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新的治疗方法

阅读：977发布：2020-08-11

专利汇可以提供新的治疗方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了细胞内蛋白质降解抑制剂，其用于治疗和预防哺乳动物肌营养不良症。具体地，本发明提供了自噬抑制剂和/或泛素-蛋白酶体系统抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)用于治疗和预防肌营养不良症(如先天性肌营养不良症[例如，MDC1A]和Duchenne型肌营养不良症[DMD])。本发明进一步提供了治疗和预防肌营养不良症的相应方法。，下面是新的治疗方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种细胞内蛋白质降解抑制剂，其用于治疗或预防哺乳动物肌营养不良症。
2.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述细胞蛋白质降解抑制剂是自噬抑制剂。
3.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述自噬抑制剂是巨自噬抑制剂。
4.如权利要求2或3所述的抑制剂，其中所述自噬抑制剂选自：3-甲基腺嘌呤、渥
曼青霉素、巴弗洛霉素类(如巴弗洛霉素A1)、氯喹、羟氯喹、PI3KIII类抑制剂(例如
LY294002)、L-天冬酰胺、过氧化氢酶、E64D、亮肽素、N-乙酰-L-半胱氨酸、胃蛋白酶抑制剂A、丙胺、4-氨基喹啉类、3-甲基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核苷(N6-MPR)、氨基硫醇化腺苷类似物、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)。
5.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述细胞蛋白质降解抑制剂是泛素-蛋白酶体系
统抑制剂。
6.如权利要求5所述的抑制剂，其中所述泛素-蛋白酶体系统抑制剂是蛋白酶体抑制
剂。
7.如权利要求6所述的抑制剂，其中所述蛋白酶体抑制剂选自：硼替佐米(PS-341、
MG-341、 )、PI-083、MLN9708、MLN4924、MLN519、卡非佐米、ONX0912、CEP-1877、NPI-0047、NPI-0052、BU-32(NSC D750499-S)、PR-171、IPSI-001、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、MG-132、MG-262、Salinosporamide A、亮肽素、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MG-115、PSI(Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-H(醛))、乙二醛肽、α-酮酰胺肽、硼酸酯肽、苯甲酰胺肽、P'-扩展α-酮酰胺肽、乳胞素、clastro-乳胞素-β-内酯、环氧酶素、eponemycin、TCM-86A、TCM-86B、TCM-89、TCM-96、YU101、TCM-95、胶霉毒素、Loidl等人研发的T-L活性特异性醛(Chem.Biol.,(1999)6:197-204)、HNE(4-羟基-2-壬烯醛)、YU102和具有蛋白酶体抑制作用的天然产物，如绿茶多酚(-)–表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、大豆异黄酮染料木素，以及香料姜黄的化合物姜黄素。
8.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症选自：先天性肌营养
不良症、Duchenne型肌营养不良症(DMD)、Becker型肌营养不良症(BMD、良性假肥大型肌营养不良症)、远端型肌营养不良症(远端肌病)、Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)、面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、强直性肌营养不良症、中央核肌病和眼咽型肌营养不良症。
9.如权利要求8所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症是先天性肌营养不良症，例如
选自：
(a)伴有细胞外基质异常的先天性肌营养不良症，如分层蛋白(层粘连蛋白-α2)缺陷
型CMD(MDC1A)和VI型胶原缺陷型CMD(Ullrich CMD和Bethlem肌病)；
(b)肌营养不良蛋白聚糖病(α-肌营养不良蛋白聚糖异常)，如福山型CMD、肌肉-眼
脑疾病变种、沃克-沃尔伯格综合征、先天性肌营养不良症1C型、先天性肌营养不良症1D型和肢带型肌营养不良症2I型；
(c)整合素α7亚单位缺陷，如整合素α7不足的先天性肌病；
(d)核膜蛋白异常，如L-CMD；
(e)ER异常，如SEPN1相关肌病(原名为强直性脊柱肌营养不良症)；
(f)未确诊CMD，包括分层蛋白阳性；和
(g)兰尼碱受体基因(RYR1)CMD。
10.如权利要求9所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症是层粘连蛋白-α2-缺陷型先
天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
11.如权利要求9所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症不是层粘连蛋白-α2-缺陷型
先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
12.如权利要求8所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症为Duchenne型肌营养不良症
(DMD)。
13.如权利要求8所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症为远端型肌营养不良症(远端
肌病)，例如选自：Miyoshi肌病、伴胫前发病的远端肌病，和Welander远端肌病。
14.如权利要求8所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症是Emery-Dreifuss型肌营养
不良症(EDMD)，例如选自：EDMD1、EDMD2、EDMD3、EDMD4、EDMD5和EDMD6。
15.如权利要求8所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症为面肩肱型肌营养不良症
(FSHMD、FSHD或FSH)，例如选自：FSHMD1A(4q35缺失)和FSHMD1B。
16.如权利要求8所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症为肢带型肌营养不良症或Erb
型肌营养不良症，例如选自：LGMD1A、LGMD1B、LGMD1C、LGMD1D、LGMD1E、LGMD1F、LGMD1G、LGMD2A、LGMD2B、LGMD2C、LGMD2D、LGMD2E、LGMD2F、LGMD2G、LGMD2H、LGMD2I、LGMD2J、LGMD2K、LGMD2L、LGMD2M、LGMD2N和LGMD2O。
17.如权利要求8所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症是强直性肌营养不良症，例如
选自：严重的先天性型DM1(也称为Steinert氏病)、儿童期发病型DM1和DM2(也称为近
端肌强直性肌病或PROMM)。
18.如前述权利要求任一项所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症与过度的自噬(例
如过度巨自噬、过度微自噬和/或过度的伴侣蛋白相关的自噬)相关。
19.如权利要求18所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症与过度巨自噬相关。
20.如权利要求1-17任一项所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症不与巨自噬失调相
关。
21.如权利要求1-17任一项所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症不与降低的巨自噬
相关。
22.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中肌营养不良症的治疗或预防导致哺乳
动物一种或多种下述参数降低：
(i)肌肉纤维化；
(ii)肌肉萎缩；
(iii)肌细胞凋亡(胱天蛋白酶-3阳性肌纤维)；
(iv)III型胶原表达；
(v)肌腱蛋白-C表达；
(vi)细胞核位于中央的肌纤维细胞的比例；和/或
(vii)层粘连蛋白-α-4表达。
23.如权利要求22所述的抑制剂，其中所述一个或多个参数相对于自噬抑制剂治疗前
水平，降低至少10%，例如，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%，或
100%。
24.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中肌营养不良症的治疗或预防导致哺乳
动物中的一种或多种下述参数增大：
(a)肌肉再生；
(b)肌肉重量；
(c)平均肌纤维直径；
(d)股四头肌湿重占体重比率；
(e)寿命；
(f)运动功能；
(g)层粘连蛋白β-2表达；
(h)细胞核位于中央的肌纤维细胞的比例；
(i)卫星细胞中MyoD1表达；和/或
(j)再生肌肉纤维中eMHC表达。
25.如权利要求24所述的抑制剂，其中所述一个或多个参数相对于自噬抑制剂治
疗前水平增大至少10%，例如，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、
90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、450%、500%、600%、700%、800%、900% 或
1000%。
26.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中肌营养不良症的治疗或预防导致苏
氨酸308和/或473的Akt磷酸化恢复到野生型或近野生型水平，例如，在野生型水平
的 ±35%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、
0.25%、0.1%、0.05%之内。
27.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中所述抑制剂与第二治疗药物或第二疗
法组合用于肌营养不良症。
28.如权利要求27所述的抑制剂，其中第二治疗药物或第二疗法包括：
(a)物理疗法、矫正整形外科手术和/或类固醇；和/或
(b)基因置换、细胞疗法和/或抗细胞凋亡疗法。
29.如权利要求27所述的自噬抑制剂，其中所述抑制剂是自噬抑制剂，且所述第二治
疗药物或第二疗法是泛素-蛋白酶体系统抑制剂(例如，蛋白酶体抑制剂)。
30.如权利要求27所述的自噬抑制剂，其中所述抑制剂是泛素-蛋白酶体系统抑制剂
(例如，蛋白酶体抑制剂)，且所述第二治疗药物或第二疗法是一种自噬抑制剂。
31.如前述任一项权利要求所述的自噬抑制剂，其中所述哺乳动物是人。
32.细胞内蛋白质降解抑制剂在制备用于治疗或预防哺乳动物肌营养不良症药物中的
用途。
33.如权利要求32所述的用途，其中所述细胞内蛋白质降解抑制剂是自噬抑制剂。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述自噬抑制剂选自：3-甲基腺嘌呤、渥曼
青霉素、巴弗洛霉素类(例如巴弗洛霉素A1)、氯喹、羟氯喹、PI3KIII类抑制剂(例如
LY294002)、L-天冬酰胺、过氧化氢酶、E64D、亮肽素、N-乙酰-L-半胱氨酸、胃蛋白酶抑制剂A、丙胺、4–氨基喹啉、3-甲基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核苷(N6-MPR)、氨基硫醇化腺苷类似物和5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)。
35.如权利要求32所述的用途，其中所述细胞内蛋白质降解抑制剂是泛素-蛋白酶体
系统抑制剂。
36.如权利要求35所述的用途，其中所述泛素-蛋白酶体系统抑制剂是一种蛋白酶体
抑制剂。
37.如权利要求36所述的用途，其中所述蛋白酶体抑制剂选自：硼替佐米(PS-341、
MG-341、 )、PI-083、MLN9708、MLN4924、MLN519、卡非佐米、ONX0912、CEP-1877、NPI-0047、NPI-0052、BU-32(NSC D750499-S)、PR-171、IPSI-001、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、MG-132、MG-262、Salinosporamide A、亮肽素、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MG-115、PSI(Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-H(醛))、乙二醛肽、α-酮酰胺肽、硼酸酯肽、苯甲酰胺肽、P'扩展α-酮酰胺肽、乳胞素、clastro-乳胞素-β-内酯、环氧酶素、eponemycin、TCM-86A、TCM-86B、TCM-89、TCM-96、YU101、TCM-95、胶霉毒素、Loidl等人研发的T-L活性特异性醛(Chem.Biol.,(1999)6:197-204)，HNE(4-羟基-2-壬烯醛)、YU102和具有蛋白酶体抑制作用的天然产物，如绿茶多酚(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、大豆异黄酮染料木素，以及香料姜黄的化合物姜黄素。
38.如权利要求32或37任一项所述的用途，其中所述肌营养不良症选自：先天性肌
营养不良症、Duchenne型肌营养不良症(DMD)、Becker型肌营养不良症(BMD、良性假肥大型肌营养不良症)、远端型肌营养不良症(远端肌病)、Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)、面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、强直性肌营养不良症、中央核肌病和眼咽型肌营养不良症。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述肌营养不良症是层粘连蛋白-α2-缺陷型先
天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
40.如权利要求38所述的用途，其中所述肌营养不良症不是层粘连蛋白-α2-缺陷型
先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
41.如权利要求38所述的用途，其中所述肌营养不良症为Duchenne型肌营养不良症
(DMD)。
42.如权利要求32至41任一项所述的用途，其中所述抑制剂与第二治疗药物或第二疗
法组合用于肌营养不良症。
43.如权利要求42所述的用途，其中所述第二治疗剂或疗法包括：
(a)物理疗法、矫正整形外科手术和/或类固醇；和/或
(b)基因置换、细胞疗法和/或抗细胞凋亡疗法。
44.如权利要求42所述的用途，其中所述细胞内蛋白质降解抑制剂是自噬抑制剂，且
所述第二治疗药物或第二疗法是泛素-蛋白酶体系统的抑制剂(例如，蛋白酶体抑制剂)。
45.如权利要求42所述的用途，其中所述细胞内蛋白质降解抑制剂是泛素-蛋白酶体
系统的抑制剂(例如，蛋白酶体抑制剂)，且所述第二治疗药物或第二疗法是一种自噬抑制剂。
46.如权利要求32至45任一项所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
47.一种治疗或预防哺乳动物肌营养不良症的方法，其包括向所述哺乳动物给予有效
量的细胞内蛋白质降解抑制剂。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述细胞蛋白质降解抑制剂是自噬抑制剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述自噬抑制剂选自：3-甲基腺嘌呤、渥曼
青霉素、巴弗洛霉素类(例如巴弗洛霉素A1)、氯喹、羟氯喹、PI3K III类抑制剂(例如LY294002)、L-天冬酰胺、过氧化氢酶、E64D、亮肽素、N-乙酰-L-半胱氨酸、胃蛋白酶抑制剂A、丙胺、4-氨基喹啉类、3-甲基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核苷(N6-MPR)、氨基硫醇化腺苷类似物和5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述细胞蛋白质降解抑制剂是泛素-蛋白酶体系
统抑制剂。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述泛素-蛋白酶体系统抑制剂是蛋白酶体抑制
剂。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自：硼替佐米(PS-341、
MG-341、 )、PI-083、MLN9708、MLN4924、MLN519、卡非佐米、ONX0912、CEP-1877、NPI-0047、NPI-0052、BU-32(NSC D750499-S)、PR-171、IPSI-001、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、MG-132、MG-262、Salinosporamide A、亮肽素、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MG-115、PSI(Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-H(醛))、乙二醛肽、α-酮酰胺肽、硼酸酯肽、苯甲酰胺肽、P'扩展α-酮酰胺肽、乳胞素、clastro-乳胞素-β-内酯、环氧酶素、eponemycin、TCM-86A、TCM-86B、TCM-89、TCM-96、YU101、TCM-95、胶霉毒素、Loidl等人研发的T-L活性特异性醛(Chem.Biol.,(1999)6:197-204)、HNE(4-羟基-2-壬烯醛)、YU102和具有蛋白酶体抑制作用的天然产物，如绿茶多酚(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、大豆异黄酮染料木素，以及香料姜黄的姜黄素化合物。
53.如权利要求47或52任一项所述的方法，其中所述肌营养不良症选自：先天性肌
营养不良症、Duchenne型肌营养不良症(DMD)、Becker型肌营养不良症(BMD、良性假肥大型肌营养不良症)、远端型肌营养不良症(远端肌病)、Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)、面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、强直性肌营养不良症、中央核肌病和眼咽型肌营养不良症。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述肌营养不良症是层粘连蛋白-α2-缺陷型先
天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述肌营养不良症不是层粘连蛋白-α2-缺陷型
先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
56.如权利要求53所述的方法，其中所述肌营养不良症为Duchenne型肌营养不良症
(DMD)。
57.如权利要求47至56任一项所述的方法，其中所述抑制剂为全身性给药。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述抑制剂是口服和/或通过肌内注射给药。
59.如权利要求47至58任一项所述的方法，其中所述抑制剂是周期性给药，例如每4
小时、6小时、12小时、24小时、48小时、每周两次、每周一次、每月两次或每月一次给药。
60.如权利要求47至59任一项所述的方法，其还提供了向哺乳动物给予用于肌营养不
良症的第二治疗药物或第二疗法。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述第二治疗药物或第二疗法包括：
(a)物理疗法、矫正整形外科手术和/或类固醇；和/或
(b)基因置换、细胞疗法和/或抗细胞凋亡治疗。
62.如权利要求60所述的方法，其中所述方法包括向哺乳动物给予自噬抑制剂与泛
素-蛋白酶体系统抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)的组合，或由其组成。
63.如权利要求47至62任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
64.一种细胞内蛋白质降解抑制剂，其使用基本上如文中所述，参照说明书。
65.一种细胞内蛋白质降解抑制剂的用途，其基本上如文中所述，参照说明书。
66.一种用于治疗或预防肌营养不良症的方法，其基本上如文中所述，参照说明书。
1.一种自噬抑制剂，其用于治疗或预防哺乳动物肌营养不良症。
2.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述自噬抑制剂是巨自噬抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的抑制剂，其中所述自噬抑制剂选自：3-甲基腺嘌呤、渥
曼青霉素、巴弗洛霉素类(如巴弗洛霉素A1)、氯喹、羟氯喹、PI3K III类抑制剂(例如LY294002)、L-天冬酰胺、过氧化氢酶、E64D、亮肽素、N-乙酰-L-半胱氨酸、胃蛋白酶抑制剂A、丙胺、4-氨基喹啉类、3-甲基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核苷(N6-MPR)、氨基硫醇化腺苷类似物、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)。
4.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症选自：先天性肌营养
不良症、Duchenne型肌营养不良症(DMD)、Becker型肌营养不良症(BMD、良性假肥大型肌营养不良症)、远端型肌营养不良症(远端肌病)、Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)、面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、强直性肌营养不良症、中央核肌病和眼咽型肌营养不良症。
5.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症是先天性肌营养不良症，例如
选自：
(a)伴有细胞外基质异常的先天性肌营养不良症，如分层蛋白(层粘连蛋白-α2)缺陷
型CMD(MDC1A)和VI型胶原缺陷型CMD(Ullrich CMD和Bethlem肌病)；
(b)肌营养不良蛋白聚糖病(α-肌营养不良蛋白聚糖异常)，如福山型CMD、肌肉-眼
脑疾病变种、沃克-沃尔伯格综合征、先天性肌营养不良症1C型、先天性肌营养不良症1D型和肢带型肌营养不良症2I；
(c)整合素α7亚单位缺陷，如整合素α7不足的先天性肌病；
(d)核膜蛋白异常，如L-CMD；
(e)ER异常，如SEPN1相关肌病(原名为强直性脊柱肌营养不良症)；
(f)未确诊CMD，包括分层蛋白阳性；和
(g)兰尼碱受体基因(RYR1)CMD。
6.如权利要求5所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症是层粘连蛋白-α2-缺陷型先
天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
7.如权利要求5所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症不是层粘连蛋白-α2-缺陷型
先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
8.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症为Duchenne型肌营养不良症
(DMD)。
9.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症为远端型肌营养不良症(远端
肌病)，例如选自：Miyoshi肌病、伴胫前发病的远端肌病，和Welander远端肌病。
10.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症是Emery-Dreifuss型肌营养
不良症(EDMD)，例如选自：EDMD1、EDMD2、EDMD3、EDMD4、EDMD5和EDMD6。
11.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症为面肩肱型肌营养不良症
(FSHMD、FSHD或FSH)，例如选自：FSHMD1A(4q35缺失)和FSHMD1B。
12.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症为肢带型肌营养不良症或Erb
型肌营养不良症，例如选自：LGMD1A、LGMD1B、LGMD1C、LGMD1D、LGMD1E、LGMD1F、LGMD1G、LGMD2A、LGMD2B、LGMD2C、LGMD2D、LGMD2E、LGMD2F、LGMD2G、LGMD2H、LGMD2I、LGMD2J、LGMD2K、LGMD2L、LGMD2M、LGMD2N和LGMD2O。
13.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症是强直性肌营养不良症，例如
选自：严重的先天性型DM1(也称为Steinert氏病)、儿童期发病型DM1和DM2(也称为近
端肌强直性肌病或PROMM)。
14.如前述权利要求任一项所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症与过度的自噬(例
如过度巨自噬、过度微自噬和/或过度的伴侣蛋白相关的自噬)相关。
15.如权利要求14所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症与过度巨自噬相关。
16.如权利要求1-13任一项所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症不与巨自噬失调相
关。
17.如权利要求1-13任一项所述的抑制剂，其中所述肌营养不良症不与降低的巨自噬
相关。
18.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中肌营养不良症的治疗或预防导致哺乳
动物一种或多种下述参数降低：
(i)肌肉纤维化；
(ii)肌肉萎缩；
(iii)肌细胞凋亡(胱天蛋白酶-3阳性肌纤维)；
(iv)III型胶原表达；
(v)肌腱蛋白-C表达；
(vi)细胞核位于中央的肌纤维细胞的比例；和/或
(vii)层粘连蛋白-α-4表达。
19.如权利要求18所述的抑制剂，其中所述一个或多个参数相对于自噬抑制剂治疗前
水平，降低至少10%，例如，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%，或
100%。
20.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中肌营养不良症的治疗或预防导致哺乳
动物中的一种或多种下述参数增大：
(a)肌肉再生；
(b)肌肉重量；
(c)平均肌纤维直径；
(d)股四头肌湿重占体重比率；
(e)寿命；
(f)运动功能；
(g)层粘连蛋白β-2表达；
(h)细胞核位于中央的肌纤维细胞的比例；
(i)卫星细胞中MyoD1表达；和/或
(j)再生肌肉纤维中eMHC表达。
21.如权利要求20所述的抑制剂，其中所述一个或多个参数相对于自噬抑制剂治
疗前水平增大至少10%，例如，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、
90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、450%、500%、600%、700%、800%、900% 或
1000%。
22.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中肌营养不良症的治疗或预防导致苏
氨酸308和/或473的Akt磷酸化恢复到野生型或近野生型水平，例如，在野生型水平
的 ±35%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、
0.25%、0.1%、0.05%之内。
23.如前述任一项权利要求所述的抑制剂，其中所述抑制剂与第二治疗药物或第二疗
法组合用于肌营养不良症。
24.如权利要求23所述的抑制剂，其中第二治疗药物或第二疗法包括：
(a)物理疗法、矫正整形外科手术和/或类固醇；
(b)基因置换、细胞疗法和/或抗细胞凋亡疗法；和/或
(c)蛋白酶体抑制剂(例如，泛素-蛋白酶体系统抑制剂)。
25.如权利要求23所述的自噬抑制剂，其中所述第二治疗药物或第二疗法是蛋白酶体
抑制剂(例如，泛素-蛋白酶体系统抑制剂)。
26.如权利要求23所述的自噬抑制剂，其中所述第二治疗药物或第二疗法是一种自噬
抑制剂。
27.如前述任一项权利要求所述的自噬抑制剂，其中所述哺乳动物是人。
28.自噬抑制剂在制备用于治疗或预防哺乳动物肌营养不良症药物中的用途。
29.如权利要求28所述的用途，其中所述自噬抑制剂选自：3-甲基腺嘌呤、渥曼
青霉素、巴弗洛霉素类(例如巴弗洛霉素A1)、氯喹、羟氯喹、PI3K III类抑制剂(例如LY294002)、L-天冬酰胺、过氧化氢酶、E64D、亮肽素、N-乙酰-L-半胱氨酸、胃蛋白酶抑制剂A、丙胺、4–氨基喹啉、3-甲基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核苷(N6-MPR)、氨基硫醇化腺苷类似物和5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)。
30.如权利要求28或29所述的用途，其中所述肌营养不良症选自：先天性肌营养不良
症、Duchenne型肌营养不良症(DMD)、Becker型肌营养不良症(BMD、良性假肥大型肌营养不良症)、远端型肌营养不良症(远端肌病)、Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)、面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、强直性肌营养不良症、中央核肌病和眼咽型肌营养不良症。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述肌营养不良症是层粘连蛋白-α2-缺陷型先
天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
32.如权利要求30所述的用途，其中所述肌营养不良症不是层粘连蛋白-α2-缺陷型
先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白-缺陷，1a/MDC1A)。
33.如权利要求30所述的用途，其中所述肌营养不良症为Duchenne型肌营养不良症
(DMD)。
34.如权利要求28至33任一项所述的用途，其中所述抑制剂与第二治疗药物或第二疗
法组合用于肌营养不良症。
35.如权利要求34所述的用途，其中所述第二治疗剂或疗法包括：
(a)物理疗法、矫正整形外科手术和/或类固醇；
(b)基因置换、细胞疗法和/或抗细胞凋亡疗法；和/或
(c)蛋白酶体抑制剂(例如，泛素-蛋白酶体系统抑制剂)。
36.如权利要求34所述的用途，其中所述第二治疗药物或第二疗法是蛋白酶体抑制剂

说明书全文

新的治疗方法

发明领域

[0001] 本发明涉及治疗和预防肌营养不良症的药物和方法。具体地，本发明提供了细胞内蛋白质降解抑制剂(如自噬抑制剂和/或蛋白酶体抑制剂)用于肌营养不良症的治疗和预防，包括但不限于层粘连蛋白-α2-缺陷型先天性肌营养不良症和Duchenne型肌营养不良症。技术背景

[0002] 肌营养不良症(MD)是指一组削弱了移动人体的肌肉的遗传性肌肉疾病。MD的特征是进行性骨骼肌无力、肌肉蛋白缺陷，以及肌肉细胞和组织死亡。九种疾病归属于MD，其包括Duchenne型、Becker型、肢带型、先天性、面肩肱型、强直性、眼咽型、远端型和Emery-Dreifuss型，但还有总共一百多种疾病类似MD。

[0003] 大多数类型的MD是多系统疾病，在人体系统的表现包括心脏、胃肠道和神经系统、内分泌腺体、皮肤、眼睛甚至大脑。该疾病也可能导致情绪不稳和学习困难。

[0004] 对任何形式的MD都没有特定的治疗方法。MD可能会导致肺功能下降，因此，辅助通气可赋予MD患者显著的临床益处。在某些情况下可能需要物理治疗以防止挛缩和保持肌肉张力，并且需要矫形器(用于支持的矫形器具)和矫正整形外科手术以提高生活质量。发生于Emery-Dreifuss型肌营养不良症和强直性肌营养不良症的心脏问题，可能需要一个心脏起搏器。发生于强直性肌营养不良症的肌强直(肌肉强烈收缩后舒张延迟)可能需用药物(如奎宁、苯妥英、或美西律)治疗，但未发现实际的长期治疗方法。

[0005] 作业疗法协助MD个体从事他/她的日常生活(自主进食，自我照顾活动等)，并尽可能最大程度独立地进行休闲活动。这可能需要使用自适应设备和节省体能技术来实现。作业疗法可根据个人环境进行改变，包括在家里或工作场所，以提高个体功能和便利性。作业治疗师还解决可能会伴随MD的心理变化和认知能力下降，以及向家庭和个体提供关于本疾病的支持和教育。

[0006] 伴随着常规的基因置换策略、基于RNA的技术和药理学方法使用中特别引人注目的进步，新的基于基因的MD疗法正在出现。然而，虽然其原理已在动物模型中得到证实，但在临床试验中是否取得成功还有待证实。

[0007] 因此，需要一种治疗和预防MD的有效药物。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明的第一个方面是提供一种用于治疗或预防哺乳动物肌营养不良症的细胞内蛋白质降解抑制剂。

[0010] “细胞内蛋白质降解抑制剂”包括能够(至少部分地)抑制哺乳动物细胞中内源性蛋白降解途径的任何药物(例如化学实体、多肽或其他物质)。

[0011] 负责蛋白质在哺乳动物细胞中降解的两个主要途径是自噬-溶酶体降解途径和泛素-蛋白酶体途径(例如，参见Knecht等人,2009,Cell Mol Life Sci.66(15):2427-43和Sandri,2010,FEBS Lett.584(7):1411-6，其公开内容引入本文作为参考)。

[0012] 在一项实施方案中，细胞蛋白质降解抑制剂是自噬抑制剂。

[0013] “自噬抑制剂”包括能够(至少部分地)抑制哺乳动物中自噬-溶酶体途径的任何药物(例如小的化学实体、多肽[包括抗体]等)。应当理解，该药物可直接(通过作用于自噬-溶酶体途径的组分)或间接(通过作用于直接或间接抑制自噬-溶酶体途径的另一种细胞成分或因子)抑制该自噬过程。

[0014] 自噬-溶酶体途径在哺乳动物中的调控在科学文献中进行了详细讨论(例如，见Mehrpour等人,2010,Cell Res.20(7):748-62和Mehrpour等人,2010,Am J Physiol Cell Physiol.298(4):C776-85，其公开内容引入本文作为参考)。

[0015] 自噬抑制剂的实例是本领域所熟知的，部分在癌症治疗中被建议使用(例如，Livesey等人,2009,Curr Opin Investig Drugs.10(12):1269-79，在其公开内容引入本文作为参考)。

[0016] 本领域技术人员应理解为，所述自噬抑制剂能够抑制(全部或部分地)巨自噬、微自噬和/或伴侣蛋白介导的自噬。

[0017] 在一项实施方案中，所述自噬抑制剂是巨自噬抑制剂。

[0018] 因此，自噬抑制剂可以选自：3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、巴弗洛霉素类(例如巴弗洛霉素A1)、氯喹、羟氯喹、PI3K III类抑制剂(例如LY294002)、L-天冬酰胺、过氧化氢酶、E64D、亮肽素、N-乙酰-L-半胱氨酸、胃蛋白酶抑制剂A、丙胺、4-氨基喹啉类、3-甲基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核苷(N6-MPR)、氨基硫醇化腺苷类似物，和5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)。

[0019] 在一项实施方案中，所述细胞蛋白质降解抑制剂是泛素-蛋白酶体系统抑制剂。

[0020] “泛素-蛋白酶体系统抑制剂”是指能够(至少部分地)抑制泛素-蛋白酶体系统功能(最好是在人体内)的药物(例如小的化学实体、多肽等)。这样的抑制剂可在沿泛素-蛋白酶体蛋白降解途径任何位点发挥抑制作用，例如，通过降解调节泛素化或去泛素化(至少部分地)抑制蛋白质降解标记，通过抑制蛋白酶体识别或结合待降解蛋白质的能力，和/或通过抑制蛋白酶体降解蛋白质的能力而发挥作用。

[0021] 泛素-蛋白酶体系统和其组分在科学文献中进行了详细描述，例如参见Ciechanover,1998,The EMBO Journal17,7151-7160(见其中图1和图2)和Bedford等
人,2011,Nat Rev Drug Discov10,29-46；其公开内容引入本文作为参考。

[0022] 在一项实施方案中，泛素-蛋白酶体系统抑制剂是一种直接作用于蛋白酶体以抑制其功能的蛋白酶抑制剂。例如，蛋白酶体抑制剂可(至少部分地)抑制人
蛋白酶体降解蛋白质的能力。蛋白酶体抑制剂的实例是本领域熟知的(例如，参见
de Bettignies&Coux,2010,Biochimie.92(11):1530-45,Kling 等人 ,2010,Nature
Biotechnology,28(12):1236-1238，其公开内容在此引入作为参考)。

[0023] 因此，泛素-蛋白酶体系统抑制剂可为选自以下的蛋白酶体抑制剂：硼替佐米(PS-341,MG-341, )、PI-083、MLN9708、MLN4924、MLN519、卡非佐米(carfilzomib)、ONX0912、CEP-1877、NPI-0047、NPI-0052、BU-32(NSC D750499-S)、PR-171、IPSI-001、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、MG-132、MG-262、Salinosporamide A、亮肽素、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MG-115、PSI(Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-H(醛))、乙二醛肽(peptide glyoxal)、α-酮酰胺肽(peptide alpha-keto amide)、硼酸酯肽、苯甲酰胺肽、P’-扩展的α-酮酰胺肽、乳胞素、clastro-乳胞素-β-内酯、环氧酶素(epoxomicin)、eponemycin、TCM-86A、TCM-86B、TCM-89、TCM-96、YU101、TCM-95、胶霉毒素、Loidl等人研发的T-L活性特异性醛(Chem.Biol.，(1999)6:197-204)、HNE(4-羟基-2-壬烯醛)、YU102和具有蛋白酶体抑制作用的天然产物，如绿茶多酚(-)–表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、大豆异黄酮染料木素，和香料姜黄的化合物姜黄素。

[0024] 例如，蛋白酶体抑制剂可以是硼替佐米(专有名称= ，IUPAC名称=[(1R)-3-甲基-1-({(2S)-3-苯基-2-[(吡嗪-2-基羰基)氨基]丙酰基}氨基)丁基]
硼酸，CAS=179324-69-7)。

[0025] 本领域技术人员还应理解，本发明提供了适于治疗和预防若干种不同形式的肌营养不良症和肌营养不良症样适应症(如相关肌病)的药物。

[0026] 在一项实施方案中，所述肌营养不良症选自：先天性肌营养不良症、Duchenne型肌营养不良症(DMD)、Becker型肌营养不良症(BMD、良性假肥大型肌营养不良症)、远端型肌营养不良症(远端肌病)、Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)、面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、强直性肌营养不良症、中央核肌病和眼咽型肌营养不良症。

[0027] 因此，肌营养不良症可以是先天性肌营养不良症，例如选自：

[0028] (a)伴有细胞外基质异常的先天性肌营养不良症，如分层蛋白(merosin)(层粘连蛋白-α2)缺陷型CMD(MDC1A)和VI型胶原缺陷型CMD(Ullrich CMD和Bethlem肌病);

[0029] (b)肌营养不良蛋白聚糖病(Dystroglycanopathy)(α-肌营养不良蛋白聚糖异常)，如福山型CMD、肌肉-眼脑疾病变种、沃克-沃尔伯格综合征、先天性肌营养不良症1C型、先天性肌营养不良症1D型和肢带型肌营养不良症2I型；

[0030] (c)整合素α7亚单位缺陷，如整合素α7不足的先天性肌病;

[0031] (d)核膜蛋白异常，如L-CMD;

[0032] (e)ER异常，如SEPN1相关肌病(原名为强直性脊柱肌营养不良症);

[0033] (f)未确诊CMD，包括分层蛋白阳性;和

[0034] (g)兰尼碱受体基因(RYR1)CMD。

[0035] 在一项优选的实施方案中，所述肌营养不良症是层粘连蛋白-α2-缺陷型先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白缺陷，1a/MDC1A)。

[0036] 然而，在另一项实施方案中，所述肌营养不良症不是层粘连蛋白-α2-缺陷型先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白缺陷，1a/MDC1A)。

[0037] 在一项替代实施方案中，所述肌营养不良症是Duchenne型肌营养不良症(DMD)。

[0038] 在另一项实施方案中，所述肌营养不良症是远端型肌营养不良症(远端肌病)，例如选自：Miyoshi肌病，伴胫前发病的远端肌病和Welander远端肌病。

[0039] 在另一项实施方案中，所述肌营养不良症是Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)，例如选自：EDMD1、EDMD2、EDMD3、EDMD4、EDMD5和EDMD6。

[0040] 在另一项实施方案中，所述肌营养不良症是面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)，例如选自：FSHMD1A(4q35缺失)和FSHMD1B。

[0041] 在另一项实施方案中，所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症或(Erb型肌营养不良症)，例如选自：LGMD1A、LGMD1B、LGMD1C、LGMD1D、LGMD1E、LGMD1F、LGMD1G、LGMD2A、LGMD2B、LGMD2C、LGMD2D、LGMD2E、LGMD2F、LGMD2G、LGMD2H、LGMD2I、LGMD2J、LGMD2K、LGMD2L、LGMD2M、LGMD2N和LGMD2O。

[0042] 在另一项实施方案中，所述肌营养不良症是强直性肌营养不良症，例如选自：严重的先天性型DM1(也称为Steinert氏病)、儿童期发病型DM1和DM2(也称为近端肌强直性肌病或PROMM)。

[0043] 如上面所讨论的，术语“肌营养不良症”包括许多与移动身体的肌肉虚弱相关的相关遗传性疾病。

[0044] 在一项实施方案中，所述肌营养不良症与过度自噬(即过度的巨自噬、微自噬和/或伴侣分子相关的自噬)相关。

[0045] 因此，所述肌营养不良症可能与过度的巨自噬相关。例如，所述肌营养不良症可以是层粘连蛋白-α2-缺陷型先天性肌营养不良症，MDC1A。

[0046] 在一项替代实施方案中，所述肌营养不良症与巨自噬失调不相关。例如，所述肌营养不良症可能是Duchenne型肌营养不良症。

[0047] 在另一项替代实施方案中，所述肌营养不良症与降低的巨自噬不相关。

[0048] 本发明的细胞内蛋白质降解抑制剂可用于治疗和/或预防肌营养不良症。

[0049] “治疗和/或预防”是指将细胞内蛋白质降解抑制剂用于防止、减少和/或消除一种或多种与肌营养不良症相关的症状或参数。

[0050] 在一项实施方案中，治疗或预防肌营养不良症导致哺乳动物一种或多种下述参数降低：

[0051] (i)肌肉纤维化；

[0052] (ii)肌肉萎缩；

[0053] (iii)肌细胞凋亡(胱天蛋白酶-3的阳性肌纤维)；

[0054] (iv)III型胶原表达；

[0055] (v)肌腱蛋白-C表达；

[0056] (vi)细胞核位于中央的肌纤维细胞的比例；和/或

[0057] (vii)层粘连蛋白-α-4表达。

[0058] 这些参数评定的方法是本领域所熟知的(例如，Gawlik等人,2010,PLoSONE5(7):e11549和Meinen等人,2007,J Cell Biol.176(7):979-93)。

[0059] 所述参数的降低可以是全部地或部分地。例如，一个或多个参数相对于抑制剂治疗前水平，可减少至少10%，例如，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。

[0060] 或者，或另外地，肌营养不良症的治疗或预防可导致哺乳动物中一种或多种下述参数增大：

[0061] (a)肌肉再生；

[0062] (b)肌肉重量；

[0063] (c)平均肌纤维直径；

[0064] (d)股四头肌湿重占体重比率；

[0065] (e)寿命；

[0066] (f)运动功能；

[0067] (g)层粘连蛋白β-2的表达；

[0068] (h)细胞核位于中央的肌纤维细胞的比例；

[0069] (i)卫星细胞中MyoD1的表达，和/或

[0070] (j)再生肌肉纤维中eMHC的表达。

[0071] 这些参数的评定方法是本领域所熟知的(例如，Gawlik等人,2010,PLoSONE5(7):e11549和Meinen等人,2007,J Cell Biol.176(7):979-93，其公开内容在此引入作为参考)。

[0072] 所述参数的增大可以是全部地或部分地。例如，一个或多个参数相对于抑制剂治疗前水平可增大至少10%，例如，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、450%、500%、600%、700%、800%、900% 或
1000%。

[0073] 或者，或另外地，肌营养不良症的治疗或预防可导致在苏氨酸308和/或473中Akt磷酸化被恢复到野生型或近野生型水平，例如，在野生型水平的±35%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%之内。

[0074] 本领域技术人员应理解，本发明的细胞内蛋白质降解抑制剂可与第二治疗药物或第二疗法组合用于治疗肌营养不良症。

[0075] 例如，所述第二治疗药物或第二疗法可包括物理疗法、矫正整形外科手术和/或类固醇，或由其组成。

[0076] 或者，或另外地，所述第二治疗药物或第二疗法可包括基因置换、细胞疗法和/或抗凋亡疗法，或由其组成(例如，Gawlik等人,2004,Hum Mol Genet.13(16):1775-84、Hagiwara 等人 ,2006,FEBS Lett.580(18):4463-8、Meinen 等人 ,2007,J CellBiol.176(7):979-93和Girgenrath等人,2009,Ann Neurol.65(1)47-56，其公开内容在此引入作为参考)。

[0077] 在一项实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂是自噬抑制剂，其与蛋白酶体抑制剂组合使用，或反之亦然。从而，这样的组合疗法寻求同时抑制哺乳动物细胞中蛋白降解的两条主要途径。

[0078] 本领域技术人员应理解，本发明抑制剂可用于任何哺乳动物。

[0079] 在一项实施方案中，所述哺乳动物是人。

[0080] 或者，哺乳动物可以是犬、猫、马，或其它家庭或农场哺乳类动物。

[0081] 本发明的第二方面是提供了细胞内蛋白质降解抑制剂在制备用于治疗或预防哺乳动物肌营养不良症药物中的用途。

[0082] 合适的细胞内蛋白质降解抑制剂的实例被上文本发明第一方面的相关内容所公开。

[0083] 因此，在一项实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂是自噬抑制剂。例如，所述自噬抑制剂选自：3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、巴弗洛霉素类(例如巴弗洛霉素A1)、氯喹、羟氯喹、PI3K III类抑制剂(例如LY294002)、L-天冬酰胺、过氧化氢酶、E64D、亮肽素、N-乙酰-L-半胱氨酸、胃蛋白酶抑制剂A、丙胺、4-氨基喹啉类、3-甲基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核苷(N6-MPR)、氨基硫醇化腺苷类似物、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)。

[0084] 在一项替代实施方案中，所述细胞蛋白质降解抑制剂是泛素-蛋白酶体系统抑制剂。

[0085] 因此，在一项实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂是蛋白酶体抑制剂。例如，所述蛋白酶体抑制剂可选自：硼替佐米(PS-341、MG-341、万 )、PI-083、MLN9708、MLN4924、MLN519、卡非佐米、ONX0912、CEP-1877、NPI-0047、NPI-0052、BU-32(NSC D750499-S)、PR-171、IPSI-001、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、MG-132、MG-262、Salinosporamide A、亮肽素、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MG-115、PSI(Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-H(醛))、乙二醛肽、α-酮酰胺肽、硼酸酯肽、苯甲酰胺肽、P’-扩展α-酮酰胺肽、乳胞素、clastro-乳胞素-β-内酯、环氧酶素、eponemycin、TCM-86A、TCM-86B、TCM-89、TCM-96、YU101、TCM-95、胶霉毒素、Loidl等人开发的T-L活性特异性醛(Chem.Biol.,(1999)6:197-204)、HNE(4-羟基-2-壬烯醛)、YU102和具有蛋白酶体抑制作用的天然产物，如绿茶多酚(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、大豆异黄酮染料木素，和香料姜黄的化合物姜黄素。

[0086] 本发明第二方面的用途涉及上述所披露有关本发明第一方面的相同的肌营养不良症适应症。

[0087] 因此，在一项实施方案中，所述肌营养不良症选自：先天性肌营养不良症、Duchenne型肌营养不良症(DMD)、Becker型肌营养不良症(BMD、良性假肥大型肌营养不良症)、远端型肌营养不良症(远端肌病)、Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)、面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、强直性肌营养不良症和眼咽型肌营养不良症。

[0088] 例如，所述肌营养不良症可以是层粘连蛋白-α2-缺陷型先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白缺陷，1a/MDC1A)。

[0089] 在一项替代实施方案中，所述肌营养不良症不是层粘连蛋白-α2-缺陷型先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白缺陷，1a/MDC1A)。

[0090] 在另一项替代实施方案中，所述肌营养不良症是Duchenne肌营养不良症(DMD)。

[0091] 本领域的技术人员应当理解，本发明第二方面的用途可提供用于任何哺乳动物的药物(见上文)。

[0092] 在一项实施方案中，所述哺乳动物是人。

[0093] 关于本发明的所有方面，所述细胞内蛋白质降解抑制剂可以以各种浓度进行配制，其取决于许多因素，包括所使用抑制剂的效力/毒性和其所用于的适应症。当然，任何给定的药物制剂最大浓度限制在抑制剂的最大溶解度内。然而，这些制剂应当含有足够量的抑制剂以在体内达到(至少部分地)抑制肌肉细胞和其他受该疾病影响的细胞(例如，Schwann细胞)中蛋白质的细胞内降解。

[0094] 在一项实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂被配制成浓度范围为1nM至1M，例如，所述药物制剂可包含浓度为1μM至1mM的抑制剂，例如，1μM至100μM、5μM至
50μM、10μM至50μM、20μM至40μM或约30μM。

[0095] 所述细胞内蛋白质降解抑制剂，通常与根据预期的给药途径和标准的制药规范(例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995,Ed.Alfonso Gennaro,Mack Publishing Company,Pennsylvania,USA，其公开内容引用并入本文)选择的合适的药物赋形剂，稀释剂或载体混合给药。合适的给药途径如下所讨论，且包括静脉内、口服、肺部、鼻内、局部、耳、眼、膀胱和中枢神经系统递送。

[0096] 例如，所述细胞内蛋白质降解抑制剂可以以片剂、胶囊、ovules、酏剂、溶液或悬浮液的形式口服、含服或舌下给药，其可含有调味剂或着色剂，用于立即释放、延迟释放或控制释放的施用。

[0097] 此类片剂可含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸，崩解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，及制粒粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外、可包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。

[0098] 类似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。在这方面，优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂，本发明的化合物可与各种甜味剂或矫味剂、着色物质或染料组合，与乳化剂和/或悬浮剂组合，以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油组合，也可与上述的组合组合使用。

[0099] 或者该制剂可通过肠胃外给药，例如，静脉内、动脉内、瘤内、瘤周、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下给药(包括通过细针阵列或使用无针技术)，或者可以通过输注技术给药。该制剂最好以可含有其它物质(例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗)的无菌水溶液形式使用。如果有必要，水溶液应该进行适当的缓冲(优选pH3-9)。无菌条件下，合适的肠胃外制剂的制备很容易根据本领域技术人员公知的标准制药技术来完成。

[0100] 适合于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括助悬剂和增稠剂。该制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下存储，仅需在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和前述种类的片剂制备。

[0101] 所述细胞内蛋白质降解抑制剂也可经鼻内或通过吸入给药，并且可通过使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃例如1,1,1,2-四氟乙3 3
烷(HFA134A)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA)、二氧化碳或其它合适的气体)从
加压容器、泵、喷射器或喷雾器中以干粉吸入或以气雾剂喷雾的形式方便地递送。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以递送计量的量来确定剂量单位。加压容器、泵、喷射器或喷雾器可含有活性抑制剂的溶液或悬浮液，例如用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其另外还可含有润滑剂，例如山梨坦三油酸酯。可将用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如，由明胶制备)配制成含有本发明化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物的制剂。

[0102] 优选地制备气雾剂或干粉制剂，以便每个计量剂量或每“喷”含有至少1mg化合物递送给患者。应当理解，气雾剂的整体剂量将根据患者和适应症而变化，且可以单剂量给药或以分开的剂量一天内多次给药。

[0103] 或者，也可使用本领域中已知的其它常规给药途径，例如，本发明制剂可以片剂、胶囊、ovules、酏剂、溶液或悬浮液的形式经口服、含服或舌下给药，其可含有调味剂或着色剂，用于立即-，延迟-或控制-释放的应用。该制剂也可经眼内，经耳内或通过海绵体内注射给予(见下文)。

[0104] 对于局部应用，例如应用至皮肤，所述细胞内蛋白质降解抑制剂可以洗剂、溶液、乳膏剂、凝胶剂、软膏剂或粉剂的形式给药(例如上述Remington的文献，第1586-1597页)。因此，抑制剂可被配制成合适的软膏剂，其含有所述活性化合物悬浮或溶解在例如以下的一种或多种的混合物中：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，其可以配制成适合的洗剂或乳膏剂，悬浮或溶解在例如以下的一种或多种物质的混合物中：矿物油、山梨坦单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、e-月桂基硫酸酯、醇(例如乙醇、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇)和水。

[0105] 适于口腔局部给药的制剂还包括锭剂，其包含调味基质中的活性成分，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；软锭剂，其包含惰性基质(如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分；和漱口液，包含合适的液体载体中的活性成分。

[0106] 该制剂也可经眼给药，特别是用于治疗眼部疾病。对于眼科应用，所述化合物可配制成等渗的、pH调节的、在无菌盐水中的微粉悬浮液，或优选地，配制成在等渗的、pH调节的无菌盐水中任选地与防腐剂(如苯扎氯铵)组合的溶液。或者，该制剂可以配制成软膏剂例如凡士林。

[0107] 用于兽医，所述的化合物可根据标准兽医学规范配制成可接受的制剂给药，且兽医将确定最适合特定动物的给药方案和给药途径。

[0108] 在一项优选的实施方案中，所述制剂适于全身给药(例如，通过口服或肠胃外给药途径)。

[0109] 包含细胞内蛋白质降解抑制剂的制剂可被储存在本领域中已知的任何合适的容器或器皿中。本领域技术人员应当，所述容器或器皿应优选气密性的和/或灭菌的。优选地，该容器或器皿由塑料材料(如聚乙烯)制成。

[0110] 本发明的第三个相关方面是提供用于治疗或预防哺乳动物中的肌营养不良症的方法，其包括向所述哺乳动物给予有效量的细胞内蛋白质降解抑制剂。

[0111] 合适的细胞内蛋白质降解抑制剂的实例被上文本发明第一方面有关内容公开。

[0112] 因此，在一项实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂是自噬抑制剂。例如，所述自噬抑制剂选自：3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、巴弗洛霉素类(例如巴弗洛霉素A1)、氯喹、羟氯喹、PI3K III类抑制剂(例如LY294002)、L-天冬酰胺、过氧化氢酶、E64D、亮肽素、N-乙酰-L-半胱氨酸、胃蛋白酶抑制剂A、丙胺、4–氨基喹啉、3-基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核苷(N6-MPR)、氨基硫醇化腺苷类似物、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)。

[0113] 在一项替代实施方案中，所述细胞蛋白质降解抑制剂是泛素-蛋白酶体系统抑制剂。

[0114] 因此，所述细胞内蛋白质降解抑制剂可以是蛋白酶体抑制剂。例如，所述蛋白酶体系统抑制剂选自：硼替佐米(PS-341、MG-341、 )、PI-083、MLN9708、MLN4924、MLN519、卡非佐米、ONX0912、CEP-1877、NPI-0047、NPI-0052、BU-32(NSCD750499-S)、PR-171、IPSI-001、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、MG-132、MG-262、Salinosporamide A、亮肽素、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MG-115、PSI(Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-H(醛))、乙二醛肽、α-酮酰胺肽、硼酸酯肽、苯甲酰胺肽、P’-扩展α-酮酰胺肽、乳胞素、clastro-乳胞素-β-内酯、环氧酶素、eponemycin、TCM-86A、TCM-86B、TCM89、TCM-96、YU101、TCM-95、胶霉毒素、Loidl等人研发的T-L活性特异性醛(Chem.Biol.,(1999)6:197-204)、HNE(4-羟基-2-壬烯醛)、YU102和具有蛋白酶体抑制作用的天然产物，如绿茶多酚(-)–表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、大豆异黄酮染料木素，和香料姜黄的化合物姜黄素。

[0115] 本发明第三方面的方法涉及上文本发明第一方面有关内容所披露的相同的肌营养不良症适应症。

[0116] 因此，在一项实施方案中，所述肌营养不良症选自：先天性肌营养不良症、Duchenne型肌营养不良症(DMD)、Becker型肌营养不良症(BMD、良性假肥大型肌营养不良症)、远端型肌营养不良症(远端肌病)、Emery-Dreifuss型肌营养不良症(EDMD)、面肩肱型肌营养不良症(FSHMD、FSHD或FSH)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、强直性肌营养不良症和眼咽型肌营养不良症。

[0117] 例如，所述肌营养不良症是层粘连蛋白-α2-缺陷型先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白缺陷，1a/MDC1A)。

[0118] 在一项替代实施方案中，所述肌营养不良症不是层粘连蛋白-α2-缺陷型先天性肌营养不良症(肌营养不良症，先天性分层蛋白缺陷，1a/MDC1A)。

[0119] 在另一项替代实施方案中，所述肌营养不良症是Duchenne型肌营养不良症(DMD)。

[0120] 本领域的技术人员应当理解，本发明第三方面的方法可以在任何哺乳动物中应用(见上文)。

[0121] 在一项实施方案中，所述哺乳动物是人。

[0122] 在本发明的方法和用途中，向患者给予药学上有效剂量的细胞内蛋白质降解抑制剂。如本文所用，“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效的”是指对于给定的肌营养不良症的适应症和给药方案提供治疗效果的量。这是通过计算与所需的添加剂和稀释剂(例如载体或给药赋形剂)组合以产生期望的治疗效果的活性物质预定的量。另外，它是指足以减少和最优选防止宿主在活动、功能和反应上的临床显著不足的量。或者，治疗有效量足以引起宿主临床显著病状的改善。正如本领域技术人员所理解的，化合物的量可根据其具体的活性而变化。合适的剂量可包含预定量的活性成分，经计算能与所需的稀释剂组合产生期望的疗效。在本发明制备组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的活性成分。如本领域已知的，治疗有效量可由普通熟练的医学或兽医工作人员基于患者特征，如年龄、体重、性别、状况、并发症、其它疾病等等确定。药学上有效剂量的给药，可以以一个单独的剂量单位或若干较小的剂量单位的形式单次给药，并且还可以以分剂量在特定的时间间隔多次给药。或者，可在一很长时期以所述剂量提供连续输注。

[0123] 在一项实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂给药的剂量足以(至少部分地)抑制正在接受治疗的患者肌肉细胞中蛋白质的降解。因此，可以选择抑制剂的剂量以抑制患者肌肉细胞中蛋白质的降解。

[0124] 通常，所述细胞内蛋白质降解抑制剂的给药剂量范围为每次给药(如每天，见下文)0.01至100mg/kg，例如每次给药0.05至50mg/kg、0.1至20mg/kg、0.01至10mg/kg、0.1至5.0mg/kg、0.5至3.0mg/kg或1至1.5mg/kg。

[0125] 应当理解，细胞内蛋白质降解抑制剂的剂量可在患者的治疗过程中改变。例如，可在初始治疗阶段使用较高剂量，随后在初始治疗完成后采用较低的“维持”剂量，以防止病症的复发。

[0126] 在一项实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂为全身给药。

[0127] 在另一项实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂为口服给药。

[0128] 在另一实施方案中，所述细胞内蛋白质降解抑制剂为反复给药，例如每4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、每周两次、每周一次、每月两次或每月一次。

[0129] 本领域的技术人员应当理解，所述细胞内蛋白质降解抑制剂可作为肌营养不良症患者的唯一治疗方法给药，或作为包含一种或多种其它治疗药物或治疗方法的组合治疗方法的一部分给药。

[0130] 在一项实施方案中，所述其它治疗药物或治疗方法包括物理疗法、矫正整形外科手术和/或类固醇。

[0131] 或者，或另外地，所述第二治疗药物或第二疗法可包括或由基因置换、细胞疗法和/或抗细胞凋亡疗法组成。

[0132] 在本发明的第三方面的另一项实施方案中，该方法包括将自噬抑制剂与泛素-蛋白酶体系统抑制剂组合给药。例如，可将巨自噬抑制剂与蛋白酶体抑制剂组合给予患者。

[0133] 优选地，现参考以下附图描述体现本发明的一些方面的非限制性实施例：

[0134] 图1.在dy3K/dy3K小鼠骨骼肌中自噬增加。(A)在3.5周龄野生型小鼠、dy3K/dy3K小鼠和4.5周龄经3-MA注射的野生型小鼠、dy3K/dy3K小鼠(每组n=6)中LC3B、
GABARAPL1、Atg4b、Vps34、Beclin、组织蛋白酶L和Lamp2a mRNA的相对量。GAPDH基因的表达作为参照。(B)左图：未经注射的野生型小鼠(a，n=5)、dy3K/dy3K小鼠(b，n=5)与经3-MA注射的野生型小鼠(c，n=6)、dy3K/dy3K小鼠(d和e，n=6)股四头肌截面的共免疫染色。LC3B(红色)存在于自噬体中，而层粘连蛋白γ1链(绿色)表示纤维边界。标尺
=40μm。(C)野生型小鼠和dy3K/dy3K小鼠(3.5周龄，每组n=6)股四头肌的LC3B密度分
析和Vps34蛋白质印迹分析(western blot)。结果以任意单位(AU)值表示。微管蛋白标记作为内参照。(D)来自对照患者和层粘连蛋白-α2链缺陷患者的人原代成肌细胞和肌管中LC3B、Vps34、组织蛋白酶L和Beclin-1的密度分析。数据为4个不同培养孔的平均值，以任意单位(AU)表示。*，P<0.05;**，P<0.001。

[0135] 图2.全身注射3-MA的骨骼肌中，肌肉形态得到改善并且纤维化降低。(A)对来自2.5和3.5周龄的野生型(a，e)、未经注射的dy3K/dy3K(b，f)、经注射的野生型和dy3K/dy3K(分别为c，d和g，h)的股四头肌(a-d)和胫骨前肌(e-h)肌肉横截面进行苏木精-伊红染色。14天后，分离肌肉并染色。(B)经3-MA注射的野生型小鼠和dy3K/dy3K小鼠(每基因型n=6)或未经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠(n=7)和野生型小鼠(n=9)的股四头肌纤维化的密度定量测定。左图：截面总面积III型胶原阳性标记的百分比。右图：横截面总面积肌腱蛋白-C阳性标记的百分比。*，P<0.05;**，P<0.001。

[0136] 图3.预防经3-MA处理的dy3K/dy3K小鼠股四头肌的萎缩。(A)分别在经3-MA注射的(绿色和橙色)和未经3-MA注射的(蓝色和红色)野生型小鼠与dy3K/dy3K小鼠中，
测定纤维直径分布(占纤维总数的百分比)。曲线间存在显著差异(p<0.0001)。(B)平均纤维直径(μm)。(C)股四头肌湿重与单位体重的比例(百分比)(分别为：野生型，n=5；
dy3K/dy3K，n=4；经注射的小鼠，n=5)。*，P<0.05;**，P<0.001。

[0137] 图4.全身注射3-MA刺激dy3K/dy3K小鼠的股四头肌再生。(A)在经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠和野生型小鼠、未经注射的dy3K/dy3K小鼠和野生型小鼠(每组n=6)中，细胞核位于中央的纤维的比例。(B)上图：未经注射的野生型小鼠(n=5)和dy3K/dy3K小鼠(N=5)与经3-MA注射的野生型小鼠(n=6)和dy3K/dy3K小鼠(N=6)的股四头肌截面的共
免疫标记。层粘连蛋白γ1链(红色)表示纤维边界而胚胎肌球蛋白重链(eMHC)(绿色)
仅表示再生纤维。DAPI(蓝色)表示细胞核。标尺=40μm。下图：表达eMHC的纤维的百分比。(C)使用抗层粘连蛋白γ1链(红色)、MyoD(绿色)和DAPI(蓝色)抗体的共免疫染
色。箭头表示肌纤维间的间质间隙中的MyoD阳性细胞核。*，P<0.05；**，P<0.001。

[0138] 图5.dy3K/dy3K小鼠在全身注射3-MA后细胞凋亡消失。(A)在经3-MA注射的野生型和dy3K/dy3K股四头肌(a，b)中，使用抗胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶-3亚型(绿
色)和层粘连蛋白γ1链(红色)的抗体共免疫染色。3-MA全身注射14天后，在dy3K/
dy3K股四头肌有限区域发现绿色阳性纤维，(b)但肌肉的大部分标记为缺乏凋亡纤维(a)。
比例尺=40μm。(B)在经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠和野生型小鼠(两组均n=6)整个
股四头肌部分中，胱天蛋白酶-3阳性纤维的百分比。(C)在经3-MA注射的dy3K/dy3K小
鼠和野生型小鼠(每组n=6)整个股四头肌部分中，TUNEL阳性肌核的百分比。*，P<0.05；
***P<0.001。

[0139] 图6.自噬抑制后Akt 信号转导的恢复。经3-MA注射的野生型和dy3K/dy3K在48小时后(A)(每基因型n=3)和14天后(B)(n分别为4和6)，股四头肌磷酸化-Akt308/Akt
和磷酸化-Akt473/Akt的密度分析和代表性蛋白质印迹图像。数据以任意单位(AU)表示，磷酸化-Akt标准化为Akt。微管蛋白用作内参照。

[0140] 图7.全身注射3-MA改善dy3K/dy3K小鼠运动、体重和存活率。(A)在旷场试验中约4周龄小鼠的探索性运动(每组n=14)。(B)4周龄未经注射和经3-MA处理的野生型小鼠(分别为n=7)和dy3K/dy3K小鼠(分别为n=12)体重测量。(C)dy3K/dy3K±两次3-MA
全身注射的存活曲线。未经注射的dy3K/dy3K小鼠中位存活期是22日(15)，而经治疗的动物是37天。*P<0.05;**，P<0.001。

[0141] 图8.mdx小鼠股四头肌自噬未上调。5周龄野生型小鼠和mdx小鼠(每个基因型n=6)(上部)与3月龄野生型小鼠和mdx小鼠(每个基因型n=3)中，LC3B、组织蛋白酶L、
Lamp2a、Gabarapl1、Atg4b、Vps34和Beclin mRNA的相对mRNA的表达。GAPDH基因表达作为参照。*，P<0.01;**，P<0.001;***，P<0.0001。

[0142] 图9.全身注射3-MA使层粘连蛋白-α4和α2链的表达标准化。(A)在经全身注射3-MA处理的野生型小鼠(a，c)和dy3K/dy3K小鼠(b，d)(每个基因型n=6)股四头肌的
横截面上，使用抗层粘连蛋白-α2(a，b)和层粘连蛋白-α4(c，d)链抗体的免疫荧光实验。
比例尺=40μm。(B)14天后野生型、未经处理的dy3K/dy3K和经3-MA注射的dy3K/dy3K(n分别为6、4和5)股四头肌层粘连蛋白-α4链的密度分析。数据以任意单位(AU)表示，层粘连蛋白α4标准化为α-辅肌动蛋白。*，P<0.05。

[0143] 图10.层粘连蛋白-α2-缺陷周围神经中Atrogene表达未显著改变。3.5周龄野生型小鼠(N=5)和dy3K/dy3K小鼠(n=5)的LC3B，组织蛋白酶L，Lamp2a，Gabarapl1，Atg4b，Vps34和Beclin mRNA的相对量。GAPDH基因的表达作为参照。实施例

[0144] 摘要

[0145] 层粘连蛋白-α2链缺陷型先天性肌营养不良症(也称为MDC1A)是一种严重并且致残的疾病。近来研究表明，蛋白酶体活性增加是这种疾病的特征。自噬溶酶体途径是涉及肌细胞内蛋白质和细胞器降解的另一种主要系统。然而，在肌营养不良症(包括MDC1A)中，自噬-溶酶体途径是否过度活跃仍有待确定。使用层粘连蛋白-α2链缺陷的dy3K/dy3K小鼠模型和MDC1A患者肌肉细胞研究表明，在层粘连蛋白-α2链缺陷肌肉中自噬相关基因表达上调。此外，研究发现自噬抑制显著改善营养不良的dy3K/dy3K的表型。具体地，它表明全身注射3-甲基腺嘌呤(3-MA)减少肌肉纤维化、萎缩、细胞凋亡和增加肌肉再生和重量。重要的是，寿命和运动能力也大大提高。这些结果表明，增强自噬活动是致病因素和自噬抑制具有治疗MDC1A的能力。

[0146] 引言

[0147] 巨自噬(以下称为自噬或自噬作用)是一个多步骤的分解代谢过程，其涉及自噬体中大量的细胞质，长寿命的蛋白质和细胞器的封存，随后与溶酶体融合，且内容物由溶酶体水解酶消化(1，2)。自噬体通常在营养或生长因子缺失的条件下和内质网应激时被激活。此外，自噬作用也与许多生理过程(包括发育，分化，或类似神经变性疾病的病理症，溶酶体贮积病，感染或癌症)相关(1，3)。然而，人们对于自噬和肌营养不良症知道很少。骨骼肌中自噬途径的作用和调节在很大程度上仍是未知的，但可以相信，过度的自噬激活有助于不同分解代谢条件下的肌肉损失(4)。有趣的是，抑制自噬过程也可能导致肌肉萎缩(5)。在酵母中，自噬是由30多个自噬相关基因控制，其中许多与哺乳动物同源(6)。值得注意的是，通过抑制Akt，FoxO3控制自噬相关基因的转录(例如，LC3、组织蛋白酶L、Lamp2a、Gabarapl1、Vps34、Atg4b和Beclin)从而控制肌肉萎缩过程中的自噬-溶酶体途径(7-9)。

[0148] 最近，有人证明在VI型胶原缺陷型肌营养不良症中自噬受损，且在该疾病小鼠模型中自噬的再激活改善了营养不良症的表型(10)。另一种类型的先天性肌营养不良症是MDC1A(OMIM＃607855)，这是由人LAMA2基因的常染色体隐性突变引起的，该基因编码胞外基底膜蛋白层粘连蛋白-211的α2亚基。MDC1A的特点是严重的全身肌肉无力、关节挛缩和周围神经病变。约30%的患者在他们的第一个十年之内死亡(11，12)。所产生的无效突变体层粘连蛋白-α2链缺陷dy3K/dy3K小鼠模型重现了人类疾病并呈现了严重的肌营养不良症，而且dy3K/dy3K小鼠还显示周围神经病变(13，14)。层粘连蛋白-α2链缺陷肌肉组织学特征包括变性/再生循环、纤维大小变异、细胞凋亡和标记的结缔组织增生。另外，骨骼肌萎缩是MDC1A的一个普遍特征(11，12，15)。

[0149] 在下面的研究中显示，在层粘连蛋白-α2链缺陷肌肉中自噬相关基因表达上调，并且在dy3K/dy3K小鼠模型中抑制自噬过程显著改善营养不良症的表型。

[0150] 材料与方法

[0151] 转基因动物

[0152] 使用如前所述的层粘连蛋白-α2链缺陷小鼠(dy3K/dy3K)，其完全缺乏层粘连蛋白-α2链(13，20)。这些小鼠出现严重的肌营养不良症和外周神经病变，并且中位存活期约为22天。在所有的实验中，将dy3K/dy3K小鼠与其同窝野生型(WT)相比。根据动物管理准则并经地区伦理机构允许，动物养在生物医学中心(Lund)的动物设施中。

[0153] 原代肌细胞培养和分化

[0154] 原代成肌细胞从对照胎(妊娠12周)和MDC1A胎(妊娠15周)获得，在LAMA2基因外显子31呈现纯合无义突变。肌肉细胞是按照法国法律伦理规则获得的。

[0155] 细胞于6孔培养板中，使用含有20%胎牛血清(Gibco)的生长培养基(F10-Hammedium，Gibco公司)在温度为37℃、CO2为5%的条件下培养。汇合约70%时，通过换成融合培养基(DMEM，Gibco)来启动分化产生肌管，所述融合培养基中含有2%马血清(Gibco)、-6 -6
10 M胰岛素(Sigma)和2.5×10 M的地塞米松(Sigma)。直接将所述细胞于溶胞缓冲液
(50mM Tris-HCl,pH6.8,10%β-巯基乙醇,4%SDS,0.03%溴苯酚蓝和20%甘油)中粉碎，获得蛋白溶胞产物。

[0156] 全身注射3-甲基腺嘌呤

[0157] 全身用药是通过对2.5周龄和3.5周龄的dy3K/dy3K小鼠和对照同窝小鼠腹腔注射3-MA(15mg/千克)进行的。注射14天后处死小鼠，并进行股四头肌和胫骨前肌形态学分析、免疫荧光实验、定量RT-PCR或蛋白印迹分析。在安乐死之前，进行探索性运动测试。

[0158] RNA提取、逆转录和实时定量PCR

[0159] 使用RNeasy mini 试剂盒(Qiagen)(包括最初步骤的蛋白酶K消化液(Fermentas公司，240纳克/微升))，从6只dy3K/dy3K小鼠(3.5周龄)和6只WT同窝小鼠、经3-MA处理的5只WT小鼠和5只dy3K/dy3K小鼠的10mg股四头肌中提取总RNA。按照制造商说
明书，用随机引物和SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen公司)由lμg总RNA合成互补DNA。用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(Fermentas)一式三份地进行定量PCR。用实时定量RT-PCR法(轻循环仪，Roche)监测目标和参照基因的表达，引物为前述自噬基因LC3B、组织蛋白酶L、Lamp2a、Gabarapl1、Atg4b、Vps34和Beclin(8)。通过连续稀释cDNA-r/slope -CT
模板的扩增(E=10 )评价每个引物对的扩增效率。使用公式E 计算效率校正的RNA
水平(任意单位)。然后计算相对于内参基因GAPDH和相对于野生型股四头肌的表达水平。

[0160] 蛋白提取和蛋白印迹分析

[0161] 从6只野生型小鼠、6只dy3K/dy3K小鼠(3.5周龄)和3-MA注射48小时或14天后的6只dy3K/dy3K小鼠中获得分离的股四头肌。每个样品立即在液氮中冷冻并用研
钵研成粉末。如先前所述获得蛋白质提取物(16)。将总共30μg变性蛋白上样至10-20%丙烯酰胺SDS-凝胶上(Clearpage，CBS Scientific)，并印迹到硝酸纤维素膜(Hybond-C，Amersham)1.5小时(Biorad)。在室温在PBS、0.01%吐温-20、5%牛奶中阻断该膜一小时，并用抗pAkt(Ser473,1/2000,#4060或Thr308,1/1000,#2965,Cell Signaling Technol
ogy),Akt(1/1000,#4685,Cell Signaling Technology),Vps34(1/200,V9764,Sigma) 或LC3B(1/250,#2775,Cell Signaling Technology)的兔多克隆抗体在4℃孵育过夜。此后，用PBS、0.05%吐温-20将印迹洗涤3次，每次10分钟，用辣根过氧化物酶偶联多克隆羊抗兔抗体(1/4000，SC-2004，Santa Cruz Biotechnology)或羊抗小鼠抗体(1/4000，SC-2005，Santa Cruz Biotechnology)孵育1小时。膜在ECL(Amersham Biosciences)中孵育，暴露于Hyperfilm(Amersham Biosciences)并显影(AGFA，Curix60)。为使装载标准化，每个膜再用小鼠单克隆抗微管蛋白(1/4000,clone DM1A,Sigma)杂交。使用Image J1.40进行量化(http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html)。

[0162] 组织学和免疫荧光实验

[0163] 在安乐死后迅速从野生型、dy3K/dy3K和经注射的小鼠(各组n=6)解剖得股四头肌和胫前肌，并用液氮冷冻于OCT(Tissue TEK)中。7μm连续切片或用苏木精-伊
红染色，或经处理用于使用以下抗体的标准程序免疫荧光实验：抗LC3B(1/100，＃3868，Cell Signaling Technology)、层粘连蛋白γ1链(1/1000，＃1083)、层粘连蛋白-α4链(1/400，＃1100)和层粘连蛋白β2链(1/400，＃1117)(由T.Sasaki博士慷慨提供)兔
多克隆抗体，抗层粘连蛋白γ1链(1/200,MAB1914,Chemicon)和肌腱蛋白-C(未稀释，
MTn15)大鼠单克隆抗体，抗III型胶原(1/100，＃1330，SouthernBiotech)羊多克隆抗体，以及对抗胱天蛋白酶-3(1/100,CPP32,BD Transduction Laboratory)、胚胎肌球蛋白重链(F1.652,Developmental Studies Hybridoma Bank)和MyoD(1/100,克隆5.8A Dako)的小鼠单克隆抗体。为检测肌纤维细胞凋亡，按制造商(GenScript)的指示使用TUNEL检测试剂盒。使用Zeiss Axioplan荧光显微镜分析各切片。使用含Openlab3 软件的ORCA1394ER 数码相机抓拍图片。

[0164] 探索性运动测试

[0165] 在旷场试验中检查探索性运动。在每个实验中，注射3-MA14天后的小鼠(dy3K/dy3K和野生型分别为11例)被放入一个新的笼子里并允许其探索笼子5分钟。手动测量小鼠四处走动的时间。

[0166] 存活曲线

[0167] 监测经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠(n=9)的死亡。用GraphPad Prism4软件构建存活曲线。

[0168] 形态分析

[0169] 对未经处理的野生型和dy3K/dy3K、注射3-MA的野生型和dy3K/dy3K动物(每组n=6)的整个股四头肌或胫骨前肌节进行测定。使用Image J软件测量肌腱蛋白-C、III型胶原阳性面积、eMHC阳性纤维、胱天蛋白酶-3阳性纤维、TUNEL阳性肌核和纤维直径。测定每只小鼠至少1500条纤维最小Feret直径(41)。将相同数目的纤维用于定量测定细胞核位于中央的纤维。从7只未经注射的野生型或dy3K/dy3K与经3-MA处理的野生型(n=4)和dy3K/dy3K(n=6)动物测定湿股四头肌重量并与体重相关联。

[0170] 统计分析

[0171] 用GraphPad Prism4的软件完成所有试验的显著性分析。对于定量PCR实验、蛋白质量化、形态分析和探索性运动测试，进行单因素方差分析(one way ANOVA)然后进行Bonferroni事后多重比较检验。关于纤维大小分布，计算χ2-检验并估算分布的配对比较，相关的p值小于0.0001。最后，应用统计对数秩检验分析存活曲线的显著性。数据始终表示为平均值±标准差。

[0172] 结果

[0173] 层粘连蛋白-α2链缺陷肌肉的自噬相关基因的表达增加

[0174] 为了测定在层粘连蛋白-α2链缺陷肌肉中自噬溶酶体途径的活性是否增加，我们首先分析这一途径的成员在dy3K/dy3K动物和尤其是由转录FoxO3控制的动物(其表达增加约2倍于dy3K/dy3K动物(16))中的表达。我们检测到dy3K/dy3K小鼠股四头肌微管相关蛋白-1轻链3B(LC3B)的mRNA水平显著增加(图1A)。LC3B是在自噬过程中进行翻
译后修饰的三种(人类)LC3亚型的一种。自噬体中LC3的存在和LC3转化为较低迁移形
式LC3II，已被用作自噬指标(17，18)。通过免疫荧光分析，我们检测到dy3K/dy3K股四头肌肌纤维积累的LC3B(图1B)且蛋白印迹分析显示dy3K/dy3K股四头肌LC3BII表达大致
增加2倍(图1C)。同样，我们注意到，dy3K/dy3K股四头肌中，自噬体膜标记物Gabarapl1、Beclin和Vps34以及半胱氨酸蛋白酶Atg4B的mRNA表达增加(图1A)。最后，在dy3K/dy3K股四头肌中，溶酶体标记物组织蛋白酶L和Lamp2a的mRNA表达也显著增加。

[0175] 我们分析对照患者和层粘连蛋白-α2链缺陷患者的原代成肌细胞和肌管，来确定在人层粘连蛋白-α2链缺陷肌肉中自噬相关基因的表达是否增强。我们注意到LC3BII、Vps34、组织蛋白酶L和Beclin的蛋白表达在MDC1A肌管中增加，但在对应的成肌细胞则没有增加(图1D)。

[0176] 层粘连蛋白-α2链与肌营养不良症蛋白-糖蛋白和其若干组分中突变的相互作用导致各种形式的肌营养不良症(19)。为了调查当肌营养不良症蛋白缺乏和肌营养不良症蛋白-糖蛋白复合物其他成员的减少时，自噬是否变化，我们量化mdx小鼠(一种Duchenne型肌营养不良症小鼠模型)股四头肌自噬相关基因的表达水平。我们未发现在5周或3月龄小鼠的LC3B、Gabarapl1、Beclin、Vps34和Atg4B的mRNA的表达发生重大变化。只有组织蛋白酶LmRNA在5周和3个月大的mdx肌肉中表达升高，且Lamp-2mRNA在3月龄mdx小鼠的表达也增加(图8)，这表明在该疾病中微自噬及随后的伴侣蛋白介导的自噬可发生变化。

[0177] 全身注射3-甲基腺嘌呤(3-MA)恢复自噬基因在层粘连蛋白-α2链缺陷的肌肉中的表达

[0178] 由于自噬-溶酶体途径系统在dy3K/dy3K的肌肉中似乎过度活跃，我们设想，抑制自噬途径可改善肌肉形状和小鼠生理学。因此，我们施用自噬抑制剂3-MA至2.5周龄dy3K/dy3K小鼠腹膜中。在这个年龄段中，dy3K/dy3K小鼠开始区别于它们的同窝小鼠。在3.5周龄重复注射。dy3K/dy3K小鼠的中位存活期约为22天，全部或大多数dy3K/dy3K在4周龄时死亡(16)。我们分析了注射后14天(dy3K/dy3K小鼠应该死亡的时间点)的小鼠及其肌肉，值得注意的是，我们发现全身注射3-MA使自噬相关基因的表达恢复至基础水平(图1A-C)。

[0179] 全身注射3-MA提高层粘连蛋白-α2链缺陷肌肉的肌肉形态

[0180] 显著地，3-MA注射导致肌肉形态相当大的改善。我们首先通过形态学测量评估营养不良症过程(病理纤维化和肌纤维直径)的主要组织学标志(hallmarks)。此前已被证明III型胶原的表达在dy3K/dy3K肌肉中增加(16)，其在经3-MA注射的小鼠中的表达与未经注射的dy3K/dy3K小鼠相比有所减少(图2B)。为了进一步证实经3-MA处理的动物中纤维化减少，我们分析了肌腱蛋白-C的表达，其也已被证明在dy3K/dy3K肌肉中增加(16，
20)。类似地，经3-MA注射的小鼠与未经注射的dy3K/dy3K小鼠相比较，其肌腱蛋白-C的表达降低(图2B)。

[0181] 我们还研究了经3-MA处理的dy3K/dy3K小鼠层粘连蛋白-α4和β2链的表达。先前已表明，在dy3K/dy3K肌膜中，层粘连蛋白-α4链的表达增加，而层粘连蛋白β2链表达减少(20，21)。在经注射的小鼠中，两种蛋白质的表达接近正常小鼠(图9)。

[0182] dy3K/dy3K肌肉的平均纤维直径显著降低是公认的(16，22，23)。值得注意的是，平均纤维直径在3-MA注射后增加，且对于野生型和dy3K/dy3K，经注射的动物股四头肌纤维尺寸分布显著移向较大的纤维(图3A，B)。我们观察到，25%的dy3K/dy3K股四头肌纤维的直径小于26μm，而在野生型和dy3K/dy3K经注射的动物中分别约为15%。此外，与年龄匹配的未经注射的dy3K/dy3K小鼠相比，经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠的股四头肌湿重与单位体重比例是正常的(图3C)。

[0183] 全身注射3-MA刺激层粘连蛋白-α2链缺陷肌肉的肌肉再生

[0184] 位于中央细胞核比例是退变-再生过程的主要特征之一。在经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠中，细胞核位于中央的细胞数目略有但显著升高(图4A)。我们还进行免疫荧光实验分析再生标记物胚胎肌球蛋白重链(新再生纤维的特异性标记物)和MyoD1(存在于活化的卫星细胞和成肌细胞)的表达。事实上，表达eMHC复溶纤维比例在经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠中增加显著(图4B)。而且，MyoD1阳性细胞核的数量在经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠中增加(图4C)。

[0185] 全身注射3-MA后细胞凋亡减少

[0186] 因为细胞凋亡有助于该疾病的进展，我们分析了全身注射小鼠的骨骼肌发生的细胞凋亡率。如前所述，在dy3K/dy3K小鼠中胱天蛋白酶-3阳性纤维(包含胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶原3蛋白)的数量与对照组相比显著增加(16)。3-MA注射48小时后，我们能够发现胱天蛋白酶-3阳性纤维的比例与未经注射的dy3K/dy3K小鼠相同(数据未显示)。
然而，注射14天后，在经3-MA注射的dy3K/dy3K股四头肌中，胱天蛋白酶-3阳性纤维的比例显著减小(图5A-B)。这些结果利用TUNEL酶标记法进一步证实。我们发现，在经3-MA处理的dy3K/dy3K动物中TUNEL阳性肌核的比例显著降低(图5C)。

[0187] 全身注射3-MA恢复Akt磷酸化

[0188] 最近，我们证明了在dy3K/dy3K股四头肌中苏氨酸308和丝氨酸473上的Akt磷酸化均减少，但Akt总水平是不变的(16)。为了研究注射3-MA是否可以恢复Akt活性，注射48小时和14天后我们处死小鼠，并了解到在两个时间点上，两个位点的Akt磷酸化都恢复到野生型水平(图6A-B)。

[0189] 全身注射3-MA增加存活和运动能力，但不显著改善周围神经病变

[0190] 在旷场试验中，dy3K/dy3K小鼠显著地不太活跃(16)。显著地，经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠显示与野生型小鼠相同水平的活力(图7A)。另外，经3-MA处理的dy3K/dy3K小鼠体重显著高于未经注射的dy3K/dy3K小鼠，尽管它们从未达到野生型小鼠的体重(图7B)。此外，经3-MA注射的dy3K/dy3K小鼠的中位存活期是37天(图7C)，而已证明未经处理的dy3K/dy3K小鼠为22天(16)。最后，虽然存活和肌肉形态显著改善，但短暂的腿麻痹常发生于经3-MA处理的dy3K/dy3K小鼠的一条腿，类似麻痹发生在未经处理的dy3K/dy3K小鼠中但未发生在3-MA注射的野生型小鼠中(16)(数据未显示)。但是，这种短暂的麻痹对运动能力无明显影响。然而，很显然，3-MA没有明显地改善外周神经的病理。与此观察一致，我们发现在层粘连蛋白-α2链缺陷坐骨神经中自噬相关基因mRNA水平没有增加(图10)。

[0191] 讨论

[0192] MDC1A是一种目前尚无法治愈的使人衰弱的肌肉疾病。已在MDC1A小鼠模型中探索若干方法预防该疾病，这些方法包括基因置换疗法(20，24，25)、抗细胞凋亡疗法(26-28)、蛋白酶体抑制疗法(16)、细胞疗法(29)和改进的再生疗法(30)。尽管转基因策略(例如过度表达层粘连蛋白-α2链、小型集聚蛋白(mini-agrin)，特别是层粘连蛋白-α1链)可能已提供了最完整的肌肉恢复，但临床上还没有可行性，而且细胞凋亡和蛋白酶体的药理学抑制分别仅导致部分恢复。因此，对于其他潜在的治疗靶点应加以探索。在这里，我们呈现的数据表明自噬增加是MDC1A的致病因素。我们发现在层粘连蛋白-α2链缺陷小鼠和人类肌肉细胞中若干自噬相关基因表达增加。我们已经表明，自噬的抑制(在MDC1A的dy3K/dy3K小鼠模型中使用3-MA)，显著降低营养不良症小鼠的多种病理症状。

[0193] 细胞凋亡已被描述为MDC1A的一个主要特征，在MDC1A的dyW/dyW小鼠模型中通过基因疗法或药理学疗法抑制细胞凋亡改善了若干病理症状(26-28，31)。自噬和凋亡通过共同的蛋白质和功能建立联系。首先，自噬是一个消除受损蛋白质或细胞器的基础机制。因此，线粒体或错误折叠蛋白的积累可引发氧化应激和细胞死亡。第二，最近已描述了在骨骼肌中通过存活信号调节自噬，其受控于通过mTOR的快速转录非依赖的机制和长期、但更有效的需要FoxO3的转录程序(7-9，32)。最后，抗凋亡蛋白(如Bcl-2家族成员)抑制Beclin-1而自噬蛋白的诱导可促进细胞死亡(33，34)。因此，测试组合抑制细胞凋亡和自噬是否会进一步恢复层粘连蛋白-α2链缺陷小鼠的表型是有意义的。此外，我们最近发现，在dy3K/dy3K肌肉中蛋白质的全局泛素化升高，且蛋白酶体抑制改善了营养不良症性表型(16)。此外，现已证明，还可通过能够结合LC3的p62/SQSTM1复合体将泛素化蛋白递送至自噬体(35-39)。因此，我们想评估自噬和蛋白酶体抑制的组合治疗方法。

[0194] 有趣的是，结合我们这里给出的数据，发现自噬的非正常功能是先天性肌营养不良症最常见两种形式的致病因素，并且两者都与胞外基质蛋白质的缺陷关联(10)。因此，我们推测细胞外基质不平衡地影响了自噬途径。我们所提供的关于Duchenne型小鼠模型mdx的其他数据表明，自噬没有变化，这强化了这一假说。在这个模型中，微自噬和随后的伴侣蛋白介导自噬(取决于Lamp2)可能会伴疾病的进展而激发。应该进一步明确，自噬在其他先天性肌肉疾病中(抗肌萎缩相关糖蛋白肌病或先天性肌病)潜在的主要或次要贡献。自噬体存在于许多肌病中，且是一组命名为自噬空泡肌病的肌肉病症的主要特征。
这组肌病由以下疾病组成：晚发性Pompe疾病，由溶酶体酸性麦芽糖酶缺陷引起(MIM编号＃232300)；Danon疾病，主要影响心脏，由于LAMP2基因(MIM编号＃300257)的缺陷所引起；和X-连锁肌病伴过度自噬(XMEA)，与VMA21基因的突变相关(40)。因此，自噬相关基因可能是遗传学上不确定的肌肉疾病中突变的潜在候选基因。

[0195] 综上所述，我们的研究首次表明，自噬可在先天性肌营养不良症状况下过度活化。另外，它的抑制改善了层粘连蛋白-α2链缺陷小鼠的肌肉表型。

[0196] 结果提供令人信服的证据支持自噬抑制剂在治疗和预防肌营养不良症(如MDC1A)中的有效性。

[0197] 参考文献

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