RPS23基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用
阅读：5发布：2021-01-12
专利汇可以提供RPS23基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 家畜 分子标记制备技术领域，具体涉及RPS23基因作为 绵羊 免疫性状的分子标记及其应用。本发明制备的分子标记由RPS23基因克隆得到，它的核苷酸序列如 序列表 SEQ ID NO：2所述。在序列表SEQ ID NO：2的第221bp处有1个A221-G221的 碱 基替换，该突变导致Bsa Ⅰ-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增RPS23基因完整CDS序列和部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为绵羊免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。，下面是RPS23基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用专利的具体信息内容。
1.一种克隆的与绵羊免疫性状检测的分子标记，它的核苷酸序列如下所示：
GAGTTTCCCCCAGTTGTTTATAGGATGGATGGGTGTTTTGGGCGATTGCCACTTAACACCAGAAGTAAACTGTTGGTTTTTTATTCCAGGAAAATGATGAAGTTCTGGTTGCTGGATTTGGTCGCAAAGGTCATGCTGTTGGTGACATTCCTGGAGTCCGCTTTAAGGTTGTCAAAGTAGCCAATGTCTCTCTTTTGGCTTTGTACAAAGGCAAGAAGGARAGACCAAGATCATAAATTTTGATGATGAAAGCGCGATAG
上述序列第221bp处的R是A或G，该突变导致PCR-Bsa Ⅰ-RFLP多态性。
2.一种检测权利要求1所述分子标记的PCR引物对，该引物对的DNA序列如下所示：
正向引物：GAGTTTCCCCCAGTTGTT，
反向引物：CTATCGCGCTTTCATCATC。
3.一种与绵羊免疫性状检测的分子标记的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤:
从绵羊湖羊全血中提取基因组DNA，在位于绵羊RPS23基因突变位点附近设计一对引物，该引物对的DNA序列如权利要求2所示，对绵羊基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如SEQ ID NO：2所示的序列，通过序列比对，筛查SNP，再利用权利要求2所示的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行Bsa Ⅰ酶切分型及检测。
4.权利要求1所述的分子标记在绵羊免疫性状检测中的应用。
5.权利要求2所述的PCR引物对在绵羊免疫性状检测中的应用。
RPS23基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 在养羊业生产中，疾病严重威胁着羊只的健康并造成巨大的经济损失。尽管通过加强饲养管理和应用药物疫苗等措施可预防疾病，但未能十分有效控制传染病的流行，同时大量药物的使用会使动物机体产生耐药性，给畜产品的安全造成隐患。
[0003] 长远来看，从抗病力的遗传基础研究出发，筛选抗性基因，从分子水平开展抗病育种，从遗传上提高羊只对病原的抗性，增强免疫力是从根本上解决这一问题的重要途径。抗病育种潜在的巨大经济效益以及某些疾病可作为研究人类疾病动物模型的诱人前景，正有力地推动着这项工作的发展。随着分子生物学、分子遗传学和基因工程技术的发展，抗病育种在绵羊的育种中已经开始发挥重要作用。
[0004] 在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。目前国内外已鉴定出的主要抗病候选基因有以下几个：
[0005] (1)天然抗性巨噬结合蛋白1(Natural resistance-associated macrophage protein 1，Nramp1)，Nramp是一个基因家族，是目前研究较多的宿主抗性基因之一，至少包括2～3个成员，现已发现有Nramp1和Nramp2。国内外学者对Nramp1基因与抗病力的相关性进行了大量的研究，把Nramp1基因作为功能基因研究其结构与动物抗病性状的报道也较多，但主要集中在人类、小鼠、猪和家禽上(陈冬金，谢喜平，陈岩锋，等.畜禽Nramp1基因抗病作用的研究进展.畜牧与饲料科学，2012，33(7)∶79-81.)。绵羊的Nramp1基因定位在1号染色体2q41-q42的区域(Pitel F.E.P.Cribiu，M.Yerle，et al.Regional localization of the ovine NRAMP gene to chromosome 2q41-q42by in situ hybridization.Cytogenet Cell Genet，1995，70(1-2)：116～118.)，山羊的Nramp1基因定位于2号常染色体上长臂q12.2(Vacca G.M.M.Pazzola，C.Pisano，et al.Chromosomal localisation and genetic variation of the SLC11A1gene in goats(Capra hircus).Vet J，2011.190(1)：60～65.)。研究发现，绵羊Nramp1基因多态性与伤寒沙门氏菌易感性和抗性有关(姚菊霞，王光华，马利青.羊主要抗病候选基因的研究进展.青海畜牧兽医杂志，2014,44(5)：40～43.)。Nrampl蛋白可抵抗分枝杆菌、沙门氏菌等多种胞内寄生病原菌的侵染而发挥重要的免疫功能，对畜禽机体抗病力影响较大(吴宏梅等，NRAMPl基因研究进展及其在抗病育种中的应用.中国畜牧兽医，2005，32(4)：26～28)。
[0006] (2)主要组织相容性复合物(MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成的一个定位于动物某对染色体的特定区域，与免疫应答和抗病性密切相关的多基因家族，在宿主的免疫反应中对病毒、细菌、寄生虫的控制和清除有重要作用。目前，已证实主要组织相容性复合物与人类和家畜的多种疾病存在着密切关系。因此，近年来对MHC的研究成为家畜抗病育种研究中的前沿部分(孙东晓等.反刍家畜主组织相容性复合物的研究进展.中国畜牧杂志，2002，38(5)：46～47.)。绵羊的MHC称为OLA(绵羊白细胞抗原)，位于第20号染色体上，具有高度的多态性和连锁不平衡性。根据MHC抗原结构和功能的不同，可将MHC分为class Ⅰ型class Ⅱ型和classⅢ型。一般认为绵羊MHC class Ⅱ的多态性和遗传性是为了保护机体组织对抗疾病的感染。在这个基因区域有DQ和DR两个亚区，OLAⅡ类分子的DQ和DR亚区的DRB和DQB两个基因位点所编码的MHC在抗原免疫系统中发挥着最主要的作用；其第2个外显子编码抗原的功能区(抗原结合区)具有丰富的多态性，它组成Ⅱ类抗原分子功能最重要的部分。此外，MHC与生产性能具有密切的联系，但需要进一步研究才能应用于家畜的遗传标记。
[0007] 此外，其它有研究的与抗病力有关的基因是TLR(Toll-like receptor，Toll样受体)MX1(Myxovirus(influenza)resistance 1，粘液病毒(流感)抗性因子1)、IL1(Interleukins 1，白 细 胞 介 素 1)、PPARG(Peroxisome proliferator activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因。
[0008] 最近研究发现老鼠上的一个基因，RPS23逆转录转座基因1，调节β-淀粉样蛋白水平和牛磺酸磷酸化水平，阿尔茨海默病(AD)的两个病理特征，并且发现RPS23rg1是由鼠的RPS23mRNA逆转录转座引起的。同时发现RPS23mRNA逆转录转座在不同物种中发生多次但在鼠中只生成另一个RPS23rg1同源基因功能表达，RPS23rg2，而人类可能不具备RPS23rg的功能性同系物。相对地RPS23rg1和RPS23rg2都是相对于父母代RPS23基因转录，在各种组织和与腺苷酸环化酶进行交互编码蛋白质中表达。与RPS23rg1蛋白类似，RPS23rg2能对蛋白激酶A的活动进行上调来降低糖原合成酶激酶的活性，β-淀粉样蛋白水平和牛磺酸磷酸化水平。然而，RPS23rg2的影响比RPS23rg1要弱，这种差异可能是由于RPS23rg2额外的羧基末端区域导致的，这可能就有抑制作用。此外，研究人员还发现RPS23rg 1的跨膜结构域对这个功能很重要。该研究结果提供了一个新的基因家族，它的产物和相关信号通路可能会阻止鼠的阿尔茨海默病的发展(Huang X,Chen Y,Li W B,et al.The Rps23rg gene family originated through retroposition of the ribosomal protein s23mRNA and encodes proteins that decrease Alzheimer's beta-amyloid level and tau phosphorylation[J].Hum Mol Genet.2010,19(19):3835-3843.)。
[0009] 通过以上资料我们可以得出RPS23基因参与多种生理病理过程并发挥着重要的作用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊HPSE基因的克隆、SNP筛查、检测及与性状关联分析。
发明内容
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，制备一种与为绵羊免疫性状的分子标记及其应用。本发明的分子标记从RPS23基因中得到。采用克隆绵羊RPS23基因的完整CDS序列，寻找RPS23基因的突变位点以及基因的多态性的检测方法，进而建立适用于绵羊免疫性状的分子标记的方法。
[0011] 具体地，本发明的技术方案如下所述：
[0012] 一种从绵羊RPS23基因片段中克隆得到一种作为与绵羊免疫性状相关的分子标记，该标记完整的编码区序列如序列表SEQ ID NO：1和图1所示，它的部分DNA序列如序列表SEQ ID NO：2和图2所述。在SEQ ID NO：1所示序列的第421位碱基处有一个A/G碱基突变，即在作为本发明的分子标记的如序列表SEQ ID NO：2所示序列的第221位碱基处有一个A221-G221的碱基突变，该突变位于第4外显子内，导致Bsa Ⅰ-RFLP多态性。
[0013] 申请人设计了一对克隆绵羊RPS23基因的CDS引物序列，该引物扩增的CDS序列如SEQ ID NO：1所述。同时申请人设计了一对包含第4外显子的用于扩增绵羊RPS23基因组序列的引物，该引物扩增的序列如SEQ ID NO：2所述(即本发明制备的分子标记)。
[0014] 申请人提供了一种制备上述分子标记的方法，所述的方法按照以下步骤进行：
[0015] 以成年湖羊瘤胃、肾、肺和脾脏等组织样提取总RNA为模板，作RT-PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列(包括全部CDS)；从绵羊血液基因组中提取DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0016] 应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：2的第221位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与绵羊免疫性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。附图说明
[0017] 序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的绵羊免疫性状的基因RPS23的cDNA序列。
[0018] 序列表SEQ ID NO：2是本发明制备的与绵羊免疫性状相关的分子标记的序列(RPS23基因用于PCR-RFLP部分DNA序列)。
[0019] 图1：是本发明克隆的绵羊免疫性状的RPS23基因用于PCR-RFLP部分DNA序列。下划线部分是引物的序列。
[0020] 图2：是本发明制备的与绵羊免疫性状相关的分子标记的序列(序列的下划线部分：即1-18bp和241-260bp为上、下游引物序列)
[0021] 图3：是本发明中绵羊RPS23基因用于克隆的CDS片段的凝胶电泳图。附图标记说明：1～10泳道:RPS23；M泳道:DL 2000Marker。
[0022] 图4：是本发明中绵羊RPS23基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段凝胶电泳图。其中:1～6泳道:RPS23；M泳道:DL 2000Marker
[0023] 图5：是绵羊RPS23基因突变位点测序峰图。
[0024] 图6：是本发明中绵羊RPS23基因BsaⅠ-RFLP的三种基因型(AA AG GG)电泳结果。附图标记说明：图中M：DNA分子量标准(DL2000ladder)。
具体实施方式
[0025] 实施例1、RPS23基因的克隆
[0026] (1)引物设计
[0028] RPS23：M-F：5＇-CAGGATGGGCAAGTGTCG-3＇，
[0029] M-R：5＇-CTATCGCGCTTTCATCATC-3＇。
[0030] (2)、PCR产物的克隆和测序
[0031] 将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体(购自宝生物工程大连有限公司)在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5mL Ependorff管中，将5μL的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，后冰浴3～4min，加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μL涂布于异丙基硫代－β-D－半乳糖苷(IPTG)X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2－3mL LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5mL EP管12000r/min离心数秒收集菌体进行制备少量的质粒。验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成，得到一条长度为460bp的cDNA序列(见SEQ ID NO：1所述)。
[0032] DNA序列同源性检索鉴定：
[0033] 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网 站 的 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊RPS23基因cDNA(GenBank收录号：XM_004009060.2)的部分序列同源性达99％。
[0034] 实施例2、PCR-RFLP诊断方法的建立
[0035] (1)、引物序列设计
[0036] RPS23：M-F：5＇-GAGTTTCCCCCAGTTGTT-3＇
[0037] M-R：5＇-CTATCGCGCTTTCATCATC-3＇
[0038] PCR反应总体积20μL，其中绵羊基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液(购自Promega公司)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，60.6℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到260bp特异扩增片段，该片段位于第4外显子(如图2)。测序的结果发现在该260bp片段中存在一个BsaⅠ酶切位点(↓GAGACC)，其中第221bp处为多态性切点，位于第4外显子中(图3)。
[0039] (3)PCR-RFLP检测条件
[0040] PCR产物酶切反应体积是10μL，其中1×buffer 1μL，PCR产物3～5μL，限制性内切酶BsaⅠ为0.3μL(10U)，用H2O补足10μL，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第221bp位置是A时，则该Fnu4HⅠ酶切位点不存在，Fnu4HⅠ酶切后检测结果只有1个片段，长度是769bp(定为等位基因A)；但存在A221→G221的替换时，其结果导致第221bp处一个BsaⅠ酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为221bp和39bp(定为等位基因G)，三种基因型GG，AG，AA如图6所述。
[0041] (4)本发明的分子标记在绵羊免疫性状标记性状关联分析中的应用[0042] 试验共检测了194只湖羊和73只湖杜湖杂交羊(湖♂×(杜泊羊♂×湖羊♀)♀)的多态性，确定其基因型，并进行基因型与免疫性状(白细胞计数(WBC)，红细胞计数(RBC)，血红蛋白(HGB)，红细胞压积(HCT)，红细胞平均体积(MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，血小板计数(PLT)，红细胞分布宽度(RDW)，血小板体积分布宽度(PDW)，平均血小板体积(MPV)，血小板压积(PCT))的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
[0043] Yijlk＝μ+Genotypei+Breedi+Sexl+Pk+Combinationm+εijlkm
[0044] 其中，Yijkl是性状观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Breedj为品种效应，Sexl为性别效应，Pk为批次效应，Combinationm为组合的效应，εijlmk为随机误差，假2
定εijlmk相互独立，服从N(0，σ )分布。基因型检测结果表明在267个个体中AA基因型有
245个，AG基因型有21个个体，GG基因型有1个个体(由于个体较少，性状关联分析时应剔除)。基因型与性状关联分析的结果是：RPS23基因与血小板体积分布宽度呈显著相关。
定εijlmk相互独立，服从N(0，σ )分布。基因型检测结果表明在267个个体中AA基因型有
245个，AG基因型有21个个体，GG基因型有1个个体(由于个体较少，性状关联分析时应剔除)。基因型与性状关联分析的结果是：RPS23基因与血小板体积分布宽度呈显著相关。
[0045] 由表1可知，RPS23基因SNP位点对血小板体积分布宽度有显著影响(P<0.05)，其中AA基因型个体的血小板体积分布宽度显著显著高于AG基因型个体的对应值。
[0046] 表1绵羊RPS23基因c.720A>G BsaⅠ酶切位点的多态性与部分免疫性状关联分析
[0047]
[0048] 注：表1中的*表示P<0.05。表中性状值为平均数±标准差。
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