在一个个体的一生中会出现两或三个明显的骨质（bone mass)改变 期（见Riggs， West J. Med. 154: 63-77， 1991)。第一期在男性和女 性中均会出现，并持续至达到峰值骨质。此第一期通过软骨内生长板的 线性生长和由于骨膜对合（periosteal apposition)的速度引起的径向 生长来实现。对于小梁骨（扁骨例如推骨和骨盆），第二期开始于大约30 岁，对于皮质骨（例如肢体中的长骨）则开始于大约40岁，并持续到老 年。此期的特征在于緩慢的骨丢失，并且在男性和女性中均会发生。在 女性中，还会出现骨丢失的第三期，其原因极可能是绝经后的雌激素缺 乏。仅在此期，女性可再从皮质骨丢失10%的骨质，从小梁区室丢失25% 的骨质（见Riggs,同上）。
骨矿质含量的丢失可以由多种情况引起，并可以导致严重的医学问 题。例如，骨质疏松症是一种使人衰弱的疾病，其特征在于患病个体中 骨骼骨质和矿质密度的明显降低，骨的结构退化包括骨微体系结构 (microarchitecture)的降解，和相应的骨脆性以及骨折易发性的增加。 人类的骨质疏松症是由临床上的骨质减少（比年轻成年骨的骨矿质密度 平均值低一个以上至2.5个以下标准差的骨矿质密度）发展来的，在美 国有大约2千5百万人患有骨质减少病。在美国另外有7-8百万名患者 已被诊断患有临床骨质疏松症（定义为比成熟的年轻成年骨的骨矿质含量平均值低2.5个以上标准差的骨矿质含量）。对于健康护理系统而言， 骨质疏松症是花费最大的疾病之一，在美国每年花费几百亿美元。除了 健康护理相关的费用外，长期的居住护理和工作日损失也增加了该疾病 的经济和社会耗费。全球大约7千5百万人有患骨质疏;松症的危险。
在人类群体中骨质疏松症的频率随年龄的增加而增加，在高加索人中 女性的骨质疏松症频率尤为突出（在美国，女性骨质疏松症患者占骨质 疏松症总患者的80%)。老年人骨錄骨脆性和骨折易发性的增加由于该群 体有较高的意外跌倒危险性而变得更为严重。在美国每年有超过1.5百 万的骨质疏松相关骨折的报道。髋骨、腕和推骨骨折是骨质疏松相关的 最常见损伤。尤其是髋骨骨折对于患者而言是极为不便和费钱的，而且 对于妇女髋骨骨折与高死亡率和发病率相关。
尽管骨质疏松已被确定为由于骨质降低引起的骨折危险性提高，但现 有的骨骼疾病治疗方案尚不能相当大程度地增加成年人的骨密度。所有 的医师都强烈体会到需要能够增加成年人骨密度的药物，尤其是增加易 于发生骨质减少和骨质疏松的腕骨、脊柱骨和髋骨的骨密度的药物。
目前防止骨质疏松的策略可以给个体提供一些益处，但不能确保消除 该疾病。这些策略包括随着高龄的开始要节制身体活动（尤其是负重活 动），在饮食中包括充足的钙，并避免食用含酒精或烟草的产品。对于 表现为临床骨质减少或骨质疏松的患者，所有目前的治疗药物和策略均 旨在通过抑制骨吸收进程来减少骨质的进一步丧失，骨吸收是组成型发 生的骨重塑过程中的一个天然组成部分。
例如，目前雌激素被用来延緩骨损失。然而，就是否对患者有长期益 处和是否对75岁以上的患者有作用，有一些争议。而且，雌激素的使用 被认为会增加患乳腺癌和子宫内膜癌的危险性。
高剂量的食物钙加上或不加维生素D也被建议用于绝经后的妇女。然 而，高剂量钙经常会有令人不快的胃肠道副作用，而且必须对血清和尿 的钙水平进行持续监测（见Khosla和Rigss， Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995)。
其它建议使用的治疗方法包括使用降钓素、二膦酸酯(bisphosphonate)、促蛋白合成笛类和氟化钠。然而，这些治疗方法 均有可能妨碍其使用的不良副作用（例如，尽管骨密度获得适度增加， 但降钙素和甾类会引起恶心并激发免疫反应，二膦酸酯和氟化钠可以抑 制骨折修复）（见Khosla和Rigss，同上）。
目前实行的治疗策略均不涉及刺激或增强新骨质生长的药物。本发明 提供能用于增加骨矿化并因此可以用于治疗多种期望增加骨质的疾病的 组合物和方法。而且，本发明提供了相关的其它益处。
发明概述
如上所述，本发明提供一种新的TGF-p结合蛋白类型或家族，用于 筛选增加骨矿质含量和骨矿质密度的化合物的方法，增加骨矿质含量和 骨矿质密度的化合物，和在多种疾病的治疗或预防中使用这些化合物的 方法。
在本发明的一个方面，本发明提供分离的核酸分子，其中所述核酸分 子选自：（a)含有SEQ ID NOs. 1、 5、 7、 9、 11、 13或15，或它们的互 补序列的分离核酸分子；（b)在高严紧条件下与（a)的核酸分子特异杂交 的分离核酸分子；和（c)根据（a)或（b)的编码TGF-p结合蛋白的分离核 酸分子。在本发明的相关方面中，提供基于与上述定义序列之一的仅一 部分发生的杂交（例如对于（a),可以是与选自SEQ ID NO. 1的第156-539位或第555-687位核苷酸的至少20、 25、 50或100个核普酸的探针 发生的杂交）的分离核酸分子。应当是很明显的，用于杂交的必需严紧 性可以根据探针的大小而改变。例如，对于25个威基的探针，高严紧条 件可以包括：60mMTrispH8. 0, 2mMEDTA， 5xDenhardt氏液，6xSSC, 0.1% (w/v)N-十二烷基肌氨酸（N-laurylsarcosin) , 0.5% (w/v) NP-40 (乙 基笨基聚乙二醇），45t:过夜，之后用0. 2xSSC/0. 1% SDS于45-50X:洗 涤两次。对于低严紧条件下100个碱基的探针，适合的条件可以包括： 5xSSPE， 5xDenhardt氏液，和0. 5% SDS于42-50"C过夜，之后用2xSSPE (或2xSSC) /0.1% SDS于42-50"C洗涤两次。
在本发明的相关方面中，提供根据Wilbur-Lipman算法与SEQ IDNOs.1、 5、 7、 9、、 11、 13或15有50%、 60%、 75%、 80%、 90%、 95%或98%水 平的同源性的分离核酸分子。例如，这样的核酸分子的代表性例子包括 编码含有SEQ ID N0s.2、 6、 10、 12、 14、或16的蛋白质的核酸分子， 或根据Lipman-Pearson算法与这些序列有50%、 6096、 75%、 80%、 90%、 95%il 989fr水平的同源性的核酸分子。
典型地，分离的核酸分子小于100kb,而且在某些实施方案中，小于 50kb、 25kb、 10kb、或甚至5kb。而且，在其它实施方案中，分离的核酸 分子在其它无关核酸分子的"文库"（例如，亚克隆BAC,如GenBank登 记号AC003098和EMB登记号AQ171546中描述的）中是不存在的。然而， 可以在相关分子的文库（例如用于改组的文库，如美国专利5,837,458; 5, 830, 721 ;和5,811,238中描述的）中找到分离的核酸分子。最后，本 文所描述的分离核酸分子不包括编码Dan、 Cerberus、 Gremlin或SCGF (美国专利5,780,263)的核酸分子。
本发明还提供含有上述核酸分子的克隆栽体，和含有可操作地与上述 核酸分子之一连接的启动子（例如调节序列）的表达载体。合适启动子 的代表性例子包括组织特异性启动子和基于病毒的启动子（例如CMV I-E 等基于CMV的启动子、SV40早期启动子和MuLV LTR)。表达载体也可以 基于或来源于病毒（例如"病毒载体"）。病毒载体的代表性例子包括单 纯疱瘆病毒栽体、腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体和逆转录病毒载体。 本发明还提供含有或包含任何上述载体的宿主细胞（包括例如人、猴、 狗、大鼠或小鼠来源的宿主细胞)。
在本发明的其它方面中，提供了制备TGF-&结合蛋白的方法，包括 步骤：在足以产生TGF-P结合蛋白的时间和条件下培养上述含载体的宿 主细胞。在进一步的实施方案中，可以对通过该方法产生的蛋白质作进 一步纯化（例如通过柱层析、亲和纯化以及诸如此类的方法）。因此，根 据本申请的公开可以容易地制备上述核酸分子所编码的分离蛋白质（例 如SEQ ID NOs. 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14或16 )。
还应该指出的是，上述蛋白质或其片段可以以融合蛋白的形式产生。 例如，在一个方面，提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的融合蛋白，其中第一多舦片段含有上述核酸分子所编码的TGF-P结合蛋白或其 至少10、 20、 30、 50或IOO个氨基酸长的部分，第二多肽片段含有非TGF-P结合蛋白。在某些实施方案中，该第二多肽可以是适于纯化或识别的 尾端（tag)(例如含有多个阴离子氨基酸残基的多A-见美国专利 4,851,341)、标记（例如绿色荧光蛋白或碱性磷酸酶）、或毒性分子（例 如篦麻毒素）。
在本发明的另一方面中，提供了能够特异结合上述TGF-p结合蛋白 类型（例如人BEER)的抗体。在多种实施方案中，该抗体可以是（例如 人或鼠来源的）多克隆抗体或单克隆抗体。在进一步的实施方案中，该 抗体是保留了整个抗体的结合特性的抗体片段（例如F(ab，）2, F(ab)2， Fab，， Fab或Fv片段，或甚至是CDR)。本发明还提供能够产生或表达上 述抗体的杂交瘤和其它细胞。
在本发明的相关方面中，本发明提供了检测TGF-p结合蛋白的方法， 包括步骤：在足以允许上述抗体与TGF-p结合蛋白结合的时间和条件下 孵育所述抗体，并检测该结合。在多种实施方案中，抗体可以与固相支 持物结合以利于洗涤或分离，和/或可以是标记的（例如用选自酶、荧光 蛋白和放射性同位素的标记）。
在本发明的其它方面中，本发明提供了与根据SEQ IDNOs. 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17或18或它们的互补序列的核酸分子在高严紧条件 下杂交的分离寡核苷酸。在进一步的实施方案中，该寡核苷酸可以在编 码SEQ ID NOs. 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14或16的序列中找到。在某些 实施方案中，该寡核苷酸长至少15、 20、 30、 50或100个核苷酸。在进 一步的实施方案中，用另一个分子（例如酶、荧光分子或放射性同位素） 标记该寡核苷酸。本发明还提供能够特异扩增编码TGF-p结合蛋白的上 述核酸分子的全部或部分的引物。这里所用术语"特异扩增"应当理解 为是指扩增上述TGF-p结合蛋白，而非其它TGF-p结合蛋白例如Dan、 Cerberus、 Gremlin或SCGF (美国专利5， 780， 263)的引物。
在本发明的相关方面中，提供了检测编码TGF-p结合蛋白的核酸分 子的方法，包括步骤：在高严紧条件下孵育上迷寡核苷酸，并检测所述寡核苷酸的杂交。在某些实施方案中，该寡核苷酸可以是标记的和/或与 固相支持物结合的。
在本发明的其它方面中，提供了能够切割编码上述TGF-p结合蛋白 之一 （例如SEQIDNOs.2、 6、 8、 10、 12、 14或16)的RNA的核酶。 该核酶可以由DNA、 RNA (包括2，-0-甲基核糖核酸）、核酸类似物（例 如具有硫代磷酸酯键的核酸）或它们的混合物组成。还提供编码这些核 酶的核酸分子（例如DNA或cDNA)，以及能够表达或产生这些核酶的 载体。载体的代表性例子包括质粒、逆转录转座子、粘粒和基于病毒的 栽体（例如，至少部分从逆转录病毒、腺病毒、或腺伴随病毒产生的病 毒载体）。本发明还提供含有这些栽体的宿主细胞（例如，人、狗、大鼠 或小鼠细胞）。在某些实施方案中，可以用栽体稳定地转化宿主细胞。
在本发明的更进一步的方面，提供通过合成或体外或体内转录产生 核酶的方法。在更进一步的实施方案中，可以对由此产生的核酶作进一 步纯化和/或将其制成药物組合物（例如该核酶或编码该核酶的核酸分子 和药物学上可接受的载体或稀释剂一起）。同样，可以将本文描述的反义 寡核苷酸和抗体或其它选定分子制成药物组合物。
在本发明的其它方面中，提供含有可与根据SEQIDNOs.l、 3、 5、 7、 9、 11、 13或15或其互补序列的核酸分子杂交的核酸分子的反义寡核 苷酸，其中所述寡核苷酸抑制本文所述的TGF-P结合蛋白（例如人 BEER)的表达。在多种实施方案中，该寡核苷酸长15、 20、 25、 30、 35、 40或50个核苷酸。优选地，该寡核苷酸的长度小于100、 75或60 个核苷酸。应该易于明了的是，该寡核苷酸可以含有一或多种核酸类似 物、核糖核酸或脱氧核糖核酸。而且，该寡核苷酸可以由一个或多个键 (linkage)修饰，这些键包括例如共价键如硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、 膦酸甲酯键、亚曱基（曱基亚胺基）键、吗啉代键(morpholino linkage)、 酰胺键、聚酰胺键、短链烷基糖间键、环烷基糖间键、短链杂原子糖间 键和杂环糖间键。嵌合寡核苷酸的一个代表性例子见美国专利5,989,912。
在本发明的再一方面，提供用于增加骨矿化的方法，包括向恒温动 物导入有效量的上述核酶。在相关方面中，该方法包括步骤：在利于核酸分子转录产生该核酶的条件下，向患者导入有效量的能产生期望核酶的 本文所描述核酸分子或载体。
在本发明的其它方面，提供转基因非人动物。在一个实施方案中，提
供其生殖细胞和体细胞含有编码上述TGF-P结合蛋白的核酸分子的转基 因动物，其中所述核酸分子可操作地与可有"达该基因的启动子相连， 该基因是在胚胎阶段导入该动物或该动物祖先的，且条件是所述动物并 非人类。在其它实施方案中，提供转基因敲除动物，包括其生殖细胞和 体细胞中至少有一个可与编码上述TGF-p结合蛋白的核酸分子杂交的内 源性核酸分子等位基因被破坏的动物，其中与不带有该破坏的动物相比， 该破坏阻止了从所述等位基因转录信使RNA，且条件是该动物并非人类。 在多种实施方案中，该破坏是核酸缺失、替代或插入。在其它实施方案 中，该转基因动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪或狗。
在本发明另外方面，提供用于检测TGF-P结合蛋白基因表达的试剂 盒，其包括一个含有核酸分子的容器，其中该核酸分子选自：（a)含有SEQ ID Nos: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13或15的核苷酸序列的核酸分子；（b) 含有（a)之核苷酸序列的互补序列的核酸分子；（c)是长度为至少15、 20、 30、 50、 75或100个核苷酸的（a)或（b)的片段的核酸分子。还提供用于 检测TGF-p结合蛋白的试剂盒，该试剂盒包含一个含有一种本文所述的 TGF-p结合蛋白抗体的容器。
例如，在本发明的一个方面，提供用于确定所选分子是否能够增加骨 矿质含量的方法，包括步骤：（a)将一种或多种候选分子与权利要求1的 核酸分子编码的TGF-p结合蛋白，以及TGF-p蛋白质家族的一个选定成 员（例如BMP5或6)相混合，（b)测定该侯选分子是否改变了 TGF-P家 族成员的信号转导（signaling),或改变了 TGF-卩结合蛋白与TGF-P家 族成员的结合。在某些实施方案中，该分子改变TGF-p起间充质细胞分 化的正调节物作用的能力。在本发明的此方面，该侯选分子可以通过例 如减少（如抑制）或增加（如增强）信号转导或结合来改变信号转导或 结合。
在另一方面，提供用于确定所选分子是否能够增加骨矿质含量的方法，包括步骤：确定所选分子是否抑制TGF-p结合蛋白与骨或其类似物 的结合。骨或其类似物的代表性例子包括鞋基磷灰石和通过活组织检查 获得的人原始骨样品。
在以上列举的方法的某些实施方案中，该所选分子包含在分子混合物 中，而且这些方法可以进一步包括步骤：分离在该测定中发挥功能的一 种或多种分子。在其它实施方案中，将TGF-P蛋白质家族结合在固相支 持物上并测量TGF-p结合蛋白的结合，或者将TGF-p结合蛋白结合在固 相支持物上并测量TGF-p蛋白质的结合。
利用诸如以上描述的方法，可以分析多种分子通过抑制TGF-p结合 蛋白与TGF-p蛋白质家族的结合增加骨矿质含量的能力。这些分子的代 表性例子包括蛋白质或肽、有机分子和核酸分子。
在本发明的其它相关方面中，提供用于增加恒温动物骨矿质含量的方 法，包括步骤：给恒温动物施用治疗上有效量的从本文所列举分析方法 鉴定的分子。在另一方面，提供用于增加恒温动物骨矿质含量的方法， 包括步骤:给恒温动物施用治疗上有效量的抑制TGF-p结合蛋白与TGF-p 蛋白质超家族，包括骨形态发生蛋白质（BMP)结合的分子。适合分子的 代表性例子包括反义分子、核酶、核酶基因和特异识别并改变TGF-p结 合蛋白活性的抗体（例如人源化抗体）。
在本发明的另一方面，提供用于增加恒温动物骨矿质含量的方法，包 括步骤：（a)向返回骨的细胞导入指导抑制TGF-p结合蛋白与TGF-p蛋白 质家族和骨形态发生蛋白质（BMP)结合的分子表达的载体，和（b)给恒 温动物施用该含有载体的细胞。如本文中所用的，应该理解，如果细胞 在外周施用后定位在骨基质中，则细胞"返回骨"。在一个实施方案中， 该方法还包括，在导入步骤之前，从骨髓分离返回骨的细胞。在再一实 施方案中，返回骨的细胞选自CD34+细胞和成骨细胞。
在本发明的其它方面，提供抑制TGF-p结合蛋白与TGF-p蛋白质超 家族结合的（优选分离的）分子。
在另一些实施方案中，该分子可以以组合物的形式提供，而且可以进 一步含有骨吸收抑制物。这些抑制物的代表性例子包括降钙素、雌激素、二膦酸酯、具有抗吸收活性的生长因子和三笨氧胺。
可以用于前述治疗方法中的分子的代表性例子包括例如核酶、核酶基 因、反义分子和/或抗体（例如人源化抗体）。依据这些分子的选择，它
们可以用来改变、拮抗或激动本文所述的TGF-p结合蛋白家族成员的信 号转导或结合。
在本发明的各种实施方案中，上述治疗或预防的分子和方法可以用于 疾病例如骨质疏松症、骨软化、牙周病、坏血病、库欣病（Cushing，s Disease )、骨折和由于肢体不动和类固醇使用引起的疾病。
参考如下详细说明和附图，本发明的这些和其它方面将是明显的。此 外，本文给出了各种更为详细地描述某些程序和组合物（例如质粒等） 的文献，并因此将它们完整地以参考文献方式并入。
附图简要^兌明
图1是人Dan、人Gremlin、人Cerberus和人Beer的氨基酸序列比 较示意图。箭头指示半胱氨酸骨架。
图2总结了从对各种组织进行TGF-p结合蛋白基因，具体是人Beer 基因表达研究获得的结果。使用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR) 方法，从由总RNA合成的第一链cDNA扩增该基因的一部分（在实施例2A 中有更为详细的描述）。
图3总结了使用与小鼠Beer转录本互补的cRNA探针进行小鼠胚胎 切片RNA原位杂交所获得的结果（在实施例2B中有更为详细的描述）。A 组为10.5 dpc胚胎的横向切片。B组是12.5 dpc胚胎的纵向切片，C组 和D组是15. 5 dpc胚胎的纵向切片。
图4说明了通过Western印迹分析显示的三种不同多克隆抗体对于 它们各自抗原的特异性（在实施例4中有更详细地描述）。图4A显示了 抗人Beer抗体对于人Beer抗原，而非人Dan或人Gremlin的特异反应 性。图4B显示了抗人Gremlin抗体对于人Gremlin抗原，而非人Beer 或人Dan的特异反应性。图4C显示了抗人Dan抗体对于人Dan抗原， 而非人Beer或人Gremlin的特异反应性。图5说明了通过Western印迹分析显示的TGF-p结合蛋白Beer对 BMP-5和BMP-6，而非BMP-4的选择性（在实施例5中有更详细地描述）。
图6阐明了 TGF-p结合蛋白Beer与BMP-5之间的离子相互作用具有 15-30nM范围的解离常数。
发明详述
定义
在详细陈述本发明之前，阐明某些术语的定义并列出和定义下文将用 到的缩写，可能对于本发明的理解是有用的。
"M"应理解为包括蛋白质或肽（例如抗体、重组结合伴侣（binding partner).具有期望结合亲和性的肽）、核酸（例如DNA、 RNA、嵌合核酸 分子和核酸类似物如PNA);和有机或无机化合物。
"TGF-B"应理解为包括任何已知或新的TGF-p超家族成员，该TGF-p超家族也包括骨形态发生蛋白质（BMP)。
"TGF-B受体"应理解为是指对于TGF-p超家族（包括骨形态发生蛋 白质（BMP))的特定成员具有特异性的受体。
、"TGF-B结合蛋白"应理解为是指对于TGF-p超家族（包括骨形态发 生蛋白质（BMP))的特定成员或子集具有特异结合亲和性的蛋白质。TGF-p 结合蛋白的具体例子包括SEQ ID NOs. 1、 5、 7、 9、 11、 13和15所编 码的蛋白质。
抑制"TGF-B结合蛋白与TGF-(3蛋白质家族和骨形态发生蛋白质 (BMP)的结合"应理解为是指，通过除去TGF-p或阻止TGF-p与TGF-p 结合蛋白结合，从而允许激活TGF-p或骨形态发生蛋白质（BMP),或允 许TGF-p家族成员包括骨形态发生蛋白质（BMP)与其各自的受体结合的 分子。该抑制可以通过例如抑制TGF-p结合蛋白与TGF-p超家族的特定 成员结合的分子来实现。
"载体"是指能够指导目的蛋白质表达的装置。载体必须包括可操 作地与目的基因连接的转录启动子元件。载体可以由脱氧核糖核酸 ("DNA")、核糖核酸（"RNA")、或两者的结合（例如DNA-RNA嵌合物）
26组成。任选地，载体可以包括聚腺苷酸化序列、 一或多个限制性位点、 以及一或多个选择标记例如新霉素磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶。此 外，依据所选宿主细胞和所用载体，还可以在本文所述的载体中并入其 它遗传元件例如复制起点、其它的核酸限制性位点、增强子、赋予转录 可诱导性的序列、和选择标记。
"分离的核酸分子"是非整合在生物体基因组DNA中的核酸分子。 例如，从真核细胞的基因组DNA中分离的编码TGF-p结合蛋白的DNA分 子即是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一个例子是非整合在生物 体基因组中的化学合成核酸分子。该分离核酸分子可以是基因组DNA、 cDNA、 RNA，或至少部分由核酸类似物组成。
"分离的多肽"是基本上不带有污染细胞成分例如本质上与该多肽 相联的碳水化合物、脂质或其它蛋白性质杂质的多肽。在某些实施方案 中，如果看起来一个特定的蛋白质制品在考马斯亮兰染色的SDS-PAGE凝 胶上表现为单一条带，则它含有分离的多肽。当指有机分子时，"分离的" 意味着采用本领域熟知方法（例如NMR、熔点法）测定时，该化合物具有 大于90%的纯度。
"硬化性狭窄（Sclerostenosis)"是Hansen ( 1967)用以指一种 疾病的术语（Hansen, H. G., Sklerosteose. In: Opitz， H. ; Schmid, F. ， Handbuch der Kinderheikunde. Berlin: Springer (出版)6 1967， 第351-355页），该疾病类似于范布肯姆全身性骨化层肥厚病，但可能有 如下不同：骨改变的放射性表现，和许多案例中食指和中指的不对称皮 肤并指（趾）现象的存在。在该疾病中下颌具有不寻常的正方形外观。
"人源化抗体"是重组蛋白质，其中鼠单克隆抗体的互补决定区已 从鼠免疫球蛋白的重和轻可变链转移至人的可变区。
正如本文所用，"抗体片段"是指抗体的部分例如F(ab，）2、 F(ab)2、 Fab，、 Fab等等。无论结构如何，抗体片段与完整抗体所识别的相同抗原 结合。例如，抗TGF-p结合蛋白单克隆抗体片段与TGF-p结合蛋白表位 结合。
术语"抗体片段"也包括通过结合特异抗原形成复合物来象抗体一样起作用的任何合成蛋白质或遗传工程蛋白质。例如，抗体片段包括由
轻链可变区构成的分离片段、由重链和轻链可变区构成的"Fv"片段、 通过肽接头连接轻链可变区和重链可变区的重组单链多肽分子（"sFv蛋 白质"）、和由模拟高变区的氨基酸残基构成的最小识别单位。
"可检测标记（label)"是可以和抗体部分结合产生对于诊断有用的 分子的分子或原子。可检测标记的例子包括螯合剂、光敏剂、放射性同 位素、荧光试剂、顺磁离子、酶和其它标记物（marker)部分。
如本文所用，"免疫结合物（i咖unocon.iugate)"是含有抗TGF-p结 合蛋白抗体或抗体片段，和可检测标记的分子。免疫结合物在结合 (conjugation)之后具有与结合之前大致上相同的，或仅轻微降低的结合 TGF-p结合蛋白的能力。
缩写：TGF-p~ "转化生长因子-p"; TGF-pBP— "转化生长因子-p 结合蛋白"（一种代表性的TGF-pBP称为"人Beer"); BMP—"骨形态发 生蛋白质"；PCR—"聚合酶链式反应"；RT-PCR—在第一步使用逆转录酶 (RT)将RNA首先转录成DNA的PCR方法；cDNA—通过将RNA序列拷贝 成DNA形式所产生的任何DNA。
如上所述，本发明提供一种新的TGF-p结合蛋白类型，以及用于增 加恒温动物的骨矿质含量的方法和组合物。筒单地说，本发明以如下意 外发现为基础：编码TGF-p结合蛋白家族一个新成员的基因的突变导致 了稀有疾病（硬化性狭窄），该疾病的特征在于与正常个体相比患者骨矿 质含量高了 1-4倍。因此，正如以下将更为详细地讨论的，该发现导致 开发了可以用于筛选抑制TGF-p结合蛋白与TGF-p蛋白质家族和骨形态 发生蛋白质（BMP)相结合的分子的方法，以及使用这些分子增加恒温动 物（包括例如人）的骨矿质含量的方法。
对称为硬化性狭窄的疾病的讨论 硬化性狭窄是Hansen( 1967)应用于一种疾病的术语（Hansen, H. G.， Sklerosteose. In: Opitz, H. ; Schmid， F. ， Handbuch derKinderheikunde. Berlin: Springer (出版）6 1967，第351-355页）， 该疾病类似于范布肯姆全身性骨化层肥厚病，但骨改变的放射性表现可 能不同，而且在许多案例中存在食指和中指的不对称皮肤并指（趾）现 象。
现已知道硬化性狭窄是一种以成年时期广泛播散性骨硬化损伤 (disseminated sclerotic lesions of the bone)为特征的常染色体半 显性疾病。该疾病是进行性的。硬化性狭窄还有一个与并指（趾）（两个 或多个指（趾）融合在一起）相关的发育问题。硬化性狭窄综合征与巨 型身高相关，许多患病个体达到6英尺高或更高。纯合子的骨矿质含量 可以比正常个体高1-6倍，而且骨矿质密度可以比正常值（例如，从未 患病同胞获得的值）高1-4倍。
硬化性狭窄综合征主要在南非荷兰人血统的Afrikaaner人中发生。 在Afrikaaner群体中大约1/140的个体是该突变基因的携带者（杂合 子）。该突变表现出100%的外显率。关于不带有相关病理学特征（并指（趾） 或头骨过度生长）的杂合子中骨矿质密度增加也有轶事报道。
目前，似乎在硬化性狭窄中还没有垂体-下丘脑轴的异常。尤其是， 似乎还没有生长激素和可的松的过度产生。此外，在患病个体中性激素 水平正常。然而，骨更新标记（bone turnover markers)(成骨细胞特 异'&喊性磷酸酶、骨钙素、I型原胶原C，前肽（PICP)，以及总的碱性磷 酸酶；（见Cornier, C., Curr. Opin. in Rheu. 7:243， 1995))指示有 与该疾病相关的高成骨细胞活性（hyperosteoblastic activity),但破 骨细胞活性正常至轻微降低，这是用骨吸收标记（吡咬啉、脱氧吡啶啉、 N-端肽、尿羟脯氨酸、血浆酒石酸抗性酸性磷酸酶和半乳糖基羟赖氨酸 (见Cornier,同上））测量的。
硬化性狭窄的特征在于在患病个体的一生中全身骨骼骨的持续沉积。 在纯合子中骨矿质的持续沉积导致在缺^械剌激感受器的骨骼区域（头 骨、颌、颅骨）中骨的过度生长。在患硬化性狭窄的纯合子中，头骨的 过度生长导致颅压迫，并最终由于脑干所受到的过高流体静压导致死亡。 在骨骼的所有其它部分，出现普通性和弥散性硬化。长骨的皮质区极大地增厚，导致骨长度的显著增加。小梁连接（trabecular connections) 增厚，而这又增加了小梁骨的强度。硬化骨表现出不寻常的X射线不透性。
正如实施例1中将更详细描述的，负责硬化性狭窄综合征的这种稀有 遗传突变定位在人第17号染色体编码TGF-(5结合蛋白家族一个新成员的 区域（该新成员的一个代表性例子称为"人Beer")。如下文将更为详细 地描述的，基于该发现，骨矿化机制获得了更为全面的理解，从而允许 开发测定增加骨矿化的分子的方法，以及这些分子在增加骨矿质含量和 治疗或预防许多疾病中的应用。
TGF-B超家族
转化生长因子-P (TGF-p)超家族包含各种（在二级和三级水平上） 具有共同的序列元件和结构基序的生长因子。已知该蛋白质家族在众多 的细胞类型上执行着广泛的生物学反应。其中许多在胚胎发育期间模式 的形成和组织的特化中发挥着重要作用；在成年个体中它们参与例如伤 口愈合和骨修复及骨重塑，以及免疫系统的调节。除了三种TGF-p夕卜， 该超家族还包括骨形态发生蛋白质（BMP)、活化素、抑制素、生长和分 化因子（GDF)以及胶质来源的神经营养因子（GDNF)。通过将特定蛋白 质划入普通亚家族的一般序列特征，建立初级分类。由于较小群体的成 员间更为严格的序列保守性，在亚家族中进行其它分层是可能的。在某 些情况中，例如对于BMP-5、 BMP-6和BMP-7,这可以是此较小群体成员 间的高达75%的氨基^同源性。这种一致性水平使得单个代表性序列即可 说明将此子群体与较大家族的其它成员分开的此子群体的关键生化元 件。
TGF-p通过诱导I型和II型受体形成异寡聚体复合物（hetero-oligomeric complexes)来实现信号转导。已经测定了 TGF-p2的晶体结 构。TGF-p2的通常折叠形式含有一个由三个二硫桥形成的稳定紧凑的半 胱氨酸节状结构。通过一个二磁挢稳定的二聚化是反向平行的。
TGF-p家族成员通过结合具有内在丝氨酸/苏氨酸激酶活性的受体来起始其细胞作用。该受体家族由两个亚家族组成，表示为I型和II型受
体。TGF-p家族的每个成员均与I型和II型受体的一个特征性组合相结 合，这两种受体均是信号转导所必需的。在目前的TGF-p受体激活模型 中，首先TGF-p与II型受体（TbR-II)结合，这以具有激活的激酶活性 的寡聚形式在细胞膜中发生。之后，在缺乏TbR-II时不能与配体结合的 I型受体(TbR-I)被吸收进该复合物中。然后，主要在近膜区的富含甘氨 酸和丝氨酸残基的域（GS域）中TbR-II使TbR-1磷酸化，并由此激活 TbR-I。
迄今已鉴定了 7种I型受体和5种II型受体。
骨形态发生蛋白质（BMP)是决定人体骨矿质 密度的关^调节蛋白质 骨形成理解方面的主要进展是骨形态发生蛋白质（BMP),又称生骨 蛋白质（OP)的鉴定，该蛋白质调节体内软骨和骨的分化。BMP/OP通过 一连串级联事件诱导软骨内的骨分化，这些事件包括软骨的形成、软骨 的过量生长和^化、血管入侵、成骨细胞的分化、和骨的形成。如上所 述，BMP/OP (BMP 2-14，和生骨蛋白1和2即QP-1和0P-2)是TGF-p 超家族的成员。BMP/OP亚家族成员之间的惊人进化保守性提示，它们在 动物的正常发育和机能中是关键的。而且，多种形式的BMP/OP的存在引 出一个重要问题，即关于此明显冗余的生物学意义的问题。BMP/OP除了 在胎儿之后（postfetal)的软骨形成和骨生成中起作用外，还在骨骼形 成（包括颅面（craniofacial)组织和牙组织的发育）以及实质器官包 括肾的胚胎发育和器官形成中起着多种作用。现在我们知道，自然界依 靠着剪裁的共同（但稀少）的分子机制来实现特化组织和器官的形成。 BMP/OP超家族是自然界筒约性的一个很好例子，即通过使用在高度保守 羧基端区域的氨基酸基序中具有微小变异的分子同种型（isoform)来规划 多种特化功能。 BMP的拮抗作用BMP亚家族和活化素亚家族均受到明显的翻译后调节。存在一个复杂 的细胞外控制系统，籍此合成并输出一个高亲和性拮抗剂，随后该拮抗 剂选择性地与BMP或活化素形成复合物以破坏它们的生物学活性（W.C. Smith (1999) TIG 15(1) 3-6)。已经鉴定了许多这种天然拮抗剂，而且 基于序列差异百分数，由于缺乏一级序列的保守性，它们似乎是独立进 化的。目前还没有关于这类蛋白质的结构研究。这些拮抗剂的研究突出 显示，其明显偏好与BMP-2和BMP-4相互作用，并中和之。而且，不同 拮抗剂的抑制机制似乎不同（S. Iemura等（1998)美国国家科学院院刊 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 95， 9337-9342)。
新的TGF-B结合蛋白 1. TGF-p结合蛋白的背景
如上所述，本发明提供一种新的TGF-p结合蛋白类型，当与人DAN、 人Gremlin和人.Cerberus以及SCGF (美国专利5,780,263)相比时此 新TGF-p结合蛋白类型具有几乎一致的半胱氨酸（二硫键）支架，但核 苷酸水平上几乎没有同源性（背景知识一般参见Hsu， D. R. ， Economides， A. N., Wang，， X., Eimon, P.M., Harland, R. M.，"非洲爪塘属背部化 (dorsaliz&g)因子Gremlin鉴定了一个拮抗BMP活性的新分泌蛋白质家 族"，分子细胞（Molecular Cell) 1:673-683,1998)。 」
该新TGF-p结合蛋白类型的一个代表性例子在SEQ ID NOs. 1、 5、 9、 11、 13和15中公开。还应当理解，这类结合蛋白的代表性成员包括TGF-p 结合蛋白变休（例如SEQ ID NOs. 5和7)。本文中所使用的"TGF-p结 合蛋白变体基因"是指编码具有SEQ ID Nos: 2、 10、 12、 14或16的修 饰氨基酸序列的多肽的核酸分子。该变体包括天然存在的TGF-p结合蛋 白基因多态性或等位基因变体，以及含有这些氨基酸序列的保守氨基酸 替换的合成基因。TGF-p结合蛋白基因的其它变体形式是含有上述核苷酸 序列的插入或缺失的核酸分子。TGF-p结合蛋白变体基因可以通过确定该 基因是否能与具有SEQ ID Nos: 1、 5、 7、 9、 11、 13或15的核苷絲 列在严紧条件下杂交来鉴定。此外，TGF-p结合蛋白变体基因应编码具有)的蛋白质。
作为一种替代方法，TGF-p结合蛋白变体基因可以通过序列比较来鉴 定。正如本文中所用的，当以获得最大对应（correspondence)的方式对 比（aligning)时，如果两个氨基酸序列的氨基酸残基相同，则这两个 氨基酸序列具有"100%的氨基酸序列一致性"。同样，当以获得最大对应 的方式对比时，如果两个核苷酸序列的核苷酸残基相同，则这两个核苷 酸序列具有"100%的核苷酸序列一致性"。序列比较可以采用标准软件程 序例如DNASTAR (Madison, Wisconsin)生产的LASERGENE生物信息计 算软件包中包括的那些程序来进行。其它通过确定最佳对比来比较两个 核苷酸或氨基酸序列的方法是本领域技术人员所熟知的（见例如Peruski 和Peruski，因特网和新生物学：基因组和分子研究的工具（The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research), (ASM Press公司，1997); Wu等（编），"核酸及蛋白质的信息高速公路 和计算机数据库"，基因生物技术方法（Methods in Gene Biotechnology),第123-151页（CRC Press公司，1997);和Bishop (编）人类基因组计算指南（Guide to Human Genome Computing)第2 版（Academic Press公司，1998))。
TGF-(3结合蛋白变体应与SEQ ID Nos: 2、 6、 10、 12、 14或16有 至少50%的#^酸序列一致性，优选高于60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90械95%的一致性。或者，TGF-p结合蛋白变体可以通过与SEQ ID Nos: 1、 5、 9、 11、 13或15有至少70%的核苷酸序列一致性来鉴定。而且， 本发明还设想了与SEQ ID NO: 1有大于75%、 80%、 85%、 90%或95%—致 性的TGF-p结合蛋白基因变体。无论使用何种鉴定TGF-p结合蛋白变体 基因或TGF-p结合蛋白变体的具体方法，TGF-p结合蛋白变体或由TGF-卩 结合蛋白基因变体编码的多肽均可以从功能上通过例如其结合TGF-p蛋 白质家族选定成员和/或抑制该成员的信号转导的能力来表征，或通过其 特异结合抗TGF-p结合蛋白抗体的能力来表征。
本发明包括TGF-p结合蛋白基因的功能性片段。在本发明范畴内， TGF-p结合蛋白基因的"功能性片段"是指编码TGF-P结合蛋白多肽的（1)
33具有上述功能活性，或（2)特异地与抗TGF-p结合蛋白抗体结合的部分的 核酸分子。例如，本文所述TGF-p结合蛋白基因的功能性片段包含SEQID Nos: 1、 5、 9、 11、 13或15核苷酸序列的一部分。
2. TGF-p结合蛋白基因的分离
编码结合蛋白基因的DNA分子可以通过使用基于例如SEQ ID No: 1 的寡核苷酸探针，筛选人cDNA或基因组文库来获得。
例如，cDNA文库制备的第一步是采用本领域技术人员所熟知的方法 分离RNA。 一般地，RNA的分离技术必需提供用于破碎细胞的方法、抑制 RNA酶指导的RNA降解的手段、以及从DNA、蛋白质和多糖污染物中分离 RNA的方法。例如，总RNA可以通过如下步骤获得：在液氮中冷冻组织， 用研钵和研棒磨碎此冷冻组织以裂解细胞，用酚/氯仿溶液抽提该研碎组 织以去除蛋白质，并通过用氯化锂选择性沉淀从剩余的杂质中分离出RNA (见例如Ausubel等（编），精编分子生物学实验指南（Short Protocols in Molecular Biology),第三版，第4-1至4-6页（John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu等,基因生物技术方法，第33-41页(CRC 出版公司1997) ["Wu (1997)"])。
或者，总RNA可以通过如下步骤分离：用异硫氰^l^提研碎组织， 用有机溶剂抽提，并使用差速离心从污染物中分离RNA(见例如Ausubel (1995)第4-1至4-6页；Wu ( 1997)第33-41页）。
为了构建cDNA文库，必需从总RNA制品中分离poly(A)+RNA。可以 通过使用oligo(dT)-纤维素层析标准技术从总RNA中分离poly(A)+RNA (见例如Ausubel (1995)第4-11至4-12页）。
采用本领域技术人员熟知的技术从poly (A)+RNA合成双链cDNA分子。 (见例如Wu ( 1997)第41-46页）。而且，可以使用商业上可获得的试剂 盒来合成双链cDNA分子。例如，这些试剂盒可以获自Life Technologies 公司（Gaithersburg， Maryland), CLONTECH Laboratories公司（Palo Alto, California), Promega公司(Madison， Wisconsin)和Stratagene Cloning Systems (La Jolla, California^可以对用以获得TGF-卩结合蛋白cDNA克隆的这种基本方法进行修 改，方法是构建富集TGF-(J结合蛋白特异性cDNA分子的扣除cDNA文库。 构建扣除文库的技术是本领域技术人员所熟知的（见例如，Sargent,"差 异表达基因的分离 (Isolation of Differentially Expression Genes)"，酶学方法(Meth. Enzymol. ) 152:423， 1987,以及Wu等(编） "扣除和完整表达cDNA文库的构建和筛选（Construction and Screening of Substracted and Complete Expression cDNA Libraries)"基因生 物技术方法(Methods in Gene Biotechnology),第20-65页（CRC出 版乂>司，1997))。
多种克隆栽体适合用于cDNA文库的构建。例如，可以在来源于噬菌 体的载体如入gtlO载体中制备cDNA文库（见例如，Huynh等，"在XgtlO 和入gtll中构建和篩选c腿文库（Constructing and Screening cDNA Libraries in人gtlO and入gtll)", DNA克隆：实用方法（DNA Cloning: A Practical Approach)第I春，Glover (编），第49页（IRL Press, 1985); Wu ( 1997)第47—52页）。
或者，可以将双链cDNA分子插入质粒栽体如pBluescript栽体 (Stratagene Cloning Systems; La Jolla， California), 入GEM—4 (Promega乂^司；Madison, Wisconsin)或其它商业可获得的载体。合 适的克隆载体还可以从美国典型培养物保藏中心（Rockville, Maryland)获得。
为了扩增克隆的cDNA分子，采用标准技术将cDNA文库插入原核宿 主中。例如，可以将cDNA文库导入大肠杆菌DH5感受态细胞中，该细胞 可以从Life Technologies公司(Gaithersburg, Maryland)获得。
可以通过本领域熟知的方法制备人类基因组DNA文库（见例如Ausubel (1995)第5-1至5-6页；Wu ( 1997)第307-327页）。基因组DNA可以通 过如下步骤分离：用去污剂Sarkosyl裂解组织，蛋白酶K消化裂解物， 通过离心从裂解物中清除不溶性碎片，使用异丙醇从裂解物中沉淀核酸， 并在氯化铯密度梯度上纯化重悬的DNA。
可以通过基因组DNA的随机剪切或通过用限制性内切酶部分消化基
35因组DNA,获得适合用于产生基因组文库的DNA片段。根据常规技术，例 如使用限制性酶消化提供合适的末端、使用碱性磷酸酶处理以避免DNA 分子不合要求的连接、并用合适的连接酶进行连接，可以将基因组DNA 片段插入载体如噬菌体或祐粒载体中。用于这些操作的技术是本领域所 熟知的（见例如Ausubel (1995)第5-1至5~6页；Wu ( 1997)第307-327 页）。
编码TGF-p结合蛋白的核酸分子还可以使用具有基于上迷人TGF-P 结合蛋白基因之核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸引物采取聚合酶链 式反应（PCR)来获得。用PCR筛选文库的一般方法参见例如，Yu等"使 用聚合酶链式反应筛选喧菌体文库（Use of Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries)", 分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)第15巻：PCR搡作指南：目前的方法和应用（PCR Protocols: Current Methods and Applications )， White(编)第211-215页 (Humama 出版公司，1993)。而且，使用PCR分离相关基因的技术描述于例如Preston "简并寡核苷酸引物和聚合酶链式反应在克隆基因家族成员中的应用 (Use of Degenerate Oligonucleotide Primes and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Member)", 分子生物学方法， 第15巻：PCR操作指南：目前的方法和应用，White (编）第317-337页 (Humama出版公司，1993)。
或者，可以从商业途径例如Research Genetics (Huntsville， AL) 和美国典型培养物保藏中心（Rokville, Maryland)获得人类基因组文 库。
可以采用标准方法（见例如Ausubel (1995)第6-1至6-11页），用 基于SEQ ID No: 1的一或多个多核苷酸探针筛选含有cDNA或基因组克 隆的文库。
按下述方法制备的抗TGF-p结合蛋白抗体也可以用来从cDNA文库中 分离编码TGF-p结合蛋白基因的DNA序列„例如，可以使用该抗体筛选 入gtll表达文库，或者可以在杂交体选择和翻译（hybrid selection and translation)后使用该抗体进行免疫筛选(见例如Ausubel (1995)第6-12至6-16页；Margolis等"用抗体和蛋白质探针筛选入表达文库（Screening 入 expression libraries with antibody and protein probes) ，，， EWA 克隆2:表达系统（腿Cloning 2: Expression Systems)第2版，Glover 等（编）第1-14页（牛津大学出版社1995))。
TGF-p结合蛋白cDNA或TGF-p结合蛋白基因组片段的序列可以采用 标准方法确定。而且，可以采用成熟技术如缺失分析（deletion analysis) ( 一般参见Ausubel ( 1995)),实现对含有TGF-(J结合蛋白启动子或调 节元件的基因组片段的鉴定。
作为替代方法，可以通过采用相互引发（mutually priming)的长 寡核苷酸以及本文所述的核苷酸序列，合成DNA分子，获得TGF-p结合 蛋白基因（见例如Ausubel (1995)第8-8至8-9页）。使用聚合膝逸式 反应的已有技术使得能够合成长至少2千碱基对的DNA分子（Adang等， 植物分子生物学(Plant Molec. Biol. ) 21:1131， 1993; Bambot等,PCR 方法和应用（PCR Methods and Applications) 2:266， 1993; Dillon 等，"聚合酶链式反应在快速构建合成基因中的应用（Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes)",分子生物学方法，第15巻：PCR搡作指南：目前的方法和应 用，White (编）第263-268页（Humama出版公司，1993); Holowachuk 等，PCR方法应用（PCR Methods Appl.) 4:299， 1995)。
3. TGF-(5结合蛋白基因的制备
可以通过采用上述程序，利用具有基于SEQ ID NO: 1、 5、 9、 11、 13 或15的核苷M列的多核苷酸探针，筛选各种cDNA或基因组文库，来 获得编码TGF-P结合蛋白基因变体的核酸分子。也可以通过合成构建 TGF-p结合蛋白基因变体。例如，可以设计一个核酸分子，其编码与SEQ ID Nos: 2、 6、 8、 10、 12、 14或16的氨基酸序列相比具有保守氨基酸改变 的多肽。即，可以获得含有SEQ ID Nos: 2、 6、 8、 10、 12、 14或16的 一或多个氨基酸替换的变体，其中TGF-卩结合蛋白氨基酸序列中的烷基 氨基酸由烷基氨基酸替代，TGF-卩结合蛋白氨基酸序列中的芳香族氨基酸由芳香族氨基酸替代，TGF-p结合蛋白氨基酸序列中的含硫氨基酸由含硫 氨基酸替代，TGF-p结合蛋白氨基酸序列中的含羟基氨基酸由含羟基氨基 酸替代，TGF-p结合蛋白氨基酸序列中的酸性氨基酸由酸性氨基酸替代， TGF-p结合蛋白氨基酸序列中的碱性氨基酸由碱性氨基酸替代，或TGF-p 结合蛋白氨基酸序列中的二碱基（dibasic)单羧基氨基酸由二碱基单羧 基氨基酸替代。
在通常的氨基酸中，例如，"保守氨基酸替代"可通过下列每组内的 氨基酸之间的替代来说明：（l)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮 氨酸，（2)笨丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，（3)丝氨酸和苏氨酸，（4)天冬氨 酸和谷氨酸，（5)谷氨酰胺和天冬酰胺，和（6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。 在进行这些替换时，重要的是尽可能维持图l描画的半胱氨酸骨架。
TGF-p结合蛋白氨基酸序列中的保守氨基酸改变可以通过用核苷酸替 代SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸来引入。这种"保守氨基酸"变体可以 通过例如寡核苷酸指导的诱变、接头分区诱变、使用聚合酶链式反应进 行的诱变等等获樹见Ausubel (1995)第8-10至8-22页；以及McPherson (编），定向资变：实践方法（Directed Mutagenesis: A Practical Approach) (IRL出版社1991))。这些变体的功能性能力可以采用标准方 法例如本文所述试验方法来测定。或者，TGF-p结合蛋白变体多肽可以通 过其特异结合抗TGF-p结合蛋白抗体的能力来鉴定。
可以进行核酸分子的常规缺失分析以获得编码TGF-(5结合蛋白多肽 的核酸分子的"功能性片段"。作为一个说明例子，可以用Bal3 I核酸 酶消化具有SEQ ID NO: 1核苷酸序列的DNA分子，获得一系列嵌套缺失。 然后以正确的阅读框将这些片段插入表达载体，分离表达的多肽并检测 其活性，或检测其结合抗TGF-p结合蛋白抗体的能力。外切核酸酶消化 的一个替代方法是使用寡核苷酸指导的诱变引入缺失或终止密码子以规 定产生期望片段。或者，可以使用聚合酶链式反应合成TGF-p结合蛋白 基因的特定片段。
用于蛋白质功能分析的标准技术描述于例如，Treuter等，分子普通 遗传学（Molec. Gen. Genet. ) 240:113， 1993; Content等，"人干扰素诱导的42kDa 2-5A合成酶的表达和初步缺失分析"，生物干扰素系统， 关于干扰素系统的ISIR-TNO会议报告（Biological Interferon Systems, Proceeding's of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems ) ， Cantell (编）,第65-72页(Nijhoff 1987) ; Herschman, "EGF受体"，动物 细胞增殖控制（Control of Animal Cell Proliferation ),第I巻，Boynton 等（编）第169-199 (Academic Press 1985); Coumaileau等，生物化 学杂志（J. Biol. Chem.)270:29270， 1995; Fukunaga等，生物化学杂 志，270: 25291， 1995; Yamaguchi等，生物化学药物学（Biochem. Pharmacol. )50:1295, 1995;和Meisel等，植物分子生物学（Plant Molec. Biol. )30:1， 1996。
本发明还考虑到具有保守氨基酸改变的TGF-(5结合蛋白基因功能片段。
可以通过按如上所述方法确定与SEQ ID Nos: 1、 5、 9、 1、 13或15 以及2、 6、 10、 12、 14或16的核苷酸和氨基^列的一致性水平，以 结构为基础筌定TGF-p结合蛋白变体基因。基于结构鉴定变体基因的一 个替代方法是，确定编码可能的TGF-p结合蛋白基因变体的核酸分子是 否能在严紧条件下与具有SEQ ID Nos: 1、 5、 9、 11、 13或15,或其长 度不少于15或20个核苷酸的部分的核苷酸序列的核酸分子杂交。作为 严紧杂交条件的举例说明，在如下緩冲液中55-60t:錄育过夜，具有TGF-P结合蛋白变体序列的核酸分子可以与具有SEQ ID NO: 1序列的核酸分 子的片段结合，该緩冲液含有例如5 x SSPE( 1 x SSPE=180mM氯化钠，lOmM 磷酸钠，ImM EDTA ( pH7. 7)), 5 x Denhardt氏液（100 x Denhardt氏液=2% (w/v)牛血清白蛋白，2% (w/v) Ficoll， 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮）和 0. 5% SDS。高度严紧的杂交后洗涤典型地是在0. 5 x SSC ( 1 x SSO150mM 氯化钠，15mM柠檬酸三钠）或0.5xSSPE中于55-60X:进行的。
无论TGF-P结合蛋白基因变体的具体核苷酸序列如何，该基因都编 码能够用其功能活性或其特异结合抗TGF-P结合蛋白抗体的能力来表征 的多肽。更具体地，TGF-P结合蛋白基因变体编码的多肽表现出本文所 述人TGF-P结合蛋白基因所编码多肽的活性的至少50%，优选60%、 70%、80%il 90%以上。
4.在培养细胞中产生TGF-P结合蛋白
为了表达TGF-P结合蛋白基因，在表达载体中编码该多肽的核酸分 子必需可操作地与控制转录表达的调节序列连接，之后导入宿主细胞中。 除了转录调节序列例如启动子和增强子，表达载体还可包括翻译调节序 列和适用于筛选携带该表达载体的细胞的标记基因。
适用于在真核细胞中产生外源蛋白质的表达载体典型地含有（l)编码 细菌复制原点和抗生素抗性标记的原核DNA元件，以为表达载体在细菌 宿主中的生长和筛选作准备；（2)控制转录起始的真核DNA元件，例如启 动子；和（3)控制转录本加工的DNA元件，例如转录终止/多腺苷酸化序 列。
本发明的TGF-P结合蛋白优选在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物宿 主细胞的例子包括非洲绿猴肾细胞（Vero; ATCC CRL 1587)，人胚胎肾 细胞（293-HEK; ATCC CRL 1573)，新生仓鼠肾细胞（BHK-21; ATCC CRL 8544);犬肾细胞（MDCK; ATCC CCL 34),中国仓鼠卵巢细胞（CH0-K1; ATCC CCL 61),大鼠垂体细胞（GH1; ATCC CCL 82 )， Hela S3细胞（ATCC CCL 2.2)，大鼠肝癌细胞（H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40转化的猴 肾细胞（COS-1; ATCC CRL 1650)和鼠胚胎细胞（NIH-3T3; ATCC CRL 1658 )。
对于哺乳动物宿主，转录和翻译调节信号可以来自病毒，例如腺病毒、 牛乳头瘤病毒、猿猴病毒等等，在这些病毒中这些调节信号与具有高水 平表达的特定基因相联系。适合的转录和翻译调节序列还可以从哺乳动 物基因例如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白基因获得。
转录调节序列包括足以指导RNA合成起始的启动子区域。适合的真 核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子[Hamer等，分子应用遗传 学杂志（J. Molec. Appl. Genet.) 1:273， 1982],疱渗病毒的TK启动 子[McKnight，细胞（Cell) 31:355， 1982], SV40早期启动子[Benoist 等，自然（Nature) 290:304， 1981], Rous肉瘤病毒启动子[Gorman等， 美国国家科学院院刊79:6777, 1982],巨细胞病毒启动子[Foecking等，基因（Gene) 45:101， 1980],和小鼠乳腺瘤病毒启动子（ 一般见， Etcheverry,"工程蛋白质在哺乳动物细胞培养物中的表达（Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture)，，， 蛋白质工 程：原理和实践(Protein Engineering: Principles and Practice)， Cleland等（编）第163—181页（John Wiley & Sons公司，1996))。
或者，如果一种原核启动子受到真核启动子的调节，则可以使用该原 核启动子，例如噬菌体T3 RNA聚合酶启动子来控制TGF-P结合蛋白基因 在哺乳动物细胞中的表达（Zhou等，分子细胞生物学（Mol. Cell Biol.) 10:4529， 1990; Kaufman等，核酸研究（Nucl. Acids Res. ) 19:4485， 1991 )。
TGF-P结合蛋白基因还可以在细菌、酵母、昆虫或植物细胞中表达。 可以用以在原核宿主细胞中表达TGF-P结合蛋白多肽的适合启动子是本 领域技术人员所熟知的，包括能识别T4、 T3、 Sp6和T7聚合酶的启动子， 入噬菌体的PK和Pt启动子，大肠杆菌的trp、 recA、热休克、lacUV5、 tac、 lpp-lacSpr、 phoA和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌（B. subtiis)的启 动子，芽孢杆菌属（Bacillus )噬菌体的启动子，链霉菌属（Str印tomyces) 的启动子，入噬菌体的int启动子，pBR322的bla启动子，以及氯霉素 乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的综述见Glick， J. Ind. Microbiol. 1:277， 1987; Watson等，基因分子生物学（Molecular Biology of the Gene)第4版(Benjamin Cummins 1987); 以及Ausubel 等（1995)。
优选的原核宿主包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilus)。适合的大肠杆菌菌抹包括BL21(DE3)、 BL21 (DE3)pLysS、 BL21(DE3)pLysE、 DHl、 DH4I、 DH5、 DH5I、 DH5IF，、 DH5IMCR、 DH10B、 DH10B/p3、 DH11S、 C600、 HBIOI、 JM101、 JM105、 JM109、 JM110、 K38、 RR1、 Y1088、 Y1089、 CSH18、 ER1451和ER1647(见例如Brown(编）Molecular Biology Labfax (Academic出版社1991))。合适的枯草芽孢杆菌菌抹 包括BR151、 YB886、 MI119、 MI120和B170 (见例如Hardy,"芽孢杆菌 克隆方法"，DNA克隆：实践方法（DNA Cloning: A Practical Approach),Glover (编）（IRL出版社1985))。
在原核宿主中表达蛋白质的方法是本领域技术人员所熟知的（见例如 William等，"应用质粒载体在大肠杆菌中表达外源蛋白质以及特异性多 克隆抗体的纯化"，DNA克隆2:表达系统，第2版，Glover等（编）第 15页（牛津大学出版社1995); Ward等，"抗体的遗传操作和表达"，单 克隆抗体：原则和应用 (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications),第137页（Wiley-Liss公司，1995);和Georgiou,"细 菌中蛋白质的表达"，蛋白质工程：原理和实践，Cleland等（编）第101 页（John Wiley & Sons^S司，1996))。
杆状病毒系统提供了一种将克隆TGF-P结合蛋白基因导入昆虫细胞 的有效手段。合适的表达载体以苜蓿银紋夜蛾（Autogr邻ha californica)多核型多角体病毒（AcMNPV)为基础，并含有熟知的启动 子例如果蝇（Drosophila)热休克蛋白质（hsp) 70启动子、苜蓿银紋夜蛾 多核型多角体病毒的立即早期基因启动子（ie-1)和迟早期39K启动子、 杆状病毒plO启动子、和果竭金属硫蛋白启动子。合适的昆虫宿主细胞 包括来源于IPLB-sf-21的细胞系， 一 种草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)蛹卵巢细胞系，例如Sf9 ( ATCCCRL 1711), Sf21AE和Sf21
(Invitrogen 乂>司；San Diego, CA),以及果錄Schneider-2细胞。用 于在杆状病毒系统中产生重组蛋白质的确立技术参见Bailey等，"杆状 病毒载体的操作(Manipulation of Baculovirus Vectors)，，， 分子生 物学方法（Methods in Molecular Biology)第7巻：基因转移和表达 实验指南(Gene Transfer and Expression Protocols), Murray (编) 第147-168页（The Humana出版公司1991); Patel等，"杆状病毒表达 系统"，DNA克隆2:表达系统，第2版，Glover等（编）第205-244页
(牛津大学出版社1995); Ausubel ( 1995)第16-37至16-57页， Richardson (编）杆状病毒表达实验指南（Baculovirus Expression Protocols) (The Humana出版公司1995);以及Lucknow，"昆虫细胞 表达技术(Insect Cell Expression Technology)，，， 蛋白质工程：原 理和实践，Cleland等（编），第183-218页（John Wiley & Sons公司
421996 )。
用于酵母中表达的启动子包括来源于GAL1 (半乳糖）、PGK (磷酸甘 油酸激酶）、ADH (醇脱氢酶）、A0X1 (醇氧化酶）、HIS4 (组氨醇脱氢酶） 等的启动子。已经设计了许多酵母克隆栽体，而且这些载体均容易获得。 这些载体包括基于YIp的栽体如YIp5， YRp载体如YRpl7， YEp栽体如 YEpl3，和YCp载体如YCpl9。本领域技术人员将理解有许多种合适载体 可以用于酵母细胞中的表达。
还可以将表达栽体导入植物原生质体、完整的植物组织、或分离的植 物细胞。培养植物组织的一般方法参见例如Miki等，"向植物导入外源 DNA的方法(Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", 植物分子生物学和生物技术方法（Methods in Plant Molecualr Biology and Biotechnology), Glick等(编）,第67-88页（CRC出版社1993)。
可以采用各种标准技术将表达载体导入宿主细胞，这些技术包括磷酸 钓转染、脂质体介导的转染、微粒介导的递送、电穿孔等等。优选地， 对转染细胞进行筛选和增殖，以提供含有稳定整合在宿主细胞基因组中 的表达载体的重组宿主细胞。将载体导入真核细胞的技术和使用显性选 择标记筛选这些稳定转化体的技术描述于例如Ausubel (1995)和Murray (编）基因转移和表达实验指南（Humana出版社1991 )。 Ausubel (1995) 也提供了用于将表达载体导入细菌、酵母、昆虫和植物细胞的方法。
表达和回收哺乳动物细胞系统产生的外源蛋白质的一般方法参见例如 Etcheverry，"工程蛋白质在哺乳动物细胞培养物中的表达"，蛋白质工 程：原理和实践，Cleland等（编），第163页（Wiley-Liss公司，1996)。 回收细菌系统产生的蛋白质的标准技术参见例如Grisshammer等，"从大 肠杆菌细胞中纯化过量产生的蛋白质"，DNA克隆2:表达系统，第2版， Glover等（编），第59-92页（牛津大学出版社1995)。 用于从杆状病 毒系统中分离重组蛋白质的已确立方法描述于例如Richardson (编），杆 状病毒表达实验指南(Baculovirus Expression Protocols) ( The Humana 出版乂^司，1995)。
更为一般地，可以通过标准技术分离TGF-P结合蛋白，例如亲和层析、大小排阻层析、离子交换层析、HPLC等等。本领域技术人员可以设 计分离和纯化TGF-P结合蛋白的其它变化方法。例如可以使用按如下描 述获得的抗TGF-P结合蛋白抗体，通过免疫亲和纯化分离大量蛋白质。
5.抗TGF-P结合蛋白抗体的产生
例如，可以使用表达载体的产物作为抗原来获得抗TGF-P结合蛋白 抗体。尤其有用的抗TGF-P结合蛋白抗体"特异结合"SEQ ID Nos:2、 6、 10、 12、 14或16的TGF-P结合蛋白，而不与其它TGF-P结合蛋白 例如Dan、 Cerberus、 SCGF或Gremlin结合。本发明抗体（包括其片段 和衍生物）可以是多克隆抗体，或尤其是单克隆抗体。该抗体可以属于 任何免疫球蛋白类型，即可以是例如IgG,如IgGp IgG2、 IgG3、 IgG4; IgE; IgM;或IgA抗体。该抗体可以是动物例如哺乳动物来源的，可以是例如 小鼠、大鼠、人或其它灵长类动物的抗体。如果需要，该抗体可以是内 化抗体(internalising antibody )。
可以采用本领域技术人员所熟知的方法制备抗重组TGF-P结合蛋白 的多克隆抗体（见例如，Green等，"多克隆抗血清的制备"，免疫化学实 验指南(Immunochemical Protocols) (Manson, 编)，第1-5页(Humana 出版社1992); Williams等，"采用质粒载体在大肠杆菌中表达外源蛋白 质以及特异性多克隆抗体的纯化"，DNA克隆2:表达系统，第2版，Glover 等（编），第15页（牛津大学出版社1995))。尽管多克隆抗体典型地是 在动物例如大鼠、小鼠、兔、山羊或绵羊中产生的，但本发明的抗TGF-P结合蛋白抗体也可以来源于非人灵长类动物的抗体。在狒狒中产生诊 断上和治疗上有用的抗体的一般技术可以参见例如Goldenberg等，国际 专利申请公开文本WO 91/11465 ( 1991 )， Losman等，国际癌症杂志(Int. J. Cancer) 46:310， 1990。
所述抗体应至少含有一个可变区结构域。该可变区结构域可以是任意 大小或氨基酸组成，并且一般在构架序列中包含至少一个负责抗原结合 的高变氨基酸序列。 一般地，术语可变（V)区结构域可以是免疫球蛋白 重（VH)链和/或轻（Vt)链可变结构域的任何适合配置。因此，例如V区结构域可以是单体，是能够以可接受的亲和性独立地与抗原结合的vH
或\结构域。或者，V区结构域可以是二体，含有Vh-Vh、 Vh-Vl或Vl-V^ 二聚物，其中L和\链以非共价形式相连（以下缩写为Fv)。然而，如 果需要，这些链可以直接地例如通过两个可变结构域之间的二硫键，或 通过接头例如肽接头共价偶联，以形成单链结构域（以下缩写为scFv)。
可变区结构域可以是任何天然存在的可变结构域，或其工程版本。工 程版本是指采用重组DNA工程技术构建的可变区结构域。该工程版本包 括那些例如通过在或向天然抗体的氨基酸序列中插入、缺失或改变，从 天然抗体可变区产生的可变区结构域。这种类型的具体例子包括那些含
有至少一个CDR并任选含有来自一个抗体的一或多个构架氨基酸和来自 第二个抗体的该可变区结构域的其余部分的工程可变区结构域。
可变区结构域可以在C端氨基酸上共价连接至少一个其它抗体结构域 或其片段。因此，例如当VH域存在于可变区结构域中时，其可以与免疫 球蛋白的Ch1域或其片段连接。同样，Vl域可以与Ck域或其片段連接。 以此方式，例如抗体可以是Fab片段，其中抗原结合域含有在C端分别 共价连接了 （y和Q域的相关的、和、结构域。CH1域可以再增加两个 氨基酸，例如用以提供如同Fab，片段中的铰链区结构域，或提供其它结 构域例如抗体CH2和CH3域。
抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区（CDR)的多肽。CDR 肽（"最小识别单位"）可以通过构建编码目的抗体的CDR的基因来获得。 该基因的制备方法例如使用聚合酶链式反应从产生抗体的细胞的RNA合 成可变区（见例如Larrick等，方法：酶学方法手抓Methods: A Companion to Methods in Enzymology) 2:106, 1991; Courtenay-Luck,"单克隆 抗体的遗传操作"，单克隆抗体：生产、工程化和临床应用（Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application), Ritter等（编），第166页（剑桥大学出版社1995);和Ward等，"抗 体的遗传操作和表达"，单克隆抗体：原理和应用，Birch等（编），第137 页（Wiley-Liss乂〉司1995))。
用于本发明的抗体一般可以是单克隆的（通过常规免疫和细胞融合程序制备的），或者对于片段而言是通过采用任何合适的标准化学技术例如 还原或酶裂解和/或消化，例如通过胃蛋白酶处理获得的。
更具体地，可以利用各种技术产生单克隆抗TGF-P结合蛋白抗体。 啮齿类动物的针对特异抗原的单克隆抗体可以通过本领域技术人员所熟 知的方法获得（见例如Kohler等，自然256:495， 1975;和Coligan等
(编），当代免疫学实验指南（Current Protocols in Immunology), 1:2.5. 1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan，，] ; Picksley等，
"针对大肠杆菌中所表达蛋白质的单克隆抗体的产生（Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli.)", DNA克隆2:表达系统，第2版，Glover等（编）第93页（牛津大学出 版社1995))。
筒单地说，单克隆抗体可以通过如下步骤获得：给小鼠注射含有TGF-&结合蛋白基因产物的组合物，通过取出血清样品验证存在抗体的产生， 取出脾脏以获得B淋巴细胞，融合B淋巴细胞和骨髓瘤细胞产生杂交瘤， 克隆杂交瘤，筛选产生抗该抗原的抗体的阳性克隆，培养产生抗该抗原 抗体的克隆，并从杂交瘤培养物中分离该抗体。
此外，本发明抗TGF-P结合蛋白抗体也可以来源于人单克隆抗体。 从经遗传改造应答抗原刺激产生特异人抗体的转基因小鼠获得人单克隆 抗体。在该技术中，人的重链和轻链座位元件被导入胚胎干细胞系来源 的小鼠抹中，其中该胚胎干细胞系含有被定向破坏的内源性重链和轻链 座位。该转基因小鼠可以合成特异针对人抗原的人抗体，而且该小鼠可 以用于产生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法描述 于例如Green等，自然遗传学（Nature Genet. ) 7:13， 1994; Lonberg 等，自然368:856， 1994;和Taylor等，国际免疫学（Int. I咖un. )6:579， 1994。
可以通过各种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。 这些分离技术包括用A蛋白S印harose进行的亲和层析、大小排阻层析、 和离子交换层析(见例如Coligan，第2. 7.1-2. 7.12页和第2. 9. 1-2. 9. 3 页；Baines等，"免疫球蛋白G ( IgG)的纯化"，分子生物学方法，第10巻，第79-104页（The Humana出版公司1992))。
对于特定应用，可能希望制备抗TGF-P结合蛋白抗体的片段。这些 抗体片段可以通过例如抗体的蛋白水解来获得。可以通过常规方法将整 个抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，获得抗体片段。作为一个说明 例子，可以通过胃蛋白酶酶解抗,供称为F(ab，）2的5S片段，产生抗 体片段。可以使用巯基还原剂进一步裂解该片段，产生单价3.5S Fab，片 段。任选地，可以使用封闭二硫键断裂所产生巯基的基团，进行该裂解 反应。作为替代方法，使用胃蛋白酶酶解直接产生两个单价Fab片段和 一个Fc片段。这些方法描述于例如Goldenberg，美国专利4， 331, 647; Nisonoff等，Arch Biochem. Biophys. 89:230， 1960; Porter，生物 化学杂志（Biochem. J. )73:119， 1959; Edelman等，酶学方法（Methods in Enz，logy ) 1:422 (Academic出版社1967); 和Coligan第 2. 8. 1-2. 8. 10页和第2. 10. —2. 10. 4页。
还可以使用其它裂解抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻-重链 片段，片段的进一步裂解，或其它酶的、化学的或遗传的技术，只要这 些片段能与完整抗体所识別的抗原结合即可。
或者，抗体可以是通过使用重组DNA技术，包括对编码抗体可变和/ 或恒定区的DNA的操作和再表达，获得的重组或工程抗体。这些DNA是 已知的和/或可以容易地从DM文库包括例如噬菌体抗体文库获得（见 Chiswell， D J和McCafferty， J. Tibtech. 80-84 (1992))，或如 果需要，可以合成这些DNA。可以使用标准的分子生物学和/或化学方法 测序和操作该DNA，以便例如按需要引入密码子创造半胱氨酸残基、或修 改、添加或缺失其它氨基酸或结构域。
由此，可以制备一或多个含有该DNA的可复制表达载体，并用以转 化合适的细胞系，例如非产病毒性（non-producing)杂交瘤细胞系如小 鼠NS0系或细菌如大肠杆菌系，在其中进行抗体的生产。为了获得有效 转录和翻译，每个载体中的该DNA序列应该包括合适的调节序列，尤其 是可操作地与可变结构域序列连接的启动子和前导序列。用于通过此方 式生产抗体的具体方法一般是熟知的，并且是常规使用的。例如，由Maniatis等描述的基本分子生物学程序（分子克隆（Molecular Biology), Cold Spring Harbor Laboratoty,纽约，1989); DNA测序 可以按Sanger等的描述（PNAS ^， 5463， （1977))和Amersham International pic测序手册进行；而位点定向诱变可以根据Kramer等 (核酸研究12， 9441, ( 1984))的方法和Anglian生物技术有限公司手 册来进行。此外，还有许多出版物详细描述了适用于通过操作DNA、构建 表达载体和转化合适细胞来制备抗体的技术，例如由Mountain A和Adair, J R在生物技术和遗传工程综述（Biotechnology and Genetic Engineering Reviews) (Tombs, MP编，巡第1章，1992, Intercept, Andover,英国）中和国际专利说明书W091/09967中所评论的。
如果需要，根据本发明的抗体可以具有与之相连的一或多个效应或报 道分子，而且本发明扩展到这些修饰蛋白质。效应或报道分子可以通过 任何可利用的氨基酸側链、末端氨基酸或，如果存在的话位于抗体中的 糖功能基团，与抗体相连，当然总是假设这并不会对该分子的结合性质 和最终有效性产生不利影响。具体的功能基团包括例如任何游离的氨基、 亚氨基、巯基、鞋基、羧基或醛基。抗体与效应和/或报道分子的连接可 以通过这些基团和效应或报道分子中的合适功能基团来实现。该连接可 以是直接的或间接的，通过间隔基团或桥连基团实现。
效应分子包括例如抗肿瘤剂、毒素（例如细菌或植物来源的酶活性毒 素和其片段，如篦麻毒素和其片段）、生物学活性蛋白质例如酶、核酸和 其片段如DNA、 RNA和它们的片段、天然存在的和合成的聚合物如多糖和 聚烷撑聚合物（polyalkylene polymer)如聚（乙二醇）和其衍生物、 放射性核素尤其是放射性碘、和螯合金属。合适的报道基团包括螯合金 属、荧光化合物或可以通过NMR或ESR光谱学检测的化合物。
具体的抗肿瘤剂包括细胞毒性和细胞抑制试剂，例如烷化剂如氮芥 (nitrogen mustard )(如笨丁酸氮芥、美法仑、氮芥 (mechlorethamine)、环磷酰胺或乌拉莫司汀）和其衍生物、三亚乙基 磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、或顺铂；抗代谢物例如氨甲蝶 呤、氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、氟乙酸或氟柠檬酸；抗生素，例如博来霉素（如博来霉素>^酸盐）、阿霉素、 道诺红霉素、丝裂霉素（如丝裂霉素c)、放线菌素（如放线菌素D)、普
卡霉素、加利车霉素（calichaemicin)和其衍生物、或埃斯波霉素和其 衍生物；有丝分裂抑制剂例如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、长春新碱或长春 碱和它们的衍生物；生物碱，例如玫瑰树碱；多元醇例如taxicin-I或 taxicin-II;激素例如雄激素（如屈他雄酮或睾内脂）、孕酮（如醋酸甲 地孕酮或醋酸甲羟孕酮）、雌激素（二甲基己烯雌酚二磷酸酯 (dimethylstiblestrol diphosphate )、聚磷酸雌二醇或雌二醇氮芥裤 酸酯（estramustine phosphate))或抗雌激素（如三笨氧胺）；蒽疲例 如米托蒽醌；脲例如羟基脲；肼例如甲基千肼；或咪唑例如达卡巴漆。
尤其有用的效应基团是加利车霉素和其衍生物（见例如南非专利说明 书85/8794、 88/8127和90/2839)。
鏊合金属包括具有2-8 (包括2和8)配位数的正二价或三价（di-or tripositive)金属鏊合物。该金属的具体例子包括锝（Tc )、铼（Re )、 钴（Co)、铜（Cu)、金(Au)、银(Ag)、铅（Pb)、铋(Bi)、铟（In)、镓(Ga)、 钇(Y)、铽(Tb)、钆(Gd)和钪(Sc)。 一般地，该金属优选是放射性核素。 具体的放射性核素包括"-Tc、 186Re、 188Re、 58Co、 ^Co、 67Cu、 195Au、 199Au、 110Ag、 203Pb、 206Bi、 207Bi、 mIn、 67Ga、朋Ga、朋Y、 ，、 160Tb、 153Gd和47Sc。
该鏊合金属可以是例如被任何适合的多齿鍫合剂鐾合的上述金属类型 之一，这些鏊合剂例如无环或环状多胺、多醚（如冠醚和其衍生物）；聚 跣胺；p卜淋；和碳环衍生物(carbocyclic derivatives)。
一般地，鏊合剂的类型取决于所用金属。然而，在根据本发明的偶联 物中一组尤其有用的鏊合剂是无环多胺和环状多胺，特别是聚氨基羧酸 (polyaminocarboxylic acid)夯!l如二亚乙基三胺五乙酸和其衍生物，和 大环胺（macrocyclicamine)例如环状三氮杂（aza)和四氮杂衍生物（例 如国际专利说明书WO 92/22583中所描述的）；以及聚酰胺，特别是去铁 铵和其衍生物。
因此，例如当希望在抗体中使用巯基作为连接点时，这可以通过与存 在于效应或报道分子中的巯基反应性基团反应来实现。这些基团的例子包括4-卣羧酸或酯（4-halcarboxylic acid or ester)例如碘乙酰胺、 二酰亚胺例如顺丁烯二醜亚胺、乙歸砜、或二硫化物。这些和其它合适 的连接程序一般地和更为具体地描述于国际专利说明书WO 93/06231、 WO 92/22583、 WO 90/091195和WO 89/01476。
筛选增加骨密度的分子的方法
如上所讨论的，本发明提供用于筛选和/或分离能够增加骨密度的化 合物的方法。例如，在本发明的一个方面中，提供用于确定所选分子是 否能够增加骨矿质含量的方法，包括步骤：（a)将所选分子与TGF-P结合 蛋白和TGF-P蛋白质家族的一个选定成员混合，（b)测定该所选分子是否 刺激了通过TGF-P蛋白质家族进行的信号转导、或抑制了 TGF-P结合蛋 白与TGF-P蛋白质家族的结合。在某些实施方案中，该分子增强TGF-P 作为间充质细胞分化的正调节物起作用的能力。
在本发明的其它方面，提供用于确定所选分子是否能够增加骨矿质含 量的方法，包括步骤(a)将所选分子暴露于表达TGF-P结合蛋白的细胞， 和（b)测定所述暴露细胞的TGF-P结合蛋白的表达（或活性）是否降低， 并由此确定该化合物是否具有增加骨矿质含量的能力。在一个实施方案 中，该细胞选自从骨活组织检查获得的自发转化或未转化正常人骨和大 鼠顶骨的成骨细胞。该方法可以通过许多种试验形式来完成，包括例如 对流免疫电泳（CIEP)、放射免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测 定（ELISA)、斑点印迹试验、抑制或竟争试验、以及三明治试验（sandwich assays )(见美国专利4, 376, 110和4, 486， 530;也见抗体：实验室手册 (Antibodies: A Laboratory Manual), 同上)。
在以下的实施例5和6中提供了这些试验方法的代表性实施方案。 简单地说，首先将TGF-P超家族的家族成员或TGF-P结合蛋白与固相支 持物结合，随后加入候选分子。然后，向该测试试验中加入标记的TGF-P超家族的家族成员或TGF-P结合蛋白，洗涤固相支持物，并测定该固 体支持物上结合的或标记的TGF-P超家族成员或TGF-P结合蛋白的量。 本文所描述的适用于增加骨矿质含量的分子是那些以统计学上显著的方式降低TGF-P结合蛋白与TGF-P超家族的一个或多个成员结合的分子。 明显地，在本发明中适用的试验方法应不限于实施例2和3中所描述的 实施方案。尤其是，可以改变许多参数，例如通过TGF-P与固相支持物 的结合，或完全去除固相等方式来改变。
在本发明的其它方面，提供用于确定所选分子是否能够增加骨矿质含 量的方法，包括步骤：（a)将所选分子暴露于表达TGF-P的细胞，和（b) 测定所述暴露细胞的TGF-P活性是否发生改变，并由此确定该化合物是 否具有增加骨矿质含量的能力。与上述方法相同，可以利用多种方法来 评价由于所选测试化合物导致的TGF-P结合蛋白表达的改变。
例如，在本发明的一个方面，提供确定所选分子是否能够增加骨矿质 含量的方法，包括步骤：（a)将所选分子与TGF-P结合蛋白和TGF-P蛋 白质家族的一个选定成员混合，（b)测定该所选分子是否上调了 TGF-P蛋 白质家族的信号转导、或抑制了 TGF-P结合蛋白与TGF-P蛋白质家族的 结合。在某些实施方案中，该分子增强TGF- P作为间充质细胞 (mechemchymal cell)分化的正调节物起作用的能力。
与上述方法相同，可以利用许多种方法来评价由于所选测试化合物引 起的TGF-P刺激作用。以下实施例6中提供了一个这样的代表性方法（也 见Durham等，Endo. 136:1374-1380)。
在本发明的再其它方面，提供确定所选分子是否能增加骨矿质含量的 方法，包括步骤：测定所选分子是否抑制TGF-P结合蛋白与骨或其类似 物的结合。如本文中所用的，应当理解骨或其类似物是指羟基磷灰石、 多由粉状形式的骨、压碎的骨或完整的骨构成的表面。与上述方法相同， 可以利用许多种方法来评价对TGF-P结合蛋白定位到骨基质的抑制。以 下实施例7中提供了一个这样的代表性方法。
应当指出的是，尽管本文列举的这些方法可以指对单一测试分子的分 析，但本发明并不应由此受到限制。尤其是，所选分子可以包含在化合 物的混合物中。因此，所列举的方法可以进一步包含步骤：分离抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员结合的分子。候选分子
对许多种分子都可以测试其抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员 结合的能力。代表性例子包括有机分子、蛋白质或肽、和核酸分子，以 下将作更为详细的讨论。尽管从以下讨论来看，明显地本文所述候选分 子可以用于本文所述的测定，但也应易于明了这些分子还可以用于各种 诊断和治疗应用。
1.有机分子
对于许多有机分子都可以测定其抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族 成员结合的能力。
例如，在本发明的一个实施方案中，合适的有机分子选自化学制品库 (chemical library),其中对化学制品作单独测定，或选自组合化学制
品库，其中对多个化合物同时进行测定，然后展开以确定和分离具有最 高活性的化合物。
这些组合化学制品库的典型例子包括由如下文献描述的组合化学制品 库：Agrafiotis等，"自动产生具有期望性质的化学化合物的系统和方法
(System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties)，，, 美国专利5， 463, 564; Armstrong, R. W.,
"通过应用多成分组合阵列合成法合成有机化合物组合阵列（Synthesis of combirmtorial arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses) ，，, TO 95/02566; Baldwin, J. J.等，"磺胺衍生物和其应用"，W0 95/24186; Baldwin, J. J. 等,"且合二氬笨并畎喃库 （combinatorial dihydrobenzopyran library)", W0 95/30642; Brenner, S.，"用于制备组合库的新试剂盒"， W0 95/16918; Chenera， B.等，"树脂结合的芳香族碳环化合物的文库制 备"，W0 95/16712; Ellman, J. A.,"在固体支持物上固相和组合合成苯
(并）二氮革类化合物库"，美国专利5,288,514; Felder, E.等，"新 组合化合物文库"，WO 95/16209; Lerner, R.等，"编码的组合化学文库"， W0 93/20242; Pavia， M. R.等，"从结构上各异的通用文库制备和筛选药 物学上有用的非肽化合物的一种方法"，W0 95/04277; Summerton， J. E.和D.D. Weller，"吗啉代-亚基组合文库和方法"，美国专利5，506，337; Holmes， C.,"用于固相合成thiazolidinones、 matathiazanones和它们的 衍生物的方法"，WO 96/00148; Phillips, GB.和GP. Wei,"固相合成苯 并咪唑"，Tet. Letters 37:4887-卯，1996; Ruhland， B.等，"结构各异的P 内酰胺的固体支持组合合成"，美国化学学会杂志（J. Amer. Chem. Soc.) 111:253-4， 1996; Look, GC.等，"从4-噢唑烷组合文库中鉴定环加氧酶-l 的抑制物"，Bioorg and Med. Chem, Letters 6:707-12， 1996。
2.蛋白质和肽
广泛的蛋白质和肽同样可以用作TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成 员结合的抑制物候选分子。
a. 组合肽文库
可以通过组合肽文库的筛选获得可能是TGF- P结合蛋白与TGF- P 家族成员结合的抑制物的肽分子。这些文库可以由本领域技术人员制备 (见例如美国专利4，528，266和4,359,535以及专利合作条约公开文本 WO 92/15679、 WO 92/15677、 WO 90/07862、 WO 90/02809)或从商业 途径购买（例如New England Biolabs Ph.D.TM噬菌体展示肽文库试剂 盒）。
b. 抗体
考虑到本文提供的此公开，可以容易地制备抑制TGF- P结合蛋白与 TGF-P家族成员结合的抗体。在本发明范围内，抗体被理解为包括单克 隆抗体、多克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段（例如Fab和F(ab，)2、 Fv可变区、或互补决定区）。正如以上所讨论的，如果抗体以大于或等 于107 M_1，优选大于或等于108 的Ka与TGF- P结合蛋白或特定的 TGF-P家族成员结合，而不与或以小于或等于106 M-1的Ka与其它的 TGF-P结合蛋白结合，则该抗体被理解为是特异针对TGF-P结合蛋白 或特定的TGF- P家族成员的。而且，本发明的抗体应当阻断或抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员的结合。
本领域普通技术人员可以容易地确定单克隆抗体或结合伴倡
53(partner)的亲和力，以及结合的抑制（见Scatchard， Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949)。
简单地说，本领域普通技术人员可以容易地从各种恒温动物例如马、 奶牛、各种家禽、兔、小鼠或大鼠产生多克隆抗体。典型地，使用TGF-P结合蛋白或其13-20个氨基酸的独特肽（优选通过使用戊二醛形成的 交联与匙孔血蓝蛋白偶联），联合佐剂例如Freund完全或不完全佐剂一 起，通过腹膜内、肌肉内、眼内、或皮下注射免疫动物。几次加强免疫 后，收集血清样品并检测其对所述蛋白质或肽的反应性。尤其优选的多 克隆抗血清将在一个这些试验中给出至少高于背景三倍的信号。依据动 物对蛋白质的反应性， 一旦动物的效价达到平台，则通过每周给动物放 血或抽血可以容易地获得更大量的抗血清。
单克隆抗体还可以容易地采用常规技术产生（见以参考文献方式并入 本文的美国专利RE 32， 011、 4,902,614、 4， 543， 439和4， 411， 993;也 见单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析中的一个方面（Monoclonal Antibodies, Hybrido迈as: A New Dimension in Biological Analyses), Plenum出版社，Kennett, McKearn和Bechtol(编），1980; 和抗体：实验室手册（Antibodies: A Laboratoty Manual), Harlow和 Lane(编），Cold Spring Harbor Laboratory出版，1988，该文献也以 参考文献方式并入本文）。
简单地说，在一个实施方案中，按以上描述，用TGF-P结合蛋白或 其部分免疫受试动物例如大鼠或小鼠。为了增强最终所获的免疫应答， 可以将该蛋白与佐剂例如Freund完全或不完全佐剂混合。在最初免疫后 的一至三周之间，可以再用一次加强免疫对动物进行再免疫，并使用以 上描述的试验检测其对蛋白质的反应性。 一旦动物对注射蛋白质的反应 性达到平台，即可将其处死，并收获含有大量B细胞的器官例如脾和淋 巴结。
从被免疫动物获得的细胞可以通过病毒例如埃-巴二氏病毒（EBV)感 染而永生化（见Glasky和Reading,杂交瘤（Hybridoma) 8(4) :377-389, 1989)。或者，在一个优选的实施方案中，为了产生分泌单克隆抗体的"杂
54交瘤"，将收获的脾和/或淋巴结细胞悬浮物与合适的骨髓瘤细胞融合。
合适的骨髓瘤系包括例如NS-1 ( ATCC TIB 18)和P3X63- Ag 8. 653 ( ATCC CRL 1580)。
在融合后，可以将细胞置于含有合适培养基例如RPMI 1640或DMEM (Dulbecoo氏修改的 Eagles培养基)(JRH Biosciences, Lenexa， Kansas)以及添加成分例如胎牛血清（即FBS,来自Hyclone， Logan, Utah, 或JRH Biosciences)的培养板中。此外，该培养基应含有选择性地允许 脾和骨髓瘤融合细胞生长的试剂例如HAT (次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷） (Sigma Chemical公司,St. Louis, Missouri )。在大约7天后，可以 对所获的融合细胞或杂交瘤进行筛选，以确定抗TGF-P结合蛋白（取决 于所用抗原），并阻断或抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员结合的 抗体的存在。
有许多种试验可以用以确定抗本发明蛋白质的抗体的存在，包括例如 对流免疫电泳、放射免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、斑点印迹试验、Western印迹、免疫沉淀、抑制或竟争试验、 以及三明治试验（见例如美国专利4, 376,110和4, 486， 530;也见抗体： 实验室手册(Antibodies: A Laboratory Manual )， Harlow和Lane (编)， Cold Spring Harbor Laboratory出版，1988)。几次克隆稀释和再次试 验之后，可以分离产生抗目的蛋白质抗体的杂交瘤。
也可以使用其它技术构建单克隆抗体（见William D. Huse等，"在 入噬菌体中产生具有免疫球蛋白谱的大型組合文库"，科学（Science) 246:1275-1281， 1989年12月；也见L. Sastry等，"在大肠杆菌中克 隆免疫球蛋白的所有组成成分以产生单克隆催化抗体：重链可变区特异 性cDNA文库的构建"，美国国家科学院院刊86:5728-5732, 1989年8 月；还见Michelle Alting-Mees等，"单克隆表达文库：杂交瘤的一种 快速替代法55,分子生物学策略（Strategies in Molecular Biology) 3:1-9,1990年1月）。这些文献描述了可从Stratagene (La Jolla, California)获得的一个商业系统，该商业系统能够通过重组技术产生抗 体。简单地说，从B细胞群体分离mRNA,用以在入I咖unoZap(H)和入I,unoZ邻（L)载体中构建重链和轻链免疫球蛋白cDNA表达文库。这些载 体可以单独进行筛选，也可以共表达以形成Fab片段或抗体（见Huse等， 同上；也见Sastry等，同上）。随后可以将阳性噬菌斑转变成允许从大 肠杆菌高水平表达单克隆片段的非裂解性质粒。
同样，也可以采用常规酶消化，或重组DNA技术以插入编码特异结合 抗体的基因的可变区，构建抗体的部分或片段例如Fab和Fv片段。在一 个实施方案中，使用针对可变区的核苦酸引物从产生目的单克隆抗体的 杂交瘤扩增编码可变区的基因。这些引物可以由本领域普通技术人员合 成，或可以从商业途径购买。Stratagene (La Jo 11 a， California)出售 针对小鼠和人可变区的引物，包括尤其是针对V他、Vft、 V比、Vw、 Ch!、、 和Cl区的引物。可以使用这些引物扩增重链或轻链可变区，然后可以将 其分别插入载体例如ImmunoZAP™ H或ImmunoZAP™ L (Stratagene)。之 后这些栽体可以被导入基于大肠杆菌、酵母或哺乳动物的系统中进行表 达。使用这些技术，可以产生大量含有融合的VH和VL域的单链蛋白质（见 Bird等，科学242:423-426， 1988)。此外，可以使用这些技术在不改 变抗体结合特异性的情况下，将"鼠"抗体改变成"人"抗体。
一旦获得合适的抗体，即可以通过本领域普通技术人员熟知的许多技 术对其进行分离或纯化（见抗体：实验室手册，Harlow和Lane (编），Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1988)。合适的技术包括狀或蛋白 质亲和柱、HPLC或RP-HPLC、在A蛋白或G蛋白柱上纯化、或任何这些 技术的组合。
c. 突变的TGF-P结合蛋白
正如本文和如下实施例（例如实施例8和9)中所描述的，与天然TGF-P结合蛋白阻断特定TGF-P家族成员活性的能力竟争的TGF-P结合蛋白 修改版本应该会导致骨密度的增加。因此，结合TGF-P家族成员但不抑 制该TGF-P家族成员功能的TGF-P结合蛋白突变体将符合此标准。该突 变版本必须有效地与TGF-P结合蛋白的内源性抑制功能相竟争。
d. 蛋白质的产生
尽管本文已提供了各种基因（或其部分），但应该理解，在本发明的范围内，对一或多个这些基因的提及包括与这些基因基本相同的这些基 因的衍生物（以及，如果合适的话，包括由这些基因和它们的衍生物编
码的蛋白质（包括肽和多肽）)。正如本文所用的，如果（a)—个核苷^
序列的等位基因变异，或者编码抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员 结合的分子，（b)核苷酸序列能够与本发明的核苷酸序列在中、高或极高 的严紧条件下杂交（见Sambrook等，分子克隆：实验室手册（Molecular Cloning: A Laboratory Mannual ), 第 2版,Cold Spring Harbor Laboratory出版社，纽约，1989)，或（c)由于遗传密码子的原因，DNA 序列与（a)或（b)中所定义的DNA序列是简并的，则该核苷酸序列被认为 是"基本相同的"。而且，本文公开的核酸分子包括互补和非互补序列， 前提是该序列在其它方面符合本文提出的标准。在本发明的范围内，高 严紧性是指标准杂交条件（例如，5xSSPE， 0.5%SDS, 或相当的 条件)。-
使用例如P/C Gene或Intelligenetics软件包（Intelligenetics， Mountain View, California)的疏水性绘图功能，或根据Kyte和 Doolittle (分子生物学杂志（J. Mol. Biol.) 157:105-132， 1982)描 述的方法，本文所述核酸分子编码的蛋白质的结构可以从一级翻译产物 预测。
本发明蛋白质可以以酸式盐或碱式盐的形式，或以中性形式制备。此 外，单个氨基酸残基可以通过氧化或还原进行修饰。而且，可以在氨基 酸和核酸序列上进行各种替代、缺失或添加，其净效应是保持或进一步 增强或降低突变或野生型蛋白的生物学活性。而且，例如由于遗传密码 子的筒并性，在编码相同氨基酸序列的核苷酸序列中，可以有相当多的 变异。
本文公开的蛋白质的其它衍生物包括该蛋白质与其它蛋白质或多肽的 结合物。这可以通过例如合成其加入可能有利于蛋白质纯化或鉴定的N-端或C-端融合蛋白来实现（见美国专利4,851,341;也见Hopp等， Bio/Technology 6:1204, 1988)。或者，可以构建诸如Flag/TGF-p结合蛋白的融合蛋白，以有助于该蛋白质的筌定、表达和分析。
本发明蛋白质可以采用本文所述的多种技术构建。而且，可以通过合 成含有突变序列的寡核苷酸在特定位置引入突变，而且该寡核苷酸的两 侧具有限制性位点，使得其能够与该天然序列片段连接。连接之后，所 获的重组序列编码具有期望的氨基酸插入、替换或缺失的衍生物。
或者，可以使用寡核苷酸指导的位点特异性（或片段特异性）诱变程 序，提供根据要求的替换、缺失或插入改变了特定密码子的改变基因。
进行如上所述改变的示例性方法公开于Walder等（基因42:133， 1986); Bauer等（基因37:73, 1985); Craik ( BioTechniques， 1985年1月， 12-19); Smith等（遗传工程：原理和方法（Genetic Engineering: Principles and Methods), Plenum出版社，1981);和Sambrook等（同 上）。还可以通过使用与所期望缺失相邻的方便限制性内切核酸酶位点， 构建缺失或截短的蛋白质衍生物（例如可溶性细胞外部分）。在限制性消 化后，可以补平突出端、然后重新连接该DNA。进行如上所述改变的典型 方法公开于Sambrook等（分子克隆：实验室指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1989)。
在本发明核酸分子中产生的突变优选保持编码序列的阅读框。而且这 些突变优选不形成能够杂交产生mRNA 二级结构例如环或发夹结构的互补 区，这些二级结构将对mRNA的翻译产生不利影响。尽管可以预先决定突 变位点，但并不必预先决定突变本身的性质。例如，为了筛选在指定位 点具有最佳特性的突变，可以在靶密码子处进行随机诱变，然后筛选具 有指明生物学活性的表达突变体。或者，可以通过合成如下寡核苷酸在 特定位置引入突变，该寡核苷酸含有突变序列，而且两翼具有使其能够 与该天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所获的重组序列编码 具有期望的氨基酸插入、替换或缺失的衍生物。
也可以采用PCR诱变技术、化学诱变技术（Drinkwater和Klinedinst, PNAS 83:3402-3406， 1986)、强制核苷酸4fi吴掺入（forced nucleotide misincorportation)(例如Liao和Wise基因88:107-111, 1990)、或 使用随机诱变处理的寡核苷酸（Horwitz等，基因組（Genome) 3:112-117，1989)来构建编码本发明蛋白质的核酸分子。
本发明还提供通过培养含有能表达上述基因的载体的宿主细胞对上述 基因进行的操作和表达。这些载体或载体结构包括合成的或cDNA来源的， 可操作地与合适的转录或翻译调节元件连接的，编码目的蛋白质的核酸 分子。合适的调节元件可以从各种来源获得，包括细菌、真菌、病毒、 哺乳动物、昆虫或植物基因。适合调节元件的选择取决于所选择的宿主 细胞，而且可以容易地由本领域普通技术人员完成。调节元件的例子包 括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、转录终止子、以及核 糖体结合序列，包括翻译起始信号。
编码上述任一种蛋白质的核酸分子可以容易地由许多种原核和真核宿 主细胞表达，这些宿主细胞包括细菌、哺乳动物、酵母或其它真菌、病 毒、昆虫、或植物细胞。转化或转染这些细胞以表达外源DNA的方法是 本领域所熟知的（见例如Itakura等，美国专利4， 704， 362; Hinnen等， 美国国家科学院院刊 75:1929-1933, 1978; Murray等，美国专利 4,801,542; Upshall等，美国专利4,935,349; Hagen等，美国专利 4,784,950; Axel等，美国专利4,399,216; Goeddel等，美国专利 4， 766， 075;和Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1989;对于植物细胞，见Czako和Marton, 植物生理学（Plant Physiol. ) 104:1067-1071， 1994;和Paszkowski 等，生物技术（Biotech. ) 24:387-392, 1992)。
适于实施本发明的细菌宿主细胞包括大肠杆菌（E. coli)、枯草芽 孢杆菌（B. subtilis)，鼠伤寒沙门氏杆菌（Salmonella typhimuriu迈）， 和假单胞菌属(Pseudomonas)、 链霉菌属(str印tomyces)和葡萄球菌属 (staphylococcus)的各个种，以及本领域普通技术人员熟知的许多其它 细菌种。细菌宿主细胞的代表性例子包括DH5a (Stratagene, Lajolla, California^
细菌表达载体优选含有在宿主细胞中起作用的启动子、 一或多个表型 选择标记、以及细菌复制原点。典型的启动子包括p-内酰胺酶（青霉素 酶）和乳糖启动子系统（见Chang等，自然275:615， 1978)、 T7 RNA聚合酶启动子（Studier等，酶学方法（Meth. Enzymol. ) 185:60-89, 1990)、 入启动子（Elvin等，基因87:123-126, 1990)、 trp启动子(Nichols 和Yanofsky，酶学方法101:155, 1983)和tac启动子（Russell等， 基因20:231， 1982)。典型的选择标记包括各种抗生素抗性标记例如卡那 霉素或氨苄青霉素抗性基因。适用于转化宿主细胞的许多质粒是本领域 所熟知的，包括尤其是pBR322 (见Bolivar等，基因2:95， 1977)， pUC 质粒pUC18、 pUC19、 pUC118、 pUC119(见Messing,酶学方法101:20-77， 1983;和Vieira和Messing,基因19:259-268, 1982 )，和pNH8A、 pNH16a、 p腿8a, 以及Bluescript M13(Stratagene， La Jolla， California)。
适用于实施本发明的酵母和真菌宿主细胞包括尤其是Saccharomyces pombe、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、 毕赤酵母属(Pichia) 或克鲁维酵母菌属（kluyveromyces )、以及曲霉属（Aspergillus)的各 个种（McKnight等，美国专利4,935， 349)。对于酵母和真菌而言，适合 的表达载体包括尤其是用于酵母的YCp50 (ATCC 37419)、和amdS克隆 载体pV3 (Turnbull， Bio/Technology 7:169， 1989)、 YRp7 (Struhl 等，美国国家科学院院刊76:1035-1039， 1978)、 YEpl3 (Broach等， 基因8:121-133， 1979)、 pJDB249和pJDB219 ( Beggs，自然275:104— 108, 1978)，以及它们的衍生物。
用于酵母的优选启动子包括来自酵母糖酵解基因（Hitzeman等，生 物化学杂志（J. Biol. Chem. ) 255:12073-12080， 1980; Alber和 Kawasaki,分子应用遗传学杂志（J. Mol. Appl. Genet.) 1:419-434, 1982)或醇脱氢酶基因（Young等，用于产生化学制品的微生物遗传工程 (Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals X Hollaender 等（编），第355页，Plenum,纽约，1982; Ammerer,酶学方法（Meth. Enzymol. ) 101:192-201， 1983)的启动子。对于真菌载体有用的启动子 的例子包括那些来源于构巢曲霉（Aspergillus nidulans )糖酵解基因 的启动子，例如adh3启动子（McKnight等，EMB0J. 4:2093-2099， 1985)。 该表达单元还可以包括转录终止子。适合的终止子的一个例子是adh3终 止子（McKnight等，同上，1985)。如同细菌载体一样，酵母载体一般也包括选择标记，其可以是表现显 性表型的许多基因中的任意一种，条件是对于该显性表型存在一种能够 筛选转化体的表型试验。优选的选择标记是那些补充宿主细胞的营养缺
陷、提供抗生素抗性或使细胞能够利用特殊碳源的选择标记，包括leu2 (Broach等，同上）、ura3( Botstein等，基因8:17， 1979 )或his3( Struhl 等，同上)。另一个适合的选择标记是赋予酵母细胞氯霉素抗性的cat基因。
用于转化真菌的技术在文献中有很好的说明，见例如Beggs (同上）、 Hinnen等（美国国家科学院院刊75:1929-1933， 1978)、 Yelton等（美 国国家科学院院刊81:1740-1747， 1984)和Russell(自然301:167-169, 1983)。宿主细胞的基因型可以含有由表达载体上存在的选择标记弥补的 遗传缺陷。对于具体宿主和选择标记的选择是本领域熟知的。
转化酵母的方法也是本领域普通技术人员所熟知的。例如，通过制备 带有DNA的酵母原生质球（见Hinnen等，美国PNAS 75:1929， 1978) 或通过用碱式盐（alkaline salts)例如LiCl处理（见Itoh等，细菌 学杂志（J. Bacteriology) 153:163， 1983)，可以容易地实现转化。真 菌转化还可以采用聚乙二醇按Cullen等描述的方法（Bio/Technology 5:369, 1987)进行。
病毒载体包括那些含有指导编码上述目的蛋白质的分离核酸分子表达 的启动子的病毒载体。在本发明的范围中可以使用许多种启动子，包括 例如诸如MoMLV LTR、 RSV LTR、 Friend MuLV LTR的启动子、腺病毒启 动子（0hno等，科学265:781-784， 1994)、新霉素磷酸转移酶启动子/ 增强子、细小病毒晚期启动子（Koering等，人类基因治疗（Hum. Gene Ther邻.）5:457-463， 1994)、疱* TK启动子、SV40启动子、金属硫蛋 白IIa基因增强子/启动子、巨细胞病毒的立即早期启动子、和巨细胞病 毒的立即晚期启动子。在本发明尤其优选的实施方案中，该启动子是组 织特异性启动子（见例如W0 91/02805; EP 0,415， 731;和W0 90/07936 )。 适合的组织特异性启动子的代表性例子包括神经特异性烯醇化酶启动 子、血小板来源的生长因子p的启动子、骨形态发生蛋白质启动子、人al-chimaerin启动子、突触蛋白I启动子和突触蛋白II启动子。除了 上述启动子外，为了靶向病毒、细菌、真菌或寄生物感染的特定细胞或 组织，还可以使用其它的病毒特异性启动子（例如逆转录病毒启动子， 包括以上提到的逆转录病毒启动子以及其它启动子如HSV启动子），肝炎、 疱渗（例如EBV)、和细菌、真菌或寄生物（例如疟疾）的特异性启动子。
适用于实施本发明的哺乳动物细胞包括尤其是COS、 CHO、 SaOS、骨 肉瘤细胞、KS483、 MG-63、原始成骨细胞、和人或哺乳动物的骨髓基质。 用于实施本发明的哺乳动物表达载体包括能够指导克隆基因或cDNA转录 的启动子。优选的启动子包括病毒启动子和细胞启动子。骨特异性启动 子包括骨唾液酸蛋白（sialo-protein)和骨钙蛋白启动子。病毒启动子 包括巨细胞病毒立即早期启动子（Boshart等，细胞（Cell) 41:521-530, 1985)、巨细胞病毒立即晚期启动子、SV40启动子（Subramani等，分子 细胞生物学（Mol. Cell Biol. ) 1:854-864， 1981)、匿V LTR、 RSV LTR、 金属硫蛋白-1、腺病毒Ela。细胞启动子包括小鼠金属硫蛋白-1启动子 (Palmiter等，美国专利4， 579， 821 )、小鼠VK启动子（Bergman等，美 国国家科学院院刊81:7041-7045， 1983; Grant等，核酸研究15:5496， 1987)和小鼠^启动子（Loh等，细胞33:85-93, 1983)。启动子的选 择至少部分地取决于所期望的表达水平或待转染的受体细胞系。
这些表达栽体还可以含有一套位于启动子下游以及编码目的肽或蛋白 质的DNA序列上游的RNA拼接位点。优选的RNA拼接位点可以>^病毒 和/或免疫球蛋白基因获得。在该表达载体中还含有位于目的编码序列下 游的fJ泉苷酸化信号。适合的fJ^苷酸化信号包括SV40的早期或晚期聚 腺苷酸化信号（Kaufman和Sharp,同上）、腺病毒5 E1B区的^J泉苷酸 化信号和人生长激素基因终止子（DeNoto等，核酸研究9:3719-3730, 1981)。该表达载体可以包括位于启动子和RNA拼接位点之间的非编码病 毒前导序列，例如腺病毒2的三联前导序列。优选的载体还可以包括增强 子序列例如SV40增强子。表达载体还可以包括编码腺病毒VA RNAs的序 列。适合的表达载体可以从商业途径获得（例如Stratagene， La Jo 1 la, CaliforniaX含有克隆DNA的载体结构可以通过例如磷酸^5介导的转染（Wigler 等，细胞14:725, 1978; Corsaro和Pearson,体细胞遗传学（Somatic Cell Genetics) 7:603， 1981; Graham和Van der Eb,病毒学（Virology) 52:456, 1973)、电穿孔（Neumann等，EMBO J. 1:841-845， 1982)或 DEAE-葡聚糖介导的转染（Ausubel等（编）当代分子生物学实验指南 (Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons公 司，纽约，1987)导入培养的哺乳动物细胞中。为了鉴定稳定整合了克隆 DNA的细胞， 一般将选择标记与目的基因或cDNA —起导入细胞。用于哺 乳动物培养细胞的优选选择标记包括赋予药物例如新霉素、潮霉素和氨 甲蝶呤抗性的基因。该选择标记可以是可扩增的选择标记。优选的可扩 增选择标记是DHFR基因和新霉素抗性基因。选择标记的综述见Thilly (哺 乳动物细胞技术(Mammalian Cell Technology), Butterworth Publishers, Stoneham， Massachusetts, 该文献以参考文献形式并入本 文)。
在开始表达目的DNA序列之前，使含有适合载体的哺乳动物细胞生 长一段时间，典型地是1-2天。然后应用药物筛选选择以稳定方式表达 选择标记的细胞的生长。对于可扩增选择标记转染的细胞，可以逐步增 加药物浓度以选择增加的克隆序列拷贝数，由此选择增加的表达水平。 选择和筛选以期望形式或以期望水平产生目的蛋白质的表达导入序列的 细胞。然后可以克隆满足这些标准的细胞，并按比例放大用于生产。
用于转染哺乳动物细胞的操作是本领域普通技术人员所熟知的。典型 的方法包括磷酸钓介导的转染、电穿孔、脂转染、逆转录病毒、腺病毒 和原生质体融合介导的转染（见Sambrook等，同上）。棵载体结构也可 以在注射至哺乳动物（或其它动物）的肌肉中后被肌细胞或其它适合的 细胞摄取。
根据本说明书，本领域已知的许多昆虫宿主细胞也可以用于本发明。 例如，Atkinson等（Pestic. Sci. 28:215-224, 1990)综述了杆状病 毒作为在昆虫细胞中表达外源DNA序列的载体的应用。
根据本说明书，本领域已知的许多植物宿主细胞也可以用于本发明。例如Sinkar等（J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58， 1987)综述了毛 根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes )作为在植物细胞中表达基因的 栽体的应用。1
在本发明的相关方面，可以在其生殖细胞和体细胞含有编码目的蛋白 质的基因，而且该基因可操作地与对于该基因表达有效的启动子相连的 转基因动物中，表达本发明的蛋白质。或者，以类似的方式，可以制备 缺乏目的基因的转基因动物（例如，"基因敲除"小鼠）。可以在各种非 人类动物，包括小鼠、大鼠、兔、绵羊、狗、山羊和猪中制备这样的转 基因动物（见Hammer等，自然315:680-683， 1985; Palmiter等，科学 222:809-814, 1983; Brinster等，美国国家科学院院刊82:4438-4442， 1985; Palmiter和Brinster,细胞41:343-345， 1985，和美国专利 5,175,383、 5,087,571、 4,736,866、 5,387,742、 5,347,075、 5,221,778 和5,175,384)。简单地说，通过例如微注射，将包括待表达的核酸分子 以及适合定位的表达控制序列的表达载体导入受精卵的原核中。注射DM 的整合通过组织样品DNA的印迹分析来检测。优选将导入的DNA并入动 物的生殖系中，以便其可以被传递给该动物的后代。组织特异性表达可 以通过使用组织特异性启动子，或通过使用允许转基因有调节地表达的 诱导型启动子例如金属硫蛋白基因启动子（Palmiter等4 1983，同上）来 实现。
可以通过尤其是培养适合的宿主和载体系统产生本发明重组翻译产 物，分离蛋白质。为了分离目的蛋白质，然后可以通过各种纯化程序， 处理该细胞系的上清液,或者当蛋白质不分泌到上清液中时处理蛋白质 包涵体或整个细胞。例如，首先可以采用商业上可获得的蛋白质浓缩滤 器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，浓缩上清液。浓缩之 后，可以将浓缩物加到适合的纯化基质例如与适合支持物结合的抗蛋白 质抗体上。或者，可以使用阴离子或阳离子交换树脂来纯化蛋白质。作 为再一种替代方法，可以使用一或多个反相高效液相色谱层析（RP-HPLC) 步骤来进一步纯化该蛋白质。分离本发明蛋白质的其它方法是本领域技 术人员所熟知的。如果根据SDS-PAGE分析以及之后的考马斯亮兰染色，未检测到其它 (非目的）蛋白质，则在本发明的范围中该蛋白质被认为是"分离的"。 在其它实施方案中，该目的蛋白质可以是分离的，以致根据SDS-PAGE分 析以及之后的银染检测不到其它（非目的）蛋白质。
3.核酸分子
在本发明的其它方面，提供能够抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族 成员结合的核酸分子。例如，在一个实施方案中，提供特异抑制TGF-P 结合蛋白核酸序列表达的反义寡核苷酸分子（ 一般见，Hirashima等，RNA 的分子生物学：新的前景（Molecular Biology of RNA: New Perspectives) ( M. Inouye和B. S. Dudock编，1987， Academic 出版 社，San Diego，第401页）；寡核苷酸：基因表达的反义抑制物 (Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression) (J. S. Cohen编，1989， MacMillan出版社，伦敦）；Stein和Cheng,科学 261:1004-1012， 1993; W0 95/10607;美国专利5， 359， 051; W0 92/06693; 和EP-A2-612844)。简单地说，构建这些分子以《吏它们与转录的TGF-P 结合蛋白mRNA序列的一个区域互补，并能够形成Watson-Crick威基配 对。所导致的双链核酸将干扰该mRNA的随后加工，由此阻止蛋白质的合 成（见实施例IO)。
在本发明的其它方面，提供能够抑制TGF-P结合蛋白结合TGF-P家 族成员的核酶。本文所用的"核酶"旨在包括含有用于特异识别的反义 序列和RNA切割酶活性的RNA分子。该催化链可以以高于化学计量的浓 度切割靶RNA中的特异位点。许多种核酶可以用于本发明范围中，包括 例如锤头核酶（如描绘于Forster和Symons,细胞48:211-220， 1987; Haseloff和Gerlach，自然328:596-600， 1988; Walbot和Bruening， 自然334:196， 1988; Haseloff和Gerlach,自然334:585， 1988);发 夹核酶（例如描迷于Haseloff等，1993年10月19曰公布的美国专利 5,254,678;以及Hempel等，1990年3月26日出版的欧洲专利公开文 本0 360 257);以及基于四膜虫（Tetrahymena)核糖体RNA的核酶（见Cech等，美国专利4,987,071)。本发明核酶典型地由RNA构成，但也可 以由DNA、核酸类似物（例如硫代磷酸酯）或它们的嵌合物（例如 DNA/RNA/RNA)构威。
4. 标记(l咖ls)
上文和下文中描述的基因产物和所有的候选分子均可以用各种化合物 标记，这些化合物包括例如荧光分子、毒素和放射性核素。荧光分子的 典型例子包括荧光素、藻胆色素蛋白例如藻红蛋白、罗丹明、得克萨斯 红和荧光素酶。毒素的典型例子包括蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、白喉毒 素、霍乱毒素、gelonin、美洲商陆抗病毒蛋白、tritin、志贺菌毒素和 假单胞菌外毒素A。放射性核素的典型例子包括Cu-64、 Ga-67、 Ga-68、 Zr-89、 Ru—97、 Tc-99m、 Rh-105、 Pd—109、 In—111、 1—123、 1—125、 I— 131、 Re—186、 Re—188、 Au—198、 Au—199、 Pb—203、 At—211、 Pb-212和 Bi-212。此外，上述抗体也可以与配体结合对的一个配偶体标记或结合。 代表性例子包括抗生物素蛋白-生物素和核黄素-核黄素结合蛋白。
用以上提及的代表性标记结合或标记本文所述分子的方法可以容易地 由本领域普通技术人员完成（见单端孢菌毒素抗体偶联物，美国专利 4， 744， 981;抗体偶联物，美国专利5,106,951;焚光物质和标记技术， 美国专利4,018,884;用于诊断和治疗的金属放射性核素标记的蛋白质， 美国专利4,897,255;和用于改良鏊合动力学的金属放射性核素鏊合的化 合物，美国专利4,988,496;也见Inman，酶学方法（Methods in Enzymology)第34巻，亲和技术，酶纯化：B部分，Jakoby和Wilchek (编），Academic出版社，纽约，第30页，1974;也见Wilchek和Bayer, "生物分析应用中的抗生物素蛋白-生物素复合物"，分析生物化学（Anal. Biochem. ) 171:1-32， 1988)。
药物组合物
如上所述，本发明还提供各种药物组合物，其含有一个抑制TGF-P 结合蛋白结合TGF-P家族成员的上述分子，以及药物学上或生理上可接
66受的载体、赋形剂或稀释剂。 一般地，此载体在使用剂量和浓度时对于 受体是无毒性的。通常，这些组合物的制备需要该治疗剂与如下物质合
并：緩冲液、抗氧化剂例如抗坏血酸、低分子量（少于约10个残基）多 肽、蛋白质、氨基酸、糖&括葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、鏊合剂例如EDTA、 谷胱甘肽、及其它稳定剂和赋形剂。中性緩冲盐或与非特异性血清白蛋 白混合的盐是典型的适合稀释剂。
此外，可以制备用于各种不同途径给药的本发明药物组合物。而且， 可以将本发明药物组合物和提供该药物组合物使用说明的包装材料一起 置于容器中。 一般地，该说明包括一个描述该药剂浓度的明确表述，以 及'在某些实施方案中，还包括对重新构成该药物组合物可能是必须的赋 形剂成分或稀释剂（例如水、盐或PBS)的相对量的描述。
治疗方法
本发明还提供增加骨矿质含量和矿质密度的方法。简单地说，有许多 病症会导致骨矿质含量的降低，包括例如疾病、遗传诱因、导致骨使用 缺乏（例如由于骨折）的事故、导致骨吸收或杀死骨形成细胞的治疗、 以及正常老化。通过使用抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员结合的 本文所述分子，可以治疗或预防这些病症。如本文所使用的，应当理解， 如果在选定位置骨矿质含量以统计学显著的方式（例如超过一倍半的标 准差）获得增加，则骨矿质含量增加了 。
导致骨矿质含量降低的多种病症均可以使用本文所述分子治疗。患有 这些病症的患者可以通过使用熟知技术（见例如Harrison氏内科医学原 理(Harrison's Principles of Internal Medicine), McGraw-Hill公 司）进行临床诊断来识别。可以治疗的疾病的代表性例子包括其中存在 骨的不正常生长或发育的发育异常。这些病症的代表性例子包括软骨发 育不全、锁骨颅骨发育不良、内生软骨瘤病、纤维性结构不良、戈谢病、 低磷狗偻病、Marfan病、遗传性多发性外生骨疣（multiple hereditary exotoses)、多发性神经纤维瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化、 硬化损害（sclerotic lesions)、骨折、牙周病、假关节和生脓性骨髓炎(Pyogenic oseomyelitis)。
其它可以治疗或预防的病症包括许多引起骨质减少（即，造成骨矿质 含量或密度比青年时期的峰值骨骼矿质含量低一个以上标准差的病症） 的原因。这些病症的代表性例子包括贫血状态、类固醇引起的疾病、肝 素造成的疾病、骨髓疾病、坏血病、营养不良、钙缺乏症、特发性骨质 疏松症、先天性骨质减少或骨质疏松症、醇中毒、慢性肝疾病、衰老、 绝经后状态、月经稀发、闭经、妊娠、糖尿病、甲状腺功能亢进、库欣 病、肢端月巴大症、'逸腺功能减退症、不活动或废用（immobilization and disuse )、反射交感性营养不良综合征、短暂性区域骨质疏松和骨软化。
在本发明的一个方面，可以通过给恒温动物施用治疗上有效量的抑制 TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员结合的分子，来增加骨矿质含量或密 度。可以治疗的恒温动物的例子包括脊推动物和哺乳动物，包括例如马、 奶牛、猪、绵羊、狗、猫、大鼠和小鼠。治疗分子的代表性例子包括核 酶、核酶基因、反义寡核苷酸和抗体（例如人源化抗体)。
在本发明的其它方面，提供用于增加骨密度的方法，包括步骤：向返 回骨的细胞导入指导抑制TGF-P结合蛋白结合TGF-P家族成员的分子表 达的载体，并给恒温动物施用该含有载体的细胞。简单地说，返回骨的 细胞可以直接从患者的骨（例如CD34+、成骨细胞、骨细胞等从骨髓获得 的细胞）、外周血或培养物获得。
将指导抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员结合的分子表达的载 体导入细胞中。适合载体的典型例子包括病毒载体例如疱夸病毒载体（例 如美国专利5,288,641)、腺病毒栽体（例如WO 94/26914、 W0 93/9191; Kolls等，PNAS 91(1) :215-219， 1994; Kass-Eisler等，PNAS 90(24) :11498-502, 1993; Guzman等，血液循环（Circulation) 88 (6) :2832-48， 1993; Guzman等，Cir. Res. 73(6》1202-1207, 1993; Zabner等，细胞75(2) :207-216, 1993; Li等，人类基因治疗4(4) :403-409， 1993; Caillaud等，欧洲神经科学杂志（Eur. J. Neurosci.) 5 (10) :1287—1291， 1993; Vincent等，Nat. Genet. 5(2) :130-134， 1993; Jaffe等，Nat. Genet. 1 (5): 372-378， 1992;和Levrero等，基因101 (2) :195-202， 1991)、腺伴随病毒栽体（WO 95/13365; Flotte等, PNAS 90(22): 10613-10617, 1993)、杆状病毒载体、细小病毒载似Koering 等，人类基因治疗5:457-463, 1994),痘病毒载似Panicali和Paoletti， PNAS 79:4927-4931， 1982;和Ozaki等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2) :653-660, 1993 )、和逆转录病毒（例如EP 0,415,731; W0 90/07936; W0 91/0285; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; 美国专利5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218)。同样可以构建含有 混合的不同病毒或非病毒来源的不同元件（例如启动子、包膜序列 (envelope sequence)等）的病毒载体。在各种实施方案中，病毒载体本 身或含有病毒载体的病毒颗粒均可以用于以下描述的方法和组合物中。
在本发明的其它实施方案中，可以通过各种技术施用编码抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员结合的分子的核酸分子本身，这些技术包 括例如施用与聚L-赖氨酸DNA复合物偶联的脱唾液酸血清类粘蛋白 (ASOR) (Cristano等，PNAS 92122-92126, 1993)、与灭活腺病毒相连 的DNA(Curiel等，人类基因治疗3(2) :147-154， 1992);细胞转染剂介 导的导入（DMRIE-DOPE, Vical， California);直接DNA注射（Acsadi 等，自然352:815-818, 1991); DNA配体（Wu等，生物化学杂志（J. Biol. Chem. ) 246:16985-16987， 1989);脂转染（Feigner等，美国国家科学 院院刊84:7413-7417, 1989);脂质似Pickering等，Circ. 89(1) :13-21， 1994;和Wang等，PNAS 84:7851-7855， 1987);微粒轰击（Williams等， PNAS 88:2726-2730, 1991);和单独（Vile和Hart,癌症研究（Cancer Res. ) 53:3860-3864， 1993)或利用PEG-核酸复合物直接递送编码该蛋 白质的核酸分子本身。
可以由本发明载体表达的分子的代表性例子包括核酶和反义分子，它 们每一种均已在上文中作了更为详细的讨论。
可以直接通过使用X射线（例如双能X射线吸收测量术，或"DEXA")， 或通过从骨更新标志（成骨细胞特异'&喊性磷酸酶、骨钙蛋白、I型原胶 C，原前肽（PICP)、和总的碱性裤酸酶；见Comier, C. ， Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995)或骨吸收标志（吡咬啉、脱氧吡咬啉、N-端肽、尿羟脯氨酸、血浆酒石酸（tartate)抗性酸性磷酸酶和半乳糖基羟赖氨酸；见 Cornier,同上）进行的推导，确定骨矿质含量的增加。还可以从体重或 利用其它方法（见Guinness—Hey， Metab. Bone Dis. and Rel. Res, 5:177-181， 1984)计算骨质的量。
正如本领域技术人员所明了的，给药的量和频率当然将取决于诸如所 治疗的指征的性质和严重程度、期望的反应、患者的情况等等因素。典 型地，本发明组合物可以通过以上提及的各种技术来施用。
我们提供以下实施例作为说明，而非限制。
实施例 实施例1
硬化性狭窄作图定位于人类第17号染色体长臂 对人类负责硬化性狭窄（sclerosteosis)的缺陷的遗传作图将负责该 疾病的基因定位在人第17号染色体的区域，该区域编码一个新的TGF-P 结合蛋白家族成员。在硬化性狭窄中，与非患病个体相比，患者骨骼骨 表现出在矿质密度方面的实质增加。头骨也表现出过度生长。硬化性狭 窄患者通常是健康的，尽管他们可能在出生时表现出不同程度的并指 (趾)，并在颅骨中表现出不同程度的颅压迫和神经压迫。
将收集自发生该疾病的24个南非Afrikaaner家族的DNA样品应用 纯合性作图方法，对硬化性狭窄相关的基因缺陷进行连锁分析（Sheffield 等，1994，人类分子遗传学（Human Molecular Genetics) 3:1331-1335， "3号染色体上巴-比综合征座位的鉴定以及对一种有效的纯合性作图方 法的评价(Idendification of a Bardet-Biedl syndrome locus on chromosone 3 and evaluation of an efficient approach to homozygosity mapping)，，）。该南非Afrikaaner群体在遗传上是同质的； 该群体是几个世纪前定居在该地区的少数建立者的后裔，自建立之后由 于地理和社会障碍该群体一直是隔离的。除了此Afrikaaner群落外，世 界各地的硬化性狭窄是稀少的，这提示在该建立群体中存在该基因的突 变，而且随着该群体的增大该基因突变在数量上也随之增加。纯合性作图的使用是基于如下假设：在来自近亲家族和隔离群体的患病个体中，与 隐性突变相邻的DNA作图标记很可能是纯合的。
选捧一套371个来自常染色体的微卫星标记（Research Genetics, 第6套)，用以对来自硬化性狭窄患者样品的DNA库进行分型。用于该分 析的DNA样品来自24个家族中的29名硬化性狭窄患者，59名未患病家 族成员，以及一组来自同一群体的无关对照个体。这些库由4-6名个体 组成，这些个体或是患病个体、来自近亲家族的患病个体、双亲和未患 病同胞，或是无关对照。在无关个体库中和在大多数有患病个体或家族 成员的库中，对所述标记的分析显示，每一个标记均有几种等位基因大 小。标记D17S1299显示是纯合性的指示：在几个患病个体库中均显示为 一条带。
用D17S1299区域（17ql2-q21)中的总共19个标记对所有24个硬 化性狭窄家族进行分型。每个家族的患病个体均显示出在该区域是纯合 的，而且对于核心单元型（core haplotype)这29名个体中的25名是 纯合的；他们每一个在D17S1787和D17S930之间都具有相同的等位基因。 其它4名个体的一条染色体与该单元型相匹配，而第二条染色体与之不 匹配„总之，该数据有力地说明此3兆碱基区域含有该硬化性狭窄突变。 对此3兆碱基区域中的大多数外显子的序列分析，鉴定了一个定位于新 TGF-P结合蛋白编码序列中的无义突变（SEQ ID No. 1第117位的C>T 突变导致一个终止密码子）。该突变表现出是Afrikaaner后裔的硬化性 狭窄患者和携带者所独有的。该基因的本质通过鉴定其内含子中的突变 (内含子的+3位存在A〉T的突变）得到进一步证实，该内含子的突变在 一名单个的患有确诊硬化性狭窄的无关患者中导致不正确的mRNA加工。
实施例2
TGF-P结合蛋白基因表达的组织特异性
A.通过RT-PCR分析人类Beer基因的表达
采用商业途径可获得的试剂盒（"用于第一链cDNA合成的Superscript Preamplification System " ， Life Technologies, Rockville， MD),从以下总RNA样品制备第一链cDNA:人脑、人肝、人 脾、人胸腺、人胎盘、人骨骼肌、人甲状腺、人脑垂体、人成骨细胞（NHOst, 获自Clonetics公司，San Diego, CA)、人骨肉瘤细胞系（Saos-2， ATCC弁 HTB-85)、人骨、人骨髓、人软骨、非洲猕猴骨、酿酒酵母、和人外周血 单核细胞。除了以下样品是内部制备的之外，所有其它这些RNA样品均 从商业途径（Clontech， Palo Alto, CA)购买：人成骨细胞、人骨肉瘤 细胞系、人骨、人软骨和非洲猕猴骨。这些内部RNA样品的制备采用了 商业上可获得的试剂盒（"TRI试剂"，Molecular Research Center公司， Cincinnati, OH)。
在这些样品和作为对照的人基因组样品上进行PCR。 Beer的有义寡 核苷酸引物的序列是：5'-CCGGAGCTGGAGMCAACAAG-3， （SEQ ID NO: 19)。 Beer的反义寡核普酸引物的序列是：5，-GCACTGGCCGGAGCACACC-3， （SEQ ID N0:20)。此外，采用针对人p-肌动蛋白基因的引物进行PCR，作为对照。 P-肌动蛋白的有义寡核苷酸引物具有序列：5，-AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3， （SEQ ID NO:21)。卩-肌动蛋白的反义寡核 苷酸引物具有序列：5，-GAAGTCCAGGGCGACGTAGCA-3， （SEQ ID NO:22)。 采用标准条件在25ul反应中，以61摄氏度作为退火温度，进行PCR。用 Beer引物进行32个PCR循环，而用p-肌动蛋白的引物进行24个PCR循 环。
扩增之后，每个反应的12ul通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色 进行分析。见图2A。 B.小鼠胚胎切片的RNA原位杂交：
采用厂商的操作指南，将小鼠的全长Beer cDNA ( SEQ ID No. 11) 以反义和有义方向克隆至pCR2. 1载体（Invitrogen， Carlsbad, CA)中。 使用Ambion公司（Austin, TX)提供的体外转录试剂，合成35-S-a-GTP 标记的cRNA有义和反义转录本。根据Lyons等的操作方法（细胞生物学 杂志（J. Cell Biol. ) 111:2427-2436, 1990),进行原位杂交。
小鼠Beer cRNA探针在发育中的小鼠胚胎的神经管、肢芽、血管和正在骨化的软骨中检测到特异表达信号。图3的A部分显示了肢芽（l)的 夕卜胚层顶峰(apical ectodermal ridge) (aer)、 血管(bv)和神经管(nt) 中的表达。B部分显示了第4脑室（4)中的表达。C部分显示了下颌骨（ma)、 颈推（cv)、枕骨（oc)、腭(pa)、和血管（bv)中的表达。D部分显示了肋 骨（r)和心瓣膜(va)中的表达。A部分是10. 5 dpc胚胎的横切片。B部分 是12. 5 dpc胚胎的纵向切片。C和D部分均是15. 5 dpc胚胎的纵向切 片。
ba二鳃弓、h二心脏、te^端脑（前脑）、b二脑、f二额鼻块（frontonasal mass)、 g二肠、h二心脏、j,、 li=JJf、 1\1=肺、ot二听泡、ao二、 sc:脊髓、skm二骨 骼肌、ns二鼻窦、仕=胸腺、to-舌、fl二前肢、di二隔膜
实施例3 重组Beer蛋白的表达和纯化 A.在C0S-1细胞中的表达：
采用如下PCR寡核苷酸引物扩增编码人全长Beer蛋白质的DNA序 列：5'寡核苷酸引物的序列是5，-MGCTTGGTACCATGC AGCTCCCAC-3， （SEQ ID N0:23)，含有一个Hind III限制性酶位点（粗体），其后是从推测的氨 基端起始密码子（ATG)之前的6个碱基对开始的Beer基因的19个核苷 酸 。 3， 寡核苷酸引 物的序列 是 5，-MGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCT-3， (SEQ ID N0:24)，含有一个Hind III限制性酶位点（粗体），之后是一个反向互 补终止密码子（CTA),再之后是FLAG表位的反向互补序列（下划线， Sigma-Aldrich公司，St. Louis, MO),而其側翼是编码Beer數基端5 个氨基酸的核苷酸的反向互补序列。将此PCR产物进行TA克斷"Original TA克隆试剂盒"，Invitrogen， Carlsbad, CA)，并通过DNA测序对单个 克隆进行筛选。然后用Hind III消化经序列证实的克隆，并使用商业上 可获得的试剂（"QIAquick凝胶提取试剂盒"，Qiagen公司，Valencia, CA) 在1. 5%琼脂糖凝胶上进行纯化。然后用T4 DNA连接酶将该片段与经Hind III消化、磷酸酶处理的pcDNA3.1质粒（Invitrogen, Carlsbad, CA)连接起来。转化大肠杆菌DH10B,并在含有100ug/ml氨千青霉素的LB平 板上铺板。使用相应于pcDNA3. 1中T7启动子/引物位置的5，引物，和相 应于内在BEER序列的反向互补序列，且具有5，-GCACTGGCCGGAG CACACC-3， （SEQ ID N0:25)序列的3，引物，通过基于PCR的筛选，鉴定带有正 确方向的期望重组体的菌落。克隆片段的序列通过DNA测序证实„
采用COS-1细胞（ATCC# CRL-1650)进行转染。使用商业上可获得 的试剂盒，依据厂商提供的操作指导（"DEAE-葡聚糖转染试剂盒"，Sigma Chemical公司，St. Louis, MO), 用50ug表达质粒pcDNA-Beer-Flag 进行转染。转染后的最终培养基是含有0. 1%胎牛血清的DMEM (Life Technologies, Rockville， MD)。培养4天后，取出该培养基。通过 SDS-PAGE和Western印迹，使用抗FLAG M2单克隆抗体（Sigma-Aldrich 公司，St. Louis, M0)，分析重组BEER蛋白的表达。重组BEER蛋白使 用抗FLAG M2亲和柱（"哺乳动物瞬时表达系统"，Sigma-Aldrich公司， St. Louis, M0)纯化。通过SDS-PAGE和Western印迹，使用抗FLAG M2 单克隆抗体，分析亲和柱曲线成分。 B.在SF9昆虫细胞中表达：
使用如下引物和标准条件，PCR扩增人Beer基因序列： 有义引物：5'-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCMGA ATGAT-3， （SEQ ID NO:26)
反义引物：5，-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGT TCTCCAGCTCGGC-3，卿ID NO:27)
所获cDNA含有带有两处修政的Beer编码区。N-端分泌信号被去除， 而且FLAG表位尾（Sigma)以符合阅读框的形式融合到插入片段的C末端。 为了转移到杆状病毒表达载体中，使用标准方法添加BamHI和HindIII 克隆位点，并将该基因亚克隆至pMelBac载体（Invitrogen)中。
采用Bac-N-Blue转染试剂盒（Invitrogen)制备表达Beer蛋白的 重组杆状病毒，并根据厂商说明书进行纯化。
在含有10%胎牛血清的TNM—FH培养基（Invitrogen)中维持SF9细 胞（Invitrogen)。对于蛋白表达，在转瓶中以大于10的M0I感染SF9培养物。每天采取培养基和细胞样品，持续5天，并通过Western印迹 使用抗FLAGM2单克隆抗体（Sigma)或抗Beer兔多克隆抗血清监测Beer 的表达。
5天后，通过离心收获杆状病毒感染的SF9细胞，并采用高盐提取 緩冲液（1. 5M NaCl， 50mM Tris pH7. 5)从细胞沉淀中提取细胞相连的 蛋白质。通过离心澄清该提取物（20ml/300ml培养物），对4升Tris緩 冲盐（150mM NaCl, 50mM Tris pH7. 5)透析三次，并通过再次离心澄清。 将该高盐组分施加于Hitrap Heparin (Pharmacia; 5ml柱床体积），用 服PES緩冲盐（25mM服PES7. 5， 150mMNaCl )进行大量洗涤，并使用150mM NaCl-1200mM NaCl的梯度洗脱结合的蛋白质。在大约800mM NaCl时观 察到Beer的洗脱。向含有Beer的组分补加甘油和DTT分别达到10%的甘 油和lmM的DTT，然后在-80"C冻存。
实施例4
抗Beer、 Gremlin和Dan的多克隆抗体的制备和检测 A. 抗原的制备：
使用标准PCR方法和如下寡核苷酸引物扩增人Beer、人Gremlin和 人Dan的DNA序列。 人Beer
有义：5，-GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTTC-3， （SEQ ID NO :28) 反义：5，-AGCATMGCTTCTAGTAGGCGTTCTCCAG-3， （SEQ ID NO :29) 人Gremlin
有义：5，-GACTTGGATCCGMGGGAAAAAGAAAGGG-3， （SEQ ID NO:30) 反义：5，-AGCATMGCTTTTMTCCAAATCGATGGA-3， （SEQ ID NO:31) 人Dan
有义：5，—ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCMCMG—3， （SEQ ID NO:32) 反义：5，-ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3， （SEQ ID NO :33)
在每一种情况中，列出的引物均扩增除去了分泌信号序列的完整编码 区。这些扩增序列包括用于亚克隆至细菌表达载体pQE-30 (Qiagen公司，Valencia, CA)的BamHI/Hindlll位点（对于Beer和Gremlin)和 Sacl/Hindlll位点（对于Dan)的限制性位点。pQE-30在该克隆区域的 5'末端含有一个编码6xHis尾的序列。用该完整结构转化大肠杆菌菌抹 M-15/pR印（Qiagen公司），并且通过测序#单个克隆。按厂商（Qiagen, TheQIAexpression)所述在M-15/pR印中表达蛋白质并对其进行纯化（6 x His亲和尾结合与S印harose偶联的Ni-NTA)。
在6M胍中进行溶解，从大肠杆菌相当大量地回收Beer蛋白，然后 透析g浓度降至2-4M以防治在贮存过程中出现沉淀。用6M胍溶解， 回收更大量的Gremlin和Dan蛋白，经纯化后胍浓度为0. 5M。
B. 多克隆抗体的生产和检测
采用标准操作，在兔和鸡宿主中制备分别针对这3种抗原的多克隆抗 体（R&R抗体，Stanwood, WA;家兔免疫和抗血清回收的标准操作；精 编分子生物学实验指南（Short Protocols in Molecular Biology)第 2版，1992, 11.37—11.41。捐赠者Helen M. Cooper和Yvonne Paterson; 由Strategic Biosolutions (Ramona， CA)制备鸡抗血清，)。
通过Western印迹筛选具有活性的家兔抗血清和鸡卵的Igy组分。 三个抗体分别通过PAGE分离，并转移至0. 45um硝酸纤维素膜上（Novex， San Diego, CA)。将该膜剪成条状，每个条含有大约75ng的抗原。在3% 的印迹级阻断剂（Blotting Grade Block ) ( Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)中封闭这些条，然后在1 x Tris緩冲盐（TBS)/0. 02%TWEEN 緩冲液中洗涤3次。将这些条与一抗（免疫前血液、兔抗血清或鸡卵IgY 在封闭緩冲液中的1:100 - 1:10， 000稀释液） 一起孵育1小时，并伴随 轻柔地滚动。经第二遍用lx TBS/0. 02% TWEEN进行的三次洗涤之后，与 二抗（过氧化物酶偶联的驴抗兔抗体，Amersham Life Science, Piscataway， NJ; 或过氧化物酶偶联的驴抗鸡抗体，Jackson I,unoResearch， West Grove, PA)孵育一小时。最后一轮用1>< TBS/0.02% TWEEN进行的三次洗涤之后，用Lumi-Light Western印迹底物（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, 德国)显色这些条。
C. 抗体的交叉反应性检测：
76按前面部分描述的操作方法，将Beer、 Gremlin或Dan的硝酸纤维 素条带与它们各自的兔抗血清或鸡卵IgY的稀释液（l:5000和1:10， 000) 以及其余两种抗原产生的抗血清或鸡卵IgY (稀释液1:1000和1:5000) 一起孵育。增加非匹配抗体的水平，以检测仅在浓度增加时才可能被观 察到的这些抗体的低亲和结合。对于使用上述操作的所有三个结合事件， 显色反应的操作和持续时间是相同的。对于所有测试的抗原，均未观察 到抗原的交叉反应性。、
实施、例5
Beer与TGF-P超家族蛋白质的相互作用 采用免疫沉淀方法研究Beer与来自TGF-P超家族的不同系统发生支 的蛋白质的相互作用。从商业途径获得纯化的TGFP-1、 2、 TGF
P -3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6和GDNF (R&D system; Minneapolis MN)。 典型的操作步骤如下。部分纯化的Beer在HEPES緩冲盐（25mMHEPES 7. 5， 150mMNaCl)中透析。在300ul IP緩冲液（150mMNaCl， 25mMTrispH7. 5， lmM EDTA, 1. 4mM卩-巯基乙醇，0.5% triton X—100和10%甘油）中进行 免疫沉淀。在存在和不存在500ng FLAG表位标记的Beer时，将30ng重 组人BMP-5蛋白（R&D system)加在15ul FLAG亲和基质（Sigma; St. Louis MO)上。4X:孵育这些蛋白质4小时，然后在IP緩冲液（每次洗 涤1ml)中洗涤与亲和基质相连的蛋白质。将结合蛋白质从亲和基质上洗 脱至60ul lxSDS PAGE样品緩冲液中。通过SDS PAGE分离这些蛋白质， 并采用抗BMP-5抗血清（Research Diagnostics公司）通过Western印 迹检测与Beer相连的BMP-5(见图5)。 Beer配体结合试验：
在lOOul PBS/0.2% BSA中加入FLAG-Beer蛋白质（20ng),然后吸 附至预先用抗FLAG单克隆抗体（Sigma, St. Louis MO)包被、用溶于 PBS的1096BSA封闭的96孔微滴定板的每个孔中。这在室温进行60分钟。 去除该蛋白质溶液，并洗涤这些孔以去除未结合蛋白质。向每个孔加入 溶于PBS/0. 2% BSA的BMP-5，浓度范围从10pM至500nM，然后室温孵育2小时。去除结合溶液，.并用200ul体积的PBS/0. 2% BSA洗涤该板三次。 然后使用BMP-5抗血清通过ELISA (F.M. Ausubel等（1998)当代分子 生物学实验指南(Current Protocols in Mol. Biol.)第2巻,11. 2. 1-11.2.22),检测BMP-5的水平。通过从总结合中減掉非特异结合来计算 特异结合，并通过LIGAND程序（Munson和Podbard，分析生物化学（Anal. Bioche迈），107，第220-239页，1980)进行分析。
在该方法的一个变化中，改造Beer并将其表达成人Fc融合蛋白质。 同样对配体BMP进行政造，并表达成小鼠Fc融合蛋白质。将这些蛋白质 一起孵育，按Mellor等所述的方法采用均一时间分辨荧光检测 (homogeneous time resolved fluorescence detection) (G. W. Mellor 等，J. of Biomol. Screening, 3(2) 91-99, 1998),进行分析。
实施例6
抑制TGF-P结合蛋白与TGF-P家族成员结合的筛选试验
重复上述试验，除了两处例外。第一，BMP浓度固定在预先确定的Kd 值上。第二，加入固定浓度的候选拮抗剂集合（对于有机小分子集合为 20uM，而在抗体研究中为luM)。结合TGF-P结合蛋白的这些候选分子（拮 抗剂）包括商业来源的或内部收集的有机化合物，这些有机化合物代表 了各种的化学结构。这些化合物在函SO中制成贮存液，并在标准试验条 件下以< 1%的终体积加入试验孔中。与BMP和Beer —起室温孵育2小时， 去除该溶液并按所描述的方法定量结合的BMP。在没有化合物或抗体时观 察到的对BMP结合产生40%#制的试剂被认为是该相互作用的拮抗剂。基 于滴定研究以测定这些试剂的抑制常数和它们对TGF-P结合蛋白结合亲 和性的影响，进一步作为潜在抑制物评价这些试剂。通过使用基于BMP 配体作用的试验的研究（例如BMP/BMP受体竟争研究），还可以进行可比 较的特异性对照试验，以确立该鉴定拮抗剂的选择性分布图。
实施例7对TGF- P结合蛋白的骨基质定位的抑制 使用修改的Nicolas方法（Nicolas, V. Calcif Tissue Int. 57:206， 1995)，评价对骨基质（羟基磷灰石）定位的抑制。简单地说，按Nicolas (同上）所述方法制备125I标记的TGF-P结合蛋白。向配有聚丙烯滤膜 (Polyfiltroninc， Weymouth MA)的96孔微滴定板的每个孔中加入羟 基磷灰石。将TGF-P结合蛋白加入含有0.2%白蛋白的PBS緩沖液中。用 该緩冲液洗涤含有基质的孔三次。使用0. 3M NaOH洗脱吸附的TGF-P结 合蛋白，并进行定量。
通过TGF-P结合蛋白与测试分子的孵育，以及将该混合物施加到上 述基质上，进行抑制物的鉴定。用含有0.2%白蛋白的PBS緩沖液洗涤该 基质三次。使用0. 3M NaOH洗脱吸附的TGF-P结合蛋白，并进行定量。 在没有化合物或抗体的情况下观察到对TGF-P结合蛋白结合的40%抑制 的试剂被认为是骨定位抑制剂。通过剂量反应研究测定这些抑制剂的抑 制常数和它们对TGF-P结合蛋白结合亲和性的影响，进一步表征这些抑 制剂。
实施例8 TGF-P结合蛋白突变体的构建
A. 资变：
pBluescript SK中的全长TGF-P结合蛋白cDNA充当诱变模板。简 单地说，使用Vent DNA聚合酶（New England Biolabs， Beverly, MA) 和适合的引物（见以上提供的讨论）通过聚合酶链式反应产生该DNA片 段。在厂商提供的緩冲液中，使用57C退火温度，进行该聚合酶链式反 应23个循环。然后将产物暴露于两个限制性酶，并在使用琼脂糖凝胶电 泳分离后，将其连接回通过酶消化去除了对应序列的pRBP4-503中。通 过DNA测序验证该突变体的完整性。
B. 突变TGF-P结合蛋白的哺乳动物细胞表达和分离
将该突变TGF-P结合蛋白cDNA转移至实施例3所述的pcDNA3.1哺 乳动物表达载体中。在验证序列后，用所获结构转染COS-1细胞，并按
79实施例3所述纯化分泌的蛋白质。
实施例9 动物模型-I 超量表达Beer基因的转基因小鼠的产生 使用从CITB小鼠基因组DNA文库（由Research Genetics, Huntsville AL获得）分离的~ 200千碱基（kb) BAC克隆15G5,确定小鼠Beer基因 的全部序列以及其5，和3，側翼区。将含有该完整基因体以及〜17 kb的5， 侧翼序列和〜20 kb的3，侧翼序列的41kb Sail片段亚克隆至S叩erCosI 粘粒栽体（Stratagene, La Jolla, CA)的BamHI位点，并在大肠杆菌 菌抹DH10B中增殖。然后从该粘粒结构，采用常规手段，凝胶纯化含有 完整小鼠Beer基因以及分别长17kb和14kb的5，和3，側翼序列的35kb Mlul-Avill限制性片段（序列号6),用于微注射小鼠受精卵（DNX转基 因；美国专利4,873,191)。以5-30%的活产幼崽频率获得其中克隆DNA 片段随机整合在基因组中的建立者动物（founder animal )。通过从少量 小鼠组织例如尾尖提取基因组DNA,并进行Southern印迹分析，验证该 转基因的存在。DNA的提取采用如下操作程序：在含有200mMNaCl， lOOmM Tris pH8. 5, 5mM EDTA， 0. 2% SDS和0. 5mg/ml蛋白酶K的裂解緩冲液 中，55t:过夜消化组织。第二天，该DNA用酚/氯仿（50:50)抽提一次， 用氯仿/异戊醇（24:l)抽提一次，然后用乙醇进行沉淀。重悬在TE(10mM Tris pH7. 5， ImM EDTA)中后，每份8-10ug DNA样品用限制性内切酶例 如EcoRI消化，然后进行凝胶电泳并将其转移至带电荷的尼龙膜例如 HyBondN+ (Amersham， Arlington Heights, IU上。然后用放射性标记 的DNA片段杂交该所获得的滤膜，该放射性标记DNA片段来源于小鼠Beer 基因座位并且既能识别来自内源性基因座位的片段又能识别来自转基因 的具有不同大小的片段。将建立者动物与非转基因小鼠进行配种，产生 足够数量的转基因和非转基因后代，并在其中测定Beer基因超量表达的 影响。对于这些研究，对各种年龄的动物（例如，1天、3周、6周、4 个月）进行多种不同的设计用来查明总的骨骼形成、骨矿质密度、骨矿质含量、破骨细胞和成骨细胞活性、软骨内骨化程度、软骨形成等的试
验。转基因的转录活性可以通过如下步骤进行测定：从不同组织中提取 RNA，并采用RT-PCR进行分析，该分析利用了转基因来源的小鼠品系 (129Sv/J)和用于DNA微注射的小鼠品系[(C57BL5/JxS几/J)F2]之间的 单核苷酸多态性。
动物模型-II 通过同源重组破坏小鼠的Beer基因
在胚胎干（ES)细胞中进行的同源重组可以用以失活小鼠的内源性 Beer基因，并随之产生带有功能缺失突变的动物。将报告基因例如大肠 杆菌的p-半乳糖苷酶基因通过基因工程插入导向载体，使其表达可以受 到内源性Beer基因启动子和翻译起始信号的控制。以此方式，可以在带 有定向等位基因的动物中，测定Beer基因表达的空间和时间模式。
首先通过将磷酸甘油酸激酶（PGK)启动子驱动的可药物筛选的新霉 素抗性基因（neo)盒从pGT-N29 (New England Biolabs， Beverly, MA) 克隆至克隆载体pSP72 (Promega， Madson， WI)中，构建该导向载体。 使用PCR，给该PGKneo盒的側翼加上噬菌体Pl loxP位点，该位点是P1 Cre 重组酶的识别位点（Hoess等，美国PNAS, 79:3398， 1982)。这就允许 之后在被打耙的ES细胞或ES细胞来源的动物中除去该neo抗性标记（美 国专利4,959,317)。该PCR引物由loxP的34个核苷酸（ntd)序列，与 PGKneo盒的5，和3'末端互补的15-25ntd,以及用于克隆至pSP72的限制 性酶识别位点（有义引物中为BamHI，反义引物中为EcoRI)组成。有义 引物的序列是：5，-MTCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA TCTGCAGGATTCGAGGGCCCCT-3， （SEQ ID N0:34);反义引物的序列是：5，-AATCTGMTTCCACCGGTGTTMTTAAATMCTTCGTAT
AATGTATGCTATACGMGTTATAGATCTAGAGTCAGCTTCTGA-3， （SEQ ID NO :35)。
下一步是将含有该大肠杆菌p-半乳糖苷酶基因和SV40 »苷酸化信 号的3. 6kb Xho1-HindIII片段从pSVp (Clontech， Palo Alto， CA)克 隆至pSP72-PGKneo质粒中。通过从BAC克隆15G5扩增一个2. 4kb的片段产生小鼠Beer基因座位的同源"短臂"。该片段的3，末端与Beer基因 的翻译起始位点相符，并且在此PCR中使用的反义引物还包括与P-半乳 糖苷酶基因的5，末端互补的30ntd，以致该基因的编码区可以按符合阅读 框的形式与Beer起始位点融合。用于将该"短臂"引入pSP72-(5gal-PGKneo 质粒的方法是，在p-gal基因上游的一个位点将此质粒线性化，然后用 该片段和此"短臂"PCR产物进行共转化，筛选该PCR产物通过同源重组 整合在其中的质粒。用于该"短臂"扩增的有义引物包括与pSV70载体 互补的30ntd，从而允许该重组事件发生。该有义引物的序列是5，-ATTTAGGTGACACTATAG
AACTCGAGCAGCTGMGCTTMCCACATGGTGGCTCACAACCAT-3，鹏ID NO :36),
反 义 引 物 的 序 列 是 ： 5，-AACGACGGCCAGTG
AATCCGTMTCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3， （ SEQ ID NO :37)。
使用引入稀有限制性酶切割位点SgrAI、 Fsel、 Ascl和Pacl的引物，
通过从BAC克隆15G5扩增一个6. lkb的片段产生Beer基因座位的"长
臂"。具体地，该有义引物的序列是 5，-ATTACCACCGGT
GACACCCGCTTCCTGACAG-3， （SEQ ID NO:38);该反义引物的序列是5，-ATTACTTMTTAAACATG0CGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTMTT—
3， （SEQ ID N0:39)。作为一个中间步骤，将所获PCR产物克隆至TA载 体（Invitrogen， Carlsbad, CA)中。
该小鼠Beer基因导向结构还包括第二个选择标记，单纯疱务病毒I型 胸苷激酶基因（HSVTK)，该基因处于劳斯肉瘤病毒长末端重复元件（RSVLTR) 的控制下。该基因的表达使得哺乳动物细胞对^~[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟 嘌#感（并且不能存活)，因此这是一个筛去新霉素抗性的细胞的方便方 法，在新霉素抗性细胞中该结构是通过非同源重组事件发生务^的（美国专 利5,464,764)。使用允许随后将片段克隆至"长臂"-TA栽体质粒的Fsel 和Ascl位点中的引物，从pPS1337扩增该RSVLTR-HSVTK盒。对于该PCR， 有义引物的序列是5，-ATTACGGCCGGCCGCMAGGMTTCMGATCTGA-3， （SEQ ID N0:40);反义引物的序列是5，-ATTACGGCGCGCCCC TCACAGGCCGCACCCAGCT-3， 卿ID NO:41)。构建该导向载体的最后一步涉及，将含有"长臂"和RSVLTR-HSVTK 基因的8.8 kb SgrAI-Ascl片段克隆至pSP72-"短臂"-pgal-PGKneo 质粒的SgrAI和Ascl位点中。通过Ascl或Pacl消化，线性化该导向载 体，然后通过电穿孔将其导入ES细胞中。
实施例10 反义介导的Beer失活 以重叠形式制备具有17个核苷酸的反义寡核苷酸，方式是第一个寡 核苷酸的5，末端与Beer转录本的翻译起始AUG重叠，然后相继的寡核苷 酸的5，末端在相对Beer AUG的5'方向上前移5个核苷酸（ 一直到50个 核苷酸之外）。使用了相同的碱基组成设计和制备相应的对照寡核苷酸， 但其序列被重新分布以抑制其与编码mRNA的任何有效杂交。通过阳离子 脂质递送（P. L. Feigner,美国国家科学院院刊84:7413， 1987),将试 剂递送至测试细胞系统中。在lOOul减少血清培养基（Opti-MEM 1减少 血清培养基；Life Technologies, Gaithersburg MD)中加入2ug反义 寡核香酸，并将其与（6ul)脂转染试剂（Lipofectin reagent) (Life Technologies, Gaithersburg MD)在此lOOul减少血清培养基中混合。 混合这些物质，室温下30分钟使其形成复合物，并将该混合物加到预先 接种的MC3T3E21或KS483细胞中。培养这些细胞，并回收mRNA。使用 RT-PCR以及Beer特异性引物监测Beer的mRNA。此外，将分开的实验 孔收集起来，并通过实施例4所述的Western印迹方法鉴定蛋白质的水 平。收获细胞，将其重悬在裂解緩冲液（50mM Tris pH 7. 5, 20mM NaCl， ImM EDTA， 1% SDS)中，并收集可溶性蛋白质。将该物质加到10_20%的 梯度变性SDS PAGE上。把分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上并按以上 所述使用抗体试剂进行Western印迹。平行地，向同样的培养物加入对 照寡核苷酸，并重复实验操作。如果使用反义寡核苷酸进行的该处理与 拼凑的对照寡核苷酸相比导致mRNA或蛋白质水平50%的变化，则Beer mRNA 或蛋白质水平的降低被认为是有意义的。该方法使得能够选择性地失活 基因以及在随后的组织培养模型中出现矿化结表型特征。序列
SEO ID No. 1:人Beer cDNA(完螯编码区加5'和3'UTRs)
TCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGCAACCCAGGGCAGGGGGC
CTCTGGGGCCGCCTACCTTTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCAC CGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGGGAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGT TGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGCCCAGAGCACA
AATAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGC
GAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAG
AGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGCA GGACACATTTCTGCCTAGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACT
ACTGGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTT
GTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAGSEQ ID No. 2:人BEER蛋白质（全序列）
MQLPLALCLVCLLVHTAFRVVEGQGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELENNKTMNRAE NGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIG RGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELK DFGTEAARP()KGRKPRPRARSAKANQAELENAY
SEQ ID No. 3:含有硬化性狭窄无义突变的人Beer cDNA
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTAT
CAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAAC TAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGG
ACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGG
GCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAA AATCATTTCCAGACAACCTCTTACTTTCTGTGTAGTmTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGACATATGAAAGCCTGCAGGACTGGTCGTTTTTTTGGCAATTC
ATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTT
AATATTGCTTTATGAATTAACAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAG
ACAATGAATCATGACCGAAAG
SEQ ID No. 4:从硬化性狭窄（Scleroeteosis)获得的截短人Beer蛋白质
MOLPLALCLVCLLVHTAFRVVEG*
SEO ID No. 5:编码蛋白质变体的人Beer cDNA (V10I)
CTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACT
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTAT
TTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTA
CAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCTAGAAAACAGCTTCTTACTGC
AATCATTTCCAGACAACCTCTTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGT
TTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAAGAGTTAAGTTACAT ATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTT AATATTGCTTTATGAATTAACAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAG ACAATGAATCATGACCGAAAG
SEQ ID No. 6:人Beer蛋白质变体（V10I)
MQLPLALCLICLLVHTAFRWEGQGWQAFKNDATEIIRELGEYPEPPPELENNKTMNRAE NGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLP醒G RGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELK DFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY
SEQ ID No. 7:编码蛋白质变体的人Beer cDNA (P3朋）
CTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACT
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTAT
CAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAAC
TACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAA
TAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGformula see original document page 88DFGPEAARPQKGRKPRPRARGAKANOAELENAY SEOIDNo. 11:小鼠Beer oDNA(仅有编码区)
AAAGCCAACCAGGCGGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAG SEO ID No. 12:小鼠Beer蛋白质(全序列)
MQPSLAPCLICLLVHAAFCAVEGQGWQAFRNDATEVIPGLGEYPEPPPENNQTMNRAENG GRPPHHPYDAKDVSEYSCRELHYTRFLTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRV KWWRPNGPDFRCIPDRYRA()RVGLLCPGGAAPRSRKVRLVASCKCKRLTRFHN(3SELKDF GPETARPQKGRKPRPGARGAKANQAELENAY
SEQ ID No. 13:大鼠Beer cDNA (完整编码区加上5' UTR)
AGAACGCCTACTAGSEQ ID No. M:大鼠Beer蛋白质（全序列）
MQLSLAPCLACLLVHAAFVAVESQGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPPQELENNQTMNRAE NGGRPPHHPYDTKDVSEYSCRELHYTRFVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLP画G RVKWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELK DFGPETARPQKGRKPRPRARGAKANQAELENAY
SEQ ID No. 15:牛Baer cDNA (部份编码序列)
SEQ ID No. 16:牛Baer蛋白质（部分序列一缺信号序列和末尾的6个残基）
NDATEIIPELGEYPEPLPELNNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDASEYSCRELHFTRYVTD
GPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLP薩GRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVOLLCPGG
AAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGPEAARPQTGRKLRPRARGTKASRA
SEQ IDNo. 17:用以制备小鼠Beer转基因的Mlu卜Avill限制性片段
CGCGTTTTGGTGAGCAGCAATATTGCGCTTCGATGAGCCTTGGCGTTGAGATTGATACCT
GATCCGCCTTGTTACGGGGCGGCGACCTCGCGGGTTTTCGCTATTTATGAAAATTTTCCGGTTTAAGGCGTTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGTTTTTATTTAAAATACCCTCT
AAGCGGTCAAACATGAGAATTCGCGGCCGCATAATACGACTCACTATAGGGATCGACGCC
TACCACGTTCTCTTAACAGGTGGCTGGGCTGTCTCTTGGCCGCGCGTCATGTGACAGCTG
AGATAAAAGTTGGCATGATCCACATTGCAGGAAGATCCACGTTGGGTnrCATGAATGTG
ATGGCTGAGGGGCTGTAAGGATCTTTCAATGTCTTACATGTGTGTTTCCTGTCCTGCACC TAGGACCTGCTGCCTAGCCTGCAGCAGAGCCAGAGGGGTTTCACATGATTAGTCTCAGAC ACTTGGGGGCAGGTTGCATGTACTGCATCGCTTATTTCCATACGGAGCACCTACTATGTG TCAAACACCATATGGTGTTCACTCTTCAGAACGGTGGTGGTCATCATGGTGCATTTGCTG
GGGCTTCCGGCACATCCTCTCAGGCCAGTGAGGGAGTCTGTGTGAGCTGCACTTTCCAAT
TAAATTTGGATGTTGTGAGGGGAAAGCGAAGGGCCTCTTTGACCATTCAGTCAAGGTACC TTCTAACTCCCATCGTATTGGGGGGCTACTCTAGTGCTAGACATTGCAGAGAGCCTCAGA
AAGCATCAGGCTCTGCCAACAGAACACTCTTTAACACTCAGGCCCTTTAACACTCAGGAC
GGCACAGGACGATATAAGTGGCTTGCTTAAGCTTGTCTGCATGGTAAATGGCAGGGCTGGformula see original document page 92GCACTCATGTGAACCAGGCATGCACACTCGGGCTTATCACACACATAATTTGAAAGAGAG
GTGTGATGAGATTTTTCCTGACAGTGACCTTTGGCCTCTCCCTCCCCCACTTCCCTTCTT
TAAAAAATACTTATCCATTTATTTATTTTTATGTGCACGTGTGTGTGCCTGCATGAGTTC ATGTGTGCCACGTGTGTGCGGGAACCCTTGGAGGCCACAAGGGGGCATCTGATCCCCTGG
ACTTGAATCTAAAGCAAGCACTTTTAACTGCTGAGGCAGCTCTCAGTACCCTTCTTCATTTACATGGTTTCATGTTTTGTTCAAGACTGAAGGATAACATTCATACAGAGAAGGTCTGGG
CTGGAGAGATGGCACTGACTGCTCTTCCAGAGGTCCGGAGTTCAATTCCCAGCAACCACA
GCTACAGTGTACTCACATAAAATAAATAAATCTTTAAAACACACACACACACACAATTAC
ACCACTGTTCAGGCTTCTAACAACCTGGTTTACTTGGGCCTCTnrCTGCTCTGTGGAGC CACACATTTGTGTGCCTCATACACGTTCTTTCTAGTAAGTTGCATATTACTCTGCGTTTT
GGGGATGTCAGAGTATTGTGAACAGGGGACAGTTCTTTTCTTCAATCATGTGGGTTCCAG TATTCTTTTTTTTTCCCCTGAGGTGGGGGCTTGTTCCATAGCCCAAACTGGCTTTGCACT
TGAAGGGATGACTGGACTGGACATGAGCGTGGAAGCCAGAGAACAGCTTCAGTCTAATGC TCTCCCAACTGAGCTATTTCGGTTTGCCAGAGAACAACTTACAGAAAGTTCTCAGTGCCA TGTGGATTCGGGGTTGGAGTTCAACTCATCAGCTTGACATTGGCTCCTCTACCCACTGAG CCTTCTCACTACTCTCTACCTAGATCATTAATTCTTTTTTAAAAAGACTTATTAGGGGGC
TCCCAGCATGCCATTGCTGGGCAGTAGGGGGCGCAGGTGTTCAACGTGAGTAGCTGTTGC CAGTTTTCCGCGGTGGAGAACCTCTTGACACCCTGCTGTCCCTGGTCATTCTGGGTGGGT
CCCACAGCCTCTTTTGCAGAGGTCTGACTGGGAGGGCCCTGGCAGCCATGTTTAGGAAAC
CCACGAGCCTGGTAAAGGAACTATGCAAACACAGGCCCTGACCTCCCCATGTCTGTTCC丁
TCCCAGAGGCTATCTTGATTCTTTGGAATGTTTAAAGTGTGCCTTGCCAGAGAGCTTACG
ATTACAAACAAACAAACAAACAAACAAACAAAGGACCTCCATTTGGAGAATTGCAAGGAT
GTTGCTATTCTAAGAATAATTAGGAGGAGGAACCTAGCCAATTGCAGCTCATGTCCGTGG GTGTGTGCACGGGTGCATATGTTGGAAGGGGTGCCTGTCCCCTTGGGGACAGAAGGAAAATGGAGAGAGAGAGAGCAAAGAAAGAAACAGCCTTTAAAAGAACTTTCTAAGGGTGGTTTT
ATATCAGGGATTTTTGTTGAATATTTCAAATTCAGCTTTAAGTGTAAGACTCAGCAGTGT TCATGGTTAAGGTAAGGAACATGCCTTTTCCAGAGCTGCTGCAAGAGGCAGGAGAAGCAG
GGCTGGTCATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTmTTmTTGGCCCAGAATGAAGTGACCAT
TAGGTTTTGGATTTTGGGCTTTGGTTTTTGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCCCTGGCTG
CATGACTTTGAGCCATCTCCAGAGAAGGAAGTGAAAATTGTGGCTCCCCAGTCGATTGGG
AGATTCCTGGCTTTCCATTAGGGCTGAAAGTACAACGGTTCTTGGTTGGCTTTGCCTCGT
TAACGCACTCTAAAGTTGTAACCAAAATAAATGTCTTACATTACAAAGACGTCTGTTTTG TGTTTCCTTTTGTGTGTTTGGGCTTTTTATGTGTGCTTTATAACTGCTGTGGTGGTGCTG
CAGTACAGCATTTTTCTAACATTTAAAAATAATCACCTAGGGGCTGGAGAGAGGGTTCCAGCAAGAGGATGGCGAGTTTGAAGGTATCTGGGGCTGTACAGCAAGACCGTCGTCCCCAAA
ACGAGATATGATGCCCTCTTCTGGTGTGTCTGAAGACAGCTACAGTGTACTTACATATAA
CATGGGCCGAGGAGGGTCCAGAGAGATAGGCTGGTAAGCTCAGTTTCTCTGTATACCCTT
AGAGATAGATCACCCCCAACAATGGCCACAGCTGGTTTTGTCTGCCCCGAAGGAAACTGA
CGCCACAGATGGACCGGCCACTTACAAGTCGAGGCAGGTGGCAGAGCCTTGCAGAAGCTC
CTCCCTGTGGCATGGCCCTCCTGCTACTGCAGGCTGAGCATTGGATTTCTTTGTGCTTAG AGGACCCAGAGCTGTTTGTGATACCATAAGAGGCTGGGGAGATGATATGGTAAGAGTGCTTTGGCCGCAAGAAGCCTGGCCAGGGAAGGAACTGCCTTTGGCACACCAGCCTATAAGTCA
GGAATTTGGTCAAGCTGGATTCCGCCTTCTGTAGAAGCCCCACTTGTTTCCTTTGTTAAG
CACCTGGGAGGTGCCAGCAGCAATTTGGAAGTTTACTGAGCTTGAGAAGTCTTGGGAGGG
CTTCAGAGGTTTGTGTGGGTGGCTAGCCTCTGCTACATCAGGGCAGGGACACATTTGCCT
GGCTCCTGAGATAAAGTCACCTGGGAGTAAGAAGAGCTGAGACTGGAAGCTGGTTTGATC CAGATGCAAGGCAACCCTAGATTGGGTTTGGGTGGGAACCTGAAGCCAGGAGGAATCCCT TTAGTTCCCCCTTGCCCAGGGTCTGCTCAATGAGCCCAGAGGGTTAGCATTAAAAGAACA
CAGGTGGCACCACTTGCCCTGAGCTTGCACCCTGACCCCAGCTTTGCCTCATTCCTGAGG
CTGGGATTnTTTTTTCCTTTTATGTCATATTGATCCTGACACCATGGAACTTTTGGAGGGCAAGCAGCCCAGCCCTGCCTTTGGGGCAAGTTCTTTTCTCAGCCTGGACCTGTGATAAT GAGGGGGTTGGACGCGCCGCCTTTGGTCGCTTTCAAGTCTAATGAATTCTTATCCCTACC
CTACTCCTTCCACCCAAATGTAAAGCCTGCGTGGGCTAGATAGGGTTTCTGACCCTGACC TGGCCACTGAGTGTGATGTTGGGCTACGTGGTTCTCTTrTGGTACGGTCTTCTTTGTAAA
GTCATATTGTAAAGGGATTTTCTACACAACAGTTTAAGGTCGTTGGAGGAAACTGGGCTT
GCACATGGAGGGGGGGGTAGGGGGGTTGGGGCTGGTGAGTTTGGCGAACTTTCCATGTGA GACTCATCCACAAAGACTGAAAGCCGCGTTTTTTTTTTTAAGAGTTCAGTGACATATTTAGGCATTGTTAATAAAGACAATGAATCTCGAGCAGGAGGCTGTGGTCTTGTTTTGTCAACC
TCCTCTCTCTTGTAAAGCCCCACCCCACTATTTGATTCCCAATTCTAGATCTTCCCTTGT CAAAGCCAAGTACAATTGAGGACCAGTTCATCATTGGGCCAAGCTTTTTCAAAATGTGAA
AGGGGTGTGAAAGCAAGATGATTGGGAGTTCGAGGCCAATCTTGGCTATGAGGCCCTGTC TCAACCTCTCCTCCCTCCCTCCAGGGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTTTTGATTTGAAACTG
GCTTCCATCTTGATTTGTGTATGTGCACACTGGGGGTTGAACCTGGGCCTTTGTACCTGC CGGGCAAGCTCTCTACTGCTCTAAACCCAGCCCTCACTGGCTTTCTGTTTCAACTCCCAA TGAATTCCCCTAAATGAATTATCAATATCATGTCTTTGAAAAATACCATTGAGTGCTGCT GGTGTCCCTGTGGTTCCAGATTCCAGGAAGGACTTTTCAGGGAATCCAGGCATCCTGAAG
TCCACCATCCTTTAGCATGCCCTTGTATTCCCATCACATGCCAGGGATGAGGGGCATCAG
GGTCAGGTTAGAGTTTATTTATGGAAAGTTATATTCTACCTCCATGGGGTCTACAAGGCT
AGAGCCACAGGGTCCCCACTCTCTTTGAAATGACTTGGACTTGTTGCAGGGAAGACAGAG
CCTGTATAAACCCTCTTCCACAGGTTCCCTGAAAGGAGCCCACATTCCCCAACCCTGTCT CCTGACCACTGAGGATGAGAGCACTTGGGCCTTCCCCATTCTTGGAGTGCACCCTGGTTT
TTCTTGTTTTGTTTGTGATTTAATTTAGGTGTATGAGTGCTTTTGCTTGAATATATGCCTGCTAAAGAGACAGGAGACAAAGGAGAGTTTCTTTTAGTCAATAGGACCATGAATGTTCCT
TTTCCCTGAGCAGTCAGGCCAGTCCAAAGCCCTTCAATTTAGCTTTCATAAGGAACACCC CTTTTGTTGGGTGGAGGTAGCACTTGCCTTGAATCCCAGCATTAAGAAGGCAGAGACAGT
CAAAAACGAACAAACAGAAAAACAAGCCAGAGTGTTTGTCCCCGTATTTTATTAATCATA
AGCAAGGAGTATGTGGTGCATAGCAAACGAGGAAGTTTGCACAGAACAACACTGTGTGTA TCCACAGACCCCTCCCCCCTTTTAACATGGGCATCTCTCATTGGCCTGGAGCTTGCCAAC
GGATTCTACTTTCTATTAAAGTATTTCTATTAAATCAATGAGCCCCTGCCCCTGCACTCA
ATACATGGAACCTGGTGTACATGTTATCTGCATGGGGTTTGCATTGCAATGGCTCTTCAG
TCACATTCTCTGTATGCCTAGCAGGGCAGTATTGGAGACTGAGACTTGACTTGTGTGTCC ATATGATTCCTCCTTTTCCTACAGTCATCTGGGGCTCCTGAGCTTCGTCCTTGTCCAAGA
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GGCCCAAAGCTACTT丁AAGAGAGAGAGAGGAATGTATAAGTATTATAATTCCAGGTTATA GTTCATTGCTGTAGAATTGGAGTCTTCATATTCCAGGTAATCTCCCACAGACATGCCACA
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CTTTGGGATTTGAGATGGTCTTTTGCAGAGCTCCTAATGGCTACATGGAGAGAGGGGGCC
CTAGCAAGAAGGCCTTCCCTGGATCACCCACCACCTTGCACCTCCAGAACTCAGAGCCAAformula see original document page 101ACTAGCCTCAGGTAGTTAACCACCGAAAATGAACCAAGGCAGTTCTAATACAAAACCACT
TACTGGGCCTCAGGGGCAGAGACAGGTGGAGCCCTGGAGTTTGAATTCCAGGTTCTGTGA CTGGCCAACACACAGCCATCTCTGCACATCTGTAGTTGCAAGCCTTTTGCACTAAGTTTG
CTCTAATCTCTTGATTTCCTCCCTCTGTCTGTTTCCTTCCTCTTGCTGGGGCCCAGTGGA
GGGGGAAGCTGTCGGCCCAGTGACTTTTTCCCCTTTCTCTTTTTCTTAGAAACCAGTCTC
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CTCTGCCAGCCCCGGTGCCTTTTCCTTTCGGAAAGGAGACCCGGAGGTAAAACGAAGTTG CCAACTTTTGATGATGGTGTGCGCCGGGTGACTCTTTAAAATGTCATCCATACCTGGGAT
CTCCTTAGTCTCCTGGCTACGCTCTTGTCACCCCCACTAAGGCTTCAACTTCTTCTATTT CTTCATCTTGACTCCTCTGTACTTTGCATGCCTTTTCCAGCAAAGGCTTTTCTTTAAATC TCCGTCATTCATAAACTCCCTCTAAATTTCTTCCCCTGCCCTTTTCTTTCTCTCTAGGGA
TTTCCCTCCTGAATCTACCACCTTCTTTCTCCCTTCTCCTGACCTCTAATGTCTTGGTCA AACGATTACAAGGAAGCCAATGAAATTAGCAGTTTGGGGTACCTCAGAGTCAGCAGGGGA
TGGTGGTGCTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGTGTGTGTGATAGTTACTGTCAAAAGTAATTCTATTTATACACCCTTATACATGGTATTGCTTTTGTTG GAGACTCTAAAATCCAGATTATGTATTTAAAAAAAAATTCCCCAGTCCTTAAAAGGTGAA
GTTTAGGGAGGTGGGGATTTGTGGTGTGGAGACAGGCAGCCTCAAGGATGCTTTTCAACA
ACGTGTGC
SEO ID No. 18:人Beer基因组序列（该基因有2个外显子，位于第161-427位 和第3186-5219位）
tagaggagaa gtctttgggg agggtttgct ctgagcacac ccctttccct ccctccgggg 60
ctgagggaaa catgggacca gccctgcccc agcctgtcct cattggctgg catgaagcag 120
agaggggctt taaaaaggcg' accgtgtctc ggctggagac cagagcctgt gctactggaa 180
ggtggcgtgc cctcctctgg ctggtaccat gcagctccca ctggccctgt gtctcgtctg 240
cctgctggta cacacagcct tccgtgtagt ggagggccag gggtggcagg cgttcaagaa 300
tgatgccacg gaaatcatcc ccgagctcgg agagtacccc gagcctccac cggagctgga 360
gaacaacaag accatgaacc gggcggagaa cggagggcgg cctccccacc acccctttga 420
gaccaaaggt atggggtgga ggag卿att cttagtaaaa gatcctgggg aggtttt卿 480
103aacttctctt tgggaggctt ggaagactgg ggtagaccca gtgaagattg ctggcctctg 540 ccagcactgg tcgaggaaca gtcttgcctg gaggtggggg aagaatggct cgctggtgca 600 gccttcaaat tcaggtgcag aggcatgagg caacagacgc仁ggtgagagc ccagggcagg 660 gaggacgctg gggtggtgag ggtatggcat cagggcatca gaacaggctc aggggctcag 720 aaaagaaaag gtttcaaaga atctcctcct: gggaatatag gagccacgtc cagctgctgg 780 taccactggg aagggaacaa ggtaagggag cctcccatcc acagaacagc acctgtgggg 840 caccggacac tctatgctgg仁ggtggctgt ccccaccaca cagacccaca tcatggaatc 900 cccaggaggt gaacccccag ctcgaagggg aagaaacagg ttccaggcac tcagtaactt 960 ggtagtgaga agagctgagg tgtgaacctg gtttgatcca actgcetagat agccctggtg 1020 tgtggggggg tgtgggggac agatctccac aaagcagtgg ggaggaaggc ca'gagaggca 1080 cccctgcagt gtgcattgcc catggcctgc ccagggagct ggcacttgaa ggaatgggag 114 0 ttttcggcac ag仁tttagcc cctgacatgg gtgcagctga gtccaggccc tggaggggag.1200 agcagcatcc tctgtgcagg agtagggaca tctgtcctca gcagccaccc cagtcccaac 1260 cttgcctcat tdcaggggag ggagaaggaa gaggaaccct gggttcctgg tcaggcctgc 1320 acagagaagc ccaggtgaca gtgtgcatct ggctctataa ttggcaggaa tcctgaggcc 1380 atgggggcgt ctgaaatgac acttcagact aagagcttcc ctgtcctctg gccattatcc 1440 aggtggcaga gaagtccact gcccaggctc ctggacccca gccctccccg cctcacaacc 1500 tgttgggact atggggtgct aaaaagggca actgcatggg aggccagcca ggaccctccg 1560tcttcaaaat ggaggacaag ggcgcctccc cccacagctc cccttctagg caaggtcagc 1620
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tggactccca cgagaggcca cagcccctga ggaagccaca tgctcaaaac aaag仁catga 1740
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tccctgggca aatgcccccc tgaccacaca caca仁tccag ccctgcagag gtgaggatgc 1860 aaaccagccc acagaccaga aagcagcccc agacgatggc agtggccaca tctcccctgc 1920 tgtgcttgct cttcagagtg ggggtggggg gtggccttc匕ctgtcccctc tctggtttgg 1980 仁cttaagact a仁ttttcatt ctttcttgtc acattggaac tatccccatg aaacctttgg 2040 gggtggactg gtactcacac gacgaccagc tatttaaaaa gctcccaccc atctaagtcc 2100 accataggag acatggtcaa ggtgtgtgca ggggatcagg ccaggcctcg gagcccaatc 2160 tctgcctgcc cagggagtat caccatgagg cgcccattca gataacacsg aacaagaaat 2220 gtgcccagca gagagccagg tcaatgtttg tggcagctga acctgtaggt tttgggtcag 2280 agctcagggc ccctatggta ggaaagtaac gacagtaaaa agcagccctc agctccatcc 2340
cccagcccag cctcccatgg atgctcgaac gcagagcctc cactcttgcc ggagccaaaa 2400
ggtgctggga ccccagggaa gtggagtccg gagatgcagc ccagcct仁tt gggcaagttc 2460
ttttctctgg ctgggcctca gtattctcat tgataatgag ggggttggac acactgcctt 2520
tgattccttt caagtctaan gaattcctgt cctgatcacc tccccttcag tccctcgcct 2580
ccacagcagc tgccctgatt tattaccttc aattaacctc tactcctttc tccatcccct 2640gtccacccct cccaagtggc tggaaaagga atttgggaga agccagagcc aggcagaagg 2700
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ataagaagac cccagaagag aaa仁gataat aataatacat aacagccgac gctttcagc仁 2820
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gccggaagcc gcggccccgc gcccggagcg ccaaagccaa ccaggccgag ctggagaacg 36 00
cctactagag cccgcccgcg cccctcccca ccggcgggcg ccccggccct gaacccgcgc 3660
cccacatttc tgtcctctgc gcgtggtttg attgtttata tttcattgta aatgcctgca 3720formula see original document page 107formula see original document page 108ctggcataga caacacaaag ccaagtacaa ttcaggacca gc仁cacagga aacttcatct 594 0 仁cttcgaagt gtggatttga tgcctcctgg gtagaaatgt aggatcttca aaagtgggcc 6000 agcctcctgc acttctctca aagtctcgcc tccccaaggt gtcttaatag tgctggatgc 6060 tagctgagtt agcatc仁tca gatgaagagt aaccctaaag ttactcttca gttgccctaa 6120 ggtgggatgg tcaactggaa agctttaaat taagtccagc ctacctt:ggg. ggaacccacc 6180 cccacaaaga aagctgaggt ccctcctga仁gacttgtcag tttaactacc aa仁aacccac 6240 t仁gaattaat catcatcatc aagtctttga taggtgtgag tgggtatcag tggccggtcc 6300 cttcctgggg ctccagcccc cgaggaggcc tcagtgagcc cctgcagaaa atccatgcat 6360 ca仁gagtgtc tcagggccca gaatatgaga gcaggtagga aacagagaca tcttccatcc 6420 ctgagaggca gtgcggtcca gtgggtgggg acacgggctc tgggtcaggt 仁tgtgttgtt 6480 tgtttgt仁tg ttttgagaca gagtctcgct cta仁tgccca ggctggagtg cagtgtcaca 6540 atctcggctt actgcasic仁t ctgcct仁ccc ggattcaagt gattctcctg cctcagcctc 6600 cagagtagct gggattacag gtgcgtgcca ccacgcctgg ctaatttttg tatttttgat 6660 agagacgggg tttcaccatg ttggccaggc tagtctcgaa ctcttgacct caagtgatct 6720 gcctgcctcg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccaccaca cccagcccca 6780 ggttggtgtt tgaatctgag gagactgaag caccaagggg ttaaatgttt tgcccacagc 6840 catacttggg ctcagttcct tgccctaccc ctcacttgag ctgcttagaa cctggtgggc 6900 acatgggcaa taaccaggtc acactgttt仁gtaccaagtg ttatgggaat ccaagatagg 6960agtaatttgc tctgtggagg gga仁gaggga tagtggttag ggaaagcttc acaaagtggg 702 0 tgttgcttag agattttcca ggtggagaag ggggc:ttcta ggcagaaggc atagcccaag 7080 caaagactgc aagtgcatgg ctgctcatgg gtagaagaga atccaccatt cctcaacatg 714 0 仁accgagtcc ttgccatgtg caaggcaaca tgggggtacc aggaattcca agcaatgtcc 7200 aaacctaggg tctgctttct gggacctgaa gatacaggat ggatcagccc aggctgcaat 7260 cccattacca cgagggggaa aaaaacc仁ga aggctaaatt gtaggtcggg ttagaggtta 7320 仁ttatggaaa gttatattct acctacatgg gg仁ctataag cctggcgcca atcagaaaag 7380 gaacaaacaa cagacctagc tgggaggggc agcattttgt tgtagggggc ggggcacatg 744 0 ttctgggggt acagccagac tcagggcttg tattaatagt ctgagagtaa gacagacaga 7500 ggga仁agaag gaaataggtc cctttctctc tctctctctc tctctctctc actctctctc 7560 tctctcacac acacacacag acacacacac acgctctgta ggggtctact tatgctccas 7620 gtacaaatca ggccacattt acacaaggag gtaaaggaaa agaacgttgg aggagccaca 7680 ggaccccaaa attccctgtt ttccttgaat caggcaggac ttacgcagct gggagggtgg 7740 agagcctgca gaagccacct gcgagtaagc caagttcaga gtcacagaca ccaaaagctg 7800 gtgccatgtc ccacacccgc ccacctccca cctgctcctt gacacagccc tgtgctccac 7860 aacccggctc ccagatcatt gattatagct ctggggcctg caccgtcctt cctgccacat 7920 ccccacccca ttcttggaac ctgccctctg tcttctccct tgtccaaggg caggcaaggg 7980 ctcagctatt gggcagcttt gaccaacagc tgaggc仁cct tttgtggctg gagatgcagg 8040aggcagggga atattcctct tagtcaatgc gaccatgtgc ctggtttgcc cagggtggtc 8100 tcgtttacac ctgtaggcca agcgtaatta ttaacagctc ccacttc仁ac tctaaaaaat 8160
gacccaatct gggcagtaaa ttatatggtg cccatgctat: taagagctgc aact仁gctgg 8220
gcgtggtggc tcacacctgt aatcccagta ctt:tgggacg tcaaggcggg tggatcacct 8280 gaggtcacga gttagagact ggcctggcca gcatggcaaa accccatctt tactaaaaat 8340
acaaaaatta gcaaggcatg gtggcatgca cc仁gtaatcc caggtactcg ggaggctgag 8400 acaggagaat ggcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccaagat tgtgccactg 8460 ccctccagcc ctggcaacag agcaagac仁t catctcaaaa gaaaaaggat actgtcaatc 8520 actgcaggaa gaacccaggt aatgaatgag gagaagagag gggctgagtc accatagtgg 8580 cagcaccgac tcctgcagga aaggcgagac actgggtcat gggtactgaa gggtgccctg 864 0 aatgacgttc tgctttagag accgaacctg agccctgaaa gtgcatgcct gttcatgggt 8700 gagagactaa attcatcatt ccttggcagg tactgaatcc tttcttacgg ctgccctcca 8760 atgcccaatt tccctacaat tgtctggggt gcctaagctt ctgcccacca agagggccag 8820 agctggcagc gagcagctgc aggtaggaga gataggtacc cataagggag gtgggaaaga 8880 gagatggaag gagaggggtg cagagcacac acctcccctg cctgacaact tcctgagggc 8940 tggtcatgcc agcagattta aggcggaggc aggggagatg gggcgggaga ggaagtgaaa 9000
aaggagaggg tggggatgga gaggaagaga gggtgatcat tcattcattc cattgc仁act 9060
gactggatgc cagctgtgag ccaggcacca ccctagctct gggcatgtgg ttgtaatctt 9120
111ggagcctcat ggagctcaca gggagtgctg gcaaggagat ggataatgga cggataacaa 9180
ataaacattt agtacaatgt ccgggaatgg aaagttctcg aaagaaaaat aaagctggtg 9240
agcatataga cagccctgaa ggcggccagg ccaggcattt ctgaggaggt ggcatttgag 9300
c 9301
从前面的描述，应该理解，尽管为了说明的目的本文描述了本发明的 具体实施方案，但可以进行各种修改而不偏离本发明的精神和范畴。因 此，本发明仅受附及权利要求的限制。序列表
<110> Brun)cow, Mary E. Galas, David J. Kovacevich, Brian Mulligan, John T. Paeper, Bryan W. Van Ness, Jeffrey Winkler, David G.
<120>增加骨矿化的组合物和方法
<130> 240083.508
<140> US
<141> 1999-11-24
<160> 41
<170> FastSEQ for Windows Version 3.0
<210> 1 <211> 2301 <212> DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>
agagcctgtg ctectggaag gtggcgtgcc ctcctctggc tggtaccatg cagctcccac 60
tggccctgtg tctcgtctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggccagg 120
ggtggcaggc gttcaagaat gatgccacgg aaatcatccc cgagctcgga gagtaccccg 180
agcctccacc ggagctggag ccatgaaccg ggcggagasc ggagggcggc 240
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tcacccgcta cgtgaccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc ca仁cggccgc ggcasgtggt 420
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agctgctgtg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540
gcasgtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600
aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccaaagcca "0
3cc3ggccg3 gctggagaac gcctac亡aga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720
gccccggccc tgaacccgcg ccccacattt ctgtcctctg cgcgtggttt gattgt仁tat 780
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atcccgggcg ccggcsaggc ccccctcagc ccgccagctg 3ggggtccc3 cggggcsggg 900
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cccttgcscc tcgctgccca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140
caactgtaga tgtggtttct agtcctggct ctgccactaa cttgctgtgt aaccttgaac 1200
tccttcggga cctca3cttc cactttgtaa aatgagggtg gaggtgggaa 1260
taggatc仁cg aggagactat tggcata仁ga tcccaaggac t:ccagtgcct tttgaatggg 1320
cagaggtgag agagagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380
caaggtcact tccagaattc etgagtt:gt:ga tgctctcttc tgacagccaa agatgaaaaa 1440
aagagtctat ttatggctga catatttacg gctgacaaac 1500
tcctggaaga a。ctatgctg ct仁cccagcc tggcttcccc ggatgtttgg Ct3CCtCC改C 1560
ccctccatct caaagaaa仁a ttggggtaga aaaggagagg gtccgagggt 1620
ggtgggaggg catqcgcccc agagcagcat ccctcccccg 1680
accc3t3gcc gtcacc仁tcc gaaaggttca aggacactgg 1740
ccttgcaggc ccgagggagc aactcacaga ccagcacatc cct仁ttgaga 1800
caccgccttc tgcccacceic tcacggacac atttctgcct agaaaacagc ttcttactgc I860
tcttacatgt gatggcatat ttgggggaaa aactacaag仁 1920
gctgtacata tgctgagaaa ctgcagagca taatagctgc tctttttgaa 1980
3atcatttcc agacaacctc ttactttctg tgtagttttt aattgttaaa 2040
agcacatgac ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100
ttccacgtgg g3cttgtcc3 agtagtggtt tttaaagagt 2160
atttattttc tcacttaagt tatttatgca aaagtttttc ttgtagagaa tgacaatgtt 2220
aatattgctt tatgaa仁taa cagtctgttc ttccagagtc cagagacatt gttaataaag 2280
acaatgaatc g 2301
<210> 2 <211> 213<212> PRT <213:>人
<400> 2 Met Gin Levi Pro
Ala Phe
Ala Thr
Glu Leu
50
Pro Pro
65
Arg Glu
Ala Lys
Arg Leu
Gly Pro 130 Gin Leu 145
Leu Val
Ser Glu
Arg Lys
Leu Glu 210
Arg Val
20 Glu lie 35
Glu Asn His His
!Leu His
Pro Val 100 Leu Pro 115
Asp Phe
Leu Ala 5
Val Glu
lie Pro
Asn Lys
Pro Phe
70 Phe Thr 85
Thr Glu Asn Ala
Leu Cys
Gly Gin
Glu Leu
Thr Met 55
Glu Thr
Arg Tyr Leu Val
Leu Val
10 Gly Trp
25
Gly Glu
Asn Arg
!Lys Asp
Val Thr
90 Cys Ser 105
Arg Gly
Cys L«eu Leu Val His Thr 15
Gin Ala Phe
Tyr Pro Glu 45
Ala Glu Asn 60
Val Ser Glu
75
Asp Gly Pro Gly Gin Cys
lie Gly 120
Arg Cys 工le Pro Asp Arg 135
Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro ISO
Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu 165 170 Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala
180 185 Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala 195 200 205
Asn Ala Tyr
Lys
30 Pro
Asn
Asp
Pro Pro
Gly Gly Arg Tyr Ssr
Lys Trp Trp 125
Tyr Arg Ala
140 Arg Ala Arg 155
Thr Arg Phe Ala Arg Pro Lys Ala Asn
Cys
Gly 110 Arg
95 Pro
Cys 80 Ser
Ala
Pro Ser
Gin Arg Val
Lys Val Arg 160 Asn Gin 175
Lys Gly
His Gin Gin
Ala Glu
:210> 3 :211> 2301 c212> DNAformula see original document page 116aatcatttcc ttsctttctg tgtagttttt 2040
tttaaac3g3 agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100
ttccacgtgg gacttgtcca caagaa仁gaa agtagtggtt tttaaagagt 2160
3tttattttc tcacttaagt t3tttatgca aaagtttttc ttgtagagaa tgacaatgtt 2220
cagtctgttc ttccagagtc cagagacatt g仁taataaag 2280
g 2301
<210> 4 <211> 23 <212> PRT <213>人
Met
<400> Gln !Leu
4
Pro
Leu
Ala Phe Arg Val Val 20
Ala Leu Cys Leu Val Cys 10
Glu Gly
Leu Leu Val His Thr 15
<210> 5 <211> 2301 <212> DNA <213>人
<400> 5
agagcctgtg ctactggaag gtggcgtgcc ctcctctggc tggtaccatg cagctcccac 60
tggccctgtg tctcatctgc ctgctggtac ccgtgtagtg gagggccagg 120
ggtggcsggc gttcaagaat gatgccacgg aaatcatccg cgagctcgga gag仁accccg 180
agcctccacc ggagctggag ccatgaaccg ggcggagaac ggagggcggc 240
CtCCCC3CC3 cccctttgag tgtccgagta cagctgccgc gagctgcact 300
tcacccgcta cgtgsiccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360
gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420
ggcgacctag tgggcccgac ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480
agctgctgtg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540
gcaagtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600
aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccsaagcca 660
accaggccga gctggagaac gcc仁actaga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720
117gccccggccc tgaacccgcg ccccacattt ctgtcctctg cgcgtggt亡t gattgtttat 780
atttcattgt 3a3tgcctgc aacccagggc 3gggggc仁ga gaccttccag gccctgagga 840
atcccgggcg ccggcaaggc ccccc仁cagc ccgccagctg aggggtccca cggggcaggg 900
gagggaattg agagtcacag acactgagcc 3cgc3gcccc gcctctgggg ccgcctacct 960
ttgctggtcc cacttcagag gaggcagaaa tggaagcatt ttcaccgccc tggggt仁tta 1020
agggagcggt gtgggagtgg gaa3gtcc3g ggactggtt3 agaaagttgg 1080
cccttgcacc tcgctgccca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140
caactgtaga tgtggtttct agtcctggct ctgccsct 33 cttgctgtgt 1200
tacacaattc tccttcggga CCtC33tttC cactttgt33 aatgagggtg gaggtgggaa 1260
taggatctcg tggcatatga tccagtgcct tttgastggg 1320
cagaggtgag 3gagagagag agaaagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380
caaggtcact tccagaattc agagttgtga tgctctcttc tgacagccaa 1440
aagagtctat ttatggctga catatttacg gctgacaaac 1500
tcctggaaga agctstgctg cttcccagcc tggcttcccc ggatgtttgg cteicctccac 1560
ccctccatct acattatcca ttggggtaga gtccgagggt 1620
ggtgggaggg catccgcccc 33cttccca3 agagcagcat ccctcccccg 1680
atgttttaaa gtcaccttcc gaagagaagt gaaaggttca aggacactgg 1740
ccttgcaggc ccgagggsgc agccatcaca aactcacaga ccsgcacatc ccttttgaga 1800
caccgccttc tgcccaccac tdacggacac atttctgcct agaaaacagc ttcttactgc I860
tcttacatgt gatggcatat cttacactaa ttgggggaaa aactacaagt 1920
gctgtacata tgctgagaas ctgcagagca taatagctgc tctttt仁gaa 1980
3atC3tttCC ageicaacctc ttactttctg tgtagttttt 2040
tttaaacaga agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100
仁tccacgtgg gacttgtcca caagaatgaa agtagtggtt tttaaagagt taagttacat 2160
3ttt3ttttC tcsct:taagt tatttatgca aaagtttttc ttgtagagaa 2220
tatgaattaa ceigtctgttc ttccagsigtc cagagacatt gttaataaag 2280
3C33tg3atC atgaccgaaa g 2301
<210> 6
<211> 213
<212> PRT <213>人
<400> 6
Met Gin Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu lie Cys Leu Leu Val His Thr 15 10 15Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp
Ala Thr
Glu
Pro
65
Arg
Leu
50
Pro
Glu
35
Glu
20 lie
lie
Asn Asn
His His Pro
Glu Leu His
Ala Lys Pro
Arg Leu
Gly
Gin 145 Leu
Pro 130 Leu
Leu
115 Asp
Val 100 Pro
Phe
85
Thr
Arg
Lys
Phe
70
Thr
Glu
Thr 55 Glu
Leu 40
Met
Thr Lys Asp
Arg Tyr Val
25
Gly Glu Tyr Pro
Asn Arg Ala Glu 60 Ser
Glu Leu Val
Asn Ala lie
Phe Arg Cys
ljeu Cys Pro
Val Ala Ser
Ser Glu Leu
Arg Lys
Lieu
Glu 210
Pro 195 Asn
Lys 180 Arg
Cys 165 Asp
Gly 150 Lys
工le 135 Gly
Gly
120 Pro
Cys 105 Arg
Thr 90 Ser
Val
75 Asp
Asp Arg Tyr
Glu Ala Pro
Cys Gly Pro Arg Ala
Lys Arg
Thr
Arg 200
Glu 185
Ser
!>eu 170 Ala
Arg 155 Thr
Arg 140 Ala
Arg Ala Lys Ala
Ala
Glu
45
Asn
Gly Gin Cys Gly Lys Trp
Trp
125 Ala
30 Pro
Pro Pro
Gly Gly Arg
Glu Tyr Ser
Gly Pro Cys
Gly 110 Arg
Arg
95
Pro
Cys
80
Ser
Ma
Pro Ser
Gin Arg Val Arg Lys Val
Phe His
Pro
Asn 205
Gin Gin
Asn 175 Lys
Arg 160 Gin
Gly
Ala Glu
<210:
<212: <213:
Ala Tyr
7
2301
DNA
人
<400> 7
agagcctgtg ctactggaag gtggcgtgcc ctcctctggc tggtaccatg cagctcccac 60
tggccctgtg tctcgtctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggccagg 120
ggtggcaggc g仁tcaagaat gatgccacgg aaatcatccg cgagctcgga gagtaccccg 180agcctccacc ggagctggag ccatg33ccg ggcggagaac ggagggcggc 240
CtCCCC3CC3 cccctt仁gag accaaagacg tgtccgagta cagctgccgc gagctgcact 300
tcacccgcta cgtgaccgat .gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360
gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420
ggcgacctag 仁gggcccgac ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480
agctgctgtg tcccggtggt gsggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540
gcaagtgcaa gcgcctcacc CgCttCC3C3 accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600
aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccaaagcca 660
accaggccga gctggagaac gcctactaga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720
gccccggccc tgaacccgcg ccccacsttt ctgtcctctg cgcgtggttt gattgtttat 780
的cccagggc agggggctga gaccttccag gccctgagga 840
atcccgggcg ccggcei6iggc ccccctcagc ccgccsgctg aggggtccca cggggcaggg 900
gagggaattg agagtcacag acactgagcc acgcagcccc gcctctgggg ccgcctacct 960
ttgctggtcc cacttcagag gaggcagaaa tggaagcatt t仁caccgccc tggggtttta 1020
agggagcggt gaaagtccag ggactgg仁ta agaaagttgg 1080
cccttgcacc tcgc仁gccca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140
仁gtggtttct agtcc仁ggct c仁gccactaa cttgctgtgt 3accttgaac 1200
tccttcggga cctcaatttc cactttgtaa aatgagggtg gaggtgggaa 1260
tagga仁ctcg ag.gagactat tggcatatga ttccaaggac tccagtgcct tttgaatggg 1320
cagaggtgag agagagagag agaaagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380
caaggtcact 仁ccagaattc agagttgtga tgctctcttc tgacagccaa agatgaaaaa 1440
aagagtctat ttatggctga C3tatttacg gctgacaaac 1500
tcctggaaga agctatgctg cttcccagcc tggcttcccc ggatgtttgg ctacctccac 1560
ccctccatct ac3tcatcc3 ttggggtaga aaaggagagg gtccgagggt 1620
ggtgggaggg 3tagaa3tC3 catccgcccc 3acttccc3a agagcagcat ccctcccccg 1680
acccatagcc gtcaccttcc gaagagaagt gaaaggttca aggacactgg 1740
ccttgcaggc agccatcaca aactcacaga ccttttgaga 1800
caccgccttc tgcccaccac tcacggacac atttctgcct ttcttactgc 1860
tcttacatgt gatggcata仁 cttacact33 ttgggggaaa 1920
gctgtacata tgctgagaaa ctgcagagca taatagctgc tctttttgaa 1980
aatcatttcc agacaacctc ttactttctg tgtagttttt aattgttaaa 2040
agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100
ttccacgtgg gacttgtcca caagaatgaa 3gtagtggtt tttaaagagt taagttacat 2160
3ttt3ttttC tcacttaagt tatttatgca aaagtttttc ttgtsgagaa tgacaatgtt 2220
tatgaattaa cagtctg仁tc ttccagagtc cagagacatt gttaataaag 2280
atgaccgaaa g 2301formula see original document page 121<210> 9 <211> 642 <212> DNA
<213> Cercopithecus pygerythrus
<400> 9
atgcagctcc cactggccct gtgtcttgtc tgcctgctgg tacacgcagc cttccgtgta 60
gtggagggcc aggggtggca ggccttcaag aatgatgcca ccccgagctc 120
ggagagtacc ccgagcctcc accggagctg gagaacaaca agacc3tgaa ccgggcggag 180
aatggagggc ggcctcccca CC3CCCCttt gagaccaaag acgtgtccga gtacagctgc 240
cgagagctgc acttc3cccg ctacgtgacc gatgggccgt gccgcagcgc caagccagtc 300
accgsgttgg tgtgctccgg ccagtgcggc ccggcacgcc tgctgcccaa cgccatcggc 360
cgcggcaagc ggtggcgccc gagtgggccc gact仁ccgct gcatccccga ccgctaccgc 420
gcgcagcgtg 亡gcagctgct g仁gtcccggt gg亡gccgcgc cgcgcgcgcg csaggtgcgc 480
ctggtggcct cgtgcaagtg caagcgcctc 3cccgcttcc 3C33CC3gtC ggagctcaag 54 0
gacttcggtc ccgaggccgc tcggccgcag aagggccgga agccgcggcc ccgcgcccgg 600
ggggccaaag ccaatcaggc cgagctggag 3acgcct3ct 642
<210> 10 <211> 213 <212> PRT
<213.> Cercopithecus pygery仁hrus
<400> Met Gin JLeu
Ala Phe Arg
Ala Thr Glu 35
Glu L>eu Glu 50
Pro Pro His 65
Arg Glu ljeu
10 Pro
Val
20
lie
Leu Ala 5
Val Glu
Leu
Gly.
lie Pro Glu
Asn Asn Lys
His
His
Pro Phe
70 Phe Thr
Thr
55
Glu
Arg
Cys Leu Val 10
Gin Gly.'Trp 25
Leu Gly Glu 40
Met Asn Arg Thr Lys Asp Tyr Val Thr
85 90
Cys Leu Leu Val His Ala 15
Gin Ala Phe' Lys Asn Asp 30
Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 45
Ala Glu Asn Gly Gly Arg 60
Val Ser Glu Tyr Ser Cys 75 80 Asp Gly Pro Cys Arg Ser 95formula see original document page 123<211> <212> <213>
<400> Met Gin Pro
Ala Phe Cys
211 PRT
台湾鼷鼠
Ala Thr
Glu Asn
50 His His 65
JLeu His
Glu
35
Asn
12 Ser
Ala
20
Val
Leu
5 Val
lie Pro
Ala Pro Cys Leu 工le Cys Leu Leu Val His Ala
Glu Gly Gin Gly
Gin Thr Met
Pro Tyx Asp
Tyr Thr
Pro Val Thr
Leu Pro
Asp Phe 130 L»eu Cys 145
Ala Ser
Leu Lys
Pro Arg
Asn Ala 210
115 Arg
Glu 100 Ala
Arg
85
Leu
Ala 70 Phe
Asn
Lys
LGly
25
Gly
10
Trp
Glu
Ala Glu
Asp Val Ser
Leu Thr Asp Val Cys Ser
lie Gly Arg Cys lie Pro
Pro Gly Cys
Liys
Asp
Pro 195 Tyr
Gly Ala 150 Cys Lys 165
Gly Pro
Asp Ala
Val 120 Arg
Gly 105 Lys
Gly
90
Gin
Trp
Tyr Arg
Pro Arg Ser
Arg Leu Thr
Phe 180
Gly Ala Arg
Glu Thr
Gly Ala
200
Ala 185 Lys
Arg 170
Ala
Gin Ala Phe
Tyr Pro Glu 45
Asn Gly Gly 60
Glu Tyr Ser
75
Pro Cys Arg
Cys Gly Pro
Trp Arg Pro 125
Ala Gin Arg
140 Arg Lys Val 155
Phe His Asn Pro Gin Lys
Asn Gin Ala
205
Arg
30
Pro
15
Asp
Pro Pro
Arg Pro Pro
Cys Arg
Ser
Ala 110 Asn
Ala Arg
Glu
80
Lys
L»eu
Gly Pro
Val Gin !Leu
Arg Leu
Gin
Gly 190 Glu
Ser 175 Arg
Val Glu Lys
Leu Glu
<210> 13 <211> 674
124formula see original document page 125Arg Leu
Leu 115 Asp
Gly Pro 130 Gin !Leu 145
Leu Val Ala Ser
100
Pro Asn Ala Phe Arg Cys
Leu
Leu Cys Pro
Cys 165 Asp
Gly 150 Lys
Phe
Ser Glu Leu Lys 180
Arg Pro Arg
Arg Lys
Glu 210
Pro 195 Asn
Ala Tyr
lie Gly 120
工le Pro Asp Arg 135
Gly Ala Ala Pro
105
Arg Val L>ys Trp
Cys Liys Gly Pro
Ala Arg
200
Arg
Glu 185 Gly
Leu 170 Thr
Ala
Trp 125 Ala
110 Arg
Ala Arg Lys Ala
Pro
Asn 205
Pro Asn
Gin Arg Val
Tyr Arg 140
Arg Ser Arg Lys Val 155
Thr Arg Phe His
Asn 175
Arg 160 Gin
Gly
Gin 190
Gin Ala Glu
:210: :211: :212: :213:
15 532 DNA Bos
torus
tgaacaacaa agaccaaaga atgggccgtg cggcgcgcct acttccgctg gcgcggcgcc ctcgcttccs cgggccggaa
15
cgcctccgag ccgcagcgcc gctgcccaac catccccgac gcgcgcgcgc caaccsgtcc gctgcggccc
atccccgagc cgggcggaga tacagctgcc aagccggtca gccatcggcc cgctaccgcg aaggtgcgcc gsgctcaagg cgcgcccggg
tgggcgagta ccccgagcc仁 ctgccagagc 60
acggagggag 3CCtCCCC3C cscccctttg 120
gggagctgca cttcacccgc taicgtgeiccg 180
ccgagctggt gtgctcgggc cagtgcggcc 240
gcggcaagtg gtggcgccca agcgggcccg 300
cgcagcgggt gcagctgttg tgtcctggcg 360
tggtggcctc gtgcaagtgc aagcgcctca 420
acttcgggcc cgaggccgcg cggccgcaaa 480
gcaccaaagc cagccgggcc ga 532
<210> 16 <211> 176 <212> PRT <213> Bos torusAsn
<400> 16 Asp Ala Thr
Levi Pro
Arg Pro
Cys Arg 50
Ser Ala 65 Ala
Glu Leu
20 Pro His 35
Glu Leu
Glu lie lie Pro
Asn Asn Lys Thr
His Pro
His Phe
Lys Pro Val
Arg Leu Leu
Thr 70 Asn
Phe Glu
40 Thr Arg 55
Glu Leu Ala lie
Ser Gly
Val Gin
Arg
Gin 145 Gly
Leu 130 Ser
Pro Asp 100 L»eu Leu 115
Val Ala
Pro 85
Phe Arg Cys lie Cys Pro
Glu Leu 10
Met Asn 25
Thr Lys
Tyr Val
Val Cys
Gly Arg
Pro Asp 105
Ala Ala
Ser Cys
Glu Leu Lys
Arg Lys Leu
Asp 150 Arg Pro 165
Gly Gly 120 Lys Cys 135
Phe Gly Pro Glu
Gly Glu
Arg Ala
Asp Ala
Thr Asp
60 Ser Gly 75
Gly Lys Arg Tyr Pro Arg
Lys Arg
Leu Thr 140 Ala Ala 155
Arg Ala Arg Gly Thr Lys
Tyx Pro Glu 15
Glu Asn Gly 3 0
Ser Glu Tyr 45
Gly Pro Cys Gin Cys Gly
Trp Trp Arg
95
Arg Ala Gin
110 Ala Arg Lys 125
Arg Phe His Arg Pro Gin Ala Ser Arg
Pro
Gly
Ser
Arg
Pro
80
Pro
Arg
Val
Asn
Thr
Ala
170 175
<210》17 <211> 35828 <212> DNA <213>台湾鼷鼠
<220:>
<22^其它特征
<222> (1)…（35828)
<223> n = A,T,C or G
<400> 17cgcgttttgg tattgcgctt cgatgagcct tggcgttgag 60
ctgctgcaca gaccgagctg gaccagcgca ttcgtgacac cgtctcct仁c 120
gaacttattc gcaatggagt g仁cattcatc aaggacngcc tggtgcta仁c 180
cacgcagcgg ccctcagccg gtgaccaata tct3C3acat cagccttggt 240
atcc仁gcgtg 3tg3gcc3gc gtsaccg仁ca gtgccgataa gt仁caaagtt 300
aaacctggtg ttga仁accaa cattgaaacg acgcgctgaa aaacgctgct 360
gaatgtgcgg cgctggatgt a亡ggcagcag gatggatgaa 420
ctggcttcct 3tgtccgcac ggccatcatg atggaatg亡t tccccggt:gg tgt tatctgg 480
cagcagtgcc gtcgatagta tgcaattgat 3tttgcgggt cctttccggc 540
gatccgcctt gttacggggc ggcgacctcg cgggttttcg ctatttatga aaattttccg GOO
gtttaaggcg tttccg仁tct tcttcgtcat ttttatttaa 33t3CCCtCt "0
gaaaagaaag gaaacgacag g仁gctgaaag cgagctt仁tt ggcctctgtc gtttcctttc 720
tctg仁ttttg tccgtggaa仁 gaacaatgga aagcagagct tatcgatgat 780
aagcggtca3 tcgcggccgc gatcgacgcc 840
tactccccgc gcatgaagcg actccgcstg cccagagacg CCCCCC33CC 900
cccaaagtgc ctgacctcag cctctaccag ctctggcttg ggcttgggcg gggtcaaggc 960
taccscgttc tcttaacagg tggctgggct gtctcttggc cgcgcgtcat gtgacagctg 1020
cctagttctg cagtgaggtc accgtggaat gtctgccttc gt仁gccatgg caacgggatg 1080
acgttacaat ctgggtgtgg agctt:ttcct gtccgtgtca ggaaatccaa at3CCCt333 1140
ataccc仁aga gctgagccaa ggctttcctg gcttctccag ataaag仁ttg 1200
acttagatgg aatgataaag acccgagcca tctgaaaatt CCtCCt33tt 1260
gcaccactag gaaatgtgta tattattgag ctcgtatgtg ttcttatttt 1320
ctt仁3gtcat gttattaata agaatttctc agcagtggga gagaaccaat 1380
agataaaagt tggcatgatc cacattgcag gaagatccac gttgggtttt catgaatgtg 1440
aagsccccst ttattaaagt cctasgctct gtttttgcac actaggaagc gatggccggg 1500
atggctgagg ggctgtaagg gtcttacatg tgtgtttcct gtcctgcacc 1560
taggacctgc tgcctagcct gcagcagagc cagaggggtt agtctcaigac "20
acttgggggc tsctgcatcg cttatttcc3 tacggagcac ctactatgtg 1680
tatggtgttc actcttcaga acggtggtgg tceitcatggt gcatttgctg 1740
acggttggat tggtggtsga gagctgagat atatggacgc actcttcagc attctgtcaa 1800
cgtggctgtg cattcttgct cctgsgcaeig gactC3cagg gtcagcctcc 1860
agctcagtcg ctgcatagtc ttagggaacc tctcccagtc ctccctacct 1920
agaagccagg gggcctggcg gtctcaggag cctgcttgct gggggacagg ttgttgagtt 1980
ttatctgcag taggttgcct aggcatagtg tcaggactga tggctgcctt 2040
tcctttgccc tctatgcaaa tctgaccttg ac3tgggggc gctgctcagc tgggaggatc 2100
ctaaagccaa tcttcgtcca cctgaaactc ctggaccaag 2160gggcttccgg C3C3仁CCtCt caggccagtg agggagtctg tgtgagctgc actttccaat 2220
ctcagggcgt gsgaggcaga gggaggtggg ggcagagcct tgcagctctt tcc仁cccatc 2280
tggacagcgc tctggctcag cagcccatat gagcacaggc 3C3tCCCC3C CCC3CCCCC3 2340
cctttcctgt cctgcagaat ttaggctctg ttcacggggg gggggggggg ggggcagtcc 2400
t3tcctctct: taggtagaca ggactctgca ggagacactg tactgcagtt 2460
tgt仁gtgagg ggaaagcgaa gggcctcttt gaccattcag 仁caaggtacc 2520
ttc仁3actcc catcgtatcg gggggctact ctagtgctag acattgcaga gagcctcaga 2580
actg亡agtta ccagtgtggt aggattgatc cttcagggag cc仁gacatgt gacagttcca 2640
ttCttC3CCC agtcaccgaa gtacctaccc cgtaacaggc accgtagcag 2700
gtactgaggg acggaccact caaagaactg acagaccgaa gccttggaat 2760
aagcatcagg ctctgccaac agaacactct ggccctttaa C3ctc3ggsc 2820
ccccaiccccc gttggcactg Ct3tCC3C3t 2880
ggcacaggac gatataagtg gcttgcttaa gcttgtctgc atggtaastg gcagggctgg 2940
attgagaccc agacattcca ac仁ctagggt Ct3仁ttt仁Ct 仁tt仁tct:cgt tgttcgaatc 3000
tggg亡cttac tgggtaaact caggctagcc 3tcct tctcc cstggcttac 3060
gagtgctagg attccaggtg tgtgctacca tgtctgactc cctgtsgctt gtctatacca 3120
tcctcac33C ataggaattg tgatagcagc 3C3C3C3CCg gaaggagctg gggaaatccc 3180
acagagggct ccgcaggatg acaggcgaat gcctac3C3g aaggtgggga agggaagcag 3240
atgggcgtgg ctatttgggg aagctgccgg 仁aaccgtata 3300
tggctgggg仁 gtcatgagat gaggcaggaa gagccacsgc aggcagcggg 3360
tacgggctcc ttattgccsa gaggctcggei tcttcctcct cttcctcctt ccggggctgc 3420
ctgttca亡tt tccaccactg cctcccatcc aggtctg仁gg c仁caggacat cacccagct:g 3480
cagaaactgg gcatcaccca cgtcctgaat gctgccgagg gc3ggtcctt catgcacg仁c 3540
aacaccagtg ctagcttcta cgaggattct ggcatcacct acttgggcat caaggccaat 3600
gatacgcagg agttcaacct cagtgcttac tttgaaaggg ccacaga仁仁t cattgaccag 3660
gcgctggccc ataaaaatgg taaggaacgt acattccggc acccatggag cgt:aagccct 3720
ctgggacctg cttcctccsa agaggccccc acttgaaaaa ggttccagaa agatcccaaa 3780
atatgccacc aactagggat taagtgtcct acatgtgagc cgatgggggc csctgcatat 3840
agtctgtgcc atagacatga caatggataa gacagagagc 3ggagttagg 3900
tagctgtgct cctttccctt taattgagtg tgcccatttt tttattcatg tatgtgtata 3960
catgtgtgtg cacacatgcc ataggttgat actgaacacc gtcttcaatc gttccccacc 4020
CC3CCtt3tt ttttgaggca gggtctcttc cctgatcctg gggctcattg gtttatctag 4080
gctgctggcc agtgagctct ggsgttctgc ttttctctac ctccctagcc ctgggactgc 4140
aggggcatg仁 gctgggccag gcttttatgt cgcgt:tgggg sggtccctag 4200
gcctgagcac cgtaaagact ctgcceicatc cccagcctgt ttgagcaagt gaaccattcc 4260
ccagaattcc cccagtgggg CtttCCt3CC cttttattgg ctaggcattc atgagtggtc 4320acctcgccag aggaatgagt ggccacgac仁 ggctcagggt cagcagccta gagatactgg 4380
gttaagtc仁t cctgccgctc gctccctgca gccgcagaca gaaagtagga ctgaatgaga 4440
gctggctagt ggtcagacag gacagaaggc tgagagggtc acagggcaga tgtcagcaga 4500
gcagacaggt tctccctctg tgggggaggg gtggcccact ttggccttct 4560
ttgtgctcca 仁agaggcttc ctgggtacac agcagcttcc ctgtcctggt ga仁仁cccaaa 4620
gag33ctccc taccactgga cttacagaag ttctattgac tggtgt:aacg gttcaacagc 4680
tttggctctt ggtggacggt gcatactgct gta仁cagctc aagagctcat tcacgaatga 4740
3C3C3C3C3C 3C3CdC3C3C 4800
gct:cagtg3C tgggcatttc tg3ac3亡ccc tgaagttagc 3C3C3仁t仁CC ctc仁ggtgtt 4860
cctggcttaa caccttctais tatctttgct gccctgttac 4920
gcccct:aggg ccactt:ccct: 仁cgcacctac ggtttctctc ctgcagctct 4980
ccctctgcct ctgagccatg ggaacagccc aataactgag 5040
aaacgtctc仁 agccaaaact tcagct3aat aatcctactg gttg仁ggaat 5100
ccttaagatt cttcatgacc tccttcac3t ggcacgagta 5160
ttattgatca a3Ct33CtC3 gttgtctt cc acctgctcaa ggaaggaaca 5220
aaattca仁cc ttaactgat:c tgtgcacctt gcacaatcca ttaagagtac 5280
taagattttg gttgtgagag cagaatgtac agct仁tgaca aggtgcatcc 5340
ttgggatgcc g3agtg3cct gctgttccag CCCCCt3CCt tctgaggctg tt t: tggaagc 5400
aatgctctgg aagcaacttt atgctggaac agcgggtcac ttcagcatcc 5460
cga仁gacgaa 仁cccgtcaaa gctgtacatt c仁g仁aacaga ctgggaaagc tgcagacttt 5520
aaggccaggg ccctatggtc cctcttaatc cctgtcacaic ccaacccgag cccttctcct 5580
ccagccgttc tgtgcttctc gatggagaac acggccttgc tagttaaagg 5640
cacccttctc acstggcagt ggttggtcat cctcattcag ggaactctgg 5700
ggcattc仁gc Cttt3CttCC tctttttgga ctacagggaa tatatgctga cttgttttga 5760
ccttgtgtat gatctttggt ctggaatgtt tcctgctagt ttttCCCC3t 5820
cctttggcsa accctatct3 t3tctt3cca c仁aggcatag tggccctcgt tctggagcct 5880
gccttcaggc tggttctcgg ggaccatgtc cctggtttct ccccagc3t3 tggtgttcac 5940
agtgttcact gcgggtggtt gcggggattg catcccagag ctccggtgcc 6000
ttgtgggtac actgctaaga tasaatggat actggcctct ctctgaccac ttgcagagct 6060
ctggtgcctt gtgggtacac tgctaagata tggcctctct ctatccactt 6120
gcaggactct agggaacagg tgagaaaacc aggggctagg agcagggagg 6180
tagctgggca gctgaagtgc ttggcgacta ggatctctag 6240
aatactctta aaatctgggt gggcagagtg gcctgcctgt ctcgggaggc 6300
ggagacaggg aatcatcaga gcaaactggc taaccagaa仁 tgagctctgg 6360
gctctgtgag agatcctgcc 3agaagacag 6420
tagatgccaa t仁ttaagccc CC3C3tgC3C atggacaagt gtgcgtttga acacacatat 6480
130formula see original document page 131gtgtatgcac atgtgccaca tgtgtacaga tactatggag gccagaagag gccatggccg 8700
tccctggagc tggagttaca ggcagcgtgt gagctgcctg gtgtgggtgc tgggaaccaa 8760
acttgaatct aaagcaagca cttttaactg ctgaggcagc tctcagtacc CttCttC3tt 8820
tctccgcctg ggttccattg tatggacaca tgtagctaga atatcttgct 8880
tgtacat仁gt tttgtgctaa tgctctatag cc仁gagctgg CCtC33CCtt 8940
gccatcctcc tgcctcagcc tcctcctcct gagtgctagg atgacaggcg agtggtaact 9000
tacatgg仁tt catgttttgt tcaagactga agga仁aacat tcatacagag aagg仁ctggg ，0
tgcagttcac tgaatggcac aacccgtgat aactcagggg 9120
ctggagagat ggcactgact gctcttccag aggtccggag ttC33ttCCC 9180
tggtggctca cagccatcta 仁aacgagatc tgacgccctc ttctggtgtg tctgaagaca 9240
gctacagtgt tctttaaaac 9300
agcccactcc atgttccctc ccacgtctct gcctacagta ctcccaggtt 9360
accactg仁tc aggcttctaa caacctggtt tacttgggcc tctt仁tctgc tctgtggagc 9420
cacacatttg tgtgcctcat acacgttctt tctagtaagt tgcatattac tctgcgtttt 9480
tacatgtatt tatttattgt agttgtgtgt gcgtgtgggc ccatgcatgg cacagtgtgt 9540
ggggatg仁ca gagtattgtg aacaggggac 3gttcttttc ttcaatcatg tgggttccag %00
aggttgaac仁 caggtcatca tgtgtggcag caaatgcctt tacccactga gacatctccs 9660
t3ttcttttt ttttcccctg aggtgggggc ttgttccata gcccaaactg gctttgcact 9720
tgcagttcaa agtgactccc tgtctccacc tcttagagta ttggaattac gatgtgtact 9780
3cc5Lcacctg actggatcat teiattctttg atgggggcgg ggaagcgcac atgctgcagg 9840
tgaagggatg actggactgg acatgagcgt ggaagccaga gaacagcttc agtctaatgc 9900
tctcccaact gagctatttc ggtttgccag acagaaagtt ctcagtgcca ，0
tgtggatt:cg 9ygttggag仁 tcaactcatc agcttgacat tggctcctct acccactgag 10020
ccttctcact 3CtCtCt3CC tagatcatta 3ttCtttttt aaaaagactt attagggggc 10080
tggagagatg gctcagccgt taagsgcacc gaatgccctt ccagaggtcc tgagttcaat 10140
tcccagcatg ccattgctgg gcagtagggg gcgcaggtgt tcaacgtgag tagctgttgc 10200
cagttttccg cggtggagaa cctcttgaca ccctgctgtc cctggtcatt ctgggtgggt 10260
gcatggtgat atgcttgttg tatggaagac tttgactgtt acag仁gaagt tgggcttcca 10320
cagttaccac gtctcccctg gccgggtgct tgtccattgc cgcgagggct 10380
acagccgctc cccaacgcta gttatcgcct acctcatgat gcggcagaag atggscgtca 10440
agtctgctct gagtactgtg aggcagsatc gtgagatcgg ccccaacgat ggcttcctgg 10500
cccasctctg ccagctcaat gacagactag ccaaggaggg caaggtgaaa ctctagggtg 10560
cccacagcct cttttgcaga ggtctgactg ggsgggccct ggcagccatg tttaggaaac 10620
acagtatacc cactccctgc acgtgcccac atctgtccca ctctggtcct 106B0
cgggggccac tccsccctta gasgaagctc tctgctcctt 10740
agccatcctt tcctgtaatt tatgtctc仁c cctgaggtga ggttcaggtt tatgtccctg 10800
132tctgtggcat cagtgaccca gctatcaggg tgca仁ggccc 10860
gggacacggg cactcttcat gacccctccc ccacctgggt tcttcctgtg tggtccagaa 10920
ccacgsgcct gg仁aaaggaa ctatgcaaac acaggccctg scctccccat gtctgttcct 10980
ggtcctcaca gcccgacacg ccctgctgag gcagacgaat gacattaagt tctgaagcag 11040
agtggagata gattagtgac aaaagaagga illOO
aattatttcc agatactaca taggggccct tgggtaagca 11160
tcccagaggc ta仁cttgatt ctttggaatg tttaaagtgt gccttgccag agagcttacg 11220
atcta仁at:ct gctgcttcag agccttccct gaggatggct ctgttccttt gc仁tgttaga 11280
agagcgatgc cttgggcagg gtttccccct tttcagaata cagggtgtaa 11340
33gg3cctcc atttggagaa ttgcaaggat 11400
tttatcctga attatagtgt aagtcatcac gccaagtgct tgccatcctg 11460
g仁tgc仁a仁tc taggaggagg aacctagcca attgcagctc atgtccgtgg 11520
gtgtg仁gcac gggtgcatat gtgcctgtcc ccttggggac agaaggaaaa 11580
tgaaaggccc ctctgctcac cctggccatt tscgggaggc tctgctggtt ccacgg仁gtc 11640
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tggagagaga gagagcaaag aactt仁cteia gggtggt亡tt 11760
tgaacctcgc tggaccttgt atgtgtgcac atttgccaga gattgaaca仁 3atcctcttg 11820
ggacttcacg ttctcatta仁 ttgtatgtct ccggggtcsc 11880
CCC3gC3CCC ggcacatagg cgtctcataa aagcccattt tatgag貼cc 11940
gagtaccccg tgtatagaga gagttgttgt cgtggggcac ccggatccca gcagcctggt 12000
tgcctgcctg taggatgtct tacaggagtt tgcagagaaa ccttccttgg agggaaagaa 12060
atatcaggga tttttgttga atatttcaaa ttcagcttta agtgtaagac tcagcagtgt 12120
tcatggttaa ggtaaggaac atgccttttc cagagctgct gcaeigsggcei ggagaagcag 12180
acctgtctta ggatgtcact cccagggtaa agacctctga tcacagcagg agcagagctg 12240
tgcagcctgg atggtcattg tcccct3ttc tgtgtgacca cagcaaccct ggtcacstag 12300
cctttttttt 仁ttttttttt tttttttttg gcccagaatg asgtgsccst 12360
agccaagttg tgtacctcag tctttagttt ccaagcggct ctcttgctca atacaatgtg-- 12420
taacactgta gagttgacag aactggt仁ca tgtgttatga 12480
aaacatctgg gctagccagg 12540
catgattgca atgtctacag gcccagttca tgagaggcag agacaggaag accgccgaaa 12600
ggtcaaggat agcatggtct acgtatcgag actccagcca gggctacggt cccaagatcc 12660
taggttttgg attttgggct ttggtttttg agacagggtt tctctgtgta gccctggctg 12720
tcctgg3act cgctctgtag accsggctgg cctcaaactt agagatctgc ctgactctgc 12780
ctttgagggc tgggacgaat gcc3CC3ctg cccaactaag attccattaa 12840
agttcaagat tgccagctcg ttaaagctaa gtagaagcag tctcaggcct 12900
gctgcttgag gctgttcttg gcttggacct gaaatctgcc cccaacagtg tccaagtgca 12960formula see original document page 134gacatcaggg cagatccttg gggccaaagg cggacaggcg agtctcgtgg taaggtcgtg 15180
tagaagcgg3 tgcatgagca cgtgccgcag gcatcatgag agagccctag gtaagtaagg 15240
atggatgtga gtgtgtcggc gtcggcgcac tgcacgtcct ggctgtggtg ctggactggc 15300
atct仁tggtg agctgtggag 柳aaatggg tagggagatc tccgaattat 15360
ttcaagaact gtctattaca aaaaagaaga 15420
gtggtgtgc3 cctstagcc3 gaaagctgga 15480
gcaagsggat ggcgagtttg aaggtatctg gggctgtaca gcaagaccgt cgtccccaaa 15540
C3gC333CCC attatgtcac acsagagtgt ttatagtgag cggcctcgct 15600
gagagcatgg ggtggggg亡g ggggtggggg aicagaaatat ctaaactgca gtcaataggg 15660
atccactgag accctggggc ttgactgcag cttaaccttg agggttt仁gt 15720
gttgagtaaa agcatcgatt actgacttas cctcaaatga agaaaaagaa 15780
C33LC5l35L3gC ggctggtgag atggctcagt gggtaagagc acccgactgc 15840
tcttccgaag gtccagagtt caaatcccag C33ccacatg gtggctcaca accatctgta 15900
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ccgagcaaac caggccccca 16020
aggcacgacg gcaggc3CC3 cgagccatcc tgtgaaaagg cagggctacc 16080
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tttcttgttg acactacttc aattacaga仁 tctagagcct 16200
ggccactctc tgctcgcttg atttttcctg ttacgtccag caggtggcgg aagtgttcca 16260
aggac3g3tc gcatcattaa ggtggccagc eitaatctccc atcagcaggt ggtgctgtga 16320
gaaccatta仁 ggtgctcaca gaatcccggg cccaggagct gccctctccc 3agtccggag 16380
caataggaaa gctttctggc ccagacaggg gcaggggaaa 16440
aggagactgg aggtcacaga caaaagggcc agcttctaac aacttcacag ctctggtagg 16500
C3CCCCC33C aatggccaca gctggttttg tctgccccga aggaaactga 16560
cttaggaagc aggtatcaga gtccccttcc tgaggggact tctgtctgcc ttgtaaagct 1"20
gtcagagcag ctgcattgat gtgtgggtgs aaaggaggac ccaggcagat 16680
cgccacaga仁 ggaccggcca cttacaagtc gaggcaggtg gcagagcctt gcagaagctc 16740
tgcaggtgga cgacactgat tcattaccca gttagcatac cacagcgggc taggcggacc 1G800
3cagcctcct tcccagtctt cctccagggc tggggag仁cc tCC33CCttC tgtctcagtg 16860
cagcttccgc cagcccctcc tccttttgca cctcaggtgt gaaccctccc tcctctcctt 16920
ctccctgtgg catggccctc ctgctactgc aggctgagca ttggatttct ttgtgcttag 16980
atagacctga gatggctttc atccct:tgga tctt3catct 17040
aggacccaga gctgtttgtg ataccataag aggctgggga taagagtgct 17100
tgctgtacaa gcatgasgac atgagttcga atccccagca accatgtgga aasataacct 17160
tctascctcs g3gttg3ggg gaaaggcagg tgga仁tctgg gggcttactg gccagctagc 17220
cagcctaacc taaatgtctc agtcagagat cctgtctcag ggaataactt gggagaatga 17280C3cctcctcai ggtctcccat gcacccac3c agacacacgg ggggggggta 17340
atgtaataag atgagggaaa tgattttttg ctaagaaatg aaattctgtg 17400
ttggccgcaa gaagcctggc actgcctttg gcacaccagc ctataagtca 17460
ccatgagttc cctggctaag aatcacatgt 3atgg3gccc aggtccctct tgcctggtgg 17520
ttgcctctcc cactggtttt g—aagagaaat tcaagagaga tctccttggt cagaattgta 17580
ggtgctgagc aatgtggagc tggggtcaat gggattcctt cttcccaggg 17640
ctgggtcata cttcaatagt agggtgctt:g cacagcaagc g仁gagaccct agg仁tagagt 17700
ccccagaatc tgcccccaac ggcatccttc tgcctctggg tgggtg卿g 17760
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ggaatttggt caagctggat tccgccttct gtagaagccc cacttgtttc ctttgttaag 17880
ctggcccaca gtttgttttg agaatgcctg aggggcccag ggagccagac 17940
ttgat3tctg cctgactgcc ctgcccgtgg gaggtactgg 18000
gagagctggc tgtgtccc仁g cc仁C3Ccaaic gccccccccc ctcctcgggt 18060
cacctgggag gtgccagcag caatttggaa g亡ttactgag cttgggaggg 18120
ctgacgctaa gcacacccct tct:ccacccc CCCCC3CCCC acccccgtga ggsggagggt 18180
gaggaaacat gggaccagcc ctgctccagc ccgtccttat tggctggcat gaggcagagg 18240
gggctttaaa aaggcaaccg ta仁ctaggct ggacactgga gcctgtgcta ccgagtgccc 18300
tcctccacct ggcagcatgc agccctcact agccccgtgc ctC3仁ctgcc tacttgtgca 18360
cgctgccttc tgtgctgtgg agggccaggg gtggcaagcc atgccacaga 18420
gg仁catccca gggcttggag agtaccccga gcctcctcct gagaacaacc agaccatgaa 18480
ccgggcggag gacctcccca ccatccctst gacgccsasig gtacgggatg 18540
aagaagcaca ttagtggggg gggaggtgac tggggtggtt ttagcatctt 18600
cttcagaggt ttgtgt:gggt ggctagcctc tgctacatca gggcagggac acatttgcct 18660
ggaagaatac tagcacagca ttagsacctg gagggcagca ttggggggct ggtagagagc 18720
acccaaggca gggtggaggc tg3ggtcagc cgaagctggc attaacacgg gcatgggctt 18780
gtstgatggt ccagagaatc tcctcctaag gatgaggaca caggtcagat ctsgctgctg 18840
accagtgggg aagtgatatg gtgaggctgg atgccagatg ccatccatgg ctgtsctata 18900
tcccacatga ccacc3c3tg agg仁aaagaa ggccccagct tgaagatgga gaaaccgaga 18960
ggctcctgag ataaagtcac ctgggagtaa gaagagctga gactggaagc tggtttgatc 19020
gcaaccctag attgggtttg ggtgggaacc tgaagccagg aggaatccct 19080
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gggtttgtag gtggcatgtg acatgagggg cagctgagtg aaatgtcccc tgtatgagca 19200
caggtggcac cacttgccct gagcttgcac cctgacccca gctttgcctc 3ttcctgsgg 19260
acsgcagaaa ctg仁ggaggc agagccagca cagagagatg cctggggtgg gggtgggggt 19320
stcacgcacg gaactagcag caatgaatgg ggtggggtgg cagctggagg gacactccag 19380
agaaatgacc ttgctggtca cc3tttgtgt gggaggagag ctcattttcc agcttgccac 19440formula see original document page 137cccgcgggcc aggagaggaa gcttgagtcc cagactctgc ctagccccgg 21"0
gtgggatggg ggtctttcta ccctcgccgg gacaaggcag tgtttccacc 21720
ttaaagggaa gggagtgtgg aacgaaagac ctgggactgg ttatggacgt acagtaagat 21780
Ct3CtCCttC cacccaaatg taaagcctgc gtgggctaga tagggtttct gaccctgacc 21840
tggccactga gtgtga仁gtt gggctacg仁g gttctctttt ggtacggtct tctttgtaaa 21900
atagggaccg gaactctgct gagattccaa ggattggggt: accccgtgta gactggtgag 21%0
agagaggaga acaggggagg ggttagggga gagattgtgg tgggcaaccg cctagaagaa 22020
gc亡gt仁tgtt ggctcccagc ctcgccgcct cagaggcttg gcttccccca ctccttcctc 22080
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gtcatattgt aaagggattt tctacacasc agtttaaggt cgttggagga aactgggctt 22260
gccagtcacc tcccatcctt gtcccttgcc aggacaccac ctcctgcctg ccacccacgg 22320
3cacatttct gtctagaaac agagcgtcgt cgtgctgtcc tctgagacag catatcttac 22380
ataatacggg gggggggggc ggagggcgca agtgttatac atatgctgag 22440
aagctgtcag gcgccacagc a仁cttttt:gt 3sa仁c3tttc c3gsc3cctc 22500
ttactttctg tgtagatttt aattgttaaa aggggaggag agagagcgtt tgtaacagaa 22560
gcacatggag gggggggtag gggggttggg gctggtgag仁 ttggcgaact ttccatgtga 22620
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3tcgctttgt gaagcacaag 亡gtgtgtggt tttttgtttt cccg3ccsig3 22800
ggcattgtta ataaagacaa tgaatctcg3 gcaggaggct gtggtcttgt tttgtcaacc 22860
3cacac貼tg tctcgccact gtcatctcac tcccttccct tggtcacaag 22920
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gtcacattca tcctttcctt tgcaaacctg gctctcsttc cccagctggg tcatcgtcat 23040
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tcctctctct tgtaaagccc C3CCCC3Ct3 tttgattccc aattctagat cttcccttgt 23400
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caaca仁cagg gctcctgctt tatgggtctg gtggggtagt 23640
aagcaagatg attgggagtt cttggctatg sggccctgtc 23700
tcaacctctc ctccctccct ccagggtttt gttttgtttt gtttttttga tttgaaactg 23760
138aatccagtca agtgcatctt tgcgtgaggg gaactctatc 23820
gcttccatct tgatttgtgt atgtgcacac tgggggttga acctgggcct ttgtacctgc 23880
cgggcaagct ctctactgct ctaaacccag ccctcactgg ctttctgttt csactcccs3 23940
tgaattcccc taaatgaatt tgtctttgaa gagtgctgct 24000
ggtgtccctg 仁ggttccaga ttccaggaag gacttttcag ggaatccagg catcctgaag 24060
aatg仁cttag agcaggaggc catggagacc ttggccagcc ccacaaggca gtg仁ggtgca 24120
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gagcccagtg ggcataggtg aagacaccgg ttgtactgtc tgtgcttcag 24300
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cagaagagag tgctgctaga ggctgcctga aggagaaggg gtcccag3ct ctctaagcaa 24420
agac仁ccact cacaggctga gcagagctgg ccgtggatgc agggagccca 24480
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tgcaggagag actaggt:tgg gctgtgatcc C3tt3CC3C3 24660
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ggtcaggtta gagtttattt atggaaagtt 3t3ttCt3CC tccatggggt ctacaaggct 24780
ggcgcccatc agaaagaaca aacaacaggc tgatctggga ggggtggtac tc仁atggcag 24840
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gtgtagcatt tacaagcctg gtgcctgagg agatcagaag atggcatcag ataccctgga 25500
actggacttg tgagccactg tgtgggtgct aggaacagaa cctggatcct 25560
ccggaagagc agacagccag cgctcttagc cactaagcca tcactgaggt tc仁ttctgtg 25620
gctaaagaga caggagacaa cttttagtca ataggaccat gaatgttcct 25680
cgtaacgtga gactagggca gggtgatccc ccagtgacac cgatggccct gtgtagttat 25740
tagcagctct agtcttattc cttaataagt cccagtttgg ggcaggagat atgtattccc 25幽
tgctttgaag tggctgaggt ccagttatct 3cttccaagt acttgtttct ctttctggag 25860
ttggggaagc tccctgcctg cctgtaaatg tgtccattct tcaaccttag acaagatcac 25920tttccctgag cttttgttgg cggatctctg ctacacagag
tttttgt:ccc
tcatccggac
tctggggctg
agcaaggagt
ctgatgtgca
tccacagscc
tgggctgggc
tgggattaca
ccagatc仁ga
ggattctact
gcagttctta
agcgaagcag
agaaagggtc
atacatggaa
caggtccacc
tactgtcagt
agctccctga
tcaca仁tctc
atatgattcc
acctggagct
gggaggaaga
ccagtctctc
agaaaggaga
actgagtacc
gtgggactcc
gatctgaatg
aagctacttt
tctctgtatc
agaaatcccc
ggccc333gc
gttcattgct
cagtcaggcc gtggaggtag tgagttcaca
tttgccattt
3C3CCC3g33
ggtggattgg atgtggtgca ggtatgggca cctcccccct tggctagctt g仁catatatg gtgc仁tgcaa ttct:3tt:a33 ggcctgctga aggacaaaga agggaaggaa cctggtgtac acactgggaa catgcctgaa agaaaggcaa
tccttttcct ggcagtgggc tgaaggaccc ctacagatgg gggtgaggca agctgcgtgg tagcccagtg tggtccagcc tttgt仁tgtt accctagctg ctgcctctgc tactttaaga
agtccaaagc cacttgcctt gccagcctgg tcgaaaaaaa
tagactaaaa
ccagatgtat
ttagatggca
tagcaaacga
catgcaagca
tttaacatgg
gtaggtccca
agcacacctg
ggcaatcggt
gtatttctat
gagtcaagtg
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atgaaccaga
atgttatctg
acsgaagcca
gaaatggaag
gaagctgggc
gcagggcagt
acagtcatct
agctgcagtg
agaggaccac
gagacagagg
gagaccaaag
cagscagcca
ctggcagagg
ctagtttcct
tgttttggtt
tcctggaact
ctcctaagtg
gagagagagg
agtcttcata
ccttcaattt gaatcccagc tctacggagt
agtgtt仁gtc gactcgggaa ggaagatggc tgggctgggt ggaagtttgc gaagccaagg gcatctctca gggatctgca gcttttttat tgaatgactg
gggagtgaga
tgaatagagg catggggttt
tgtgggcact attggagact ggggctcctg ataga仁gtct cgacctctgc cgagagatga
atgccaaggc ggagtgctga tccagttgct tggttttgtt cactctgtag ctggaattaa aatgtataag ttccaggtaa
agctttcata attaagaagg gagttccaag agaaataaag
taatgtgctg gtggttacga
gacagcctta ttggcctgga tatctctgcc gtgggttctg cttcatctcc agcccc仁gcc gcaagcctcg ggctcgggat caggaagggt gcattgcaat tagg仁ggtgt tgcgccgcaa gaagggagct gagacttgac agcttcgtcc gcaagaaaga tgcctgacaa atggtcaggg cttgtgctct tcggctgatc 3tggtgcatg gggataaagc tggtttttcg accaggctgg aggcc仁gcgc
tctcccacag
aggaacaccc cagagacagt acagccaggc
tctctgtttc cagttgcaca tgactgcagg actgtgtgta gggtag仁gtt gcttgccaac tccctagtgc ggctttgaac ccagaccctg cctgcactca 3gaccccatc atggagatac agggccctgc ggctcttcag tggagtcaga ttaggatatt ttgaa仁gatg ttgtgtgtcc ttgtccaaga tctgaaaaga agctgcagga gaggagtcag acagctactg atggcacctc gtttggatat 3仁cctgacc3 sggcagggtt cctcgeiactc caccactgcc ccaggttata acatgccsca
25980 26040 26100 26160 26220 26280 26340 26400 26460 26520 26580 26640 26700 26760 26820 26880 26940 27000 27060 27120 27180 27240 27300 27360 27420 27480 27540 27600 27660 27720 27780 27840 27900 27960 28020 28080
140aaacascctg ttctscgsaa tctctcatgg 3CtCCCttCC taaactgtgt 2&140
caa3tctaca agaaatagtg acagtcacag tctctaacgt tttgggcatg agtctgaagt 28200
ctcattgcta agtactggga tttacctagt gtcagcattt ggagcagagc 28260
ctttgggatt tgagatggtc ttttgcagag ctcctsatgg ctacatggag agagggggcc 28320
tgggagagac ccatacacct tttgctgcct tatgtcacct gacctgctcc ttgggaagct 28380
ggccttccct gg3tc3ccc3 ccaccttgca cctccagaac 28440
cttgttactg tcgtcaaagc acagtcggtc tgggttgtat cactgtcaat 28500
gggaaacaga cttgcctgga g仁acattgca taatgtctag aaatgaaaag 28560
tcctatagag ttagc仁ggca ggccctggag gaggctggct 28620
ttgtcctccc cgaggaggtg gcgagtaagg tgtaaatgtt catggatgta aatgggccca 28S80
tatatgaggg tctggggtas ca3g站ggcc tgtgaatata aagcactgaa ggtatgtcta 28740
gtctggagaa ggtcactaca gagagttctc catactcagtg 28800
c3csceiceiCEL aaaaaggaag 28860
gagcaagtac attgtgtgat tgtgtgtgtg actctgatgt cac3tgctC3 28920
tcttgcccta accaaatggc ccctgagagg aicactgt:tgg 2B980
ctgtgtgctc acgtttttct taaagcgtct gtctggtttg ctgctagca仁 caggcagact 29040
tgcagcagac t3C3tatgct cagccctg朋 gtccttctag ggtgcatgtc 仁cttcagaat 29100
ttcagaaagt cattctgtggc tccaggaccg cctgcactct ccctctgccg cgaggctgca 29160
gactctaggc tggggtggaa gcaacgctta cctctgggac aagtataaca tgttggcttt 29220
tct仁tccctc tgtggctcca acctggacat aaaatagatg caagctgtgt 29280
tcctcccgtc cacttagttc tCa3C33t33 ctactctgag agcacttatt 29340
ttagacataa gctttggctc attccccc3c 仁agctcttac ttctttaact ctttC33acc 29400
attctgtgtc ttccacatgg ttagttacct ctccttccat cctggttcgc ttcttcctt:c 29460
gagtcgccct cagtgtctct aggtgatgct tgtaagatat tCtttCt3C3 aagc仁gagag 29520
tggtggcact tgatctacac agcaagc仁cc aggat:atcca 29580
gggcaatgtt gggaaaacct ttctcaaaca aaaagagggg ttcagttgtc 29640
ccatgggtta agaagtctag acgagccatg gtgatgcata cctttcatcc aagcacttag 29700
gaggcaaaga tctttgactt tgaggccagc taggttacat: agtgataccc 29760
tgcttagtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtg仁aatt 仁aaaagtcta 29820
aaaatgcatt cttttaaaeia tatgtataag tatttgcctg cacat3tgta tgtatgtatg 29880
tataccatgt gtgtgtctgg tgctgaagga ctaggcatag actccctaga actagagtca 29940
tagacagttg tgacactccc C35LCCCCCC3 ccatgtgggt gct仁gaagct 3sactcctgt 30000
cctttgtaaa gcagcaggtg tctatgaacc ctgaaccatc tctccagtct ccagatgtgc 30060
attctcaaag aggagtcctt catatttccc 3tCCtteitC6L gtgagcatcc 30120
tcgsgtcacc 3asgct3ctg caaaccctct tagggaacat cttctacttg 30180
gctcatgaaa cacacsig3g仁 catgcactca 30240formula see original document page 142gtctgtgtac tcacagggag gagggtggca aagccctggt cctctacggg ctgggggaag 32460
gggggaagct gtcggcccag tgactttttc ccctttctct ttttctt3g3 aaccagtctc 32520
aatt仁aagat aatgagtctc ctcattcacg tgtgctcact attcataggg acttatccac 32580
ccccgccctg tcaatctggc taagtaagac aagtcaaatt taaaagggaa cgtttttcta 32640
aaaatgtggc tggaccgtgt gccggcacga aaccagggat ggcggtctaa gttacstgct 32700
ctctgccagc cccggtgcct t仁tcctttcg gaaaggagac ccggaggtaa aacgaagttg 32760
ccaacttttg gcgccgggtg atgtcatcca tacctgggat 32820
agggaaggct cttcagggag tcatctagcc ctcccttc3g cacttccggt 32880
ttagttagct tccacctggt cccttatccg ctgtctctgc ccactsgtcc tcatccatcc 32940
ggtttccgcc CtC3tCC3CC ttgccctttt agttcctaga aagcagcacc gtagtcttgg 33000
caggtgggcc attggtcact ccgctaccac tgt仁accatg gccaccaagg tgtcatttaa 33060
atatgagctc actgagtcct gcgggatggc 仁tggttggta atatgcttgc 33120
tgagaactgg agt仁caattc ccagcacatg gatgta仁ttc cagcacctgg 33180
gcagagatct taaeigctcct: ggccagacag ccc3gcctaa gtgsgagacc 33240
ctgtctcaag aaacaagatg gaacatC33s ggtca3cctc ttgtctccac 33300
acacacacgc acatacstcc acacacaggc aaacacatgc acacacctga acaccctcca 33360
仁acatacacc 33C3ttCCCt 33420
ctccttagtc tcctggctac gctcttgtca CCCCC3Ct33 ggcttcaact tcttctsttt 33480
cttcatcttg actcctctgt actttgcatg ccttttccag caaaggcttt tctttaastc 33540
tccgtcattc 3t333CtCCC tctaaatttc ttcccctgcc cttttctttc tctctaggga 33600
gataaagaca agtcaccgtg ggaccagttt attcacccac ccacccctgc 33660
ttctgttcat ccggccagct aagtagtcca acctctctgg tgctgtaccc tggaccctgg 33720
cttcaccaca gctcctcc3仁 gctacccagc cctgcaaacc ttcagcctag cctctggttc 33780
tcc3acc3gc acaggcccag tctggcttct atgtcctaga 3atctccttc attctctcca 33840
tttccctcct ccttctttct cccttctcct gacctctaat gtcttggtca 33900
aacgattaca aggaagccaa tgaaattagc agtttggggt acctcagagt cagcagggga 33960
gctgggatga 3ttC3C3ttt ccaggccttt gctttgctcc ccggattctg acaggcagtt 34020
ccgaagctga gtccaggaag ctgaatttaa cagctgggtt ctgaggcagc 34080
cctsccaceit cagctggccc tgactgagct gtgtctgggt ggcagtggtg ctggtggtgc 34140
tggtggtgct ggtggtggtg gtggtggtgg tggtggtggt ggtggtggtg tgtgtgtgtg 34200
ttttctgctt ttacaasact tttctaattc gacaaatctg cctcatatag 34260
gcagaaagat gacttatgcc 34320
atagttactg tcaaaagtaa ttctstttat acacccttat acatggtatt gcttttgttg 34380
gagactctaa aatccagatt atgtatttaa cccagtcctt aaaaggtgaa 34440
gaatggaccc aga仁agaagg tcacggcaca ag仁atggagt cggagtgtgg agtcctgcca 34500
atggtct:gga cagagagggt CC貼g5LC333 tgcctcgcct cctaaggaac 34560
143formula see original document page 144formula see original document page 145ccacagcagc tgccctgat仁 tattaccttc tactcctttc tccatcccct 2640
gtccacccct cccaagtggc tggaaaagga atttgggaga agccagagcc aggcagaagg 2700
tgtgctgagt acttaccctg cccaggccag ggaccctgcg gcacaagtgt ggcttaaatc 2760
ataagaagac cccagaagag aaatgataat aacagccgac gctttcagct 2820
atatgtgcca aatggtattt tctgcattgc gtgtgtaatg csatgcttgg 2880
ggcggccca仁 tttgcagaca ggaagaagag gaac仁tgccc 2940
ctgcagtgag cgatggagcc ctggtgtttg gtcatittggc tccgagggga 3000
caggg仁gcgc aggagagctt tccaccagct ctagagcatc tgggaccttc ctgcaa亡aga 30G0
tgttcagggg tggagacagg cttggcaaaa gcagggct:gg ggtggagaga 3120
gacgggccgg tccsgggcag accctcacgc gcgcctctc仁 3180
ccacagacgt gtccgagtac agctgccgcg agctgcactt cacccgctac gtgaccgatg 3240
ggccg仁gccg cagcgccaag ccggtcaccg agctggtgtg ctccggccag tgcggcccgg 3300
cgcgcctgct gcccaacgcc atcggccgcg gcaagtggtg gcgacctagt gggcccgact 3360
tccgctgcat ccccgaccgc taccgcgcgc agcgcgtgca gctgctgtgt cccggtggtg 3420
aggcgccgcg cgcgcgcaag gtgcgcctgg tggcctcgtg cgcctcaccc 3480
gct:tcc3c3a ccagtcggag ctcaaggact tcgggaccga ggccgctcgg ccgcagaagg 3540
gccggasgcc gcggccccgc gcccggagcg cc333gcc33 ccaggccgag ctggagaacg 3600
cctac仁3gag cccgcccgcg CCCCtCCCC3 ccggcgggcg ccccggccct gaacccgcgc 3660
cccacatttc tgtcctctgc gcgtggtttg attgtttata tttcattg仁a aatgcctgca 3720
acccagggca gggggctgag accttccagg ccctgaggaa tcccgggcgc cggcaaggcc 3780
cccctceigcc cgccagctga ggggtcccac ggggcagggg agggaattga gagtcacaga 3840
cactgagcca cgcagccccg cctctggggc cgcctacctt tgctggtccc acttcagagg 3900
aggcagaaat ggaagcattt tcaccgccct gggagcggtg tgggagtggg 3960
aaagtccagg gactggttaa gaaagttgga taagattccc ccttgcacct cgctgcccat 4020
cagaaagcct gaggcgtgcc cagagcacaa gactgggggc aactgtagat gtggtttcta 4080
gtcctggctc tgccactaac ttgctgtgta accttgaact ccttcgggac 4140
ctcaatttcc- actttgtaaa atgsgggtgg aggtgggaat sggstctcga ggagactatt 4200
ggcatatgat tcc33ggact ccagtgcctt ttgaatgggc aigaggtgsiga gagagagaga 4260
gaaagagaga gaatgaatgc agttgcattg attcagtgcc aaggtcactt ccagaattca 4320
gagttgtgat gctctcttct gacagccaaa asaaaagtaa 4380
agagtctatt tatggctgac atatttacgg cctggaagsa gctatgctgc 4440
ttccceigcct ggcttccccg gatgtttggc tacctccacc CCtCC3tCtC 4500
catcatccat tggggtagaa aaggagaggg tccgagggtg gtgggaggga tagaaatcac 4560
atccgcccca acttcccaaa gagcagcatc cctcccccga ccc3t3gcc3 tgttttaaag 4620
tcaccttccg aagagaagtg aaaggttcaa ggacactggc cttgcaggcc cgagggagca 4680
gccatcacsa 3ctcacagac cagcacatcc cttttgagac accgccttct gcccaccact 4740
146cacggacaca tttctgccta tcttactgct cttacatgtg atggcatatc 4800
ttacactaaa tgggggaaaa actacaagtg ctgtacatat gctgagaaac 4860
tgcagagcat aatagctgcc ctttttgaaa 3tC3tttCC3 gacaacctct 4920
t3Ctttctgt gtagttttta attgttaaaa ttaaacagaa gcacatgaca 4980
tatgaaagcc tgcaggactg gtcgt仁t亡tt tggcaattct tccacgtggg acttgtccac 5040
gtagtggttt ttaaagagt仁 aag仁tacata ttt3ttttCt cacttaagtt 5100
atttatgcaa aagtttttct tgtagagaat gacaatgtta atattgcttt atgaattaac 5160
agtctgttct tccagagtcc agagacattg tgaccgaaag 5220
gatgtgg仁ct c3tt仁tgtca accacacatg acgtcatttc tgtcaaagtt gacacccttc 5280
tcttggtcac tagagctcca accttggaca cacctt仁gac tgctctctgg tggcccttgt 5340
ggcaattatg tcttcctttg aaaagtcatg tttatccctt cctttccaaa cccagaccgc 5400
atttcttcac ccagggcatg cagccttgta tcct:tttagc agcctcccct 5460
ccstgctggc ctgttctcat tgtatcactc ccctgctcaa 3agcc仁tcca 5520
tagctccccc t仁gcccagga tcaagtgcag tttccctatc tgscatggga ggccttctct 5580
gcttgactcc C3CCtCCC3C tccaccaagc ttcctactga ctccaaatgg 5G40
ccctgcttcc ttag仁仁tgcc dtccac3Ctt 3gc3ccccc3 ataactaatc ctctttcttt 5700
aggattcaca ttac仁tgtca tctcttcccc taaccttcca gagatgttcc 3atctcccat 5760
gatccctctc tcctctgagg ttccagcccc ttttgtctac sccactactt tggttcctaa 5820
ttctgttttc catttgacag tcattcatgg aggaccagcc tggccaagtc ctgcttagta 5880
ctggcataga ttcaggacca gctcacagga 3acttcatct 5940
tcttcgaagt gtggatttga tgcctcctgg gtagaaatg仁 aggatcttca aaagtgggcc 6000
agcctcctgc aagtctcgcc tccccssggt tgctggatgc 6060
tagctgagtt agcatcttca gatgaagagt tt3CtCttC3 gttgccctaa 6120
ggtgggatgg tcaactggaa agctttaaat taagtccagc ctaccttggg ggaacccacc 6180
ccc3c333g3 aagc仁gaggt ccctcctgat gacttgtcag 6240
ttgaattaat C3tC3tC3tC aagtctttga taggtgtgag tgggtatcag tggccggtcc 6300
cttcctgggg ctccagcccc cgaggaggcc tcagtgagcc cctgcagaaa atccatgcat 6360
catgagtgtc tcagggccca gaatatgaga gcaggtagga tcttccatcc 6420
ctgagaggca gtgcggtcca gtgggtgggg acacgggctc tgggtcaggt ttgtgttgtt 6480
tgtttgtttg ttttgagaca gagtctcgct ctattgccca ggctggagtg cagtgtcaca 6540
atctcggctt actgcaactt ctgccttccc ggattcaagt gattctcctg cctcagcctc 6G00
cagagtagct gggattacag gtgcgtgccei ccacgcctgg ctastttttg tatttttgat 6660
agagacgggg tttcaccatg ttggccaggc tagtctcgaa ctcttgacct caagtgatct 6720
gcctgcctcg gcctcccsas gtgctgggat tacaggcgtg cccsgcccca 6780
ggttggtgtt tgaatctgag gagactgaag caccaagggg tt333tgt:tt tgcccacagc 6840
cstacttggg ctcagttcct tgccctaccc ctcacttgag ctgcttagaa cctggtgggc 6900
147acatgggcaa taaccaggt:c 3C3Ctgtttt gtaccaagtg ttatgggaat ccaagatagg 6960
agtaatttgc tctgtggagg ggatgaggga tagtggttag ggaaagcttc acaaagtggg 7020
tgttgcttag agattttcca ggtggagaag ggggcttcta ggcagaaggc atagcccaag 7080
aagtgcatgg ctgctcatgg gtagaagaga stccaccatt cctcaacatg 7140
taccgagtcc ttgccatgtg caaggcaaca tgggggtacc aggaattcca agca3tgtcc 7200
aaacctaggg tctgctttct gggacc仁gaa gatacaggat ggatcagccc 7260
cccstteicc3 cgagggggaa aaaaacctga aggctaaatt gtaggtcggg 7320
tttatggaaa gttatattct acctacatgg ggtctataag cctggcgcca atcagaaaag 7380
cagacctagc tgggaggggc agcatnttgt tgtagggggc 7440
ttctgggggt acagccagac tcagggcttg ctgagagtaa gacagacaga 7500
gggatagaag gaaataggtc cctttctctc tctctctctc tctctctctc actctctctc 7560
tctctcac3c acgctctgta ggggtctact tatgctccaa 7620
ggccacattt acacaaggag gtaaaggaaa agaacgttgg 7680
ggaccccaaa attccctgtt ttccttgaat caggcaggac t: tacgcagct 9ggagggtgg 7740
agagcctgca gaagccacct caagt仁caga gtcacagaca ccaaaagctg 7800
gtgccatgtc cc3c3cccgc ccacc仁ccca cctgctcctt gacacagccc tgtgctccac 7860
aacccggctc ccagatcatt gattatagct ctggggcctg C3ccgtcctt cctgccacat 7920
CCCC3CCCC3 ttcttggaac ctgccctctg tcttctccct tg仁ccaaggg caggcaaggg 7980
ctcagctatt gggcagcttt gaccaacagc tgaggctcct tttgtggctg gagatgcagg 8040
aggcagggga tagtcaatgc gaccatgtgc ctggtt仁gcc cagggtggtc 8100
tcgtttacac ctgtaggcca agcgtaatta ttaacagctc ccacttctac 8160
geiccceieitict gggcagtaaa cccatgcteit taagagctgc aacttgctgg 8220
gcgtggtggc tcacacctgt aatcccagta ctttgggacg tcaaggcggg tggatcacct 8280
gaggtcacga gttagagact ggcctggcca gcatggcaaa 3ccccatctt 8340
gcaaggcatg gtggcatgca cctgtaatcc csggtactcg ggaggctgag 8400
acaggagaat ggcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccaagat tgtgccactg 8460
ccctccagcc ctggcaacag agcaagactt gaaaaaggat ac仁gtcsatc 8520
actgcaggaa gaacccaggt aatgaatgag gagaagagag gggctgagtc accatagtgg 8580
cagcaccgac tcctgcagga aaggcgagac gggtactgaa gggtgccctg 8640
aatgacgttc tgctttagag accgaacctg agccctgaaa gtgcatgcct gttcatgggt 8700
gagagactaa ccttggcagg tactgaatcc tttcttacgg ctgccctcca 87G0
atgcccaatt tgtctggggt gcctaagctt ctgcccacca agagggccag 8820
agctggcagc gagcagctgc aggtaggaga gataggtacc cataagggag gtgggaaaga 8880
gagatggaag gagaggggtg cagagcacac acctcccctg tcctgagggc 8940
tggtcatgcc agcagattta aggcggaggc aggggagatg gggcgggaga ggaagtgaaa 9000
aaggagaggg tggggatgga gaggaagaga 9ggtgatcat tc3ttcattc cattgctact 9060gactggatgc cagctgtgag ccaggcacca ccctagctct gggcatgtgg ttgtaatctt 9120
ggagcctcat .ggagctcaca gggagtgctg gcaaggagat ggataatgga cggataacaa 9環
ataaacattt agtacaatgt ccgggaatgg aaagttctcg aaagaaaaat aaagctggtg 9240
agcatataga cagccctgaa ggcggccagg ccaggcattt ctgaggaggt ggcatttgag 93 00
e 9301
<210> 19 <211> 21 <212〉 DNA <213>i人工序列
<220>
<223> PGR引物 <400> 19
ccggagctgg agaacaacaa g 2!
<210> 20 <211> 19 DNA <213>人工序列
<220>
<223> PGR弓|物-<400> 20
gcactggccg gagcacacc. 19
<210> 21 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PGR引物<400> 21
aggccaaccg cgagaagatg acc 23
<210> 22 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223》PGR引物 <400> 22
gaagtccagg gcgacgtagc a 21
<210> 23 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PGR引物 <400> 23
aagcttggta ccatgcagct cccac 25
<210> 24 <211> 50 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PGR引物 <400> 24
aagcttctac ttgtcatcgt cgtccttgta gtcgtaggcg ttctccagct 50formula see original document page 151formula see original document page 152<223> PGR引物 <400> 31
agcataagct tttaatccaa atcgatgga 29
<210> 32
<211> 33
<212> DMA <213>人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 32
actacgagct cggccccacc acccatcaac aag
<210> 33 <211> 34 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PGR引物 <400> 33
acttagaagc tttcagtcct cagccccctc ttcc
33
34
•c210> 34 <211> " <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR引物 <400> 34aatctggatc cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatctgca ggattcgagg 60 gcccct "
<210〉 35
<211> 82
<212> DMA <213>人工序列
<220>
<:223> PCR引物 <400> 35
aatctgaatt ccaccggtgt taat仁aaata acttcgtata atgta仁gcta tacgaagtta 60 tagatctaga gtcagcttct ga 82
<210> 36 <211> 62 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR引物 <400> 36
atttaggtga cactatagaa ctcgagcagc tgaagcttaa ccacatggtg gctcacaacc 60 3t 62
<210> 37 <211> 54 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PGR弓l物 <400> 37
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