一种检测绝对端粒长度的PCR方法
专利汇可以提供一种检测绝对端粒长度的PCR方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种检测绝对端粒长度（absolute telomere length）的PCR方法，能方便准确地检测人端粒的绝对长度，属于分子 生物 技术和医学检测领域。本发明采用基因合成的方法，分别合成端粒和单拷贝基因36B4的寡核苷酸序列，并连接到质粒载体上构建标准品，使用大肠杆菌体外扩增质粒标准品，提取质粒DNA，测量浓度，计算拷贝数及端粒总长度。确定标准品起始量，进行梯度稀释，采用 荧光 定量PCR法（Q-PCR法）分别得到端粒及36B4的标准曲线，通过标准曲线对待测样本DNA的端粒总长度以及36B4的拷贝数绝对定量，从而计算待测样本DNA的平均绝对端粒长度。采用绝对端粒长度PCR法检测端粒长度，具有成本低、周期短、准确度高的优点，适合高通量检测，易于临床推广使用，实用性较强。，下面是一种检测绝对端粒长度的PCR方法专利的具体信息内容。
1.一种检测绝对端粒长度的PCR方法，其特征在于，采用基因合成的方法，分别合成端粒和单拷贝基因36B4的寡核苷酸序列，并连接到质粒载体上构建标准品，使用大肠杆菌体外扩增质粒标准品，提取质粒DNA，测量浓度，计算拷贝数及端粒总长度；确定标准品起始量，进行梯度稀释，采用荧光定量PCR法（Q-PCR法）分别得到端粒及36B4的标准曲线，通过标准曲线对待测样本DNA的端粒总长度以及36B4的拷贝数绝对定量，从而计算待测样本DNA的平均绝对端粒长度，步骤包括：
（1）基因组DNA提取：取适量全血或细胞，用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，使用酶标仪测量其浓度和纯度；
（2）设计并合成端粒和单拷贝基因36B4的引物；
（3）选择质粒载体，设计并人工合成端粒和单拷贝基因36B4的基因，连接到质粒载体上，构建质粒标准品；
（4）使用大肠杆菌扩增质粒标准品；
（5）质粒DNA提取：使用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA，使用酶标仪测量其浓度和纯度；
（6）标准曲线的制作：
①端粒标准曲线制作：根据基因合成报告单，获得端粒质粒标准品的总长度，计算质粒平均分子量（MW）=(碱基对数)×(660 道尔顿/碱基)g/mol；根据公式质粒拷贝数copies/ul =(6.02× 1023 copies/mol) × (浓度ng/ul×10-9) / （MW g/mol），公式端粒长度（kb/ul）= copies/ul×84bp，计算标准品起始模板量20ng质粒DNA对应的端粒总长度为6.96×
108kb，等比稀释，稀释倍数为10，标准品设置5个点，标准品最低模板量对应的端粒总长度为6.96×104kb，通过端粒标准曲线对待测样本DNA端粒总长度进行定量，得到具体数值；
②单拷贝基因36B4标准曲线制作：根据基因合成报告单，获得单拷贝基因36B4质粒标准品的总长度，计算质粒平均分子量（MW）=(碱基对数)×(660 道尔顿/碱基)g/mol；根据公式质粒拷贝数copies/ul =(6.02× 1023 copies/mol) × (浓度ng/ul×10-9) / （MW g/mol），标准品起始模板量0.2ng质粒DNA对应的单拷贝基因36B4拷贝数的为6.56×107，等比稀释，稀释倍数为10，标准品设置5个点，标准品最低模板量对应的单拷贝基因36B4拷贝数为6.56×103，通过36B4标准曲线对待测样本DNA单倍体拷贝数进行定量，得到具体数值；
（7）绝对端粒长度PCR检测待测样本DNA端粒长度：
①端粒反应体系及反应条件：PowerUp SYBR Green Master Mix(2×)10ul、Tel-F（10uM）0.54ul、Tel-R（10uM）1.8ul、DNA2ul、Rnase-free H2O 5.66ul；按50℃ 2min，95℃
2min，95℃ 15S、60℃ 1min 40个循环进行反应；
②单拷贝基因36B4反应体系及反应条件：PowerUp SYBR Green Master Mix(2×)
10ul、36B4-F（10uM）0.6ul、36B4-R（10uM）1ul、DNA2ul、Rnase-free H2O 6.4ul；按50℃
2min，95℃ 2min，95℃ 15S、52℃ 15S、72℃ 1min 40个循环进行反应；
（8）数据分析：通过待测样本DNA端粒总长度及单倍体拷贝数，计算平均绝对端粒长度。
2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（2）中端粒和单拷贝基因36B4引物序列如下：
Tel-FCGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT
TEL-RGGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT
36B4-FCAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC
36B4-R CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。
3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）端粒和单拷贝基因36B4质粒载体及标准品序列如下：
端粒 pMV261质粒载体 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
36B4 pUC57 质粒载体
CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGTACCCGTTGATGATAGAATGGG。
一种检测绝对端粒长度的PCR方法
技术领域
背景技术
5’→ 3’方向简单重复的(TTAGGG)序列组成，端粒长度为0.5-20kb。端粒是非结构基因，不具有编码蛋白质的功能，但却具有其他重要的生物学功能，例如保证DNA的完整复制，维持染色体结构稳定，控制细胞分裂周期，可作为细胞的“分裂时钟”反映细胞的分裂能力。正常情况下，由于 DNA 聚合酶不能完整的复制染色体的末端，端粒DNA会随着细胞的每次分裂
而缩短，当其缩短到一定长度时，染色体则无法完成正常复制，细胞有丝分裂也会随之停
滞，转而进入衰老阶段，因此端粒长度的变化决定着细胞的命运。
义，因此急需一种精确度高且经济实用的端粒检测方法。
发明内容
粒长度的检测。
酶标仪测量其浓度和纯度；
（2）设计并合成端粒和单拷贝基因36B4的引物；
（3）选择质粒载体，设计并人工合成端粒和单拷贝基因36B4的基因，连接到质粒载体
上，构建质粒标准品；
（4）使用大肠杆菌扩增质粒标准品；
（5）质粒DNA提取：使用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA，使用酶标仪测量其浓度和纯
度；
（6）标准曲线的制作：
①端粒标准曲线制作：根据基因合成报告单，获得端粒质粒标准品的总长度，计算质粒
平均分子量（MW）=(碱基对数)×(660 道尔顿/碱基)g/mol；根据公式质粒拷贝数copies/ul
23 -9
=(6.02× 10 copies/mol) × (浓度ng/ul×10 ) / （MW g/mol），公式端粒长度（kb/
ul）= copies/ul×84bp，计算标准品起始模板量20ng质粒DNA对应的端粒总长度为6.96×
108kb，等比稀释，稀释倍数为10，标准品设置5个点，标准品最低模板量对应的端粒总长度为6.96×104kb，通过端粒标准曲线对待测样本DNA端粒总长度进行定量，得到具体数值。
g/mol），计算标准品起始模板量0.2ng质粒DNA对应的单拷贝基因36B4的拷贝数为6.56×
107，等比稀释，稀释倍数为10，标准品设置5个点，标准品最低模板量对应的单拷贝基因
36B4拷贝数为6.56×103，通过36B4标准曲线对待测样本DNA单倍体拷贝数进行定量，得到
具体数值。
（10uM）0.54ul、Tel-R（10uM）1.8ul、DNA2ul、Rnase-free H2O 5.66ul；按50℃ 2min，95℃
2min，95℃ 15S、60℃ 1min 40个循环进行反应。
2min，95℃ 2min，95℃ 15S、52℃ 15S、72℃ 1min 40个循环进行反应。
TEL-RGGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT
36B4-FCAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC
36B4-R CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA
进一步的，步骤（3）端粒和单拷贝基因36B4标准品序列如下：
端粒 pMV261质粒载体
TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT
TAGGGTTAGGG
36B4 pUC57 质粒载体
CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGTACCCGTTGATGATAGAATG
GG
本发明的有益效果是：本发明在Q-PCR法检测端粒相对长度的基础上，加入端粒与单拷
贝基因36B4标准曲线，对待测样本DNA的端粒与单拷贝基因36B4进行绝对定量，从而获得平均绝对端粒长度。本发明待检测样本DNA，包括人淋巴细胞基因组DNA、人全血基因组DNA及人源细胞系基因组DNA，仅需要10ngDNA，即可获得绝对端粒长度。本发明检测方法，检测成本低、通量高，检测结果准确、可靠，适合大规模样本高通量检测。
附图说明
图1为本发明具体实施方式端粒质粒标准品构建图谱；
图2为本发明具体实施方式单拷贝基因36B4质粒标准品构建图谱；
图3为本发明具体实施方式端粒扩增曲线图；
图4为本发明具体实施方式端粒熔解曲线图；
图5为本发明具体实施方式端粒标准曲线图；
图6为本发明具体实施方式单拷贝基因36B4扩增曲线图；
图7为本发明具体实施方式单拷贝基因36B4熔解曲线图；
图8为本发明具体实施方式单拷贝基因36B4标准曲线图。
具体实施方式
离液分离淋巴细胞；
（2）基因组DNA提取：取分离的淋巴细胞，用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试
剂盒提取淋巴细胞基因组DNA，使用酶标仪测量其浓度和纯度，A260/A280值介于1.8-2.1之间DNA纯度合格，可用于检测。
Tel-F CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT 39 HPLC
TEL-R GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT 39 HPLC
36B4-F CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 23 HPLC
36B4-R CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA 25 HPLC
（4）选择质粒载体，设计并人工合成端粒和单拷贝基因36B4的基因，连接到质粒载体
上，构建质粒标准品；
标准品 质粒载体 序列5’→ 3’ 长度
TEL pMV261 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 84bp
36B4 pUC57 CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGTACCCGTTGATGATAGAATGGG 75bp（5）使用大肠杆菌扩增质粒标准品：将构建的质粒标准品导入大肠杆菌中，使用LB培养
基培养大肠杆菌，扩增质粒标准品；
（6）质粒DNA提取：使用 Axygen质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA，使用酶标仪测量其
浓度和纯度，A260/A280值介于1.8-2.1之间DNA纯度合格，可用于检测；
（7）标准曲线的制作：
①端粒标准曲线制作：根据基因合成报告单，获得端粒质粒标准品的总长度，计算质粒
平均分子量（MW）=(碱基对数)×(660 道尔顿/碱基)g/mol；根据公式质粒拷贝数copies/ul =(6.02× 1023 copies/mol) × (浓度ng/ul×10-9) / （MW g/mol），公式端粒长度（kb/
ul）= copies/ul×84bp，计算标准品起始模板量20ng质粒DNA对应的端粒总长度为6.96×
108kb，等比稀释，稀释倍数为10，标准品设置5个点，标准品最低模板量对应的端粒总长度为6.96×104kb，通过端粒标准曲线对待测样本DNA端粒总长度进行定量，得到具体数值。
g/mol），计算标准品起始模板量0.2ng质粒DNA对应的单拷贝基因36B4的拷贝数为6.56×
7
10 ，等比稀释，稀释倍数为10，标准品设置5个点，标准品最低模板量对应的单拷贝基因
36B4拷贝数为6.56×103，通过36B4标准曲线对待测样本DNA单倍体拷贝数进行定量，得到
具体数值。
Grade Water，配置成10uM的工作液。
试剂 体积
ABI PowerUp SYBR Green Master Mix(2×) 10ul
Tel-F（10uM） 0.54ul
Tel-R（10uM） 1.8ul
Rnase-free H2O 5.66ul
DNA 2ul
36B4反应体系：
试剂 体积
ABI PowerUp SYBR Green Master Mix(2×) 10ul
36B4-F（10uM） 0.6ul
36B4-R（10uM） 1ul
Rnase-free H2O 6.4ul
DNA 2ul
③PCR反应条件
程序 TEL 36B4
激活UDG酶 50℃ 2min 50℃ 2min
预变性 95℃ 2min 95℃ 2min
变性 95℃ 15s 95℃ 15s
退火 60℃ 1min 52℃ 15s
延伸 72℃ 1min
循环数 40个 40个
PCR分为两部份，第一部分是检测样本DNA总端粒长度，第二部分是检测样本DNA单拷贝
基因36B4拷贝数，每次反应都包含标准曲线。这两部分分别在两个96孔板上进行， 为确保实验数据的稳定性和准确性，每个样本在两个板上的位置是相互对应的(包括排和列)，每
个样本设置三个复孔可以最大限度的减少检测误差。
有可比性并减少实验误差，需要在每一块板中加入阳性对照孔(已知端粒长度的样本）。
保每个待测样本都落在标准曲线生成的直线范围内；观察熔解曲线，确保无非特异性产物
扩增；每个样本三个副孔的Ct值的标准误须在0.5Ct(CV>5%)。
值即待测样本DNA单倍体平均绝对端粒长度。因人类单倍体中含有23条染色体，46个端粒，所以单倍体平均绝对端粒长度/46=平均绝对端粒长度。
理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意
义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均
应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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