诊断患者所患癌症的最常用方法是得到怀疑组织的样本，然后在 显微镜下检查有无明显的恶性细胞。当怀疑组织的解剖位置已知时， 所述方法相对较为简单，但是当不存在有可以轻易确定的肿瘤或癌前 损伤时，所述方法就不那么简单。例如，为了从痰液中检测有无肺癌 需要在样本中找到一个或多个相对较为不寻常的肿瘤细胞。因此，如 果样本不能灵敏且精确地反映肺部情况，就不能正确诊断出患有肺癌 的患者。
Palcic等人在美国专利申请US6026174中公开了一个基于显微镜 的系统和方法，该系统用于检测诊断细胞和具有与恶性肿瘤相关改变 的细胞。所述Palcic等人的系统包括一个自动分类器，具有常规显微 镜、照相机和图像数字转换器，控制并与上述组件连接的计算机系统， 进行初次细胞分类的初级分类器，以及进行接下来的细胞分类的次级 分类器。该方法利用自动分类器自动检测诊断细胞以及具有与恶性肿 瘤相关改变的细胞。然而，常规显微镜的使用限制了所述诊断结果的 质量，其不能对着色密度进行精确测量。所述Palcic等人的方法没有 提及分子探针的使用。
随着分子探针的出现，例如抗体探针和核酸杂交探针，通过标记 这些分子探针然后测量它们在生物细胞和组织中的位置和浓度，从而 解决新的与疾病相关的问题。随着人们对这些探针进行更加精确地定 位和定量的需求，同时还出现了对改进技术的需求，用于在显微镜下 对探针密度进行两维(二维)和三维(3维)的测量。常规的光学显微技 术利用玻片上的细胞，由于焦平面深度、采样角度以及细胞制备中所 产生的通常导致细胞在成像平面上重叠的问题，其仅仅进行近似两维 和三维的测量。光学显微技术的另一个缺陷是通过物镜观察而存在的 固有局限性，其中只有位于窄的焦平面中的区域提供了分析用的精确 数据。
流式细胞仪方法通过使细胞在流体中一个接一个的流动，从而克 服了上述细胞重叠的问题。不幸地是，流式细胞仪系统不能产生与传 统光学显微技术相同质量的细胞图像，而且无论如何其不是三维的。 相关背景技术参见Shapiro，HM， Practical Flow Cytometry，第3版， Wiley-Liss，1995。
在计算机辅助断层摄影技术领域，Johnson等人提出的美国专利 No.5402460于1995年3月28日公开，其题目为“三维微断层分析系 统”。其中公开了一种微断层系统，通过x线发生器和x线检测器产 生样本的高分辨率三维图像，其中x线检测器用于测量x线束经过所 述样本发生的减弱。Johnson等人的微断层系统对样本的每次观察产生 两个投影，每个投影采用不同能量的x线束。在对样本的一个观察产 生两个投影之后，将样本在样本支架上旋转然后进行另一组投影。对 样本每次观察产生的投影一起进行分析，提供关于材料的相位差的定 量指标，所述材料包括上述样本。结合不同观察的投影提供样本的三 维图像。本文结合并引用美国专利No.5402460。尽管美国专利 No.5402460中教导的x-线技术在某些应用中有用，但是其不能提供 用于流式细胞仪的光学技术方案，通过所述光学技术方案可以测量生 物细胞内分子密度的三维分布。
为了克服上述系统中的上述和其它缺陷，本发明的目的是将流式 细胞仪中一个接一个的显示细胞与多个点光源投影的计算机光学断层 摄影技术结合起来，从多个投影中重建细胞内的密度信息。重建的三 维密度信息能够精确测量核密度特征(NDF)和细胞质密度特征 (CDF)。
本文中所提及的NDF和CDF是投影成像系统所特有的，不需要 使用透镜和焦平面及其固有的不希望有的模糊制品，其产生原因是位 于窄的焦平面之外的非聚焦结构。由于投影成像系统不需要透镜和焦 平面，而产生x射线照相，其中所述结构均同时清楚显示，因而密度 特征的测量比传统显微系统更加定量及精确。所以，术语“NDF”和 “CDF”指由x射线照相得到的密度特征量度以及采用x射线照相的 断层摄影重建。NDF和CDF是指公知的在与癌症组织相关的细胞中发 生的细微变化。上述变化指示偏离常态，并反映与疾病过程相关的分 子变化。
然而，目前NDF和CDF仍没有被广泛接受用于筛选确定病人是 否患有或将要患有癌症，这是因为测量方法没有提供足够的精确度和 /或通量。一般地，通过仔细选择取自肿瘤或癌前损伤附近位置的细 胞样本，并采用具有相对高放大倍率的显微镜观察细胞，从而检测NDF 和CDF。但是，细胞内发生的NDF和CDF变化被认为是非常细微的， 以至于通过常规显微设备工作的病理学家不能可靠地检测出上述变 化，特别是病理学家通常不能进行定量测量。例如，NDF变化可以由 核内DNA的分布和密度指示，伴随着核形状的微小变化。由于人类观 察者们不能较为容易地对上述微小细胞变化进行定量，因此很难确定 哪个细胞显示了NDF改变。

在一个实施例中，本发明提供了一种检测细胞样本中靶细胞的方 法，包括以下步骤，获得细胞样本并将细胞悬浮于溶液中；如果需要， 将细胞样本中的细胞固定于溶液中；对细胞进行着色和/或标记，以 产生与样本的每个分子内的核分子或其它结构有关的光学密度；用 “点”光源照明样本，通过数字阵列检测器得到透过样本的一个或多 个投影成像(例如，x射线照相)；补偿投影成像在背景照明上的变化； 分析投影成像并检测靶目标；对每个靶目标计算一组一维(一维)和 两维(二维)特征值；将上述特征值组提供给至少一个分类器(90)，分 类器确定和表征细胞样本中的靶细胞。
另一方面，本发明提供了自动检测细胞样本中NDF和CDF的系 统。优选的系统包括流式光学X线断层摄影(FOT)装置，其由计算 机系统控制并与计算机系统相连接。FOT捕获的投影成像存储在图像 处理板中，并经计算机系统控制以检测是否存在一维和两维的NDF和 CDF。通过计算机可以重建多个投影图像以产生三维(3维)或更高维 (3维+)的图像以及与之相关的NDF和CDF。
为了测量NDF和CDF，需获取细胞样本，并在悬浮液中着色，然 后由FOT成像。所述着色是化学计量的，和/或与DNA和/或DNA 相关蛋白，或包括细胞质的细胞内的其它靶分子成比例。然后计算机 系统直接对投影图像进行分析和/或计算出也被分析的三维(3D)重 建。所述图像对于不均衡照明和图像获取系统的其它缺陷进行校正。 对所述图像进行校正后，计算靶目标的边缘、表面积、体积和密度， 也就是界限，界线确定哪些像素或体素属于靶目标或靶结构而哪些属 于背景。
计算机系统为每个目标或结构计算一组一维，二维，3维和3维+ 特征值。对于某些特征的计算，用一个或多个像素(或体素)扩大或 缩小边缘(或表面)，从而对沿着最高梯度值的界限进行校正。这样 做的目的是使每个特征在不同类型目标之间都具有更高的分辨能力， 从而是目标特异性的。然后通过分类器分析这些特征值，分类器用这 些特征值确定目标是人造物品还是细胞核或靶结构。如果目标似乎是 细胞核或靶结构，然后用所述分类器对特征值进行进一步的分析，以 确定所述目标是否显示指示疾病的NDF和CDF。基于样本中所发现的 目标的数量，所述目标似乎具有显著的与疾病相关的NDF和CDF改 变，进行统计学评价以确定所述细胞样本来自的病人是健康的还是患 有恶性肿瘤。
在其它实施例中，本发明提供了一种检测细胞样本中上皮细胞的 方法，以及在所述上皮细胞中检测具有与疾病有关的NDF和CDF的 细胞。在另一实施例中，提供了一种预测病人是否会患有癌症的方法。
附图说明
附图1示意性地显示了在本发明一个实施例中流式细胞仪系统的 例子。
附图2示意性地显示了在本发明一个实施例中单个细胞流动过程 的例子。
附图3A和附图3B示意性地显示了在本发明一个实施例中一个细 胞和重建横截面的例子。
附图4示意性地显示了在本发明一个实施例中重建圆柱体的例子。
附图5示意性地显示了在本发明一个实施例中流式光学X线断层 摄影(FOT)系统的例子。
附图6示意性地显示了在本发明一个实施例中位于重建圆柱体内 的投射射线的例子。
附图7示意性地显示了在本发明一个实施例中重建圆柱体的顶视 图。
附图8示意性地显示了在本发明一个实施例中在细胞重建中采用 的光源/单列射线结构的几何形状。
附图9示意性地显示了在本发明一个实施例中对来自投影图像和 X线断层摄影重建的NDF和CDF进行分析所采用的分类方法。

此处结合特定的生物细胞实施例对本发明进行描述，但是，应该 这样理解，这些例子用于阐述本发明的原理，并不对本发明进行限制。 在一个实施例中，在一微观体积内构建点密度和发射密度的三维分布 考虑到位于所述微观体积内的任何位置测量密度和荧光，并确定靶结 构、靶分子或靶分子探针的位置。采用标记的分子探针，可以测量结 合在所述微观目标特定结构上的探针数量。为了阐述，可以用至少一 种标记分子探针标记例如生物细胞等的目标，所述探针的测量量和位 置可以产生关于细胞疾病状态的重要信息，包括但不局限于，各种肿 瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌以及卵巢癌。
制备用于流式细胞仪的生物细胞，并用标记的用于特定疾病诊断 的分子探针进行着色或标记，使其流过一装置，收集投影图像，并从 基本垂直于细胞流动矢径的光学投射射线路径重建二维和3维密度信 息。控制细胞沿某一轴的流动速度，重建的垂直二维平面可以被正确 地沿着上述细胞轴进行定位(或迭加)，以产生完整细胞的3维图像， 或可以直接从二维光透射投影或发射投影计算出细胞的3维图像。
由于下列特征，流式细胞仪非常适合于图像重建：
●细胞以单行通过毛细管，因此细胞重叠和遮蔽降至最低，
●可以直接测量通过毛细管的细胞流动速度，其是恒定的，
●细胞趋向于毛细管的中心轴，因此在结构上是放射状对称的，
●取决于细胞固定和悬浮试剂，细胞可以保持可塑性，相应于毛 细管的速度梯度，细胞可以呈现沿z轴的伸长形状。
本发明利用了上述特点提供用于点光源投影成像和断层成像重建 的系统。
参照图1，图1示意性地给出了本发明一个实施例的流式细胞仪系 统的例子。所述系统以坐标系11进行定向，所述坐标系11具有x、y、 z方向的三个坐标。在操作时，用公知的注射装置4将细胞1注射入注 射管3。所述毛细管在注射端5较宽，包括一压力盖6。从管8引入外 鞘流7，以在毛细管2内产生层流。传统流式细胞仪的特征在于，制备 并悬浮于溶液中的细胞1可以被冲压通过毛细管2，从而细胞沿着流动 轴伸长，并朝着毛细管2的中心轴近似向下移动，用虚线9表示。较 为有利的是，细胞可以轴向对称地流动，并沿着圆柱形毛细管的中心 轴以单列、恒定速度10移动。
现在参照图2，图2示意性地给出了本发明一个实施例的单个细胞 的流动过程。一个细胞1以用速度矢量10表示的恒定速度(V)移动 通过毛细管2。所述细胞1包括细胞质壁12和细胞核壁13。在流动通 过毛细管2的过程中，细胞1通过多个重建平面，为了进行阐述，分 别用第一、第二和第三重建平面14a，14b和14c表示。穿过细胞质壁 的第一平面片段15a位于重建平面14a内。类似地，穿过细胞质壁和 细胞核壁的第二平面片段15b位于重建平面14b内，第三平面片段15b 位于重建平面14c内。本发明的一个主要特征在于许多具有可选择波 长的点光源同心分布在毛细管周围。所述点光源与相对的光传感器阵 列共同工作，所述光传感器阵列对光谱的可选择部分敏感，从而可以 得到透射穿过细胞的光的投影。可以直接用断层图像重建算法对得到 的投影图像进行分析或处理，以提供细胞内密度和/或发射强度分布 的空间图形或图像。应该这样理解，在实际工作中，依赖于呈现给系 统的目标的所需图像分辨率，重建平面的数量可以从几个到几百个或 更多。可以在软件中结合或迭加一组重建的平行平面片段图像，以产 生细胞内密度和发射强度的三维(3维)图像。此外，用平面(二维) 光传感器阵列代替线(一维)传感器阵列，用锥形照明射线模式代替 扇形照明射线模式，可以同时得到多个连续通过流动细胞的平面片段。 作为结果，采用锥形光束重建算法，可以直接从两维(二维)投影计 算出细胞体积内的密度和发射强度分布的三维(3维)图像。作为选择， 可以直接分析具有无限景深的二维点光源投影图像。
对于生物细胞，重建平面之间的距离(d)可以是几微米或更小。 位于细胞1内的一个点可以与不同时间间隔的每个重建平面重合，其 中时间间隔(t)可以表述为：
t＝d÷V    (方程1)
结合参照附图3A和3B，其示意性地给出了本发明一个实施例的 重建横截面16。流动细胞的轴向对称以及向心性有利于由通过细胞的 光投影重建细胞内的点密度。此外，投影的采样空间可以做成包括三 个分离腔室的模型：
1.细胞17外部的流体(也就是外鞘流体或细胞悬浮介质)，
2.细胞质18，以及
3.细胞核19
定量知晓在这三个腔室中的光密度或分子探针的分布就足够解决 细胞生物学和疾病诊断中的许多重要问题。此外，如果特定分子探针 优选结合至细胞质或细胞壁12和细胞核壁13的边界表面，计算这两 个边界表面是非常有用的。此外，将这些壁作为上述三个不同腔室的 过渡表面是足够的。
通过将细胞的重建片段结合起来，或以螺旋状体积测量的方式进 行重建，可以产生3维形态和体积信息，但是绝对(与相对相反)体 积依赖于细胞位置的准确信息。细胞位置是流动速度的函数。但是， 在一些情况下，密度或分子探针的相对浓度足够用于解决下述诊断问 题：有多少探针位于相对于细胞核的细胞质内，而又有多少未结合探 针位于背景液体中？或者，探针主要位于细胞膜上还是位于核膜表 面？
尽管通过毛细管的细胞可以在结构上变成放射对称状，至少一个 结合分子探针在核和细胞质腔室内的分布并不是如上所述的轴向对 称。因此，需要的是成像系统以及(特别是发射)重建算法提供足够 的空间分辨率对结合的荧光分子探针的体积进行定位，其比上述要求 的提供三个腔室分析的分辨率更加精细。进一步地，需要的是所述系 统提供关于在两个细胞内腔室中非对称分布的探针浓度的定量信息。 通过亚微粒空间分辨率有助于了解探针与特定亚细胞腔室、位于细胞 质或细胞核中的结构或细胞器之间的关系。
一个更加特殊的例子是关于早期检测高危患者的癌症。在上述情 况下，当细胞发生改变，某些基因将表达过高或过低。测量相对于细 胞核的细胞质中基因产物(通常为蛋白质)的相对过度或过低表达， 同时使背景悬浮液体中的非结合探针正常化，这在诊断上是非常重要 的。如果基因产物是蛋白质，可以使用标记抗体探针定位和/或定量基 因产物蛋白质以评价细胞的疾病状态。因此，对这三个腔室的分析足 够用于确定疾病状态。
现在参照附图4，附图4中示意性地给出了重建圆柱体的例子，所 述重建圆柱体包绕流动管2，所述流动管包括流动细胞1，如本发明的 一个实施例所述。重建圆柱体20，例如包括由点光源21构成的的螺旋 线24，所述点光源以预定螺旋倾斜度分布，其倾斜角为θ。每个点光 源发出一光子束22，其中光子束22通常为锥形或扇形。在附图4中光 源为螺旋状设置，但是部分地依据电子设备的速度、细胞速度以及使 传感器(检测器)处的投影信号不产生重叠的几何图形，点光源的排 列可以是各种各样的几何图案。传感元件23用于接受来自点光源的光。
当完整细胞1经过光源时，固定的点光源21与相对的安装在管外 周的检测器23可以对细胞1进行多投射角度的采样。通过对点光源和 减弱的透射光和/或散射光和/或发射光的发射或读出进行时间控制，或 对两者都进行时间控制，每个检测出的信号将与沿着流动细胞z方向 的轴的一个特定已知位置一致。这样，以已知速度并沿着垂直于光源 的一个已知轴流动的细胞1可以用经过细胞的投影进行光学切割并重 建形成x-y平面的二维片段，所述光源可以同步发射光或被检测出。通 过将序列片段迭加或在数学上结合起来，可以形成细胞的3维图形。 同时还可以将细胞运动与流动轴周围的光源位置结合起来，以产生可 以重建的数据，例如以螺旋形式构建细胞的3维图形。可以通过迭加 连续的平面图像进行重建，所述平面图像是通过扇形光束重建算法由 线性(一维)投影重建的，或是通过锥形光束重建算法由平面(二维) 投影重建的。所述细胞的3维图像可以产生关于亚细胞结构以及有关 标记分子探针的位置和数量的定量量度，所述分子探针提供诊断信息。
如上所述，重建截面或体积的二维或3维密度结构要求有一个以 上的经过细胞截面的投影。在传统的一个片段与一个片段的医学计算 机断层x射线照相法中，通过使患者保持不动，而x射线源和相对的 检测器沿着外周移动产生经过患者的多个投射角度，从而进行多个投 影。通过类比，本发明的流式光断层成像系统以预定速度使细胞通过 多个光源，所述光源以不同角度设置在毛细管的外周，从而当细胞经 过点光源时产生多个投影。这些点光源发出光子，所述光子经过细胞 被与光源相对的传感器阵列检测。所述点光源可以沿着螺旋线24和其 它适当的几何图案排列在毛细管的外周，这样当细胞经过点光源阵列， 可以从多个角度对细胞的每个点进行采样。对于好的采样几何图案， 这些点光源可以覆盖外周的至少180度。在某些情况下，较少的角度 覆盖范围(也就是低于采样的角度)是可行的，但是额外的放射覆盖 范围将提高计算机重建的精确度和信噪比。根据几何学，对于锥形或 扇形光束图像重建，较为有利的是采用传统的分析、迭代或统计学算 法。(参见例如，Gilbert，P，“Iterative Methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections”，Journal of Theoretical Biology 36：105-17，1972；Oppenheim，BE，“More accurate algorithms for iterative 3 dimensional reconstruction，”IEEE Transactions on Nuclear Science NS-21：72-7，1974；Singer，JR，Grunbaum，FA，Kohn，P和Zubelli， JP，“Image reconstruction of the interior of bodies that diffuse radiation” Science 248(4958)：990-3，1990；Mueller，K和Yage，R，“Rapid 3-D cone-beam reconstruction with the simultaneous algebraic reconstruction technique(SART)using 2-D textrue mapping hardware”，IEEE transactions on Medical imaging 19(12)1227-37，2001.)相关的方法包括 但不局限于ART(代数重建技术，如Bellman，SH，Bender，R，Gordon，R 和Rowe，JE的“ART is science being A defense of algebraic reconstruction techniques for three-dimensional electron microscopy”， Journal of Theoretical Biology 32：205-16，1971)，SIRT(联立迭代重建技 术，例如Gilbert，id#1493中所述)，MLEM(最大似然期望值最大化， 例如，Manglos，SH，Jaszcak，RJ和Floyd，CE的“Maxium likelihood reconstruction for cone beam SPECT：development and initial tests”， Physics in Medicine and Biology 34(12)：1947-57，1989，#1382)，以及 OSEM(有序子集期望值最大化，例如Manglos，SH，Gagne，GM，Krol A，Thomas，FD和Narayanaswamy，R“Transmission maximum-likelihood reconstruction with ordered subsets for cone beam CT”，Physics in Medicine and Biology 40(7)：1225-41，1995，#4389)。
方法
流式细胞仪
参见附图5，其示意性给出了本发明一个实施例的流式光学断层成 像系统(FOT)。所述流式光学断层成像系统包括一流式细胞仪，以 及位于毛细管2周围的重建圆柱体20。光子源25和光子传感器26与 作为触发装置的脉冲高度分析仪27一起工作。脉冲高度分析仪按照公 知的原理工作，为细胞的开始提供第一触发点28，为细胞的结束提供 第二触发点29，所述脉冲高度分析仪输出与每个细胞的开始和结束相 对应的触发信号30，其中所述触发信号被重建圆柱体20接收。
计算机40通过信号线41-43将数据、控制信号和定时信号传输 给点光源21、传感元件23和脉冲高度分析仪27。所述计算机可以包 括一个公知的计算机或多个计算机以及适于图像获取和图像重建处理 的阵列处理器。
商业上的流式细胞仪具有三个基本流动结构：也就是，圆柱形流 动管，矩形流动管和空气系统中的流动(参见，Shapiro，HM，Practical Flow Cytometry，3rd，ed.，Wiley-liss，1995)。优选的结构为圆柱形流动 管，这是因为保持最理想的圆柱形几何形状对于重建算法是非常重要 的，将由于流动硬件而导致的径向依赖性降至最低(见附图1)。而且， 圆柱形流动管可以相对于毛细管的横截面具有均匀的薄壁。
此外，触发装置可以位于重建模块的上游，提供一定时信号，当 细胞进入然后从重建圆柱体中出去时，启动然后终止数据采集。有利 的是，所述触发装置可以包括一激光二极管，CCD，PMT，光电探测 器组合，固态光电探测器和上述元件的组合。所述触发装置有一阈值 设置用于探测流动细胞的存在，因此产生一触发信号。当下游的重建 圆柱体开始采集关于特定靶细胞的数据，所述触发信号与已知的细胞 速度用于计算。进一步地，对应于细胞进入和流出重建圆柱体的第一 和第二触发点之间的时间间隔可以被分为相等或不等的增量，在每个 增量期间，可以通过选通光源21和对传感器阵列23进行读数获得另 外的投影数据。
需要对流动速度进行控制和精确地测量。在高级商业系统中采用1 米/秒至10米/秒之间的速度具有上述能力。根据下文所要描述的数据 采集速度和信噪比可以确定最佳细胞速度。
重建模块
现在参照附图6，其示意性地给出了本发明一个实施例的重建圆柱 体20内的扇形投射射线的例子。重建圆柱体的目的是提供将多个沿着 小的外周固定的点光源21a-21c发出的光投射至圆柱形毛细管。点光源 发出的光子具有已知的投射几何形状，例如扇形或锥形，并通过毛细 管被传感元件23a，23b或23c阵列检测出，所述传感元件阵列可以根 据情况位于相应的点光源对面的更大的外周上。出于阐述的目的，图 中给出了适于扇形光束透射的弯曲线(一维)传感器阵列，但是也可 以采用适于锥形光束照明的直线(一维)传感器阵列或平面(二维) 传感器阵列。这样，可以产生一组投射射线，其中投射射线可以被描 绘成连接点光源和单个传感元件的直线。沿着例如射线31的特定投射 射线离开点光源的光子数量与特定传感元件接收的光子数量之差与丢 失或减弱的光子数量有关，其原因是细胞与沿着投射光线路径的流动 管内其它内容物的相互作用。
然而，由于光散射、光子能量漂移、不完善的几何图形以及校准 不正可以使情况变得复杂，当同时激发多个点光源时，不同光源的光 子可以到达同一个特定传感元件。通过细心地构造重建圆柱体，例如 通过仔细选择本文所述的点光源的图案以及与它们相对的检测器，以 及对多个点光源的激活和传感器的读出进行适当地时间控制或多路传 输，可以将由于上述问题导致的光子污染降至最低但是不能消除。
对系统校准可以估计出光子污染，例如没有细胞存在。也就是说， 可以轮流启动每个光源并测量其对每个传感器的影响，从而提供偏移 数据使系统正常化。另外的校准步骤使用，例如光学特性已知的成像 乳胶聚合物珠或其它微球或椭圆形小球，并采用所需要的密度范围进 行细胞成像。通过如下文所述在检测器中使用带通滤波器，由荧光探 针发出的光子可以与来源于点光源的光子区分开来。
光源
每个光源可以具有相同的一般特性，优选地：
●可以近似为小的圆形点光源，
●可以以已知的光谱容量发光，
●从光源发出的光子可以具有已知的几何图形，例如锥形或扇 形。
每个光源产生针对每个投射角的数据。当细胞流过模块时，沿着 螺旋线排列的多个光源产生来源于经过每个连续平面(或重建部分) 的多个投射角的数据，所述螺旋线的轴线是流动管的中心轴。根据传 感器的几何图形，数个点光源可以共同线性排列在同一个外周上，这 样投影不会在传感器上重叠。将光源等距离地沿着180度的螺旋线排 列，可以获得良好的采样几何图形，然而在某些情况下，也可以是较 小的角度覆盖范围，为了提供信噪比可以采用360度覆盖范围。理想 的光源数目是每个平面重建(x-y平面)或体积重建内所需分辨率的函 数。出于阐述的目的，点光源采用了螺旋分布，但是应这样理解，点 光源阵列可以采用各种各样的几何图形。进一步地，通过采用各种各 样的二极管或其它激光器或白色或其它宽带光源的带通滤波器，例如 汞或氙弧光灯，光源的波长是可以选择的。
现在参照附图7，其示意性地给出了根据本发明一个实施例的附图 6中重建圆柱体的顶视图。图中给出了第一点光源21a和传感器阵列 23a，以及具有细胞核19的细胞，所述细胞垂直于光源轨迹投射的平 面流动，其在两维上构成了重建圆圈32，其中所有的投影，即使以时 间交错模式获取的投影，均被描绘成重叠的，其中包含了整个细胞。 第二个点光源21b和第二个传感器阵列23b排列在螺旋线周围大约 30°，第三个点光源21c和第三个传感器阵列23c排列在螺旋线周围大 约90°。
数据收集与位于“厚”的平面轴向横截面内的细胞速度同步控制。 理想的平面厚度是在z方向上所需分辨率的函数。典型地，轴向(z方 向)上的分辨率小于平面横轴向方向的分辨率。同时，重建的最佳圆 圈可以由投影扇形的重叠交叉部分限定，所述投影扇形的顶点为点光 源，底部为传感阵列的宽度。理想的是，重建圆柱体的几何图形应使 流动细胞的横截面全部包含在重建圆圈中。
在构建点光源时可以采用数个选择方案，例如：
●在激光或其它高强度光子源的前面有一小孔，
●具有小的横截面的光纤，
●在光子源前有一具有短焦距的透镜，
●发出的一个点位于磷表面上(CRT的一种形式)的电子束，以 及
●以上所述的不同组合。
所述几何图形为点光源离靶目标(细胞)越近，放大倍率越高， 这是因为离光源越近的目标对着越宽的几何角度。相反，如果在系统 设计之前知道所需要的分辨率，可以针对该特定分辨率将几何图形优 化。有关背景技术，可以参见Blass，M(主编)， Handbook of Optics：fiber optics and nonlinear optics，第2版，第4卷，Mcgraw-Hill，2001。
现在参见附图8，其示意性地给出了根据本发明一个实施例在细胞 重建中采用的直线阵列23。例如，对于包含在30微米直径的重建圆圈 内的细胞横截面12和核19，以及所需的0.5微米分辨率，Nyquist采 样(也就是2倍的过采样)规定了每个点光源21至少需要120个传感 元件33。位于顶点的点光源21和位于底部的线阵列长度34构成了一 三角形35，从而例如直径为30微米的细胞位于三角形35之内，其尽 可能地接近于点光源21。在该例子中，如果阵列中的每个元件(例如， CCD)为20微米宽，阵列长度为2400微米，则细胞的中心距离点光 源约100微米(毛细管直径的一半)，当点光源和线性阵列之间的距 离是8毫米，提供80倍的放大。
在第二个例子中，重建圆圈的直径为30微米，互补金属氧化物半 导体(CMOS)的像素大小为4微米。在该情况下，所述阵列可以含有 120个元件，宽度为480微米，可以距离点光源1.6mm放置，当点光 源和细胞间的距离为100微米，提供160倍的放大。
传感元件
每个点光源应具有一对应的传感元件阵列，例如以直线或曲线几 何排列的CCD，其与点光源相对，用于接收透射穿过重建圆圈的光子 射线。典型地，线阵列的传感元件以点光源和中心流动轴之间的线为 中心，并可以垂直于流动轴排列。可以采用二维阵列，其中只对二维 阵列内每条线上的元件子集进行读数用作重建输入。在二维阵列中， 将适当数量的元件沿着点光源的螺旋形排列适当地与每个不同点光源 对齐，从而将每个元件的连续子集交错开来。
对于一个片段接一个片段的扇形光束重建，使用30微米重建圆圈 和每个扇形有120个传感元件，获得0.5微米的分辨率，一个具有 2000×2000 20微米元件的二维阵列足够用于进行检测136，点光源以1 径向角度增量设置，其中连续视野之间的平均偏移量为300微米，其 等于15个传感元件(在阵列的中心，偏移量可以是140微米或7个元 件，但是在阵列的边缘，视野之间的1径向角度范围可以导致更大的 偏移量)。如果传感器阵列中平均15排为一组为每片提供投影数据， 那么在细胞图像中z轴分辨率为3.75微米，然而如果每个投影平均为 2排，则目标空间的轴向分辨率为0.5微米，等于横轴向的分辨率。
在本发明的一个优选实施例中，二维阵列沿着圆柱形外周弯曲排 列，所述圆柱形外周与重建圆柱体同心，这样所有射线路径在长度上 均相等。对于30微米的重建圆圈，一个弯曲的二维阵列，其中只含有 所需的相对于点光源的螺旋轨迹的元件，所述二维阵列可以是宽为120 个元件、高(长度)为136个元件的倍数的螺旋条带，如上文所述。
尽管出于阐述的目的描述了平面或“厚”的扇形照明，但是应这 样理解，真正的未经准直的锥形光束照明可以与二维平面检测器结合 使用，采用锥形光束算法进行3维重建。可以直接对所述二维投影图 像进行分析，以获得例如关于疾病状态或细胞变化状态的信息。对于 直接的体积锥形光束重建，对多个点光源发出的照明进行多路复用， 考虑到点光源和检测器的几何排列，使得来自于不同点光源的照明锥 形不与传感器阵列重叠。
然而，如果细胞以1米/秒(或1,000,000米/秒)的速度流动，二 维阵列上的每个元件为20微米宽，每20微秒的线性读出可以轻易地 捕获0.25微米细胞片段内的数据。当平均一排有15个传感器为3.75 微米的片段提供数据，那么每300微秒进行一次读数。采用更大的二 维阵列可以使重建图像的质量得到显著的改善。
对于特别适用于大量透射或发射波段的多谱段成像的本发明的实 施例，包括系列设置的两个或多个重建模块是非常有利的。可以通过 插入毛细管片段分离上述多个重建圆柱体，每个模块提供充足的投影 数据，用于产生关于流经该模块的目标的完整重建图像。每一个重建 模块中的点光源和/或传感器阵列可以最优化从而适合于一特定波段。 例如，第一重建模块可以采用强白光照明和不经过滤检测以提供完整 的投影数据集以重建关于目标光密度、吸收或散射系数的图形，而第 二重建模块可以采用以495nm为中心的窄波带照明，例如氩离子激光 器(488nm)，以激发用荧光探针标记的蛋白质，与经过滤的对520nm 发射光敏感的传感器阵列一起进行免疫荧光研究，提供充足的第二完 整投影数据，通过下文描述的发射光重建算法，描绘出标记蛋白质的 浓度分布。第三个重建模块可以使用以535和/或342nm为中心的窄带 照明，激发以化学计量结合至DNA的碘化丙啶(Propidium iodide)， 以及过滤传感器阵列，从而最佳地检测出红(617nm)的发射光以研究 倍数性。应这样理解，上述例子仅用作说明，所述方法通常适用于任 一用于照明和检测的波长组合。
图像重建
最常用的、易于实施的重建算法，也就是公知的经过滤的反向投 射法，衍生自采用锥形光束和扇形光束的计算机断层x射线照相(CT) 中的类似范例(参见以下参考文献，例如，Kak，AC和Slaney，M， Principles of computerized tomographic imaging，IEEE Press，纽约，1988， 和Herman，G， Image reconstruction from projections：the fundamentals of computerized tomography，Academic Press，纽约，1988)。这些方法的 基础是经修正的Radon转换定律，其反映了光源/检测器结构的特定几 何图形和照明光束的射线路径。然而，对于临床用x射线CT，为了一 个片段接一个片段的获取，使人体固定不动，而x射线源和检测器阵 列沿着患者周围的弧形移动从位于给定片段内的多个投射角度采集数 据。然后将患者沿着z轴重新定位，采集另一片段的数据等等。此外， 在更加先进的临床螺旋CT中，患者在z方向上连续平移，而光源/检 测器设备连续旋转提供螺旋形的投射数据，然后将该数据进行内推得 到垂直于患者z轴的投影。在流式光学X线断层摄影中，研究对象(细 胞)相对于静止光源和检测器阵列以恒定速度流动，其中多个光源/检 测器系统与沿着细胞速度矢量的特定选通时间点同步获得数据，从而 产生位于一个给定片段或体积内的多个投射角数据。对于一个片段接 一个片段的扫描，重建算法计算垂直于移动轴的平面的二维图像，多 个片段的序列迭加将产生研究对象的3维图像，其中对比度是CT或流 式光学X线断层摄影中研究对象的x射线减弱系数或光密度变化的函 数。对于体积、锥形光束扫描，重建算法直接从平面透射或发射光投 影计算细胞内或其它研究对象内的体积的3维图像，其中对比度是成 像目标内的光密度和/或标记探针密度分布的函数。
理想的是，对于透射数据产生细胞密度重建，或对于发射数据重 建标记探针分布，或者两者都包括，采用图像重建算法而不是过滤的 反向投射。在某些情况下，常用的一类算法也就是公知的迭代重建算 法更加有效，特别是对于发射断层成像或在例如本发明中，在已知目 标轴向对称和具有三个腔室性质的情况下，在重建算法中可以结合先 验信息以提高重建的质量(参见，例如Gilbert，P，“Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections”，Journal of theoretical Biology 36：105-17，1972以及上文提及 的其它参考文献)。
类似地，一种方法可以是有利地采用基于有限元素模型(FEM) 的统计重建算法。FEM算法衍生自线性传输理论，其中在元素的所有 边缘求解光子传播/移动方程从而产生成像目标的吸收、散射、反射率 和各向异性因数特性的某些组合的两维或三维图形。上述方法的例子 参见Paulsen，KD和Jiang，H的“Spatially varing optical property reconstruction using a finite element diffusion equation approximation”， Medical Physics 22(691-701)1995，以及Hampel，U和Freyer，R的“Fast image reconstruction for optical absorption tomography in media with radially symmetric boundaries”，Medical Physics 25(1)：92-101，1998，以及 Jiang，H、Paulsen，KD和Osterberg，UL，“Frequency-domain near-infrared photo diffusion imaging：initial evaluation in multitarget tissuelike phantoms”，Me dical Physics 25(2)：183-93，1998。
颜色分离
如果使用多颜色的点光源(例如，白光)，则可以采用不同颜色 着色(例如生色团)以区分大量的分子探针和细胞内的结构特征。本 文，在光源或检测阵列(或两者)处采用系列带通滤波器分离波长数 据，并对单个着色分子进行重建和空间定位。对多个探针成像的更稳 固的办法是采用强白光光源，并同时收集传感器阵列的多个过滤带宽， 从而通过图像重建算法计算每个生色团的空间成像片段。这些可以显 示为彩色图像。
荧光、磷光、化学发光和纳米颗粒发光
作为流式光学断层成像系统的一个特殊例子，某些特定分子探针 可以用“报道分子”进行标记，所述报道分子在受到初级光子源激发 时，可以发出不同波长(更长)的光。来自报道分子的第二次发射可 以用标准光滤波器过滤以将初级光源的光子从次级发射的光子中分离 出来。然而，次级发射光子的图像重建算法更加复杂，这是因为从光 源发出的第二次发射的光子不一定是沿着直线射线路径。如果假设次 级点光源发出的次级光子为均一球形，则到达任一传感元件的次级光 子强度是与传感元件之间距离的简单函数。进一步的精细化通过提供 相对于点光源位于重建片段中的次级光子的空间分布，可以解释次级 光源发出的次级光子的非球形分布。上述任一方法提供了计算位于重 建片段或体积内的次级光源的位置的方法。成像目标与检测器阵列之 间的校准将改善图像重建。
如果通过光过滤同时计算初级光子强度和次级光子强度，则原始 光子强度的高分辨率密度重建可以叠加或融合在次级光源重建上，这 样在单个重建图像中就具有图像形态和定位的探针浓度。根据强度、 信噪比、以及在光源和/或传感器处过滤或产生窄波带光子的能力，利 用多个次级光源是有利的，每个次级光源对应于不同的标记分子探针。
2001年3月13日公开的Basiji等人的美国专利No.6201628(题目 是“高通量光扫描仪”)中披露了一扫描装置，用于对底物荧光、光 密度或磷光进行自动、快速和灵敏的扫描。所述扫描仪采用具有恒定 路径长度的光学系统，可以使进行高速扫描的移动光束与减少噪声的 相位灵敏检测结合起来。所述扫描仪包括光源，用于接收来自光源的 光并将其扫过控制镜的扫描镜，用于接收来自扫描镜的光并将其反射 给底物的控制镜，这样所述光沿着扫描弧经过底物，以及用于接收来 自底物的发射或散射光的光电检测器，其中光源至光电检测器的光路 路径长度在整个经过底物的扫描中基本恒定。所述光学系统可以进一 步地包括波导或反射镜用于收集来自底物的发射或散射光并将其引至 光电检测器。对于相位敏感检测，光源是强度调制的，检测器连接至 相位敏感检测电子设备。同时还提供了使用底物转换器的扫描仪。对 于两维成像，所述底物被转换成一维，而扫描镜扫描在第二维中扫描 光束。对于高通量的扫描仪，将多个底物放置于来自盘式供给机的传 输带上。美国专利No.6201628在本文结合并作为参考。然而，这些申 请中没有考虑到产生光学投射图像，因此不能用这些图像进行断层成 像重建。
如上所述，本申请是一自动检测细胞核中NDF和细胞质中CDF 的系统，其对患者的细胞进行光学投影和断层成像重建。根据与疾病 相关的NDF和CDF的存在与否，可以作出关于患者是否患有恶性肿 瘤的结论。
现在参照附图9，其示意性地给出了本发明一个实施例的对细胞重 建数据进行分类的方法。该系统可以包括数个分类器，它们可以共同 工作确定特定细胞样本是否含有靶细胞和诊断细胞，所述细胞具有与 疾病相关的NDF和CDF。一个分类器是计算机程序，基于特定特征值 94对目标进行分析。本发明的自动分类器系统可以包括，例如，初级 分类器90，其执行基本的筛选功能并选择靶目标。次级分类器92对细 胞目标进行分类，分为形态上不正常或形态上正常但是具有与疾病相 关的NDF和CDF，或正常而且不显示与疾病相关的NDF和CDF。可 以提供报道93对任一和全部分类器的分类结果进行详细解释。应理解 为根据应用可以采用多个和不同的分类器。
如上所述，本发明的自动系统可以包括一初级和次级分类器，但 是也可以使用单个分类器用于顺序进行本发明的分类。基于统计学方 法产生分类函数的软件包通常在商业上可以购得。
本发明的自动分类器优选包括基于直接计算出的NDF和CDF、采 用模糊二元判断或Bayesian统计判断来执行其分类功能的分类器。所 述分类器可以包括大量的特征值，例如包括形态特征，光度特征，离 散质地特征，Markovian质地特征，非Markovian质地特征，不规则碎 片质地特征以及运转周期质地特征。
初级分类器典型地可将靶目标分为三个类型：1)包括诊断细胞和 可能含有与疾病相关的NDF和CDF的细胞的上皮细胞；2)炎症细胞； 以及3)人造物品。初级分类器可以通过二元决策树和选择特征值进行 一个细胞接一个细胞的分类。
如上所述，本发明的系统将细胞核与人造物品、上皮细胞与其他 细胞类型、具有与疾病相关的NDF和CDF的细胞与其它正常上皮细 胞区分开来的能力依赖于分类器根据计算的特征值进行区分的能力。 例如，为了判别正常上皮细胞和异常上皮细胞(也就是，诊断细胞)， 本发明可以采用数个不同的判别函数，每个函数用于确认特定类型的 目标，以及NDF和CDF发生的改变。
次级分类器对经初级分类器选择的细胞样本中的上皮细胞进行分 类，也采用二元决策树和特征值执行其分类功能。所述次级分类器可 以认为是一个样本接一个样本的分类器，用于分析经初级分类器分类 的上皮细胞，并将这些细胞分为正常而且与疾病相关的NDF或CDF 阴性，或正常而且与疾病相关的NDF或CDF阳性。与初级分类器一 样，次级分类器基于一组优选的NDF和CDF值对细胞进行区分。
每个分类器所使用的特征组来自分析细胞核和/或细胞质的定量密 度特征的判别函数，而且优选包括最小数量的特征。理想地，选择最 小数量的最佳核特征将产生有效且稳定的分类器。也就是说，分类器 优选可以精确地对细胞或细胞类型进行分类，同时可靠地对各种细胞 和样本制剂进行分类。
所述分类器可以包括至少一个判别函数，其中判别函数采用来自x 射线照相的特征对样本中靶细胞进行分类，包括但不局限于，一维和 二维核密度特征(NDF)以及细胞质密度特征(CDF)，和选自以下 的特征，包括面积、平均半径、光密度(OD)方差、光密度斜度、光 密度范围、光密度平均值、光密度最大值、光点密度、低DNA区域、 高DNA区域、低DNA量、高DNA量、高平均距离、中等/高平均距 离、相关性、均匀性、熵、分形维数、DNA指数、质地、点状、连接 部分以及在空间密度频率空间中的各种谐波。
细胞样本可以是人类的肺组织、宫颈组织、血样或可以含有不寻 常细胞。在一个例子中，用于确定NDF和CDF而对样本进行着色包 括用化学计量或成比例的DNA和RNA染料进行着色。DNA染料可 以选自以下构成的组中，福尔根(Feulgen)染料，Romanowski染料， May-Grunwald-Giemsa染料，甲基绿和硫堇。在另一例子中，样本可以 用抗体标记物进行着色以确定NDF和CDF。在另一个例子中，可以非 常有利地采用核酸序列标记物对样本进行着色。
本发明的系统对于分析生物细胞的不同类型是有用的。在一个例 子中，靶细胞被选择用于诊断癌症，和/或，所述靶细胞可以有利地是 扩散前的癌细胞。靶细胞可以包括扩散的癌细胞，其中利用所述靶细 胞筛选癌症患者。也可以利用靶细胞确定患者是否会患有扩散性癌症。 所述扩散癌细胞可以源自上皮细胞癌。选择性地，或另外，所述扩散 前的癌细胞可以源自上皮细胞癌。有利地是，上皮细胞癌可以选自由 以下构成的组中，肺癌和喉癌、宫颈癌和卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、 皮肤癌和胃肠道癌症。
在用于分析多维图像的实施例中，例如，3维图像和更高维(3维 +)图像，对样本中靶细胞进行分类的特征可以包括但不局限于，一维、 二维、3维、3维+核密度特征(NDF)和细胞质特征(CDF)，以及 选自由以下构成的特征，包括面积、平均半径、体积、平均体积、光 密度(OD)方差、光密度斜度、光密度范围、光密度平均值、光密度 最大值、光点密度、低DNA容量、高DNA容量、低DNA量、高DNA 量、高平均距离、中等/高平均距离、相关性、均匀性、熵、分形维数、 DNA指数、质地、点状、连接部分以及在空间密度频率空间中的各种 谐波。高DNA容量，例如可以是高于对正常细胞群进行测量得到的基 线。
本文对本发明进行了详细地描述以符合专利法，并提供了本领域 技术人员所需的信息以应用本发明的新颖原理，并构建和使用所需要 的示范性和专门组件。然而，应理解为，本发明可以通过不同的设备、 装置和重建算法实施，可以对本发明作出关于设备细节和操作步骤的 各种改变，只要不偏离本发明的真正精神和范围。
相关申请
本申请是尚未审批的由Alan C.Nelson于2001年8月10日提出的 美国申请09/927151的系列申请，而该申请又与Alan C.Nelson于2001 年3月28日提出的尚未审批的临时申请(序列号为60/279244)相关， 上述两个申请的名称均为“用光学X线断层摄影法显示流体中微小物 体的装置和方法”。