一种新型化学合成的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾
专利汇可以提供一种新型化学合成的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种化学合成的药物胡椒酸 钾 及其用于制备 乳腺癌 靶向 治疗 药物的应用。乳腺癌靶向药物胡椒酸钾(GBK)，其结构式如下：通过对乳腺癌靶向药物胡椒酸钾的药理药效鉴定证明，胡椒酸钾对 肿瘤 细胞的增殖具有抑制作用，而对正常细胞的增殖没有影响，因此，可开发为一种新型的抗肿瘤临床药物，或与现有抗肿瘤药物联合用药，进一步也可研发出低毒性、具有选择性的抗肿瘤辅助药物。，下面是一种新型化学合成的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾专利的具体信息内容。
1.一种乳腺癌靶向药物胡椒酸钾(GBK)，其结构式如下：
2.权利要求1所述的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾制备方法，其特征在于：胡椒酸钾是以胡椒碱为原料合成的水溶性降脂胡椒碱衍生物，具体的合成步骤如下：首先将3.5kg氢氧化钾在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒碱搅拌充分溶解，回流反应10h,此时将温度控制在88℃，抽滤，即得到胡椒酸钾。
3.权利要求1所述的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾的药理药效鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)化学合成:胡椒酸钾是以胡椒碱为原料合成的水溶性降脂胡椒碱衍生物，具体的合成步骤如下：首先将3.5kg氢氧化钾在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒碱搅拌充分溶解，回流反应10h,此时将温度控制在88℃，抽滤，即得到胡椒酸钾盐；
(2)肿瘤细胞系及正常对照细胞系的培养：
实验过程中用到的肿瘤细胞系及正常对照细胞系的名称及培养方式如下：
三种培养基的不同成分购自不同的生物公司，其中DMEM、RPMI-1640购自HyClone公司，F12购自gibco公司、青链霉素混合液Pen Strep(+10000Units/ml Penicillin、+10000μg/ml Streptomycin)、谷氨酰胺L-Glu(100×L-Glutamin)，胰岛素(insulin)和地塞米松(dexamethasone)购自SIGMA公司；
培养步骤：贴壁细胞在相应培养基中置于37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，当细胞密度达到培养器皿底面积的80％的时候，按照1：10的比例进行细胞传代。传代时先用适量胰酶消化细胞，直至大多数的细胞从培养皿底部消化起来，之后用9倍于胰酶体积的完全培养基终止消化反应。按照所需细胞浓度进行细胞的传代；
(3)胡椒酸钾对正常细胞和癌细胞毒性测定
通过测定胡椒酸钾对正常细胞和癌细胞毒性，以确定在后续实验过程中药物的使用浓度，步骤如下：
将多种正常细胞(GES-1，L132，HSF，COS-7)和癌细胞(MCF-7，SUM159，HepG2，A549，BGC-
823，SGC-7901)从37℃，5％CO2培养箱中拿出来，在超净台中去掉各自的培养基，加入10ml
1×PBS(Transgen Biotech)洗去残留的培养基，在每个培养皿中加1ml 0.05％的胰酶，放回到细胞培养箱中37℃，5％CO2中消化3min。3min后取出培养皿，在显微镜下观察是否将细胞消化起来，在消化起来的细胞培养皿中加入适量相应培养基终止消化，吹打均匀后，取10μl于血细胞计数板上，用血细胞计数板计数1ml培养基中细胞的个数，之后调节培养基中的细胞个数，使其终浓度为5×103/100μl。取出96孔板，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，然后向96孔板的最左侧一列加入100μl空白培养基，作为阴性对照组，在其余孔中各加入100μl相应的细胞悬液，摇匀后重新放回培养箱中37℃，5％CO2培养24h，用于细胞贴壁生长。24h后除阴性对照和阳性对照外，从左向右依次加入0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml浓度梯度的GBK作用于细胞中48h，48h后向每孔(包括阴性对照组和阳性对照组)均加入10μl CCK-8溶液，在细胞培养中继续培养90min，在酶标仪上OD＝450nm波长下，测定细胞的存活率，预测GBK对不同细胞作用的IC50值；
(4)胡椒酸钾的选择性抑制作用实验
通过测定胡椒酸钾对于不同的癌细胞系以及正常细胞系生长的抑制作用，确定胡椒酸钾是否对某些癌细胞的增殖具有选择性的抑制作用，步骤如下：
将贴壁的正常细胞及癌细胞消化起来，细胞计数后调节细胞浓度，使其浓度为5×103/
100μl，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入每种细胞相应的空白培养基，向96孔板的其余每个孔中各加100μl细胞悬液，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h；24h后按照0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml、400μg/ml的浓度向每孔中加入无菌无酶水或GBK溶液，每种细胞分别都设置这6个GBK的浓度梯度；每次实验相同浓度重复3次，且独立实验重复3次，每种细胞均使用各自培养基作为调0孔，到相应时间点后向每孔加入
10μl CCK-8溶液继续培养90min，用酶标仪在OD＝450nm波长下读数，计算细胞活性；
(5)胡椒酸钾对肿瘤细胞周期的影响
抗肿瘤药物对于肿瘤细胞增殖的抑制作用一般是通过产生细胞压力(cellular
stress),比如氧化压力、复制压力、代谢和蛋白毒性压力以及DNA损伤；DNA复制压力作用于细胞周期进程的不同阶段，阻碍细胞周期进程，最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的；因此检测胡椒酸钾对肿瘤细胞周期的影响，用于确认其抑制癌细胞增殖的机理。
取出MCF-7、HepG2、SGC-7901，消化细胞后，将细胞分别用6cm板，在细胞培养箱中37℃，
5％CO2培养24h；24h后以0μg/ml、1/2IC50μg/ml、IC50μg/ml、2IC50μg/ml浓度加入GBK溶液处理细胞48h；48h后收集细胞，使用流式细胞仪检测：配制70％乙醇，放在-20℃预冷；倒掉培养基，向每个6cm板中加入少量1×PBS，洗去残留的培养基，向每个6cm板中加入0.6ml
0.05％的胰酶，放回到37℃，5％CO2细胞培养箱中消化细胞3min。3min后，取出6cm板，向每个6cm板中加入1.4ml 1×PBS吹打均匀，终止消化，并将其收集到2ml离心管中；500rpm，离心10min。取出离心管，弃上清液，重新加入1ml 1×PBS重悬细胞，洗去残留胰酶，500rpm，离心10min。10min后，取出离心管，弃上清液，再次加入200μl 1×PBS重悬细胞；从冰箱中取出提前预冷的70％乙醇，取800μl加入到1.5ml离心管中，置于冰上继续预冷；将200μl 1×PBS重悬的细胞悬液加到预冷的70％乙醇中，置于冰上固定30min；从-20℃中取出RNase A，取1μl 10mg/ml RNase+99μl去离子水配制成100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，备用；从4℃冰箱中取出1mg/ml PI，取62.5μl 1mg/ml PI+937.5μl去离子水将PI稀释为62.5μg/ml，备用；30min后，从冰上取出离心管，置于离心机中500rpm，离心10min；10min后取出离心管，弃上清液，加入500μl 1×PBS重悬细胞，500rpm，离心10min，洗去残留的乙醇。取出离心管，弃上清液，向每个离心管中各自加入100μl 100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，室温下孵育5min；5min后，向每个离心管中加入400μl 62.5μg/ml的PI染料，工作浓度为50μg/ml，置于冰上，避光孵育染色30min；30min后，将细胞悬液用200目的筛子过滤到流式细胞上样管中，每个上样管都须置于冰上，上样检测，分析数据；
(6)胡椒酸钾对肿瘤细胞信号通路的影响
首先从胡椒酸钾处理过的癌细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后进行人类细胞全基因组转录芯片(global transcriptional microarray)筛选，筛选出胡椒酸钾处理后乳腺瘤细胞(MCF-7)及胃癌细胞(SGC-7901)相对于不处理的相应肿瘤细胞系的差异表达基因，筛选出GBK影响的细胞途径；
提取总RNA的过程及反转录过程：将MCF-7及SGC-7901细胞从细胞培养箱中取出后，用胰蛋白酶消化起来，并以2×106个/10ml的细胞量铺板，并放于细胞培养箱中培养24h，24h后取出2个10cm板，按照1.5IC50μg/ml的浓度分别向两个培养皿中加入GBK溶液和无菌无酶的水(对照组)，分别标为实验组和对照组，继续置于培养箱中培养48h，48h后提取总RNA，具体步骤如下：从培养箱中取出2个培养皿，去掉培养基，并用1×PBS洗一次，洗去残留的培养基；向2个培养皿中分别加入1ml TransZolTM Up，轻轻摇晃培养皿，吹打细胞，使裂解液能够均匀的分布在培养皿表面，与细胞密切接触。用细胞刮铲充分刮铲贴壁细胞，使得裂解液中无明显沉淀；用无菌无酶的枪头将细胞裂解液加入到1.5ml无菌无酶离心管中；在无菌无酶的条件下，室温中静置5min；向1.5ml无菌无酶离心管中加入200μl氯仿，剧烈振荡30s，无菌无酶条件下室温放置3min；将离心管置于提前预冷的低温离心机中10000rpm，低温(4℃)离心15min；取500μl上清液于一个新的1.5ml无菌无酶离心管中，然后加入500μl异丙醇，颠倒混匀，在室温条件下放置10min；10000rpm，低温(4℃)，离心10min；从离心机中取出离心管，弃上清；向1.5ml离心管中加入1ml提前配制好的75％乙醇溶液，涡旋1min；7500rpm，低温(4℃)离心5min；弃上清，在无菌无酶条件下室温干燥，使残留的乙醇完全挥发掉；向1.5ml离心管中加入50μl RNA溶解液；在60℃烘箱中放置10min，在超净台中分装3μl于小的无菌无酶PCR管中，用于凝胶电泳和浓度检测，其余保存于-80℃冰箱中用于后续qRT-PCR；用无水乙醇处理电泳槽，并重新配置电泳用凝胶取少量样品跑电泳；反转录的试剂购自TransGen Biotech(货号AT-311)，按照试剂盒说明书进行反转录；
对人类细胞全基因组转录芯片筛选出的差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证：实验所使用的荧光染料为Takara公司的 Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(货号RR820A)。
4.一种治疗乳腺癌的临床药物，其特征在于：包含权利要求1所述的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾。
5.权利要求1所述的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾在制备治疗乳腺癌临床药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾在制备治疗乳腺癌临床药物中的应用，其特征在于：权利要求1所述的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾与依托泊苷联合用药。
一种新型化学合成的乳腺癌靶向药物胡椒酸钾
技术领域
背景技术
发明内容
100μl 1×PBS，然后向96孔板的最左侧一列加入100μl空白培养基，作为阴性对照组，在其余孔中各加入100μl相应的细胞悬液，摇匀后重新放回培养箱中37℃，5％CO2培养24h，用于细胞贴壁生长。24h后除阴性对照和阳性对照外，从左向右依次加入0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml浓度梯度的GBK作用于细胞中48h，
48h后向每孔(包括阴性对照组和阳性对照组)均加入10μl CCK-8溶液，在细胞培养中继续培养90min，在酶标仪上OD＝450nm波长下，测定细胞的存活率，预测GBK对不同细胞作用的IC50值；
10/100μl，在96孔板最外层每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入每种细胞相应的空白培养基，向96孔板的其余每个孔中各加100μl细胞悬液，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h；
24h后按照0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml、400μg/ml的浓度向每孔中加入无菌无酶水或GBK溶液，每种细胞分别都设置这6个GBK的浓度梯度；每次实验相同浓度重复
3次，且独立实验重复3次，每种细胞均使用各自培养基作为调0孔，到相应时间点后向每孔加入10μl CCK-8溶液继续培养90min，用酶标仪在OD＝450nm波长下读数，计算细胞活性；
0.05％的胰酶，放回到37℃，5％CO2细胞培养箱中消化细胞3min。3min后，取出6cm板，向每个6cm板中加入1.4ml 1×PBS吹打均匀，终止消化，并将其收集到2ml离心管中；500rpm，离心10min。取出离心管，弃上清液，重新加入1ml 1×PBS重悬细胞，洗去残留胰酶，500rpm，离心10min。10min后，取出离心管，弃上清液，再次加入200μl 1×PBS重悬细胞；从冰箱中取出提前预冷的70％乙醇，取800μl加入到1.5ml离心管中，置于冰上继续预冷；将200μl 1×PBS重悬的细胞悬液加到预冷的70％乙醇中，置于冰上固定30min；从-20℃中取出RNase A，取1μl 10mg/ml RNase+99μl去离子水配制成100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，备用；从4℃冰箱中取出1mg/ml PI，取62.5μl 1mg/ml PI+937.5μl去离子水将PI稀释为62.5μg/ml，备用；30min后，从冰上取出离心管，置于离心机中500rpm，离心10min；10min后取出离心管，弃上清液，加入500μl 1×PBS重悬细胞，500rpm，离心10min，洗去残留的乙醇。取出离心管，弃上清液，向每个离心管中各自加入100μl 100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，室温下孵育5min；5min后，向每个离心管中加入400μl 62.5μg/ml的PI染料，工作浓度为50μg/ml，置于冰上，避光孵育染色30min；30min后，将细胞悬液用200目的筛子过滤到流式细胞上样管中，每个上样管都须置于冰上，上样检测，分析数据；
留的培养基；向2个培养皿中分别加入1ml TransZol Up，轻轻摇晃培养皿，吹打细胞，使裂解液能够均匀的分布在培养皿表面，与细胞密切接触。用细胞刮铲充分刮铲贴壁细胞，使得裂解液中无明显沉淀；用无菌无酶的枪头将细胞裂解液加入到1.5ml无菌无酶离心管中；在无菌无酶的条件下，室温中静置5min；向1.5ml无菌无酶离心管中加入200μl氯仿，剧烈振荡
30s，无菌无酶条件下室温放置3min；将离心管置于提前预冷的低温离心机中10000rpm，低温(4℃)离心15min；取500μl上清液于一个新的1.5ml无菌无酶离心管中，然后加入500μl异丙醇，颠倒混匀，在室温条件下放置10min；10000rpm，低温(4℃)，离心10min；从离心机中取出离心管，弃上清；向1.5ml离心管中加入1ml提前配制好的75％乙醇溶液，涡旋1min；
7500rpm，低温(4℃)离心5min；弃上清，在无菌无酶条件下室温干燥，使残留的乙醇完全挥发掉；向1.5ml离心管中加入50μl RNA溶解液；在60℃烘箱中放置10min，在超净台中分装3μl于小的无菌无酶PCR管中，用于凝胶电泳和浓度检测，其余保存于-80℃冰箱中用于后续qRT-PCR；用无水乙醇处理电泳槽，并重新配置电泳用凝胶取少量样品跑电泳；反转录的试剂购自TransGen Biotech(货号AT-311)，按照试剂盒说明书进行反转录；
具体实施方式
100μl，随机选定5只裸鼠作为对照组，另7只作为实验组，佩戴耳标。将NOD/SCID鼠以两只为一单位，置于鼠笼中每天给与食物和水，于SPF级鼠房中培养3周。在实验前一天给小鼠喝Neomycin sulfate/Polymycin B sulfate双抗水，并换上高压灭菌的垫料盒。在注射肿瘤细胞后每3天称量小鼠体重，并统计数据。在肿瘤块长到8mm3后，向每只裸鼠注射GBK药物或
0.9％生理盐水。实验组按照10μg/g体重注射GBK，对照组注射相应体积的0.9％生理盐水，连续注射21天。在给药期间，每隔3天对小鼠进行称重并做好记录。每隔3天用游标卡尺对瘤块的大小进行测量记录，肿瘤体积按照如下的公式计算，肿瘤体积V＝ab2/2，(其中a是肿瘤最长径，b是肿瘤最短径)，并绘制肿瘤生长曲线和体重变化曲线。21天后，脱颈处死荷瘤鼠，摘取肿瘤块，剥离肿块秤重，并将实验组和对照组放置一起拍照，记录质地、浸润情况及血供情况。置于10％福尔马林中浸泡，用于后续做石蜡包埋、切片、HE染色及免疫组化，分析结果(参加图7)。
10min。加一抗：弃血清，滴加一抗(1：50稀释抗体)1％BSA稀释，4℃过夜。加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗(山羊抗兔/抗鼠IgG-HRP)，然后置于37℃温箱中30～60min。PBS洗3次，每次5min，每张切片加100μl新配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10分钟，控染色，显色完成后加入PBS终止显色。复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70％酒精-80％酒精-
90％酒精-95％酒精-100％酒精-100％酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
100μl 1×PBS，然后向96孔板的最左侧一列加入100μl空白培养基，作为阴性对照组，在其余孔中各加入100μl相应的细胞悬液，摇匀后重新放回培养箱中37℃，5％CO2培养24h，用于细胞贴壁生长。24h后除阴性对照和阳性对照外，从左向右依次加入0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml浓度梯度的GBK作用于细胞中48h，
48h后向每孔(包括阴性对照组和阳性对照组)均加入10μl CCK-8溶液，在细胞培养中继续培养90min，在酶标仪上OD＝450nm波长下，测定细胞的存活率，预测GBK对不同细胞作用的IC50值(参见图1)。
24h后按照0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml、400μg/ml的浓度向每孔中加入无菌无酶水或GBK溶液，每种细胞分别都设置这6个GBK的浓度梯度。每次实验相同浓度重复
3次，且独立实验重复3次，每种细胞均使用各自培养基作为调0孔，到相应时间点后向每孔加入10μl CCK-8溶液继续培养90min，用酶标仪在OD＝450nm波长下读数，计算细胞活性。
0.05％的胰酶，放回到37℃，5％CO2细胞培养箱中消化细胞3min。3min后，取出6cm板，向每个6cm板中加入1.4ml 1×PBS吹打均匀，终止消化，并将其收集到2ml离心管中。500rpm，离心10min。取出离心管，弃上清液，重新加入1ml 1×PBS重悬细胞，洗去残留胰酶，500rpm，离心10min。10min后，取出离心管，弃上清液，再次加入200μl 1×PBS重悬细胞。从冰箱中取出提前预冷的70％乙醇，取800μl加入到1.5ml离心管中，置于冰上继续预冷。将200μl 1×PBS重悬的细胞悬液加到预冷的70％乙醇中，置于冰上固定30min。从-20℃中取出RNase A，取1μl 10mg/ml RNase+99μl去离子水配制成100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，备用。从4℃冰箱中取出1mg/ml PI，取62.5μl 1mg/ml PI+937.5μl去离子水将PI稀释为62.5μg/ml，备用。30min后，从冰上取出离心管，置于离心机中500rpm，离心10min。10min后取出离心管，弃上清液，加入500μl 1×PBS重悬细胞，500rpm，离心10min，洗去残留的乙醇。取出离心管，弃上清液，向每个离心管中各自加入100μl 100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，室温下孵育5min。5min后，向每个离心管中加入400μl 62.5μg/ml的PI染料，工作浓度为50μg/ml，置于冰上，避光孵育染色30min。30min后，将细胞悬液用200目的筛子过滤到流式细胞上样管中，每个上样管都须置于冰上，上样检测，分析数据。
30s，无菌无酶条件下室温放置3min。将离心管置于提前预冷的低温离心机中10000rpm，低温(4℃)离心15min。取500μl上清液于一个新的1.5ml无菌无酶离心管中，然后加入500μl异丙醇，颠倒混匀，在室温条件下放置10min。10000rpm，低温(4℃)，离心10min。从离心机中取出离心管，弃上清。向1.5ml离心管中加入1ml提前配制好的75％乙醇溶液，涡旋1min。
7500rpm，低温(4℃)离心5min。弃上清，在无菌无酶条件下室温干燥，使残留的乙醇完全挥发掉。向1.5ml离心管中加入50μl RNA溶解液。在60℃烘箱中放置10min，在超净台中分装3μl于小的无菌无酶PCR管中，用于凝胶电泳和浓度检测，其余保存于-80℃冰箱中用于后续qRT-PCR。用无水乙醇处理电泳槽，并重新配置电泳用凝胶取少量样品跑电泳。反转录的试剂购自TransGen Biotech(货号AT-311)，按照试剂盒说明书进行反转录。
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