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吸收光谱扫描流动血细胞计数

阅读：359发布：2020-05-14

专利汇可以提供吸收光谱扫描流动血细胞计数专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及吸收光谱扫描流动血细胞计数。本发明提供了用于分析流动流中的荧光粒子的激发光谱的系统和方法。该系统使用白光激光器和颜色分离光学器件来提供用于照明流动流的区域的空间分布的、连续的颜色光谱激发光系统。穿过探测区域的粒子横穿激发光的全色散光谱，并且在粒子穿过探测区域时连续地测量来自粒子的荧光发射。所测量的在激发光的每个波长下的荧光发射提供了粒子的激发光谱，该激发光在粒子穿过探测区域时改变通过激发光的全光谱。，下面是吸收光谱扫描流动血细胞计数专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于测量流体流中的荧光粒子的激发光谱的流动式粒子分析仪，所述流动式粒子分析仪包括：
a)发射准直的宽光谱激发光束的激发光源，
b)将激发光束聚焦并引导到所述流体流中的探测区域上的激发光学器件，其中所述激发光学器件包括使激发光束的光谱色散的色散元件，并且其中所述色散元件被确定朝向以使得产生的连续改变波长的光谱色散在小管通道的探测区域上，使得穿过所述小管通道的粒子将会横穿激发光束的色散的连续的光谱；以及
c)测量从探测区域中的粒子发射的光的探测光学器件。
2.根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，还包括光学小管，光学小管具有延伸通过所述光学小管的所述小管通道，其中所述流体流穿过所述小管通道，并且其中流体流中的所述探测区域在所述小管通道中。
3.根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所述激发光源包括白光激光器。
4.根据权利要求3所述的流动式粒子分析仪，其中，所述激发光源还包括限制由白光激光器发射的波长的范围的滤波元件。
5.根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括光电探测器，所述光电探测器构造为测量比被引导到探测区域上的激发光的光谱中的波长更长的波长的范围。
6.根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件被构造为获得由探测区域中的粒子产生的发射光谱。
7.根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述发射光谱是由探测区域中的粒子产生的全部发射光谱的至少大部分。
8.根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括长通滤波器。
9.根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括单个探测器。
10.根据权利要求9所述的流动式粒子分析仪，其中，所述单个探测器是宽波段探测器。
11.根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所测量的从探测区域中的粒子发射的光按照在激发光束的每个波长的激发效率来改变强度，并获得粒子的激发光谱。

说明书全文

吸收光谱扫描流动血细胞计数

[0001] 本申请是申请日为2012年05月31日、申请号为201280031089.7，发明名称为“吸收光谱扫描流动血细胞计数”发明专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及流体流中的荧光粒子的光学分析的领域。

背景技术

[0003] 流动式粒子分析仪(诸如流动血细胞计数器)是公知的分析工具，其能够基于诸如光散射和荧光的光学参数来表征粒子。在流动血细胞计数器中，例如，流体悬浮液中的粒子(诸如分子(molecule)、与分析物结合的珠子或个体细胞)通过探测区域，在该探测区域中，粒子暴露到通常来自于一个或多个激光器的激发光，并且粒子的光散射和荧光特性被测量。其粒子或成分通常由荧光染料标记，以有助于探测，并且可以通过使用光谱有区别的荧光染料来标记不同粒子或成分,以同时探测多种不同粒子或成分。通常，有多种光电探测器，每一个光电探测器用于被测量的每个散射参数，并且每一个光电探测器用于被探测的每个有区别的染料。所获得的数据包括对于光散射参数和荧光发射中每一个测量的信号。

[0004] 血细胞计数器还包括用于记录所测量的数据和分析数据的装置。例如，通常，数据存储和分析是使用连接到探测电子装置的计算机来进行的。数据通常被以表格形式存储，其中每一行对应于每个粒子的数据，并且列对应于每个所测量的参数。用来存储来自于流动血细胞计数器的数据的标准文件格式(例如“FCS”文件格式)的使用有助于使用独立的程序和机器来分析数据。使用当前的分析方法，为了易于可视化，数据通常被显示为2维(2D)图表，但是其他方法可以被用来将多维数据可视化。

[0005] 使用流动血细胞计数器测量的参数通常包括由粒子沿着几乎向前的方向散射的激发光(被称作为前向散射(FSC))，由粒子沿着几乎侧向散射的激发光(被称作为侧向散射(SSC))以及从荧光粒子以光谱的一个或多个通道(频率范围)发射的光(被称作为FL1、FL2等)或者由主要在该通道探测的荧光染料发射的光。不同的细胞类型可以由由于利用染料标记的抗体对各种细胞蛋白质标记而产生的散射参数以及荧光发射来识别。

[0006] 流动血细胞计数器可以从例如BD Biosciences(San Jose，CA)买到。流动血细胞计数器在本领域中在各种文献中充分描述，例如包括：Landy等人合编，Clinical Flow Cytometry，Annals of the New York Academy of Sciences Volume 677(1993)；Bauer等人合编，Clinical Flow Cytometry:Principles and Applications，Williams&Wilkins(1993)；Ormerod编写，Flow Cytometry:A Practical Approach,Oxford Univ.Press(1997)；Jaroszeski等人合编，Flow Cytometry Protocols，Methods in Molecular Biology No.91,Humana Press(1997)；以及Shapiro，Practical Flow Cytometry第四版，Wiley-Liss(2003)；通过引用将它们全部结合在这里。通过由多颜色流动血细胞计数器进行的细胞(或其他粒子)的分析获得的数据是多维度的，其中每个细胞对应于由所测量的参数限定的多维空间中的点。细胞或粒子的布居(population)被识别为数据空间中的点的簇。因此，布居和簇的识别可以通过绕显示在数据的一个或多个2维图(被称作为“散射图”或“点图”)绘出门限(gate)来手动地进行。可选择地，簇可以被识别，并且限定布局的限制的门限可以被自动地确定。用于自动化门限的大量方法已经在文献中描述了。例如参见美国专利号4,845,653、5,627,040、5,739,000、5,795,727、5,962,238、6,014,904、6,944,338，通过引用将他们全部结合在这里。

[0007] 在典型的基于激光器的流动血细胞计数器中，可用的激发波长受到合适的激光器的可用性的限制。波长可选择的单波长激发源已经被描述为用于流动血细胞计数器。例如，美国专利No.4,609,286(Sage)描述了流动血细胞计数器，其使用色散棱镜来从用作激发源的光谱丰富光源选择波长。光源由棱镜色散，使得波长可以使用狭缝来选择，以允许基本单波长的光通过，并阻挡全部其他波长。期望的波长可以通过将狭缝物理地移动到光谱中的期望波长来选择。

[0008] Telford等人在2009年于Cytometry A 75(5):450-459描述了使用超连续谱白色激光作为流动血细胞计数器的激发源。超连续谱白色激光器在从近紫外到红外的宽波段范围内连续地发射，由此对于人眼看起来是白色的。Telford等人描述了将声光滤波器或有涂层的带通滤波器插入到光束的前方，以隔离具体波长范围，从而允许用户从超连续谱选择感兴趣的带宽。所得到的激发源可以被用来通过使用具有期望颜色透射要求的滤波器选择任何单激发波长和带宽。

[0009] 在典型流动血细胞计数器中，荧光发射被在多个探测通道(每个探测通道被限定为光谱内的频率范围)中测量，其中，每个通道中的发射被使用单个光电探测器测量。因此，每个探测器提供频率的范围的单个测量结果。典型地，探测器通道被选择为使得每个通道被优化，以从不同染料之一探测发射。可选地，发射光可以使用探测通道的阵列来测量，使得每个染料发射被在一个以上通道中测量。

[0010] Robinson等人在由Tuan Vo-Dinh等人编辑的Advanced Biomedical and Clinical Diagnostic Systems III,Proc.of SPIE Vol.5692(SPIE,Bellingham,WA,2005):3579-365中描述了一种流动血细胞计数器探测系统，其中发射的光由衍射光栅色散到32通道PMT探测器上。因此，荧光发射可以在32个窄的、相邻的探测通道中测量，这些探测通道一同跨越光谱区域。代替对于每个染料的单个荧光强度值，使用该系统获得的数据对于每个染料包括对于多个相邻探测通道的强度值。从多个光谱相邻的探测通道获得的测量结果的集合取决于染料的发射光谱。

发明内容

[0011] 本发明提供了用于分析流动流中的荧光粒子的激发光谱的系统和方法。

[0012] 本发明的系统使用白光激光器和颜色分离光学器件来提供空间分布的、连续的颜色光谱激发系统，其被用于照明流动流的区域。激发光的光谱沿着流动流的长度展开，使得光谱展开到比待检测的粒子的直径大得多的区域。流动通过探测区域的粒子将会在任何一点仅由小的波长范围激发，但是在其横穿整个探测区域时将会暴露到激发光的全部光谱。随着荧光粒子行进通过激发束并且由此通过连续地改变激发光的波长而受到激发，探测器测量来自于粒子的荧光发射，该荧光发射按照在每个波长的激发效率来改变强度。其结果是扫描粒子的激发光谱。

[0013] 激发光谱的空间扩展(展开)是通过使光穿过诸如棱镜或衍射光栅的颜色分离光学器件(例如色散元件)来实现的。颜色分离光学器件被确定方向，使得光谱沿着流动路径展开，从而覆盖纵向探测区域。在流中流动的粒子将会随着其穿过探测区域而暴露到连续地改变波长的光。

[0014] 一般来说，光谱可以沿着流动路径展开，使得移动粒子将会从短波长到长波长或者从长波长到短波长扫描(sweep)激发光谱。优选地，光谱沿着流动路径展开，使得移动粒子将会从短波长到长波长扫描激发光谱。

[0015] 在一个实施例中，单个宽波段探测器被用于测量来自于在粒子穿过探测区域时由连续光谱激发束激发的粒子的发射。因此，粒子发射可以在粒子由激发光的全光谱顺序地激发时被连续地测量。由单探测器探测的波长的范围优选地被选择为在荧光粒子发射的范围内，但是在激发光谱之外。优选地，探测器被构造为使用合适的长通滤波器测量比最长激发波长更长的全部波长。

[0016] 在另一个实施例中，激发光源引起连续可变的、波长可选择的带通滤波器(可调谐滤波器)，其定位在白光激光器激发光源和颜色分离光学器件之间。滤光器允许从由白光激光器提供的颜色的范围选择任何基本单颜色(波长的窄波段)的激发束。该基本单颜色的激发束将会照明探测区域内的单个点。因为光谱由颜色分离光学器件展开到探测区域并且色散的角度取决于光的颜色，所以由滤波器选择的激发光的颜色的改变也导致探测区域内的照明点的位置的改变。

[0017] 连续可变的、可选择波长的带通滤波器被构造为将激发光的波长从光谱的一端连续地改变到另一端，这也导致照明点从探测区域的一端扫到另一端。滤波器的改变速率也被计时，使得照明点以与粒子在流动流中的速率相同的速率穿过探测区域。通过在粒子进入探测区域时开始光谱扫描，粒子将会在其穿过探测区域的同时保持被照射，然而是被以激发光谱的连续改变的颜色照射。

[0018] 连续改变的光谱扫描被与粒子流动对准，并且使得能够使用粒子运动扫描通过光谱，但是将激发光限制到粒子，并且可能限制到受限的围绕区域。这将可能导致探测通道中的信号噪声的杂散激发光的量最小化。

[0019] 在另一个实施例中，多个宽波段探测器被用来测量在粒子穿过探测区域时从由连续光谱激发束激发的粒子的发射。每个探测通道(由探测器测量的频率范围)被选择为使得每个通道在激发光谱的至少一部分之外，使得连续的探测通道交错，每个通道以更长的波长开始并且激发光的光谱有少许重叠。

[0020] 使用交错探测通道的实施例优选地与经可调谐地过滤的激发光一起使得能够在于激发光的光谱的一部分重叠的波长中探测粒子发射。随着粒子移动通过探测区域并且由逐渐更长的波长照射，测量波长比激发光的波长更长的测量光的探测通道可以被用来探测粒子发射。当激发光波长在扫描期间变长，使得其余探测通道重叠时，由于由激发光引起的干涉，探测通道对于测量发射不再有用。此时，由一个或多个剩余探测通道探测发射。类似地，当激发光波长在扫描期间变长，使得其与第二探测通道重叠时，由于由激发光引起的干涉，该探测通道对于测量发射不再有用，并且发射由一个或多个剩余探测通道探测。最终探测通道优选地使用长通滤波器测量比最长激发波长更长的全部波长。

[0021] 在另一个实施例中，多个带通滤波器被用来测量来自于在粒子穿过探测区域时由连续光谱激发束激发的粒子的发射。每个探测通道(由探测器测量的频率范围)被选择为使得探测通道不重叠。优选地，每个探测通道将会大致对应于被用于标记粒子的荧光染料的激发光谱极值，使得每个探测通道主要测量来自于一个染料的发射。这使得能够相对独立地测量用于标记多个被标记粒子的每种染料的激发光谱。

[0022] 在另一个方面，本发明提供了使用本发明的仪器分析荧光粒子的方法。

[0023] 本发明和仪器可以被用来分析由一个或多个染料标记的粒子。对于被单染料染色的粒子，例如通过将所测量的激发光谱与在先测量的来自于用于试验的染料的激发光谱匹配，可以从激发光谱模式识别染料。对于被多种染料染色的粒子，例如通过将所测量的激发光谱与在先测量的激发光谱的组合匹配，可以从激发光谱模式识别染料。各种已知的“拟合优度”算法适合于将所测量的光谱与已知光谱的组合匹配。附图说明

[0024] 图1A、图1B和图1C描绘了本发明的流动式粒子分析仪的实施例的光学系统的元件的示意性表示。

[0025] 图2A、图2B和图2C描绘了荧光粒子穿过流动通道以及照明粒子的激发光。

[0026] 图3A、图3B和图3C描绘了本发明的流动式粒子分析仪的另一个实施例的光学系统的元件的示意性表示。

[0027] 图4A、图4B、图4C和图4D描绘了荧光粒子穿过流动通道以及照明粒子的激发光。

[0028] 图5描绘了荧光粒子的激发和发射光谱、用于激发粒子的激发光源的光谱以及用于探测粒子发射的探测通道之间的关系。

[0029] 图6描绘了荧光粒子的激发和发射光谱、用于激发粒子的激发光源的光谱以及用于探测粒子发射的两个重叠(交错)的探测通道之间的关系。

[0030] 图7描绘了荧光粒子的激发和发射光谱、用于激发粒子的激发光源的光谱以及用于探测粒子发射的两个不重叠的探测通道之间的关系，其中每个探测通道被选择来近似地对应于不同染料的激发极值(maxima)。

具体实施方式

[0031] 为了清楚提供以下的定义。除非特殊指明，全部的术语按照本领域中常用的那样使用。这里上文和下文引用的全部相关文件通过引用结合到这里。

[0032] “流动式粒子分析仪”被用在这里指示通过将粒子穿过一个或多个光学探测器来分析悬浮在流动流体流中的粒子的任何仪器，并且例如包括分析或分类流动血细胞计数器、血液学分析仪和细胞计数器。包括粒子的流体流(流动流)通常穿过光学小管(cuvette)中的通道，在其中执行光学分析，但是光学分析可以对于从喷嘴喷射的空气中的流体流进行。小管和通道的至少一部分(优选地全部)是光学透明的，以使得能够进行流体流内的粒子的光学探测。例如，在典型流动血细胞计数器中，光学探测是通过使用来自小管外侧的激发光激发荧光地标记的粒子来进行的，并且来自粒子的荧光发射是使用定位在小管外侧的光电探测器检测的。小管的光学透明的部分可以由任何合适的材料制成，包括熔融硅、石英、光学玻璃或光学梯度塑料。

[0033] 如这里所使用的，“系统”和“仪器”意图包括硬件(例如，机械和电子器件)和相关软件(例如，计算机程序)组件。

[0034] 如这里所使用的，光电探测器广义地表示光电探测器本身以及任何相关的光学和/或电子器件。例如，信号放大(光电探测器增益)可以由光电探测器单独提供或者由放大光电探测器的输出的分离信号放大器提供。由光电探测器测量的光可以通过使用滤波器、反射镜、透镜或其他光学器件来限制。由于这个原因，“光电探测器”被用在这里单独指示光电探测器或者指示伴随一个或多个信号放大器和光学器件的光电探测器，如果存在的话。

[0035] “探测器通道”、“探测通道”或“通道”指的是由特定光电探测器检测的波长的范围。所探测的波长的范围通常使用频率相关滤波器和/或分光反射镜来确定，如本领域中已知的。为了清楚，术语“通道”在这里的使用与流动血细胞计数器领域中的次级使用不同，以表示可以由单个探测器探测的强度值的范围的离散细分。

[0036] 在一些实施例中，使用单个探测器通道，其中，探测器通道由带通滤波器或由长通滤波器限定，其中带通滤波器传输两个阈值波长之间的波长的光，并且长通滤波器仅传输比某阈值波长更长的波长的光。

[0037] 在其他实施例中，由长通滤波器限定的多个探测器通道被使用，其中每个长通滤波器传输比不同阈值波长更长的波长的光，使得探测器通道部分重叠。

[0038] 在其他实施例中，由带通滤波器限定的多个不重叠探测器通道被使用，以有助于多个光谱不同的荧光染料的独立测量。染料和探测器通道被选择，使得每个染料的发射极值尽可能地在不同的探测器通道内，即，使得每个染料与被优化来探测来自该染料的光的探测器通道匹配。然而，由于其发射光谱的宽度，来自于给定染料的光可能在一个或多个其他探测器通道中发射。在除了最接近地匹配染料的发射极值的探测器通道之外的探测器通道内由染料发射的光在这里被称作为“溢出(spillover)”。最接近地匹配染料的发射极值的探测器通道在这里参照给定染料被称作为染料探测通道或主要通道。全部的其他探测器通道参照给定染料被称作为溢出通道或次级通道。染料及其染料探测通道将会被称作为“相应的”或“匹配的”。参照探测通道，对应于探测通道的染料被称作为主要染料；向探测通道内发射溢出的其他燃料被称作为次级染料。

[0039] 如这里所使用的，术语“粒子”指的是合成粒子(诸如微粒子或珠子)以及从生物源得到的粒子(诸如真核细胞、细菌、病毒或高分子)二者。如这里所使用的，粒子的“布居”指的是相对于待测量的参数表现出基本相同的光学特性的粒子的组，诸如相同类型的细胞(细胞布居)或者在实际制造公差内具有相同尺寸、形状和成分的合成珠子。

[0040] 荧光粒子在这里被用于表现出可检测的荧光的任何粒子。粒子可以是固有的荧光的，或者可以包括一个或多个荧光染料。例如，细胞通常使用结合到细胞子部分的染料-抗体结合物(conjugate)由一个或多个荧光染料标记，以能够进行检测和分析，并且被标记的细胞是荧光粒子的示例。

[0041] 这里使用的术语“MFI”表示荧光粒子的布局的平均或中值荧光强度。将会理解可以使用布居荧光的其他统计测量结果，诸如截断的平均荧光或截断的中值荧光。

[0042] 光谱指的是在白光(或宽光谱光源)的光束诸如通过穿过棱镜而被散射时形成的颜色的连续波，因此其成分波长按照顺序排列。参照这里使用的宽光谱或白光激发源，诸如该光激光器，光谱指的是由激发源发射的波长(颜色)的连续光谱。如这里使用的“激发源”指的是发光组件(诸如激光器)以及任何相关光束成形或滤波组件(如果存在的话)。由激发源发射的波长的范围整体可以被相对于由发光组件单独发射的波长的范围调整或限制。例如，由白光激光器发射的光谱可以被以未经调整的形式使用，或者该光谱可以由适当的滤波来限制，以提供在期望波长范围的光谱。

[0043] 以下提供了在可见光谱内波长和颜色的大致对应关系的表格。

[0044] 颜色/波长的表格

[0045]

[0046]

[0047] 白光激发源

[0048] 如这里所使用的，“白光激发源”指的是发射宽波段的、基本准直的光的光源。本发明中优选使用的白光激发源是超连续白光激光器。

[0049] 超连续白光激光器可以例如从Fianium有限公司(英国，南安普顿)买到。其示例包括FemtoPower FP1060和FP532、Fianium SC450、Fianium SC450-8-VE超连续激光器。Fianium SC450具有5W的总激光输出，并且具有从约450到2000nm的大的发射范围。Fianium SC450-8-VE超连续激光器在单模光束中具有8W的总光学功率以及在可见波长范围中超出
1.5W的光学功率。

[0050] 超连续白光激光器的附加示例包括提供400-2400nm单模光谱的SuperK EXTREME Supercontinuum Fiber Laser Series(NKT Photonics A/S,Birkerod,Denmark)以及提供约450到2000nm光谱的具有5W总激光输出的Koheras SuperK Extreme源(Koheras A/S,Denmark)。

[0051] 由白光激发源提供的波长的最大范围取决于由激光器发射的波长的范围。由白光激发源发射的波长的实际范围可以使用激光器与流动细胞之间的附加滤波器来进一步限制。

[0052] 颜色分离光学器件

[0053] 宽光谱(白光)激光源色散成为光谱是通过使用颜色分离光学器件来实现的，包括色散元件，诸如棱镜或衍射光栅，这两者都是本领域中已知的。激发光束的色散也导致激发光沿着一个方向的空间扩展(展开)，使得光谱可以扩展到比粒子尺寸大得多的探测区域。

[0054] 在优选实施例中，一个或多个棱镜被用来将白光激发光束色散成其颜色的构成光谱。棱镜一般将相比于衍射光栅在大得多的频率带宽上色散光，使得它们对于宽光谱的光谱测量更加有用。此外，棱镜与光栅不同，不受到由于重叠光谱级次而产生的错乱。

[0055] 在美国专利No.4,609,286中描述了合适的色散棱镜，通过引用将其全部结合在这里。

[0056] 在优选实施例中，棱镜系统在欧洲专利公报EP01403632中描述，通过引用将其全部结合在这里。该基于棱镜的细胞计数器激发光学系统被设计为与数个分离的单色激发激光器工作。色散棱镜的组改变不同波长光束的方向，使得具有分离的输入的光束从最终棱镜基本重叠在几乎彼此平行的位置出射。然而，因为在本发明中使用单个、宽光谱激发光束，所以基于棱镜的细胞计数器激发光学系统将会将宽光谱光束色散成为其光谱，展开到与流动通道平行。

[0057] 可调谐滤波器(TF)

[0058] 可调谐滤波器(TF)是其光谱发射可以通过施加电压、声学信号等来电学地控制的装置。在本领域中已知各种可调谐滤波器。在优选实施例中，可调谐滤波器是声光可调谐滤波器(AOTF)。声光可调谐滤波器是固态的、电可调谐带通滤波器，其使用各向异性介质内的声光相互作用。所发射的光被使用施加到AOTF换能器的射频信号(RF)频率来控制。通过改变与波长范围对应的施加频率，通过AOTF传输的光可以在完整的光谱上改变。

[0059] AOTF可以从Fianium Ltd.(Southampton,UK),Panasonic Industrial Company(Secaucus,NJ)和Crystal Technology,Inc.(Palo Alto,CA)买到。优选的AOTF可以从Crystal Technology,Inc作为部件编号97-02838-01得到，其允许在从430-670nm的范围内可选择地传输。

[0060] 在结合AOTF的实施例中，由白光激发源发射的波长的实际范围由附加滤波器限制到由AOTF提供的可选择传输频率的范围内。

[0061] 能够产生适合于控制AOTF的迅速变化的RF信号的可编程RF频率发生器在本领域中已知。

[0062] 基于附图的描述

[0063] 图1A-图1C描绘了本发明的系统的组件的数个视图。图1A描绘了侧面的、成角度的视图，图1B描绘了侧视图，并且图1C描绘了俯视图。并非全部的元件都在全部视图中可见。

[0064] 粒子1(在图1B和图1C中可见)被运送通过小管2中的流动通道。来自于超连续白光激光器10的光穿过棱镜12，并且之后通过聚焦透镜14被聚焦到流动通过小管2中的流动通道的流体流。棱镜将激发光色散为其颜色的光谱，使得光束的宽度被沿着与流动通道平行的方向加宽。因此，照射到粒子1上的激发光的波长随着粒子1移动经过探测区域(小管2中的流动通道的暴露到来自于激光器10的光的区域)而连续地改变。如图1C的俯视图所示，棱镜不影响横穿流动通道的激发光束的宽度。

[0065] 来自粒子的荧光发射由透镜16收集并且朝向光电探测器20引导。透镜16的直径大于探测区域的长度，使得无论粒子在探测区域中的什么位置，发射都可以被收集。长通滤波器18被确定方向在光电探测器20的前方。长通滤波器阻挡被选择来仅通过比激发光的最长波长更长的波长。因此，长通滤波器阻挡由光电探测器测量激发光，并且允许基本在没有来自激发光的干扰的情况下测量粒子发射。

[0066] 探测光学器件(透镜16、长通滤波器18和光电探测器20)被确定方向，以收集并测量从激发束的方向成直角发射的荧光。因为激发光的强度通常比荧光反射的强度大的多，并且因为长通滤波器通常不能100％有效地阻挡所选择的波长范围之外的光，所以直线朝向将会受到由于激发光穿过长通滤波器而产生的背景信号的不理想水平的影响。通过将收集光学器件的方向确定为使得仅测量与激发束光路成直角的荧光发射，可以将该背景最小化。在该构造中，带通滤波器主要具有排除由粒子成直角散射的激发光的功能，在流动血细胞计数器中将这种散射称作为侧向散射。

[0067] 图2A-图2C

[0068] 图2A-图2C描绘了使用图1的系统来扫描粒子的激发光谱。如图所示，粒子1在其穿过小管2中的流动通道时的方向(可以在图2B和图2C中看到)是从图的底部到顶部。已经由棱镜色散为颜色的光谱的激发束与流动通道在被称作为探测区域的通道长度上交叉。为了示意性目的，被描绘为虚线之间的阴影区域的激发光束被示出为扩展到从蓝光到红光的光谱范围。波长的实际范围将取决于由激发源发射的波长的范围。为了有助于描述，表现出了激发束内的四个离散颜色，但是激发束实际上可以从其光谱在光束底部极限处的蓝色末端连续地改变到其光谱在光束顶部极限处的红色末端。因此，粒子1在其穿过流动通道的探测区域时被暴露到从蓝色到红色的激发光的整个光谱。

[0069] 图2A描绘了荧光粒子的光谱扫描的起点。粒子刚刚进入探测区域并且暴露到在激发束的光谱的蓝色末端中的光的波长。

[0070] 图2B描绘了光谱扫描的中间阶段。粒子已经移动通过探测区域的中途，使其暴露到在红色和绿色之间的光的波长。

[0071] 图2C描绘了光谱扫描的结束。粒子已经移动为使其将要离开激发束。此时，其暴露到处于红色中的光的波长。

[0072] 随着粒子移动通过探测区域并且由连续变化的激发束波长激发，在探测波长的静态波段中测量的来自粒子的荧光发射由透镜16收集并且朝向光电探测器20(这两个元件都在图1中示出)引导。所得到的数据提供粒子在激发束的波长范围上的激发光谱的测量结果。

[0073] 在探测区域内的任意给定位置，粒子1将会暴露到取决于粒子的大小、探测区域的大小和由激发束发射的波长的范围的小范围的波长。优选地，激发束光谱将会展开到比粒子大小明显大得多的探测区域。例如，如果激发束由棱镜扩散以覆盖1mm的探测区域，那么直径10μm的细胞将会暴露到作为色散到探测区域的全部激发光谱的百分之一的波长波段。实践中，这可以被当做为基本单波长激发。

[0074] 粒子暴露到任何一个位置的波长的波段的宽度可以基于粒子的大小以及每距离激发波长的变化速率来计算。令P表示粒子大小，令D表示探测区域的长度，其对应于经扩展的激发束的大小，并且令F1和F2分别表示由激发源发射的最短和最长波长。光谱覆盖等于差的绝对值(|F1-F2|)的波长范围，展开到距离D，并且每距离的激发波长的改变速率是|F1-F2|/D。因此，在探测区域内的给定位置处的粒子被暴露到的|F1-F2|/D*P的波长范围。例如，如果光谱覆盖展开到1mm探测区域上的200nm的范围，那么10nm粒子在探测区域种的任一点处将会仅暴露到2nm的激发光的范围。

[0075] 图3A-图3C

[0076] 图3A-图3C描绘了本发明的系统的可选实施例的组件的数个视图。图3A描绘了侧面的、成角度的视图，图3B描绘了侧视图，并且图3C描绘了俯视图。与图1A-图1C中描绘的组件相同的组件由相同的数字表示。与图1相同，并非全部的元件都在全部视图中可见。

[0077] 粒子1(在图3B和图3C中可见)被运送通过小管2中的流动通道。来自于超连续白光激光器10的光穿过棱镜12，并且之后通过聚焦透镜14被聚焦到流动通过小管2中的流动通道的流体流。棱镜将激发光色散为其颜色的光谱，使得照射到粒子1上的激发光的波长随着粒子1移动经过探测区域(小管2中的流动通道的暴露到来自于激光器10的光的区域)而连续地改变。

[0078] 来自粒子的荧光发射由透镜16收集并且朝向光电探测器20引导。透镜16的直径大于探测区域的长度，使得无论粒子在探测区域中的什么位置，发射都可以被收集。长通滤波器18被确定方向在光电探测器20的前方。长通滤波器被选择来仅通过比激发光的最长波长更长的波长。因此，长通滤波器阻挡由光电探测器测量激发光，并且允许测量粒子发射。

[0079] 图3的系统还包括触发机构，其允许探测粒子何时将要进入探测区域。激光器40发射光束，该光束由反射镜42反射到基本与由白光激光器10发射的激发束平行，但是在其上游。激光器40优选地发射在激光器10的光谱之外的光的波长，例如更短波长，但是可以可选地发射在激光器10的光谱内的波长。将要进入探测区域的粒子首先暴露到来自于激光器40的光。光电探测器47定位为测量前向散射光。光电探测器阵列46被定位为测量侧向散射光和来自于由激光器40激发的粒子的荧光发射。

[0080] 如俯视图(图3C)所示，来自于由激光器40照射的粒子的侧向散射和荧光发射由透镜16收集并且使用反射镜44朝向探测器阵列46反射。反射镜44优选地反射100％的光，但是定位为使得仅反射来自于来自激光器40的光束与流动流的交叉部的发射。来自于光谱扫描探测区域的光不遇到反射镜，并且由光电探测器20探测。可选择地，反射镜44可以是反射给定波长范围的光的分光反射镜。

[0081] 探测器阵列46包括一个或多个分离探测器，其能够探测侧向散射光和/或荧光发射。例如，在优选的实施例中，探测器阵列46包括在美国专利No.7,129,505和6,683,314中描述的探测光学器件，通过引用将其全部结合在这里。

[0082] 探测器阵列46被构造为使用探测器通道来测量发射，这些探测器通道是彼此不同的、与由白光激光器提供的频率的范围部分重叠的或者重叠的。因为两个激发/探测器系统是空间分离的，所以他们是基本独立的。因此，一般来说，本发明的光谱扫描可以与典型的流动血细胞计数器中标准激发和探测光学器件一同实施，典型的流动血细胞计数器可以包括多个激发激光器和多个探测器阵列。

[0083] 触发器被用来对粒子进入探测区域进行计时。优选地，触发是基于散射参数(例如，前向散射)，但是在实践中，在探测区域上游的任何可区别的信号都适合于进行触发。

[0084] 声光可调谐滤波器(AOTF)30定位在激光器10与棱镜12之间的激发束的路径上。AOTF 30可操作地连接到控制器32。AOTF 30是通带滤波器，其可以在由控制器32施加到AOTF的RF频率的控制下选择并传送来自于入射光的波长的所选择的窄波段。为了简化解释，AOTF可以被描述为选择具体波长，但是将会明白AOTF实际选择波长的窄波段。控制器32被构造为向AOTF提供可变RF频率，由此控制所选择的波长。

[0085] 色散的激发束被过滤为波长的窄波段的宽度对应于色散的、全光谱激发束的宽度的一部分。因此，在波长的给定所选择窄波段处，仅在探测区域内的一小点被照明，并且该点的位置由棱镜色散的角度来确定。因为每个波长都由棱镜在不同角度色散，所以将波长的所选择的窄波段从光谱的一端改变到另一位置导致将被照明的点从探测区域的一端伴随着移动到另一位置。控制器32被构造为与粒子穿过流动通道的移动同步地改变由AOTF选择的波长的窄波段，使得粒子在穿过探测区域的同时被连续地照明，尽管激发光具有持续改变的波长。

[0086] 为了将由AOTF选择的波长的改变与粒子穿过流动通道的移动同步，波长选择必须与粒子进入探测区域同步，并且波长选择的改变速率必须与粒子穿过探测区域的速率同步。粒子进入探测区域从触发器信号(例如，前向散射)开始计时，触发器信号是从粒子穿过在紧接在探测区域的上游的触发器激光束而获得的。触发器信号被从探测器47或46(取决于探测器46和47中哪一者用作触发器信号)发送到控制器32，控制器32开始扫过RF信号并控制AOTF扫过所选择的波长。

[0087] 从探测到触发到开始光谱扫描的时间取决于流速以及从触发探测区域到光谱扫描探测区域的距离。在实践中，系统可以被经验地校准。

[0088] 控制器32被构造为改变由AOTF选择的波长，使得探测区域内的被照明的点以与粒子相同的速率移动。粒子的速率(即，流动流穿过小管2的速率)是与仪器相关的，并且可以使用流动血细胞计数器的领域中标准的方法来经验地确定。

[0089] 图4A-图4D

[0090] 图4A-图4D描绘了使用图3的系统来扫描粒子的激发光谱。如图所示，粒子1在其穿过小管2中的流动通道时的方向是从图的底部到顶部。已经由棱镜色散为颜色的光谱的激发束与流动通道在被称作为探测区域的通道长度上交叉。为了示意性目的，激发光束被示出为扩展到从蓝光到红光的光谱范围。波长的实际范围将取决于由激发源发射的波长的范围。为了有助于描述，表现出了激发束内的四个离散颜色，但是激发束实际上可以从其光谱在光束底部极限处的蓝色末端连续地改变到其光谱在光束顶部极限处的红色末端。因此，粒子1在其穿过流动通道的探测区域时被暴露到从蓝色到红色的激发光的整个光谱。

[0091] 图4A描绘了由前向探测器47检测粒子。由前向散射探测器检测粒子提供表示粒子1将会进入光谱扫描探测区域的触发。

[0092] 图4B描绘了荧光粒子的光谱扫描的起点。粒子刚刚进入探测区域并且暴露到在激发束的光谱的蓝色末端中的光的波长。全部激发束由声光可调谐滤波器(AOTF)30过滤，以在全部激发束的光谱中的最短波长(大值蓝色)处提供激发光的窄波段。经过滤的激发束的窄波段被描绘为虚线之间的阴影区域。因为激发束光谱的蓝色端被色散到最大的角度，并且形成探测区域的极限，所以窄波段与流动流在探测区域的起点处交叉。

[0093] 图4C描绘了光谱扫描的中间阶段。粒子已经移动通过探测区域的中途，使其定位在探测区域中处于黄色和绿色之间波长的光与流动流交叉的位置处。由AOTF选择的波长的窄波段已经与粒子移动同步地改变，使得粒子被该窄波段内的波长照射，并且激发束的全光谱内的其他波长已经被过滤掉。

[0094] 图4D描绘了光谱扫描的结束。粒子已经移动为使其将要离开激发束。此时，粒子定位在探测区域中大约红色的光的波长与流动流交叉的位置。由AOTF选择的波长的窄波段已经与粒子移动同步地改变，使得粒子被该窄波段内的波长照射，并且激发束的全光谱内的其他波长已经被过滤掉。

[0095] 因此，如上所述，随着粒子移动通过探测区域，通过连续地改变具有波长的窄波段的激发束来激发该粒子。窄激发束跟踪粒子通过探测区域。激发束的物理移动是由棱镜的与波长有关的色散以及由AOTF连续地改变的波长选择而导致的。

[0096] 随着粒子行进通过探测区域并且由连续改变的激发束波长激发，来自粒子的荧光发射(在探测波长的静态波段中测量的)由透镜16收集，并且被朝向光电探测器20引导(这两个要素都在图3中示出)。所产生的数据提供了粒子的激发光谱在激发束的波长范围上的测量结果。

[0097] 图5

[0098] 图5描绘了本发明的一个实施例的激发束光谱和探测器通道，连同示例性荧光粒子(在这里被称作为FP1)的激发和发射光谱。FP1的激发光谱510和发射光谱520仅为了示意性目的而示出，以帮助于理解本发明，并且不意图表示任何具体荧光染料的光谱。x轴是波长，并且y轴是用于示意性说明标准化光谱的任意刻度。在该示例中，荧光粒子表现在约550nm处的激发峰和在约625nm处的发射峰(具有75nm的斯托克斯频移)。

[0099] 激发束光谱的极限(由激发源发射的波长的范围)和探测通道的极限(用于探测粒子荧光的波长的范围)被示意性地示出为沿着x轴的条。在该示例中，假设激发束的光谱的范围从450到600nm，其对应于从蓝色到橘红色的颜色的范围(见以上的表格)。由长通滤波器(例如，图1和图3中示出的滤波器18)的透射范围限定的探测器通道探测比约630nm更长的波长的发射。

[0100] 如可以从图5看到的，探测器通道测量在荧光粒子FP1的全部发射光谱的大部分上的发射。随着粒子移动通过流动通道并且由固定地变化的激发波长激发，来自粒子的发射被在探测器通道中测量。在该示例中，对激发源的光谱的扫描基本提供了FP1的全部激发光谱的扫描，因为FP1的激发光谱被大部分包括在由激发光源提供的波长的范围内。

[0101] 长通滤波器的使用通常优先于带通滤波器的使用，因为长通滤波器将所测量的荧光反射的量最小化，但是这两者都是可以使用的。

[0102] 限定了探测通道的长通滤波器排除了激发光到达探测器。因为探测器通道与激发束光谱明显分离，所以激发束可以在全部时间都打开。因此，图5中示出的实施例可以使用图1和图2中示出的仪器和方法，或者图3和图4中示出的仪器和方法。

[0103] 图6

[0104] 图6描绘了本发明的另一个实施例的激发束光谱和探测器通道，以及第二示例性荧光粒子(在这里被称作为FP2)的激发和发射光谱。FP2的激发光谱610和发射光谱620仅为了示意性目的而示出，以帮助于理解本发明，并且不意图表示任何具体荧光染料的光谱。x轴是波长，并且y轴是用于示意性说明标准化光谱的任意刻度。在该示例中，荧光粒子表现在约510nm处的激发峰和在约585nm处的发射峰(具有75nm的斯托克斯频移)。

[0105] 激发束光谱的极限(由激发源发射的波长的范围)和探测通道的极限(用于探测粒子荧光的波长的范围)被示意性地示出为在粒子光谱下方沿着x轴的条。在该示例中，假设激发束的光谱的范围从450到600nm。第一探测通道640与图5的探测通道相同，并且探测波长比约630nm更长的发射。第二探测通道630由第二长通滤波器限定，并且探测波长比约550nm更长的全部发射。因此，第二长通滤波器排除了波长比550nm更低的激发光到达探测器。

[0106] 如可以从图6看到的，FP2的发射极值恰好在探测器通道640的截止波长的左侧，并且FP2的全部发射落到探测器通道640内的部分仅为FP2的全部发射光谱的一小部分。虽然来自FP2的发射可以使用探测器通道640测量，但是期望减小探测敏感度，因为来自FP2的大部分发射由长通滤波器阻挡。

[0107] 第二探测通道630探测波长比约550更长的发射，并且被构造为探测由FP2发射的全部光的大部分。然而，探测通道630与激发束的发射光谱重叠。因此，如果激发束的全部光谱会连续地照射流动通道，则激发束光谱与探测通道630重叠的部分将会与该通道内FP2荧光的探测相干涉。

[0108] 图6中示出的探测方案优选地被用于图3和图4中示出的仪器和方法。如上所述，随着粒子移动通过流动通道并且通过持续改变激发波长而被激发，在任意一个时刻仅基本单个波长照射到粒子。激发束从约450nm的波长扫描到约600nm，从而跟踪粒子的移动。在该扫描期间，在激发束在探测通道630的截止波长以下的同时，没有激发光束可以被散射且比得上FP2荧光的探测。因此，当在450-550nm的范围上扫描在FP2激发光谱期间，探测通道630可以被用来探测来自于FP2的发射。

[0109] 一旦激发束已经到达探测通道630的阈值，探测通道630不再被用来测量来自于FP2的发射。然而，探测通道640仍可以被用来测量来自于FP2的发射。在探测通道640中来自于FP2发射测量结果的信号被放大，以补偿较低的探测灵敏度。因此，FP2的激发光谱可以被在全部激发束光谱上扫描，在探测通道640(具有较低灵敏度)中测量，或者在完成使用探测通道640(具有较低灵敏度)扫描之后，片段地使用探测通道630(具有高灵敏度)在范围450-550nm上测量。

[0110] 图6描述了使用两个重叠探测器通道以使得能够在更宽的范围内以更高的特异性扫描激发光谱的探测方案。清楚地，可以使用额外的探测器通道。每个探测通道可以增加所执行的、高度有效地探测发射的激发光谱扫描的范围。

[0111] 多个探测器通道不需要重叠。例如，探测器通道630也可以由透过在550nm到630nm之间的光的带通滤波器限定，630nm是下一个探测器通道的起点

[0112] 图6中示出的探测方案也适合于测量其他荧光粒子(诸如FP1)的激发光谱，如上文描述并在图5中示出的。为了测量FP1的激发光谱，探测通道630可以被忽略，或者可以被用来在激发扫描的第一部分期间改善FP1的发射的测量。一般来说，通过提供一组交错的探测通道，可以测量具有与白光激光器的光谱重叠的激发光谱的任何荧光粒子。在激发光被改变横跨光谱的同时，来自分离的探测通道的信息优选地被结合，以获得荧光发射的最灵敏的测量。

[0113] 图7

[0114] 图7描绘了本发明的另一个实施例的激发束光谱和探测器通道，连同第二示例性荧光粒子(在这里被称作为FP2)的激发和发射光谱以及第三示例性荧光粒子(在这里被称作为FP3)的激发和发射光谱。FP2的激发光谱710和发射光谱720以及FP3的激发光谱715和发射光谱725仅为了示意性目的而示出，以帮助于理解本发明，并且不意图表示任何具体荧光染料的光谱。x轴是波长，并且y轴是用于示意性说明标准化光谱的任意刻度。在该示例中，荧光粒子FP2表现在约510nm处的激发峰和在约585nm处的发射峰(具有75nm的斯托克斯频移)，并且荧光粒子FP3表现在约550nm处的激发峰和在约625nm处的发射峰(具有75nm的斯托克斯频移)。

[0115] 激发束光谱的极限(由激发源发射的波长的范围)和探测通道的极限(用于探测粒子荧光的波长的范围)被示意性地示出为在粒子光谱下方沿着x轴的条。在该示例中，假设激发束的光谱的范围从450到600nm。由带通滤波器限定的第一探测通道730探测在约560-590nm范围上的波长的发射。该第一探测通道大致对应于FP2的发射极值，而上波长边界被选择为避免包含来自FP3的大量发射。该第一探测通道也被称作为FP2通道。由第二带通滤波器限定的第二探测通道740探测在约625-710nm范围上的波长的发射。该第二探测通道大致对应于FP3的发射极值，而下波长边界被选择为避免包含来自FP2的大量发射。该第二探测通道也被称作为FP3通道。

[0116] 如可以从图7看到的，FP2通道测量FP2发射的大部分，但是测量FP3的发射的小部分。类似地，FP3通道测量FP3发射的大部分，但是测量FP2的发射的小部分。两个探测通道的对应于两个染料激发极值的选择使得能够相对独立地测量两个染料发射，这进一步使得能够相对独立地测量两个染料激发光谱。

[0117] 图7中示出的探测方案优选地用于图3A-图3C以及图4A-图4D中示出的仪器和方法。如上所述，随着粒子移动通过流动通道并且通过持续改变激发波长而被激发，在任意一个时刻仅基本单个波长照射到粒子。激发束从约450nm的波长扫描到约600nm，从而跟踪粒子的移动。在该扫描期间，在激发束在FP2探测通道730的波长以下的同时，没有激发光束可以被散射且比得上FP2荧光的探测。因此，当在450-560nm的范围上扫描在FP2激发光谱期间，FP2探测通道730可以被用来探测来自于FP2的发射，450-560nm的范围表示FP2对其表现明显激发的波长的大部分范围。

[0118] 因为FP3通道在激发光波长范围之外，所以在FP3通道中没有检测到散射的激发光束。因此，当在激发光波长的整个扫描上扫描FP3激发光谱期间，FP3通道740可以被用来检测来自于FP3的发射。因为FP3的激发光谱超出了激发光波长的范围，所以这提供了FP3的激发光谱的大部分，但并非全部。

[0119] 图7描述了使用与将会用在试验中的具体染料匹配的探测器通道的探测方案的示例。对应于染料激发极值的探测通道的选择使得能够相对独立地测量染料发射，这进一步使得能够相对独立地测量染料激发光谱。虽然在图7中示出了两种染料，但是这种探测方案可以通过使用对应更高数目的探测通道而应用到大量的光谱不同的染料的分析，每个探测通道与具体染料的发射匹配。

[0120] 本发明的实施例的优点是其有助于分析由多种染料标记的粒子。例如，与典型的通过流动血细胞计数器进行细胞分析的情况相似地，细胞可以由大量不同染料标记，每种染料结合到不同的细胞蛋白质。这种多重标记的细胞将会表现出由于染料结合而产生的全部激发光谱。通过使用与各个染料匹配的探测器并且因此能够相对独立地测量染料发射，激发光谱可以被更加容易地分离为与结合的每种染料的激发光谱相对应的成分。

[0121] 本领域中已知将作为不同光谱的卷积的光谱数学地分离(解卷积)为成分光谱的方法(例如，见Robinson等人所著的supra)。这种方法可以被用来在本方法中计算每个成分染料的分布，并且因此识别存在于粒子(诸如细胞)上的标记。

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