用于处理组织学、尸体、细胞学样品的组合物
阅读：779发布：2020-05-15
专利汇可以提供用于处理组织学、尸体、细胞学样品的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及制备 组织学 、尸体、细胞学样品或类似样品的组合物以用于其分析，所述组合物无毒无害且能立即使 生物 样品脱 水 和透化。，下面是用于处理组织学、尸体、细胞学样品的组合物专利的具体信息内容。
1.一种使生物样品脱水和透化的组合物，所述组合物包括以下或由其组成：a)至少一种2-乙基己酯，选自苯甲酸-2-乙基己酯、棕榈酸-2-乙基己酯、椰油酸-2-乙基己酯、硬脂酸-2-乙基己酯、乙酸-2-乙基己酯；b)乙醇和/或异丙醇，所述2-乙基己酯的浓度范围是30-
70％，乙醇的浓度范围是20-60％且异丙醇的浓度范围是10-30％，其中所述百分比是相对于组合物总体积的体积百分比。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述2-乙基己酯的浓度是50％，乙醇是
35％且异丙醇是15％，其中所述百分比是相对于组合物总体积的体积百分比。
3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物在生物样品处理中使生物样品脱水和透化的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样品选自组织学、细胞学、尸体样品。
5.如权利要求3-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述生物样品是待进行显微镜分析，免疫组化分析，基于ISH、FISH、CISH、PCR分子生物技术的分析的样品。
6.一种生物样品处理方法，所述方法包括以下阶段或由其组成：用权利要求1或2所述的组合物处理生物样品，使生物样品脱水和透化。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述处理在30℃-80℃范围的温度或室温进行。
8.如权利要求6-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自组织学、细胞学、尸体样品。
9.选自苯甲酸-2-乙基己酯、棕榈酸-2-乙基己酯、椰油酸-2-乙基己酯、硬脂酸-2-乙基己酯、乙酸-2-乙基己酯苯甲酸-2-乙基己酯的至少一种2-乙基己酯作为生物样品透化剂的应用。
用于处理组织学、尸体、细胞学样品的组合物
[0001] 本发明涉及处理组织学、尸体、细胞学样品的组合物。特别是，本发明涉及处理组织学、尸体、细胞学样品或类似样品的组合物，所述组合物无毒无害且能迅速使生物样品脱水和透化(diaphanization)。
[0003] 所述生物样品处理阶段一般包括以下阶段：a)固定期；b)脱水期；c)透化期；d)包埋期。
[0004] 在固定期中，将解剖结构例如获自手术室或尸体解剖室或外科手术室的解剖结构浸入固定液中，一般是缓冲福尔马林10％或醇或其它特定固定剂，由之后组织学或免疫组织化学分析的特性而定。此阶段的功能是终止蛋白质变性，防止蛋白质链脱离。因此，固定的目的在于维持组织结构。
[0006] 透化阶段能使生物样品之后包埋于石蜡中。出于此目的，使用与浸渍剂(例如石蜡)相容的溶剂，其在此阶段中取代水溶性溶剂。例如，透化剂(diaphanizing agent)是石蜡溶剂、二甲苯或二甲苯替代物如D-柠檬烯、异链石蜡、辛烷、丙酮。
[0007] 最后，样品进入石蜡包埋阶段，包括将样品浸入在约54-58℃融化的石蜡。此阶段中，组织中所含的透化溶剂被石蜡取代。样品纳入蜡块后，进行样品冷却和固化，这可允许用超薄切片机完成所需微米级的切片切割以用于显微镜观察。
[0008] 目前，通过能预设各试剂中持久时间、温度、压力和真空的装置来自动完成样品处理。一般，位置是12或15个且整个处理阶段的平均时间是12-18小时。时间取决于组织类型。通过常规标准方法，所述处理由乙醇步骤完成，乙醇梯度增加以使生物组织脱水。所述步骤先在50％乙醇中进行，随后在70％乙醇中，接着在80％乙醇中，再在90％乙醇中，随后在
96％乙醇中进行3步，最后在在无水的99.99％酒精中进行3步。此阶段结束时，样品组织中的所有水被乙醇取代。
96％乙醇中进行3步，最后在在无水的99.99％酒精中进行3步。此阶段结束时，样品组织中的所有水被乙醇取代。
[0009] 后面的步骤对应于旨在用石蜡相容性溶剂取代乙醇的透化期。一般，此阶段中，使用二甲苯或其替代物并完成3个不同位置的3个步骤，因为需要在第一步骤释放乙醇后，所述组织通过有清洗溶剂的另一位置。
[0010] 最后，在包埋期中，所述组织在3或4个于54-58℃熔化的石蜡位置处进行处理。
[0011] 概括而言，10％福尔马林固定后，现有工艺水平提供以下步骤和时间：
[0012] 1,00小时，乙醇50％
[0013] 1,00小时，乙醇70％
[0014] 1,00小时，乙醇80％
[0015] 1,00小时，乙醇96％
[0016] 1,00小时，乙醇96％
[0017] 1.30小时，乙醇99,99％
[0018] 1.30小时，乙醇99,99％
[0019] 1,00小时，二甲苯或其替代物
[0020] 1,00小时，二甲苯或其替代物
[0021] 1.30小时，二甲苯或其替代物
[0022] 1.30小时，石蜡
[0023] 2,00小时，石蜡
[0024] 2,00小时，石蜡。
[0025] 基于上面所述，显然已知方法存在数种劣势：使用不同试剂，有必要准备梯度增加的乙醇、二甲苯或其替代物；使用高挥发性溶剂(乙醇或二甲苯)；使用导致过敏的物质，如二甲苯、甲苯、辛烷、d-柠檬烯、松节油、丙酮、异链石蜡，或对操作者有害且一些情况下有毒的物质，如二甲苯、甲苯、辛烷、丙酮、异链石蜡；提供用于处理的长时间和众多位置。
[0026] 已知其它处理方法，所述方法使用乙醇、异丙醇和原油衍生烃类如辛烷或异链石蜡的混合物来取代乙醇和二甲苯或二甲苯替代物。特别地，EP0822403和EP 1508026专利描述基于使用混合物的组织处理方法，所述混合物能同时完成样品脱水和透化。这类混合物由辛烷(或异链石蜡)、异丙醇和乙醇构成。然而，即使这些方法减少样品处理时间，使用诸如辛烷或异链石蜡等物质存在高挥发性和对操作者及环境有毒的严重缺点。
[0027] 鉴于以上所述，显然需要提供能克服已知试剂缺点的新试剂。
[0028] 本发明的发明者现已发现选自下组的2-乙基己酯具有透化能力：苯甲酸-2-乙基己酯、棕榈酸-2-乙基己酯、椰油酸-2-乙基己酯、硬脂酸-2-乙基己酯、乙酸-2-乙基己酯，优选苯甲酸-2-乙基己酯。因此，发明者制备了脱水和透化组合物以处理待分析的生物样品，所述组合物没有对人致癌的多环芳烃。不同于已知试剂，根据关于保护工人免受工作中暴露于化学、物理和生物试剂危险和关于改善工人安全和健康的欧盟指令，本发明所述组合物对操作者既无害也无毒。此外，根据关于工作场所安全和就更高环境尊重而言更高生物降解性(约88％)的欧盟指令，本发明的组合物总是呈现低挥发性。
[0029] 根据本发明使用所述组合物能显著减少样品处理时间并简化处理阶段。事实上，本发明所述组合物可取代脱水和透化阶段的已知试剂。因此，样品直接用本发明组合物作为独特试剂处理，或在10％福尔马林固定后用其处理，避免在乙醇中脱水和在二甲苯或其替代物中透化的不同阶段。此外，根据本发明方法，处理位置降低到3个，试剂中持久性的平均时间为1.30小时。更确切地，固定后的组织处理包括3个不同位置处同一试剂的3个组织步骤，随后转到石蜡包埋阶段，各1.30小时。
[0030] 因此，根据现有技术，就完整处理而言，处理时间降低到约9小时，常规处理为15或18小时。下面报道本发明所述处理示例，其应用于高百分比脂质(因此关键)且厚度为4mm的组织。低百分比脂质且厚度较薄的组织导致处理时间和位置显著减少。
[0031] 固定后，使用本发明组合物的处理可包括以下位置和时间：
[0032] 1.30小时，本发明的试剂对象；
[0033] 1.30小时，本发明的试剂对象；
[0034] 1.30小时，本发明的试剂对象；
[0035] 1.30小时，石蜡；
[0036] 1.30小时，石蜡；
[0037] 1.30小时，石蜡。
[0038] 或者，对于小型活检，所述方法可包括：
[0039] 5分钟，本发明的试剂对象；
[0040] 5分钟，本发明的试剂对象；
[0041] 5分钟，本发明的试剂对象；
[0042] 5分钟，本发明的试剂对象；
[0043] 5分钟，石蜡；
[0044] 5分钟，石蜡。
[0045] 在通过采用本发明所述组合物处理生物样品的实验中，观察到组织的细胞结构改善，即，保留诊断化合物形态和着色。为此，强调完成数个比较试验的事实，即，各样品分成更多部分且一部分样品根据传统方法进行处理，而另一部分用本发明组合物对象进行处理。比较通过传统方法和本发明组合物对象获得的结果，证实以下结果：切片和着色后，用本发明组合物对象处理的样品在显微镜下似乎更清楚且分辨更好。细胞结构看来更明确，因此能更易于读取和诊断解读。用相同处理时间比较进行进一步的免疫组化试验(抗原修复、抗体孵育、检测系统和发色时间相同)。只要涉及抗原-抗体反应的阳性和阴性，所述结果重叠，此外，用本发明组合物对象处理的样品在显微镜视野的抗原-抗体阳性位点中呈现更佳显色清晰度。因此，本发明所述处理使得诊断更可靠，特别是在需要完成关于组织区域阳性的定量分析的情况中。
[0046] 因此，本发明的特定目标是包括以下或由其组成的组合物：a)至少一种2-乙基己酯，选自苯甲酸-2-乙基己酯、棕榈酸-2-乙基己酯、椰油酸-2-乙基己酯、硬脂酸-2-乙基己酯、乙酸-2-乙基己酯；b)乙醇和/或异丙醇。优选使用异丙醇百分比低的乙醇混合物，由于认为异丙醇有刺激性和高挥发性，因而使用少量为佳。然而，所述样品可甚至用组合物处理，所述组合物仅含乙醇和2-乙基己酯，优选苯甲酸-2-乙基己酯，或仅含异丙醇和2-乙基己酯，优选苯甲酸-2-乙基己酯。
[0047] 优选地，在本发明所述组合物中，2-乙基己酯优选苯甲酸-2-乙基己酯的浓度范围是30-70％，乙醇的浓度范围是20-60％且异丙醇的浓度范围是10-30％，其中所述百分比是相对于组合物总体积的体积百分比。根据一个优选的实施方式，2-乙基己酯优选苯甲酸-2-乙基己酯的浓度是50％，乙醇是35％且异丙醇是15％，其中所述百分比是相对于组合物总体积的体积百分比。
[0048] 根据本发明的另一个实施方式，2-乙基己酯可被以下混合物取代：浓度为55-70％的戊二酸二异丁酯或戊二酸二甲酯，浓度为10-30％的己二酸二异丁酯或己二酸二甲酯和浓度为10-25％的琥珀酸二异丁酯或琥珀酸二甲酯，其中所述百分比是相对于戊二酸二异丁酯或戊二酸二甲酯、己二酸二异丁酯或己二酸二甲酯和琥珀酸二异丁酯或琥珀酸二甲酯的混合物总体积的体积百分比。
[0049] 本发明的另一目标是使用上面所定义组合物以处理生物样品，例如组织学、细胞学、尸体样品或类似物。根据本发明处理后，所述样品可进行显微镜分析，免疫组化分析，基于ISH、FISH、CISH、PCR分子生物技术的分析。
[0050] 本发明还涉及处理生物样品的方法，所述方法包括用上面所定义组合物的生物样品处理阶段或由其组成，如组织学、细胞学、尸体样品或类似物。根据本发明方法，样品处理可在20-30℃到80℃范围的温度或室温进行。
[0051] 本发明的另一目标是使用至少一种选自下组的2-乙基己酯：苯甲酸-2-乙基己酯、棕榈酸-2-乙基己酯、椰油酸-2-乙基己酯、硬脂酸-2-乙基己酯、乙酸-2-乙基己酯苯甲酸-2-乙基己酯，优选苯甲酸-2-乙基己酯，作为生物样品的透化剂。
[0052] 现在根据优选实施方式，通过阐述性而不是限制性方式描述本发明。
[0054] 将刚完成的活检(实施TAC，通过内窥镜或经皮方法)立即浸入本发明组合物(醇混合物50％+苯甲酸-2-乙基己酯50％)1小时(持续30分钟，无论所述样品是否已在福尔马林中固定)。完成处理包括：30分钟固定，各在本发明组合物对象中约7分钟的3个步骤，各在58℃融化的石蜡中约5分钟的2个步骤。因此，所述样品包埋于石蜡中并由超薄切片机切割。所得切片置于60°炉上约20分钟。之后，用苏木精-伊红完成初步染色(着色阶段，包括安装载玻片，标准持续时间是约1小时)。因此，在显微镜下观察载玻片。
[0055] 结论：在未“固定”活检情况中，从取活检时间到诊断制剂时间(即使是初步，但在任何情况中为形态学)需要仅3小时；在已“固定于福尔马林10％”的实验室所得活检情况中，约2个半小时。
[0056] 用含异丙醇、乙醇和辛烷或异链石蜡的溶液处理一部分相同生物样品。用本发明组合物对象处理的样品在苏木精-伊红的组化染色后，从形态角度和色彩收率(chromatic yield)方面都显示高级结构。因此，能观察到更高清晰度的细胞结构细节。此外，免疫组化试验显示所述结果相对于抗原-抗体反应有重叠。另外，在显微镜载片台上，用本发明组合物对象处理的样品在抗原-抗体阳性位点中具有更佳显色清晰度。因此，本发明所述处理使得诊断更可靠，特别是在出于诊断目的需要完成关于组织区域阳性的定量分析的情况中。
[0057] 实施例2：处理所取肺组织，所述组织由以下组成：约50％表观正常组织和50％表观不正常组织，即病理性(可能是肿瘤)，具有1cm×1cm×0,5cm大小的平行六面体形状。
[0058] 刚从手术室收集的组织样品尺寸减少到上述尺寸并浸入本发明组合物(醇混合物50％+苯甲酸-2-乙基己酯50％)3小时，采用3个步骤，约60分钟。
[0059] 因此，样品浸入石蜡约1小时(2个步骤，各30分钟)，由超薄切片机切割，置于炉上约20分钟并用苏木精-伊红染色(着色持续时间约1小时)。
[0060] 结论：从手术室采集时间到诊断制剂时间需要约6小时，甚至考虑到从手术室运输材料到实验室的平均时间。
[0061] 在以前的情况中，样品还用含异丙醇、乙醇和辛烷或异链石蜡的溶液处理。用本发明组合物对象处理的样品结果被认为与用含辛烷组合物和含异链石蜡组合物所得的结果重叠。免疫组化如前显示，在显微镜载片台上，用本发明组合物对象处理的样品在抗原-抗体阳性位点中具有更佳显色清晰度。因此，本发明所述处理使得诊断更可靠，特别是在出于诊断目的需要完成关于组织区域阳性的定量分析的情况中。通过常规处理完成同一试验且结论相同，在用本发明组合物对象处理的情况中，形态学方面和免疫组化反应更清晰更佳。
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