替换。
17.权利要求1-16中任一项的肽探针，其中所述变体序列包含用丙氨酸残基替换或添加所述参照序列的至少3个连续的残基。
18.权利要求1-17中任一项的肽探针，其中所述一个或多个氨基酸添加、替代或删除将盐桥引入所述变体序列中。
19.权利要求18的肽探针，其中所述变体序列包含选自下组的残基间的盐桥：谷氨酸残基和组氨酸残基、谷氨酸残基和精氨酸残基、和谷氨酸残基和赖氨酸残基。
20.权利要求1-19中任一项的肽探针，其中所述一个或多个氨基酸添加、替代或删除将Aβ结合基序引入所述肽探针中。
21.权利要求20的肽探针，其中所述Aβ结合基序包含GXXEG。
22.权利要求1-21中任一项的肽探针，其中所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序的构象。
23.权利要求22的肽探针，其中所述靶蛋白是Aβ蛋白，而所述变体序列包含一处或多处选自下组的替代：G29H、G29R、G29K、和G33E。
24.权利要求22或权利要求23的肽探针，其中所述变体序列的β-片层结构在热力学上没有所述参照序列的β-片层结构强。
25.权利要求24的肽探针，其中所述靶蛋白是Aβ蛋白，而所述变体序列包含一处或多处选自下组的替代：I32S、F19S、S26D、H29D、I31D、L34D、和L34P。
26.权利要求1-25中任一项的肽探针，其中所述变体序列比所述参照序列具有升高的亲水性和/或在水溶液中的溶解度。
27.权利要求26的肽探针，其中所述变体序列包含一处或多处引入谷氨酸残基和/或d-精氨酸残基的氨基酸添加或替代。
28.权利要求26的肽探针，其中所述变体序列与亲水性模块缀合。
29.权利要求28的肽探针，其中所述亲水性模块包含可溶性聚乙二醇模块。
30.权利要求1-29中任一项的肽探针，其中可检测标记物与所述肽探针的末端赖氨酸残基的侧链缀合。
31.权利要求1-30中任一项的肽探针，其中可检测标记物与所述肽探针的内部赖氨酸残基的侧链缀合。
32.权利要求1-31中任一项的肽探针，其中所述肽探针与生物素模块缀合。
33.权利要求32的肽探针，其中所述肽探针经由肽接头与生物素模块缀合。
34.权利要求33的肽探针，其中所述肽接头选自下组：柔性接头、螺旋接头、凝血酶位点接头和扭结接头。
35.权利要求34的肽探针，其中所述接头包含选自由SEQ ID NO：56-60组成的组的氨基酸序列。
36.权利要求32的肽探针，其中所述肽探针经由内部赖氨酸残基的侧链与生物素模块缀合。
37.权利要求1-36中任一项的肽探针，其中所述靶蛋白是Aβ蛋白。
38.权利要求37的肽探针，其中所述变体序列包含选自由SEQ ID NO：2-55组成的组的氨基酸序列。
39.权利要求37的肽探针，其中所述变体序列包含氨基酸序列SEQ ID NO：2(肽22)。
40.一种针对能够展现出与淀粉样蛋白生成性疾病有关的构象变化的靶蛋白的肽探针，其中所述肽探针是肽或肽模拟物，其(i)由10至50个氨基酸残基组成，其包含作为参照序列变体的氨基酸序列，所述参照序列由所述靶蛋白的β-片层形成区的氨基酸序列组成，(ii)能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者，并(iii)在结合靶蛋白后采用不太有序的构象。
41.权利要求40的肽探针，其中所述肽探针在N端、C端、这两端、或者在所述肽在结合靶蛋白后经历构象变化时产生信号的一个或多个位置处用可检测标记物来标记。
42.权利要求41的肽探针，其中所述肽探针用可检测标记物对来标记，所述可检测标记物对选自受激子对、FRET对和荧光团/猝灭剂对。
43.权利要求42的肽探针，其中所述肽探针用受激子对来标记，并在所述肽探针未结合靶蛋白时发射升高的受激子信号，而在所述肽探针结合靶蛋白时发射升高的自身信号。
44.权利要求43的肽探针，其中所述受激子对包含两个芘模块。
45.权利要求42的肽探针，其中所述肽探针用FRET对来标记，并在所述肽探针未结合靶蛋白时发射升高的荧光共振转移(FRET)信号，而在所述肽探针结合靶蛋白时发射非FRET荧光团信号。
46.权利要求42的肽探针，其中所述肽探针用荧光团/猝灭剂对来标记，并在所述肽探针未结合靶蛋白时发射降低或猝灭的信号，而在所述肽探针结合靶蛋白时发射荧光团信号。
47.权利要求40-46中任一项的肽探针，其中所述靶蛋白是Aβ蛋白。
48.权利要求47的肽探针，其中所述变体序列包含选自由SEQ ID NO：2-4、14-15和
28-35组成的组的氨基酸序列。
49.权利要求1-36和40-46中任一项的肽探针，其中所述靶蛋白选自下组：淀粉样胰岛多肽前体蛋白、淀粉样β蛋白、Aβ肽、血清淀粉样蛋白A、胰岛素、amylin、非淀粉样蛋白β组分、朊病毒、血红蛋白、免疫球蛋白或其片段、β2-微球蛋白、α-突触核蛋白、视紫红质、α1-抗胰凝乳蛋白酶、晶体蛋白、τ、p53、早老蛋白、低密度脂蛋白受体、载脂蛋白、超氧化物歧化酶、神经丝蛋白、运甲状腺素蛋白、原降钙素或降钙素、心房钠尿因子、凝溶胶蛋白、囊性纤维化跨膜调节物、亨延顿氏病蛋白、血纤蛋白原α-链、苯丙氨酸羟化酶、胶原、β-氨基己糖苷酶、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白。
50.一种用于检测测试样品中的靶蛋白的方法，其中所述靶蛋白展现出与淀粉样蛋白生成性疾病有关的β-片层构象，包括
(i)使所述样品与权利要求1-49中任一项的肽探针接触以形成测试混合物；并(ii)检测所述肽探针与所述样品中存在的任何靶蛋白间的任何结合。
51.权利要求50的方法，其中所述肽探针在N端、C端、这两端、或者在所述肽在结合靶蛋白后经历构象变化时产生信号的一个或多个位置处用可检测标记物来标记。
52.权利要求51的方法，其中所述肽探针用两种或更多种标记物来标记，其中在所述肽探针结合靶蛋白时所述肽探针上的两种或更多种标记物间的距离与在所述肽探针未结合靶蛋白时的所述距离不同。
53.权利要求51-52中任一项的方法，其中在所述肽探针结合靶蛋白时由所述可检测标记物产生的所述信号与在所述肽探针未结合靶蛋白时产生的所述信号不同。
54.权利要求50-53中任一项的方法，其中所述肽探针用可检测标记物对来标记，所述可检测标记物对选自受激子对、FRET对和荧光团/猝灭剂对。
55.权利要求54的方法，其中所述肽探针用受激子对来标记，并在所述肽探针展现出β-片层构象时发射受激子信号。
56.权利要求55的方法，其中所述可检测标记物包含芘模块。
57.权利要求54的方法，其中所述肽探针用FRET对来标记，并在所述肽探针展现出β-片层构象时发射荧光共振转移(FRET)信号。
58.权利要求54的方法，其中所述肽探针用荧光团/猝灭剂对来标记，且其中所述荧光团信号在所述肽探针展现出β-片层构象时被猝灭。
59.权利要求50-58中任一项的方法，其中步骤(ii)包括检测由在结合靶蛋白后经历构象变化的所述肽探针产生的任何信号。
60.权利要求51-58中任一项的方法，其中步骤(ii)包括检测包含所述肽探针和靶蛋白的复合物，其通过检测由所述复合物中存在的任何可检测标记物产生的任何信号来进行。
61.权利要求60的方法，其中所述复合物是不溶性复合物，且步骤(ii)包括检测由所述不溶性复合物中存在的任何可检测标记物产生的任何信号。
62.权利要求60的方法，其中所述复合物是可溶性复合物，且步骤(ii)包括检测由所述可溶性复合物中存在的任何可检测标记物产生的任何信号。
63.权利要求60的方法，其中该方法进一步包括在步骤(ii)前通过选自离心、大小排阻层析、和亲和层析的方法来分开所述复合物与所述测试混合物。
64.一种用于检测与淀粉样蛋白生成性疾病有关的靶蛋白的方法，其中肽探针在来自受试者的生理学样品中，包括
(A)使所述样品与肽探针接触，所述肽探针是肽或肽模拟物，其(i)由10至50个氨基酸残基组成，其包含作为参照序列变体的氨基酸序列，所述参照序列由所述靶蛋白的β-片层形成区的氨基酸序列组成，(ii)能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者，并(iii)在结合靶蛋白后采用不太有序的构象；并
(B)检测所述探针与所述样品中存在的任何靶蛋白间的任何结合。
65.权利要求64的方法，其中所述肽探针在N端、C端、这两端、或者在所述肽在结合靶蛋白后经历构象变化时产生信号的一个或多个位置处用可检测标记物来标记。
66.权利要求65的方法，其中所述肽探针用可检测标记物对来标记，所述可检测标记物对选自受激子对、FRET对和荧光团/猝灭剂对。
67.权利要求66的方法，其中所述肽探针用受激子对来标记，且步骤(ii)包括检测任何升高的自身信号或降低的受激子信号。
68.权利要求66的方法，其中所述肽探针用FRET对来标记，且步骤(ii)包括检测任何升高的非FRET荧光团信号或降低的FRET信号。
69.权利要求66的方法，其中所述肽探针用荧光团/猝灭剂对来标记，且步骤(ii)包括检测任何升高的荧光团信号。
70.一种用于在受试者中检测与淀粉样蛋白生成性疾病有关的靶蛋白的体内方法，包括
(A)对所述受试者施用权利要求1-49中任一项的肽探针，其中所述探针用在所述探针结合靶蛋白时产生信号的可检测标记物来标记，并
(B)检测所述信号。
71.权利要求70的方法，其中使用成像技术来检测所述信号。
72.权利要求71的方法，其中所述成像技术选自下组：正电子发射断层摄影(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、磁共振成像(MRI)、放射照相术、断层摄影术、荧光术、核医学、光学成像、脑照相术和超声波扫描术。
73.一种治疗患有或有风险形成淀粉样蛋白生成性疾病的受试者的方法，包括对所述受试者施用权利要求1-49中任一项的肽探针。
74.权利要求70-73中任一项的方法，其中所述探针与针对所述淀粉样蛋白生成性疾病的别的治疗剂缀合。
75.一种针对能够展现出与淀粉样蛋白生成性疾病有关的β-片层构象的靶蛋白的肽探针，其中所述肽探针
(i)由10至50个氨基酸残基组成，其包含作为参照序列变体的氨基酸序列，所述参照序列由所述靶蛋白的β-片层形成区的氨基酸序列组成，(ii)能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者，并(iii)在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用β-片层构象，其中
所述变体序列相对于所述参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除，使得(A)所述变体序列的无规卷曲/α-螺旋构象比由所述参照氨基酸序列组成的探针在氧化环境中更稳定；和/或
(B)无规卷曲/α-螺旋构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离与β-片层构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离不同；和/或
(C)所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后比所述参照序列更有效地采用β-片层构象。
76.依照权利要求1-49中任一项的肽在用于检测与淀粉样蛋白生成性疾病有关的靶蛋白的体内方法中的用途。
77.依照权利要求1-49中任一项的肽在治疗患有或有风险形成淀粉样蛋白生成性疾病的受试者的方法中的用途。
构象动力肽
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0003] 背景
[0004] 1.发明领域
[0005] 本发明提供了可用于例如检测具有特定构象的靶蛋白(包括错折叠蛋白质或具有可与疾病有关的β-片层二级结构的蛋白质)的构象动力肽(conformationally dynamic peptide)。还提供了检测此类靶蛋白、诊断与此类靶蛋白有关的疾病或其风险、和治疗与此类靶蛋白有关的疾病的方法。
[0006] 2.背景
[0007] 错折叠蛋白质病症的发病机制的特征在于正常的蛋白质转化成倾向于聚集的富含β-片层的构象。在阿耳茨海默氏病(AD)的病例中，淀粉样β(Aβ)蛋白自组装成神经毒性寡聚物和原纤维作为疾病的成因得到充分支持。与疾病有关的其它错折叠蛋白质包括传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy，TSE)、脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)、和脑血管疾病(CVD)中的朊病毒；帕金森病(Parkinson’s disease)的Lewy小体中的α-突触核蛋白沉积物、额颞痴呆(frontal temporal dementia)和皮克氏病(Pick’s disease)中神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle)中的τ；促淀粉样性侧索硬化(amylotrophic lateral sclerosis)中的超氧化物歧化酶；和亨延顿氏病(Huntington’s disease)中的亨延顿蛋白。参见例如Glenner等，J.Neurol.Sci.94：1-28，1989；Haan等，Clin.Neurol.Neurosurg.92(4)：305-310，1990。
[0008] 美国专利No.7,166,471、US 2006/0286672、US 2005/0026165、US 2008/0171341、US 2006/0057671和US 2008/0095706描述了可用于检测例如错折叠蛋白质、具有主要为β-片层的二级结构的靶蛋白、和处于特定自我聚集状态的靶蛋白的肽。可以在这些专利文件的任一篇(通过提及而将每篇的内容完整收入本文)中所描述的方法中使用本文中所描述的肽。
[0009] 发明概述
[0010] 依照一些实施方案，提供了针对能够展现出与淀粉样蛋白生成性疾病(amyloidogenic disease)有关的β-片层构象的靶蛋白的肽探针，其中所述肽探针(i)由10至50个氨基酸残基组成，其包含作为参照序列变体的氨基酸序列，所述参照序列由所述靶蛋白的β-片层形成区的氨基酸序列组成，(ii)能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者，并(iii)在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用β-片层构象或者在结合靶蛋白后经历产生可检测信号的构象变化。所述变体序列相对于所述参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除，使得(A)所述变体序列的无规卷曲/α-螺旋构象比由所述参照氨基酸序列组成的探针在氧化环境中更稳定和/或(B)无规卷曲/α-螺旋构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离与β-片层构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离不同和/或(C)所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后比所述参照序列更有效地采用β-片层构象和/或(D)所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序的构象和/或(E)所述变体序列的β-片层结构在热力学上没有所述参照序列的β-片层结构强和/或(F)所述变体序列比所述参照序列具有升高的稳定性和/或降低的反应性和/或(G)所述变体序列比所述参照序列具有升高的亲水性和/或在水溶液中的溶解度和/或(H)所述变体序列比所述参照序列具有额外的Aβ结合基序和/或(I)所述变体序列具有增强的形成聚集体的能力。在一些实施方案中，变体序列进一步包含在C端添加的赖氨酸残基。
[0011] 在一些实施方案中，所述肽探针在N端、C端、这两端、或者在所述肽采用β-片层构象或者在结合靶蛋白后经历构象变化时产生信号的一个或多个位置处用可检测标记物，诸如荧光标记物来标记。在一些实施方案中，所述肽探针用两种或更多种标记物来标记，其中在所述肽探针结合靶蛋白时所述肽探针上的两种或更多种标记物间的距离与在所述肽探针未结合靶蛋白时的所述距离不同。在一些实施方案中，在所述肽探针结合靶蛋白时由所述可检测标记物产生的所述信号与在所述肽探针未结合靶蛋白时产生的所述信号不同，诸如在肽探针展现出β-片层构象时的信号大于在肽探针展现出无规卷曲/α-螺旋构象时产生的信号。在这些中任一项实施方案中，所述肽探针可以用可检测标记物对来标记，所述可检测标记物对选自受激子对、FRET对和荧光团/猝灭剂对。在肽探针用受激子对诸如芘对来标记时，它可以在肽探针展现出β-片层构象时发射受激子信号。在肽探针用FRET对诸如DACIA-I/NBD、Marina蓝/NBD、丹酰/Trp、和EDANS/FAM来标记时，它可以在肽探针展现出β-片层构象时发射荧光共振转移(FRET)信号。在肽探针用荧光团/猝灭剂对，诸如芘/Dabcyl、EDANS/Dabcyl和FAM/Dabcyl来标记时，荧光团信号可以在肽探针展现出β-片层构象时被猝灭。
[0012] 在一些实施方案中，肽探针中的一个或多个氨基酸添加、替代或删除是在参照序列的内部部分做出的，或者在参照序列的N端或C端，或者在这两端，或者在内部和末端做出的。
[0013] 在一些实施方案中，所述变体序列包含用抗氧化的残基，诸如丙氨酸残基替换甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，所述变体序列包含用丙氨酸残基替换参照序列的至少3个连续的残基。
[0014] 另外/或者，在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸添加、替代或删除在两个残基间，诸如谷氨酸残基和组氨酸残基、谷氨酸残基和精氨酸残基、和/或谷氨酸残基和赖氨酸残基间引入盐桥。
[0015] 另外/或者，在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸添加、替代或删除将Aβ结合基序引入所述肽探针中，诸如GXXEG基序(SEQ ID NO：25)。
[0016] 另外/或者，在一些实施方案中，所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序的构象。在具体的实施方案中，靶蛋白是Aβ蛋白，而所述变体序列包含一处或多处选自下组的替代：G29H、G29R、G29K、和G33E。另外/或者，所述变体序列的β-片层结构在热力学上没有所述参照序列的β-片层结构强。在具体的实施方案中，所述变体序列包含一处或多处选自下组的替代：I32S、F19S、S26D、H29D、I31D、L34D、和L34P。
[0017] 另外/或者，在一些实施方案中，所述变体序列比所述参照序列具有升高的亲水性和/或在水溶液中的溶解度。在具体的实施方案中，所述变体序列包含引入谷氨酸残基和/或d-精氨酸残基的一个或多个氨基酸添加或替代。另外/或者，所述变体序列可以与亲水性模块(moiety)，诸如可溶性聚乙二醇模块缀合。
[0018] 依照前述中任一项实施方案，可检测标记物可以与所述肽探针的末端赖氨酸残基的侧链缀合，和/或与所述肽探针的内部赖氨酸残基的侧链缀合。
[0019] 依照前述中任一项实施方案，所述肽探针可以诸如经由肽接头与生物素模块缀合。在具体的实施方案中，所述肽接头选自下组：柔性(flexible)接头、螺旋接头、凝血酶位点接头和扭结接头。在更具体的实施方案中，所述接头包含选自由SEQ ID NO：56-60组成的组的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述肽探针经由内部赖氨酸残基的侧链与生物素模块缀合。
[0020] 依照一些实施方案，所述肽探针是肽或肽模拟物，其(i)由10至50个氨基酸残基组成，其包含作为参照序列变体的氨基酸序列，所述参照序列由所述靶蛋白的β-片层形成区的氨基酸序列组成，(ii)能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者，并(iii)在结合靶蛋白后采用不太有序的构象。在别的实施方案中，此类肽探针在N端、C端、这两端、或者在所述肽在结合靶蛋白后经历构象变化时产生信号的一个或多个位置处用可检测标记物来标记，诸如用选自受激子对、FRET对和荧光团/猝灭剂对的可检测标记物对来标记。在具体的实施方案中，所述肽探针用受激子对(诸如两个芘模块)来标记，并在所述肽探针未结合靶蛋白时发射升高的受激子信号，且在所述肽探针结合靶蛋白时发射升高的自身信号。在其它具体的实施方案中，所述肽探针用FRET对来标记，并在所述肽探针未结合靶蛋白时发射升高的荧光共振转移(FRET)信号，而在所述肽探针结合靶蛋白时发射非FRET荧光团信号。在其它具体的实施方案中，所述肽探针用荧光团/猝灭剂对来标记，并在所述肽探针未结合靶蛋白时发射降低或猝灭的信号，而在所述肽探针结合靶蛋白时发射荧光团信号。
[0021] 依照本文中所描述的任何实施方案，变体序列可以包含选自SEQ ID NO：2-55的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO：2-55的氨基酸序列组成。在具体的实施方案中，变体序列包含氨基酸序列SEQ ID NO：2(肽22)或者由氨基酸序列SEQ ID NO：2(肽22)组成。
[0022] 在一些实施方案中，变体序列包含用谷氨酸残基替换至少一个残基。在一些实施方案中，变体序列包含用组氨酸残基替换至少一个残基。在一些实施方案中，变体序列包含一处或多处选自下组的替代：用丝氨酸残基替换异亮氨酸残基；用脯氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酰胺残基或赖氨酸残基替换谷氨酸残基；用丝氨酸残基替换苯丙氨酸残基；用脯氨酸残基替换亮氨酸残基；用甘氨酸残基替换丙氨酸残基；和用天冬酰胺残基替换天冬氨酸残基。在一些实施方案中，变体序列包含在C端添加的赖氨酸残基。在一些实施方案中，肽探针包含选自由SEQ ID NO：2-8组成的组的氨基酸序列。
[0023] 依照其它实施方案，提供了用于检测测试样品中的靶蛋白的方法，其中所述靶蛋白展现出与淀粉样蛋白生成性疾病有关的β-片层构象，包括(i)使所述样品与本文中所描述的任何肽探针接触以形成测试混合物；并(ii)检测所述肽探针与存在的任何靶蛋白间的任何结合。
[0024] 在一些实施方案中，步骤(ii)包括检测由展现出β-片层构象或者结合靶蛋白后经历构象变化的肽探针的荧光标记物产生的任何信号。在一些实施方案中，步骤(ii)包括检测包含所述肽探针和靶蛋白的复合物，其通过检测由所述复合物中存在的任何可检测标记物(诸如荧光标记物)产生的任何信号来进行。在一些实施方案中，所述复合物是不溶性复合物(诸如淀粉样蛋白β原纤维)，且步骤(ii)包括检测由所述不溶性复合物中存在的任何可检测标记物(诸如荧光标记物)产生的任何信号。在一些实施方案中，所述复合物是可溶性复合物(诸如淀粉样蛋白β寡聚物)，且步骤(ii)包括检测由所述可溶性复合物中存在的任何可检测标记物(诸如荧光标记物)产生的任何信号。在一些实施方案中，方法进一步包括在步骤(ii)前通过选自离心、大小排阻层析、和亲和层析的方法来分开所述复合物与所述测试混合物。
[0025] 依照其它实施方案，提供了一种用于检测与淀粉样蛋白生成性疾病有关的靶蛋白的方法，其中肽探针在来自受试者的生理学样品中，包括(A)使所述样品与肽探针接触，所述肽探针是肽或肽模拟物，其(i)由10至50个氨基酸残基组成，其包含作为参照序列变体的氨基酸序列，所述参照序列由所述靶蛋白的β-片层形成区的氨基酸序列组成，(ii)能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者，并(iii)在结合靶蛋白后采用不太有序的构象；并(B)检测所述探针与所述样品中存在的任何靶蛋白间的任何结合。在一些实施方案中，所述肽探针在N端、C端、这两端、或者在所述肽在结合靶蛋白后经历构象变化时产生信号的一个或多个位置处用可检测标记物来标记。在具体的实施方案中，所述肽探针用受激子对来标记，且步骤(ii)包括检测任何升高的自身信号或降低的受激子信号。在其它实施方案中，所述肽探针用FRET对来标记，且步骤(ii)包括检测任何升高的非-FRET荧光团信号或降低的FRET信号。在其它实施方案中，所述肽探针用荧光团/猝灭剂对来标记，且步骤(ii)包括检测任何升高的荧光团信号。
[0026] 在其它实施方案中，提供了一种用于在受试者中检测与淀粉样蛋白生成性疾病有关的靶蛋白的体内方法，包括(A)对所述受试者施用如本文中所描述的任何肽探针，其中所述探针用在所述探针结合靶蛋白时产生信号的可检测标记物来标记，并(B)检测所述信号。在一些实施方案中，使用成像技术，诸如正电子发射断层摄影(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、磁共振成像(MRI)、放射照相术、断层摄影术、荧光术、核医学、光学成像、脑照相术和超声波扫描术来检测信号。
[0027] 在其它实施方案中，提供了一种治疗患有或有风险形成淀粉样蛋白生成性疾病的受试者的方法，包括对所述受试者施用本文中所描述的任何肽探针。在一些实施方案中，所述探针与针对所述淀粉样蛋白生成性疾病的别的治疗剂缀合。
[0028] 依照本文中所描述的任何实施方案，靶蛋白可以选自下组：淀粉样胰岛多肽前体蛋白、淀粉样β蛋白、Aβ肽、血清淀粉样蛋白A、胰岛素、amylin、非淀粉样蛋白β组分、朊病毒、血红蛋白、免疫球蛋白或其片段、β2-微球蛋白、α-突触核蛋白、视紫红质、α1-抗胰凝乳蛋白酶、晶体蛋白、τ、p53、早老蛋白、低密度脂蛋白受体、载脂蛋白、超氧化物歧化酶、神经丝蛋白、运甲状腺素蛋白、原降钙素或降钙素、心房钠尿因子、凝溶胶蛋白、囊性纤维化跨膜调节物、亨延顿氏病蛋白、血纤蛋白原α-链、苯丙氨酸羟化酶、胶原、β-氨基己糖苷酶、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白。依照具体的实施方案，靶蛋白可以是Aβ蛋白。
[0030] 图1A显示了芘的芘间距离随芘化(pyrenate)肽的溶剂环境的分布的计算机预测(左侧小图：水，右侧小图：40％TFE)，所述芘与对应于Aβ肽区的肽的每个末端缀合。
[0031] 图1B显示了在肽为β-片层构象时与肽的N和C端缀合的芘模块极其物理接近。
[0032] 图1C显示了在肽为无规卷曲/α-螺旋构象时与肽的N和C端缀合的芘模块间的距离。
[0033] 图2列出了本文中所描述的肽(SEQ ID NO 2-13)及其相对于野生型参照序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸添加和/或替代的具体实施方案，所述野生型参照序列基于“野生型”Aβ蛋白中具有供缀合荧光标记物用的C端添加的赖氨酸的氨基酸16-35。
[0034] 图3显示了使用肽探针(SEQ ID NO：1)来检测不溶性Aβ42靶蛋白纤维的基于离心的体外相互作用测定法的结果。
[0035] 图4A和图4B显示了使用经标记的肽探针(SEQ ID NO：4)来检测可溶性Aβ42靶蛋白寡聚物的基于大小排阻层析的体外相互作用测定法，其中图4B中显示了结果，其显示了在存在寡聚物的情况中回收经荧光标记的肽，指示肽探针结合靶蛋白寡聚物。用SEQ ID NO：1的经标记的肽探针获得相似的结果，如图14中所显示的。
[0036] 图5A和图5B显示了使用经标记的肽探针(SEQ ID NO：2)来检测经生物素标记的可溶性Aβ42靶蛋白寡聚物的基于亲和层析的体外相互作用测定法，图5B中显示了结果，其显示了仅在存在高分子量寡聚物的情况中在捕捉材料中检测出经标记的肽探针，指示肽探针结合靶蛋白寡聚物。用SEQ ID NO：1的经标记的肽探针获得相似的结果，如图15中所显示的。
[0037] 图6A显示了与参照肽(SEQ ID NO：1)相比与本文中所描述的肽(肽22；SEQ ID NO：2)的溶剂诱导的构象变化有关的最大信号获得的测定。图6B报告了与参照肽相比在存在原纤维淀粉样靶蛋白的情况中的肽构象变化有关的最大信号获得的测定结果。
[0038] 图7显示了pH和盐浓度对肽38(SEQ ID NO：3)的二级结构的影响，如通过圆二色性旋光分光法(CD)分析所测定的。
[0039] 图8显示了Aβ42寡聚物(靶蛋白)的相互作用对肽38(SEQ ID NO：3)的二级结构的影响，如通过CD分析所测定的。
[0040] 图9A和图9B显示了Aβ42寡聚物(靶蛋白)的相互作用对肽45(SEQ ID NO：4)的芘荧光特性的影响。图9A显示了肽-靶物复合物的荧光发射。图9B显示了单独的肽的荧光发射。
[0041] 图10显示了本文中所描述的肽探针在结合不同底物后的构象变化。顶部小图：在每个末端用芘标记的肽探针(诸如SEQ ID NO：1)在结合40％TFE中的Aβ纤维后采用增加的β-片层构象，如通过升高的芘受激子信号所检测的。底部小图A：在每个末端用芘标记的肽探针(诸如肽22，SEQ ID NO：2)在结合水中的Aβ寡聚物后采用不太有序(例如减少的β-片层)构象，如通过升高的芘单体(“自身”)信号所检测的。底部小图B：在每个末端用FRET标记物标记的肽探针在结合水中的Aβ寡聚物后采用增加的β-片层构象，如通过FRET信号所检测的。肽探针AD293(SEQ ID NO：52)、AD292(SE ID NO：53)、AD 291(SEQ ID NO：54)和AD 290(SEQ ID NO：55)已经展现出与此类构象变化一致的荧光行为。
[0042] 图11显示了在没有(左侧)和存在(右侧)可溶性Aβ寡聚物的情况中在每个末端用芘标记的肽22(SEQ ID NO：2)的原始荧光谱。肽22的荧光在没有寡聚物的情况中随时间是稳定的(没有单体或受激子荧光的升高)，但是在与可溶性Aβ寡聚物一起温育时展现出芘单体信号的升高。(实线＝时间0；虚线＝3小时；点线＝18小时)。
[0043] 图12显示了肽22(SEQ ID NO：2)对可溶性Aβ寡聚物的特异性。前两幅小图显示了在将肽22与通过两种不同方法制备的可溶性Aβ寡聚物一起温育时的芘单体信号的剂量依赖性升高。接着的两幅小图显示了在将肽22与Aβ40单体和Aβ42单体一起温育时没有荧光变化。接着的小图显示了在将肽22与Aβ40纤维一起温育时没有荧光变化，而接着的小图显示了在将肽22与Aβ42纤维一起温育时单体荧光的某些剂量依赖性升高。最后两幅小图显示了在将肽22与对照溶液(BSA或脱水酶)一起温育时没有荧光变化。数据显示了单体荧光面积随时间的自然对数(Ln)。(点线＝0.3uM底物；虚线＝0.1uM；虚线/点线＝0.03uM；实线＝单独的p22)。
[0044] 图13A和图13B显示了肽22(SEQ ID NO：2)在与可溶性Aβ42寡聚物相互作用后的构象变化。图13A显示了肽22在与可溶性Aβ42寡聚物相互作用后的荧光变化，从受激子转变成单体荧光。(实线：没有Aβ42寡聚物；虚线/点线：30nNAβ42寡聚物；大虚线：100nNAβ42寡聚物；小虚线：300nNAβ42寡聚物)。图13B显示了肽22的二级结构，如通过CD分析所测定的，所述CD分析在存在Aβ42寡聚物的情况中没有检测到通过芘荧光变化可检测的构象变化。(实线：肽22；虚线/点线：Aβ42寡聚物；大虚线：个别样品的结果的算术和；小虚线：肽22和Aβ42寡聚物的混合物)。
[0045] 图14A和图14B显示了使用经标记的肽探针(SEQ ID NO：1)来检测可溶性Aβ42靶蛋白寡聚物的基于大小排阻层析的体外相互作用测定法，图14B中显示了结果，其显示了在存在寡聚物的情况中回收经荧光标记的肽，指示肽探针结合靶蛋白寡聚物。
[0046] 图15A和图15B显示了使用经标记的肽探针(SEQ ID NO：1)来检测经生物素标记的可溶性Aβ42靶蛋白寡聚物的基于亲和层析的体外相互作用测定法，图15B中显示了结果，其显示了仅在存在高分子量寡聚物的情况中在捕捉材料中检测出经标记的肽探针，指示肽探针结合靶蛋白寡聚物。
[0047] 发明详述
[0048] 1.定义
[0049] 如本文中所使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述/该”指单数和复数两者，除非明确规定仅指单数。
[0050] 术语“约”及一般的范围使用(无论是否通过术语约来量化)意为所理解的数目不限于本文中所列的精确数目，而且意图指基本上在所引用的范围内同时不背离发明范围的范围。如本文中所使用的，“约”会是本领域普通技术人员理解的，而且会随使用其的上下文而在一定程度上变化。若使用该术语之处本领域技术人员鉴于使用其的上下文无法清楚其含义，则“约”会指具体项的多至±10％。
[0051] 如本文中所使用的，“受试者”表示需要检测或治疗性处理的任何动物，包括人和驯养动物，诸如猫、犬、猪、牛、绵羊、山羊、马、家兔，等等。“受试者”还包括研究背景中所使用的动物，包括小鼠和其它小哺乳动物。典型的受试者可以有状况、疾病或病症的风险或者被怀疑为患有此类状况，或者可以渴望测定在具体状况，诸如与靶蛋白有关的状况、疾病或病症方面的风险或状态。如本文中所使用的，“治疗性”处理包括施用治疗剂以治疗现有的状况，预防受试者有风险或形成的状况，或者用于健康维持。
[0052] 如本文中所使用的，“构象”指蛋白质或肽的特定二级结构，例如α-螺旋、无规卷曲或β-片层二级结构。“构象变化”指从一种构象改变成另一种。
[0053] “朊病毒”指与基于朊病毒的疾病有关的蛋白质。“PrP蛋白”、“PrP”、等等在本文中可互换使用，意为已知在人和动物中引起疾病(诸如海绵状脑病)的感染性颗粒形式Sc Sc C(“PrP ”)和在合适的条件下转化成感染性PrP 形式的非感染性形式(“PrP”)。朊病Sc
毒颗粒主要(若不仅)由PrP基因编码的PrP 分子组成。如本文中所使用的，“朊病毒”包括在所使用的任何动物中，且特别是在人和驯养家畜中引起所有或任何这些疾病或其它疾病的所有形式的朊病毒。
毒颗粒主要(若不仅)由PrP基因编码的PrP 分子组成。如本文中所使用的，“朊病毒”包括在所使用的任何动物中，且特别是在人和驯养家畜中引起所有或任何这些疾病或其它疾病的所有形式的朊病毒。
[0054] 如本文中所描述的，“淀粉样蛋白生成性疾病”指在身体中形成淀粉样斑或淀粉样沉积物的疾病。在多种病症，诸如糖尿病、AD、瘙痒病、BSE、CJD、慢性萎缩病(CWD)、相关传染性海绵状脑病(TSE)、和本文中所公开的其它疾病中找到淀粉样蛋白形成。然而，本发明不限于淀粉样蛋白生成性疾病，而且可用于诊断和治疗与蛋白质的特定构象或聚集状态有关的任何疾病或状况。
[0055] 术语“Aβ蛋白”在本文中用于指所有形式的Aβ蛋白，包括AB40和AB42。“Aβ”蛋白还包括所有天然存在的突变体，包括已知抑制形成聚集体的趋势升高的天然存在的突变体。此类突变体是本领域中已知的，诸如那些披露于Murakami等，J.Biol.Chem.46：46179-46187，2003的，通过提及而将其完整收入本文。
[0056] “靶蛋白”在本文中用于指适合于通过本发明来靶向、检测或鉴定的任何蛋白质，诸如那些能够构象变化的蛋白质。如本文中所描述的，靶蛋白可以与以β-片层构象表征的疾病状态有关。靶蛋白可以是天然存在的蛋白质。
[0057] “天然的”或“天然存在的”蛋白质指自自然界中存在的来源回收的蛋白质。天然蛋白质会包括翻译后修饰，包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化、酰化、和切割。“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。
[0058] “肽模拟物”又称为拟肽(peptidomimic)或模拟肽(peptidomimetic)，并且指模拟肽特性的任何分子。肽模拟物包括模拟特定肽的折叠和/或二级结构的聚合分子，及那些模拟肽的生物学或化学特性的。肽模拟物可以具有氨基酸主链，而且含有非天然的化学或氨基酸替代。或者，肽模拟物可以具有不同的化学主链，诸如3-肽、邻氨基苯甲酰胺寡聚物、低聚(间亚苯基亚乙炔基)、寡聚尿素、Oligopynolinones、Azatides和N-取代的甘氨酸寡聚物。肽模拟物可以具有不同的化学特性，诸如对蛋白酶的抗性，而保留肽特征，诸如肽折叠和肽-肽相互作用(包括例如经由氢键结合等的相互作用)。可以在本发明中使用任何合适的肽模拟物，并且包括那些设计和/或构建的，如记载于Chongsiriwatana，N.P等Proc Natl Acad Sci USA 2008，105，(8)，2794-9；Kirshenbaum，K.等Current Opinion in Structural Biology 1999，9，(4)，530-535；Lee，B.c.等，Journal of the American Chemical Society 2005，127，(31)，10999-11009的，在此通过提及而完整收录每篇。
[0059] 通过比较一种多肽的氨基酸序列与第二种多肽的序列来确定两种多肽间的“相似性”。若一种多肽的某个氨基酸与第二种多肽的相应氨基酸相同或者是其保守氨基酸替代，则它与第二种多肽的相应氨基酸是相似的。保守替代包括那些记载于Dayhoff，M.O.编，The Atlas of Protein Sequence and Structure 5，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.(1978)，及于Argos，P.(1989)EMBO J.8：779-785的。例如，属于下列各组之一的氨基酸代表保守变化或替代：
[0060] -Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；
[0061] -Cys、Ser、Tyr、Thr；
[0062] -Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；
[0063] -Lys、Arg、His；
[0064] -Phe、Tyr、Trp、His；和
[0065] -Asp、Glu。
[0066] “同源性”、“...的同源物”、“同源”、“同一性”、或“相似性”指两个多肽之间的序列相似性，其中同一性是更严格的比较。同源性和同一性可以各自通过比较每种序列(其可以为了比较目的而加以比对)中的位置来确定。在比较序列中的某个位置被相同氨基酸占据时，则分子在所述位置处相同。氨基酸序列的同一性程度是由氨基酸序列共享的位置处的相同氨基酸的数目的函数。氨基酸序列的同源性或相似性的程度是由氨基酸序列共享的位置处的氨基酸(即结构相关的)的数目的函数。“无关的”或“非同源”序列与本文中所描述的序列之一共享10％或更小的同一性。相关序列共享超过10％序列同一性，诸如至少约15％序列同一性、至少约20％序列同一性、至少约30％序列同一性、至少约40％序列同一性、至少约50％序列同一性、至少约60％序列同一性、至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性、或至少约99％序列同一性。
[0067] 术语“百分比同一性”指两种氨基酸序列之间的序列同一性。可以通过比较每个为了比较目的而比对的序列中的位置来确定同一性。在一个比较序列中的等同位置在另一个序列中的相同位置上被相同氨基酸占据时，则分子在所述位置处是相同的；在等同位置被相同或相似氨基酸残基(例如在立体和/或电子性质上相似)占据时，则分子在所述位置处可以称为同源的(相似的)。同源性、相似性、或同一性百分比的表述指由比较序列共享的位置处的相同或相似氨基酸残基的数目的函数。可以使用多种比对算法和/或程序，包括FASTA、BLAST、或ENTREZ。FASTA和BLAST作为GCG序列分析包(威斯康辛大学，Madison，Wis.)的一部分可获得，而且可以与例如缺省设置一起使用。ENTREZ经由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，国家医学实验室，NIH，Bethesda，Md.可获得。在一个实施方案中，可以通过GCG程序用1的缺口加权来确定两个序列的百分比同一性，例如，对每个氨基酸缺口加权，就像它是两个序列之间的单个氨基酸错配一样。用于确定序列同一性的其它技术是本领域中公知的并有描述的。
[0068] 2.靶蛋白和疾病
[0069] 在它们采用特定构象或自我聚集状态时与人或动物疾病有关的蛋白质是本领域中已知的。此类疾病的例子包括淀粉样蛋白生成性疾病，包括阿耳茨海默氏病(AD)、脑淀粉样血管病(CAA)、和脑血管疾病(CVD)。如本文中所使用的，“淀粉样蛋白生成性疾病”指在身体中形成淀粉样斑或淀粉样沉积物的疾病。在多种病症，诸如糖尿病、AD、瘙痒病、牛海绵状脑病(BSE)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、慢性萎缩病(CWD)、相关传染性海绵状脑病(TSE)中找到淀粉样蛋白形成。
[0070] 多种疾病与蛋白质的特定结构形式(例如“错折叠蛋白质”或自我聚集的蛋白质)有关，而不同结构形式的蛋白质(例如“正常的蛋白质“)是无害的。如此，对于这些状况，β-片层构象可以是一种用于检测疾病的目标结构状态，而α-螺旋和/或无规卷曲构象可以是一种确认缺乏疾病，或者鉴定缺乏疾病的进行性状态的目标结构状态。在许多情况中，正常的蛋白质是可溶的，而错折叠的蛋白质形成不溶性聚集体。
[0071] 以下是与特定结构蛋白质状态有关的疾病的非限制性列表，其后面圆括号中有牵涉的蛋白质：阿耳茨海默氏病(APP、Aβ肽、α1-抗胰凝乳蛋白酶、τ、非Aβ组分、早老蛋白1、早老蛋白2、apoE)；朊病毒病、CJD、瘙痒病、和BSE(PrPSc)；ALS(SOD和神经丝)；皮克氏病(Pick小体)；帕金森病(Lewy小体中的α-突触核蛋白)；额颞痴呆(原纤维中的τ)；糖尿病II型(amylin)；多发性骨髓瘤-浆细胞体液不调(IgGL链)；家族性淀粉样多神经病(amyloidotic polyneuropathy)(运甲状腺素蛋白)；甲状腺髓样癌(原降钙素)；慢性肾衰竭(β2-微球蛋白)；充血性心力衰竭(心房钠尿因子)；老年性心脏和系统淀粉样变(运甲状腺素蛋白)；慢性炎(血清淀粉样蛋白A)；动脉粥样硬化(ApoA1)；家族性淀粉样变(凝溶胶蛋白)；和亨延顿氏病(亨延顿氏病蛋白)。还有，传染性海绵状脑病(TSE)；
脑淀粉样血管病(CAA)、和脑血管疾病(CVD)中的朊病毒；和促淀粉样性侧索硬化中的超氧化物歧化酶。参见例如Glenner等，J.Neurol.Sci.94：1-28，1989；Haan等，Clin.Neurol.Neurosurg.92(4)：305-310，1990。
脑淀粉样血管病(CAA)、和脑血管疾病(CVD)中的朊病毒；和促淀粉样性侧索硬化中的超氧化物歧化酶。参见例如Glenner等，J.Neurol.Sci.94：1-28，1989；Haan等，Clin.Neurol.Neurosurg.92(4)：305-310，1990。
[0072] 经常，这些不溶性蛋白质形成由具有β-折叠片构象的共同特征的非分枝原纤维构成的聚集体。在CNS中，淀粉样蛋白可以存在于脑和脑膜血管(脑血管沉积物)中及在脑实质(斑)中。在人和动物模型中的神经病理学研究指示淀粉样蛋白沉积物近端的细胞在其正常的功能上受到扰乱。参见例如Mandybur，Acta Neuropathol.78：329-331，1989；Kawai等，Brain Res.623：142-146，1993；Martin等，Am.J.Pathol.145：1348-1381，
1994；Kalaria等，Neuroreport 6：477-80，1995；Masliah等，J.Neurosci.16：5795-5811，
1996。另外，其它研究指示淀粉样蛋白原纤维实际上可以启动神经变性。参见例如Lendon等，J.Am.Med.Assoc.277：825-831，1997；Yankner，Nat.Med.2：850-852，1996；Selkoe，J.Biol.Chem.271：18295-18298，1996；Hardy，Trends Neurosci.20：154-159，1997。
1994；Kalaria等，Neuroreport 6：477-80，1995；Masliah等，J.Neurosci.16：5795-5811，
1996。另外，其它研究指示淀粉样蛋白原纤维实际上可以启动神经变性。参见例如Lendon等，J.Am.Med.Assoc.277：825-831，1997；Yankner，Nat.Med.2：850-852，1996；Selkoe，J.Biol.Chem.271：18295-18298，1996；Hardy，Trends Neurosci.20：154-159，1997。
[0073] 虽然导致蛋白质错折叠的根本分子机制没有得到充分了解，但是所有上文所提及的神经学病症的共同特征是形成原纤维，其聚集在一起而形成β片层结构。原纤维形成和随后与斑沉积物有关的β-片层二级结构的形成经由复杂的机制而发生，所述机制牵涉成核阶段，其中蛋白质的单体联合以形成原纤维，接着原纤维在每个末端延伸。如此，能够破坏原纤维形成的肽、蛋白质或抗体探针会阻止疾病进展，而且如此是有治疗意义的。另外，能够与患病蛋白质的特定自我结合状态结合的药剂是可用于检测并量化特定形式的错折叠蛋白质，及了解疾病进展的诊断工具。如此，能够与特定自我聚集状态的特定蛋白质结合的高度选择性肽药剂作为检测剂及供治疗性应用都是有用的。
[0074] 本发明提供了用于检测与疾病有关的错折叠靶蛋白的肽探针和方法。此类错折叠蛋白质可以展现并增加β-片层二级结构或构象，而且可以形成不溶性聚集体、原纤维或沉积物，诸如作为此类疾病的标志的斑。
[0075] (i)淀粉样蛋白生成性疾病
[0076] 淀粉样β蛋白(Aβ)是淀粉样蛋白生成性疾病诸如阿耳茨海默氏病(AD)、脑淀粉样血管病(CAA)、和脑血管疾病(CVD)的主要成因剂。在健康个体的血浆和脑脊液中找到可溶性Aβ，而且疾病表现为与形成在患病个体中找到的斑或聚集体的不溶性原纤维关联。
[0077] Aβ是通过在数个位点之任一处切割淀粉样β前体蛋白(APP)，产生数种形式的Aβ而生成的。在淀粉样斑中找到的两种丰富的形式是Aβ1-40(又称为Aβ40)和Aβ1-42(又称为Aβ42)，其是通过APP的备选羧基端截短而生成的。参见例如Selkoe等，PNAS USA 85：7341-7345，1988；Selkoe，Trends Neurosci.16：403-409，1993。Aβ40和Aβ42具有相同的氨基酸序列，其中Aβ42具有两个额外的残基(Ile和Ala)和其C端。虽然Aβ40更丰富，但是Aβ42更具原纤维生成性，而且是AD和CAA两者的淀粉样沉积物中的两种的主要组分。参见例如Wurth等，J.Mol.Biol.319：1279-90(2002)。如上文所记录的，Aβ蛋白的所有天然存在的突变体可以是靶蛋白或者充当本发明背景中的参照序列的基础。
[0078] Aβ42的血浆水平升高已经与AD及与AD的风险升高联系起来。还有，已经显示了Aβ42/Aβ40水平的比率的量级对于AD、CAA、和其它状况，诸如老年抑郁(late-life depression，LLMD)具有临床意义。参见例如Pomara等.Neurochem.Res.(2006)。通常使用单克隆抗体来测定Aβ42和Aβ40的血浆水平。在上文所描述的AD病例中的淀粉样沉积物外，大多数AD病例还与血管壁中的淀粉样蛋白沉积物有关。参见例如Vinters H.V.，Stroke Mar-Apr；18(2)：311-324，1987；Itoh Y. 等，Neurosci.Lett.155(2)：144-147，1993年6月11日。
[0079] (ii)朊病毒病和传染性海绵状脑病
[0080] 朊病毒是在人和动物中引起中枢神经系统海绵状脑病的感染性病原体。潜在的朊病毒前体是一种称为PrP 27-30的蛋白质，即一种聚合(聚集)成在受感染的脑中以斑块C找到的杆样细丝的28千道尔顿疏水性糖蛋白。正常的朊病毒蛋白(PrP)是一种主要具有Sc
α螺旋和卷曲-环结构的细胞表面金属糖蛋白。异常的形式(PrP )是一种对蛋白酶有抗性，而且具有主要含有β-片层的二级结构的构象异构体。认为二级结构的此构象变化导致聚集和最终的在朊病毒病过程中的神经毒性斑块沉积物。
α螺旋和卷曲-环结构的细胞表面金属糖蛋白。异常的形式(PrP )是一种对蛋白酶有抗性，而且具有主要含有β-片层的二级结构的构象异构体。认为二级结构的此构象变化导致聚集和最终的在朊病毒病过程中的神经毒性斑块沉积物。
[0081] 朊病毒有关的疾病(又称为传染性海绵状脑病或“TSE”)包括绵羊和山羊的瘙痒病、鹿和麋的慢性萎缩病、和牛的牛海绵状脑病(BSE)。参见例如Wilesmith和Wells，Microbiol.Immunol.172：21-38，1991。已经鉴定出人的四种朊病毒病：(1)库鲁病(kuru)、(2)克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、(3)Gerstmann-Strassler-Scheinker病(GSS)、和(4)致命性家族性失眠(fatal familial insomnia，FFI)。参见例如Gajdusek，D.C.，Science 197：943-969，1977；Medori等N.Engl.J.Med.326：444-449，1992。TSE是致命性神经变性性疾病。这些疾病以正常的蛋白酶-敏感性、宿主编码的朊病毒蛋白(PrP-sen)的异常蛋白酶K抗性同等型(PrP-res)在脑中的形成和积累表征。PrP-res是通过翻译后过程自PrP-sen形成的，所述翻译后过程牵涉将PrP-sen转化成具有更高β-片层含量的PrP-res分子聚集体的构象变化。PrP-res的这些大分子聚集体的形成与TSE-介导的脑病理学紧密相关，其中在脑中形成PrP-res的淀粉样沉积物，其最终变为“海绵状”(充满孔)。
[0082] 细胞蛋白质PrP-sen是一种由在人中位于染色体20上的基因编码的唾液酸糖蛋白。PrP基因在神经和非神经组织两者中表达，在神经元中找到其mRNA的最高浓度。Prp基因的序列披露于美国专利No.5,565,186，通过提及而将其收入本文。
[0083] 3.构象动力肽
[0084] 本文中描述了可用于例如检测具有特定构象的靶蛋白，包括错折叠蛋白质或具有可与疾病有关的β-片层二级结构的蛋白质的构象动力肽。所述肽在诊断与此类靶蛋白有关的疾病或其风险，及治疗与此类靶蛋白有关的疾病的方法中也是有用的。
[0085] 所述肽作为针对靶蛋白的探针是有用的，所述靶蛋白能够展现出或展现出与淀粉样蛋白生成性疾病有关的β-片层构象。所述肽能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者。在一些实施方案中，所述肽在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用β-片层构象。在其它实施方案中，所述肽在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序(例如减少的β片层)构象。
[0086] 先前已经描述了包含Aβ蛋白序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基16-35的肽探针。此类探针含有负责分子内β-片层形成和蛋白质聚集两者的疏水核心。虽然此“野生型”肽如在有机溶剂中的基于纤维的测定法中所预期的那样运行(例如，其在没有底物的情况中在40％TFE中具有α螺旋结构，而且在引入Aβ原纤维底物后转变成β-片层结构)，但是其它特性使其在体外测定法中使用不太理想。例如，它在水溶液中具有低溶解度，而且其β-片层结构在热力学上较强，并对构象变化有抗性。如此，已经设计出具有更期望的特征以改善在体外测定法和体内应用中的性能的肽探针。
[0087] 如本文中更为详细地描述的，在一些实施方案中，肽探针具有相对于参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除的变体序列，使得(A)所述变体序列的无规卷曲/α-螺旋构象比由所述参照氨基酸序列组成的探针在氧化环境中更稳定和/或(B)无规卷曲/α-螺旋构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离与β-片层构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离不同和/或(C)所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后比所述参照序列更有效地采用β-片层构象。
[0088] 另外/或者(特别关于上述实施方案(C))，肽探针可以具有相对于参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除的变体序列，使得(D)所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序或减少的β-片层构象。在一些更具体的实施方案中，(E)所述变体序列的β-片层结构在热力学上没有由所述参照序列组成的探针的β-片层结构强。
[0089] 另外/或者，肽探针可以具有相对于参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除的变体序列，使得(F)变体序列比由参照序列组成的探针具有升高的稳定性和/或降低的反应性；(G)变体序列比由参照序列组成的探针具有升高的亲水性和/或在水溶液中的溶解度和/或(H)变体序列比由参照序列组成的探针具有额外的Aβ结合基序。
[0090] 另外/或者，变体序列相对于参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除，使得(I)变体序列具有增强的形成聚集体的能力。在更具体的方面，变体序列可以包含天然存在的突变体的截短形式。
[0092] 依照一些实施方案，肽以构象依赖性方式结合靶蛋白，而且经历自主要为无规卷曲(未结构化的)或α-螺旋构象向富含β-片层的构象的结构转化，诸如在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后。在这些实施方案中，一般地，肽从不太有序的构象改变成较为有序的构象。报告模块与这些肽的缀合可以提供用于监测构象转化(诸如使用经荧光标记的肽经由荧光谱的变化)的简单机制。
[0093] 依照其它实施方案，肽以构象依赖性方式结合靶蛋白，而且在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后经历自主要为富含β-片层的构象向不太有序或减少的β-片层构象或增加的无规卷曲(未结构化的)或α-螺旋构象的结构转化。在这些实施方案中，一般地，肽从较为有序的构象改变成不太有序的构象。报告模块与这些肽的缀合可以提供用于监测构象转化(诸如使用经荧光标记的肽经由荧光谱的变化)的简单机制。
[0094] 依照一些实施方案，将肽设计为(诸如例如通过选择特定的氨基酸删除、替代或添加)改善其在不同测定条件(诸如在不同pH和/或盐条件等等下在水对有机溶剂中使用)中的性能。
[0095] 在描述并公开本发明的具体实施方案前，应当理解本文中所描述的具体材料、方法和组合物仅作为例子呈现，而并不限制本发明的范围。除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的意义。通过提及而将提及的列出已知方法的出版物和其它材料完整收入本文，就像以全文列出一样。
[0096] 可以通过任何方法，诸如直接合成或以重组方式生成本文中所描述的肽。列出重组DNA技术的一般原则的标准参考著作包括Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Planview，N.Y.；McPherson，M.J. 编 (1991)Directed Mutagenesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford；Jones，J.(1992)Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford Science Publications，Oxford；Austen，B.M.和Westwood，O.M.R.(1991)Protein Targeting and Secretion，IRL Press，Oxford。
[0097] 可以在实施本发明中利用本领域普通技术人员已知的任何合适的材料和/或方法。然而，描述了例示性的材料和方法。除非另有记录，在以下描述和例子中所提及的材料、试剂等自商业来源可获得。
[0098] 如上文所记录的，本文中所描述的构象动力肽可用于例如检测具有特定构象的靶蛋白，包括错折叠蛋白质或具有可与疾病有关的β-片层二级结构的蛋白质。例如，所述肽作为针对靶蛋白的探针是有用的，所述靶蛋白能够展现出或展现出与淀粉样蛋白生成性疾病有关的β-片层构象。所述肽在诊断和治疗方法中，及在筛选药物候选物的方法中也可以是有用的。为了方便，所述肽在不减损其在其它背景中的效用的情况中在本文中称为“探针”。
[0099] 在一些实施方案中，肽探针包含作为参照序列的变体的氨基酸序列，其中参照序列由经历构象转变，诸如从α-螺旋/无规卷曲构象转变成β-片层构象的靶蛋白的氨基酸序列组成。此类区在本文中称为靶蛋白的“β-片层形成区”。例如，已知Aβ蛋白的氨基酸16-35包含β-片层形成区。如此，参照序列可以包含Aβ蛋白的氨基酸16-35或17-35。因此，可以基于现有的序列和构象信息自靶蛋白序列设计或者备选地可以凭实验容易地确定肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，参照序列由靶蛋白的天然存在的突变体，诸如已知展现出升高的采用β-片层构象和/或形成聚集体的趋势的突变体的β-片层形成区的氨基酸序列组成。Aβ突变体的例子记载于Murakami，见上文，并且包括替代A21G、E22G、E22Q、E22K、和D23N。
[0100] 参照序列可以包含靶蛋白的最小数目的连续氨基酸，诸如靶蛋白序列的至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、或至少约50个连续的氨基酸，或者这些数目间的任何范围，诸如靶蛋白序列的约10至约25个连续的氨基酸。
[0101] 肽探针自身包含至少约5个氨基酸，并且可以包括多达约300至约400个氨基酸，或者更多，或者中间的任何大小，诸如长约10个氨基酸至约50个氨基酸。在一些实施方案中，肽由约5至约100、约10至约50、约10至约25、约15至约25、或约20至约25个氨基酸组成。在别的实施方案中，肽包含约17至约34个氨基酸，包括约20个氨基酸、约21个氨基酸、约22个氨基酸、约23个氨基酸、约24个氨基酸、或约25个氨基酸。不同长度的肽可以展现出不同程度的与靶蛋白的相互作用和结合，而且得到本文中的教导指导的熟练技术人员可以选择合适的长度。
[0102] 在一些实施方案中，肽经历与靶蛋白的结构变化相似的结构变化。例如，在一些实施方案中，肽能够采用无规卷曲/α-螺旋构象和β-片层构象两者，而且在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用β-片层构象。在其它实施方案中，肽探针以β-片层构象提供，而且在与β-片层构象的靶蛋白接触、结合和/或相互作用后经历向不太有序的或减少的β-片层构象/增加的α-螺旋构象的构象变化。
[0103] 肽可以在溶液，诸如具有约4和约10之间，诸如约5和约8之间的pH，具有约0.05和约0.5之间的离子强度(在通常用氯化盐，诸如氯化钠或氯化钾制备时)的水溶液中提供。溶液还可以以约30％至约70％(按体积计)之间，诸如约45％至约60％之间的量包含水可混合的有机材料，诸如三氟乙醇。可以用合适的缓冲系统诸如乙酸盐/乙酸、Tris、或磷酸盐来制备溶剂。
[0104] 如下文更为详细地讨论的，可以使用本文中所公开的肽探针来检测体外或体内的靶蛋白。肽探针也可用于鉴定治疗剂，诸如依照US 2008/0095706(对应于美国专利申请11/828,953)(通过提及而将其全部内容完整收入本文)中所描述的方法来进行。
[0105] (i)变体序列
[0106] 如上文所记录的，在一些实施方案中，肽探针包含相对于参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除的参照序列变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽由变体序列组成。如上文所记录的，参照序列由靶蛋白的β-片层形成区的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，将变体序列设计为改善肽在用于检测靶蛋白的测定法中的性能。例如，在一些实施方案中，将变体设计为使得变体序列的无规卷曲/α-螺旋构象比由参照氨基酸序列组成的探针在氧化环境中更稳定。另外/或者，将变体序列设计为使得无规卷曲/α-螺旋构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离与β-片层构象的所述变体序列的N端与C端之间的距离不同(例如大于)。另外/或者，将变体序列设计为使得所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后比所述参照序列更有效地采用β-片层构象。另外/或者，将变体序列设计为使得所述变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序或减少的β-片层构象，而且可以具有在热力学上没有所述参照序列的β-片层结构强的β-片层结构。另外/或者，将变体序列设计为使得变体序列具有升高的稳定性和/或降低的反应性、升高的亲水性和/或溶解度、和/或额外的Aβ结合基序。另外/或者，变体序列相对于参照序列可以包含一处或多处氨基酸删除，使得变体序列具有增强的形成聚集体的能力。
[0107] 在一些实施方案中，将变体序列设计为提高与未结合靶蛋白的肽有关的任何信号和与结合靶蛋白的肽有关的信号之间的信号差异，诸如通过提高与肽的随机/α-螺旋构象有关的任何信号(例如背景信号)和与肽的β-片层构象有关的信号之间的信号差异来进行。这可以通过例如降低与肽的随机/α-螺旋构象有关的任何背景信号和/或提高与肽的β-片层构象有关的信号来实现。这些相同的设计基本原理对于肽探针也是有用的，所述肽探针以β-片层构象提供，而且在结合靶蛋白后采用不太有序或减少的β-片层构象/增加的α-螺旋构象，尽管背景信号会与探针的β-片层构象有关。
[0108] 例如，可以在其N和C端之每端处或附近标记肽探针，使得通过在各模块彼此物理接近时，诸如在肽展现出使N和C端物理接近的β-片层构象时发生的在标记模块间的相互作用来产生信号。此类信号会与肽的β-片层构象有关。类似地，在肽为β-片层构象时物理接近的及在肽为无规卷曲/α-螺旋构型时远离的任何一个或多个位点处标记肽，使得标记物相互作用以在肽为β-片层构象时发射信号。与β-片层构象有关的信号可以不同于与无规卷曲/α-螺旋构象有关的任何信号，诸如具有更大的量级和/或处于不同频率或波长。
[0109] 在肽探针在与靶蛋白结合后从不太有序的构象改变成较为有序的构象的实施方案中，例如若无规卷曲/α-螺旋构象容许标记物变得足够的物理接近以产生信号和/或若肽探针采用与靶蛋白的接触、结合或相互作用(诸如可以在溶液中发生)无关的β-片层构象，则可以观察到背景信号。可以例如通过使无规卷曲/α-螺旋构象稳定化以使与靶蛋白接触、结合或相互作用无关的β-片层构象的形成最小化来降低与肽的无规卷曲/α-螺旋构象有关的背景信号。例如，可以将肽探针设计为使得未结合的肽探针的无规卷曲/α-螺旋构象展现出升高的稳定性。例如，用形成α-螺旋的残基(诸如丙氨酸)和/或形成盐桥的残基(诸如组氨酸和谷氨酸)的替代可以使未结合的肽探针的无规卷曲/α-螺旋构象稳定化。此类升高的稳定性通过降低标记物会足够的物理接近以产生信号的可能性来降低背景信号。如此，在一些实施方案中，肽的变体序列包含提高无规卷曲/α-螺旋构象的稳定性的氨基酸替代、添加和/或删除。
[0110] 另外/或者，在肽为无规卷曲/α-螺旋构象时增加N与C端间(或者标记物位点间)的距离会降低与随机/α-螺旋构象有关的任何信号。另外/或者，例如在肽为β-片层构象时可以通过缩短N与C端间(或者标记物位点间)的距离来提高与肽的β-片层构象有关的信号。可以使用标准的蛋白质建模方法来对无规卷曲/α-螺旋构象对β-片层构象的肽的末端间(或标记物位点间)的距离计算机建模。
[0111] 在下文的讨论中，基于Aβ蛋白的氨基酸序列来对点突变编号，所述Aβ蛋白的残基16-35在图2中列出(具有添加的C端赖氨酸残基)。
[0112] α螺旋形成和稳定性
[0113] 在一些实施方案中，变体序列包含添加一个或多个具有形成α螺旋的倾向的氨基酸残基，诸如丙氨酸(A)，或者用一个或多个具有形成α螺旋的倾向的氨基酸残基，诸如丙氨酸(A)的替代。可以将此类氨基酸残基引入参照序列的内部位点中，或者在参照序列的任一或两个末端处引入。在一些实施方案中，参照序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个此类氨基酸残基，其作为额外的残基或替换靶蛋白的残基(替代)。在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽探针包含变体序列SEQ ID NO：3(肽38)或SEQ ID NO：4(肽45)。在具体的实施方案中，肽探针由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4组成。
[0114] 以带互补电荷的残基引入点突变也可以提高形成α螺旋的倾向，诸如Aβ肽探针中的突变G29H和G33E。这些特定的替代也提高亲水性和在水溶液中的溶解度。如此，在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽探针包含变体序列SEQ ID NO：2(肽22)，或者由SEQ ID NO：2组成。
[0115] 在其它实施方案中，可以进一步修饰本文中所描述的任何其它变体以包括丙氨酸残基或带互补电荷的残基，从而增强α螺旋形成。
[0116] 盐桥
[0117] 在一些实施方案中，变体序列包含一处或多处氨基酸替代或添加，其引起能够形成盐桥的氨基酸或者引入能够与目前存在于参照序列中的氨基酸形成盐桥的氨基酸。盐桥是带负电荷与带正电荷的氨基酸间的弱离子相互作用。在一些实施方案中，氨基酸替代或添加在能够与序列中的另一个氨基酸形成盐桥的位置中引入一个或多个正电氨基酸残基，诸如精氨酸或赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸替代或添加在能够与序列中的另一个氨基酸形成盐桥的位置中引入一个或多个负电氨基酸残基，诸如天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸替代或添加在能够彼此或与序列中的其它氨基酸形成一个或多个盐桥的位置中引入一个或多个正电和一个或多个负电氨基酸残基两者。在其它实施方案中，盐桥包含一个或多个可离子化的残基诸如组氨酸、酪氨酸或丝氨酸。在具体的实施方案中，变体序列包含在能够形成一个或多个盐桥的位置中引入一个或多个组氨酸残基和/或精氨酸残基和/或赖氨酸残基和/或谷氨酸和/或天冬氨酸残基和/或酪氨酸残基和/或丝氨酸残基的氨基酸替代或添加。
[0118] 在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽探针包含SEQ ID NO：2-4之一的变体序列(肽22、肽38、或肽45)。在具体的实施方案中，肽探针由SEQ ID NO：2-4之一组成。在其它具体的实施方案中，肽包含SEQ ID NO：14-17之一的变体序列(肽22变异1；肽22变异2、肽59、肽77)。在具体的实施方案中，肽由SEQ ID NO：14-17之一组成。在其它实施方案中，本文中所描述的任何其它变体可以进一步修饰为包括盐桥。
[0119] 如上文所记录的，可以将盐桥设计为使肽的α-螺旋构象稳定化。另外/或者，盐桥的存在提供了关于使用肽来控制测定法中产生的信号的机制。例如，测定缓冲液的盐和/或pH可以选择或调节为加强或减弱盐桥，并且如此控制α-螺旋构象的稳定性和β-片层构象的形成。
[0120] β-片层形成和稳定性
[0121] 在一些实施方案中，变体序列包含一个或多个氨基酸添加、删除和/或替代，其便于在与靶蛋白接触、结合或相互作用后(或者在其它有助于β-片层形成的条件下)采用β-片层构象，使得变体序列(或包含其的肽)在与靶蛋白接触、结合或相互作用后(或者在其它有助于β-片层形成的条件下)比参照序列更有效地采用β-片层构象。此类肽探针可以比参照序列展现出升高的对检测具有β-片层构象的靶蛋白的灵敏性。在一些实施方案中，变体序列包含天然存在的突变体，诸如展现出升高的采用β-片层构象和/或形成聚集体的趋势的突变体的β-片层形成区中找到的一处或多处氨基酸替代。例如，包含一处或多处替代I32S或E22P的变体在此背景中是有用的，诸如SEQ ID NO：5或7。其它例子包括包含替代E22Q(“Dutch”)或E22K(“Italian”)的变体，诸如SEQ ID NO：11或12。在另一个实施方案中，变体替代包含一处或多处替代F19S和L34P，诸如SEQ ID NO：8。其它变体可以自本领域中已知的突变体，诸如那些披露于Murakami等，J.Biol.Chem.46：46179-46187，2003的突变体衍生。例如，变体可以包含一处或多处替代A21G、E22G(“Arctic”)、和D23N。此类变体的例子包括SEQ ID NO：9、10或13。另外，本文中所描述的任何变体可以进一步包含基于这些或其它已知突变的一处或多处点突变。例如，基于肽22变体的变体可以进一步包含一处或多处点突变，诸如E22K、E22Q、或E22G。此类变体的例子包括SEQ ID NO：19-21。在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽探针包含SEQ ID NO：5、7-13或18-21之任一项的变体序列。在具体的实施方案中，肽探针由SEQ ID NO：
5、7-13、或18-21之任一项组成。
5、7-13、或18-21之任一项组成。
[0122] 在其它实施方案中，肽探针具有相对于参照序列包含一个或多个氨基酸添加、替代或删除的变体序列，使得变体序列在结合展现出β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序的或减少的β-片层构象和/或增加的α-螺旋构象。此类变体的例子包括SEQ ID NO：2(肽22)、SEQ ID NO：3(肽38)、SEQ ID NO：4(肽45)、SEQ ID NO：14(肽22变异1)、和SEQ ID NO：15(肽22变异2)。在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽探针包含SEQ ID NO：2-4或14-15之任一项的变体序列。在具体的实施方案中，肽探针由SEQ ID NO：2-4或
14-15之任一项组成。
14-15之任一项组成。
[0123] 在更具体的实施方案中，变体序列相对于参照序列包含一处或多处别的氨基酸添加、替代或删除，使得变体序列的β-片层结构在热力学上没有由参照序列组成的探针的β-片层结构稳定或强。例如，变体序列SEQ ID NO：2相对于编号的野生型序列可以包含一处或多处别的替代诸如F19S、S26D、H29D、I31D、L34D、和L34P。参见例如，下文表中的肽AD323(SEQ ID NO：28)；AD325(SEQ ID NO：29)；AD330(SEQ ID NO：30)；AD329(SEQ ID NO：31)；AD328(SEQ ID NO：32)；AD327(SEQ ID NO：33)；GM6(SEQ ID NO：34)；GM6变异1(SEQ ID NO：35)。肽I32S(SEQ ID NO：5)也可以落入此种类中。在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽探针可以包含SEQ ID NO：5或28-35之任一项的变体序列，或者可以由SEQ ID NO：5或28-35之任一项组成。
[0124] 升高的稳定性和/或降低的反应性
[0125] 在一些实施方案中，变体序列包含一处或多处使变体(或包含其的肽)比参照序列在氧化环境中更稳定的氨基酸添加、删除和/或替代。在一些实施方案中，用抗氧化的残基，诸如丙氨酸残基替换一个或多个甲硫氨酸残基，诸如C端甲硫氨酸残基。在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽包含变体序列SEQ ID NO：6(肽AD250)。在具体的实施方案中，肽由SEQ ID NO：6组成。在其它实施方案中，可以通过用对氧化更具抗性的残基，诸如丙氨酸残基替换甲硫氨酸残基，诸如C端甲硫氨酸残基来进一步修饰本文中所描述的任何其它变体。
[0126] 溶解度和/或亲水性
[0127] 在一些实施方案中，变体序列包含一处或多处使变体(或包含其的肽)更亲水和/或在水环境中更可溶的氨基酸添加、删除和/或替代。例如，在C和/或N端处或附近包含一个或多个带电荷的残基(诸如谷氨酸和/或d-精氨酸)的变体展现出升高的亲水性和在水溶液中的溶解度。例如，变体序列可以包含1、2、3或更多个N端、C端、或内部谷氨酸和/或d-精氨酸残基。在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽探针可以包含变体AD272(SEQ ID NO：22)、AD316(SEQ ID NO：23)、AD305(SEQ ID NO：24)、和AD271(SEQ ID NO：26)，或者可以由这些序列组成。在其它实施方案中，可以通过在N端或C端处或附近添加1、2、3或更多个谷氨酸和/或d-精氨酸残基来进一步修饰本文中所描述的任何其它变体。
[0128] 另外/或者，可以将肽探针与亲水性模块，诸如水溶性聚乙二醇(PEG)，诸如具有约1、5、6、10、12、15、20、25、30或35kDa的分子量的PEG，包括具有约10kDa的分子量的PEG(“PEG10”)缀合。在表1中在下文的例子(AD274)中描述了包含野生型β-片层形成序列(SEQ ID NO：1)的此类肽探针的例子。可以将本文中所描述的任何变体或肽探针与亲水性模块缀合。
[0129] AB结合基序
[0130] 在一些实施方案中，变体序列包含一处或多处提供额外的Aβ结合基序，诸如包含氨基酸残基GxxEG(SEQ ID NO：25)(其中“X”代表任何氨基酸残基)的基序的氨基酸添加、删除和/或替代。此类变体序列的例子包括P59(SEQ ID NO：17)和P77(SEQ ID NO：16)。在靶蛋白是Aβ蛋白的具体实施方案中，肽探针可以包含SEQ ID NO：16或17之任一项的变体序列，或者可以由SEQ ID NO：16或17之任一项组成。在其它实施方案中，本文中所描述的任何其它变体可以进一步修饰为包括GxxEG基序。
[0131] 应当理解，本文中所描述的肽可以包含上文所描述的添加、替代和删除的一种或多种任意组合。在一些实施方案中，在上文所描述的氨基酸添加和替代外，肽可以包含一个或多个便于标记的氨基酸残基的添加或替代。在一些实施方案中，肽包含一个或多个赖氨酸残基以便于标记，诸如用芘模块标记。在一些实施方案中，肽在其C端、N端、或这两端处或附近包含赖氨酸残基。例如，肽可以在其C端、N端、或这两端包含赖氨酸残基。在其它实施方案中，赖氨酸残基在肽中的其它位点，正如可适用于标记的，如上文所讨论的。在参照序列包含Aβ蛋白的氨基酸16(赖氨酸)的实施方案中，可以使用该赖氨酸残基进行标记。在一些实施方案中，经由C端赖氨酸上的侧链来标记肽探针。
[0132] 在一些实施方案中，肽探针具有替换C端羧基基团的C端酰胺基团。
[0133] 在一些实施方案中，变体序列相对于参照序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处氨基酸添加、替代或删除。在其它实施方案中，变体序列由长约10至约25个氨基酸组成，并且变体序列相对于参照序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处氨基酸添加、替代或删除。在另一个实施方案中，变体序列与参照序列具有约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约66％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、或约10％同一性。在一些实施方案中，变体序列与参照序列具有约66％至约97％同一性。
[0134] 可以通过在下文实施例中所描述并例示的方法来评估任何给定肽的适合性。例如，可以如实施例1和实施例5中所例示的那样评估肽采用β-片层构象的能力。可以如实施例3-5中所例示的那样确认肽结合靶蛋白并发射信号的能力。
[0135] (ii)标记物
[0136] 本文中所公开的探针可以包含一种或多种可检测标记物。例如，可以将探针与标记物共价或非共价偶联或融合。在一些实施方案中，标记物选择为容许检测探针的特定构象，诸如在探针与靶蛋白结合时采用的构象。在此情况中，标记物在探针为第一、未结合构象(诸如主要为无规卷曲/α-螺旋构象或不太有组织的或不太密的形式)时可以发射第一信号(或无信号)，而在探针在与靶蛋白结合后经历构象转变(诸如主要为β-片层构象或较有组织的或较密的形式)时可以发射第二信号，或者无信号(即探针被猝灭)。互补的一般原则适用于如下的肽探针，其在与靶蛋白结合后从较为有序的构象改变成不太有序的构象，其中第一信号与探针的第一、未结合的构象(诸如β-片层构象或较有组织的或较密的形式)有关，而在探针在与靶蛋白结合后经历构象转变(诸如主要为无规卷曲/α-螺旋构象或不太有组织的或不太密的形式)时发射第二信号或无信号。第一信号和第二信号可以在一种或多种属性，诸如强度、波长等方面不同。在信号包括发射光的实施方案中，第一信号和第二信号可以在激发波长和/或发射波长方面不同。在探针经历构象转变时产生的信号可以源自结合同一探针的标记物间的相互作用或者可以源自结合不同探针的标记物间的相互作用。
[0137] 在一些实施方案中，标记物和标记位点选择为使得标记物基于探针的构象而确实相互作用或不相互作用，例如使得标记物在探针为其未结合构象时不相互作用，而在探针在与靶蛋白结合后经历构象转变时确实相互作用，以产生可检测信号(包括猝灭)，或者反之亦然。根据探针的结合状态，例如根据探针在与靶蛋白结合后是否已经经历构象转变，这可以通过选择离得更远或更接近地在一起的标记位点来实现。在一些实施方案中，与结合的探针有关的信号的量级与所检测的靶蛋白的量正相关。如此，本发明的方法容许检测并量化靶蛋白。
[0138] 例如，可以使用荧光标记物(包括受激子、FRET或荧光团/猝灭剂标记物对)以容许检测探针的特定构象，诸如在探针与靶蛋白诸如错折叠的Aβ蛋白结合时采用的构象。在这些实施方案中，用第一标记物和第二标记物(每个是受激子、FRET或荧光团/猝灭剂对的互补成员)在分开的位点处标记探针。例如，形成受激子的标记物在探针为其未结合状态时可以发射其单体信号，而可以在探针在与靶蛋白结合后经历使标记物更为物理接近的构象转变时发射其受激子信号。这在图10，顶部小图中示意性显示。类似地，FRET标记物可以在探针经历使标记物更为物理接近的构象转变时发射其FRET信号。这在图10，底部小图B中示意性显示。另一方面，荧光团/猝灭剂标记物对可以在探针为其未结合状态时发射荧光团信号，并可以在探针经历使标记物更为物理接近的构象转变时猝灭所述信号。如上文所记录的，可以将标记物定位为使得在探针在与靶蛋白结合后经历构象转变时发生信号的相反变化。
[0139] 或者，对于在与靶蛋白联合或结合后从较为有序的构象改变成不太有序的构象的探针，形成受激子的标记物可以在探针为其未结合状态时发射其受激子信号，并在探针在与靶蛋白结合后经历降低标记物的物理接近性的构象转变时发射其单体信号。这在图10，底部小图A中示意性显示。同样地，FRET标记物可以在探针为其未结合状态时发射其FRET信号，并在探针经历降低标记物的物理接近性的构象转变时发射不同信号或无信号。另一方面，荧光团/猝灭剂标记物对可以在探针为其未结合状态(其中各标记物极其物理接近)时被猝灭，而且可以在探针为其未结合状态(其降低标记物的物理接近性)时发射荧光团信号。再次，可以将标记物定位为使得在探针在与靶蛋白结合后经历构象转变时发生信号的相反变化。
[0140] 在一些实施方案中，用可检测标记物对探针末端加帽(在肽的一个或两个末端)。在一些实施方案中，探针在其C端、N端、或这两端处或附近包含可检测标记物。例如，探针在其C端、N端、或这两端、或在探针在与靶蛋白有关的Aβ蛋白聚集体结合后经历构象转变时产生信号的任何其它位点处可以包含可检测标记物。如此，例如，标记物位点可以选自(i)N端和C端；(ii)N端和与C端不同的(other than)分开位点；(iii)C端和与N端不同的分开位点；和(iv)与N端和C端不同的两个位点。与N端或C端不同的标记物位点可以是肽探针内的任何位点，包括离末端残基为1、2、3、4、5、或更多个残基。下文表1中的肽探针AD272(SEQ ID NO：22)、AD316(SEQ ID NO：23)、AD305(SEQ ID NO：24)、AD271(SEQ ID NO：26)、和AD273(SEQ ID NO：27)是肽探针的例子，其中标记物之一在末端附近而不是在末端。在这些探针中，标记物位点离N端或C端为2或3个残基。
[0141] 在一些实施方案中，在N端氨基酸残基的胺基团上提供N端标记物。在其它实施方案中，在N端处或附近的氨基酸残基的侧链上，诸如在N端处或附近的赖氨酸(K)残基的侧链上提供N端标记物。标记物位点可以选择为改变肽探针的荧光特性，并改善或优化信噪比。下文表1中描绘的肽探针AD266(SEQ ID NO：36)和AD268(SEQ ID NO：37)是具有在第一个N端赖氨酸残基的侧链上提供的N端标记物的肽探针的例子。
[0142] 在一些实施方案中，在N端胺上提供N端标记物，并在C端赖氨酸残基的侧链上提供C端标记物。在其它实施方案中，在N端赖氨酸残基的侧链上提供N端标记物，并在C端赖氨酸残基的侧链上提供C端标记物。
[0143] 在一个实施方案中，芘模块存在于探针的每个末端处或附近，并且芘单体信号与芘受激子信号的比率取决于探针的构象。例如，单体信号可以在探针为其未结合状态时占优势，并且受激子信号可以在探针在与靶蛋白结合后经历构象转变时占优势(或者受激子信号可以升高，而不必要变得占优势)，或者反之亦然。如此，可以测量芘单体信号与芘受激子信号的比率。存在于探针上的其它位点处的芘模块在此背景中也可以是有用的，只要受激子形成是构象依赖性的，其基于肽探针的结合或未结合状态。表1包括在N端和C端之每端处或附近用芘(“(PBA)”)标记的许多肽探针。
[0144] 可以通过光学特性的变化来检测受激子的形成。根据荧光团标记物，通过已知的荧光测定技术，包括UV、lR、CD、NMR、或荧光等来测量此类变化。光学特性的这些变化的量级与已经采用与信号有关的构象的探针的量成正比，并且因此与存在的靶蛋白或结构的量成正比。
[0145] 虽然这些实施方案已经在受激子对方面更为详细地进行了描述，但是本领域技术人员应当理解，相似的考虑因素适用于FRET和荧光团/猝灭剂对。表1包括在N端和C端之每端处或附近用FRET或荧光团/猝灭剂对标记物标记的许多肽探针。例如，可以在一端用芘而在另一端用猝灭剂诸如Dabcyl荧光猝灭剂(4-(4-二甲基氨基苯基)二氮烯基苯甲酸)标记肽探针，如以AD326(SEQ ID NO：43)所例示的。或者，可以在一端用荧光团EDANS(5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸)而在另一端用猝灭剂诸如Dabcyl标记肽探针，如以AD309(SEQ ID NO：44)、AD306(SEQ ID NO：45)、AD303(SEQ ID NO：46)、AD302(SEQ ID NO 47)、AD301(SEQ ID NO：48)、和AD300(SEQ ID NO：49)例示的。或者，可以在一端用丹酰标记物(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)而在另一端用色氨酸残基(Trp，W)来标记肽探针，以提供FRET对标记，如以AD295(SEQ ID NO：50)例示的。或者，可以在一端用5(6)羧基荧光素(FAM)而在另一端用EDANS来标记肽探针，如以AD294(SEQ ID NO：51)、AD293(SEQ ID NO：52)、AD292(SEQ ID NO：53)、AD291(SEQ ID NO：54)、和AD290(SEQ ID NO：55)所例示的。这些例示性的肽探针包含本文中别的地方所描述的野生型和变体序列，而且表明本文中所描述的任何肽探针可以在多个标记物位点处用任何标记物对来标记。在一些实施方案中，将标记物与赖氨酸残基，包括N端、C端或内部赖氨酸残基缀合。在其它实施方案中，将标记物与谷氨酸残基，包括N端、C端或内部谷氨酸残基缀合。在一些实施方案中，将一个标记物与赖氨酸残基缀合，而将另一个标记物与谷氨酸残基缀合。熟练技术人员会容易地认可标记物位点的其它组合和排列，而且其包含在本发明中。
[0146] 此外，虽然这些实施方案已经参照每个肽探针使用两个标记物进行了描述，但是应当理解，可以使用多个标记物。例如，一个或多个标记物可以存在于每个标记位点处，或者多个标记物可以各自存在于探针上的不同标记位点处。在这些实施方案中，标记物可以产生独立的信号，或者可以叙述为受激子对、FRET对、信号/猝灭剂等。例如，一个位点可以包含1、2、3、4或更多个芘模块，而另一个位点可以包含相应的猝灭剂。
[0147] 如上文所记录的，本文中所公开的探针可以包含可检测标记物。例如，探针可以包含与标记物共价或非共价偶联或融合的肽探针。在一些实施方案中，用可检测标记物来对肽探针末端加帽(在肽的一个或两个末端)。在一些实施方案中，肽在其C端、N端、或这两端处或附近包含可检测标记物。例如，肽在其C端、N端、或这两端、或在肽采用β-片层构象，或与其结合状态有关的其它构象时产生信号的任何其它位点处可以包含可检测标记物。在一些实施方案中，用大小范围为约1至约5个氨基酸的小的疏水性肽来对C端和N端两者末端加帽。这些肽可以是天然的或合成的，但是优选的是天然的(即自靶蛋白衍生)。在肽采用β-片层构象(或其它靶蛋白有关的构象)时产生的信号可以源自结合同一肽的标记物间(肽内)的相互作用和/或可以源自结合不同肽的标记物间(肽间)的相互作用。例如，β-片层构象的肽可以自我结合，使得结合不同肽分子的标记物在物理上足够接近以产生肽间信号。
[0148] 在一些实施方案中，使用标记物来检测肽的特定构象，诸如β-片层构象或其它靶蛋白有关的构象。在此情况中，标记物可以在肽为第一构象(诸如无规卷曲/α-螺旋构象)时发射第一信号(或无信号)，而在肽为第二构象(诸如β-片层构象)时发射第二信号。如上文所讨论的，互补原则适用于如下的肽探针，其在与靶蛋白结合后从较为有序的构象改变成不太有序的构象，其中第一信号与探针的第一、未结合的构象(诸如β-片层构象或较有组织的或较密的形式)有关，而在探针在与靶蛋白结合后经历构象转变(诸如主要为无规卷曲/α-螺旋构象或不太有组织的或不太密的形式)时发射第二信号或无信号。第一信号和第二信号可以强度、波长等的一项或多项中不同。在信号包括发射光的实施方案中，第一信号和第二信号可以在激发波长和/或发射波长方面不同。
[0149] 例示性的标记物包括荧光剂(例如荧光团、荧光蛋白、荧光半导体纳米晶体)、磷光剂、化学发光剂、显色剂、猝灭剂、染料、放射性核素、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素、链霉亲合素半抗原，等等)、酶(例如β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶，等等)、酶底物、酶辅因子(例如NADPH)、酶抑制剂、闪烁剂、抑制剂、磁性颗粒、寡核苷酸、和本领域中已知的其它模块。在标记物是荧光团的情况中，可以使用荧光团的一项或多项特征来评估经标记的探针的结构状态。例如，荧光团的激发波长可以随经标记的探针的结构状态而不同。在一些实施方案中，荧光的发射波长、强度、或偏振(polarization)可以随经标记的探针的结构状态而变化。
[0150] 如本文中所使用的，“荧光团”指可以被光激发而发射荧光或磷光的化学基团。“猝灭剂”指能够猝灭来自荧光供体的荧光信号的试剂。第一荧光团可以发射荧光信号，其激发第二荧光团。第一荧光团可以发射被第二荧光团猝灭的信号。本文中所公开的探针可以经历荧光共振能量转移(FRET)。
[0151] 荧光团和猝灭剂可以包括下列试剂(或以下列商品名称出售的荧光团和猝灭剂)：1，5IAEDANS；1，8-ANS；伞形酮(例如4-甲基伞形酮)；吖啶酯、5-羧基-2，7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-HAT(羟色胺)；5-羟色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；锥虫黄TM TM
(Acriflavin)；锥虫黄福尔根SITSA；Alexa Fluor 350 ；Alexa Fluor 430 ；Alexa Fluor TM TM TM TM TM
488 ；Alexa Fluor 532 ；Alexa Fluor 546 ；Alexa Fluor 568 ；Alexa Fluor 594 ；
TM TM TM TM
Alexa Fluor 633 ；Alexa Fluor 647 ；Alexa Fluor 660 ；Alexa Fluor 680 ；茜素络合酮；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC；AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；氨甲基香豆素(AMCA)；苯胺蓝；蒽基硬脂酸酯；APC(别藻蓝蛋 白)；APC-Cy7；APTS；Astrazon亮 红4G；Astrazon橙R；Astrazon红6B；AstrazonTM TM
黄7GLL；阿 的 平(Atabrine)；ATTO-TAG CBQCA；ATTO-TAG FQ；金 胺 (Auramine)；
Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(二氨基苯基 二唑)；硫酸小檗碱；β内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H)；蓝色荧光蛋白；BFP/GFP FRET；Bimane；双苯甲酰胺TM
(Bisbenzamide)；双苯甲酰胺(Hoechst)；Blancophor FFG；Blancophor SV；BOBO -1；
TM
BOBO -3；Bodipy 492/515；Bodipy 493/503；Bodipy 500/510；Bodipy 505/515；Bodipy
530/550；Bodipy 542/563；Bodipy 558/568；Bodipy 564/570；Bodipy 576/589；Bodipy
581/591；Bodipy 630/650-X；Bodipy 650/665-X；Bodipy 665/676；Bodipy FL；Bodipy FL ATP；Bodipy Fl-神经酰胺；Bodipy R6G SE；Bodipy TMR；Bodipy TMR-X缀合物；
TM TM
Bodipy TMR-X，SE；Bodipy TR；Bodipy TR ATP；Bodipy TR-X SE；BO-PRO -1；BO-PRO -3；
TM
亮硫黄素(Sulphoflavin)FF；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙深红(Calcium Crimson )；钙TM
绿；钙橙；Calcofluor白；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；级联蓝(Cascade Blue )；级联黄；儿茶酚胺；CCF2(GeneBlazer)；CFDA；CFP-青色荧光蛋白；CFP/YFP FRET；叶绿素；
色霉素A；CL-NERF(比率染料，pH)；CMFDA；腔肠素(Coelenterazine)f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素n；腔肠素O；香豆素鬼笔毒环肽；C-藻蓝蛋白TM TM TM
(phycocyanine)；CPM甲基香豆素；CTC；CTC甲 ；Cy2 ；Cy3.18；Cy3.5 ；Cy3 ；Cy5.18；
TM TM TM
Cy5.5 ；Cy5 ；Cy7 ；Cyan GFP；环AMP荧光传感器(Fluorosensor)(FiCRhR)；Dabcyl；丹酰；丹酰胺；丹酰尸胺；丹酰氯；丹酰DHPE；丹酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl
3；DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光素二乙酸酯)；DDAO；DHR(二氢罗丹明123)；Di-4-ANEPPS；
Di-8-ANEPPS(非比率型)；DiA(4-Di-16-ASP)；二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH)；DiD-亲脂性示踪剂；DiD(DiIC18(5))；DIDS；二氢罗丹明123(DHR)；DiI(DiIC18(3))；二硝基酚；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(DiIC18(7))；DNP；多 巴 胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；
DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；曙红；藻红；藻红ITC；溴化乙啶；乙啶同二聚体-1(EthD-1)；吖啶橙(Euchrysin)；EukoLight；氯化铕(III)；EYFP；快蓝(Fast Blue)；
FDA；福尔根(碱性副品红(Pararosaniline))；FITC；Flazo橙；Fluo-3；Fluo-4；荧光素(FITC)；荧光素二乙酸酯；荧光-祖母绿(Fluoro-Emerald)；荧光-金(Fluoro-Gold)TM TM
(羟芪巴脒)；荧光-红宝石(Fluor-Ruby)；FluorX；FM 1-43 ；FM 4-46；Fura红 ；FuraTM
红 /Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl亮 红 B；Genacryl 亮 黄 10GF；Genacryl粉红3G；Genacryl黄5GF；GeneBlazer(CCF2)；荧光蛋白(例如GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；GFP野生型、非UV激发(wtGFP)；GFP野生型、UV激发(wtGFP)；和GFPuv)；乙醛酸；粒状蓝；血卟啉；Hoechst 33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；HPTS；羟基香豆素；羟芪巴脒(FluoroGold)；羟色胺；Indo-1；吲哚二碳花青(Indodicarbocyanine)(DiD)；吲哚三碳花青(DiR)；内白(Intrawhite)Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；Laurodan；
LDS 751(DNA)；LDS 751(RNA)；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；钙黄绿素/乙啶同二聚体；LOLO-1；LO-PRO-1；萤光黄；鲁米诺、Lyso Tracker蓝；Lyso Tracker蓝-白；Lyso Tracker绿；Lyso Tracker红；Lyso Tracker黄；
LysoSensor蓝；LysoSensor绿；LysoSensor黄/蓝；Mag绿；苏丹红(根皮红B)；Mag-Fura红；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-Indo-1；镁绿；镁橙；孔雀石绿；Marina蓝；Maxilon亮黄素10GFF；Maxilon亮黄素8GFF；部花青(Merocyanin)；甲氧基香豆素；Mitotracker绿FM；Mitotracker橙；Mitotracker 红；光 神 霉 素(Mitramycin)；Monobromobimane；
Monobromobimane(mBBr-GSH)；Monochlorobimane；MPS(甲基绿派洛宁均二苯乙烯)；NBD；
TM
NBD胺；尼罗红；NED ；Nitrobenzoxadidole；去甲肾上腺素；核快红(Nuclear Fast Red)；
TM
核黄(Nuclear Yellow)；Nylosan亮Iavin E8G；Oregon绿；Oregon绿488-X；Oregon绿 ；
TM TM TM
Oregon绿 488；Oregon绿 500；Oregon绿 514；和平蓝(Pacific Blue)；碱性副品红(福尔根)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-德克萨斯红[红613]；根皮红B(苏丹红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；膦3R；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome蓝黑；POPO-1；POPO-3；
PO-PRO-1；PO-PRO-3；报春花灵(Primuline)；普施安黄(Procion Yellow)；碘化丙啶(Propidium Iodid，PI)；PyMPO；芘；派若宁(Pyronine)；派若宁B；Pyrozal亮黄素7GF；QSY
7；芥奎吖因(Quinacrine Mustard)；红613[PE-德克萨斯红]；试卤灵(Resorufin)；RH
414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B；罗丹明B 200；罗丹明B Extra；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明Phallicidine；罗丹明鬼笔毒环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红；R-藻青蛋白(phycocyanine)；R-藻红蛋白(PE)；
RsGFP；S65A；S65C；S65L；S65T；蓝宝石GFP；SBFI；血清素；Sevron亮红2B；Sevron亮红TM TM TM
4G；Sevron亮红B；Sevron橙；Sevron黄L；sgBFP ；sgBFP (super glow BFP)；sgGFP ；
TM
sgGFP (super glow GFP)；SITS；SITS(报春花灵)；SITS(均二苯乙烯异硫代磺酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿；谱浅绿(SpectrumAqua)；
谱绿(SpectrumGreen)；谱橙(SpectrumOrange)；谱红(Spectrum Red)；SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉铵)；均二苯乙烯(Stilbene)；磺基罗丹明(Sulphorhodamine)B can C；磺基罗丹明G Extra；SYTO 11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO 16；
SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；
SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO 45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；
SYTO 63；SYTO 64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO 84；SYTO 85；SYTOX 蓝；
TM TM TM
SYTOX绿；SYTOX橙；TET ；四环素；四甲基罗丹明(TRITC)；德克萨斯红 ；德克萨斯红-X缀合物；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫黄素5；硫黄素S；硫黄素TCN；
Thiolyte；噻唑橙；Tinopol CBS(Calcofluor白)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；
TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC四甲基罗丹明异硫氰酸酯；真蓝(True Blue)；
真红(TruRed)；Ultralite；荧光素钠(Uranine)B；Uvitex SFC； wt GFP；WW 781；
X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；
YOYO-3；及其盐。
(Acriflavin)；锥虫黄福尔根SITSA；Alexa Fluor 350 ；Alexa Fluor 430 ；Alexa Fluor TM TM TM TM TM
488 ；Alexa Fluor 532 ；Alexa Fluor 546 ；Alexa Fluor 568 ；Alexa Fluor 594 ；
TM TM TM TM
Alexa Fluor 633 ；Alexa Fluor 647 ；Alexa Fluor 660 ；Alexa Fluor 680 ；茜素络合酮；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC；AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；氨甲基香豆素(AMCA)；苯胺蓝；蒽基硬脂酸酯；APC(别藻蓝蛋 白)；APC-Cy7；APTS；Astrazon亮 红4G；Astrazon橙R；Astrazon红6B；AstrazonTM TM
黄7GLL；阿 的 平(Atabrine)；ATTO-TAG CBQCA；ATTO-TAG FQ；金 胺 (Auramine)；
Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(二氨基苯基 二唑)；硫酸小檗碱；β内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H)；蓝色荧光蛋白；BFP/GFP FRET；Bimane；双苯甲酰胺TM
(Bisbenzamide)；双苯甲酰胺(Hoechst)；Blancophor FFG；Blancophor SV；BOBO -1；
TM
BOBO -3；Bodipy 492/515；Bodipy 493/503；Bodipy 500/510；Bodipy 505/515；Bodipy
530/550；Bodipy 542/563；Bodipy 558/568；Bodipy 564/570；Bodipy 576/589；Bodipy
581/591；Bodipy 630/650-X；Bodipy 650/665-X；Bodipy 665/676；Bodipy FL；Bodipy FL ATP；Bodipy Fl-神经酰胺；Bodipy R6G SE；Bodipy TMR；Bodipy TMR-X缀合物；
TM TM
Bodipy TMR-X，SE；Bodipy TR；Bodipy TR ATP；Bodipy TR-X SE；BO-PRO -1；BO-PRO -3；
TM
亮硫黄素(Sulphoflavin)FF；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙深红(Calcium Crimson )；钙TM
绿；钙橙；Calcofluor白；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；级联蓝(Cascade Blue )；级联黄；儿茶酚胺；CCF2(GeneBlazer)；CFDA；CFP-青色荧光蛋白；CFP/YFP FRET；叶绿素；
色霉素A；CL-NERF(比率染料，pH)；CMFDA；腔肠素(Coelenterazine)f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素n；腔肠素O；香豆素鬼笔毒环肽；C-藻蓝蛋白TM TM TM
(phycocyanine)；CPM甲基香豆素；CTC；CTC甲 ；Cy2 ；Cy3.18；Cy3.5 ；Cy3 ；Cy5.18；
TM TM TM
Cy5.5 ；Cy5 ；Cy7 ；Cyan GFP；环AMP荧光传感器(Fluorosensor)(FiCRhR)；Dabcyl；丹酰；丹酰胺；丹酰尸胺；丹酰氯；丹酰DHPE；丹酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl
3；DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光素二乙酸酯)；DDAO；DHR(二氢罗丹明123)；Di-4-ANEPPS；
Di-8-ANEPPS(非比率型)；DiA(4-Di-16-ASP)；二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH)；DiD-亲脂性示踪剂；DiD(DiIC18(5))；DIDS；二氢罗丹明123(DHR)；DiI(DiIC18(3))；二硝基酚；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(DiIC18(7))；DNP；多 巴 胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；
DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；曙红；藻红；藻红ITC；溴化乙啶；乙啶同二聚体-1(EthD-1)；吖啶橙(Euchrysin)；EukoLight；氯化铕(III)；EYFP；快蓝(Fast Blue)；
FDA；福尔根(碱性副品红(Pararosaniline))；FITC；Flazo橙；Fluo-3；Fluo-4；荧光素(FITC)；荧光素二乙酸酯；荧光-祖母绿(Fluoro-Emerald)；荧光-金(Fluoro-Gold)TM TM
(羟芪巴脒)；荧光-红宝石(Fluor-Ruby)；FluorX；FM 1-43 ；FM 4-46；Fura红 ；FuraTM
红 /Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl亮 红 B；Genacryl 亮 黄 10GF；Genacryl粉红3G；Genacryl黄5GF；GeneBlazer(CCF2)；荧光蛋白(例如GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；GFP野生型、非UV激发(wtGFP)；GFP野生型、UV激发(wtGFP)；和GFPuv)；乙醛酸；粒状蓝；血卟啉；Hoechst 33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；HPTS；羟基香豆素；羟芪巴脒(FluoroGold)；羟色胺；Indo-1；吲哚二碳花青(Indodicarbocyanine)(DiD)；吲哚三碳花青(DiR)；内白(Intrawhite)Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；Laurodan；
LDS 751(DNA)；LDS 751(RNA)；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；钙黄绿素/乙啶同二聚体；LOLO-1；LO-PRO-1；萤光黄；鲁米诺、Lyso Tracker蓝；Lyso Tracker蓝-白；Lyso Tracker绿；Lyso Tracker红；Lyso Tracker黄；
LysoSensor蓝；LysoSensor绿；LysoSensor黄/蓝；Mag绿；苏丹红(根皮红B)；Mag-Fura红；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-Indo-1；镁绿；镁橙；孔雀石绿；Marina蓝；Maxilon亮黄素10GFF；Maxilon亮黄素8GFF；部花青(Merocyanin)；甲氧基香豆素；Mitotracker绿FM；Mitotracker橙；Mitotracker 红；光 神 霉 素(Mitramycin)；Monobromobimane；
Monobromobimane(mBBr-GSH)；Monochlorobimane；MPS(甲基绿派洛宁均二苯乙烯)；NBD；
TM
NBD胺；尼罗红；NED ；Nitrobenzoxadidole；去甲肾上腺素；核快红(Nuclear Fast Red)；
TM
核黄(Nuclear Yellow)；Nylosan亮Iavin E8G；Oregon绿；Oregon绿488-X；Oregon绿 ；
TM TM TM
Oregon绿 488；Oregon绿 500；Oregon绿 514；和平蓝(Pacific Blue)；碱性副品红(福尔根)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-德克萨斯红[红613]；根皮红B(苏丹红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；膦3R；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome蓝黑；POPO-1；POPO-3；
PO-PRO-1；PO-PRO-3；报春花灵(Primuline)；普施安黄(Procion Yellow)；碘化丙啶(Propidium Iodid，PI)；PyMPO；芘；派若宁(Pyronine)；派若宁B；Pyrozal亮黄素7GF；QSY
7；芥奎吖因(Quinacrine Mustard)；红613[PE-德克萨斯红]；试卤灵(Resorufin)；RH
414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B；罗丹明B 200；罗丹明B Extra；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明Phallicidine；罗丹明鬼笔毒环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红；R-藻青蛋白(phycocyanine)；R-藻红蛋白(PE)；
RsGFP；S65A；S65C；S65L；S65T；蓝宝石GFP；SBFI；血清素；Sevron亮红2B；Sevron亮红TM TM TM
4G；Sevron亮红B；Sevron橙；Sevron黄L；sgBFP ；sgBFP (super glow BFP)；sgGFP ；
TM
sgGFP (super glow GFP)；SITS；SITS(报春花灵)；SITS(均二苯乙烯异硫代磺酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿；谱浅绿(SpectrumAqua)；
谱绿(SpectrumGreen)；谱橙(SpectrumOrange)；谱红(Spectrum Red)；SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉铵)；均二苯乙烯(Stilbene)；磺基罗丹明(Sulphorhodamine)B can C；磺基罗丹明G Extra；SYTO 11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO 16；
SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；
SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO 45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；
SYTO 63；SYTO 64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO 84；SYTO 85；SYTOX 蓝；
TM TM TM
SYTOX绿；SYTOX橙；TET ；四环素；四甲基罗丹明(TRITC)；德克萨斯红 ；德克萨斯红-X缀合物；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫黄素5；硫黄素S；硫黄素TCN；
Thiolyte；噻唑橙；Tinopol CBS(Calcofluor白)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；
TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC四甲基罗丹明异硫氰酸酯；真蓝(True Blue)；
真红(TruRed)；Ultralite；荧光素钠(Uranine)B；Uvitex SFC； wt GFP；WW 781；
X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；
YOYO-3；及其盐。
[0152] 在一些实施方案中，标记物是芘模块。如本文中所使用的，芘模块包括芘，其包含四个融合的苯环或芘的衍生物。芘衍生物意为包含芘的四个融合的苯环的分子，其中将一个或多个芘碳原子取代或与别的模块缀合。例示性的芘衍生物包括烷基化的芘，其中用线性或分枝的、取代的或未取代的烃基、烯基、炔基或酰基基团，诸如C1-C20、线性或分枝的、取代的或未取代的烃基、烯基、炔基或酰基基团(其中可以用例如包括O、N或S原子的模块(例如羰基、胺、硫氢基)或者用卤素取代该基团)取代一个或多个芘碳原子。在一些实施方案中，芘衍生物包括一个或多个游离的羧基基团和/或一个或多个游离的胺基，它们各自可以直接附着于芘碳原子或者附着于如上文所描述的线性或分枝的、取代的或未取代的烃基、烯基、炔基或酰基基团上的任何位置，诸如附着于与芘碳分开1或更多个，诸如1至3、1至5、或更多个原子的碳原子。在一些实施方案中，用一个或多个乙酸模块和/或一个或多个乙胺模块取代芘。在一些实施方案中，用单个甲基、乙基、丙基或丁基基团取代芘衍生物。在一些实施方案中，用短链脂肪酸，诸如芘丁酸酯取代芘。在另一个实施方案中，将芘与清蛋白、转铁蛋白或抗体的Fc片段缀合。在一些实施方案中，经由碳-碳连接、氨基基团、肽键、醚、硫醚、二硫化物、或酯连接来将取代基附着于芘。在其它实施方案中，芘衍生物是PEG化的芘，即与聚乙二醇(PEG)缀合的芘。此类芘衍生物可以展现出更长的体内循环半衰期。在其它实施方案中，芘衍生物是与清蛋白缀合的芘。
[0153] 在一些实施方案中，标记物包含作为融合蛋白的一部分掺入肽探针中的荧光蛋白。荧光蛋白可以包括绿色荧光蛋白(例如GFP、eGFP、AcGFP、TurboGFP、Emerald、Azami Green、和ZsGreen)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、Sapphire、和T-Sapphire)、青色荧光蛋白(例如ECFP、mCFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、和Midoriishi Cyan)、黄色荧光蛋白(例如EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、PhiYFP、ZsYellow1、和mBanana)、和橙色及红色荧光蛋白(例如Kusabira橙、mOrange、dTomato、dTomato-Tandem、DsRed、DsRed2、DsRed-Express(T1)、DsREd- 单 体、mTangerine、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、HcRed1、mRaspberry、HcRed-Tandem、mPlum和AQ143)。本领域中描述了其它荧光蛋白(Tsien，R.Y.，Annual.Rev.Biochem.67：509-544(1998)；及Lippincott-Schwartz等，Science 300：87-91(2003))。
[0154] 如上文所记录的，探针可以包含在如下的融合蛋白中，所述融合蛋白还包括在探针的N端或C端处偶联的荧光蛋白。可以经由肽接头来偶联荧光蛋白，如本领域中所描述的(U.S.6,448,087；Wurth等，J.Mol.Biol.319：1279-1290(2002)；及Kim等，J.Biol.Chem.280：35059-35076(2005)，通过提及而将其完整收入本文)。在一些实施方案中，合适的接头可以长约8-12个氨基酸。在别的实施方案中，接头的大于约75％的氨基酸残基选自丝氨酸、甘氨酸、和丙氨酸残基。
[0155] 在包含体内检测或成像的实施方案中，可以使用可用于体内成像的标记物。例如，可以使用可用于磁共振成像的标记物，诸如氟-18，也可以使用化学发光标记物。在另一个实施方案中，用放射性标记物标记探针。例如，标记物可以提供具有足以被目前为此目的而采用的仪器检测到的能量的正电子发射。此类实体的一个例子包含氧-15(即一种通过正电子发射来衰变的氧同位素)或其它放射性核素。另一个例子是碳-11。可以对患者施用经此类标记物标记的探针，容许其定位于靶蛋白，并可以对患者成像(扫描)以检测定位的探针，并且如此鉴定定位的靶蛋白的位置。可以通过会容许定位于靶蛋白位置的任何合适的手段，诸如通过直接注射、鼻内或口服来施用经标记的探针。在一些实施方案中，可以将经放射性标记的探针注射入患者中，并在外部监测探针对蛋白质靶物的结合。
[0156] 在一些实施方案中，标记物包含寡核苷酸。例如，肽探针可以与寡核苷酸标签偶联，所述寡核苷酸标签可以通过本领域中的已知方法(例如扩增测定法诸如PCR、TMA、b-DNA、NASBA，等等)来检测。
[0157] 4.方法
[0158] 本文中所描述的肽探针与靶蛋白选择性结合，而且在与靶蛋白结合后经历构象转变。例如，在一些实施方案中，本文中所描述的探针结合与靶蛋白有关的Aβ蛋白聚集体，而且在此类结合后经历构象转变。如上文所记录的，构象转变可以包含探针的N与C端间(或者任何其它两点间)的距离变化、紧密程度不同地折叠、采用较为有序或不太有序的构象、从主要为一种二级结构改变成主要为另一种二级结构、或不同二级结构的相对量的任何变化。如上文所记录的，“构象转变”包括可以通过间接的手段，诸如经由下文所讨论的标记物信号传导(即使构象的更直接的测量，诸如CD未揭示构象变化)来检测的那些转变。
[0159] 在一些实施方案中，探针经历与靶蛋白的构象变化相似的构象变化。例如，在一些实施方案中，探针能够采用主要为无规卷曲/α-螺旋构象和主要为β-片层构象两者，并且在结合展现出主要为β-片层构象的靶蛋白后采用主要为β-片层构象。在一些实施方案中，探针以主要为α-螺旋/无规卷曲构象提供，并且在与主要为β-片层构象的靶蛋白接触、结合、联合和/或相互作用后经历向主要为β-片层构象的构象转变。在其它实施方案中，探针通过变得更压缩、更弥散、或者采用任何不同构型来转变构象。在一些实施方案中，探针更紧密地采用Aβ蛋白聚集体的构象。在其它实施方案中，探针能够采用主要为无规卷曲/α-螺旋构象和主要为β-片层构象两者，并且在结合展现出主要为β-片层构象的靶蛋白后采用不太有序的或减少的β-片层构象。在这些实施方案中，探针可以以主要为β-片层构象提供，并且在与主要为β-片层构象的靶蛋白接触、结合、联合和/或相互作用后经历向不太有序的或减少的β-片层构象/增加的无规卷曲/α-螺旋构象的构象转变。
[0160] 在一些实施方案中，肽探针优先结合自我聚集的特定状态，诸如单体、二聚体、可溶性寡聚物(例如4-12聚体)、不溶性聚集体和原纤维(例如100-1000聚体或更大)的靶蛋白。一般地，这记载于US 2008/0095706(对应于美国专利申请11/828,953)，通过提及而将其全部内容完整收入本文。这通过用肽22(SEQ ID NO：2)完成的工作来例示。
[0161] 图12显示了肽22(SEQ ID NO：2)对可溶性Aβ寡聚物的特异性。前两幅小图显示了在将肽22与通过两种不同方法制备的可溶性Aβ寡聚物一起温育时的芘单体信号的剂量依赖性升高。接着的两幅小图显示了在将肽22与Aβ40单体和Aβ42单体一起温育时没有荧光变化。接着的小图显示了在将肽22与Aβ40纤维一起温育时没有荧光变化，而接着的小图显示了在将肽22与Aβ42纤维一起温育时单体荧光的某些剂量依赖性升高。最后两幅小图显示了在将肽22与对照溶液(BSA或脱水酶)一起温育时没有荧光变化。如此，肽22优先结合可溶性Aβ寡聚物形式的Aβ蛋白。已经对肽38(SEQ ID NO：3)获得了相似的数据，这显示了它也优先结合可溶性Aβ寡聚物形式的Aβ蛋白。
[0162] 因为认为可溶性寡聚物是Aβ蛋白的活性病原性形式，所以检测可溶性Aβ寡聚物的能力可以具有特别的临床意义。此外，检测可溶性Aβ寡聚物的能力可以在疾病进展的过程期间比通过检测Aβ原纤维所容许更早地容许检测、诊断和治疗。
[0163] 如此，依照一些实施方案，提供了一种用于在测试样品中检测靶蛋白的方法，其中靶蛋白展现出与淀粉样蛋白生成性疾病有关的β-片层构象，所述方法包括：(i)使样品与肽探针接触以形成测试混合物；并(ii)检测肽探针与存在的任何靶蛋白间的任何结合。在一些实施方案中，在体外实现该方法。
[0164] “测试样品”指要测试的任何样品，并且可以是来自人或动物组织、血液、脑脊液、尿液、粪便、毛发、唾液或患者的任何其它部分等。在另一个实施方案中，测试样品可以来自可含有含感兴趣的靶蛋白的生物学材料的任何来源，包括药物产品、食物产品、衣服或其它动物来源的材料或环境样品。可以以与本方法相容的任何方式，例如均质化、细胞破坏、稀释、澄清等来制备测试样品以在本方法中使用。应当注意不使测试样品中的蛋白质变性，从而靶蛋白保留其初始的构象。任选地，可以使用常规的技术诸如超声处理来分拆测试样品，之后添加肽探针。在涉及体内检测的实施方案中，测试样品是活的受试者。
[0165] 对于体外使用，探针可以在溶液，诸如具有约4和约10之间，诸如约5和约8之间的pH，具有约0.01和约0.5之间的离子强度(在通常用氯化盐，诸如氯化钠或氯化钾制备时)的水溶液中提供。溶液还可以以约30％至约100％(按体积计)之间，诸如约45％至约60％之间的量包含水可混合的有机材料(例如三氟乙醇、六氟-2-丙醛(HFIP)或乙腈(ACN))。可以用合适的缓冲系统诸如乙酸盐/乙酸、Tris、或磷酸盐来制备溶剂。对于体内使用，探针可以在任何生理学可接受溶液中提供。例如，可以将探针以三氟乙酸盐制备，并在有机溶剂，诸如100％HFIP或50％ACN中重悬。
[0166] 在其它实施方案中，所述方法在体内实现，并且包括对受试者施用肽探针，并例如扫描受试者以检测定位于β-片层构象靶蛋白位置的经标记的肽探针。在例如US2008/0095706中提供了关于体内方法的更多详情，通过提及而其内容完整收入本文。在此类体内实施方案中，可以诸如通过局部注射来对患者施用经标记的肽探针，容许其定位于患者内存在的靶蛋白或高阶靶蛋白结构的任何位置，然后可以对患者扫描以检测位于靶蛋白或高阶靶蛋白结构的位置处的经标记的探针的位置。还涵盖其它施用路径，包括鼻内和口服。如上文所讨论的，可以用适合于体内成像的任何标记物来标记探针。患者可以进行全身扫描以鉴定靶蛋白的任何位置。或者，可以扫描患者的特定区域以确定靶蛋白是否位于该特定区域中。感兴趣的特定区域可以包括血管组织、淋巴组织或脑(包括海马或额叶)、或其它器官诸如心脏、肾、肝或肺。例示性的合适的扫描或成像技术包括正电子发射断层摄影(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、磁共振成像(MRI)、放射照相术、断层摄影术、荧光术、核医学、光学成像、脑照相术和超声波扫描术。
[0167] 在一些实施方案中，诸如为了检测不溶性靶蛋白(诸如Aβ原纤维)，肽探针与靶蛋白间的结合导致不溶性复合物的形成。可以使用常规的技术来检测不溶性复合物，诸如通过使用常规的技术诸如使不溶性复合物沉淀的离心和/或过滤自反应混合物分离不溶性复合物来进行。然后，可以通过检测技术来进一步表征不溶性复合物，例如不溶性复合物中存在的任何肽探针。此类检测技术可以包括例如检测肽探针的标记物，或者通过使用诸如SDS-PAGE(其基于分子量来分离蛋白质)等技术或本领域中已知的其它常规的技术来表征不溶性复合物的其它技术。不溶性复合物中的肽探针上的可检测标记物的检测与肽探针-靶蛋白复合物的存在关联，其继而与测试样品中的靶蛋白关联。
[0168] 在一些实施方案中，诸如为了检测可溶性靶蛋白聚集体(诸如可溶性Aβ寡聚物)，肽探针与靶蛋白间的结合导致可溶性复合物的形成。可以通过数种不同方法来实现检测包括可溶性复合物的复合物。例如，可以分开复合物与反应混合物的其它组分，诸如未结合的肽探针和/或未结合的靶蛋白，然后可以通过检测复合物中存在的肽探针上的可检测标记物来检测复合物。可以使用本领域中已知的任何方法来实现分离。
[0169] 在一些实施方案中，使用大小排阻层析(SEC)来分离肽探针-靶蛋白复合物。SEC使用捕捉介质(又称作固定相)中的孔或开口来保留较小的分子，使得较小的分子较慢地迁移通过捕捉介质，而较大的分子较快地通过。这些孔或开口具有限定的大小，并且可以选择为区分肽探针-靶蛋白复合物与未结合的肽探针和/或未结合的靶蛋白。依照这些方法，肽探针-靶蛋白复合物会在未结合的肽探针前洗脱。较早级分中的肽探针上的可检测标记物的检测与肽探针-靶蛋白复合物的存在关联，其继而与测试样品中的靶蛋白关联。
[0170] 备选的实施方案使用亲和层析来保留捕捉介质上的肽探针-靶蛋白复合物。此方法利用捕捉介质，诸如固相，其包含结合肽探针-靶蛋白复合物的亲和分子。亲和分子可以选择为特异性结合靶蛋白、肽探针、复合物、或与肽探针-靶蛋白复合物的任何组分缀合的标记物。在一些实施方案中，亲和分子特异性结合靶蛋白或与靶蛋白缀合的标记物，使得靶蛋白保留于捕捉介质上。一旦洗掉未结合的组分(包括任何未结合的肽探针)，通常便可以使用洗脱缓冲液来洗脱结合的材料，并可以分析洗脱剂。洗脱剂中的肽探针上的可检测标记物的检测与洗脱剂中的肽探针-靶蛋白复合物的存在关联，其继而与测试样品中的靶蛋白关联。在一些实施方案中，将靶蛋白与捕捉介质的亲和分子结合的模块缀合。例如，若亲和分子包含亲合素或链霉亲合素，则可以将靶蛋白与生物素缀合。
[0171] 在其它实施方案中，将肽探针与被亲和分子特异性结合的模块，诸如生物素缀合。此类肽探针特别适合于在ELISA和免疫沉淀测定法中使用。例如，可以与经生物素标记的肽探针一起使用经亲合素包被的板。清洗以除去非特异性结合的探针后，添加要测定靶蛋白的样品。清洗以除去非特异性结合的物质后，添加特异性结合靶蛋白的抗体(诸如小鼠抗Aβ抗体，诸如识别Aβ抗体，而非肽探针的抗体6E10)。清洗以除去非特异性结合的抗体后，添加经标记的抗体(诸如标记有辣根过氧化物酶的小鼠抗IgG抗体)。在此类测定法中，抗体标记物的检测与样品中的靶蛋白的存在关联。
[0172] 下文表1中的肽探针AD310(SEQ ID NO：38)、AD313(SEQ ID NO：39)、AD314(SEQ ID NO：40)、AD317(SEQ ID NO：41)、和AD321(SEQ ID NO：42)例示了此类肽探针的具体实施方案，及生物素化的备选位点的例子。虽然这些肽探针之每种包含SEQ ID NO：2(肽22)，但是本领域技术人员应当理解，可以如上文一般描述及如由这些肽探针明确例示的那样将本文中所描述的任何肽探针生物素化。例如，可以经由螺旋接头(诸如EAAAK；SEQ ID NO：56)在C端实现生物素化，如以AD310(SEQ ID NO：38)例示的。一般地，螺旋接头包括形成α螺旋的残基，诸如丙氨酸残基。或者，可以经由赖氨酸残基(包括内部或末端赖氨酸残基)上的侧链来实现生物素化，如以AD313(SEQ ID NO：39)例示的。或者，可以经由柔性接头(诸如GSSGSSK(SEQ ID NO：57))在C端实现生物素化，如以AD314(SEQ ID NO：40)例示的。一般地，柔性接头包括一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基，或可以自由旋转约其 和ψ角的其它残基。或者，可以经由凝血酶位点接头(诸如包含LVPRGS(SEQ ID NO：58)的接头，诸如GLVPRGSGK(SEQ ID NO：59))在C端实现生物素化，如以AD317(SEQ ID NO：41)例示的。或者，可以经由扭结接头(诸如PSGSPK(SEQ ID NO：60))在C端实现生物素化，如以AD321(SEQ ID NO：42)例示的。一般地，扭结接头包含一个或多个脯氨酸残基，或具有严格保护生物素模块远离肽探针的蛋白质结合基序的固定的 和ψ角的其它残基。
[0173] 在一些实施方案中，通过检测由肽探针产生的信号，诸如在肽探针展现出β-片层构象或与其靶蛋白结合状态有关的其它构象时产生的信号来检测肽探针与靶蛋白间的结合。可以在从反应混合物分离(诸如上文所描述)或不分离(诸如在体内实施方案中)肽探针-靶蛋白复合物的情况中在体外或在体内实现这些实施方案。在这些实施方案中，可以用形成受激子的标记物，诸如芘，或用FRET标记物来标记肽探针。凭借任一类标记物，在肽探针采用β-片层构象或与其靶蛋白结合状态有关的其它构象时产生信号，诸如可以在与展现出β-片层构象的靶蛋白接触、相互作用或结合后发生。
[0174] 受激子指不必是共价的且在已经被光子激发的分子实体与相同的未激发分子实体间形成的加合物。加合物在自然界中是短暂的，并且在其通过发射光子而发荧光前一直存在。受激子表示两个荧光团的相互作用，其在用特定波长的光激发后发射不同波长的光，该光与由单独起作用的任一种荧光团发射的光在量级上也不同。有可能通过产生比通常的发射谱的波长长的波长的新荧光带来识别受激子(或受激子的形成)。因为激发谱与单体的激发谱相同，所以可以区分受激子与荧光共振能量转移。受激子的形成取决于荧光团的几何排列，而且很大程度上受其间距离的影响。
[0175] 在一个实施方案中，芘模块存在于肽探针的每个末端处或附近，并且荧光团间的受激子形成可忽略，只要总体肽构象是α-螺旋或无规卷曲，但是在肽药剂经历结构变化(诸如构象变化成β-片层构象)，从而使芘模块彼此接近时形成受激子。存在于肽上的其它位置处的芘模块在此背景中也可以是有用的，只要受激子形成是构象依赖性的。此外，受激子形成的量级与存在的蛋白质分析物的量成正比。如此，本发明的方法通过检测受激子形成而容许靶蛋白或结构的检测和体内成像。
[0176] 在肽探针在与靶蛋白联合或结合后从较为有序的构象变化成不太有序的构象的实施方案中，在芘模块存在于肽探针的每个末端处或附近时，受激子信号可以是与肽的未结合状态有关的信号，并且芘单体荧光会较低。在此类肽与β-片层构象的靶蛋白接触时，它们经历降低芘标记物的物理接近的构象变化，导致芘受激子信号降低和芘单体信号升高。存在于肽上的其它位置处的芘模块在此背景中也可以是有用的，只要受激子/单体信号传导取决于随肽探针是为联合(例如结合)还是为未结合(例如没有结合靶蛋白)状态而变化的构象。此外，在这些实施方案中，芘单体信号的升高或芘受激子信号的降低与存在的靶蛋白的量成正比。如此，这些实施方案同样通过监测受激子和单体信号传导而容许靶蛋白或结构的检测和体内成像。这在图11中显示，其使用肽22进行(在下文更为详细地描述的)。具体地，图11显示了在没有(左侧)和存在(右侧)可溶性Aβ寡聚物的情况中在每个末端经芘标记的肽22(SEQ ID NO：2)的原始荧光谱。肽22的荧光在没有寡聚物的情况中随时间是稳定的(没有单体或受激子荧光的升高)，但是在与可溶性Aβ寡聚物一起温育时展现出芘单体信号的升高。
[0177] 可以通过光学特性的变化来检测受激子的形成。根据附着于探针的荧光团，可以通过已知的荧光测量技术，包括UV、IR、CD、NMR、或荧光等来测量此类变化。光学特性的这些变化的量级与已经采用与该变化有关的结构状态的缀合物的量成正比，而且与存在的靶蛋白或结构的量成正比。
[0178] 相似的考虑因素适用于FRET。例如，可以在每个末端处或附近用选自下列FRET标记物对的标记物来标记肽探针：DACIA-I/NBD、Marina蓝/NBD和EDANS/Fam(荧光)。对于在与靶蛋白联合或结合后从不太有序的构象变化成较为有序的构象的肽探针，FRET信号的检测与肽探针的β-片层构象有关，而且与靶蛋白的存在关联。对于在与靶蛋白联合或结合后从较为有序的构象变化成不太有序的构象的肽探针，FRET信号的检测与肽探针的未结合状态有关，而不同(单体)信号或无信号的检测与靶蛋白的存在关联。
[0179] 相似的考虑因素也适用于荧光团/猝灭剂标记物，如上文所讨论的。
[0180] 如上文所讨论的，本文中所描述的肽探针设计为诸如通过展现出降低的背景信号来在检测测定法中实现增强的性能。如此，肽探针可以比检测展现出β-片层构象的靶蛋白中的参照肽更灵敏且更可靠。
[0181] 如上文所记录的，靶蛋白可以与疾病或状况有关。如此，靶蛋白的检测可以与疾病或状况的诊断或风险关联。在一些实施方案中，由本文中所描述的肽探针检测的展现出β-片层构象的靶蛋白的量可以与临床相关疾病特征，诸如疾病进展或状态，或疾病的素因关联。在其它实施方案中，可以使用本文中所描述的方法来测定患者中存在的错折叠淀粉样蛋白的量，和/或Aβ40与Aβ42蛋白的比率，已知所述特征对应于淀粉样蛋白生成性疾病，诸如AD的疾病进展。
[0182] 本文中所描述的肽探针也可用于鉴定抑制靶蛋白展现出β-片层构象的能力的药剂，诸如可以用于治疗背景。在此类方法中，将药剂与靶蛋白一起温育，并检测肽探针与展现出β-片层构象的靶蛋白的结合。通过比较在与和不与药剂一起温育的情况中结合靶蛋白的肽探针的量，可以测定药剂的抑制能力。例示性的方法记载于US 2008/0095706(对应于美国专利申请11/828,953)，通过提及而将其全部内容完整收入本文。
[0183] 5.体内治疗方法
[0184] 在其它实施方案中，提供了用于阻止靶蛋白的蛋白质聚集体形成的体内方法，包括使体内的靶蛋白与针对靶蛋白的肽探针接触，其中肽探针优先结合靶蛋白，由此阻止靶蛋白的高阶蛋白质聚集体的形成。在一些实施方案中，肽探针优先结合选自下组的自我聚集的特定状态的靶蛋白：单体、可溶性寡聚物、和不溶性自我聚集体。
[0185] 依照其它实施方案，提供了用于投递针对靶蛋白的治疗剂的方法，包括组合治疗剂与针对靶蛋白的肽探针，并对有此需要的患者施用肽探针-治疗剂组合。例如，可以将肽探针与治疗剂缀合(直接或经由接头)以对靶蛋白的位置靶向投递治疗剂。在此类体内实施方案(其在上文所提及的US 2008/0095706中披露)中，可以诸如通过局部注射来对患者施用肽探针(单独的或作为包含另一种治疗剂的组合)，并容许其定位于患者内存在的靶蛋白或高阶靶蛋白结构的任何位置，以实现疗法。还涵盖其它施用路径，包括鼻内和口服。感兴趣的特定区域可以包括血管组织、淋巴组织或脑(包括海马或额叶)、或其它器官诸如心脏、肾、肝或肺。
[0186] 6.试剂盒
[0187] 还提供了包含本文中所描述的肽的试剂盒。试剂盒可以准备好用于实施本文中所描述的方法。通常，试剂盒包括可用于实施方法的至少一种组分或组分的包装组合。“包装组合”意为试剂盒提供含有一种或多种组分，诸如肽探针、缓冲剂、使用指令等的组合的单一包装。包含单一容器的试剂盒包括在“包装组合”的定义内。试剂盒可以包括实施本文中所公开的方法必需的一些或所有组分。通常，试剂盒在至少一个容器中包括至少一种肽探针。试剂盒可以在一个或多个容器中包括多种肽探针，其可以是相同或不同的，诸如包含不同序列和/或不同标记物的探针。多种探针可以存在于单一容器中或者在各含有单一探针的不同容器中。实施例
[0188] 实施例1
[0189] 荧光报告模块与肽的缀合可以提供监测肽在不同溶剂条件下，或者在存在相互作用配偶体(诸如靶蛋白)和辅因子(诸如抗淀粉样蛋白剂)的情况中的构象动力学的简单机制。如上文所讨论的，根据芘是否为单体状态或者它是否与其它芘分子极其物理接近或配对(受激子状态)，芘发射两种独特的荧光谱。在芘在本文中所描述的肽的N和C端处或附近缀合时，芘模块可以随肽的构象而以不同距离分开，其中芘为β-片层构象时极其物理接近(图1B)，而为无规卷曲/α-螺旋构象时相隔较远(图1C)。如此，在将芘在本文中所描述的肽的N和C端处或附近缀合时，它可以而肽的构象而提供具有两种独特的荧光谱的荧光信号，其中单体信号与肽的无规卷曲/α-螺旋构象有关，而受激子信号与肽的β-片层构象有关。结果可以以β-片层构象(受激子)的信号或者以来自β-片层构象(受激子)的信号与来自α-螺旋构象(单体)的信号的荧光比率报告。
[0190] 在将超过一个芘模块与感兴趣的肽缀合时，可以使用计算机建模来预测芘间距离，以选择会随肽的构象而产生不同信号的肽。图1A显示了芘的芘间距离于室温随肽的溶剂环境的分布的计算机预测，所述芘与对应于Aβ肽(SEQ ID NO：1)区的肽的每个末端缀合。如此图中所显示的，肽在水中采用β-片层构象，其中芘模块相对极其接近(N和C端芘环的中心间为约 )。比较而言，肽在40％三氟乙醇(TFE)中采用α-螺旋构象，其中芘模块相隔更远(N和C端芘环的中心间为约 )。
[0191] 实施例2
[0192] 依照本文中所描述的原则来设计新的肽探针。如图2中所显示的，肽序列基于Aβ肽的氨基酸17-35，其是Aβ肽的β-片层形成区。参照序列(WT；SEQ ID NO：1)对应于野生型序列，其具有添加的末端赖氨酸残基以便于芘标记。
[0193] 肽22(SEQ ID NO：2)包括用组氨酸残基的替代、用谷氨酸残基的替代、和添加的C端赖氨酸残基。
[0194] 肽38(SEQ ID NO：3)包括用四个连续的丙氨酸残基的替代、用组氨酸残基的替代、用谷氨酸残基的替代、和添加的C端赖氨酸残基。
[0195] 肽45(SEQ ID NO：4)包括添加的三个连续的N端丙氨酸残基、用组氨酸残基的替代、用谷氨酸残基的替代、和添加的C端赖氨酸残基。
[0196] 肽I32S(SEQ ID NO：5)包括用亮氨酸残基替换异亮氨酸残基和添加的C端赖氨酸残基。
[0197] 肽M35A(SEQ ID NO：6)包括用丙氨酸残基替换C端残基、和添加赖氨酸残基作为肽的C端残基。
[0198] 肽E22P(SEQ ID NO：7)包括用脯氨酸残基替换谷氨酸残基。
[0199] 肽GM6(SEQ ID NO：8)包括用丝氨酸残基替换苯丙氨酸残基及用脯氨酸残基替换亮氨酸残基。
[0200] 如上文所讨论的，肽22、38和45(SEQ ID NO.2-4)中的组氨酸和谷氨酸残基替代容许那些残基间的盐桥的形成，这可以使α-螺旋构象稳定化和/或提供一种用于控制通过控制测定条件产生的信号的手段。如上文所讨论的，这些肽展现出降低的背景信号，这是由于肽在没有β-片层构象的靶蛋白的情况中不太可能采用β-片层构象。
[0201] 如上文所讨论的，肽38(SEQ ID NO：3)和肽45(SEQ ID NO：4)中的连续的丙氨酸替代(丙氨酸重复)具有高的α-螺旋倾向，并且如此使肽的α-螺旋构象稳定化。再次，这些肽展现出降低的背景信号，这是由于肽在没有β-片层构象的靶蛋白的情况中不太可能采用β-片层构象。
[0202] 如上文所讨论的，一些替代便于在与靶蛋白接触、结合或相互作用后采用β-片层构象，或其它构象变化，使得肽采用β-片层构象，或者在与靶蛋白接触、结合或相互作用后比参照序列更有效地经历构象变化。在SEQ ID NO：7、9、13和19-21中将丙氨酸替换成甘氨酸、谷氨酸替换成脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、或赖氨酸，和天冬氨酸替换成天冬酰胺导致具有增强的β-片层形成和聚集特性的肽探针。
[0203] 肽M35A(SEQ ID NO：6)中的C端甲硫氨酸残基替代使肽比参照(野生型)序列在氧化环境中更稳定。
[0204] 其它工作已经显示了，肽I32S(SEQ ID NO：5)中异亮氨酸成丝氨酸的替代、肽AD323、AD325、AD330、AD329、AD328、和AD327(SEQ ID NO：28-33)中的丝氨酸、组氨酸、异亮氨酸、和/或亮氨酸成天冬氨酸的替代、和肽GM6和GM6变异1(SEQ ID NO：34-35)中的苯丙氨酸成丝氨酸及亮氨酸成苯丙氨酸的替代使所得的探针的β-片层构象脱稳定化，尽管这些探针在与靶蛋白，诸如Aβ寡聚物接触、结合或相互作用后比参照(野生型)序列更有效地经历构象变化。
[0205] 实施例3
[0206] 可以在数种不同测定法中针对已知的靶蛋白使用肽探针来评估它们在给定的测定法中使用和/或在给定的测定条件下使用的适合性。例如，一种肽在一个特定的测定法中可以是更有效的，而不同肽在不同测定法中可以是更有效的。在数种不同测定法中使用SEQ ID NO：1的肽，如下文所讨论的。可以使用相似的测定法来检测测试样品中的靶蛋白。
[0207] (i)不溶性复合物
[0208] 在此测定法中，在基于离心的体外相互作用测定法中组合可溶性肽探针与不溶性靶蛋白纤维。会在不溶性沉淀物中检测出结合靶蛋白的肽探针，所述不溶性沉淀物可以使用离心来分离。未结合不溶性靶蛋白纤维的肽探针保留在上清液中，并且在沉淀物中检测不到。
[0209] 在存在增加量的三氟乙醇(TFE)的情况中将Aβ42纤维(靶蛋白)和肽探针(SEQ ID NO：1)一起温育3小时。以17,000x g将样品离心30分钟，并将沉淀物在样品缓冲液中变性，并通过SDS-PAGE来分析。结果在图3中显示。为了比较而显示参照样品(输入)。在此实施例中，在40％TFE条件时清楚地观察到靶蛋白与肽探针的结合(在40％TFE时比较左侧和右侧小图，其中“肽”带在左侧小图，而不是右侧小图中出现)。这指示肽降落到具有原纤维形式的靶蛋白的旋转沉淀物中，所述原纤维形式的靶蛋白在SDA-PAGE上以单体Aβ42显示，这是因为原纤维在SDS-PGE条件下溶解成单体。
[0210] 若用可检测的标记物来标记肽，则沉淀的不溶性复合物中的信号会与靶物-肽结合关联(未显示)。
[0211] (ii)大小排阻层析
[0212] 在此测定法中，在基于大小排阻层析的体外相互作用测定法中组合可溶性肽探针与例如可溶性靶蛋白寡聚物。
[0213] 将经标记的肽探针(SEQ ID NO：1，2μM)和靶蛋白(Aβ寡聚物，2μM)在Hepes缓冲液(10mM，pH 7.0)中一起温育90分钟，然后加载至G25大小排阻柱(其具有5000Da分子量截留)上。将该柱以735x g进行离心达2分钟。通过TECAN荧光计来分析洗脱剂和柱材料。此方法在图14A中显示。也可以通过SDS-PAGE来分析洗脱剂(未显示)。
[0214] 在此测定法中，未结合的肽探针会由于其较小的大小而保留于柱上。如此，洗脱剂中的经标记的肽探针的检测指示洗脱剂中的靶蛋白-肽复合物的存在。这通过图14B中所显示的结果来确认，该图显示了在存在寡聚物的情况中回收经荧光标记的肽。
[0215] 在用肽45进行的相似的测定法中，将经标记的肽探针(SEQ ID NO：4，2μM)和靶蛋白(Aβ寡聚物，2μM)在Hepes缓冲液(10mM，pH 7.0)中一起温育90分钟，然后加载至G25大小排阻柱(其具有5000Da分子量截留)上。将该柱以735x g进行离心达2分钟。通过TECAN荧光计来分析洗脱剂和柱材料。此方法在图4A中显示。在此测定法中，未结合的肽探针会由于其较小的大小而保留于柱上。如此，洗脱剂中的经标记的肽探针的检测指示洗脱剂中的靶蛋白-肽复合物的存在。这通过图4B中所显示的结果来确认，该图显示了在存在寡聚物的情况中回收经荧光标记的肽。
[0216] (iii)亲和层析
[0217] 在此测定法中，在基于亲和层析的体外相互作用测定法中组合可溶性肽探针与例如可溶性靶蛋白寡聚物。
[0218] 对于此实施例，用亲和分子诸如生物素来标记靶蛋白，并将其与经标记的肽探针一起温育。温育后，将混合物与支持物(例如柱或珠)上的捕捉模块，诸如链霉亲合素一起温育，从而捕获靶蛋白。清洗未结合的材料后，可以检查支持物以检测经标记的肽探针，这会指示支持物上结合的靶蛋白-肽探针复合物的存在。或者，可以洗脱结合的材料，然后对其检查以检测经标记的肽探针。再次，经标记的肽探针的检测会指示洗脱剂中的靶蛋白-肽探针复合物的存在。图5A和图15A显示了使用经生物素标记的靶蛋白和经链霉亲合素包被的珠进行的亲和层析测定法。此类测定法可用于例如评估给定的肽探针的功效。
[0219] 将经标记的肽探针(SEQ ID NO：1，2μM)和生物素化的靶蛋白(Aβ42寡聚物，2μM)在PBS中一起温育30分钟。然后，使用经链霉亲合素包被的磁珠来将混合物进行捕捉步骤。用PBS清洗该珠以除去未结合的材料，并通过SDS-PAGE来分析捕获的材料。
[0220] 在备选的测定法(方案B，在图15A中显示)中，于室温将4μN生物素化的Aβ42寡聚物与预清洗的链霉亲合素Dynabead一起温育30分钟。然后，用PBS缓冲液将复合物清洗两次，并在PBS缓冲液中重悬。然后，混合等体积的结合的寡聚物和4μM经标记的肽探针(SEQ ID NO：1)，并于室温温育30分钟。然后，通过三次PBS清洗，接着通过磁体来收集珠复合物来洗去未结合的材料。然后，将复合物在1X LDS缓冲液中重悬，煮沸10分钟，并在10％Bis-Tris凝胶上加载。
[0221] 图15B显示了结果。如图中所显示的，仅在存在高分子量寡聚物的情况中在捕捉材料中检测出经标记的肽探针，指示肽探针结合靶蛋白寡聚物。也可以通过荧光谱来分析捕捉材料(未显示)。
[0222] 在用肽22进行的相似的测定法(方案A)中，将经标记的肽探针(SEQ ID NO：2，4μM)和生物素化的靶蛋白(Aβ42寡聚物，4μN)在Hepes缓冲液(10mM，pH 7.0)中一起温育90分钟。然后，使用经链霉亲合素包被的磁珠来将混合物进行捕捉步骤。用PBS清洗该珠以除去未结合的材料，并通过SDS-PAGE来分析捕捉材料。
[0223] 在用肽22进行的备选测定法(方案B，在图5A中显示)中，于室温将4μN生物素化的Aβ42寡聚物与预清洗的链霉亲合素Dynabead一起温育30分钟。然后，用PBS缓冲液将复合物清洗两次，并在PBS缓冲液中重悬。然后，混合等体积的结合的寡聚物和4μM经标记的肽探针(SEQ ID NO：2)，并于室温温育30分钟。然后，通过三次PBS清洗，接着通过磁体来收集珠复合物来洗去未结合的材料。然后，将复合物在1X LDS缓冲液中重悬，煮沸10分钟，并在10％Bis-Tris凝胶上加载。
[0224] 图5B显示了结果。左侧小图(第1道-第3道)显示了链霉亲合素磁珠下拉合成的生物素化的寡聚物(将第2道和第3道与第1道比较)。第4道显示了类似于100％结合的以4μM的浓度直接加载于凝胶上的肽探针(肽22)。第2道显示了加载至凝胶上的结合反应(方案A)，注意Aβ寡聚物和肽探针共洗脱。第3道和第4道显示了在不添加(第3道)和添加(第4道)生物素化的Aβ42寡聚物的情况中依照方案B制备的结合反应。在没有寡聚物的情况中，肽探针不存在于凝胶上，指示它尚未结合链霉亲合素珠。在存在生物素化的寡聚物的情况中，回收到肽探针。这些结果显示了肽探针直接结合生物素化的Aβ42寡聚物。
[0225] 实施例4
[0226] 如上文所讨论的，在一些实施方案中，肽探针的变体序列设计为提高与未结合靶蛋白的肽有关的任何信号和与结合靶蛋白的肽有关的信号间的信号差异，诸如通过增加与肽的(未结合的)随机/α-螺旋构象有关的任何信号(例如背景信号)和与肽的(结合的)β-片层构象有关的信号间的信号差异来进行。一种评估此参数的方式是在不同浓度的TFE(其是一种诱导肽中的α-螺旋构象的有机溶剂)中温育经标记的肽。出于上文所讨论的原因，在其α-螺旋与β-片层构象间具有显著信号差异的肽可以是特别有用的。
[0227] 将在每个末端用芘标记的肽探针22(SEQ ID NO：2，2μM)在tris缓冲液(10mM Tris，pH 7.0)中的0至80％TFE中温育30分钟。通过TECAN荧光计来测量反应，并记录受激子：单体荧光比率。如图6A中所显示的，缓冲液中的肽22的最大信号响应(80至20％TFE的信号获得)是约100比率单位，其比参照肽(SEQ ID NO：1)的最大信号响应大4倍。在存在原纤维淀粉样靶蛋白的情况中测试经历构象变化的能力时，肽22比参照肽(SEQ ID NO：1)大2.6倍地运行。也就是说，肽22在存在原纤维淀粉样靶蛋白的情况中展现出比参照肽的最大信号获得大约2.6倍的最大信号获得。
[0228] 实施例5
[0229] (i)对肽探针构象的结构分析
[0230] 如实施例2中所讨论的，将组氨酸和谷氨酸残基替代引入肽22、38和45(SEQ ID NO：2-4)中，从而容许形成那些残基间的盐桥。可以在不同pH和盐条件下对此类肽实施CD分析以测定肽在给定条件下的构象。
[0231] 在此实施例中使用在每个末端用芘模块标记的肽38(SEQ ID NO：3)。如图7中所显示的，在pH 7(实线)，肽是高度α螺旋的(38％)，而且α螺旋构象的比例在pH 4(小虚线)甚至更高(52％)。在这两种pH水平，500mM NaCl的添加有利于β-片层构象而大大减少α螺旋构象。如此，在pH 7，在存在500mM NaCl(大虚线)的情况中，α螺旋含量是4％，而β-片层含量是40％(在没有盐的情况中自10％上升)。在pH 4，在存在500mM NaCl(虚线/点线)的情况中，α螺旋含量是6％，而β-片层含量是52％(在没有盐的情况中自4％上升)。这些结果指示盐桥使α螺旋构象(其构象在低pH和低盐时是有利的)稳定化。在较大的盐浓度，盐桥受到破坏，并且不再使α螺旋构象稳定化。
[0232] (ii)对结合靶蛋白的肽探针的结构分析
[0233] 可以通过CD分析来评估结合靶蛋白的肽探针的构象。图8显示了各自分开及组合的经二芘标记的肽38(SEQ ID NO：3)和Aβ42寡聚物(靶蛋白)的构象。单独的肽是高度α螺旋的(36％)。将肽38与靶蛋白混合后，肽经历导致增加的β-片层构象和减少的α螺旋构象的构象转变。也就是说，肽38的二级结构得到改变，使得α螺旋的比例二等分(18％)，而β-片层结构的比例从20％提高至31％。如此，肽38在与Aβ42寡聚物靶蛋白接触后采用β-片层构象，并且可以通过CD分析来检测构象变化。
[0234] (iii)对结合靶蛋白的肽探针的受激子分析
[0235] 也可以通过对单独的和与靶蛋白组合的肽测量芘荧光来检测结合靶蛋白的肽探针的构象。图9B显示了游离的经二芘标记的肽45(SEQ ID NO：4)的芘荧光。与β-片层构象有关的受激子荧光与α-螺旋构象有关的单体荧光相比具有不同的波长，并且受激子∶单体荧光比率是9∶1。图9A显示了在存在不同量的Aβ42寡聚物靶蛋白(0，0.03，0.1和0.3μM)的情况中经二芘标记的肽45的芘荧光。Aβ42寡聚物靶蛋白的添加导致在最高Aβ42寡聚物浓度(0.3μM)时受激子∶单体荧光比率向20∶1的剂量依赖性转变。
受激子∶单体荧光比率的此变化反映肽的相应构象变化，其导致增加的β-片层构象，和减少的α螺旋构象。如此，肽45在与Aβ42寡聚物靶蛋白接触后以剂量依赖性方式采用β-片层构象，并且可以通过测量芘荧光来检测构象变化。
受激子∶单体荧光比率的此变化反映肽的相应构象变化，其导致增加的β-片层构象，和减少的α螺旋构象。如此，肽45在与Aβ42寡聚物靶蛋白接触后以剂量依赖性方式采用β-片层构象，并且可以通过测量芘荧光来检测构象变化。
[0236] 实施例6
[0237] 图10示意性显示了本文中所描述的方法和探针的数个不同实施方案。
[0238] (i)Aβ纤维测定法(顶部小图)
[0239] 可以在有机溶剂，诸如40％TFE中进行Aβ纤维测定法。如图10的顶部小图中所显示的，在没有Aβ纤维的情况中在40％TFE中温育的在每个末端用芘标记的肽探针(例如SEQ ID NO：1)展现出主要为α螺旋的构象，如可以通过CD分光术所观察到的(数据未显示)。此构象与芘模块的单体或自身荧光(370-410nm；见图6)有关。在引入Aβ纤维底物后，探针采用β-片层构象。此构象与芘模块的受激子荧光(430-530nm；见图6)有关。
[0240] (ii)Aβ寡聚物测定法(底部小图)
[0241] 可以在水性溶剂，诸如水中进行Aβ寡聚物测定法。如图10的底部小图A中所显示的，在没有Aβ寡聚物的情况中在每个末端用芘标记的肽探针22(例如SEQ ID NO：2)展现出与芘模块的受激子荧光有关的构象(见图11)，并且因此认为具有增加的β-片层结构。在引入Aβ寡聚物后，荧光谱转变成主要为自身荧光(单体的)(见图11)，其与减少的β-片层结构，或增加的α螺旋结构有关。
[0242] 或者，如图10的底部小图B中所显示的，可以在每个末端用FRET对(例如FAM和EDANS)的成员来标记肽探针。依照例示的实施方案，FRET标记物在没有Aβ寡聚物的情况中不相互作用，而在引入Aβ寡聚物后，荧光谱转变成FRET-荧光，其与增加的β-片层结构有关。肽探针AD293(SEQ ID NO：52)、AD292(SE ID NO：53)、AD 291(SEQ ID NO：54)和AD 290(SEQ ID NO：55)已经展现出与此类构象变化一致的荧光行为。
[0243] 涉及图10，底部小图的观察结果提示，至少对于这些肽，在肽探针的氨基酸序列外，标记物的性质可以影响肽探针的折叠特性和/或构象。如此，芘标记物可以促成β-片层结构的形成，所述β-片层结构导致没有Aβ寡聚物情况中的受激子荧光。另一方面，FRET对不表现为如在没有底物的情况中一样强地相互作用。
[0244] 实施例7
[0245] 如上文所讨论的，肽22(SEQ ID NO：2)在与Aβ寡聚物相互作用后经历构象变化。图11显示了在每个末端用芘标记且于室温在10mM Hepes(pH 7.0)中在水性条件下温育数小时的肽22的荧光谱。肽22的荧光在没有寡聚物的情况中随时间是稳定的(没有单体或受激子荧光的升高)，但是在与可溶性Aβ寡聚物一起温育时展现出芘单体信号的升高。
(实线＝时间0；虚线＝3小时；点线＝18小时)。具体地，并如图11(右侧小图)中所显示的，肽22展现出从芘受激子(于约460和485nm的发射最大值)向芘单体(于约380和
400nm的发射最大值)的时间依赖性构象转变。
(实线＝时间0；虚线＝3小时；点线＝18小时)。具体地，并如图11(右侧小图)中所显示的，肽22展现出从芘受激子(于约460和485nm的发射最大值)向芘单体(于约380和
400nm的发射最大值)的时间依赖性构象转变。
[0246] 实施例8
[0247] 此实施例例示肽22对Aβ寡聚物的特异性。
[0248] 于室温将肽22(100nM)在水中与等摩尔浓度(0、30、100、和300nN)的数种潜在的Aβ底物：Aβ42寡聚物(1型)；Aβ42寡聚物(2型)；Aβ1-42单体；Aβ1-40单体；Aβ1-42纤维；Aβ1-40纤维；牛血清清蛋白(对照底物)；和碳酸酐酶(对照底物)一起温育15小时。
[0249] 如图12中所显示的，肽22在两种Aβ寡聚物底物方面展现出剂量依赖性荧光响应，其特征在于芘单体(自身)荧光随寡聚物加载升高而升高。Aβ42单体和Aβ40纤维在较高的底物加载时诱导轻微的荧光响应。这些数据表明在水性条件下，肽22荧光响应是靶物特异性且剂量响应性的。
[0250] 实施例9
[0251] 此实施例进一步研究了肽22的反应性。
[0252] 参考图13A，于25℃将肽22(70nM)与0、30、100、或300nN合成的Aβ42寡聚物一起温育，并在温育3小时后记录荧光发射谱。如图13(顶部小图)中所显示的，在没有Aβ42寡聚物的情况中，肽22展现出非常少的芘单体(自身)荧光(370-420nm)。然而，芘单体(自身)荧光以剂量依赖性方式随Aβ42寡聚物浓度而升高。例如，并如图13中所显示的，肽22在与300nNAβ42寡聚物一起温育时比与30Aβ42寡聚物一起温育时显示更大的芘单体荧光。(实线：无Aβ42寡聚物；虚线/点线：30nN Aβ42寡聚物；大虚线：100nN Aβ42寡聚物；小虚线：300nNAβ42寡聚物)。
[0253] 使用圆二色性(CD)分析来测定肽22、合成的Aβ42寡聚物、及其混合物的二级结构。于室温将样品在10mM磷酸钠(pH 7.0)中温育3小时，之后测量CD。对于每份样品，自190-260nm评估相对椭圆率。图13(顶部小图)显示了4μM肽22(实线)；33nM合成的Aβ42寡聚物(虚线/点线)；两种个别样品的算术和(大虚线)；肽22和合成的Aβ42寡聚物的混合物(小虚线)的CD谱。每个数据集表示三次分开的谱扫描的平均值。
[0254] 数据显示单独的肽22具有主要为β片层的二级结构(36％)，而合成的Aβ42寡聚物基本上是未结构化的(即椭圆率是0)。在将两种种类一起温育时，肽22的结构保持主要为β片层(43％)，具有与两种个别组分的和非常相似的谱。数据提示在肽22与Aβ42寡聚物相互作用后发生的构象变化，所述Aβ42寡聚物改变通过CD检测不到的肽22的荧光谱，并且因此没有显著改变肽或肽-寡聚物复合物的总体β-片层含量。
[0255] 实施例10
[0256] 下文表1中列出了依照上文所描述的原则设计的例示性肽探针。如通过序列中的阴影所显示的，大多数肽序列基于Aβ肽(WT；SEQ ID NO：1)的氨基酸16-35，其是Aβ肽的β-片层形成区(其它序列基于Aβ肽的更长的部分)，具有添加的C端赖氨酸残基以便于标记。在该表中标示序列变体的种类(或多种种类)(例如进行修饰以改善稳定性，提供盐桥，增加溶解度，促成α-螺旋形成，使β-片层结构脱稳定化，添加Aβ结合基序等)。还显示了肽探针标记的选项，包括不同标记物位点和标记物对。除非另有指明，用两个芘标记物来标记所有肽，一个在N端胺上，而另一个在C端赖氨酸残基的侧链上。另外，除非另有指明，所有构建体含有替换羧基基团的C端酰胺。
[0257] 在该表中使用以下缩写：
[0258] “PBA”＝芘丁酸
[0259] “r”＝d-精氨酸
[0260] “Dabcyl”＝4-(4-二甲基氨基苯基)二氮烯基苯甲酸
[0261] “EDANS”＝5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸
[0262] “FAM”＝5(6)羧基荧光素
[0263] “丹酰”＝5-二甲基氨基萘-1-磺酰
[0264] 表1：肽探针
[0265]
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272] 预期基于天然存在的突变体的肽具有增强的形成聚集体种类的能力。
[0273] 已经显示了肽探针肽22(SEQ ID NO：2)、肽22变异1(SEQ ID NO：14)、肽22变异2(SEQ ID NO：15)、肽38(SEQ ID NO：3)和肽45(SEQ ID NO：4)在水性测定法中与Aβ42寡聚物起反应。令人惊讶地，此反应性的特征在于自主要为芘受激子荧光转化成芘自身荧光。
数据提示这些肽探针在水性条件下与Aβ42寡聚物相互作用后经历自β-片层构象至减少的β-片层或增加的α螺旋构象(或其它构象)的构象转变。
数据提示这些肽探针在水性条件下与Aβ42寡聚物相互作用后经历自β-片层构象至减少的β-片层或增加的α螺旋构象(或其它构象)的构象转变。
[0274] 为了追踪P22设计，创建具有不太稳定的β-片层结构的P22变体，在与Aβ42寡聚物相互作用后观察到的构象转化会比P22序列情况中观察到的构想转化在热力学上有利。已经合成了这些肽，并在上文表1中列出。
[0275] 如表1中所指明的，构建具有FRET对或具有Dabcyl猝灭剂模块的肽，所述Dabcyl猝灭剂模块猝灭配对的荧光模块(例如EDANS)的荧光信号传导。具有备选的标记物对的这些肽可以容许水性测定法中的更大的灵敏度。
[0276] 如上文表1中所例示的，用荧光标记物/猝灭剂对标记在与Aβ42寡聚物相互作用后经历自β-片层构象向减少的β-片层或增加的α螺旋构象(或其它构象)的构象转变的肽探针(诸如肽22)时，最初猝灭荧光标记物信号，然后在肽探针在与Aβ42寡聚物相互作用后经历构象转变时不被猝灭，导致信号信号的诱导。
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