靶向和/或结合EGFL7的多肽以及抑制血管生成的方法
阅读：1021发布：2021-01-10
专利汇可以提供靶向和/或结合EGFL7的多肽以及抑制血管生成的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及以EGFL7或其受体为靶向和/或与EGFL7或其受体结合从而降低EGFL7促血管生成活性的多肽。因此，多肽在一个方面可有效 治疗 涉及病理性血管生成的 疾病 、紊乱或病症，例如癌症。，下面是靶向和/或结合EGFL7的多肽以及抑制血管生成的方法专利的具体信息内容。
1.一种与EGFL7结构域相互作用的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与EGFL7 C端结构域相互作用，或多肽在EGFL7的Notch结合域外与EGFL7相互作用。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽与序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)或其中的生物活性变体的一致性至少约为50％。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的多肽，其中所述多肽与序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)或其中的生物活性变体的一致性至少约为75％。
5.根据权利要求4，所述多肽与序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)或其中的生物活性变体的一致性至少约为85％。
6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述多肽与序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)或其中的生物活性变体至少有90％一致性。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述多肽与序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)或其中的生物活性变体至少有95％。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述多肽与序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)或其中的生物活性变体至少有99％一致性。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的多肽，包含一种保守氨基酸置换。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的多肽，其中所述多肽中含有序列
HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)、KLQLVLAPLHSLAS(SEQ ID NO:14)，或RSPGLAPARPRYA(SEQ ID NO:15)。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的多肽，其中所述多肽中含有约8个氨基酸残基-约250个氨基酸残基。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽中含有约8个氨基酸残基-约250个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约200个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约100个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约50个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约30个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约20个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约16个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约12个氨基酸残基，或约12个氨基酸残基-约16个氨基酸残基。
13.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽中由序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)、KLQLVLAPLHSLAS(SEQ ID NO:14)，或RSPGLAPARPRYA(SEQ ID NO:15)构成。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的多肽，其中多肽是HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)或GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)。
15.根据权利要求1-14中任意一项所述的多肽，其中所述多肽与EGFL7结合。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽以纳摩尔级亲和力结合EGFL7。
17.根据权利要求15或16所述的多肽，其中所述多肽特异性结合EGFL7。
18.根据权利要求1-17中任意一项所述的多肽，其中所述多肽结合EGFL7的二聚化结构域。
19.根据权利要求1-18中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节EGFL7受体结合。
20.根据权利要求1-19中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节EGFL7活性。
21.根据权利要求1-20中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节小管发生。
22.根据权利要求1-21中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节细胞迁移。
23.根据权利要求1-22中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节细胞黏附。
24.根据权利要求1-23中任意一项所述的多肽，其中所述多肽可调节血管生成。
25.根据权利要求1-24中任意一项所述的多肽，其中所述多肽中含有一种可检测标记。
26.根据权利要求25所述的多肽，其中采用核医学技术可检测出所述标记。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述标记为钆元素。
28.根据权利要求1-27中任意一项所述的多肽，其中所述多肽与一种药剂偶联，可使该药剂靶向递送到受试者体内有表达的EGFL7的部位。
29.根据权利要求28所述的多肽，其中所述药剂为一种抗VEGF抗体。
30.根据权利要求28或29所述的多肽，其中所述药剂可通过纳米颗粒与所述多肽偶联。
31.一种多肽与序列HMYFLLGH或其中的生物活性变体至少有90％一致性。
32.根据权利要求31所述的多肽，其中所述多肽与序列HMYFLLGH或其中的生物活性变体至少有95％一致性。
33.根据权利要求32所述的多肽，其中所述多肽与序列HMYFLLGH或其中的生物活性变体至少有99％一致性。
34.根据权利要求31-33中任意一项所述的多肽，其中所述多肽包含一种保守氨基酸置换。
35.根据权利要求31所述的多肽，其中所述多肽中含有序列HMYFLLGH。
36.根据权利要求31-35中任意一项所述的多肽，其中所述多肽中含有约8个氨基酸残基-约300个氨基酸残基。
37.根据权利要求34所述的多肽，其中所述多肽中含有约8个氨基酸残基-约200个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约100个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约50个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约30个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约20个氨基酸残基，或约8个氨基酸残基-约12个氨基酸残基。
38.根据权利要求31所述的多肽，其中所述多肽由序列HMYFLLGH构成。
39.根据权利要求31-38中任意一项所述的多肽，其中所述多肽结合EGFL7。
40.根据权利要求39所述的多肽，其中所述多肽以纳摩尔级亲和力结合EGFL7。
41.根据权利要求39或40所述的多肽，其中所述多肽特异性结合EGFL7。
42.根据权利要求31-41中任意一项所述的多肽，其中所述多肽结合EGFL7的二聚化结构域。
43.根据权利要求31-42中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节EGFL7受体结合。
44.根据权利要求31-43中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节EGFL7活性。
45.根据权利要求31-44中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节小管发生。
46.根据权利要求31-45中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节细胞迁移。
47.根据权利要求31-46中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节细胞黏附。
48.根据权利要求31-47中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节血管生成。
49.根据权利要求31-4548中任意一项所述的多肽，其中所述多肽中含有一种可检测标记。
50.根据权利要求49所述的多肽，其中采用核医学技术可检测出所述标记。
51.根据权利要求50所述的多肽，其中所述标记为钆元素。
52.根据权利要求31-51中任意一项所述的多肽，其中所述多肽与一种药剂偶联，可使该药剂靶向递送到受试者体内有表达的EGFL7的部位。
53.根据权利要求52所述的多肽，其中所述药剂为一种抗VEGF抗体。
54.根据权利要求52或53所述的多肽，其中所述药剂可通过纳米颗粒与所述多肽偶联。
55.一种多肽与序列GSLLVHSFQQLG或其中的生物活性变体至少有90％一致性，其中所述多肽中含有约12个氨基酸残基-约250个氨基酸残基。
56.根据权利要求55所述的多肽，其中所述多肽与序列GSLLVHSFQQLG或其中的生物活性变体至少有95％一致性。
57.根据权利要求56所述的多肽，其中所述多肽与序列GSLLVHSFQQLG或其中的生物活性变体至少有99％一致性。
58.根据权利要求55-51中任意一项所述的多肽，其中所述包含一种保守氨基酸置换。
59.根据权利要求55所述的多肽，其中所述多肽中含有序列GSLLVHSFQQLG。
60.根据权利要求55-59中任意一项所述的多肽，其中所述多肽中含有约12个氨基酸残基-约200个氨基酸残基、约12个氨基酸残基-约100个氨基酸残基、约12个氨基酸残基-约50个氨基酸残基、约12个氨基酸残基-约30个氨基酸残基、约12个氨基酸残基-约20个氨基酸残基，或约12个氨基酸残基-约16个氨基酸残基。
61.根据权利要求55所述的多肽，其中所述多肽由列GSLLVHSFQQLG构成。
62.根据权利要求55-61中任意一项所述的多肽，其中所述多肽结合EGFL7。
63.根据权利要求55-62中任意一项所述的多肽，其中所述多肽结合EGFL7的二聚化结构域。
64.根据权利要求62或63所述的多肽，其中所述多肽以纳摩尔级亲和力结合EGFL7。
65.根据权利要求62-64中任意一项所述的多肽，其中所述多肽特异性结合EGFL7。
66.根据权利要求55-65中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节EGFL7受体结合。
67.根据权利要求55-66中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节EGFL7活性。
68.根据权利要求55-67中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节小管发生。
69.根据权利要求55-68中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节细胞迁移。
70.根据权利要求55-69中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节细胞黏附。
71.根据权利要求55-70中任意一项所述的多肽，其中所述多肽调节血管生成。
72.根据权利要求55-71中任意一项所述的多肽，其中所述多肽中含有一种可检测标记。
73.根据权利要求72所述的多肽，其中采用核医学技术可检测出所述标记。
74.根据权利要求73所述的多肽，其中所述标记为钆元素。
75.根据权利要求55-74任意一项所述的多肽，其中所述多肽与一种药剂偶联，可使该药剂靶向递送到受试者体内有表达的EGFL7的部位。
76.根据权利要求75所述的多肽，其中所述药剂为一种抗VEGF抗体。
77.根据权利要求75或76所述的多肽，其中所述药剂可通过纳米颗粒与所述多肽偶联。
78.一种从由DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)、KLQLVLAPLHSLAS(SEQ ID NO:14)、RSPGLAPARPRYA(SEQ ID NO:15)及其生物活性变体构成的群体中选择的多肽。
79.一种权利要求1-78中任意一项所述多肽的核酸编码。
80.一种包含权利要求79所述核酸的载体。
81.一种包含权利要求80所述载体的细胞。
82.一种成分包含权利要求1-78中任意一项所述多肽，权利要求79所述核酸，或权利要求81所述细胞，以及药学上可接受的载体和/或一种抗血管生成剂，例如一种抗VEGF抗体。
83.一种药物包含权利要求1-78中任意一项所述多肽，权利要求79所述核酸，或权利要求81所述细胞，以及药学上可接受的载体和/或一种抗血管生成剂，例如一种抗VEGF抗体。
84.一种治疗病理性血管生成的方法，所述方法包含给予需要治疗的受试者权利要求
1-78中任意一项所述的多肽。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述病理性血管生成为一种从由癌症、关节炎、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病构成的群体中选择的疾病或病症。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述病理性血管生成为癌症。
87.权利要求1-78中任意一项所述的多肽治疗病理性血管生成的用法。
88.根据权利要求87所述的用法，其中所述病理性血管生成为一种从由癌症、关节炎、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病构成的群体中选择的疾病或病症。
89.根据权利要求88所述的用法，其中所述病理性血管生成为癌症。
90.一种病理性血管生成受试者的筛查方法，该方法包含给予受试者权利要求25-27，
49-51和72-74中任意一项所述的包含可检测标记的多肽，并且为检测所述标记的受试者成像，其中检测所述标记提示所述受试者存在病理性血管生成。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述标记的检测为对所述受试者进行病理性血管生成的诊断。
92.根据权利要求90或91，其中所述病理性血管生成是一种从由癌症、关节炎、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病构成的群体中选择的疾病或病症。
93.根据权利要求92，其中所述病理性血管生成为癌症。
94.权利要求25-27，49-51和72-74中任意一项所述的包含可检测标记的多肽，在受试者病理性血管生筛查中的用法，其中所述标记的检测提示所述受试者存在病理性血管生成。
95.根据权利要求94所述的用法，其中所述标记的检测是对所述受试者的病理性血管生成进行诊断。
96.根据权利要求95所述的用法，其中所述病理性血管生成为一种从由癌症、关节炎、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病构成的群体中选择的疾病或病症。
97.根据权利要求96所述的用法，其中所述病理性血管生成为癌症。
98.一种预测癌症预后的方法，该方法包含给予一名癌症受试者文中据权利要求1-78中任意一项所述的多肽并测定该受试者体内是否存在此多肽，其中该受试者体内存在此多肽，预后则不佳，如果该受试者体内不存在此多肽，预后佳。
99.根据权利要求1-78中任意一项所述的多肽用法预测癌症预后，其中该受试者体内存在此多肽，预后则不佳，如果该受试者体内不存在此多肽，预后佳。
100.一种在存在病理性血管生成的患者中靶向递送药物的方法，该方法包含给予受试者与权利要求28-30，52-54和75-77中任意一项所述的药剂结合的多肽。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述病理性血管生成为一种从由癌症、关节炎、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病构成的群体中选择的疾病或病症。
102.根据权利要求101所述的用法，其中所述病理性血管生成为癌症。
103.根据权利要求28-30，52-54和75-77中任意一项所述与药剂结合的多肽的用法，这种用法为存在病理性血管生成的患者靶向递送药物。
104.根据权利要求103所述的用法，其中所述病理性血管生成为一种从由癌症、关节炎、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病构成的群体中选择的疾病或病症。
105.根据权利要求104所述的用法，其中所述病理性血管生成为癌症。
靶向和/或结合EGFL7的多肽以及抑制血管生成的方法
发明领域
[0001] 本发明涉及血管生成。更具体地，本发明涉及EGF样结构域7(EGFL-7)相互作用多肽，以及采用此类多肽抑制血管生成的方法与涉及病理性血管生成的治疗、诊断和成像的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 血供形成为许多生理过程和病理过程的基本要求，尤其是在生长旺盛的组织中，例如胚胎和肿瘤。通过生成促血管生成因子，此类组织可满足充分血供的需求，促血管生成因子可通过复杂但有序事件(称为血管生成)促进新血管形成。如果肿瘤生长，则认为血管生成对从增生向瘤形成转变至关重要，并且对向肿瘤生长和转移提供营养至关重要。因而，血管生成可使肿瘤生长直径约达1mm以上，另外，还可成为转移性肿瘤细胞播散和随后再植的途径。
[0004] 因此，血管生正在成为癌症的一种重要生物标志物和治疗性靶标。虽然大多数现行无创性血管成像方法可以估计血管密度，但是，近期对前列腺癌肿瘤血管系统实施的一项综合分析得出的结论是调整临床因素以后微血管密度与癌症别死亡率不相关。然而，血管的形状和尺寸，具有高度预测性，血管形状最不规则的患者出现致命性疾病的可能性升至17.1倍(Mucci等，2009，J Clin Oncol，27：5627-33)。
[0005] 血管形成过程受到严格调控。迄今为止，已证实有显著数量的分子(主要是周围细胞产生的分泌因子)可调节内皮细胞分化、增殖、迁移并接合成索状结构。举例说明，已确定血管内皮生长因子(VEGF)为参与刺激血管生成和参与诱导血管通透性的一种关键因子。抗VEGF单抗或VEGF作用的其他抑制剂都是治疗肿瘤和各种眼内新生血管疾患的有前景候选物质。举例说明，此类抗体在EP817,648、WO 1998/45331和WO 1998/45332中已做介绍。
[0006] 另外，已证明一种细胞外基质(ECM)相关表皮生长因子样结构域蛋白7(EGFL7)可通过内皮细胞进行表达，并且在血管生成中有一定作用(Parker等，2004，Nature，428：754-758；Nichol和Stuhlmann，2012，119：1345-1352)。
[0007] 虽然有人建议用抑制性抗EGFL7单抗治疗肿瘤(美国2007/0031437、美国2009/0297512、美国2010/0203041和美国2010/0285009)，但还有人建议用EGFL7激动剂加强EGFL7治疗肿瘤的活性(美国专利号：7,947,278)。
[0008] 仍需能有助于估计血管形状和尺寸并且能为将EGFL7作为靶标确定不同途径的可供选择的成像方法。
发明内容
[0009] 本发明涉及靶向和/或结合EGFL7或其受体从而降低EGFL7促血管生成活性的多肽等等。这样，此多肽在一个方面可用于治疗涉及病理性血管生成的疾病、紊乱或病症，例如，举例说明，癌症。
[0010] EGFL7在血管生成旺盛的内皮中特异性表达。因此，发现与EGFL7结合或相互作用的多肽在一个方面也可作为病理性血管生成受试者的成像方法使用。在另一方面，此类多肽也可用做靶向抗血管生成疗法的靶向部分。文中所述多肽直接或间接地与药剂结合，此多肽能有助于将药剂递送到血管 生成旺盛的区域，从而可使药剂将期望区域作为靶标。
[0011] 肿瘤内存在EGFL7也可预测预后，相应地，文中所述多肽在另一方面也可作为预测癌症受试者预后的方法。另外，发现文中所述多肽还可作为筛查和/或诊断癌症或涉及病理性血管生成的其他疾病、紊乱或病症的方法。
[0012] 根据本发明的在一个方面，提供一种与EGFL7结构域相互作用的多肽。
[0013] 在一个方面，此多肽与EGFL7的C端结构域相互作用，或多肽在EGFL7的Notch结合域外与EGFL7相互作用。
[0014] 在一个方面，所述多肽与序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)或其中的生物活性变体的一致性至少约为50％、75％、85％、90％、95％、99％或100％。
[0015] 在一个方面，此多肽包含一种保守氨基酸置换。
[0016] 在一个方面，此多肽包含序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)、KLQLVLAPLHSLAS(SEQ ID NO:14) 或 RSPGLAPARPRYA(SEQ ID NO:15)。
[0017] 在一个方面，此多肽中含有约8个氨基酸残基-约300个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约250个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约200个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约100个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约50个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约30个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约20个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约16个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约12个氨基酸残基或者约12个氨基酸残基-约16个氨基酸残基。
[0018] 在一个方面，此多肽是由序列HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)、KLQLVLAPLHSLAS(SEQ ID NO:14) 或 RSPGLAPARPRYA(SEQ ID NO:15)构成的。
[0019] 在一个方面，此多肽为HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)或GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)。
[0020] 在一个方面，此多肽结合EGFL7。在一个方面，此多肽以纳摩尔级亲和力结合EGFL7。在一个方面，此多肽特异性结合EGFL7。在一个方面，此多肽结合EGFL7的二聚化结构域。在一个方面，此多肽调节EGFL7受体结合。在一个方面，此多肽调节EGFL7活性。在一个方面，此多肽调节小管发生。在一个方面，此多肽调节细胞迁移。在一个方面，此多肽调节细胞黏附。在一个方面，此多肽调节血管生成。
[0021] 在一个方面，此多肽中含有一种可检测标记。在一个方面，采用核医学技术可检测出该标记。在一个方面，该标记为钆元素。
[0022] 在一个方面，此多肽与药剂偶联后可使该药剂靶向递送到受试者体内有已表达的EGFL7的部位。在一个方面，该药剂为一种抗VEGF抗体。在一个方面，该药剂可通过纳米颗粒与所述多肽偶联。
[0023] 根据本发明的另一方面，提供一种与序列HMYFLLGH至少有90％一致性的多肽或者此多肽的一种生物活性变体。
[0024] 在一个方面，此多肽中含有与序列HMYFLLGH至少有95％、99％或100％一致性的序列或此多肽的生 物活性变体。
[0025] 在一个方面，此多肽中含有一种保守氨基酸置换。
[0026] 在一个方面，此多肽中含有序列HMYFLLGH。
[0027] 在一个方面，此多肽中含有约8个氨基酸残基-约300个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约200个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约100个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约50个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约30个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约20个氨基酸残基或者约8个氨基酸残基-约12个氨基酸残基。
[0028] 在一个方面，此多肽由序列HMYFLLGH构成。
[0029] 在一个方面，此多肽结合EGFL7。在一个方面，此多肽以纳摩尔级亲和力结合EGFL7。在一个方面，此多肽可特异性结合EGFL7。在一个方面，此多肽结合EGFL7的二聚化结构域。在一个方面，此多肽调节EGFL7受体结合。在一个方面，此多肽调节EGFL7活性。在一个方面，此多肽调节小管发生。在一个方面，此多肽调节细胞迁移。在一个方面，此多肽可调节细胞黏附。在一个方面，此多肽调节血管生成。
[0030] 在一个方面，此多肽中含有一种可检测标记。在一个方面，采用核医学技术可检测出该标记。在一个方面，该标记为钆元素。
[0031] 在一个方面，此多肽与药剂偶联后可使该药剂靶向递送到受试者体内有已表达的EGFL7的部位。在一个方面，该药剂为一种抗VEGF抗体。在一个方面，该药剂可通过纳米颗粒与所述多肽偶联。
[0032] 根据本发明的另一方面，提供一种包含与序列GSLLVHSFQQLG至少有90％一致性的多肽或者此多肽的一种生物活性变体，其中的所述多肽中含有约12个氨基酸残基-约250个氨基酸残基。
[0033] 在一个方面，此多肽中含有与序列GSLLVHSFQQLG至少有95％、99％或100％一致性的序列或此多肽的一种生物活性变体。
[0034] 在一个方面，此多肽中含有一种保守氨基酸置换。
[0035] 在一个方面，此多肽中含有序列GSLLVHSFQQLG。
[0036] 在一个方面，此多肽中含有约12个氨基酸残基-约200个氨基酸残基、约12个氨基酸残基-约100个氨基酸残基、约12个氨基酸残基-约50个氨基酸残基、约12个氨基酸残基-约30个氨基酸残基、约12个氨基酸残基-约20个氨基酸残基或者约12个氨基酸残基-约16个氨基酸残基。
[0037] 在一个方面，此多肽由序列GSLLVHSFQQLG构成。
[0038] 在一个方面，此多肽结合EGFL7。在一个方面，此多肽以纳摩尔级亲和力结合EGFL7。在一个方面，此多肽可特异性结合EGFL7。在一个方面，此多肽结合EGFL7的二聚化结构域。
[0039] 在一个方面，此多肽调节EGFL7受体结合。在一个方面，此多肽调节EGFL7活性。在一个方面，此多肽调节小管发生。在一个方面，此多肽可调节细胞迁移。在一个方面，此多肽调节细胞黏附。在一个方面，此多肽调节血管生成。
[0040] 在一个方面，此多肽中含有一种可检测标记。在一个方面，采用核医学技术可检测出该标记。在一个方面，该标记为钆元素。
[0041] 在一个方面，此多肽与药剂偶联后可使该药剂靶向递送到受试者体内有已表达的EGFL7的部位。在一个方面，该药剂为一种抗VEGF抗体。在一个方面，该药剂可通过纳米颗粒与所述多肽偶联。
[0042] 根据本发明的另一个方面，提供一种从由DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)、KLQLVLAPLHSLAS(SEQ ID NO:14)、RSPGLAPARPRYA (SEQ ID NO:15)及其生物活性变体构成的群体中选择的多肽。
[0043] 在一个方面，提供一种编码此多肽的核酸、一种包含该核酸的载体和一种包含该载体的细胞。
[0044] 在另一方面，提供包含此多肽、该核酸或该细胞的一种组成或一种药物，以及一种在药学上可接受的载体和/或一种抗血管生成剂(例如，一种抗VEGF抗体)。
[0045] 在另一方面，提供一种治疗病理性血管生成的方法，所述方法包含给予其中需要治疗的受试者文中所述多肽。
[0046] 在另一方面，提供一种用文中所述多肽处理病理性血管生成。
[0048] 在另一方面，提供用于筛查受试者的病理性血管生成的一种方法，该方法包含给予受试者带文中所述可检测标记的多肽以及对该受试者进行成像以检测所述标记，如果检出所述标记则提示所述受试者存在病理性血管生成。
[0049] 在另一方面，提供一种用带文中所述可检测标记的多肽筛查受试者病理性血管生成，如果检出所述标记则提示所述受试者存在病理性血管生成。
[0050] 一方面，检测出所述标记可诊断出所述受试者存在病理性血管生成。在另一方面，病理性血管生成是从由癌症、关节炎、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病所构成的群体中选择的一种疾病或病症。在一个方面，病理性血管生成为癌症。
[0051] 在另一方面，提供一种预测癌症预后的方法，这种方法包含给予一名癌症受试者文中所述多肽并测定该受试者体内是否存在此多肽，如果该受试者体内存在此多肽，预后则不佳，如果该受试者体内不存在此多肽，预后佳。
[0052] 在另一方面，提供一种在受试者中用文中所述多肽预测癌症预后，如果该受试者体内存在此多肽，预后则不佳，如果该受试者体内不存在此多肽，预后佳。
[0053] 在另一方面，提供一种在存在病理性血管生成的患者中靶向递送药物的方法，这种方法包含给予受试者能与文中所述药剂结合的多肽。
[0054] 在另一方面，提供一种在病理性血管生成患者中用能与文中所述药剂结合的多肽靶向递送药物。
[0055] 在一个方面，病理性血管生成为从由癌症、关节炎、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病所构成的群体中选择的一种疾病或病症。一方面，病理性血管生成为癌症。
[0056] 本发明的其他特征和优点在下文的详细说明中显而易见。然而，应理解的是，该详细说明和这些具体实施例以及同时给出的本发明的实施方式仅作说明使用，因为本领域技术人员根据所述详细说明很容易发现本发明的精神和范围内的各种变更和修改。附图说明
[0057] 根据这些附图的以下相关说明应进一步理解，在本发明中：
[0058] 图1显示的是在OBOC肽文库中筛选与重组EGFL7蛋白具有高亲和力的结合肽的一种高通量策略。(a)多个磁珠结合一个磁珠法(beads on a bead approach)的示意图。
[0059] 纯化重组GST-EGFL7蛋白通过抗GST抗体结合在蛋白A/G包被的磁珠上，并与展示随机8氨基酸肽的TentaGel磁珠库混合，(b)展示高亲和力肽(这种高亲和力肽能使磁珠牢固结合在TentaGel磁 珠表面上)的TentaGel磁珠用磁体进行分离。(c)采用EGFL7阳性HT1080-tdTomato细胞和EGFL7阴性HT1080-GFP细胞实施二级细胞水平筛选的示意图。采用COPAS Biosort仪(Union Biometrica)分离阳性目标磁珠，采用MALDI TOF MS/MS对肽实施珠上测序。
[0060] 图2显示的是根据重组EGFL7蛋白对高亲和力性结合肽实施的纯化和鉴定。(a)银染色凝胶显示重组GST-EGFL7蛋白纯化(左)。(b)采用多克隆抗EGFL7抗体对洗脱组分实施Western印迹分析。(c)Western印迹分析证实纯化EGFL7蛋白缀合在磁珠上。(d)采用二级细胞水平筛选法鉴定与细胞表面上展示的EGFL7有高亲和力的肽。Western印迹分析证实采用多克隆抗EGFL7抗体(右)时EGFL7在MDA435-GFP细胞和HT1080-tdT-EGFL7v5细胞中表达。荧光显微图像显示的是与红色HT1080-tdT细胞(+EGFL7)强相关但与绿色MDA435-GFP细胞(-EGFL7)相互作用极少的样本目标磁珠。
[0061] 图3显示的是序列GSLLVHSFQQLG(LCE71/LCE77)和序列HMYFLLGH(LCE72/LCE78)结合表达EGFL7并被过量未标记肽阻塞的人类内皮细胞(p>0.001)。
[0062] 图4显示的是体外血管生成测定证明存在VEGF和FGF的情况下与对照品(FLAG肽和H2O)相比GSLLVHSFQQLG和HMYFLLGH在基质胶上可抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)芽生和管形成。通过计数HUVECs所形成的分支点数对芽生水平进行定量分析。
[0063] 图5显示的是体内血管生成测定采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型证明GSLLVHSFQQLG和HMYFLLGH可显著抑制血管生成。在纤维网格中培养HT1080细胞以便刺激血管从CAM聚集到网格上。通过计数网格内有可见血管(箭头所指处)的格子的百分比对血管生成水平进行定量分析。
[0064] 图6显示的是采用流式细胞仪评价的HUVECs摄取荧光素标记的E7-p72肽(HMYFLLGH)。(a)Western印迹分析显示采用以外显子5为靶标的siRNA敲低EGFL7。(b)用阴性siRNA(对照)或EGFL7siRNA处理的细胞HUVECs的FITC-E7-p72(FITC-HMYFLLGH)摄取的流式细胞仪分析。(c)显示细胞平均荧光强度的图示。
[0065] 图7显示人类内皮细胞摄取E7-p72肽(HMYFLLGH)有赖于EGFL7表达。(a)显示采用以EGFL7的外显子5为靶标的siRNA敲低EGFL7的Western印迹分析。
[0066] (b)用阴性siRNA(对照)或EGFL7siRNA(n＝10000)处理的HUVECs摄 取FITC-E7-p72(FITC-HMYFLLGH)的流式细胞仪分析。(c)显示(b)流式细胞仪实验测定的细胞平均荧光强度的图示。
[0068] 图9显示采用定向的体内血管生成测定系统 (DIVAA)测定 (A)LCE71(GSLLVHSFQQLG)肽和(B)LCE72/E7-p72(HMYFLLGH)肽抑制小鼠血管生成。条形图的是各组在在血管新生试验管(n＝8)内观察到的血管生成百分比。血管新生试验管中充满了基底膜提取物(BME)。加入HT1080细胞，刺激血管生成。BME(-ve)为一种阴性对照品，其中仅含BME而无细胞。所有统计都是采用单因素ANOVA和tukey事后检验实施的。
[0069] 图10显示LCE71(GSLLVHSFQQLG)未改变人类内皮细胞的黏附特性。(a)细胞黏附测定显示与Flag标签肽或乱序肽相比LCE71(200μm)未改变EA.hy926内皮细胞的细胞黏附特性。采用siRNA敲低EA.hy926细胞中的EGFL7显著降低了细胞黏附性(p<0.01)。细胞核用Hoechst染料染色，用Volocity软件(6.1.2版，Improvision)成像和计数。所有统计都是采用单因素ANOVA和tukey事后检验实施的。(b)对EA.hy926细胞实施黏着斑蛋白染色显示盖玻片上有黏附斑形成。左图：黏着斑蛋白(橙色)和DAPI(蓝色)。右图：黏着斑蛋白(橙色)、WGA浆膜染色(绿色)和DAPI(蓝色)的合并图。标尺条，10μm。
[0070] 图11显示的是在用LCE71(GSLLVHSFQQLG)处理后测定HUVECs中的RTK活化情况。(a)有49种不同抗人类RTK抗体的膜芯片(R&D系统)与经过对照Flag或
LCE71(GSLLVHSFQQLG)肽(200μm)处理的HUVECs得到的溶解产物孵育4个小时。检
测磷酸化RTKs时，将其与一种抗磷酸化HRP抗体进行孵育，随后通过增强化学发光进行处理。(b)磷酸化RTK芯片坐标(左)及其各自的RTKs(右表)。(c)瀑布图显示经过
LCE71(GSLLVHSFQQLG)肽处理后的HUVECs中的RTKs的活化特征。采用Volocity(6.1.2版，PerkinElmer)定量分析了各斑点距离(a)的平均信号强度。将通过经LCE71处理的膜得到的值标准化至通过经Flag处理的膜得到值。
LCE71(GSLLVHSFQQLG)肽(200μm)处理的HUVECs得到的溶解产物孵育4个小时。检
测磷酸化RTKs时，将其与一种抗磷酸化HRP抗体进行孵育，随后通过增强化学发光进行处理。(b)磷酸化RTK芯片坐标(左)及其各自的RTKs(右表)。(c)瀑布图显示经过
LCE71(GSLLVHSFQQLG)肽处理后的HUVECs中的RTKs的活化特征。采用Volocity(6.1.2版，PerkinElmer)定量分析了各斑点距离(a)的平均信号强度。将通过经LCE71处理的膜得到的值标准化至通过经Flag处理的膜得到值。
[0071] 图12显示经过LCE71处理后HUVECs中的Axl和VEGFR 1RTKs磷酸化降低。(a)HUVECs采用Flag(对照)或LCE71肽(200pM)处理4个小时。采用偶联在蛋白A/G琼脂糖上的4G10抗磷酸化抗体实施免疫沉淀。采用抗AxI、抗VEGFRl和抗GAPDH抗体实施Western印迹分析。(b)条形图显示的是(a)中所示的Western印迹得到的各带的平均信号强度。
[0072] 采用Volocity软件(6.1.2版，PerkinElmer)实施定量分析。将通过细胞溶解产物得到的值标准化至GAPDH。
[0073] 图13显示的是合成的[68Ga]DOTA-LCE71/LCE72([68Ga]DOTA-GSLLVHSFQQLG/HMYFLLGH)的放射化学纯。HPLC条件：流动相：乙腈/H2O，梯度10/90-90/10(v/v)，含TFA0.1％，10min，流速：1.5mL/min，Sunfire RP分析柱；色谱：流量计数(黑色)；UV(254nm，红色)。
[0075] 本发明详细说明
[0076] 本发明涉及与EGFL7结合和/或相互作用的多肽。EGFL7为在肿瘤和血管生成旺盛的其他组织内皮中被上调的一种蛋白质。举例说明，EGFL7表达与恶性胶质瘤、肝细胞癌和非小细胞肺癌的预后不佳相关，EGFL7为临床相关肿瘤和转移的生物标志物。
[0077] 在本文中，介绍了可结合EGFL7和/或调节EGFL7活性从而抑制血管生成的新型多肽的鉴定与特征。采用一种新型结合一个磁珠(beads on a bead)法，筛查组合肽文库鉴定多肽，然后检测在体外和体内的抗血管生成活性。多肽还可与荧光素染料缀合，并且发现，通过EGFL7表达细胞特异性摄取和内化可有效反映EGFL7表达。
[0078] 除非另有说明，技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同。参见，例如，Singleton等，第2版《微生物学和分子生物学词典》，约翰威立国际出版公司(纽约市，纽约州。1994)；Sambrook等，《分子克隆——实验室手册》，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约州，1989)，其中各项均以引用方式并入本文中。对于本发明，以下术语定义如下。
[0079] 在本文中，术语“EGFL7”是指EGFL7的天然多肽和EGFL7变体或者突变型多肽的序列。
[0080] “天然序列EGFL7”中含有氨基酸序列与天然性EGFL7(不管采用的是哪种制备方法或物种)的氨基酸序列相同的多肽。因而，天然序列EGFL7可含有自然中存在的人类EGFL7、鼠科动物EGFL7、非洲爪蛙EGFL7、斑马鱼EGFL7或其他任何物种的EGFL7的氨基酸序列。举例说明，SEQ ID NO:1中所述的一种典型的全长天然序列人类EGFL7氨基酸序列。SEQ ID NO:2中公开的一种天然序列小鼠EGFL7氨基酸序列，SEQ ID NO:3中公开的一种天然序列非洲爪蛙EGFL7，SEQ ID NO:4中公开的一种天然序列斑马鱼EGFL7。这些序列显示在图8中。
[0081] 此类天然序列EGFL7可从自然中分离出，也可通过重组和/或人工合成方式制成。术语“天然序 列EGFL7”尤其包含自然出现的原前蛋白型、前蛋白型和成熟型以及截短型EGFL7，自然出现的变体型，以及自然出现的等位基因变异体。
[0082] “EGFL7变体”是在生物学上具有活性的EGFL7多肽，但氨基酸序列不同于天然序列EGFL7多肽序列，例如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4(分别为人类、鼠科动物、非洲爪蛙和斑马鱼EGFL7)中公开的序列，这是通过在天然序列中插入、删除、修饰和/或置换一个或多个氨基酸残基实现的。EGFL7变体的序列与天然序列EGFL7(例如，SEQ ID NO:1的人类EGFL7)的一致性通常低于100％。然而，通常在生物学上具有活性的EGFL7变体有一个氨基酸序列与自然出现的EGFL7氨基酸序列至少约有70％一致性的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1的人类EGFL7，通常至少约有75％一致性，更常见的是至少约有80％一致性，甚至更常见的是至少约有85％一致性，甚至更常见的是至少约有90％一致性，甚至更常见的是至少约有95％到至少约99％氨基酸序列一致性(以1％的增量递增)。EGFL7变体包括由至少3个氨基酸组成的且能保持相应天然序列EGFL7多肽的生物活性的肽段。EGFL7变体还包括在天然EGFL7序列的N-端或C-端或在天然EGFL7序列的内部增加一个或多个氨基酸残基的EGFL7多肽。EGFL7变体还包括许多氨基酸残基被删除并任意由一个或多个氨基酸残基取代的EGFL7多肽。EGFL7变体也可被共价修饰，举例说明，用自然出现的氨基酸以外的其他部分进行置换，或者通过修饰一个氨基酸残基而产生一个非自然出现的氨基酸。EGFL7变体可能包含肝素结合域。
[0083] 本文中的“氨基酸序列一致性百分比”是指候选序列中与感兴趣序列(例如，本发明中的多肽)中的残基相同的氨基酸残基所占百分比，在比对序列和插入空位(如有必要)后，使序列一致性百分比达最大，且不考虑作为序列一致性一部分的任何保守置换。由于会影响序列一致性或同源性，不对候选序列进行N端、C端或内部延长、删除或插入。比对方法和电脑程序在所属领域被熟知，例如“BLAST”。
[0084] 本文中的“有活性的”或“活性”是指天然的或自然产生的EGFL7的生物学和/或免疫学活性，其中的“生物学”活性是指天然的或自然产生的EGFL7所引发的生物学功能(抑制或刺激作用)。
[0085] 因而，“在生物学上具有活性的”或“生物活性”与“EGFL7”或“分离出的EGFL7”连用时是指表现出或具有天然序列EGFL7的作用或功能的EGFL7多肽。EGFL7的其中一个生物活性是能促进血管形成。EGFL7的其他生物活性包括促进内皮细胞迁移和黏附。通常，EGFL7的生物活性是能调节小管发生。
[0086] “在生物学上具有活性的”或“生物活性”与变体EGFL7相互作用多肽连用时是指表现出或具有亲本EGFL7相互作用多肽序列的作用或功能的变体EGFL7相互作用多肽。与亲本EGFI7相互作用多肽相比，变体EGFL7相互作用多肽序列的生物活性可能会升高，也可能会降低。
[0087] “抑制”或“抑制的”这些术语是指EGFL7的功能或活性降低、受限、阻塞或中和。这些术语包括全部或部分抑制EGFL7功能或活性，其中包括EGFL7与其受体结合。
[0088] “EGFL7受体”是指结合EGFL7的分子以及调解EGFL7的生物特性的分子。
[0089] “分离出的”是指从其来源纯化得到的分子或者是通过重组或合成方法制成后纯化得到的分子。纯化多肽实质上不含其他多肽或肽。
[0090] 文中的“实质上不含”是指低于约5％，通常低于约2％，甚至更常见的是低于约1％，甚至更常见的是低于约0.5％，最常见的是低于约0.1％(混有其他来源蛋白时)。“基本上纯的”蛋白是指包含至少约含90％的组合物(按蛋白质的重量计)，根据组合物的总重量，通常至少约含95％(按重量计)，更常见的是至少约含90％(按重量计)，甚至更常见的是至少约含95％(按重量计)，甚至更常见的是至少约含99％(按蛋白质的重量计)，根据组合物的总重量。
[0091] 在本文中，“治疗”或“疗法”为取得有益或理想的临床结果的一种方法。对本发明而言，有益或理想的临床结果包括但不限于缓解症状、减轻疾病程度、稳定(即，不加重)疾病状态、延迟或减慢疾病进展、疾病状态转佳或缓和以及可检测或不可检测的缓解(部分或全部缓解)。“治疗”或“疗法”还意味着与不接受治疗或疗法时的预计生存期相比可使生存期延长。
[0092] 因而，“治疗”或“疗法”是一种以改变紊乱病理为目的干预措施。尤其是，治疗或疗法可能会直接预防、缓解或减轻细胞变性或损害病理(例如，癌症治疗中的肿瘤细胞的病理)，也可能会使细胞对其他治疗剂的治疗或疗法更易感。
[0093] “有效治疗量”、“有效量”或“足量”这些术语是指数量充分，给予受试者时(其中包括哺乳动物，举例说明，人类)可达到预期效果，举例说明，可有效治疗癌症的量。文中所述的多肽的有效量因各种因素(例如，受试者的疾病状态、年龄、性别和体重)有所不同。本领域有经验的人员知道，要使治疗响应达到最佳，可调整用量或治疗方案。
[0094] 而且，采用有效治疗量的受试者的治疗方案可包括单次给药，或者包括系列给药。治疗时间的长度取决于许多因素，例如，疾病的严重程度、受试者的年龄、多肽的浓度、患者对多肽的响应性或者这些因素的组合。另外，还应当理解的是，在特定治疗方案的期间内，治疗所使用的多肽的有效剂量可能会增加或减少。用量可能会改变，采用本领域中的已知标准诊断测定很明显。在几个方面，本发明中的多肽在实施传统抗癌药物治疗、放疗、激素疗法、生物疗法和/或肿瘤手术切除之前、期间或之后给药。
[0095] 本文中的术语“受试者”是指任何动物界中的任何成员，通常为哺乳动物。术语“哺乳动物”是指被归入哺乳动物类别中的任何动物，其中包括人类、其他高级灵长类动物、家畜和农畜，以及动物园动物、竞技动物或宠物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等等。通常，哺乳动物为人类。
[0096] 本文中的“肿瘤”是指所有赘生物细胞生长和增殖(无论是恶性还是良性)和所有癌前和癌性细胞和组织。
[0097] “癌症”和“癌性的”这些术语是指或描述的是通常以细胞生长失控为特征的哺乳动物的生理状况。举例说明，癌症包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体事例包括上皮细胞癌、肺癌(其中包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(其中包括胃肠癌)，胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型头颈癌以及B细胞淋巴瘤(其中包括低度/滤泡型非何杰金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度恶性/滤泡型NHL；中度恶性弥漫性NHL；高度恶性免疫母细胞NHL；高度恶性淋巴母细胞NHL；高度恶性小无核裂细胞NHL；巨块型瘤体NHL；外套细胞淋巴瘤；AIDS相关性淋巴瘤和特发性巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性粒细胞性白血病；和移植后淋巴组织增生性紊乱(PTLD)以及与瘢痣病相关的血管异常、浮肿(例如，与脑肿瘤相关的浮肿)和梅格斯氏综合征。
[0098] “化疗剂”是一种可用于处理癌症的化学化合物。举例说明，这些化疗剂包括烷化TM剂(例如，塞替派、CYTOXAN 环磷酰胺)；烷基磺酸盐类(例如，白消安、英丙舒凡和嗪消安)；氮丙啶类(例如，苯佐替派、卡波醌、美妥替腺和乌瑞替派)；乙基蜜胺类类和甲基蜜胺类，其中包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三乙撑磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；乙酰精宁类(例如，布拉他辛和布拉它辛酮)；喜树碱类(例如，托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀；CC-1065及 其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物；念珠藻素类(例如念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素类(例如，合成类似物KW-2189和合成类似物CB1-TM1)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇类；海綿抑制素；氮芥类(例如，苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥)；亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀)；抗生素(例如，烯二炔类抗生素)，举例说明，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1l和卡奇霉素ωl1，达内霉素，其中包括达内霉素A，二膦酸盐(例如，氯膦酸盐，埃斯培拉霉素，新制癌菌素发色团分子和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团分子)；阿克拉霉素；放射菌素；氨茴霉素；重氮丝氨酸；博来霉素类；放线菌素；卡柔比星；去甲柔红霉素；嗜癌霉素；色霉素类；更生霉素；柔红霉素；地托TM
比星；6-重氮基-5-氧-L-原亮氨酸；ADRIAMYCIN 阿霉素(其中包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉阿霉素和脱氧阿霉素)；表柔比星；依索比星；伊达比星；麻西罗霉素；丝裂霉素类(例如，丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、派来霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链唑霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素和佐柔比星)；抗代谢药(例如，甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU))；叶酸类似物(例如，二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤、曲美沙特)；嘌呤类似物(例如，氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤)；嘧啶类似物(例如，盐酸环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷)；雄激素类(例如，卡普睾酮、丙酸盐屈他雄酮、表硫雄醇、环戊缩环硫雄烷和睾内酯)；抗肾上腺素类(例如，氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦)；叶酸补充剂(例如，亚叶酸)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；胺吖啶；贝拉布昔；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；醋酸羟哔咔唑；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素类化合物(例如，美登素和安丝菌素)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨TM
氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；甲基苄肼；PSK 多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(例如，T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；
甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；阿糖胞苷；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；紫TM TM
杉烷类，例如，TAXOL 紫杉醇、无克列莫佛的ABRAXANE ，紫杉醇的白蛋白工程纳米颗粒配TM TM
方，TAXOTERE 和多西他赛；苯丁酸氮芥；GEMZAR 吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂配合物(例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂)；长春碱；铂制剂；依托泊苷(VP-16)；异环TM
磷酰胺；长春新碱；NAVELBINE 长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；依立替康类药物(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂(例如，RFS
2000)；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇(例如，维甲酸)；卡培他滨；上述任何物质在药学上可接受的盐类、酸类或衍生物。
比星；6-重氮基-5-氧-L-原亮氨酸；ADRIAMYCIN 阿霉素(其中包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉阿霉素和脱氧阿霉素)；表柔比星；依索比星；伊达比星；麻西罗霉素；丝裂霉素类(例如，丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、派来霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链唑霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素和佐柔比星)；抗代谢药(例如，甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU))；叶酸类似物(例如，二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤、曲美沙特)；嘌呤类似物(例如，氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤)；嘧啶类似物(例如，盐酸环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷)；雄激素类(例如，卡普睾酮、丙酸盐屈他雄酮、表硫雄醇、环戊缩环硫雄烷和睾内酯)；抗肾上腺素类(例如，氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦)；叶酸补充剂(例如，亚叶酸)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；胺吖啶；贝拉布昔；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；醋酸羟哔咔唑；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素类化合物(例如，美登素和安丝菌素)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨TM
氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；甲基苄肼；PSK 多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(例如，T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；
甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；阿糖胞苷；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；紫TM TM
杉烷类，例如，TAXOL 紫杉醇、无克列莫佛的ABRAXANE ，紫杉醇的白蛋白工程纳米颗粒配TM TM
方，TAXOTERE 和多西他赛；苯丁酸氮芥；GEMZAR 吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂配合物(例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂)；长春碱；铂制剂；依托泊苷(VP-16)；异环TM
磷酰胺；长春新碱；NAVELBINE 长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；依立替康类药物(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂(例如，RFS
2000)；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇(例如，维甲酸)；卡培他滨；上述任何物质在药学上可接受的盐类、酸类或衍生物。
[0099] 该定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，例如，抗雌激素类和选TM择性雌激素受体调控剂(SERMs)，其中包括，举例说明，他莫昔芬(其中包括NOLVADEX 他莫昔芬)，雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，可莫昔芬，LY117018，奥那司酮，和FARESTON托瑞米芬；可抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，芳香酶可调节肾上腺内的雌激TM TM
素生成，例如，举例说明，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、MEGASE 醋酸甲地孕酮、AROMASIN 依西TM TM TM
美坦、福美坦、法倔唑、RIVISOR 伏氯唑、FEMARA 来曲唑和ARIMIDEX 阿那曲唑；抗雄激素类(例如，氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林)；以及曲沙他滨(一种
1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核 苷酸，特别是能抑制见于畸变细胞增殖中的信号传导通路基因表达的反义寡核苷酸(例如，举例说明，PKC-α、Ralf和H-Ras)；核糖酶TM
类(例如，VEGF表达抑制剂(如，ANGIOZYME 核糖酶)和HER2表达抑制剂)；抗体(例如，TM TM
抗VEGF抗体(例如，AVASTIN 抗体)；疫苗(例如，基因治疗疫苗，举例说明，ALLOVECTINTM TM TM TM
疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗)；PROLEUKIN rIL-2；LURTOTECAN 拓扑异构酶1抑TM
制剂；ABARELIX rmRH以及药学上可接受的盐类、酸类或上述任何一项的任衍生物。
素生成，例如，举例说明，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、MEGASE 醋酸甲地孕酮、AROMASIN 依西TM TM TM
美坦、福美坦、法倔唑、RIVISOR 伏氯唑、FEMARA 来曲唑和ARIMIDEX 阿那曲唑；抗雄激素类(例如，氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林)；以及曲沙他滨(一种
1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核 苷酸，特别是能抑制见于畸变细胞增殖中的信号传导通路基因表达的反义寡核苷酸(例如，举例说明，PKC-α、Ralf和H-Ras)；核糖酶TM
类(例如，VEGF表达抑制剂(如，ANGIOZYME 核糖酶)和HER2表达抑制剂)；抗体(例如，TM TM
抗VEGF抗体(例如，AVASTIN 抗体)；疫苗(例如，基因治疗疫苗，举例说明，ALLOVECTINTM TM TM TM
疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗)；PROLEUKIN rIL-2；LURTOTECAN 拓扑异构酶1抑TM
制剂；ABARELIX rmRH以及药学上可接受的盐类、酸类或上述任何一项的任衍生物。
[0100] “眼内新生血管疾病”是以眼睛新生血管为特征的一种疾病。举例说明，眼内新生血管疾病包括但不限于，增殖期视网膜病变、脉络膜新生血管(CNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性和其他缺血相关性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管和视网膜新生血管。
[0101] “联合”一种或甚至多种治疗剂的给药包括同时(同步)给药以及按照任何顺序连续给药。
[0102] 本文所述的“载体”包括以采用的用量和浓度接触后对细胞和哺乳动物都无毒的且在药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。通常，在药学上可接受的载体为水性pH缓冲溶液。举例说明，在药理学上可接受的载体包括缓冲剂(例如，磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸类)、抗氧化剂(其中包括抗坏血酸)、低分子量(低于约10个残基)多肽、蛋白质(例如，血清白蛋白、动物胶或免疫球蛋白)、亲水聚合物(例如，聚乙烯吡咯酮)、氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、单糖类、二糖类和其他碳水化合物(其中包括葡萄糖、甘露糖和糊精)、螯合剂(例如，EDTA)、糖醇类(例如，甘露醇和山梨TM醇)、成盐抗衡离子(例如，钠离子)和/或非离子型表面活性剂(例如，TWEEN 、聚乙二醇TM
(PEG)、和PLURONICS )。
(PEG)、和PLURONICS )。
[0103] “脂质体”为由各种类型脂质类、磷脂类和/或表面活性剂构成的用于为受试者(例如，一种哺乳动物)递送药物(例如，一种化疗剂)的一种小囊泡。脂质体的组成成分通常以双分子层形式排列，这与生物膜上的脂质排列相似。
[0104] 为理解本专利申请的范围，本文所使用的术语“包含”及其派生词都为开放式术语，用于列举存在的具体指明的特征、要素、组成、群体、整体和/或步骤，但并不排除存在的其他未具体指明的特征、要素、组成、群体、整体和/或步骤。前述内容也适用于具有类似含义的词语，例如“其中包括”、“有”及其派生词等术语。最后，本文中使用的程度术语，例如“实质上”、“约”和“大概”，是指修改后术语有合理程度的偏差，以致于最终结果并未显著改变。这些程度术语应被解释为包括与修改后术语至少有±5％偏差，如果该偏差并不能否定修改的词语的含义。
[0105] 多肽
[0106] 本发明包含与EGFL7相互作用从而可调节EGFL7的功能和/或活性的多肽。EGFL7相互作用多肽通常结合EGFL7并通过调节辅因子与EGFL7结合、通过调节EGFL7多肽的相应折叠、通过调节EGFL7的相应翻译后加工、通过调节EGFL7与其受体结合或通过调节EGFL7二聚化或多聚化起作用。也有可能EGFL7相互作用多肽为EGFL7的结构类似物。
[0107] EGFL7包含几种结构域，其中包括信号序列、羧基端(matrilin基因样)结构域、Notch结合域、二聚化结构域和氨基端结构域。EGFL7相互作用多肽通常结合EGFL7的特异性结构域，例如羰基端结构域或二聚化结构域。EGFL7相互作用多肽可结合Notch结构域。从而可通过调节Notch与EGFL7的结合起作用。然而，EGFL7相互作用多肽通常在Notch结合域外结合，而不影响Notch结合。在一个具 体方面，，EGFL7相互作用多肽起作用可不依赖于Notch结合。
[0108] 举 例 说 明，EGFL7相 互 作 用 多 肽 序 列 包 括 HMYFLLGH(SEQ ID NO:5)、GSLLVHSFQQLG(SEQ ID NO:6)、DPYDHEFR(SEQ ID NO:7)、AYYEEAYE(SEQ ID NO:8)、RYVDHEDW(SEQ ID NO:9)、EWELHAEE(SEQ ID NO:10)、SQSSMYPS(SEQ ID NO:11)、RYQLHHPR(SEQ ID NO:12)、WYKLHPTM(SEQ ID NO:13)、KLQLVLAPLHSLAS(SEQ ID NO:14)、和RSPGLAPARPRYA(SEQ ID NO:15)及其生物活性变体。已证实这些EGFL7相互作用多肽与EGFL7结合或相互作用并且抑制血管生成。EGFL7相互作用多肽序列可由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15或其生物活性变体的任何一种序列所构成，或者其可能包括SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15或其生物活性变体的任何一种序列。这些序列的组合和/或其他EGFL7相互作用多肽序列也可能被采用，且可能一同起到协同作用或相加作用。
[0109] 包含本发明中的EGFL7相互作用多肽的序列可能含有任何数目的氨基酸残基，然而，这些序列通常包含至少约3个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约300个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约250、约8个氨基酸残基-约200个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约
100个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约50个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约30个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约20个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约16个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约12个氨基酸残基或者约12个氨基酸残基-约16个氨基酸残基，这些范围内的任何单个数字增加在本文中都是具体设想的，例如，举例说明，8、9、10、
11、12、13、14、15或16个氨基酸残基。
100个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约50个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约30个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约20个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约16个氨基酸残基、约8个氨基酸残基-约12个氨基酸残基或者约12个氨基酸残基-约16个氨基酸残基，这些范围内的任何单个数字增加在本文中都是具体设想的，例如，举例说明，8、9、10、
11、12、13、14、15或16个氨基酸残基。
[0110] 生物活性变体包括具有EGFL7相互作用活性的SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:13的任何变体序列。变体序列的EGFL7相互作用活性可能与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:13的亲本序列的相同，也可能与亲本序列相比有所增加或降低。
[0111] 举例说明，考虑了乙酰化序列，例如序列Ac-GSLLVHSFQQLG，其中的“Ac”表示此多肽的乙酰化作用。举例说明，考虑了这些序列中的保守氨基酸置换。举例说明，保守氨基酸置换在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、天门冬酰胺(谷氨酰胺和天门冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小分子氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)所构成的群体中。通常不改变特定活性的氨基酸置换在所属领域中已被熟知，举例说明，H.Neurath和R.L.Hill(1979)在纽约学术出版社出版的《蛋白质》(The Proteins)(以引用方式将其并入本文中)中已对其做了介绍。最常见的置换为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
[0112] 因而，HMYFLLGH中的一个或两个组氨酸残基可独自被精氨酸或赖氨酸置换，蛋氨酸残基可被甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸置换，酪氨酸残基可被苯丙氨酸或色氨酸置换，苯丙氨酸残基可被酪氨酸或色氨酸置换，一个或两个亮氨酸残基可被异亮氨酸或缬氨酸置换，甘氨酸残基可被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸或蛋氨酸置换，或者可被其任何组合置换。
[0113] 与此类似，GSLLVHSFQQLG中的一个或两个甘氨酸残基可独自被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸或蛋氨酸置换，一个或两个丝氨酸残基可被甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或蛋氨酸置换，任何一个或多个亮氨酸残基可被异亮氨酸或缬氨酸置换，缬氨酸残基可被亮氨酸或异亮氨酸置换，组氨酸残基可被精氨酸或赖氨酸置换，苯丙氨酸残基可被酪氨酸或色氨酸置换，一个或两个谷氨酰胺残基可被天门冬酰胺置换，或者可被其任何组合置换。
[0114] SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:13的序列变体可依同样的方法确定。
[0115] 或者，EGFL7相互作用多肽序列中的氨基酸改变在性质上属于此多肽的理化性质改变。举例说 明，氨基酸改变可能会改善此多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最佳pH，等等。举例说明，多肽序列中的任何一种或多种氨基酸都可以为左旋形式或右旋形式。也可采用外消旋混合物。
[0116] 亲本多肽中需要生物活性的氨基酸可按照所属领域中已知的程序进行鉴定，例如定点突变(Cunningham和Wells，1989，科学杂志244：1081-1085，以引用方式将其并入本文中)。生物相互作用的活性位点也可通过物理分析结构进行确定，如通过核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记之类的技术，连同推定的接触位点氨基酸的突变进行确定。参见，举例说明，de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，分子生物学杂志224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64(该文各项均以引用方式全部并入本文中)。需要生物活性的氨基酸的特性还可通过分析同亲本多肽相关的多肽的一致性进行推断。
[0117] 单个或多个氨基酸置换、删除和/或插入及其检测，可采用已知的突变、重组和/或改组法，随后实施相关筛选程序，例如以下所介绍的方法：Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，美国国家科学院院刊86：2152-2156；WO
95/17413或WO 95/22625，其中各项均以引用方式全部并入本文中。可以使用的其他方法包括错误倾向PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，生物化学30：10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204，该文各项均以引用方式全部并入本文中)以及区域定向突变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；和Ner等，1988，DNA 7：127，其中各项均以引用方式全部并入本文中)。
95/17413或WO 95/22625，其中各项均以引用方式全部并入本文中。可以使用的其他方法包括错误倾向PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，生物化学30：10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204，该文各项均以引用方式全部并入本文中)以及区域定向突变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；和Ner等，1988，DNA 7：127，其中各项均以引用方式全部并入本文中)。
[0118] 可将突变/改组法与高通量自动筛选方法相结合，用于检测宿主细胞表达的克隆的、经诱变的多肽的活性(Ness等，1999，自然生物技术17：893-896，以引用方式将其并入本文中)。编码有活性多肽的经诱变DNA分子可从宿主细胞中回收，并采用标准方法快速测序。这些方法可迅速确定多肽中的单个氨基酸残基的重要性。
[0119] 变体EGFL7相互作用多肽还包括杂合多肽，其中的一部分EGFL7相互作用多肽在N-端或C-端与另一种多肽或其一部分融合。
[0120] 变体EGFL7相互作用多肽可以是融合多肽或剪切融合多肽，其中的另一种多肽融合在EGFL7相互作用多肽的N-端或C-端。融合多肽是将编码另一种多肽的多聚核苷酸融合在编码EGFL7相互作用多肽的多聚核苷酸上生成的。融合多肽生成技术在所属领域中已众所周知，这些技术包括连接编码多肽的编码序列，以使其在框架内，并且融合多肽的表达是由相同的启动子和终止子调控的。融合蛋白还可采用内蛋白技术制成，其中的融合在翻译后进行(参见，举例说明，Cooper等，1993，EMBO J.12：2575-2583；Dawson等，1994，Science 266：776-779，该文各项均以引用方式全部并入本文中)。
[0121] 融合多肽可进一步包含融合多肽间的切割位点。分泌融合蛋白后，切割该位点释放出2个多肽。举例说明，切割位点包括但不限于Martin等，2003，工业微生物学和生物技术杂志3：568-576；Svetina等，2000，生物技术杂志76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，环境生物技术应用63：3488-3493；Ward等，1995，生物技术13：498-503；Contreras等，1991，生物技术9：378-381；Eaton等，1986，生物技术25：505-512；Collins-Racie等，
1995，生物技术13：982-987；Carter等，1989，蛋白质、结构、功能和遗传学6：240-248；
Stevens，2003，药物发现世界4：35-48，其中各项均以引用方式全部并入本文中。
1995，生物技术13：982-987；Carter等，1989，蛋白质、结构、功能和遗传学6：240-248；
Stevens，2003，药物发现世界4：35-48，其中各项均以引用方式全部并入本文中。
[0122] 通常，EGFL7相互作用多肽的生物活性变体，举例说明，HMYFLLGH或GSLLVHSFQQLG，与EGFL7相互作用多肽序列至少约有50％序列一致性。更显而易见，与EGFL7相互作用多肽序列的序列一致性至少约为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0123] EGFL7相互作用多肽也可包含一种可检测标记。“可检测标记”为由于具有特定功能特性和/或化学特征而可被检测出的化合物和/或要素，利用这些可检测标记可检测出其所附着的EGFL7多肽，和/或如果需要可进一步实施定量分析。
[0124] 多肽诊断通常分为两类，即，用于体外诊断和/或用于采用各种成像技术(例如，核成像技术)检测的体内诊断方案。应该理解的是，用于成像的EGFL7相互作用多肽可以是可调节EGFL7的活性的调节肽，也可无任何生物活性并且可单纯结合EGFL7。
[0125] 许多适用显影剂在所属领域中都已知可附着在多肽上(参见，举例说明，美国专利No.5,021,236、美国专利No.4,938,948和美国专利No.4,472,509，该文各项均以引用方式全部并入本文中)。举例说明，所使用的成像部分为顺磁离子、放射性同位素、荧光色素、NMR可检测物质或X线成像可检测物质。
[0126] 如果是顺磁离子，例如包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，通常使用的是钆离子。铁离子在其他情况下有用，例如X线成像，包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，尤其是铋(III)。
[0127] 如果放射性同位素用于治疗和/或诊断，例如包括211砹、11碳、14碳、51铬、36氯、5758 64 57 152 18 67 68 3 123 125 111 59 32 186 188 75
钴、钴、铜、铜、 铕、氟、镓、镓、氢、 碘、 碘、 铟、铁、磷、 铼、 铼、
35 99m 90 125 99m 111
硒、硫、 锝和/或 钇。 碘经常用于某些实施方式， 锝和/或 铟由于能量低并
且适用于远距离检测也经常使用。放射性标记的多肽可按照所属领域所熟知的方法制成。
例如，多肽可通过接触钠和/或碘化钾和一种化学氧化剂(例如，次氯酸钠)或一种酶氧化
99m
剂(例如，乳酸过氧化物酶)进行碘化。多肽可通过配位基交换过程用 锝进行标记，举例说明，用二价锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合在葡聚糖凝胶柱上，将此多肽涂在该柱上。或者，可采用直接标记技术，例如，通过孵育高锝酸盐、一种还原剂(例如，SNCI2)、一种缓冲溶液(例如，酞酸钠钾溶液)和此多肽。经常用于将以金属离子形式存在的放射性同位素结合在多肽上的中间官能团有二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四醋酸(EDTA)或
1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。可通过辅基法用氟-18标记多肽，
18
以此法首先对小分子做放射性标记，然后将其与此肽偶联，举例说明，制备[ 氟]-氟安息香酸，然后将其与此肽的氨基偶联。
钴、钴、铜、铜、 铕、氟、镓、镓、氢、 碘、 碘、 铟、铁、磷、 铼、 铼、
35 99m 90 125 99m 111
硒、硫、 锝和/或 钇。 碘经常用于某些实施方式， 锝和/或 铟由于能量低并
且适用于远距离检测也经常使用。放射性标记的多肽可按照所属领域所熟知的方法制成。
例如，多肽可通过接触钠和/或碘化钾和一种化学氧化剂(例如，次氯酸钠)或一种酶氧化
99m
剂(例如，乳酸过氧化物酶)进行碘化。多肽可通过配位基交换过程用 锝进行标记，举例说明，用二价锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合在葡聚糖凝胶柱上，将此多肽涂在该柱上。或者，可采用直接标记技术，例如，通过孵育高锝酸盐、一种还原剂(例如，SNCI2)、一种缓冲溶液(例如，酞酸钠钾溶液)和此多肽。经常用于将以金属离子形式存在的放射性同位素结合在多肽上的中间官能团有二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四醋酸(EDTA)或
1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。可通过辅基法用氟-18标记多肽，
18
以此法首先对小分子做放射性标记，然后将其与此肽偶联，举例说明，制备[ 氟]-氟安息香酸，然后将其与此肽的氨基偶联。
[0128] 计划作为可检测标记使用的荧光标记包括，举例说明，Alexa 350、Alexa430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、瀑布蓝、Cy3、Cy5、6-FAM、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、若丹明绿、罗丹明红、肾造影剂、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红。通常，荧光标记为荧光素。
[0129] 本发明中计划使用的另一类多肽/可检测标记缀合物包括主要用于体外的缀合物，其中，此多肽与一个第二结合配体和/或与显色底物接触后会生成有色产物的一种酶(一种酶标签)结合。举例说明，这些合适的酶包括尿素酶、碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶以及这些酶的组合。典型的第二结合配体有生物素和/或卵白素与抗生蛋白链菌素复合物。此类标记的使用已为所属领域的技术人员所熟知，并且已在(举例说明)美国专利No.3,817,837、美国专利No.3,850,752、美国专利No.3,939,350、美国专利No.3,996,345、美国专利No.4,277,437、美国专利No.4,275,149和美国专利No.4,366,241中做了说明。该文各项均以引用方式全部并入本文中。
[0130] 含有叠氮基的分子，通过弱紫外光产生的活性氮烯中间物，也可用于与多肽形成共价键(Potter与Haley，1983)。尤其是，已将嘌呤核苷酸的2-叠氮类似物和8-叠氮类似物作为定点光探针用于鉴定粗细胞抽提物中的核苷酸结合蛋白(Owens与Haley，1987；Atherton等，1985，其中各项均以引用方式全部并入本文中)。2-叠氮核苷酸和8-叠氮核苷酸也曾用于映射纯化蛋白质的核苷酸结合域(Khatoon等，1989；King等，1989；Dholakia等，1989)，也可用作多肽结合剂。
[0131] 此项技术中已知的几种方法可用于将可检测标记附着或缀合在多肽上。有些附着方法涉及到使用金属螯合物，举例说明，将一种有机螯合剂(例如，二乙烯三胺五乙酸酸脱水物(DTPA)、乙三胺四乙酸、N-氯-p-甲苯磺酰胺和/或四氯-3a-6a-二苯基甘脲-3)附着在此多肽上(参见，举例说明，美国专利No.4,472,509和美国专利No.4,938,948，该文各项均以引用方式全部并入本文中)。存在偶联剂(例如戊二醛或高碘酸盐)的情况下，多肽也可能会与酶相互作用。与荧光素标记物缀合的缀合物可在存在这些偶联剂的情况下或者通过与一种异硫氰酸酯反应进行制备。采用结合剂(例如，甲基-p-羟基苯甲亚胺酸乙酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟苯基)丙酸盐)，还可使可检测标记与此多肽结合(参见，举例说明，美国专利No.4,938,948，以引用方式将其并入本文中)。
[0132] 由于EGFL7在血管生成旺盛的组织中特异性表达，EGFL7相互作用多肽可与药剂(例如，化疗剂)偶联，从而可将该药剂靶向递送到有已表达的EGFL7的部位。
[0134] 该EGFL7相互作用多肽通过脂质体、纳米微囊、微粒、微球体、纳米颗粒、脂质颗粒、囊泡等等可与药剂偶联，在受试者体内可使表达的EGFL7的区域成为药剂的靶标。通常，可将该药剂封装在一种脂质颗粒、一种脂质体、一种囊泡、一种纳米球或一种纳米颗粒内进行递送，举例说明，至少有一部分EGFL7相互作用肽暴露，从而可与表达的EGFL7相互作用。
[0135] 脂质体的形成与使用已为所属领域的技术人员所熟知(参见，举例说明，Couvreur等，FEBS Lett.1977年12月15日；84(2)：323-6；Couvreur，治疗药物载体系统标准综述.1988；5(1)：1-20；Lasic，Trends Biotechnol.1998年7月；16(7)：307-21；Gabizon与Papahadjopoulos，Proc Natl Acad Sci USA.1988年9月；85(18)：6949-53；
Allen和Chonn，FEBS Lett.1987年10月19日；223(l)：42-6；美国专利No.5,741,516，以引用方式将其全部并入本文中)。此外，还有人对脂质体和作为潜在药物载体的脂质体样制品的各种方法进行了回顾(Takakura，日本临床，1998年3月；56(3)：691-5；Chandran等，印度实验生物学杂志.1997年8月；35(8)：801-9；Margalit，治疗药物载体系统标准综述。1995；12(2-3)：233-61；美国专利No.5,567,434、美国专利No.5,552,157、美国专利No.5,565,213、美国专利No.5,738,868和美国专利No.5,795,587，该文各项均以引用方式全部并入本文中)。
Allen和Chonn，FEBS Lett.1987年10月19日；223(l)：42-6；美国专利No.5,741,516，以引用方式将其全部并入本文中)。此外，还有人对脂质体和作为潜在药物载体的脂质体样制品的各种方法进行了回顾(Takakura，日本临床，1998年3月；56(3)：691-5；Chandran等，印度实验生物学杂志.1997年8月；35(8)：801-9；Margalit，治疗药物载体系统标准综述。1995；12(2-3)：233-61；美国专利No.5,567,434、美国专利No.5,552,157、美国专利No.5,565,213、美国专利No.5,738,868和美国专利No.5,795,587，该文各项均以引用方式全部并入本文中)。
[0136] 脂质体是采用分散在水介质中的磷脂类制成的，并会自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLVs))。MLVs的直径范围通常为25nm-4μm。MLVs经超声处理可形成直径范围为200-500A且核内含水溶液的单层小囊(SUVs)。
[0137] 脂质体与细胞膜相似之处，并且可与本发明一同用作药剂的载体。由于它们可包埋水脂溶性物质和脂溶性物质(即，分别在水空间之内和在自身的双分子层之内)，因此应用广泛。
[0138] 除了Couvreur等(FEBS Lett.1977年12月，15；84(2)：323-6)和Couvreur等(治疗药物载体系统标准综述.1988；5(1)：1-20)的报道以外，在制备脂质体配方时可利用以下信息。磷脂类在水中分散后，除了能形成脂质体以外，还可形成其他各种结构，具体取决于脂质与水的摩尔 比。摩尔比低时，脂质体为典型结构。脂质体的物理特性取决于pH值、离子强度和存在二价阳离子。脂质体对离子物质和极性物质的通透性低，但在高温温度时会发生相变，相变可显著改变脂质体的通透性。
[0139] 相变涉及从密集的有序结构(称为凝胶状态)变为松散的低序结构(称为流态)。这发生在典型的相变温度时，会导致对离子、糖类和药物的通透性增加。
[0140] 除了温度以外，脂质体暴露在蛋白中也可导致通透性发生改变。某些可溶性蛋白(例如，细胞色素C)可与双分子层结合、使双分子层变形并透过双分子层，从而可引起通透性改变。胆固醇可抑制蛋白的这种通透，将磷脂类排列得更紧密时，胆固醇可明显抑制蛋白通透。可以预期，用于递送抗生素和抑制剂的最典型脂质体构造将包含胆固醇。
[0141] 截留溶质的能力因脂质体的不同类型而异。举例说明，MLVs截留溶质的效率为中度，而SUVs的效率极低。然而，SUVs的优点是粒度分布均匀性和重现性，单层大囊(LUVs)则掺杂了粒度与截留效率的优缺点。这些都可通过乙醚蒸发进行制备，溶质截留的效率为MLVs的3-4倍。
[0142] 除了脂质体特征以外，截留化合物的一个重要决定因素就是化合物本身的物化性质。极性化合物被截留在水空间内，非极性化合物结合囊泡的脂质双分子层。极性化合物通过渗透作用释放，或者在双分子层破裂后释放，而非极性化合物仍与双分子层紧密相连，除非通过温度或使其暴露于脂蛋白才能将其分离出。这两种类型在相变温度时流出率都达到了最大。
[0143] EGFL7相互作用多肽可用于结合脂质体表面，可将脂质体及其中的药物直接递送到机体内有已表达的EGFL7的区域。
[0144] 或者，在药学上可接受的纳米微囊配方也可用于以稳定且可重复的方式截留药剂(Henry-Michelland等，药学与药理学杂志.1987年12月；39(12)：973-7；Quintanar-Guerrero等，药物开发和工业制药杂志。1998年12月；24(12)：1113-28；
Douglas等，治疗药物载体系统标准综述.1987；3(3)：233-61，其中各项均以引用方式全部并入本文中)。为避免胞内高分子过载引起副作用，此类超细颗粒(粒度约为0.1μm)应采用在体内能降解的聚合物进行设计。举例说明，符合这些要求的可生物降解聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒可考虑用于本发明。根据描述，此类颗粒可能容易制成(Couvreur等，
1980(参照前文)和1988(参照前文)；zur Muhlen等，Eur J Pharm Biopharm.1998年
3月；45(2)：149-55；Zambaux 等 J Control Release.1998 年 1 月 .2；50(1-3)：31-40；
Pinto-Alphandry等，1995J Drug Target.1995；3(2)：167-9和美国专利No.5,145,684，该文各项均以引用方式全部并入本文中)。
Douglas等，治疗药物载体系统标准综述.1987；3(3)：233-61，其中各项均以引用方式全部并入本文中)。为避免胞内高分子过载引起副作用，此类超细颗粒(粒度约为0.1μm)应采用在体内能降解的聚合物进行设计。举例说明，符合这些要求的可生物降解聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒可考虑用于本发明。根据描述，此类颗粒可能容易制成(Couvreur等，
1980(参照前文)和1988(参照前文)；zur Muhlen等，Eur J Pharm Biopharm.1998年
3月；45(2)：149-55；Zambaux 等 J Control Release.1998 年 1 月 .2；50(1-3)：31-40；
Pinto-Alphandry等，1995J Drug Target.1995；3(2)：167-9和美国专利No.5,145,684，该文各项均以引用方式全部并入本文中)。
[0145] EGFL7相互作用多肽可配制成多种组成，这些组成可进一步包含一种或多种在药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、佐剂或它们的混合物。
[0146] 将纯度适当的期望多肽与可选药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合在一起，制备EGFL7相互作用多肽治疗组合物(第16版《雷氏药学大全》，Osol，A.ed.(1980)，以引用方式将其并入本文中)，以冻干剂或水溶液形式储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的用量和浓度时对接受者是无毒的，这在上文中已做介绍。
[0147] 此类载体的更多示例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如，人血清白蛋白)、缓冲物质(例如，磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如，硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类物质和聚乙二醇。外用型或凝胶型多肽的载体包括多糖(例如，羧甲基纤维素钠或甲基纤维素)、聚乙烯吡咯酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙 烯-嵌段共聚物、聚乙二醇和木蜡醇。所有给药都可以采用传统贮库形式。此类形式包括，举例说明，微囊，纳米微囊、脂质体、膏药、吸入剂、鼻喷雾剂、舌下含片和缓释制剂。
[0148] EGFL7相互作用多肽通常采用浓度范围为约0.1mg/ml-约100mg/ml的此类赋形剂制成。
[0149] 另一种配方是将EGFL7相互作用多肽混合到成型品中。此类成型品可用于调节内皮细胞生长和血管生成。另外，可采用这些成型品调节肿瘤浸润和转移。
[0150] 体内给药使用的EGFL7相互作用多肽通常都无菌。这很容易实现，举例说明，冻干和复溶之前或之后通过无菌滤过膜进行过滤。如果全身给药，EGFL7相互作用多肽一般以冻干形式或溶液形式储存。如果以冻干形式储存，EGFL7相互作用多肽通常要联合其他成份制成配方，在使用时利用适当稀释剂进行复溶。例如，EGFL7相互作用多肽的液体制剂为一种无菌、透明、无色且无保存剂的溶液，封装在单剂量小瓶中以供皮下注射用。
[0151] 适合重复使用的含保存剂药物组合物可能含有(举例说明，主要取决于多肽的适应证和类型)：EGFL7相互作用多肽、能将pH值范围(通常约为4-8)维持在可使溶液中的多肽稳定性达到最大的缓冲剂、主要用于稳定多肽以防搅动引起聚集的去垢剂/表面活性剂、等渗剂、选自由苯酚、苯甲醇和苯索卤铵(例如，氯化物)组成的群体的保存剂以及水。
[0152] 如果采用的是非离子去垢剂，则可能—举例说明—包含聚山梨醇酯类(例如，TM TM TMPOLYSORBATE (TWEEN )20，80，等等)或泊洛沙姆类(例如，POLOXAMER 188)。使用非离子表面活性剂时，允许制剂受到不会引起多肽变性的表面切应力。而且，含有表面活性剂的此类制剂可用于气雾剂器械(例如，用于肺部给药的器械)和无针射流注射枪(参见，例如，EP 257,956，以引用方式将其并入本文中)。
[0153] 为确保EGFL7相互作用多肽液相成分等渗性，可添加等渗剂，其中包括多元糖醇类，通常为三元或更高元糖醇类(例如，甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇)。这些糖醇类可单独使用，也可联合使用。或者，氯化钠或其他适当无机盐类也可用于维持溶液等渗。
[0154] 缓冲剂，举例说明，可以是醋酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂，具体根据需要的pH值而定。本发明的一类液体制剂的pH值采用缓冲剂维持在约4-8的范围内，通常约为生理性pH值。
[0155] 保存剂苯酚、苯甲醇和苯索卤铵类(例如，氯化物)都是已知的可使用的抗微生物剂。
[0156] 文中所述的治疗性EGFL7相互作用多肽组合物通常置于带无菌输液港的容器(举例说明，静脉输液袋)内或置于带皮下注射针可刺穿塞的小瓶内。这些组合物通常以重复性静脉内(i.v.)、皮下(s.c)或肌内(i.m.)注射方式给药，如果要递送到鼻内或肺内，以气雾剂形式给药(关于肺内递送，请参见，例如，EP 257,956，以引用方式将其并入本文中)。
[0157] 内装用于诊断或治疗文中所述紊乱的EGFL7相互作用多肽的试剂盒之类的制品含有至少一种容器和一种标记。适当的容器包括，举例说明，药瓶、小瓶、注射器和试管。容器可用各种材料(例如，玻璃或塑料)制成。容器内装可有效诊断或治疗病症的组合物，容器可有一个无菌输液港(举例说明，容器可以是一个静脉输液袋或带一个皮下注射针可刺穿塞的一个小瓶)。
[0158] 组合物中的有效成分为一种EGFL7相互作用多肽。容器上的标签或与容器相关的标签上标明了用于诊断或治疗特定病症的组合物。该制品可进一步包括第二个容器，该容器中装有在药学上可接受的缓冲剂，例如，磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。还可进一步包含从商业角度和用户角度看是理想的其他材料，其中包括其他缓冲剂、稀释剂、滤过剂、注射针、注射器和包装说明书及使用说明书。该制品还可包括第二个或第三个容器及文中所述的另一种活性药剂。
[0159] EGFL7相互作用多肽也可以缓释制剂形式给药。举例说明，缓释制剂包括内含此多肽的固态疏水聚合物半透性基质，这些基质可以是成型制品(例如，薄膜或微囊)形式。举例说明，缓释型基质包括聚酯类、水凝胶类(例如，Langer等(J.Biomed.Mater.Res.15：
167-277(1981))和Langer(Chem.Tech.12：98-105(1982))所描述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或者聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利No.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物类(Sidman等，Biopolymers 22：547-556(1983))、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等(参照前文))、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物类，例TM
如Lupron Depot (由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射性微球体)以及聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP 133,988)。这些参考文献分别以引用方式并入本文中。
167-277(1981))和Langer(Chem.Tech.12：98-105(1982))所描述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或者聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利No.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物类(Sidman等，Biopolymers 22：547-556(1983))、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等(参照前文))、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物类，例TM
如Lupron Depot (由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射性微球体)以及聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP 133,988)。这些参考文献分别以引用方式并入本文中。
[0160] 虽然聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸，释放分子能持续100多天，但是，某些水凝胶类释放蛋白的持续时间较短。当封装在囊内的蛋白在体内停留较长时间时，这些蛋白由于暴露在37℃的潮湿环境中可能会发生变性或聚集，从而导致生物活性丧失，并且可能会导致免疫原性发生改变。可制定理性策略来稳定蛋白质，具体根据涉及到的机制而定。举例说明，如果发现聚集机制是通过巯基-二硫键互换反应形成分子间二硫键，则可通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制水分含量、采用适当的添加剂以及研发特异性聚合物基质组合物实现稳定。
[0161] 缓释型EGFL7相互作用多肽组成还包括用脂质体包埋的EGFL7相互作用多肽。内有EGFL7相互作用多肽的脂质体是采用本身已公开的方法制成的：DE 3,218,121；
Epstein等，美国国家科学院院刊82：3688-3692(1985)；Hwang等，美国国家科学院院刊
77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利No.4,485,045和美国专利No.4,544,545；EP 102,324，该文各项均以引用方式并入本文中。
Epstein等，美国国家科学院院刊82：3688-3692(1985)；Hwang等，美国国家科学院院刊
77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利No.4,485,045和美国专利No.4,544,545；EP 102,324，该文各项均以引用方式并入本文中。
[0163] 当然，EGFL7相互作用多肽的有效治疗剂量因诸如下列的因素而异：需治疗(其中包括预防)的病理状态、给药方法、涉及到的任何联合疗法、受试者的年龄、体重、一般医学状况、病史等等，该领域中的执业医师。相应地，临床医生必须按照要求滴定剂量以及修改给药途径，以使疗效最佳。临床医生给予EGFL7相互作用多肽，直至达到治疗所述病症的预期效果为止。举例说明，如果目的是治疗癌症，在一个方面，用量应能抑制肿瘤生长。
[0164] 按照上述指导原则，有效剂量的范围通常为约0.001-约1.0mg/kg，更为常见的范围为大约0.01-1.0mg/kg，最常见的范围为大约0.01-0.1mg/kg。
[0165] 非口服途径给药时，EGFL7相互作用多肽可注射给药，剂量约0.01-50mg，常用的剂量约0.05-约20mg，最常用的剂量约1-约20mg，按每kg体重计，每日静脉内注射1-3次。口服途径给药时，EGFL7相互作用多肽的常用剂量约5mg-约1g，通常约10-约100mg，按每kg体重计，每日口服1-3次。应当理解的是，内毒素污染至少要保持在安全水平，举例说明，低于约0.5ng/mg蛋白质。此外，用于人类时，配方的无菌性、致热原性、一般安全和纯度通常要符合FDA生物制品办制定的标准。
[0166] EGFL7多肽或拮抗剂或激动剂的给药途径与已知方法一致，例如，注射或静脉内输注、肌内、脑内给药、腹膜内给药、脑脊髓内给药、皮下给药、眼内给药、关节内给药、滑膜腔内给药、鞘内给药、口服、外用或吸入途径给药，或通过缓释系统给药。EGFL7相互作用多肽还可适当采用肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径给药，可以起到局部和全身治疗作用。预计腹膜内给药途径特别 有用，举例说明，在用于治疗卵巢肿瘤时。
[0167] EGFL7相互作用多肽预防或治疗所述紊乱的有效性通过连续给予此多肽或者与对用于这些目的有效的另一种药剂(具有相同组成或具有同样的个别组成)联用可能会提高。
[0168] 举例说明，用于治疗血管生成相关病症(例如，癌症或眼部疾病)的EGFL7相互作用多肽可与细胞毒性药物、化疗或上述抗血管生成剂联合使用，可能会与此类其他制剂起到协同或相加作用。在一个肿瘤模型中，发现肿瘤用抗VEGF抗体治疗以后EGFL7仍可使肿瘤血管持续退化(参见美国2007/0031437，以引用方式将其并入本文中)。不希望受到特定理论束缚，有可能EGFL7具有支持EC沿着已有ECM轨道迁移的作用，从而在抗血管生成治疗后有助于肿瘤血管再生。因此，可将EGFL7相互作用多肽与能促进或敏化抗血管生成剂活性的抗血管生成剂联合使用。一方面，EGFL7相互作用多肽与抗VEGF抗体贝伐单抗联用可提高抗肿瘤疗效。
[0169] 诺适得TM为阿瓦斯汀 TM(贝伐单抗)的一个Fab片段，阿瓦斯汀TM专门用于治疗TM“湿型”年龄相关性黄斑变性且已获批。因此，可将EGFL7相互作用多肽与诺适得 或另一种抗血管生成剂联合治疗“湿型”年龄相关性黄斑变性。
[0170] 与EGFL7相互作用多肽联合使用的治疗剂的有效剂量由医生或兽医决定。为最大程度管理治疗的病症，可调整用量。此外，还可根据使用的治疗剂的类型和治疗的具体患者等因素进行确定剂量。通常，如果未将该治疗剂与EGFL7相互作用多肽联用，采用的剂量与使用的剂量相同。
[0171] 鉴定EGFL7相互作用多肽的方法
[0172] 本发明还包含鉴定与EGFL7相互作用并调节EGFL7的活性和/或功能的多肽的筛选方法。在一个具体方面，采用图1所示和Cho等(以引用方式将其并入本文中)所述的“beads on a bead”法在组合肽文库中进行筛选。通过这种方法，在90μm Tentagel上合成一珠一物(OBOC)文库，通过每个珠子展示一种唯一的八肽。纳米磁珠经全长重组EGFL7包被后，与肽文库混合，采用大型流式细胞仪分选相互作用程度最高的文库珠“目标物”。然后，可用人类内皮细胞通过珠上细胞结合测定验证肽目标物。之后，采用内部MALDI-TOF/MS技术对验证的目标肽进行排序，采用表面等离子共振(SPR)技术量化其与EGFL7的结合亲和力(Amadei等，2009，质谱测定杂志，45：241-51；美国专利No.5,510,240；和美国专利No.7,262,269，其中各项均以引用方式全部并入本文中)。
[0173] 通常情况下，测定时一般首先鉴定候选EGFL7相互作用多肽，以便快速鉴定EGFL7活性的潜在调节剂。举例说明，此类测定为一种蛋白质间结合测定，其中，测定了候选分子结合EGFL7受体的能力。在另一个示例中，测定了候选分子干扰EGFL7结合EGFL7受体的能力。鉴定与EGFL7结合和/或相互作用的化合物的方法参见美国2007/0031437(以引用方式将其并入本文中)。由于此类方法与多肽鉴定相关，因此在下文中做了简要介绍。
[0174] 在一个方面，EGFL7相互作用多肽可通过其调节(即，抑制或增强)EGFL7的一种或多种生物活性的能力进行鉴定。因而，使候选多肽与EGFL7接触。然后评价EGFL7的生物活性。在一个方面，测定了EGFL7刺激内皮细胞增殖的能力。在另一方面，还测定了EGFL7促进内皮细胞存活的能力。在其他几个方面，测定了EGFL7促进内皮细胞迁移、黏附或管形成的能力。如果存在此多肽时EGFL7的生物活性可调，则可将此多肽视为一种EGFL7相互作用多肽。
[0175] 此外，适用于测定蛋白质间相互作用的任何方法都可用于鉴定与EGFL7相互作用的多肽。在可能采用的传统方法中，采用免疫共沉淀法、交联法和梯度共纯化法或色谱柱法鉴定与EGFL7相互作用的多肽。对于此类测定，EGFL7组分可以是全长蛋白质、其一种可溶性衍生物、一种与感兴趣结构域相对应的肽或是内有与EGFL7相同区域的一种融合蛋白。
[0176] 可采用这些方法同步鉴定编码能与EGFL7相互作用的蛋白质的基因。这些方法包括，举例说明，按照与众所周知的λgt11文库抗体探测技术相似的方式用标记的EGFL7或其变体探测表达文库。
[0177] 检测蛋白质在体内相互作用的方法——双杂交系统的详细介绍仅做说明使用，而不是用于限制。已有人对该系统的一个版本做了描述(Chien等，美国国家科学院院刊88：9578-9582(1991)，以引用方式将其并入本文中)，且可从Clontech公司(帕罗奥多，加利福尼亚州)购买到。
[0178] 简言之，利用此类系统制成的质粒能编码双杂化蛋白质：一个质粒包含编码转录激活子蛋白DNA结合域的核苷酸，该核苷酸可与编码EGFL7的核苷酸序列融合，或多肽、肽或融合蛋白，其他质粒中包含编码转录激活子蛋白活化结构域的核苷酸，该核苷酸可与编码已重组到该质粒中作为cDNA文库的一部分的未知多肽的cDNA融合。将DNA结合域融合质粒和cDNA库转化到内含调节区有转录激活子结合位点的报告基因(例如，HBS或lacZ)的酿酒酵母菌株中。任何杂化蛋白都无法单独激活报告基因转录：DNA结合域杂交由于其无法活化功能而无法激活，活化结构域杂交由于无法定位到结合位点而无法激活。双杂交蛋白相互作用可使功能激活子蛋白重组，从而可表达报告基因，报告基因表达通过测定报告基因产物进行检测。
[0179] 可采用双杂交系统或相关方法筛查与“引诱”基因产物相互作用的蛋白质的活化结构域文库。举例说明(但并不起到任何限制作用)，EGFL7可作为引诱基因产物。总基因组或cDNA序列与编码活化结构域的DNA融合。将编码与与DNA结合域融合的引诱EGFL7基因产物的文库和质粒共转化到酵母报告菌株中，从得到的转化体中筛选表达报告基因的转化体。举例说明(但并不起到任何限制作用)，引诱EGFL7基因序列，例如，基因的开放阅读框，可被克隆到载体中，这样，经翻译后可与编码GAL4蛋白DNA结合域的DNA融合。对这些集落进行纯化，分离出负责报告基因表达的文库质粒。然后通过DNA测序鉴定由文库质粒编码的蛋白质。
[0180] 对于源自需测定的与引诱EGFL7基因产物相互作用的多肽，采用该领域中的常规方法检测其细胞系的cDNA文库。按照文中所述的特定系统，举例说明，将cDNA片段插入到载体中，从而使其翻译融合到GAL4的转录活化结构域上。文库可与引诱EGFL7基因GALA融合质粒共转化到酵母菌株中，该酵母菌株中存在启动子驱动的lacZ基因，启动子内有GALA活化序列。cDNA编码多肽，与引诱EGFL7基因产物相互作用的GAL4转录活化结构域融合，重组活性GAL4蛋白质，从而驱动报告基因表达。驱动报告基因表达的集落可采用该领域常规使用的方法进行检测。然后，从这些菌株中纯化出cDNA，用其生成引诱EGFL7基因相互作用多肽并采用常规使用的技术进行分离。
[0181] 通过计算机建模和搜索技术鉴定多肽，或改进已鉴定出的可调节EGFL7功能或活性的多肽。
[0182] 鉴定出此类多肽以后，鉴定与EGFL7相互作用的活性位点或区域。此类活性位点一般可是结合位点的配体。活性位点可采用所属领域已知方法进行确定，其中包括，举例说明，肽的氨基酸序列、核酸的核苷酸序列或相关多肽与EGFL7的复合物的研究。在后一种情况中，可采用化学法或X射线结晶法查找已发现的复合多肽所在的EGFL7来确定活性位点。
[0183] 其次，确定活性位点的三维几何结构，这可通过已知方法进行，这些方法包括X射线结晶学，通过此法可确定完整的分子结构。在另一方面，可通过固相或液相NMR确定某些分子内距离。也可采用其他任何经验性结构测定方法确定部分或完整几何结构。几何结构可采用可提高测定的活性位点结构准确度的天然或人工合成的复合多肽进行测定。
[0184] 如果测定的结构不完整或不是很准确，可采用计算机辅助数字建模法完善结构或提高准确度。已得到公认的任何建模方法都可使用，其中包括对特定生物聚合物(例如多肽)具有特异性的参数化模型、基于计算分子运动的分子动力学模型、基于热集合的统计力学模型或者联合模型。在大多 数类型的模型中，标准分子力场(表示原子组分与基团间的力)都是必要的，可从物理化学中已知的力场中进行选择。不完整或不太准确的实验结构可制约通过这些建模方法算出的完整和更准确的结构。
[0185] 最后，通过实验、建模或联合方法确定了活性位点(或结合位点)的结构以后，可通过搜索内有化合物及其分子结构信息的数据库识别出候选相互作用多肽。通过该搜索可找出结构与已确定的活性位点结构匹配的多肽以及与定义活性位点的基团相互作用的多肽。此类搜索可手工进行，但通常采用计算机辅助。通过此搜索发现的多肽为EGFL7活性的潜在调节剂。
[0186] 又或，可通过这些方法鉴定根据已知相互作用化合物或配体改进的相互作用多肽。已知多肽的组成可修饰，修饰的结构影响可采用上述适用于新组成的实验法和计算机建模法进行确定。然后，比较复合物的更改后结构与活性位点结构，确定改进的适合或相互作用结果。通过这种方式，可迅速评价组成的系统变异(例如更改侧基)，从而可得到特异性或活性改进的修饰的相互作用多肽。
[0187] 基于EGFL7活性位点(或结合位点)鉴定的用于鉴定相互作用多肽的更多实验方法和计算机建模方法对所属领域的技术人员而言是显而易见的。
[0188] 分子建模体系的实例为CHARMm和QUANTA程序(Polygen公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞)。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA进行分子结构建立、图形建模和分析。QUANTA可以实现分子之间行为的相互作用建模、改性、可视化、和分析。
[0189] 虽然上述内容是关于设计和合成可改变结合的多肽，同样也可以针对EGFL7相互作用多肽来筛选已知多肽库和/或新多肽库。
[0190] 可以设计体系来识别可与EGFL7相互作用(例如，与其结合)或者可以干扰EGFL7结合到同源受体、结合配体或底物的多肽。识别出的多肽可以用于，例如，调控野生型和/或EGFL7基因突变产物的活性；可以用于详细说明EGFL7的生物学功能；可以用于筛选可破坏正常EGFL7相互作用的标识化合物；或者可能它们自身就可破坏或激活类似作用。
[0191] 用于识别可结合EGFL7或EGFL7同源受体或底物的多肽的检测原理，包括准备EGFL7和受试多肽的反应混合物，在可以让两个组分发生反应和结合的条件下充分反应一段时间，然后在反应混合物中形成可以移除和/或被检出的复合物。使用的EGFL7种属可根据筛选检测的目标而更改。例如，当需要天然受体的拮抗剂时，可以使用能够在检测系统中提供优势的(例如，标记、生成复合物的分析，等)全长EGFL7或可溶的EGFL7片段、多肽，或包含一个或多个EGFL7结构域混合蛋白或多肽的融合蛋白。比如说，当寻找直接与EGFL7相互作用的化合物时，可以使用与EGFL7匹配的多肽和包含EGFL7的融合蛋白。
[0192] 可使用多种方法进行筛选检测。例如，进行此种检测的一个方法是将EGFL7、多肽、肽或融合蛋白或者受试多肽固定到固相上，然后在反应最后检测固定在固相上的EGFL7/受试多肽复合物。在此种方法的一个方面，EGFL7可以固定到固相表面，并且受试多肽未固定，可以进行标记，可以是直接或间接。
[0193] 实际中，微滴定板通常可用作固相。所固定的组分可以通过非共价或共价连接来固定。非共价连接可以通过简单的将蛋白质溶液包被到固相表面然后干燥来完成。或者，固定的抗体，一般为单克隆抗体，特异性的针对需要固定的蛋白，可以用于将蛋白质固定到固相表面。
[0194] 为了进行检测，将未固定的成分加入到包含固定成分的包被表面。当反应完成后，去除未反应的成分(如，通过清洗)，此时的条件下，任何形成的复合物应保持固定在固相表面的状态。固定在固相表面的复合物的检测可以通过多种方式来完成。当之前未固定成分预先标记时，在表面检测 到标记的固定成分说明形成了复合物。当之前未固定的成分未标记时，可以使用间接标记来检测固定在表面上的复合物；例如，使用标记的针对之前未固定成分的特异性抗体(抗体，相应的，可以直接标记或者通过标记的抗Ig抗体间接标记)。
[0195] 或者，反应可以在液相中进行，将反应产物从未反应的成分中分离出来，然后对复合物进行检测；例如，用固定的特异性针对EGFL7蛋白、多肽、肽或融合蛋白或受试化合物的抗体来捕获在溶液中形成的所有复合物，然后使用特异性针对可能的复合物其他成分的标记抗体来检测捕获的复合物。
[0196] 可以与EGFL7相互作用的大分子被称为，为了在此进行讨论，“结合配体”。这些结合配体有可能涉及EGFL7介导的生物学通路。因此，需要识别可以干扰或破坏此类结合配体的相互作用的多肽，这有助于调控或增加EGFL7在体内活性和/或控制与此活性相关的失调(或相关的缺陷)。
[0197] 用于识别干扰EGFL7和结合配体或配体之间相互作用的检测系统的基本原理包括制备包含EGFL7或某些相关变体、和结合配体的反应混合物，在可以让两者发生反应和结合的条件下充分反应一段时间，然后形成复合物。为了检测多肽的抑制活性，在受试多肽存在和不存在的情况下制备反应混合物。受试多肽可以包含在最初的反应混合物中，或可以在EGFL7及其结合配体加入之后的一段时间内再加入。对照反应混合物在不包含受试多肽或包含对照多肽的条件下孵育。然后，对EGFL7及其结合配体之间形成的所有复合物进行检测。在对照反应中形成复合物，但是在包含受试多肽的反应混合物中不形成复合物，说明该物质可干扰EGFL7及其结合配体的相互作用。另外，在包含受试多肽和正常EGFL7蛋白的反应混合物中形成的复合物同样也可以与包含受试多肽和突变EGFL7蛋白的反应混合物中形成的复合物进行比较。当需要识别可特异性破坏突变或突变的EGFL7但是不破坏正常蛋白质相互作用的多肽时，该比较可能会很重要。
[0198] 干扰EGFL7及其结合配体的相互作用的多肽的检测可以以异相和均相形式进行。异相检测包括将EGFL7，或结合配体固定在固相上，在反应最后，在固相上检测所捕获的复合物。在均相检测中，整个反应在液相中进行。在另一个方法中，反应物加入的顺序可以更改以得到关于被试多肽的不同信息。例如，受试多肽可以通过竞争来干扰反应，可以通过在受试多肽存在下进行反应来识别；例如，通过将受试多肽先于或者与EGFL7和相互作用结合配体一同加入反应混合物中。或者，受试多肽破坏已形成的复合物，可以通过将受试多肽在复合物形成后加入反应混合物来进行测试。
[0199] 在特定的实施例中，可以制备一种EGFL7融合蛋白用于固定。例如，EGFL7，或其肽的片段，可以使用融合载体融合到谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因，例如pGEX-5X-l，按这种方法，在得到的融合蛋白中可以维持其结合活性。相互作用的结合配体可以使用常规的成125
熟方法进行纯化和用于制备单克隆抗体。此抗体可以用放射性同位素 I进行标记，例如，使用常规的成熟方法。在异相检测中，融合蛋白可以固定到谷胱甘肽-琼脂糖微球上。然后，在受试多肽存在和不存在时加入相互作用结合配体，用可发生相互作用和结合的方式。
在反应期结束时，未结合的物质可以洗去，然后标记的单克隆抗体可以加入到体系中并可以与形成复合物的成分相结合。EGFL7和相互作用结合配体之间的相互作用可以通过测量仍结合在谷胱甘肽-琼脂糖微球上的放射性的量来检测。受试肽对相互作用的成功抑制将降低所测得的放射性。
熟方法进行纯化和用于制备单克隆抗体。此抗体可以用放射性同位素 I进行标记，例如，使用常规的成熟方法。在异相检测中，融合蛋白可以固定到谷胱甘肽-琼脂糖微球上。然后，在受试多肽存在和不存在时加入相互作用结合配体，用可发生相互作用和结合的方式。
在反应期结束时，未结合的物质可以洗去，然后标记的单克隆抗体可以加入到体系中并可以与形成复合物的成分相结合。EGFL7和相互作用结合配体之间的相互作用可以通过测量仍结合在谷胱甘肽-琼脂糖微球上的放射性的量来检测。受试肽对相互作用的成功抑制将降低所测得的放射性。
[0200] 或者，GST融合蛋白和相互作用结合配体可以在液相中一同混合，此时不加入固相的谷胱甘肽-琼脂糖微球。然后，在反应种属相互反应期间或之后加入受试多肽。然后，将谷胱甘肽-琼脂糖微球加入到该混合物中，洗去未结合的物质。再然后，通过加入标记抗体并测量微球上的放射性，可以测出EGFL7和结合配体之间相互作用的抑制程度。
[0201] 调控EGFL7与其受体的结合的EGFL7相互作用多肽，可以通过在竞争性抑制检测的条件下，将EGFL7和备选的多肽与膜结合EGFL7受体或重组受体相结合来进行检测。EGFL7可以是标记的，如放射性标记，由此，结合到受体的EGFL7分子数量可以用于确定备选多肽的有效性。在另一个相互作用EGFL7多肽检测中，哺乳动物细胞或表达EGFL7受体的膜制剂将与标记的EGFL7进行孵育，在备选多肽存在的情况下。然后，可以测得多肽增强或阻断该相互作用的能力。
[0202] 测试与EGFL7相互作用的候选多肽的方法
[0203] 可使用多种方法测试EGFL7多肽与EGFL7相互作用的活性。这样的测定包括下文的实施例中以及U.S.2007/0031437中提供的测定，通过引用将其整体并入本文。
[0204] 对于癌症，可使用多种公知的动物模型来测试与EGFL7相互作用的候选多肽，例如小分子拮抗剂。这些模型的体内性质使它们对人患者的响应特别具有预测性。肿瘤和癌症(例如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等)的动物模型包括非重组动物和重组(转基因)动物两种。非重组动物模型包括例如，啮齿类模型，如鼠类模型。这些模型可通过使用标准技术将肿瘤细胞引入同系小鼠来得到，所述标准技术例如，皮下注射、尾静脉注射、脾移植、腹膜内移植、肾小囊下的一直或卵巢(orthopin)移植，如移植与结肠组织中的结肠癌细胞。参见例如，与1997年9月18日出版的PCT出版物No.WO 97/33551，通过引用将其整体并入本文。可能在肿瘤学研究中最经常使用的动物物种是免疫血线小鼠，特别是裸鼠。胸腺发育不全的裸鼠可成功地充当人肿瘤异种移植物的宿主，这一发现导致这类裸鼠广泛用于该目的。已经将常染色体的隐性nu基因引入非常多种不同的裸鼠同源品系中，包括例如，ASW、A/He、AKR、BALB/c、BIO.LP、C17、C3H、C57BL、C57、CBA、DBA、DDD、I/st、NC、NFR、NFS、NFS/N、NZB、NZC、NZW、P、RIII和SJL。此外，已经培育出除裸鼠外的广泛种类的具有遗传性免疫缺陷的其他动物，并用作肿瘤异种移植物的接受者。更多详细信息参见例如，E.Boven和B.Winograd编写的《裸鼠肿瘤学研究》(CRC出版社公司，1991)，通过引用将其整体并入本文。
[0205] 引入这些动物中的细胞可来源于已知的肿瘤/癌细胞系，例如B 104-1-1细胞系(经neu原癌基因转染的稳定的NIH-3T3细胞系)；ras-转染的NIH-3T3细胞；Caco-2细胞(ATCC HTB-37)；或中等良好分化的II级人结肠腺癌细胞系HT-29(ATCC HTB-38)；或来源于原发性肿瘤或癌。肿瘤细胞或癌细胞样品可使用包括冷冻和储存于液氮中在内的标准条件得自经历手术的患者。Karmali等，Br.J.Cancer 48:689-696(1983)，通过引用将其整体并入本文。
[0206] 可通过多种方法将肿瘤细胞引入例如裸鼠或EGFL7敲除的小鼠等动物中。小鼠的皮下(s.c.)空间非常适于肿瘤移植。肿瘤可作为固体块移植，或通过使用套针作为针吸组织活检移植，或作为细胞悬液移植。对于固体块或套针移植，将合适尺寸的组织片段引入皮下空间中。从原发性肿瘤或稳定的肿瘤细胞系新鲜制备细胞悬液，并经皮下注射。肿瘤细胞还可注射为皮下移植物。在该位置处，接种物沉积于真皮结缔组织和皮下组织之间的下部。
[0207] 乳腺癌动物模型可通过例如以下方法来生成，例如：移植用神经母细胞瘤细胞(neu原癌基因从该细胞开始分离)移植大鼠，或将neu-转化的NIH-3T3细胞移植至裸鼠中，基本如Drebin等，美国国家科学院院刊83:9129-9133(1986)中所描述，通过引用将其整体并入本文。
[0208] 类似地，结肠癌动物模型可通过将结肠癌细胞传递至例如裸鼠等动物中，导致在这些动物中发 生肿瘤。裸鼠中的人结肠癌正位移植模型已经在例如Wang等，癌症研究杂志54:4726-4728(1994)和Too等，癌症研究杂志55:681-684(1995)中有表述，通过引用将每一篇文献的整体并入本文。该模型基于由Anticancer公司(圣地亚哥，加利福尼亚)出TM售的所谓“METAMOUSE ”。
[0209] 可移除动物中产生的肿瘤，并进行体外培养。然后可将来自体外培养的细胞传递给动物。这样的肿瘤可充当进一步测试或多肽筛选的靶标。例如，Meth A、CMS4、CMS5、CMS21和WEHI-164是BALB/c雌性小鼠的化学诱导的纤维肉瘤(DeLeo等，J.Exp.Med.146:720(1977)，通过引用将其整体并入本文)，其提供了用于研究多种试剂的抗肿瘤活性的高度可控的模型系统。Palladino等，免疫学杂志138:4023-4032(1987)，通过引用将其整体并入本文。简言之，将肿瘤细胞在细胞培养物中进行体外繁殖。在注射至动物中6 7
之前，洗涤细胞系，并以约10×10细胞/ml至10×10 细胞/ml的细胞密度悬浮于缓冲剂中。然后用10-100μl的细胞悬液经皮下感染动物，等待1-3周时间以使肿瘤出现。
之前，洗涤细胞系，并以约10×10细胞/ml至10×10 细胞/ml的细胞密度悬浮于缓冲剂中。然后用10-100μl的细胞悬液经皮下感染动物，等待1-3周时间以使肿瘤出现。
[0210] 此外，研究最彻底的实验肿瘤小鼠Lewis肺癌可用作研究性肿瘤模型。该肿瘤模型中的效力已经与对被诊断患有小细胞肺癌(SCCL)的人患者的治疗用的有益效果关联起来。该肿瘤可通过注射来自受感染小鼠的肿瘤碎片或维持于培养物中的细胞来引入正常小鼠中。Zupi等，Br.J.Cancer 41:增刊4,30(1980)，通过引用将其整体并入本文。有证据指示，肿瘤可起始于甚至单个细胞的注射，并且经感染的肿瘤细胞中有非常高的比例存活下来。关于该肿瘤模型的进一步信息参见Zacharski,Haemostasis 16:300-320(1986)，通过引用将其整体并入本文。
[0211] 与EGFL7相互作用的候选多肽的效力还可在自发动物肿瘤的治疗中进行测试。适于这样的研究的示例性靶标是猫口腔鳞状细胞癌(SCC)猫口腔SCC是高度侵袭性的恶性肿瘤，其为最常见的猫口腔恶性肿瘤，占该物种中所报道的口腔肿瘤的60％以上。该肿瘤很少转移至远距离的位点，但是这种低的转移发生率可能只不过反映了携带该肿瘤的猫的短生存期。这些肿瘤主要由于猫口腔的解剖学而通常不能进行手术。现今没有针对该肿瘤的有效治疗。在进行该研究之前，每只猫进行完全的的临床检查和组织活检，并通过计算断层扫描术(CT)进行扫描。诊断患有舌下口腔鳞状细胞肿瘤的猫可排除于本研究中，因为这样的肿瘤可导致舌头变得麻痹。因此，即使该治疗对肿瘤有效，所影响的动物也可能本身无法进行饲喂。每只猫进行重复的治疗，持续较长的一段时间。在治疗期间每天以及在每次后续复查时采集肿瘤图像。治疗后，对每只猫都进行另一次CT扫描。此后，每8周评价CT扫描和胸透图像。这些数据用于评价与对照组相比的存活、相应和毒性。阳性相应可需要肿瘤退化的证据，一般伴随生活质量的改善和/或寿命的增加。
[0212] 此外，还可测试其他自发的动物肿瘤，例如狗、猫和狒狒纤维肉瘤、腺癌、淋巴瘤、软骨瘤或平滑肌肉瘤。其中，狗和猫的乳腺癌是典型模型，因为其外观和行为与人的乳腺癌非常相似。然而，该模型的使用受限于动物中这类肿瘤的稀有发生率。
[0213] 一种在携带移植肿瘤的动物模型中评价测试多肽的方法是在治疗之前和之后测量肿瘤的尺寸。传统上，用游标卡尺对移植肿瘤进行二维或三维的测量。限制于二维的测量并非总是准确地反映肿瘤的大小；因此，常常通过数学公式将其中转化成相应的体积。然而，肿瘤尺寸的测量可能非常不准确。多肽候选物的治疗效果常常可通过治疗诱导的生长延迟和特异性生长延迟来得到更好的描述。在肿瘤生长的描述中的另一个重要变量是肿瘤体积倍增时间。还有人介绍了计算和描述肿瘤生长的计算机程序，参见例如Rygaard和Spang-Thomsen，Proc.6th Int.免疫缺乏的动物实验研究， Wu和Sheng(巴塞尔,1989)，第301页，通过引用将其整体并入本文中。
[0214] 此外，可通过使用用于生产转基因动物的标准技术将EGFL7基因的编码部分引入目的动物的基因组中来工程化重组(转基因)动物模型。可充当转基因操作的靶标的动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非人灵长类，例如狒狒、黑猩猩和猴。本领域已知的将转基因引入这些动物中的技术包括原核显微注射(美国专利No.4,873,191)；逆转录病毒介导的向生殖细胞系中的基因传递(例如Van der Putten等，美国国家科学院院刊82:6148-615(1985))；胚胎干细胞中的基因靶向(Thompson等，细胞56:313-321(1989))；胚胎的电穿孔(Lo，分子细胞生物学杂志3:1803-1814(1983))；精子介导的基因传递，Lavitrano等，细胞57:717-73(1989)。纵览可参见例如美国专利No.4,736,866。这些文献中的每一篇都通过引用将其整体并入本文。
[0215] 转基因动物还包括仅部分它们的细胞携带转基因的动物(“嵌合动物”)。转基因可作为单独的转基因整合，或以多连体的形式整合，例如头-头或头-尾串联重复。转基因还可通过以下方法选择性地引入特定细胞中，例如Lasko等，美国国家科学院院刊89:6232-636(1992)中所述的技术。可通过标准技术来监测转基因在转基因动物中的表达。
例如，可使用Southern印迹分析或PCR扩增来鉴定转基因的整合。接着，可使用例如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学等技术来分析mRNA表达水平。然后，这样的动物可用于测试与EGFL7相互作用的候选多肽。
例如，可使用Southern印迹分析或PCR扩增来鉴定转基因的整合。接着，可使用例如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学等技术来分析mRNA表达水平。然后，这样的动物可用于测试与EGFL7相互作用的候选多肽。
[0216] 本领域已知的测量血管发生的其他体外和体内测试也适于本文中对于EGFL7相互作用的候选多肽的效力。在一个实例中，将诸如可制备的或通过市售得到的人脐静脉内5
皮细胞(HUVEC)或人微血管内皮细胞(HMVEC)等内皮细胞以2×10细胞/ml的浓度与纤维蛋白原混合(在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中5mg/ml，以1:1(v/v)比率)。添加凝血酶(5单位/ml终浓度)，并将混合物立即转移至24孔板中(0.5ml每孔)。使纤维蛋白凝胶形成，然后向每个孔中添加VEGF和bFGF(各为5ng/ml终浓度)，以及候选多肽。于37℃下5％CO2中孵育细胞4天，期间计数每个孔的细胞，并将细胞分类成圆形、无分支延伸型、一分支延伸型或者2分支或更多分支延伸型。结果通常表示为，每个浓度多肽5个不同孔的平均值。通常而言，在存在例如与EGFL7相互作用的多肽等血管生成抑制剂的情况下，细胞保持圆形或形成未分化的管(例如，0分支或1分支)。
皮细胞(HUVEC)或人微血管内皮细胞(HMVEC)等内皮细胞以2×10细胞/ml的浓度与纤维蛋白原混合(在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中5mg/ml，以1:1(v/v)比率)。添加凝血酶(5单位/ml终浓度)，并将混合物立即转移至24孔板中(0.5ml每孔)。使纤维蛋白凝胶形成，然后向每个孔中添加VEGF和bFGF(各为5ng/ml终浓度)，以及候选多肽。于37℃下5％CO2中孵育细胞4天，期间计数每个孔的细胞，并将细胞分类成圆形、无分支延伸型、一分支延伸型或者2分支或更多分支延伸型。结果通常表示为，每个浓度多肽5个不同孔的平均值。通常而言，在存在例如与EGFL7相互作用的多肽等血管生成抑制剂的情况下，细胞保持圆形或形成未分化的管(例如，0分支或1分支)。
[0217] 本领域认识到该测定对体内抗血管生成具有预测性(Min等，1996，通过引用将其整体并入本文)。
[0218] 在一个替选测定中，当在MATRIGELTM上培养内皮细胞时观察到内皮细胞管的形成4
(Schnaper等，1995，通过引用将其整体并入本文)。将内皮细胞(1×10细胞/孔)转移TM
至覆盖有MATRIGEL 的24孔板上，并在48h后定量管的形成。通过与内皮细胞同时添加或在添加内皮细胞后的多个时间点添加多肽来测试与EGFL7相互作用的候选多肽。
(Schnaper等，1995，通过引用将其整体并入本文)。将内皮细胞(1×10细胞/孔)转移TM
至覆盖有MATRIGEL 的24孔板上，并在48h后定量管的形成。通过与内皮细胞同时添加或在添加内皮细胞后的多个时间点添加多肽来测试与EGFL7相互作用的候选多肽。
[0219] 该测定通过将内皮细胞呈递至特定的基底膜(即，迁移中和分化中的内皮细胞预TM期首先遇到的基质层)类型来模拟血管发生。除了结合生长因子以外，Matrigel (和原位基底膜)或其蛋白水解产物中发现的基质组分还可刺激内皮细胞管形成，这使该模型与先前描述的纤维蛋白凝胶血管发生模型互补(Blood和Zetter，1990；Odedra和Weiss，1991，通过引用将每一篇文献的整体并入本文)。在两种测定中，与EGFL7相互作用的候选多肽都抑制内皮细胞管形成，这提示这些多肽还将具有体内抗血管生成活性。
[0220] 此外，广泛接受的功能性血管发生测定以及由此而来的抗血管生成试剂测定新血管化的角膜微 囊袋测定和鸡绒毛膜尿囊膜(CAM)测定。通过引用具体将美国专利No.5,712,291并入本文，以示出角膜微囊袋测定和CAM测定对鉴定用于极宽范围的血管生成疾病的治疗的试剂具有充分的预测性。
[0221] 还通过引用具体将美国专利No.5,001,116并入本文以描述CAM测定。总之，在第3天或第4天，从壳移除已受精的鸡胚胎，并将包含测试化合物的甲基纤维素盘移植到绒毛膜尿囊膜上。约48h后检测胚胎，如果在甲基纤维素盘周围出现清晰的无血管区，则测量该区的直径。如在美国专利No.5,712,291(通过引用具体并入本文以做证明之用)中公开的，在本发明的上下文中，任何无血管区的出现都足以证明抗血管生成多肽。该区越大则多肽越有效。
[0222] 新血管化的角膜微囊袋可使用大鼠或兔子的角膜来实施。如美国专利No.5,712,291和5,871,723所证实，该体内模型被广泛接受为具有临床用途的预测性，每一篇专利都通过引用并入本文，用于证明的目的。
[0223] 在本发明中，角膜微囊袋测定可用于鉴定与EGFL7相互作用的多肽。这由血管发生的显著减少所证明，如通过始终观察到的并且一般来说明显的角膜内血管数的减少来表示。这样的响应通常定义为当与候选多肽接触时这些角膜仅示出显示没有持续生长证据的偶然的萌芽和/或发卡环。
[0224] 利用EGFL7相互作用多肽进行治疗和诊断的方法
[0225] EGFL7相互作用多肽在文中所述的体内和/或体外测定中均显示出活性，很可能适用于治疗与病理性血管生成相关的各种紊乱，其中包括影响血管的全身性紊乱。其治疗用途包括动脉、毛细血管、静脉和/或淋巴管疾病。
[0226] EGFL7相互作用多肽还可用于抑制红细胞生成或粒细胞生成，抑制伤口愈合或组织再生以及用于关于组织(例如，结缔组织、皮肤、骨骼、软骨、肌肉、肺脏或肾脏)过度再生的相关治疗，抑制血管生成，抑制内皮细胞迁移，抑制血管平滑肌生长和内皮细胞生成。举例说明，EGFL7相互作用多肽可用于限制伤口愈合过程中的结缔组织过度生成或限制肺纤维化(如果EGFL7能促进此类生成)，因而，此类多肽可用于治疗急性心肌梗死和心力衰竭。
[0227] 特殊类型疾病介绍如下，EGFL7相互作用多肽可用于特定部位药剂递送的靶向部分，或者用于治疗或预防紊乱。动脉粥样硬化为一种以脂质蓄积、平滑肌细胞增殖和动脉壁内纤维组织形成所致的动脉内膜增厚斑块堆积为特征的疾病。该病可影响任何器官中的大动脉、中动脉和小动脉。已知内皮和血管平滑肌细胞功能变化在调节这些斑块的聚积和消退中具有重要作用。
[0228] 高血压的特征是全身动脉系统、肺动脉系统或门静脉系统的血压升高。血压升高可能是由内皮功能受损和/或血管疾病所致，血压升高也可能引起内皮功能受损和/或血管疾病。
[0229] 炎症性血管炎包括巨细胞动脉炎、大动脉炎、结节性多动脉炎(其中包括微血管病型)、川崎病、显微镜下多血管炎、韦格纳肉芽肿和各种感染相关性血管疾患(其中包括亨诺-许兰氏紫癜)。已证实内皮细胞功能改变在这种疾病中起到了重要作用。
[0230] 雷诺氏病和雷诺现象的特征是四肢遇冷后循环系统间断性异常损害。已证实内皮细胞功能改变在这种疾病中起到了重要作用。
[0231] 动脉瘤为与内皮细胞和/或血管平滑肌细胞改变相关的动脉树或静脉树囊形扩张或梭形扩张。
[0233] 血栓性静脉炎和淋巴管炎分别为静脉和淋巴管炎症性病变，可由内皮细胞功能改变所致和/或可能导致内皮细胞功能改变。与此类似，淋巴水肿为一种内皮细胞功能改变所致的淋巴管损害性疾病。
[0234] 良性和恶性血管肿瘤家族的特征是脉管系统的细胞基本组分增生和生长异常。举例说明，淋巴管瘤为淋巴系统良性肿瘤，为常见于新生儿的先天性(往往呈囊性)淋巴管畸形。
[0235] 囊性肿瘤倾向于长入邻近组织，常见于颈区和腋区。也见于四肢的软组织。主要症状有扩张性(有时呈网状)结构化淋巴管以及有结缔组织包裹的淋巴囊肿。认为淋巴管瘤是由于连接胚胎淋巴管不当或其缺陷引起的，从而导致局部淋巴引流受损。
[0236] EGFL7相互作用多肽的另一种用途是预防或抑制肿瘤血管生成，其中涉及可使肿瘤生长和/或转移的血管化。因而，EGFL7相互作用多肽大体上可用于治疗和/或预防癌症。
[0237] EGFL7相互作用多肽也可用于治疗眼内新生血管疾病。
[0239] 其他治疗方案可与EGFL7相互作用多肽结合使用。举例说明，如果用此多肽治疗癌症，接受此类多肽治疗的患者可能还要接受放疗。或者，可能还要给予患者化疗剂。此类化疗剂的制剂和给药方案可以生产商说明书为依据，或者由经验丰富的医生根据经验确定。此类化疗的制剂和给药方案参见Chemotherapy Service，Ed.,M.C.Perry(Williams&Wilkins出版社：巴尔的摩，马里兰州，1992)，以引用的方式将其并入本文中。化疗剂可在给予此多肽之前或之后使用，也可与多肽同时使用。
[0240] 如果用此多肽治疗癌症，也可考虑EGFL7抗体，例如美国2007/0031437中所述的抗体(以引用的方式并入本文中)或抗其他肿瘤相关抗原的其他抗体，例如与ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或VEGF受体中的一种或多种结合的抗体。另外，抗体适合逐次接种或与放疗联合使用，而不管是否涉及到辐照或使用放射性物质。又或，结合相同抗原或者结合文中所述的两种或更多种不同抗原的两种或更多种抗体可同时给予患者。有时，给予患者一种或多种细胞因子也可能是有益的。在一个方面，所述多肽与生长抑制剂联合给药。举例说明，可首先给予生长抑制剂，随后给予本发明中的相互作用多肽。然而，也可考虑同步给药或首先给予此多肽。
[0241] 生长抑制剂的适当剂量就是当前使用的剂量，由于生长抑制剂与所述多肽具有联合作用(协同作用)，可下调剂量。
[0242] 在一个方面，联合疗法可破坏肿瘤血管化。在肿瘤患者中给予已确定的有效治疗剂量的EGFL7相互作用多肽和抗体(例如，抗VEGF)，举例说明，通过观察肿瘤坏死或其转移灶(如果有)进行确定。可进一步给予其他抗肿瘤剂，例如α-干扰素、β-干扰素或γ-干扰素、抗HER2抗体、heregulin因子、抗heregulin抗体、D-因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或者给予能促进肿瘤内微血管凝血的制剂，例如抗蛋白C抗体、抗蛋白S抗体或C4b结合蛋白(参见，WO 91/01753，以引用的方式并入本文中)或者加热或辐射。
[0243] 在其他几个方面，将FGF或PDGF拮抗剂，例如抗FGF或抗PDGF中和抗体，与EGFL7相互作用多肽一同给予患者。在伤口愈合期间或需要新生血管化时，可暂停多肽治疗。
[0244] 在另一方面，EGFL7可作为靶标用于筛查、诊断疾病和/或预测疾病预后。举例说明，EGFL7是一种在肿瘤和血管生成旺盛的其他组织内皮细胞中被上调的蛋白质。EGFL7表达与几种类型癌症(其 中包括恶性胶质瘤、肝细胞癌和非小细胞肺癌等等)的预后不佳相关，EGFL7可作为临床相关肿瘤和转移的一种生物标志物。尤其是，按照上文所述方法将有效诊断或预后用量的EGFL7相互作用多肽给予受试者，或者将其用于半体内肿瘤样本，例如活检样本。此类用量可足以治疗癌症，或者仅够检出与EGFL7结合的结合型EGFL7相互作用多肽。EGFL7相互作用多肽通常按照上述说明进行标记，以便于成像及其在体内分布或便于测定样本。对于应进一步接受检查以便做出诊断的受试者，结合型EGFL7多肽可作为一个筛查指标，或者存在结合型EGFL7本身就具有诊断作用。此外，如果患者已被诊断出癌症，与不存在结合型EGFL7多肽时相比，存在结合型EGFL7多肽可作为一个预后不佳的指标。EGFL7多肽结合可定性或量化，因此，在几个方面可用于获得每位受试者的疾病状态、级别和预后方面的更具体信息。
[0245] EGFL7多肽也可与其他诊断分子或预后分子(例如某些肿瘤中过表达的生长受体)联合使用，从而可获得有关所述肿瘤的更多具体信息。
[0246] 以上披露大致介绍了本发明。为能更完整地理解，可参照下文中的具体实施例。介绍的这些实施例仅做说明之用，并非用于限制本发明的范围。等价物的形式与置换改变也应被视为可能建议或采取权宜之计的情况。尽管文中采用了专用术语，此类术语具有描述性意义，不用于限制目的。实施例
[0247] 实施例1-与 EGFL7相互作用的候选多肽的鉴定
[0248] 方法：
[0249] 重组EGFL7的克隆和表达
[0250] 通过PCR(正向引物：5'-CACCATGAGGGGCTCTCAGGAGGTG-3'，以及反向引物：5'-CTACGAGTCI I ICJI IGCAGGAGCAG-3')扩增EGFL7cDNA，并根据手册说明将其克隆至pENTR/TEV/D-TOPO载体(Invitrogen)中。通过重组将TEV-EGFL7区克隆至pDEST20质粒中，并且根据Invitrogen手册说明分离重组杆状病毒质粒DNA。
[0251] 重组GST-EGFL7的纯化
[0252] 重组杆状病毒由使用CellFECTIN转染试剂(Invitrogen)以1mg杆状病毒质粒DNA转染的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21细胞产生。根据Invitrogen手册中描述的标准规程进行病毒的噬斑滴定。将Sf21细胞接种于具有约80％汇合度的T175细胞培养烧瓶中。当细胞贴壁后，去除介质，并用重组杆状病毒以20的感染复数(MOI)于27℃下感染细胞72h。将细胞裂解物收集于0.1％NP40中，并使其通过1mL的谷胱甘肽-琼脂糖树脂。然后用25mL缓冲剂(150mM NaCI、20mM Tris-HCI、pH 7-9)洗涤柱子，并用添加有20mM还原型谷胱甘肽的缓冲剂洗脱。将洗脱液收集成1mL的级分，并储存于4℃下。使用SDS-PAGE并通过银染显色来分析所有洗脱级分。
[0253] EGFL7-磁珠的生成
[0254] 将包含EGFL7重组蛋白的所有级分汇集到一起。将30μg抗GST抗体混合于蛋白质溶液中，并用370mg MagnaBind蛋白质A/G磁珠(Thermo Scientific)于4℃下孵育15min。用洗涤缓冲剂洗涤几次后，通过在SDS上载缓冲剂中煮沸从而使蛋白质从磁珠中释放，并通过Western印迹使用抗EGFL7多克隆抗体(R&D Systems)对蛋白质进行分析。
[0255] 筛选OBOC文库
[0256] 在筛选前使用70％乙醇、蒸馏水和结合缓冲剂(50mM Na2HPO4、150mM NaCl、2mM CaCl2、0.5 M L-精氨酸、pH 7.4)对OBOC肽文库珠进行充分洗涤。使磁珠与文库珠在玻璃小瓶中混合，并于37℃下孵育1h。将强磁体放置于该小瓶的一侧，并如Cho等所描述的来筛选文库。汇集阳性点，并用乙醇和水充分洗涤。如Cho等所描述使用表达tdTomato的EGFL7-阳性HT1080纤维肉瘤细胞和表达GFP的EGFL7阴性MDA435乳腺癌细胞来进行二级的细胞基筛选。收集点珠，并如Cho等所描述使用MALDI TOF MS/MS对肽进行珠上测序。
[0257] 结果：
[0258] 纯化重组EGFL7蛋白(图2A和2B)，并将其缀合于磁珠上。进行Western印迹分析以通过使用多克隆抗EGFL7抗体来显示经纯化的EGFL7成功地缀合于磁珠上(图2C)。然后使经EGFL7缀合的磁珠与OBOC重组肽文库混合，并使用强钕磁体分离阳性点。使用EGFL7阳性的红色细胞(TH1080-tdT-EGFL7v5)和EGFL7阴性的绿色细胞(MDA435-GFP)进行二级细胞结合测定，将该测定用于鉴定对展示于细胞表面的EGFL7具有高亲和力的肽(图2D)。在倒置荧光显微镜下检查磁珠，并手动分离与红色细胞强烈关联但是与绿色细胞几乎没有或完全没有相互作用的点珠。
[0259] 使用OBOC肽文库筛选法鉴定出，序列HMYFLLGH、DPYDHEFR、AYYEEAYE、RYVDHEDW、EWELHAEE、SQSSMYPS、RYQLHHPR和WYKLHPTM对EGFL7具有高亲和力。
[0260] 其他示例性的与EGFL7相互作用的多肽在表1中示出。表1中标记为“LCE#”的柱1表示化合物参考数。表1中标记为“序列”的柱2表示肽的氨基酸序列。表1中标记为“纯度”的柱3表示使用来自反相HPLC分析的220nm处的UV吸收度实验确定的化学纯度。表1中标记为“MS Calc”的柱4表示当使用电喷雾(阳离子模式)质谱仪时预期的理论的肽的质荷比。表1中标记为“MS Expt”的柱5表示当使用电喷雾(阳离子模式)质谱仪时实验确定的肽的质荷比。
[0261] 表1.EGFL7相互作用多肽。
[0262]
[0263] 注：小写字母表示D-氨基酸。
[0264] 实施例2–确定来源自EGFL7的备选 EGFL7相互作用多肽
[0265] 选择三个来源自EGFL7的高度保守序列，这些序列不存在于EGFL8中。确定的序列为GSLLVHSFQQLG、KLQLVLAPLHSLAS、和RSPGLAPARPRYA。
[0266] 实施例3–验证所确定的EGFL7相互作用多肽
[0267] 方法：
[0268] 结合试验
[0269] 按照GWC说明书中的标准方案将肽固定到金斑点上。然后将肽置于500微升纯化的EGFL7蛋白质中。使用V++精密数字成像系统(V++Precision Digital Imaging Systems，软件版本为5.0)收集每个含有肽的金斑点的反射率改变百分数(％R)，然后使用GraphPad Prism中的“结合后解离”公式计算解离常数(KD)。
[0270] 体外血管生成
[0271] 96孔板包被每孔50mL的基质胶。在基质胶固化之后，将大约2000个HUVECs接种到聚合后的基质上。每孔加入VEGF(10ng/ml)和bFGF(10ng/ml)作为血管生成促进因子。在相应孔中加入浓度为200mM的HMYFLLGH或FLAG肽(对照)，然后在37℃和5％CO2条件下孵育。4-6h后，在倒置显微镜下进行细胞成像，对每个孔中每个视野下分支点的数量进行计数，以定量血管形成程度。
[0272] 体内鸡绒毛尿囊膜(CAM)血管生成测定
[0273] 鸡胚胎绒毛尿囊膜(CAM)种植测定用于测量新血管生成。当含有或者不含HMYFLLGH时(终浓度为200μM)，分别在胶原沉浸网格(植入物在第9天的无壳胚胎的CAM上放置3天，然后使用Zeiss Lumar荧光体视显微镜对其进行成像。通过计算每个网格中包含可见血管格子的百分数来定量血管生成水平。
[0274] 结果：
[0275] 使用上述结合试验，对于GSLLVHSFQQLG和HMYFLLGH，计算所得的结合亲和力分别为14.7nM和13.2nM(图3)。
[0276] 体外血管生成测定表明HMYFLLGH与对照(FLAG肽和水)相比，在VEGF和FGF存在时，会抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在基质胶上的生长和管形成(图4)。通过对HUVEC细胞形成的分支点数量计数来定量生长水平(图4)。
[0277] 体内血管生成测定表明HMYFLLGH在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型中显著抑制血管生成。在纤维网格上培养HT1080细胞来刺激来自网格上CAM血管的聚集(图4)。通过计算网格中包含可见血管格子的百分数来定量血管生成水平(用红色箭头表示)(图5)。
[0278] 体外血管生成测定同样用于确定GSLLVHSFQQLG或HMYFLLGH作用中不需要的缺口结合域(图6)。
[0279] 实施例4–使用EGFL7结合多肽进行成像
[0280] 方法：
[0281] FITC-E7-p72(FITC-HMYFLLGH) 和 FITC-E7-p72(dAA) 的 细 胞 摄 取 试 验(FITC-HMYFLLGH(dAA))
[0282] 通过使用针对蛋白质外显子5的siRNA和INTERFERin转染试剂(HUVECs-si)得到EGFL7敲除的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。将野生型HUVECs和HUVECs-si细胞接种到6孔组织培养板的不同孔中，细胞融合度大约为80％。细胞在含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2条件下孵育过夜。将每个孔中的培养基去除，替换为预冷的PBS。将FITC-E7-p72(FITC-HMYFLLGH)加入细胞，终浓度为1mM，在4℃下孵育1h。使用EDTA将细胞从孔中脱附下来，用PBS清洗三次，并且用4％的甲醛固定。使用流式细胞术来分析荧光标记肽的摄取。
[0283] 结果：
[0284] 通过流式细胞术来评价HUVECs对荧光标记HMYFLLGH肽的摄取。图7A中显示，Western印迹分析表明使用针对外显子5的siRNA敲除了EGFL7。使用流式细胞术分析阴性siRNA(对照)或EGFL7 siRNA处理后的HUVEC细胞对FITC标记HMYFLLGH的摄取，结果见图7B。图7C显示GraphPad Prism(5.0版本)绘制的平均细胞荧光曲线图。
[0285] 实施例5-定向体内血管发生测定 (DIVAA)
[0286] 方法：
[0287] 根据制造商的建议规程(Trevigen,Gaithersburg,MD)使用DIVAA试剂盒评估7周大的雌性裸鼠(Crl:NU-Foxnlnu；Charles River)的血管发生。用基底膜提取物(BME)、BME+50,000HT1080细胞或BME+50,000HT1080+GSLLVHSFQQLG(LCE71)或HMYFLLGH(LCE72/E7-p72)填充血管反应管，并将其经皮下插入小鼠体内。10天后，处死小鼠，移出血管反应器，并将血管反应器内容物转移至离心管中。在FITC-凝集素溶液中标记内皮细胞过夜，并使用板读数器定量荧光。所有涉及动物的实验都经西安大略大学动物使用委员会(规程No.2008-101)批准。
[0288] 结果：
[0289] 图9A示出，200μM GSLLVHSFOOLG能够抑制装有基底膜提取物(BME)的血管反应器中HT1080细胞介导的血管发生。图9B示出，200μM HMYFLLGH能够抑制装有基底膜提取物(BME)的血管反应器中HT1080细胞介导的血管发生。
[0290] 实施例6-细胞粘着测定和EA.hy926内皮细胞中黏着斑蛋白的免疫细胞化学定位[0291] 方法：
[0292] 对于粘着测定，使用EGFL7siRNA(Sigma,Canada)或乱序的siRIMA(阴性对照)(Sigma,加拿大)转染EA.hy926内皮衍生细胞。将EA.hy926内皮衍生细胞接种于6孔板上，并使用INTEFERin转染试剂(Polyplus transfection)用EGFL7siRNA或乱序siRNA以40nM的终浓度转染。通过胰酶/EDTA处理使经EGFL7siRNA或乱序siRNA(阴性对照)处理的EA.hy926内皮衍生细胞分散，并将其重悬于包含1％血清的DMEM中。将细胞平铺于96孔板中，并用200μM乱序的GSLLVHSFQQLG肽Flag(对照)于37℃下处理4h。然后用PBS洗涤细胞三次，并用4％甲醛固定。用Hoechst(Pierce)染色细胞核，并在EVOS fl倒置荧光显微镜(AMG)下成像。使用4.0版的Volocity确定仍然粘附在板上的细胞数。使用单向方差分析和Tukey事后测试进行所有统计。
[0293] 对于黏着斑蛋白染色，将EA.hy926细胞平铺于盖玻片上，并用200μM乱序(对照)肽或GSLLVHSFQQLG肽与37℃下在包含1％血清的DMEM中处理4h。然后用PBS洗涤细胞三次，并用4％甲醛固定。用包含0.2％Triton-X的PBS对细胞进行增透2min，然后用5％山羊血清和1％BSA于25℃下封闭1h。以1:500的稀释度添加抗黏着斑蛋白一抗，并于25℃下孵育1h。用PBS洗涤细胞三次，并以1:1000的稀释度用Alexa Fluor594二抗(Invitrogen,加拿大)于25℃下孵育1h。然后用PBS洗涤细胞三次。接着以1:1000的稀释度用麦胚凝集素(WGA)于室温下处理细胞10min。洗涤细胞两次，用包含DAPI的ProLong Gold试剂洗涤细胞两次，并在Zeiss涡流片共聚焦显微镜下成像。采集通过每个细胞的Z叠加影像。
[0294] 结果：
[0295] 图10示出，GSLLVHSFQQLG(LCE71)不改变人内皮细胞的粘着性。图10A示出了细胞粘着测定的结果，其中当对细胞使用乱序siRNA或当与对照细胞相比向细胞施用200uM GSLLVHSFQQLG(LCE71)时，EA.hy926内皮细胞的粘着未示出不同。另一方面，当使用特异性敲除EGFL7的siRNA时，细胞粘着显著降低，这指示，EGFL7在细胞粘着中是重要的介导物。图10B示出了用GSLLVHSFQQLG(LCE71)处理之前或之后，以黏着斑蛋白(橙色)、DAPI(蓝色)和WGA质膜着染色剂(绿色)进行了染色的EA.hy926内皮细胞。在这两种情况下都观察到盖玻片上有粘着斑形成。
[0296] 实施例7-磷酸 -RTK分析阵列
[0297] 方法：
[0298] 通过用胰酶/EDTA处理使HUVEC分散，并将其重悬于EGM中。将细胞平铺于T-75烧瓶中，并用200μM Flag或E7C13肽于37℃下在EGM中处理4h。收集细胞，并根据人磷酸受体酪氨酸激酶阵列(Human Phospho-Receptor Tyrosine Kinase(RTK)Array Kit)(R&D systems)制造商的指南使其在阵列缓冲剂1中裂解。封闭后，根据制造商的指南每个磷酸-RTK阵列膜都用100μg裂解产物孵育。洗涤膜，并用抗磷酸-HRP进行孵育。根据制造商指南通过增强的化学发光(ECL)检测活化的酪氨酸激酶。
[0299] 结果：
[0300] 图11描述了用GSLLVHSFQQLG(LCE71)处理后HUVEC中的RTK活化。图11A示出了展示49种用来自以对照肽或200uM GSLLVHSFQQLG(LCE71)肽处理的HUVEC的裂解物孵育的不同人RTK抗体的阵列膜。图11B示出了阵列坐标(左)及其相应的RTK(右表)。图11C是示出用GSLLVHSFQQLG肽处理后HUVEC 中的RTK活化谱的瀑布图。可见到，几种RTK的磷酸化提高，例如Mer和成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)，并且另几种RTK的磷酸化降低，例如间变性淋巴瘤激酶(ALK)、血管内皮生长因子受体(VEGF R)和Axl。
[0301] 实施例8-磷酸酪氨酸的免疫沉淀
[0302] 方法：
[0303] 使HUVEC在T-75烧瓶中生长，并用200μM Flag或E7C13肽于37℃下在EGM中处理4h。用PBS洗涤细胞，并使其在RIPA缓冲剂(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM EDTA、1mM NaF、1mM PMSF、1％NP40、0.1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)中裂解。收集细胞裂解物，并使用BCA蛋白质测定来确定细胞浓度。从每个样品中留出一份裂解物用于Western印迹分析。
每份裂解物通过用30uL经洗涤的蛋白A/G珠在转子上于4℃孵育1h来进行预清除。通过离心(12,000×g，5秒)收集将预清除的裂解物，并用3μL 4G10抗磷酸抗体(Millipore)于4℃孵育2h。向每个样品中添加经洗涤的蛋白A/G珠(30μL)，并在转子上与4℃孵育
2h。通过离心(12,000×g，5秒)收集裂解物，并留出用于Western印迹分析。使用洗涤缓冲剂(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM EDTA、1mM NaF、1％NP40)洗涤免疫复合物五次，并通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析。蛋白样品在8％凝胶上跑电泳，并转移中PVDF膜(Bio-Rad)上。用抗AxI抗体(R&D Systems)和抗VEGFR-1抗体(Sigma,加拿大)完成经免疫沉淀的蛋白质的检测。
每份裂解物通过用30uL经洗涤的蛋白A/G珠在转子上于4℃孵育1h来进行预清除。通过离心(12,000×g，5秒)收集将预清除的裂解物，并用3μL 4G10抗磷酸抗体(Millipore)于4℃孵育2h。向每个样品中添加经洗涤的蛋白A/G珠(30μL)，并在转子上与4℃孵育
2h。通过离心(12,000×g，5秒)收集裂解物，并留出用于Western印迹分析。使用洗涤缓冲剂(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM EDTA、1mM NaF、1％NP40)洗涤免疫复合物五次，并通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析。蛋白样品在8％凝胶上跑电泳，并转移中PVDF膜(Bio-Rad)上。用抗AxI抗体(R&D Systems)和抗VEGFR-1抗体(Sigma,加拿大)完成经免疫沉淀的蛋白质的检测。
[0304] 结果：
[0305] 图12证实了分析阵列的结果，并示出，用GSLLVHSFQQLG(LCE71)处理后，HUVEC中Axl和VEGFR1 RTK的磷酸化降低。图12A示出了经对照Flag肽或200μMLCE71(GSLLVHSFQQLG)肽处理了4h的HUVECs的Western印迹。使用偶联于蛋白A/G琼脂糖上的4G10抗磷酸抗体进行免疫沉淀。使用抗AxI抗体、抗VEGFR1抗体和抗GAPDH抗体进行Western印迹分析。图12B是示出得自图12A中示出的Western印迹的每条带的平均信号强度的直方图。
[0306] 实施例9-DOTA-EGFL7肽的合成
[0307] 1.DOTA-LCE71(DOTA-GSLLVHSFQQLG)/DOTA-LCE72(DOTA-HMYFLLGH)的合成[0308] 通过用于具有树脂(Rink-Amide-MBHA)的固相合成的经典方法来合成该肽(方案1)：
[0309]
[0310] 反应条件：a)('Bu)3DOTA、HCTU、DIPEA、DMF；b)TFA/H20/Tis(95％/2.5％/2.5％)；69/71
c) GaCl3，NaOAc/HOAc pH＝4.5；d)TFA/DCM(2％)；e)哌啶/DMF(20％)。
c) GaCl3，NaOAc/HOAc pH＝4.5；d)TFA/DCM(2％)；e)哌啶/DMF(20％)。
[0311] 方案1.[Ga]DOTA-LCE71和[Ga]DOTA-LCE72的合成
[0312] a)Fmoc-脱保护：通过哌啶/DMF(40％，1.2ml)从树脂或肽的N端进行两次Fmoc保护基团的去除。使用DMF洗涤树脂6次。
[0313] b)肽偶联条件：通过Fmoc-氨基酸以及DMF中的HCTU(4当量)和DMF中的DIPEA(8当量)于75℃下进行偶联反应5min，并用DMF洗涤。使DOTA(t-Bu)3和Fmoc-组氨酸在室温下偶联1h。
[0314] c)从树脂切割肽：最后用切割混合物TFA/H20/TIS 95％/2.5％/2.5％处理肽6h。
[0315] d)从树脂上具有Fmoc保护的N端的肽切割mtt保护基团。使用混合物(TFA/TIS/DCM：2％/5％/93％)切割mtt基团2mL×6。
[0316] e)肽纯化：从树脂切割肽后，用冷叔丁基甲基醚稀释未加工的肽，并通过离心机使其沉淀出来。在HPLC上纯化未加工的肽，并冻干，得到白色固体(对于DOTA-LCE71，35mg，9.7％；对于DOTA-LCE72，32mg，9.8％)。
[0317]
[0318] 2.[69/71Ga]DOTA-LCE71/LCE72(-GSLLVHSFQQLG/HMYFLLGH)的合成
[0319] 将DOTA-LCE71/DOTA-LCE72(10mg) 溶 解 于NaOAc/HOAc(pH ＝5，0.1M)，添 加GaCl3(5mg)， 并于70℃下加热30min。在HPLC上纯化反应混委会，并冻干，得到白色固体。69/71 69/71
(对于[ Ga]DOTA-LCE71，3mg；对于[ Ga]DOTA-LCE72，2mg)。
(对于[ Ga]DOTA-LCE71，3mg；对于[ Ga]DOTA-LCE72，2mg)。
[0320] 3.[68Ga]LCE71/LCE72多肽(-GSLLVHSFQ-QLG/HMYFLLGH)68
[ Ga]LCE71/LCE72多肽可根据方案2中所描述的艾克特-齐格勒模型自动合成
68 3+ 68
LCE71/LCE72多肽 Ga 羟乙基哌嗪乙硫磺PH＝3.5[ Ga]LCE71/LCE72多肽
[ Ga]LCE71/LCE72多肽可根据方案2中所描述的艾克特-齐格勒模型自动合成
68 3+ 68
LCE71/LCE72多肽 Ga 羟乙基哌嗪乙硫磺PH＝3.5[ Ga]LCE71/LCE72多肽
[0321] 方案2：[68Ga]DOTA-LCE71/LCE72放射
[0322] 使100μL HEPES缓冲剂(1M，pH＝3.5)中的10μg前体与N2溶液(300μL)中的68Ga3+混合。将反应小瓶于90℃下加热10min。将反应小瓶冷却至室温，并固定于Sep-Pak C-18料筒中。使用乙醇从Sep-Pak C-18料筒洗涤出产物。放射性化学物质的产量是，对于[68Ga]DOTA-LCE71为81％，对于[68Ga]DOTA-LCE72为53％。对于[68Ga]DOTA-LCE71，比活为3.3GBq/μmol，并且对于[68Ga]DOTA-LCE72，比活为9.4GBq/μmol。在分析HPLC上测量放射性化学物质的纯度(图13)。
[0323] 实施例10-肿瘤减小的研究
[0324] 我们评价了与EGFL7相互作用的肽对治疗以不同的纤维肉瘤、人前列腺癌细胞系和乳腺癌细胞系建立的裸鼠中的实体瘤的可能性。我们将对这些肽与对照肽或乱序肽的效率进行比较。然后，我们将把这些有前景的抗血管生成肽候选物的应用转化到临床上，以用于治疗患者的癌症。
[0325] 方案：
[0326] 在图14的流程图中示出了本方案。麻醉裸鼠，并对其经皮下注射前列腺癌(PC3)、乳腺癌(MDA231)或纤维肉瘤(HT1080)细胞至小鼠一侧下背中，以引起原位疾病。
[0327] 先生成剂量曲线以确定与EGFL7相互作用的肽的量可为动物所耐受。
[0328] 使肿瘤生长至约15mm3。
[0329] 基于剂量曲线，动物接受与EGFL7相互作用的肽(E7-p72/HMYFLLGH或LCE71/GSLLVHSFQQLG)或对照肽的尾静脉注射。此外，我们还组合施用了与EGFL7相互作用的肽和阿瓦斯汀，以评价所述肽是否能够比单独使用阿瓦斯汀的治疗提供协同治疗益处。
[0330] 对动物实施安乐死，并切除肿瘤、固定、冷冻并切片用于组织学分析。
[0331] 还可采集器官用于生物分布研究。
[0332] 预期结果:
[0333] 我 们 预 期，与 经 对 照 肽 处 理 的 小 鼠 相 比，经E7-p72(HMYFLLGH) 或LCE71(GSLLVHSFQQLG)治疗的小鼠肿瘤尺寸减小，并且寿命延长。我们还预期，使用这些肽的抗EGFL7治疗将比单独使用阿瓦斯汀的治疗提供额外的治疗益处。在我们的组织学分析中，基于上述实施例，我们预期在经与EGFL7相互作用的肽治疗的小鼠中见到由于可预测的血管发生的降低而导致的肿瘤相关血管的减少。
[0334] 上述公开内容一般性地描述了本发明。虽然此处使用了具体的术语，但是这些术语旨在进行描述性，而非限制本发明。
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