[0001] 相关申请的交叉参考本申请要求2015年9月30日递交的美国临时申请第62/235477号、2016年1月14日递交
的美国临时申请第62/278866号、2016年2月9日递交的美国临时申请第62/293235号以及
2016年2月25日递交的美国临时申请第62/299952号的优先权，其内容在此通过参照具体结
合。在整个该说明书中引用的任何专利、专利申请和参考文献的内容特此通过参照以其全
部结合。

[0002] 本发明涉及用eteplirsen在患者中治疗肌营养不良的改进方法。还提供适合于促进人肌营养不良蛋白基因中51号外显子跳跃的组合物。

[0003] 在多种遗传性疾病中，突变对基因最终表达的影响可通过剪接过程期间所靶向的外显子跳跃的过程来调控。在正常地功能蛋白由于其中的突变而过早终止的情况下，用于
通过反义技术修复一些功能蛋白产生的手段已经显示通过在剪接过程期间进行干预是可
能的，并且如果与致病突变相关的外显子可从某些基因特异性地缺失，则有时可产生与天
然蛋白质具有类似生物学性质或具有足够生物活性以改善由与外显子相关的突变引起的
疾病的缩短的蛋白质产物(参见例如Sierakowska, Sambade等人 1996; Wilton, Lloyd等
人 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout等人 2001; Lu, Mann等人 2003; Aartsma-Rus, 
Janson等人 2004)。

[0004] 杜兴氏肌营养不良(DMD)由蛋白质肌营养不良蛋白表达缺陷引起。编码蛋白质的基因含有79个外显子，分布在超过200万个核苷酸的DNA上。改变外显子阅读框或引入终止
密码子，或者特征为除去整个的一个或多个框外外显子或重复一个或多个外显子的任何外
显子突变，都有可能破坏功能性肌营养不良蛋白的产生，导致DMD。

[0005] 出生时肌酸激酶水平升高可以记录到疾病发作，并且在生命的第一年可能存在显著的运动缺陷。到7或8岁时，大多数DMD患者步态越来越吃力，并且失去从地板起身并爬上楼梯的能力；到10-14岁时，大多数依赖轮椅。DMD一律是致命的，受影响的个体一般地在其十八九岁或20岁出头时死于呼吸衰竭和/或心力衰竭。DMD的持续进展允许在疾病的所有阶
段进行治疗性干预，然而，治疗目前限于糖皮质激素，其与许多副作用相关，包括体重增加、行为变化、青春期变化、骨质疏松症、库欣综合征样面容(Cushingoid facies)、生长抑制和白内障。因此，开发更好的疗法来治疗这种疾病的根本原因势在必行。

[0006] 已经发现出现了肌营养不良的一种不太严重的形式即贝克型肌营养不良(Becker muscular dystrophy, BMD)，其中突变(一般地是缺失一个或多个外显子)导致沿着整个肌
营养不良蛋白转录物的正确阅读框，使得mRNA翻译成蛋白质不会过早终止。如果在突变的
肌营养不良蛋白pre-mRNA的加工中上游和下游外显子的连接保持基因的正确阅读框，则结
果是编码具有短内部缺失的保持一些活性的蛋白质的mRNA，导致贝克型表型。

[0007] 多年来已经知道，不改变肌营养不良蛋白阅读框的一个或多个外显子的缺失会产生BMD表型，而引起移码的外显子缺失将会产生DMD(Monaco, Bertelson等人 1988)。通常，改变阅读框并因此中断正确的蛋白质翻译的肌营养不良蛋白突变(包括点突变和外显子缺
失)导致DMD。还应该注意到，某些BMD和DMD患者具有覆盖多个外显子的外显子缺失。

[0008] 测试用于治疗DMD的剪接转换寡核苷酸(splice switching oligonucleotide, SSO)的安全性和功效的最近临床试验基于SSO技术，以通过空间阻断剪接体来诱导pre-
mRNA的选择性剪接(Cirak等人, 2011; Goemans等人, 2011; Kinali等人, 2009; van 
Deutekom等人, 2007)。然而，尽管取得了这些成功，但是可用于治疗DMD的药理学选择有
限。

[0009] 因此，仍然需要用于在患者中治疗肌营养不良比如DMD和BMD的改进的组合物和方法。

[0010] 本公开至少部分地基于令人信服的临床证据，所述证据显示，如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的那样，在4年时间内，伴随DMD患者肌肉中同时产生新的肌营养不良蛋白，用
51号外显子跳跃反义寡核苷酸eteplirsen治疗稳定步行能力(例如稳定离床活动)。具体地
讲，每周一次以30 mg/kg的剂量用eteplirsen长期治疗的DMD患者中有83% (10/12)在第
192周保持能离床活动，肺功能持续稳定。事实上，在eteplirsen治疗期的第168-192周之
间，患者离床活动稳定。这种治疗功效与观察到所有患者在180周时具有可测量的51号外显子跳跃相关。此外，在180周时，如通过免疫组织化学测量的那样，11名患者中有10名具有肌营养不良蛋白阳性纤维，和如通过蛋白质印迹分析测量的那样，11名患者中有9名具有肌营养不良蛋白的蛋白质表达。如通过免疫组织化学测定的那样，未接受eteplirsen的匹配的
外部对照患者没有肌营养不良蛋白阳性纤维，和如通过蛋白质印迹分析测定的那样，9名患者中仅有1名具有肌营养不良蛋白的蛋白质表达。

[0011] 另外，在192周治疗期内用超过2300个剂量的eteplirsen治疗的患者中未观察到与药物相关的严重不良事件。

[0012] eteplirsen的这些出乎意料的临床观察结果的意义进一步通过以下事实放大：相对于所有DMD患者或在DMD基因的任何外显子中具有突变的DMD患者，具有顺从51号外显子
跳跃的突变的患者具有特别差的预后(参见图5)。此外，eteplirsen能够在7岁或更大的患
者中获得这些令人信服的治疗效果。如图4中显示的那样，相对于年龄小于7岁的患者的离
床活动下降比率，该年龄组的患者通常在离床活动方面遭遇急剧下降。因此，本公开确立
eteplirsen治疗可延缓具有特别侵袭性DMD形式的患者亚群的疾病进展和/或稳定疾病。

[0013] 因此，在一个方面，本发明涉及用于治疗杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静
脉内给予患者eteplirsen超过168周，从而治疗患者。

[0014] 在另一方面，本发明涉及通过延缓疾病进展来治疗杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过168周，使得如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的那
样，患者的疾病进展被延缓，从而治疗患者。

[0015] 在另一方面，本发明涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过168周，从而如通过6分钟步行试
验(6MWT)测量的那样，在患者中相对于基线保持离床活动或减少离床活动丧失。

[0016] 在本发明的一些方面，eteplirsen每周一次静脉内给予患者至少180周。在本发明的其他方面，eteplirsen每周一次静脉内给予患者至少192周。

[0017] 本发明的其他方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen至少192周，使得如通过6分钟步行试验
(6MWT)测量的那样，到192周时患者相对于基线保持离床活动或者相对于基线丧失50%或更
少(例如49、48、47、46、45、44或43%或更少)的离床活动。

[0018] 本发明的其他方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen至少192周，使得如通过6分钟步行试验
(6MWT)测量的那样，到192周时患者相对于基线保持离床活动或者相对于基线丧失43%或更
少的离床活动。

[0019] 在另一方面，本发明涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持肺功能或减少肺功能丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过168周，从而在患者中相对于基线保
持肺功能或减少肺功能丧失。

[0020] 在本发明的这些和其他方面，肺功能被测量为最大呼气压力(MEP)。在本发明的这些和其他方面，肺功能被测量为最大吸气压力(MIP)。在本发明的这些和其他方面，肺功能被测量为用力肺活量(FVC)。

[0021] 本发明的其他方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因
突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过168周，从而在患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生。

[0022] 在本发明的这些和其他方面，肌营养不良蛋白的蛋白质产生可通过例如逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白质印迹分析或免疫组织化学(IHC)来测量。

[0023] 本发明的另一方面涉及通过延缓疾病进展来治疗杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过168周，使得患者的疾病进展被延缓，从而治疗患者。

[0024] 本发明的其他方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过168周，从而在患者中相对于基线
保持离床活动或减少离床活动丧失。

[0025] 在本发明的这些和其他方面，eteplirsen每周一次静脉内给予患者至少180周或至少192周。

[0026] 本发明的另一方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen至少192周，使得到192周时患者相对于
基线保持离床活动或者相对于基线丧失43%或更少的离床活动。

[0027] 在本发明的这些和其他方面，离床活动使用北极星移动评价量表(North Star Ambulatory Assessment, NSAA)测量。

[0028] 本发明的其他方面涉及用于治疗杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，其中eteplirsen每周一次以30 mg/kg的
剂量静脉内给予患者超过168周。

[0029] 在另一方面，本发明涉及通过延缓疾病进展来治疗杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，其中eteplirsen每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者超过168周，使得如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的
那样，患者的疾病进展被延缓。

[0030] 在另一方面，本发明涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，其中eteplirsen每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者超过168周，从而如通过6分钟步行
试验(6MWT)测量的那样，在患者中相对于基线保持离床活动或减少离床活动丧失。

[0031] 本发明的另一方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，其中
eteplirsen每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者至少192周，使得到192周时患者相
对于基线保持离床活动或者相对于基线丧失43%或更少的离床活动。

[0032] 在另一方面，本发明涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持肺功能或减少肺功能丧失的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，其中
eteplirsen每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者超过168周，从而在患者中相对于
基线保持肺功能或减少肺功能丧失。

[0033] 本发明的其他方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的
DMD基因突变，其中eteplirsen每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者超过168周，从
而在患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生。

[0034] 本发明的另一方面涉及通过延缓疾病进展来治疗杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，其中eteplirsen每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者超过168周，使得患者的疾病进展被延缓，从而治疗患
者。

[0035] 本发明的其他方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，其中
eteplirsen每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者超过168周，从而在患者中相对于
基线保持离床活动或减少离床活动丧失。

[0036] 本发明的另一方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的eteplirsen，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，其中
eteplirsen每周一次以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者至少192周，使得到192周时患者相
对于基线保持离床活动或者相对于基线丧失43%或更少的离床活动。

[0037] 在本发明的任何前述和其他方面，DMD患者为7岁或更大。

[0038] 在本发明的任何前述和其他方面，eteplirsen经35-60分钟作为静脉输注给予。

[0039] 在本发明的任何前述和其他方面，除了给予eteplirsen之外，患者被给予皮质类固醇(例如泼尼松)。皮质类固醇可在用eteplirsen治疗之前或连同eteplirsen治疗一起或
继用eteplirsen治疗之后给予。

[0040] 在本发明的任何前述和其他方面，本发明的方法进一步包括确认患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变。

[0041] 本公开还提供令人信服的临床证据，其显示在216周(4年内)时用eteplirsen治疗的12名患者中的10名(83.3%)保持能离床活动。相比之下，如通过Kaplan-Meier分析测量的那样，匹配的外部对照组中89.7%的患者丧失了离床活动(参见工作实例)。事实上，在治疗4年时离床活动丧失比率的Kaplan-Meier估值对eteplirsen治疗患者为16.7%，和对外部对
照为89.7% (p=0.0038, 对数秩检验(log-rank test))。

[0042] 此外，如以下表2和3中显示的那样，不仅12名患者中的10名在216周的治疗过程中，在预计丧失离床活动的年龄保持离床活动，而且在某些情况下，如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的那样，患者保持了相当大比例的其步行能力。例如，编号15的受试者在216周时相对于基线6MWT丧失了1米(表2)。在另一个实例中，几名eteplirsen治疗的受试者，包括编号4的受试者，相对于基线保持了超过50%的其步行能力。这些数据显示，eteplirsen治疗在治疗杜兴氏肌营养不良患者时高度有效，尤其包括在这种患者中延缓疾病进展、减少疾
病进展的严重程度、减少离床活动丧失的比率、保持离床活动及减少离床活动丧失。

[0043] 因此，在另一方面，本公开提供通过延缓疾病进展来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变。方法包括每周
以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过192 (例如193、194、195、196、197、198、
199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、
218、219、220、221、222、223、224、225、230、235、240、245、250、255或260或者更多)周，使得如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的那样，患者的疾病进展被延缓，从而治疗患者。

[0044] 本发明的其他方面涉及通过减少疾病进展的严重程度来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括
每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过192周，使得如通过6分钟步行试验
(6MWT)测量的那样，患者的疾病进展的严重程度被减少，从而治疗患者。

[0045] 在另一方面，本发明涉及通过减少患者的离床活动丧失比率来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法
包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过192周，使得如通过6分钟步行
试验(6MWT)测量的那样，在216周时患者的离床活动丧失比率不超过20%，从而治疗患者。

[0046] 本发明的另一方面涉及用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过192周，从而如通过6分钟步行
试验(6MWT)测量的那样，在患者中相对于基线保持离床活动或减少离床活动丧失。

[0047] 在本发明的这些和其他方面，离床活动被保持至少治疗的216周。

[0048] 在本发明的这些和其他方面，在治疗约3年和治疗约4年之间患者的离床活动丧失不超过20%。在本发明的其他方面，在治疗约3年和治疗约4年之间患者的离床活动丧失不超过30%。在本发明的仍然其他方面，在治疗约3年和治疗约4年之间患者的离床活动丧失不超过40%。在本发明的其他方面，在治疗约3年和治疗约4年之间患者的离床活动丧失不超过
50%。

[0049] 在本发明的这些和其他方面，患者的离床活动丧失相对于基线不超过约20%。在本发明的其他方面，患者的离床活动丧失相对于基线不超过约30%。在本发明的仍然其他方
面，患者的离床活动丧失相对于基线不超过约40%。在本发明的其他方面，患者的离床活动丧失相对于基线不超过约50%。在本发明的其他方面，患者的离床活动丧失相对于基线不超过约60%。

[0050] 本发明的另一方面涉及用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过192周，使得如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的那
样，患者在216周保持能离床活动。

[0051] 在本发明的这些和其他方面，eteplirsen每周静脉内给予患者至少216周。

[0052] 在本发明的这些和其他方面，患者为7岁或更大(例如在eteplirsen治疗开始时)。在本发明的另一方面，在用eteplirsen治疗216周时，患者为11岁或更大。在本发明的仍然其他方面，在用eteplirsen治疗216周时，患者为14岁或更大。

[0053] 在本发明的这些和其他方面，eteplirsen经35-60分钟作为静脉输注给予。

[0054] 在本发明的这些和其他方面，患者在治疗216周时保持至少55米的6分钟步行距离(6MWD)。在本发明的其他方面，患者在治疗216周时保持至少100米的6分钟步行距离
(6MWD)。在本发明的仍然其他方面，患者在治疗216周时保持至少200米的6分钟步行距离
(6MWD)。在本发明的其他方面，患者在治疗216周时保持至少300米的6分钟步行距离
(6MWD)。在本发明的另一方面，患者在治疗216周时保持至少400米的6分钟步行距离
(6MWD)。

[0055] 在本发明的这些和其他方面，除了给予eteplirsen之外，患者被给予类固醇。在本发明的其他方面，类固醇在给予eteplirsen之前、连同给予eteplirsen一起或继给予eteplirsen之后给予患者。

[0056] 在本发明的这些和其他方面，患者正在进行背景类固醇治疗。在本发明的其他方面，类固醇为皮质类固醇。在本发明的仍然其他方面，皮质类固醇为倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松、泼尼松龙或地夫可特。

[0057] 在本发明的这些和其他方面，本发明的方法进一步包括确认患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变。

[0058] 本发明的另一方面涉及用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的
DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen至少216周，从
而在患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生。

[0059] 在本发明的这些和其他方面，肌营养不良蛋白的蛋白质产生通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白质印迹分析或免疫组织化学(IHC)来测量。

[0060] 本发明的其他方面涉及通过延缓疾病进展来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen至少216周，使得患者的疾病进展被延缓，从而治
疗患者。

[0061] 本发明的另一方面涉及用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过192周，从而在患者中相对于
基线保持离床活动或减少离床活动丧失至少216周。

[0062] 在另一方面，本发明涉及用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持肺功能或减少肺功能丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen超过192周，从而在患者中相对于基
线保持肺功能或减少肺功能丧失至少216周。

[0063] 在本发明的这些和其他方面，肺功能被测量为最大呼气压力(MEP)。在本发明的其他方面，肺功能被测量为最大吸气压力(MIP)。在本发明的仍然其他方面，肺功能被测量为用力肺活量(FVC)。

[0064] 在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者为正在进行背景类固醇治疗的患者。

[0065] 一些文献报道表明DMD患者在独立地从地板起身能力的丧失与接着在随后1年内离床活动丧失之间的关联(Bushby and Connor (2011) Clin Investig (Lond.) 1(9):
1217-1235 and Henricson等人 (2013) Muscle Nerve 48(1):55-67)。如以下工作实例中
描述的那样，4名eteplirsen治疗的患者在1-3年丧失了在没有外部支持的情况下起身的能
力。然而，尽管丧失了从仰卧起身的能力，但是这些eteplirsen患者在治疗4年时保持离床活动。因此，这些数据表明，eteplirsen治疗甚至在已经丧失独立地从仰卧起身能力的患者中保持离床活动能力。

[0066] 因此，在仍然另一方面，本文描述的任何方法可涉及治疗已经丧失独立地从仰卧起身的能力的患者。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者在用eteplirsen治疗
之前至少1年丧失独立地从仰卧起身的能力。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者在开始用eteplirsen治疗的1年内丧失独立地从仰卧起身的能力。在本文描述的任何方
法的一些实施方案中，患者在开始治疗的两年内丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0067] 在一些实施方案中，本文描述的任何方法包括用eteplirsen持续治疗，即使患者在用eteplirsen治疗期间丧失从仰卧位起身的能力。

[0068] 在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者的起身时间超过10秒。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者的起身时间超过15秒。在本文描述的任何方法的一
些实施方案中，患者的起身时间超过20秒。

[0069] 在另一方面，本发明提供一种通过延缓疾病进展来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以
30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，使得如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的那
样，患者的疾病进展被延缓，从而治疗患者，其中患者在用eteplirsen治疗之前已经丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0070] 在另一方面，本发明特征为一种通过延缓疾病进展来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周
以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，使得如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的
那样，患者的疾病进展被延缓，从而治疗患者，其中患者在用eteplirsen治疗期间(例如在开始用eteplirsen治疗之后约6个月、1年、2年或者甚至3年时)丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0071] 在仍然另一方面，本发明特征为一种通过延缓疾病进展来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括
每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，使得如通过6分钟步行试验(6MWT)测
量的那样，患者的疾病进展被延缓，从而治疗患者，其中患者在用eteplirsen治疗之前已经丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0072] 在另一方面，本发明特征为一种通过延缓疾病进展来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周
以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，使得如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的
那样，患者的疾病进展被延缓，从而治疗患者，其中患者在用eteplirsen治疗期间(例如在开始用eteplirsen治疗之后约6个月、1年、2年或者甚至3年时)丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0073] 在另一方面，本发明特征为一种用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因
突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，从而如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的那样，在患者中相对于基线保持离床活动或减少离床活动丧失，其中患
者在用eteplirsen治疗之前已经丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0074] 在另一方面，本发明特征为一种用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因
突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，从而如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的那样，在患者中相对于基线保持离床活动或减少离床活动丧失，其中患
者在用eteplirsen治疗期间(例如在开始用eteplirsen治疗之后约6个月、1年、2年或者甚
至3年时)丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0075] 在另一方面，本发明特征为一种用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持肺功能或减少肺功能丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，从而在患者中相对于基线保
持肺功能或减少肺功能丧失，其中患者在用eteplirsen治疗之前已经丧失独立地从仰卧起
身的能力。

[0076] 在另一方面，本发明特征为一种用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持肺功能或减少肺功能丧失的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，从而在患者中相对于基线保
持肺功能或减少肺功能丧失，其中患者在用eteplirsen治疗期间(例如在开始用
eteplirsen治疗之后约6个月、1年、2年或者甚至3年时)丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0077] 在本文描述的任何方法的一些实施方案中，肺功能被测量为最大呼气压力(MEP)。在一些实施方案中，肺功能被测量为最大吸气压力(MIP)。在一些实施方案中，肺功能被测量为用力肺活量(FVC)。

[0078] 在另一方面，本发明特征为一种用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生的方法，所述患者具有顺从51号外显
子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，从而在患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生，其中患者在用eteplirsen
治疗之前已经丧失独立地从仰卧起身的能力。

[0079] 在另一方面，本发明特征为一种用于在有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生的方法，所述患者具有顺从51号外显
子跳跃的DMD基因突变，方法包括每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，从而在患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生，其中患者在用eteplirsen
治疗期间(例如在开始用eteplirsen治疗之后约6个月、1年、2年或者甚至3年时)丧失独立
地从仰卧起身的能力。

[0080] 在一些实施方案中，肌营养不良蛋白的蛋白质产生通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白质印迹分析或免疫组织化学(IHC)来测量。

[0081] 在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者为7岁或更大。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，eteplirsen经35-60分钟作为静脉输注给予。

[0082] 在一些实施方案中，本文描述的任何方法包括给予患者类固醇，例如皮质类固醇。在一些实施方案中，皮质类固醇为倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松或地夫可特。

[0083] 在本文描述的任何方法的一些实施方案中，皮质类固醇在给予eteplirsen之前、连同给予eteplirsen一起或继给予eteplirsen之后给予。

[0084] 在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者正在进行背景类固醇(例如间歇或持续/长期背景类固醇治疗)。

[0085] 在一些实施方案中，本文描述的任何方法进一步包括确认患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变。

[0086] 在一些实施方案中，本文描述的任何方法进一步包括确认患者在给予eteplirsen之前具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变。

[0087] 在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在开始用eteplirsen治疗之后1年内，患者丧失独立地从仰卧起身的能力。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在开始治
疗之后2年内，患者丧失独立地从仰卧起身的能力。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在开始治疗时，患者的起身时间超过10秒。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在开始治疗时，患者的起身时间超过15秒。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者的起身时间超过20秒。

[0088] 在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者正在进行间歇背景类固醇治疗。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，患者正在进行持续背景类固醇治疗。

[0089] 在本文描述的任何方法或组合物的一些实施方案中，患者在约6个月-约4岁之间(包括约6个月和约4岁在内)。在一些实施方案中，患者为至少6 (例如至少7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、30或36)个月。在一些实施方案中，患者不超过4岁。在一些实施方案中，eteplirsen可肠胃外例如皮下给予这种患者。

[0090] 在仍然另一方面，本公开特征为一种通过延缓疾病进展来治疗有需要的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的方法，所述患者具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变，方法包括
连同类固醇一起每周以30 mg/kg的剂量静脉内给予患者eteplirsen，使得如通过6分钟步
行试验(6MWT)测量的那样，患者的疾病进展被延缓，从而治疗患者，其中相对于CDC/TREAT-NMD指南推荐的类固醇剂量，给予eteplirsen允许给予患者较低剂量的类固醇(Bushby K, 
Lynn S, Straub V. Collaborating to bring new therapies to the patient: the 
TREAT-NMD model. Acta Myo 2009; 28:12-15)，并获得可比的、相同的或提高的功效水
平。例如，给予患者的类固醇剂量可在推荐的类固醇剂量的约75%-约80%之间。

[0091] 在另一方面，本发明涉及用于在有需要的患者中治疗杜兴氏肌营养不良(DMD)的eteplirsen，所述患者具有可通过跳跃51号外显子纠正的DMD基因突变，其中治疗包括一周一次给予患者30 mg/kg的单次静脉内剂量的eteplirsen，从而如通过6分钟步行试验
(6MWT)测定的那样，延缓疾病进展超过168周。

[0092] 在另一方面，本发明涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持离床活动或减少离床活动丧失的eteplirsen，所述患者具有可通过跳跃51号外显子纠正的DMD基因突
变，其中治疗包括一周一次给予患者30 mg/kg的单次静脉内剂量的eteplirsen，从而如通
过6分钟步行试验(6MWT)测定的那样，相对于基线保持离床活动或减少离床活动丧失超过
168周。

[0093] 本发明的其他方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中保持肺功能或减少肺功能丧失的eteplirsen，所述患者具有可通过跳跃51号外显子纠正的DMD基因突变，其中治疗包括一周一次给予患者30 mg/kg的单次静脉内剂量的eteplirsen，从而相对于基线保
持肺功能或减少肺功能丧失超过168周。

[0094] 在另一方面，本发明涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生的eteplirsen，所述患者具有可通过跳跃51号外显子
纠正的DMD基因突变，其中治疗包括一周一次给予患者30 mg/kg的单次静脉内剂量的
eteplirsen，从而修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生超过168周。

[0095] 本发明的另一方面涉及用于在杜兴氏肌营养不良(DMD)患者中修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生的eteplirsen，所述患者具有可通过跳跃51号外显子纠
正的DMD基因突变，其中治疗包括一周一次给予患者30 mg/kg的单次静脉内剂量的
eteplirsen，从而修复mRNA阅读框以诱导肌营养不良蛋白的蛋白质产生至少216周。
附图说明

[0096] 图1为用于治疗DMD患者的研究设计的示意图。在双盲安慰剂对照研究201中，将12名DMD患者随机分到3组中的1组：组1，eteplirsen 30 mg/kg/wk；组2，eteplirsen 50 mg/kg/wk；和组3，安慰剂/延迟的eteplirsen。在25周时，组3中安慰剂治疗的患者转换为用30或50 mg/kg /周的eteplirsen进行开放标签治疗。在开放标签扩展研究202中，患者保持其相同剂量的eteplirsen。功效评估。6MWT用作功能结果(functional outcome)的量度。

[0097] 图2为选择匹配的外部对照组的示意图。针对具有51号外显子顺从患者的6MWT数据、长达36个月的纵向6MWT数据、基因突变数据和等同护理标准，选择意大利Telethon (n=
97)和鲁汶NMRC (n=89)登记处。用于选择患者的因素为：类固醇治疗、>7岁、顺从51号外显子跳跃和180-400 m的基线6MWT。这导致13名患者被选定为匹配对照。

[0098] 图3通过图表描绘在基于年龄组(即年龄小于7岁或7岁以上)顺从外显子跳跃的DMD患者的疾病进展的自然历史期间6MWT的距离随着时间推移的结果。深色线显示年龄小
于7岁的患者的距离变化。浅色线显示7岁或更大的患者的距离变化。在36个月结束时注意
到相差194 m。

[0099] 图4通过图表描绘在基于年龄组(即年龄小于7岁或7岁以上)具有任何基因型的DMD患者的疾病进展的自然历史期间6MWT的距离随着时间推移的结果。深色线显示年龄小
于7岁的患者的距离变化。浅色线显示7岁或更大的患者的距离变化。在36个月结束时注意
到相差167 m。

[0100] 图5通过图表描绘在基于基因型的DMD患者的疾病进展的自然历史期间6MWT的距离随着时间推移的结果。上线显示具有所有突变的患者的距离变化。中线显示具有任何外
显子突变的患者的距离变化。下线显示具有51号外显子突变的患者的距离变化。

[0101] 图6通过图表描绘eteplirsen的功能性功效。深色线显示12名接受了eteplirsen的患者(无论是从研究开始还是首先接受安慰剂的那些患者)基于6MWT的步行距离随着时
间的推移从基线的距离变化(m)。较浅色线显示13名匹配的对照患者基于6MWT的步行距离
随着时间的推移从基线的变化。在36个月结束时注意到相差151 m。

[0102] 图7通过图表描绘6MWT作为随着时间的推移从基线的百分比变化的结果。深色线代表12名接受了eteplirsen的患者(无论是从研究开始还是首先接受安慰剂的那些患者)。
虚线显示8名未被安慰剂延迟的患者的变化。较浅色线代表11名匹配的对照患者。

[0103] 图8通过图表描绘丧失了离床活动的患者随着时间推移的百分比。深色条代表12名接受了eteplirsen的患者，和较浅色条代表13名匹配的对照患者。

[0104] 图9通过图表描绘在eteplirsen治疗组(“治疗的”)和匹配的外部对照组(“未治疗的”)中在180周时肌营养不良蛋白阳性纤维从基线的百分比。4名独立的病理学家观察了组织切片并测定了肌营养不良蛋白阳性纤维的百分比。

[0105] 图10A显示eteplirsen治疗组的肺功能进展。最上面的线代表作为百分比的用力肺活量(FVC)。中线显示作为百分比的最大吸气压力(MIP)和下线显示作为百分比的最大呼
气压力(MEP)。

[0106] 图10B-10D显示匹配的外部对照组的肺功能进展。图10B显示作为百分比的用力肺活量(FVC)。图10C显示作为百分比的最大吸气压力(MIP)。图10D显示作为百分比的最大呼
气压力(MEP)。

[0107] 图11通过图表描绘在4年内如通过Kaplan-Meier曲线测定的那样在eteplirsen治疗组(“ETETRTD”)和匹配的外部对照组(“EXTCTRL”)中离床活动的可能性。对ETETRTD组估计离床活动丧失16.7%和对EXTCTRL组为89.7%。P=0.0038，基于对数秩检验。

[0108] 图12通过图表描绘eteplirsen的功能性功效。上线(菱形)显示12名接受了eteplirsen的患者(无论是从研究开始还是首先接受安慰剂的那些患者)基于6MWT的步行
距离随着时间的推移从基线的平均距离变化(m)。下线(方形)显示13名匹配的对照患者基
于6MWT的步行距离随着时间的推移从基线的平均变化。在4年结束时注意到相差162 m。

[0109] 图13为描绘每个组(eteplirsen治疗组和匹配的外部对照组)中随着时间已经丧失离床活动的患者的百分比的条形图。

[0110] 图14为描绘在每个组(eteplirsen治疗组和匹配的外部对照组)中给予患者的推荐剂量的类固醇(地夫可特(DFZ)或泼尼松(Pred))的平均百分比的条形图。

[0111] 本公开的实施方案涉及通过给予专门设计以诱导人肌营养不良蛋白基因中51号外显子跳跃的反义化合物eteplirsen来治疗肌营养不良(比如BMD和BMD)的改进方法。肌营
养不良蛋白在肌肉功能中起至关重要的作用，并且各种肌肉相关疾病的特征为该基因的突
变形式。因此，在某些实施方案中，本文描述的改进方法可用于诱导人肌营养不良蛋白基因突变形式的51号外显子跳跃，比如在DMD和BMD中发现的突变的肌营养不良蛋白基因。

[0112] 由于由突变引起的异常mRNA剪接事件，这些突变的人肌营养不良蛋白基因(即DMD基因)或者表达缺陷型肌营养不良蛋白，或者根本不表达可测量的肌营养不良蛋白，这种情况导致各种形式的肌营养不良。为了补救这种情况，eteplirsen与突变的人肌营养不良蛋
白基因的预加工RNA的选定区域杂交，在该原本异常剪接的肌营养不良蛋白mRNA中诱导外
显子跳跃和差别剪接，从而使得肌细胞能够产生编码功能性肌营养不良蛋白的mRNA转录
物。在某些实施方案中，生成的肌营养不良蛋白不一定为肌营养不良蛋白的“野生型”形式，而是截短的，然而功能性或半功能性的肌营养不良蛋白形式。

[0113] 通过增加肌细胞中功能性肌营养不良蛋白的水平，这些和相关实施方案可用于预防和治疗肌营养不良，尤其是其特征为由于异常mRNA剪接所致的缺陷型肌营养不良蛋白表
达的那些肌营养不良形式，比如DMD和BMD。本文描述的方法进一步提供给肌营养不良患者
改进的治疗选择，并且提供优于治疗肌营养不良相关形式的备选方法的显著和实际优势。

[0114] 因此，本发明涉及通过在患者中诱导51号外显子跳跃来治疗肌营养不良比如DMD和BMD的改进方法。在一些实施方案中，将有效量的eteplirsen(例如30 mg/kg患者体重)给予具有顺从51号外显子跳跃的DMD基因突变的DMD患者，其中给予是在足以治疗疾病的一段
时间内。在一些实施方案中，eteplirsen例如每周一次以约25 mg/kg-约50 mg/kg之间的剂量(例如约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、
47、48、49或50 mg/kg)给予患者。在一些实施方案中，eteplirsen例如每周一次以约25 mg/kg-约50 mg/kg之间的剂量(例如约30 mg/kg-约50mg/kg、约25 mg/kg-约40 mg kg/kg、约
28 mg/kg-约32 mg/kg或者约30 mg/kg-约40 mg/kg)给予患者。在一些实施方案中，将有效量的eteplirsen给予有需要的患者至少168 (例如至少169、170、171、172、173、174、175、
176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、
195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、
214、215或216)周。在一些实施方案中，治疗DMD患者包括给予eteplirsen(例如以30 mg/kg的剂量)超过168 (例如超过169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、
182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、
201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216或者超过216)周。在一些实施方案中，治疗DMD患者包括给予eteplirsen(例如以30 mg/kg的剂量)至少约
168-约192周或者约168-约216周。在一些实施方案中，将有效量的eteplirsen给予有需要
的患者至少192 (例如至少169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、
182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、
201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215或216)周。在一些实施方案中，将有效量的eteplirsen给予有需要的患者超过192 (例如超过193、194、195、
196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、
215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、230、235、240、245、250、255或者260或更多)周。在一些实施方案中，治疗DMD患者包括给予eteplirsen(例如以30 mg/kg的剂量)
至少216 (例如至少217、218、219、220、221、222、223、224、225、230、235、240、245、250、255或者260或更多)周。在一些实施方案中，治疗DMD患者包括给予eteplirsen(例如以30 mg/
kg的剂量)至少约192周-约216周。

[0115] 肌营养不良蛋白基因中的各种突变顺从51号外显子跳跃。以下外显子中突变的非限制性实例顺从 51号外显子跳跃，包括例如45-50、47-50、48-50、49-50、50、52、52-63 (Leiden Duchenne muscular dystrophy mutation database, Leiden University 
Medical Center, The Netherlands)。确定患者是否具有顺从外显子跳跃的DMD基因突变
完全处于本领域技术人员的范围内(参见例如Aartsma-Rus等人 (2009) Hum Mut 30:293-
299)。

[0116] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文描述的那些
类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。对于本发明的目的，以下术语定义如下。

[0117] I. 定义所谓的“约”意指量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度变化多达参考量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度的30、25、20、15、10、
9、8、7、6、5、4、3、2或1%。

[0118] 术语“反义寡聚物”和“反义化合物”和“反义寡核苷酸”可互换使用，并且指的是各自带有碱基配对部分的环状亚基序列，通过亚基间键连接，使得碱基配对部分通过Watson-Crick碱基配对杂交于核酸(一般地为RNA)中的目标序列以在目标序列内形成核酸:寡聚物异源双链体。环状亚基基于核糖或另一种戊糖，或者在一个优选的实施方案中为吗啉代基
(参见以下吗啉代寡聚物的描述)。寡聚物可具有与目标序列精确或近似的序列互补性，接
近寡聚物末端的序列变化通常优于内部的变化。

[0119] 术语“吗啉代寡聚物”或“PMO”(氨基磷酸酯(phosphoramidate)-或磷酰二胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer))指的是由吗啉代亚基结构组成的寡核苷酸类似物，其中(i) 所述结构通过含磷键(长度1-3个原子，优选地长度2个原子，和优选地不荷电或为阳离子)连接在一起，所述键将一个亚基的吗啉代基氮连接于相邻亚基
的5’ 环外碳，和(ii) 每个吗啉代环带有嘌呤或嘧啶碱基配对部分，其通过碱基特异性氢键合而有效地结合于多核苷酸的碱基。参见例如图1A中的结构，其显示优选的磷酰二胺键
类型。只要其不干扰结合或活性，就可对这种键进行变化。例如，连接于磷的氧可用硫取代(硫代磷酰二胺(thiophosphorodiamidate))。5’氧可用氨基或低级烷基取代的氨基取代。
连接于磷的悬氮可为未取代、用(任选取代的)低级烷基单取代或二取代的。嘌呤或嘧啶碱
基配对部分一般地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。吗啉代寡聚物的合成、结构和结合特征在美国专利第5698685、5217866、5142047、5034506、5166315、5521063、
5506337、8076476、8299206和7943762 (阳离子键)中得以详述，它们全部在此通过参照结合。修饰的亚基间键和末端基团在PCT申请US2011/038459和公开WO/2011/150408中得以详
述，本文通过参照以其全部结合。

[0120] “eteplirsen”(也称为“AVN-4658”) 为具有碱基序列5’- CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’ (SEQ ID NO:1)的PMO。eteplirsen以CAS登记号
1173755-55-9注册。化学名包括：
RNA，[P-脱氧-P-(二甲基氨基)](2’,3’-二脱氧-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环seco)(2’a→5’)(C-m5U-C-C-A-A-C-A-m5U-C-A-A-G-G-A-A-G-A-m5U-G-G-C-A-m5U-m5U-m5U-C-m5U-
A-G), 5’-[P-[4-[[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]羰基]-1-哌嗪基]-N,N-二甲基
膦酰胺酯(phosphonamidate)]
和
P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)-5’-O-{P-[4-(10-羟基-2,5,8-三氧杂癸酰)哌嗪-
1-基]-N,N-二甲基磷二酰胺基(dimethylphosphonamidoyl)}-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胞苷酰(secocytidylyl)-(2’a→5’)-P,3’-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,
3’-开环胸苷酰(secothymidylyl)- (2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胞苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-
2’,3’-开环胞苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰(secoadenylyl)-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,
3’-开环胞苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→5’)-P,3’-二脱氧-P-(二甲基氨基)- 2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胸苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)- 2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胞苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)- 2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→
5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→5’)-P,
2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环鸟苷酰(secoguanylyl)-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环鸟苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→5’)-P,2’,
3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环鸟苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)- 2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→5’)-P,3’-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胸苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环鸟苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)- 
2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环鸟苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)- 2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胞苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)- 2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→5’)- P,3’-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胸苷酰-(2’a→5’)- P,3’-二脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胸苷酰-(2’a→5’)-P,3’-二脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胸苷酰-(2’a→
5’)-P,2’,3’-三脱氧-P- (二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胞苷酰-(2’a→5’)-P,
3’-二脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环胸苷酰-(2’a→5’)-P,2’,3’-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环腺苷酰-(2’a→5’)-2’,3’-二脱氧-2’,3’-亚氨基-2’,3’-开环鸟苷(secoguanosine)。

[0121] eteplirsen具有以下结构：“外显子”指的是在预加工的(或前体)RNA的任一部分已通过剪接去除之后，编码蛋白
质的核酸的限定部分或以RNA分子的成熟形式表示的核酸序列。成熟的RNA分子可为信使
RNA (mRNA)或非编码RNA的功能形式，比如rRNA或tRNA。人肌营养不良蛋白基因具有约79个外显子。

[0122] “内含子”指的是不翻译成蛋白质的(基因内)核酸区域。内含子为非编码部分，其被转录成前体mRNA (pre-mRNA)，并且随后在形成成熟RNA期间通过剪接去除。

[0123] “有效量”或“治疗有效量”指的是作为单次剂量或作为一系列剂量的部分给予人受试者，有效产生期望的治疗效果的治疗化合物(比如反义寡核苷酸)的量。对于反义寡核苷酸，这种效果一般地通过抑制选定目标序列的翻译或天然剪接处理来实现。在一些实施
方案中，有效量为30 mg/kg包含eteplirsen的组合物用于治疗受试者一段时间。在一些实
施方案中，有效量为约30 mg/kg eteplirsen，以将受试者的肌营养不良蛋白阳性纤维的数目增加至正常值的至少20%。在另一个实施方案中，有效量为约30 mg/kg eteplirsen，以在患者中相对于健康同伴稳定、保持或从20%不足(例如在6MWT中)改善步行距离。在另一方
面，有效量为约30 mg/kg，每周一次超过168周(例如至少169、170、171、172、173、174、175、
176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、
195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、
214、215或216)周，从而在患者中稳定离床活动(在丧失离床活动后)或改善离床活动(例如如通过6MWT测量的那样)。在另一方面，有效量为约30 mg/kg每周一次超过168周(例如至少
169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、
188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、
207、208、209、210、211、212、213、214、215或216周)，使得在约168-约192周之间患者离床活动得以稳定(在丧失离床活动后)或改善。在另一方面，有效量为约30 mg/kg，每周一次超过
192周，从而在患者中稳定离床活动(在丧失离床活动后)、减少离床活动丧失比率、减少离床活动的丧失或改善离床活动(例如如通过6MWT测量的那样)。在另一方面，有效量为约30 mg/kg每周一次至少216周，使得相对于没有用eteplirsen治疗的匹配患者，在约192-约216周之间患者离床活动的丧失被减少，离床活动被稳定(例如相对于基线)，或者离床活动丧
失比率被减少。

[0124] “外显子跳跃”通常指的是整个外显子或其一部分从给定的预加工的RNA去除，从而被排除存在于成熟RNA(比如被翻译成蛋白质的成熟mRNA)中的过程。因此，原本由跳跃的外显子编码的蛋白质部分不存在于所表达的蛋白质形式中，一般地产生改变的(尽管仍然
功能性的)蛋白质形式。在某些实施方案中，被跳跃的外显子为来自人肌营养不良蛋白基因的异常外显子，其可在其序列中含有原本会引起异常剪接的突变或其他改变。在某些实施
方案中，被跳跃的外显子为人肌营养不良蛋白基因的51号外显子。

[0125] “肌营养不良蛋白”为一种杆状细胞质蛋白，并且为肌营养不良蛋白(即DMD)基因编码的将肌纤维的细胞骨架通过细胞膜连接至周围细胞外基质的蛋白质复合物的至关重
要部分。肌营养不良蛋白含有多个功能结构域。例如，肌营养不良蛋白在约14-240位氨基酸处含有肌动蛋白结合结构域和在约253-3040位氨基酸处含有中央杆状结构域。这种大的中
央结构域由24个血影蛋白样的约109个氨基酸的三螺旋元件形成，其与α-辅肌动蛋白和血
影蛋白具有同源性。重复序列一般地被4个富含脯氨酸的非重复节段(也称为铰链区)中断。
重复序列15和16由18个氨基酸的片段分开，该片段似乎提供了肌营养不良蛋白的蛋白水解
切割的主要位点。大多数重复序列之间的序列同一性为10-25%。一个重复序列含有3个α-螺旋：1、2和3。α-螺旋1和3各自由7个螺旋转角形成，可能通过疏水界面作为卷曲螺旋相互作用。α-螺旋2具有更复杂的结构，并且由被甘氨酸或脯氨酸残基分开的4个和3个螺旋转角的节段形成。每个重复序列由两个外显子编码，所述外显子一般地在α-螺旋2的第一部分的
47-48位氨基酸之间被内含子中断。另一个内含子在重复序列的不同位置被发现，通常分散在螺旋-3上。肌营养不良蛋白还在约3080-3360位氨基酸处含有富含半胱氨酸的结构域，包括显示与粘菌(盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)) α-辅肌动蛋白的C末端结构域
同源的富含半胱氨酸的节段(即280个氨基酸中的15个半胱氨酸)。羧基末端结构域在约
3361-3685位氨基酸处。

[0126] 肌营养不良蛋白的氨基末端与F-肌动蛋白结合，和羧基末端与肌膜上的肌营养不良蛋白相关蛋白质复合物(DAPC)结合。DAPC包括肌营养不良蛋白聚糖、肌膜蛋白聚糖、整合蛋白和小窝蛋白，并且任何这些组分中的突变引起常染色体遗传性肌营养不良。当肌营养
不良蛋白不存在时，DAPC不稳定，这导致成员蛋白质的水平降低，并且继而导致渐进性纤维损伤和膜渗漏。在各种形式的肌营养不良比如杜兴氏肌营养不良(DMD)和贝克型肌营养不
良(BMD)中，肌细胞产生改变的和功能上有缺陷的肌营养不良蛋白形式，或者根本不产生肌营养不良蛋白，主要是由于基因序列的突变导致不正确的剪接。如以上指出的那样，缺陷型肌营养不良蛋白的优势表达或者肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白样蛋白的完全缺乏导
致肌肉变性的快速进展。在这方面，“缺陷型”肌营养不良蛋白可通过本领域已知的在某些DMD或BMD受试者中产生的肌营养不良蛋白形式，或者通过不存在可检测的肌营养不良蛋白
来表征。

[0127] 本文使用的术语“功能”和“功能性”等指的是生物、酶促或治疗功能。

[0128] “功能性”肌营养不良蛋白通常指的是，一般地与存在于某些DMD或BMD受试者中的改变的或“缺陷型”形式的肌营养不良蛋白相比，具有足够的生物活性以减少肌肉组织的渐进性降解(否则这是肌营养不良的特征)的肌营养不良蛋白。在某些实施方案中，功能性肌营养不良蛋白可具有如根据本领域常规技术测量的野生型肌营养不良蛋白的体外或体内
生物活性的约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100% (包括其间的所有整数)。作为一个实例，体外肌肉培养物的肌营养不良蛋白相关活性可根据肌管大小、肌原纤维组织
(或组织破坏)、收缩活动和乙酰胆碱受体的自发簇集来测量(参见例如Brown等人, 
Journal of Cell Science. 112:209-216, 1999)。动物模型也是用于研究疾病发病机制
的宝贵资源，并且提供一种测试肌营养不良蛋白相关活性的手段。DMD研究中最广泛使用的两种动物模型为mdx小鼠和金毛猎犬肌营养不良(GRMD)狗，两者均为肌营养不良蛋白阴性
(参见例如Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003)。这些和其他动物
模型可用于测量各种肌营养不良蛋白的功能活性。包括截短形式的肌营养不良蛋白，比如
由本发明的某些外显子跳跃反义化合物产生的那些形式。

[0129] 术语肌营养不良蛋白合成或产生的“修复”通常指的是在用如本文描述的eteplirsen治疗后在肌营养不良患者中产生肌营养不良蛋白(包括截短形式的肌营养不良
蛋白)。在一些实施方案中，治疗导致患者的新肌营养不良蛋白产生增加1%、5%、10%、20%、
30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100% (包括其间的所有整数)。在一些实施方案中，治疗将患者的肌营养不良蛋白阳性纤维数目增加至正常值的至少20%、约30%、约40%、约50%、约
60%、约70%、约80%、约90 %或约95%-100%。在其他实施方案中，治疗将患者的肌营养不良蛋白阳性纤维数目增加至正常值的约20%-约60%或约30%-约50%。治疗后患者的肌营养不良蛋
白阳性纤维百分比可通过使用已知技术的肌肉活检来测定。例如，肌肉活检可取自合适的
肌肉，比如患者的肱二头肌。

[0130] 分析阳性肌营养不良蛋白纤维的百分比可在治疗前和/或治疗后或者整个治疗过程中的时间点实施。在一些实施方案中，治疗后活检取自治疗前活检的对侧肌肉。治疗前和治疗后肌营养不良蛋白表达研究可使用任何合适的肌营养不良蛋白测定来实施。在一个实
施方案中，使用为肌营养不良蛋白标志物的抗体比如单克隆或多克隆抗体对来自肌肉活检
的组织切片实施免疫组织化学检测。例如，可使用MANDYS106抗体，其为肌营养不良蛋白的高度敏感标志物。可使用任何合适的二次抗体。

[0131] 在一些实施方案中，通过将阳性纤维数目除以所计数的总纤维来计算肌营养不良蛋白阳性纤维的百分比。正常肌肉样品具有100%肌营养不良蛋白阳性纤维。因此，肌营养不良蛋白阳性纤维百分比可表示为正常值的百分比。为了控制治疗前肌肉中微量水平的肌营
养不良蛋白以及回复纤维的存在，当计数治疗后肌肉中的肌营养不良蛋白阳性纤维时，可
使用来自每位患者的治疗前肌肉的切片来设置基线。这可用作计数所述患者治疗后肌肉切
片中的肌营养不良蛋白阳性纤维的阈值。在其他实施方案中，抗体染色的组织切片也可用
于使用Bioquant图像分析软件(Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, 
TN)进行肌营养不良蛋白量化。可将总肌营养不良蛋白荧光信号强度报道为正常值的百分
比。另外，用单克隆或多克隆抗肌营养不良蛋白抗体进行蛋白质印迹分析可用于测定肌营
养不良蛋白阳性纤维的百分比。例如，可使用来自Novacastra的抗肌营养不良蛋白抗体
NCL-Dys1。肌营养不良蛋白的产生还可通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测量。可设计
引物来测量产生功能性肌营养不良蛋白的肌营养不良蛋白基因。肌营养不良蛋白阳性纤维
的百分比还可通过测定肌聚糖(sarcoglycan)复合物(β, γ)和/或神经元NOS的组分表达
进行分析。

[0132] 在一些实施方案中，用eteplirsen治疗减缓或减少在没有治疗的情况下预计的DMD患者的渐进性呼吸肌功能障碍和/或衰竭。在一些实施方案中，用eteplirsen治疗稳定
DMD患者的呼吸肌功能。在一个实施方案中，用eteplirsen治疗可减少或消除在没有治疗的情况下预计的辅助通气需要。在一个实施方案中，用于追踪疾病过程的呼吸功能测量以及
潜在治疗性干预的评估包括最大吸气压力(MIP)、最大呼气压力(MEP)和用力肺活量(FVC)。
MIP和MEP分别测量一个人在吸入和呼出期间可产生的压力水平，并且是呼吸肌肌力的敏感
量度。MIP为膈肌无力的量度。

[0133] 在一个实施方案中，MEP可在其他肺功能测试(包括MIP和FVC)发生变化之前下降。在另一个实施方案中，MEP可能是呼吸功能障碍的早期指标。在另一个实施方案中，FVC可用于测量最大吸气之后强制呼气期间排出的空气总体积。在DMD患者，FVC伴随身体生长而增
加，直到青少年早期。然而，随着生长由于疾病进展而减缓或受阻以及肌无力的发展，肺活量进入下降期，并且在10-12岁之后以每年平均约8%-8.5%的比率下降。在另一个实施方案
中，预计的MIP百分比(针对体重调整的MIP)、预计的MEP百分比(针对年龄调整的MEP)以及
预计的FVC百分比(针对年龄和身高调整的FVC)为支持性分析。

[0134] 所谓的“分离的”意指材料基本上或本质上不含正常地在其天然状态下伴随它的组分。例如，本文使用的“分离的多核苷酸”可指已经以天然存在的状态从侧翼序列纯化或去除的多核苷酸，例如已经从正常地与片段相邻的序列去除的DNA片段。

[0135] 所谓的“增强”或“增加”或“修复”或“刺激”通常指的是与没有eteplirsen或对照化合物引起的响应相比，eteplirsen在细胞或受试者中产生或引起更大生理响应(即下游效应)的能力。可测量的生理响应可包括增加肌营养不良蛋白的功能形式的表达、或增加肌肉组织中肌营养不良蛋白的相关生物活性以及自本领域的理解和本文描述显而易见的其
他响应。还可测量增加的肌肉功能，包括增加或改善肌肉功能约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、
8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、
55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。还可测量表达功能性肌营养不良蛋白的肌纤维的百分比，包括在约1%、2%、%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、
50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的肌纤维中增加的肌营养不良蛋白表达。例如，已经显示，如果25-30%的纤维表达肌营养不良蛋白，则可发生约40%的肌肉功能改善(参见例如DelloRusso et al, Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979-12984, 2002)。
“增加的”或“增强的”量可包括例如为没有eteplirsen(不存在药物)或对照化合物产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如500、1000倍) (包括其间的所有整数和小数点并且大于1)例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

[0136] 术语“减少”或“抑制”通常涉及如根据诊断领域的常规技术测量的eteplirsen“减少”相关生理或细胞响应，比如本文描述的疾病或病症的症状的能力。相关生理或细胞响应(体内或体外)对于本领域技术人员为显而易见的，并且可包括减少肌营养不良的症状或病理学，或者减少肌营养不良蛋白的缺陷型形式，比如在DMD或BMD个体中表达的改变的肌营
养不良蛋白形式的表达。响应的“减少”可包括例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、
11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%减少，包括其间的所有整数。

[0137] 个体(例如哺乳动物，比如人)或细胞的“治疗”为用于试图改变个体或细胞的自然过程的任何类型的干预。治疗包括(但不限于)给予药用组合物，并且可以预防性地或继发生病理事件或与病原体接触之后实施。治疗包括对与肌营养不良蛋白相关的疾病或病症的
症状或病理学的任何期望的效果，如在某些形式的肌营养不良中，并且可包括例如正治疗
的疾病或病症的一种或多种可测量标志物的最小变化或改善。还包括“预防性”治疗，其可涉及降低正治疗的疾病或病症的进展速率、延缓疾病或病症的发作或者降低其发作的严重
程度。“治疗”或“预防”不一定表明完全根除、治愈或预防疾病或病症或其相关症状。

[0138] 在一个实施方案中，用eteplirsen治疗增加新肌营养不良蛋白的产生，并且保持离床活动或者减缓或减少在没有治疗的情况下预计的离床活动丧失。例如，治疗可以稳定、保持、改善或增加受试者的步行能力(例如稳定离床活动)。在一些实施方案中，治疗保持、增加患者稳定步行距离或减少其丧失，如通过例如McDonald等人 (Muscle Nerve, 2010; 
42:966-74; Muscle Nerve, 2010; 41:500-10, 本文通过参照结合)描述的6分钟步行试
验(6MWT)测量的那样。6MWT为一个关注于离床活动的有临床意义的终点，作为疾病状态变
化的表现表征步行功能随着时间推移的变化。

[0139] 6分钟步行距离(6MWT)的变化可表示为绝对值、百分比变化或%预测值的变化。在一些实施方案中，治疗在受试者中相对于健康同伴保持或从20%不足改善6MWT的稳定步行
距离。相对于健康同伴的典型表现，DMD患者在6MWT中的表现可通过计算%预测值来确定。例如，对于男性，%预测6MWD可使用以下公式来计算：196.72 + (39.81 x 年龄) - (1.36 x年
2
龄) + (132.28 x以米为单位的高度)。对于女性，%预测6MWD可使用以下公式来计算：
188.61 +  (51.50 x年龄) -  (1.86  x年龄2) +  (86.10  x 以米为单位的高度) 
(Henricson等人 PLoS Curr., 2012, 第2版, 本文通过参照结合)。在一些实施方案中，用eteplirsen治疗将患者的稳定步行距离从基线增加至超过3、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或50米(包括其间的所有整数)。在一些实施方案中，用eteplirsen治疗减少稳定步行距离
的丧失。在一些实施方案中，患者保持至少50米的6MWD。在一些实施方案中，患者保持至少
55米的6MWD。在一些实施方案中，患者保持至少100、200、300或400米的6MWD。

[0140] 由于DMD患者的肌肉功能下降，在疾病进展期间离床活动通常会丧失。离床活动可通过各种方法测量，包括北极星移动评价量表(NSAA)。NSAA由North Start Clinical 
Network的Physiotherapy Assessment and Evaluation Group开发，以评价DMD男孩的离
床活动，并且提供评分从2-0的活动列表，其中2为正常和0为“无法独立实现”(2006-2011 MDC/North Star Clinical Network)。这些活动的范围在从站立最少3秒到爬上爬下一个
箱子到跑步。在某些实施方案中，用eteplirsen治疗可保持、稳定、增加或改善离床活动，例如如通过NSAA测定的那样。

[0141] 在一些实施方案中，可评价DMD患者的肌肉功能在没有外部援助(独立地)的情况下从仰卧位起身的能力。在一些实施方案中，评价可包括受试者是否具有从仰卧位起身的
能力。在一些实施方案中，评价包括患者在没有外部援助的情况下从仰卧位起身所需的时
间(例如以秒计)。这种测量为本领域技术人员熟知的，并且描述于例如Bushby and Connor (2011) Clin Investig (Lond.) 1(9):1217-1235 and Henricson等人 (2013) Muscle 
Nerve 48(1):55-67中，其每一个的公开本文通过参照以其全部结合。在一些实施方案中，通过本文描述的任何方法治疗的患者在开始用eteplirsen治疗之前已经丧失独立地从仰
卧位起身的能力。在一些实施方案中，患者在开始用eteplirsen治疗之前至少1 (例如至少
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、18、20、24或更多)个月丧失了独立地从仰卧位起身的能力。在一些实施方案中，通过本文描述的任何方法治疗的患者在用eteplirsen治疗时丧失
独立地从仰卧位起身的能力。在一些实施方案中，患者在开始用eteplirsen治疗之后至少1(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、18、20、24、30或36或更多)个月丧失独立地从仰卧位起身的能力。

[0142] 在一些实施方案中，用eteplirsen治疗的患者，例如用约30 mg/kg eteplirsen进行长期每周治疗约168周-约192周之间或约168周-约216周之间，相对于基线遭受离床活动
减少不超过60 (例如59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44或43)%(例如如通过6MWT测量的那样)。在一些实施方案中，用eteplirsen治疗的患者，例如用约30 mg/kg eteplirsen进行长期每周治疗约168周-约192周之间或约168周-约216周之间，相对于
基线遭受离床活动减少不超过43 (例如42.5、42、41.5、40、39.5、39、38.5、38、37.5、37、
36.5或36) %(例如如通过6MWT测量的那样)。在一些实施方案中，在用eteplirsen治疗约
168周-约192周之间，患者的离床活动(例如如通过6MWT或NSAA测量的离床活动能力)得以
稳定。在一些实施方案中，患者的离床活动在用eteplirsen进行长期每周治疗约168周后稳定至少25 (例如26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、
47、48、49、50、60、72、84或96或更多)周。在一些实施方案中，eteplirsen治疗患者的离床活动丧失比率或离床活动丧失在约192周-约216周时减少。在一些实施方案中，eteplirsen治疗患者的离床活动丧失比率或离床活动丧失在约216周时相对于基线减少。

[0143] 本文使用的术语“疾病稳定”、“被稳定”、“稳定化”或类似的语法术语意指增加或减少小于20 (例如小于19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1) %为疾病的至少一个可测量或可评估方面。因此，在一些实施方案中，在给定治疗期内稳定离床活动的患者在所述治疗期间离床活动减少不超过20%。在一些实施方案中，在给定治疗期内稳定离床活动的患者在所述治疗期间离床活动下降不超过10%。在一些实施方案中，在给定治疗期内稳定离床活动的患者在所述治疗期间离床活动下降不超过5%。在一些实施方案中，在给定治疗期内稳定离床活动的患者在所述治疗期间离床活动下降不超过2.5%。在一些实施
方案中，在给定治疗期内稳定离床活动的患者在所述治疗期间离床活动下降不超过1%。例
如，在约168周-约192周之间稳定离床活动的患者可为在所述期间相对于基线经历不超过5 (例如少于4、3、2或1)%的另外离床活动丧失的患者。

[0144] “每周一次”给药、给药“每周一次”和“每周”给药本文可互换使用。

[0145] DMD患者的肌肉功能丧失可能发生在儿童正常生长发育的背景下。确实，年龄较小的DMD儿童可能会在约1年过程中在6MWT期间显示步行距离增加，尽管有渐进性肌肉损伤。
在一些实施方案中，来自DMD患者的6MWD与典型发育对照受试者以及来自年龄和性别匹配
受试者的现有规范性数据相比。在一些实施方案中，正常生长和发育可使用符合规范性数
据的基于年龄和身高的公式来解释。这种公式可用于将6MWD转换为DMD受试者的百分比预
测(%预测)值。在某些实施方案中，%预测6MWD数据的分析代表一种解释正常生长和发育的
方法，并且可显示，早龄期(例如小于或等于7岁)的功能获得代表稳定而不是改善DMD患者
的能力(Henricson等人 PLoS Curr., 2012, 第2版, 本文通过参照结合)。

[0146] 本文使用的“患者”包括呈现可用eteplirsen治疗的症状或处于呈现症状风险下的任何人，比如患有DMD或BMD或与这些病症相关的任何症状(例如肌纤维丧失)或者处于其
风险下的受试者。

[0147] 本文使用的“儿科患者”为1-21岁的患者(包括1和21岁在内)。在一些实施方案中，儿科患者为7-21岁(例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21岁)的患者。在一些实施方案中，儿科患者为小于7岁的患者。在一些实施方案中，儿科患者为7岁或更大的患者。

[0148] 在本文描述的任何方法或组合物的一些实施方案中，患者在约6个月-约4岁之间(包括约6个月和约4岁在内)。例如，在一些实施方案中，患者为至少约6 (例如至少7、8、9、
10、11或12)个月-小于约48 (例如47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、
31或30)个月之间。在一些实施方案中，患者为至少6 (例如至少7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、24、30或36)个月。在一些实施方案中，患者为不超过4岁。在一些实施方案中，eteplirsen可肠胃外例如皮下给予这种患者。

[0149] II. 制剂和治疗在某些实施方案中，本发明提供如本文描述的适用于治疗性递送eteplirsen的制剂或
组合物。因此，在某些实施方案中，本发明提供药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的eteplirsen。尽管
eteplirsen可单独给予，但是优选的是作为药用制剂(组合物)给予该化合物。

[0150] 本发明包含eteplirsen的组合物可单独或与另一种治疗剂组合给予。另外的治疗剂可在给予本发明组合物之前、同时或之后给予。例如，组合物可与类固醇和/或抗生素组合给予。在某些实施方案中，将组合物给予正在进行背景类固醇治疗(例如间歇或长期/持
续背景类固醇治疗)的患者。本领域技术人员将会意识到，这种患者为经受进行中的长期使用类固醇(或皮质类固醇)的那些患者，在其基础上给予另一种治疗比如eteplirsen。例如，在一些实施方案中，在给予eteplirsen之前，患者已经用皮质类固醇治疗(例如稳定剂量的皮质类固醇治疗4-6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或更多周)，并且继续接受类固醇治疗。类固醇可为糖皮质激素或泼尼松。糖皮质激素比如皮质醇控制碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢，并且通过防止磷脂释放、减少嗜酸性粒细胞作用和一些其他机制而抗炎。盐皮质激素比如醛固酮控制电解质和水的水平，主要是通过促进肾脏
中的钠潴留。皮质类固醇为一类化学物质，包括在脊椎动物的肾上腺皮质中天然产生的类
固醇激素以及在实验室合成的这些激素的类似物。皮质类固醇参与广泛范围的生理过程，
包括应激反应、免疫反应和炎症调节、碳水化合物代谢、蛋白质分解代谢、血液电解质水平和行为。皮质类固醇包括(但不限于)倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙和泼尼松。可在给予本发明组合物之前、同时或之后给予的一种特定感兴趣的类固醇为地夫可特及其制剂(例如MP-104, Marathon Pharmaceuticals LLC)。

[0151] 在一些实施方案中，用eteplirsen治疗患者可降低保持在较高剂量的类固醇且不存在eteplirsen的情况下达到的类似水平、相同或者甚至更好功效需要的类固醇协同治疗
的量。在一些实施方案中，对于类似水平的疾病状态或进展的患者，患者可被给予类固醇比如地夫可特或泼尼松的剂量，其比类固醇的推荐剂量(例如如由CDC/TREAT-NMD指南推荐的
那样; 参见Bushby K, Lynn S, Straub V. Collaborating to bring new therapies to 
the patient: the TREAT-NMD model. Acta Myo 2009; 28:12-15)少至少5 (例如至少6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、
37、40、45、50、55、60、65或70) %。在一些实施方案中，eteplirsen治疗的患者被给予给定类固醇推荐剂量的约75%-约80%之间。

[0152] 根据指南，泼尼松的推荐起始剂量为0.75 mg/kg/天，地夫可特的推荐起始剂量为0.9 mg/kg/天，早上给药。一些儿童在给药之后几小时会经历短暂的行为副作用(活动过
度、情绪波动)。对于这些儿童，下午给予药物可能会减轻这些困难中的一些。对于离床活动个体，剂量通常会随着儿童的生长而增加，直至体重达到约40 kg。泼尼松的最大剂量通常限定在约30 mg/天，和地夫可特为36 mg/天。保持长期类固醇治疗的非离床活动青少年通
常体重超过40 kg，并且每kg泼尼松剂量通常可使得降至0.3-0.6 mg/kg/天的范围。尽管这个剂量低于约30 mg上限，但是其显示出明显益处。

[0153] 决定类固醇的维持剂量是患者生长、患者对类固醇治疗的反应和副作用负担之间的平衡。这个决定需要在每次诊所访问时基于完成的测试结果以及副作用是否是无法应对
或容忍的问题进行回顾。在开始显示功能下降的接受相对低剂量类固醇(低于每kg体重起
始剂量)的DMD患者中，可能有必要考虑“功能救援”调整。在这种情况下，将类固醇的剂量增加至目标值，并且然后在约2-3个月内重新评估患者的任何益处。

[0154] 可以给予的其他药物包括兰尼碱(ryanodine)受体的拮抗剂，比如丹曲林，其已经显示在DMD患者细胞和小鼠模型中增强反义介导的外显子跳跃(G. Kendall等人 Sci 
Tranl Med 4:164-160 (2012), 本文通过参照结合)。

[0155] 用于递送核酸分子的方法描述于例如Akhtar等人, 1992, Trends Cell Bio., 2:139; 和Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. 
Akhtar; Sullivan等人, PCT WO 94/02595中。这些和其他方案可用于实际上递送任何核
酸分子，包括eteplirsen。

[0156] 如以下详述的那样，本发明的药用组合物可专门配制用于以固体或液体形式给予，包括适合于以下的那些：(1) 口服给予，例如大剂量药液(水或非水溶液剂或混悬剂)、片剂(例如靶向用于颊服、舌下和全身吸收的那些片剂)、大丸剂、散剂、颗粒剂、用于应用于舌的糊剂；(2) 肠胃外给予，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，例如作为无菌溶液剂或混悬剂或者缓释制剂；(3) 局部应用，例如作为应用于皮肤的霜剂、软膏剂或控释贴剂或喷雾剂；(4) 阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、霜剂或泡沫剂；(5) 舌下；(6) 眼；(7) 透皮；或(8) 鼻。

[0157] 短语“药学上可接受的”本文用于指的是在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、变态反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

[0158] 本文使用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组成或媒介物，比如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或者硬脂酸)或溶剂包封材料，参与将对象化合物从一个器官或身体的一
部分携带或运送至另一个器官或身体的一部分。每种载体在与制剂的其他成分相容且对患
者无害的意义上必须是“可接受的”。

[0159] 可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例非限制性地包括：(1) 糖类，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2) 淀粉类，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3) 纤维素及其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4) 西黄蓍胶粉；(5) 麦芽；(6) 明胶；(7) 滑石；(8) 赋形剂，比如可可脂和栓剂蜡；(9) 油类，比如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇类，比如丙二醇；(11) 多元醇类，比如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12) 酯类，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13) 琼脂；(14) 缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；(15) 海藻酸；(16) 无热原水；(17) 等渗盐水；(18) 林格氏液；(19) 乙醇；(20) pH缓冲溶液；(21) 聚酯类、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22) 用于药用制剂的其他非毒性相容性物质。

[0160] 适合于与eteplirsen一起配制的物质的另外非限制性实例包括：PEG缀合的核酸、磷脂缀合的核酸、含有亲脂性部分的核酸、硫代磷酸酯、可增强药物进入各种组织的P-糖蛋白抑制剂(比如Pluronic P85)；可生物降解聚合物，比如用于在植入之后缓释递送的聚
(DL-丙交酯-co-乙交酯)微球(Emerich, D F等人, 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) 
Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.；和负载纳米粒子，比如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些，其可递送药物穿过血脑屏障并且可以改变神经元摄取机制(Prog 
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)。

[0161] 本发明特征还为包含含有聚乙二醇脂质的表面修饰脂质体(PEG修饰的、分支和未分支的或其组合，或者长循环脂质体或隐形脂质体)的组合物的用途。eteplirsen还可包含各种分子量的共价连接的PEG分子。这些制剂提供用于增加目标组织中药物累积的方法。这类药物载体抵抗单核吞噬细胞系统(MPS或RES)的调理作用和消除作用，从而使得延长血液
循环时间和增强包封药物的组织暴露(Lasic等人 Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; 
Ishiwata等人, Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011)。已经显示这种脂质体在肿
瘤中选择性地累积，推测可能是通过新生血管化的目标组织中的外渗和捕获(Lasic等人, 
Science 1995, 267, 1275-1276; Oku等人, 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 
86-90)。长循环脂质体增强DNA和RNA的药代动力学和药效学，特别是与已知在MPS组织中累积的常规阳离子脂质体相比(Liu等人, J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi
等人, 国际PCT公开号WO 96/10391; Ansell等人, 国际PCT公开号WO 96/10390; Holland
等人, 国际PCT公开号WO 96/10392)。基于其避免在代谢侵袭性MPS组织比如肝脏和脾脏中
累积的能力，与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可更大程度地保护药物免于核酸酶降
解。

[0162] 在进一步的实施方案中，本发明包括如在美国专利第6692911、7163695和7070807号中描述的制备用于递送的eteplirsen。在这方面，在一个实施方案中，本发明提供组合物中的eteplirsen，组合物包含单独或与PEG(例如分支或未分支的PEG或两者的混合物)组合
的赖氨酸和组氨酸(HK)的共聚物(如在美国专利第7163695、7070807和6692911号中描述的
那样)，与PEG和靶向部分组合的所述共聚物，或与交联剂组合的前述中的任何一种。在某些实施方案中，本发明提供在包含葡糖酸修饰的聚组氨酸或葡糖酰化的聚组氨酸/转铁蛋白-
聚赖氨酸的组合物中的eteplirsen。本领域的技术人员还将认识到，具有与His和Lys相似
性质的氨基酸可在组合物中替代。

[0163] eteplirsen的某些实施方案可含有碱性官能团，比如氨基或烷基氨基，并且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面术语“药学上可接受的盐”指的是本发明化合物的相对非毒性的无机和有机酸加成盐。这些盐可在给予媒介物或剂型制造
过程中原位制备，或者通过使纯化的游离碱形式的本发明化合物与合适的有机或无机酸单
独反应，并且在随后的纯化期间分离因此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、枸橼酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等(参见例如Berge等人 (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19)。

[0164] eteplirsen的药学上可接受的盐包括该化合物的常规非毒性盐或季铵盐，例如来自非毒性有机或无机酸的盐。例如，这种常规非毒性盐包括衍生自无机酸比如盐酸、氢溴
酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些盐；和自有机酸比如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸等制备的盐。

[0165] 在某些实施方案中，eteplirsen可含有一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”指的是本发明化合物的相对非毒性的无机和有机碱加成盐。这些盐同样地可在给予媒介物或剂
型制造过程中原位制备，或者通过使纯化的其游离酸形式的化合物与合适的碱比如药学上
可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐、与氨或与药学上可接受的有机伯、仲或叔胺单独反应来制备。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。
可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见例如Berge等人, 以上)。

[0166] 润湿剂、乳化剂和润滑剂(比如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂还可存在于组合物中。

[0167] 药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1) 水溶性抗氧化剂，比如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏二亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2) 油溶性抗氧化剂，比如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3) 金属螯合剂，比如枸橼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

[0168] 本发明的制剂包括适合于口服、鼻、局部(包括颊服和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外给予的那些。制剂可便利地以单位剂型呈现)，并且可通过药学领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将依正治疗的宿主、特定给予模式
而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的化合物
的量。通常，在100%之外，该量将在约0.1%-约99%活性成分的范围内，优选地为约5%-约70%，最优选地为约10%-约30%。

[0169] 在某些实施方案中，本发明的制剂包含选自环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂例如胆汁酸和聚合物载体例如聚酯和聚酸酐的赋形剂及eteplirsen。在某些实施方案中，以上提及的制剂使成为口服可生物利用的eteplirsen。

[0170] 制备这些制剂或组合物的方法包括使eteplirsen与载体以及任选的一种或多种辅助成分缔合在一起的步骤。通常，制剂通过将本发明化合物与液体载体或细分的固体载
体或两者均匀和紧密地缔合在一起，然后视需要使产物成形来制备。

[0171] 适合于口服给予的本发明制剂可以胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用矫味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、散剂、颗粒剂形式，或者作为在水或非水液体中的溶液剂或混悬剂，或者作为水包油或油包水液体乳剂，或者作为酏剂或糖浆剂，或者作为软锭剂(使用惰性基质，比如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口水等给予，各自含有预定量的本发明化合物作为活性成分。eteplirsen还可作为大丸剂、干药糖剂或糊剂给予。

[0172] 在用于口服给予的本发明固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂、糖锭等)中，活性成分可与一种或多种药学上可接受的载体比如枸橼酸钠或磷酸二钙和/或以下中的任何一种混合：(1) 填充剂或增量剂，比如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2) 粘合剂，比如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3) 润湿剂，比如甘油；(4) 崩解剂，比如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5) 溶液缓凝剂，比如石蜡；(6) 吸收促进剂，比如季铵化合物和表面活性剂，比如泊洛沙姆和月桂基硫酸钠；(7) 湿润剂，比如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子型表面活性剂；(8) 吸收剂，比如高岭土和膨润土；(9) 润滑剂，比如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸及其混合物；(10) 着色剂；和(11) 控释剂比如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药用组合物还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物还可用作软和硬壳明胶胶囊剂中的填充剂，使
用这种赋形剂比如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。

[0173] 片剂可通过压制或模制来制备，任选地含有一种或多种辅助成分。压制片剂可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备。模制片剂可通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。

[0174] 本发明药用组合物的片剂和其他固体剂型，比如糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可任选地用包衣和外壳比如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其他包衣来刻痕或制备。其也可使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素(以提供期望的的释放曲线)、其他聚合物基质、
脂质体和/或微球配制，以便提供其中活性成分的缓慢或控制释放。其可配制成用于快速释放，例如冷冻干燥。其可通过例如经保留细菌的过滤器过滤或者通过掺入以无菌固体组合
物形式存在的灭菌剂来灭菌，灭菌剂可在使用之前即刻溶解于无菌水或一些其他无菌可注
射介质中。这些组合物还可任选地含有遮光剂，并且可属于这样的组合物，其仅或优先地在胃肠道的某个部分，任选地以延迟的方式释放活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括
聚合物和蜡。活性成分还可以微囊包封形式存在，如果合适的话，含有一种或多种以上描述的赋形剂。

[0175] 用于口服给予本发明化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，比如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，比如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。

[0176] 除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可包含佐剂比如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

[0177] 除了活性化合物之外，混悬剂还可含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。

[0178] 用于直肠或阴道给予的制剂可作为栓剂呈现，其可通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体混合来制备，所述赋形剂或载体包含例如可
可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐，并且其在室温下为固体，但在体温下为液体，并且因此将在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。

[0179] 用于局部或透皮给予本文提供的寡聚物的制剂或剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。eteplirsen可在无菌条件下与药学上可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。除了本发明的活性化合物之外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂可含有赋形剂，比如动物和植物脂肪、油类、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。

[0180] 除了eteplirsen之外，散剂和喷雾剂还可含有赋形剂比如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常规抛射剂，比如氯氟烃类和挥发性未取代的烃类，比如丁烷和丙烷。

[0181] 透皮贴剂具有向身体提供本发明寡聚物的控制递送的附加优点。这种剂型可通过使寡聚物溶解或分散于合适的介质中来制备。吸收增强剂也可用于增加药物穿过皮肤的通
量。这种通量的速率可通过提供速率控制膜或使药物分散于聚合物基质或凝胶中以及本领
域已知的其他方法来控制。

[0182] 适合于肠胃外给予的药用组合物可包含与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水或非水溶液剂、分散体、混悬剂或乳剂或者无菌粉末组合的eteplirsen，所述无菌粉末可在临用前重构成为无菌可注射溶液剂或分散体，其可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与打算的接受者的血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。可用于本发明药用
组合物的合适的水和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇类(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油类比如橄榄油和可注射有机酯类比如油酸乙酯。合适的流动性可例如通过使用包衣材料比如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持需要的粒度和通过使
用表面活性剂来保持。

[0183] 这些组合物还可含有佐剂比如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等可确保防止微生物对eteplirsen的作用。还可期望在组合物中包含等渗剂比如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延缓吸收的物质比如单硬脂酸铝和明胶来实现延长可注射药用形式的吸收。

[0184] 在一些情况下，为了延长药物的作用，期望减缓药物从皮下或肌内注射的吸收。这可通过使用水溶性不佳的结晶或无定形材料的液体混悬液以及本领域已知的其他方法来实现。那么药物的吸收速率取决于其溶出速率，而溶出速率又可取决于晶体大小和结晶形
式。或者，肠胃外给予药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮于油性媒介物中来实现。

[0185] 可注射储库形式可通过以可生物降解聚合物比如聚丙交酯-聚乙交酯形成eteplirsen的微胶囊基质来制备。依eteplirsen与聚合物的比率以及所使用特定聚合物的
性质而定，可控制eteplirsen释放速率。其他可生物降解聚合物的实例包括聚原酸酯和聚
酸酐。储库型可注射制剂还可通过将药物包封在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制
备。

[0186] 当eteplirsen作为药物给予人和动物时，其可本身或者作为含有与药学上可接受的载体组合的例如0.1-99% (更优选地10-30%)活性成分的药用组合物给予。

[0187] 如以上指出的那样，本发明的制剂或制备物可口服、肠胃外、全身、局部、直肠或肌内给予。其一般地以适合于每种给予途径的形式给予。例如，其以片剂或胶囊剂形式，通过注射、吸入、洗眼剂、软膏剂、栓剂等给予，通过注射、输注或吸入给予，通过洗剂或软膏剂局部给予，和通过栓剂直肠给予。

[0188] 本文使用的短语“肠胃外给予”和“肠胃外给予的”意指除了肠内和局部给予外的给予模式，通常通过注射，并且非限制性地包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

[0189] 本文使用的短语“全身给予”、“全身给予的”、“外周给予”和“外周给予的”意指除了直接进入中枢神经系统外的化合物、药物或其他物质的给予，使得其进入患者的系统，并且因此经受代谢和其他类似过程，例如皮下给予。

[0190] 不管所选择的给予途径如何，可以合适的水合形式使用的eteplirsen和/或本发明的药用组合物可通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。本发
明药用组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对特定患者、组合物和给予
模式有效实现期望的治疗反应，而对患者没有不可接受的毒性的活性成分的量。

[0191] 所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括eteplirsen或其酯、盐或酰胺的活性、给予途径、给予时间、eteplirsen的排泄或代谢速率、吸收的速率和程度、治疗持续时间、与eteplirsen组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前医疗史以及医学领域熟知的类似因素。

[0192] 在一些实施方案中，eteplirsen的剂量为在足以治疗DMD或BMD的一段时间内约30 mg/kg。在一些实施方案中，eteplirsen例如每周一次以约25 mg/kg-约50 mg/kg之间(例如约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 mg/kg)的剂量给予患者。在一些实施方案中，eteplirsen例如每周一次以约25 mg/
kg-约50 mg/kg之间(例如约30 mg/kg-约50 mg/kg、约25 mg/kg-约40 mg/kg、约28 mg/kg-约32 mg/kg或约30 mg/kg-约40 mg/kg)的剂量给予患者。

[0193] 在一些实施方案中，eteplirsen一周一次静脉内给予。在某些实施方案中，输注时间为约15分钟-约4小时。在一些实施方案中，输注时间为约30分钟-约3小时。在一些实施方案中，输注时间为约30分钟-约2小时。在一些实施方案中，输注时间为约1小时-约2小时。在一些实施方案中，输注时间为约30分钟-约1小时。在一些实施方案中，输注时间为约60分钟。在一些实施方案中，输注时间为35-60分钟。

[0194] eteplirsen可在给予抗生素、类固醇或其他治疗剂随后或同时给予。治疗方案(剂量、频率、途径等)基于治疗中的受试者的免疫测定、其他生化测试和生理检查的结果，如所指明的那样进行调整。

[0195] 可通过熟悉本领域的人员已知的多种方法将核酸分子给予细胞，方法包括(但不限于)如本文描述和本领域已知的那样通过离子电渗法或通过掺入其他媒介物比如水凝
胶、环糊精、可生物降解纳米胶囊和生物粘附微球而包封在脂质体中。在某些实施方案中，微乳化技术可用于改善亲脂性(不溶于水的)药物的生物利用度。实例包括Trimetrine 
(Dordunoo, S. K.,等人, Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 
1685-1713, 1991 and REV 5901 (Sheen, P. C.,等人, J Pharm Sci 80(7), 712-714, 
1991)。除了别的益处以外，微乳化通过优先将吸收引导至淋巴系统而不是循环系统来提供增强的生物利用度，这从而绕过肝脏，并且防止化合物在肝胆循环中的破坏。

[0196] 在本发明的一个方面，制剂含有由eteplirsen和至少一种两亲性载体形成的胶束，其中胶束具有小于约100 nm的平均直径。更优选的实施方案提供具有小于约50 nm平均直径的胶束，和甚至更优选的实施方案提供具有小于约30 nm或者甚至小于约20 nm平均直
径的胶束。

[0197] 尽管可考虑所有合适的两亲性载体，但是目前优选的载体通常为具有公认无毒(GRAS)状态，并且可溶解本发明化合物并在稍后阶段当溶液与复杂水相(比如人胃肠道中
存在的水相)接触时使其微乳化的那些载体。通常，满足这些要求的两亲性成分具有2-20的HLB (亲水-亲脂平衡)值，并且其结构含有C-6至C-20范围内的直链脂肪族基团。实例为聚
乙二醇化脂肪酸甘油酯和聚乙二醇。

[0198] 两亲性载体的实例包括饱和和单不饱和聚乙二醇化脂肪酸甘油酯，比如由完全或部分氢化的各种植物油获得的那些。这种油可有利地由三-、二-和单-脂肪酸甘油酯以及相应脂肪酸的二-和单-聚乙二醇酯组成，特别优选的脂肪酸组成包括癸酸4-10%、癸酸3-9%、月桂酸40-50%、肉豆蔻酸14-24%、棕榈酸4-14%和硬脂酸5-15%。另一类有用的两亲性载体包括用饱和或单不饱和脂肪酸(SPAN-系列)或相应的乙氧基化类似物(TWEEN系列)部分酯化
的脱水山梨糖醇和/或山梨醇。

[0199] 市售可用的两亲性载体可为特别有用的，包括Gelucire-系列、Labrafil、Labrasol或Lauroglycol (全部由Gattefosse Corporation, Saint Priest, France制造
和分销)、PEG-单油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-单月桂酸酯和二月桂酸酯、卵磷脂、聚山梨酯
80等(由美国和全球的一些公司生产和分销)。

[0200] 在某些实施方案中，可通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等发生递送，用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞。特别地，本发明的组合物可配制成用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中的递送。这种递送媒介物的配制和使用可使用已知和常规技术来实施。

[0201] 适用于本发明的亲水性聚合物为易于溶于水，可共价连接于形成囊泡的脂质，并且其在体内耐受而没有毒性作用(即生物相容性)的那些。合适的聚合物包括聚乙二醇
(PEG)、聚乳酸(也称为聚丙交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇。在某些实施方案中，聚合物具有约100或120道尔顿直至约5000或10000道尔顿，或者约300道尔顿-约5000道尔顿的分子量。在其他实施方案中，聚合物为具有分子量约
100-约5000道尔顿或具有分子量约300-约5000道尔顿的聚乙二醇。在某些实施方案中，聚
合物为750道尔顿的聚乙二醇(PEG(750))。聚合物还可根据其中的单体数目来定义，本发明的优选实施方案使用至少约3种单体的聚合物，这种PEG聚合物由3种单体(约150道尔顿)组
成。

[0202] 可适用于本发明的其他亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺以及衍生化纤维素比如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

[0203] 在某些实施方案中，本发明的制剂包含选自以下的生物相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯基聚合物、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚原酸酯、聚丁酸、聚戊酸、聚丙交酯-共聚-己内酯、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯及其掺混物、混合物或共聚物。

[0204] 环糊精为环状寡糖，由6、7或8个葡萄糖单位组成，分别用希腊字母α、β或γ命名。葡萄糖单位通过α-1,4-糖苷键连接。由于糖单位的椅式构象，所有仲羟基(在C-2、C-3处)位于环的一侧，而C-6处的所有伯羟基位于另一侧。结果，外表面为亲水性的，使得环糊精为水溶性的。相比之下，环糊精的空腔为疏水性的，因为其由原子C-3和C-5的氢以及醚样氧形成衬里。这些基质使得能够与多种相对疏水性化合物包括例如类固醇化合物比如17α-雌二醇复合(参见例如 van Uden等人 Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113 (1994))。复
合通过范德华相互作用和通过形成氢键而发生。关于环糊精化学的一般性综述参见Wenz, 
Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:803-822 (1994)。

[0205] 环糊精衍生物的物理化学性质强烈取决于取代的种类和程度。例如，其水中溶解度在不溶性(例如三乙酰基-β-环糊精)-147%可溶性(w/v) (G-2-β-环糊精)的范围内。另
外，其可溶于许多有机溶剂中。环糊精的性质使得能够通过增加或减少其溶解度来控制各
种制剂组分的溶解度。

[0206] 已经描述了许多环糊精及其制备方法。例如，Parmeter (I),等人 (美国专利第3453259号)和Gramera,等人 (美国专利第3459731号)描述了电中性环糊精。其他衍生物包
括具有阳离子性质的环糊精[Parmeter (II), 美国专利第3453257号]、不溶性交联环糊精
(Solms, 美国专利第3420788号)和具有阴离子性质的环糊精[Parmeter (III), 美国专利
第3426011号]。在具有阴离子性质的环糊精衍生物中，已将羧酸、亚磷酸、次亚膦酸、膦酸、磷酸、硫代膦酸、硫代亚磺酸和磺酸附加于母体环糊精上[参见Parmeter (III), 以上]。此外，Stella,等人 (美国专利第5134127号)描述了磺基烷基醚环糊精衍生物。

[0207] 脂质体由至少一个包封水性内部隔室的脂质双层膜组成。脂质体可通过膜的类型和大小来表征。小单层囊泡(SUV)具有单一膜并且一般地直径范围在0.02-0.05 μm之间，大单层囊泡(LUVS)一般地大于0.05 μm。寡层大囊泡和多层囊泡具有多个通常同心的膜层，并且一般地大于0.1 μm。具有几个非同心膜的脂质体，即包含在一个较大囊泡内的几个较小囊泡，称为多泡囊泡。

[0208] 本发明的一个方面涉及包含含有eteplirsen的脂质体的制剂，其中脂质体膜配制成提供具有增加的携带能力的脂质体。或者或另外，本发明的化合物可包含在脂质体的脂
质体双层内或吸附到其上。eteplirsen可与脂质表面活性剂聚集并携带在脂质体的内部空
间内，在这些情况下，脂质体膜配制成抵抗活性物质-表面活性剂聚集体的破坏作用。

[0209] 根据本发明的一个实施方案，脂质体的脂质双层含有用聚乙二醇(PEG)衍生化的脂质，使得PEG链从脂质双层的内表面延伸到由脂质体包封的内部空间中，并且从脂双层的外部延伸进入周围环境。

[0210] 包含在本发明脂质体内的活性物质以溶解形式存在。表面活性剂和活性物质的聚集体(比如含有目标活性物质的乳液或胶束)可被包裹在本发明脂质体的内部空间内。表面
活性剂起分散和溶解活性物质的作用，并且可选自任何合适的脂肪族、脂环族或芳香族表
面活性剂，包括(但不限于)不同链长度(例如约C14-约C20)的生物相容性溶血磷脂酰胆碱
(LPG)。聚合物衍生化的脂质比如PEG-脂质也可用于胶束形成，因为其将起抑制胶束/膜融
合的作用，并且当向表面活性剂分子加入聚合物时，降低表面活性剂的CMC并助于胶束形
成。优选的是具有微摩尔范围的CMO的表面活性剂，较高CMC表面活性剂可用于制备包裹在
本发明脂质体内的胶束。

[0211] 本发明的脂质体可通过本领域已知的多种技术中的任何一种来制备。参见例如美国专利第4235871号; 公开的PCT申请WO 96/14057; New RRC, Liposomes: A practical 
approach, IRL Press, Oxford (1990), pages 33-104; Lasic DD, Liposomes from 
physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993。例
如，本发明的脂质体可通过使用亲水性聚合物衍生化的脂质扩散到预先形成的脂质体中来
制备，比如通过以对应于脂质体中期望的衍生化脂质的最终摩尔百分比的脂质浓度使预先
形成的脂质体暴露于由脂质接枝聚合物组成的胶束。如本领域已知的那样，含有亲水性聚
合物的脂质体还可通过均质化、脂质场水合(lipid-field hydration)或挤出技术形成。

[0212] 在另一个示例性的配制程序中，活性物质首先通过超声处理分散于易于溶解疏水性分子的溶血磷脂酰胆碱或其他低CMC表面活性剂(包括聚合物接枝脂质)中。然后将生成
的活性物质的胶束混悬液用于再水合含有合适摩尔百分比的聚合物接枝脂质或胆固醇的
干燥脂质样品。然后使用本领域已知的挤出技术使脂质和活性物质混悬液形成为脂质体，
并且通过标准柱分离将生成的脂质体与未包封的溶液分离。

[0213] 在本发明的一个方面，脂质体被制备成在选定的大小范围内具有基本均匀的大小。一种有效的分选方法包括将脂质体的水悬浮液挤出通过一系列具有选定的均匀孔径的
聚碳酸酯膜，膜的孔径大致对应于通过经所述膜挤出产生的最大脂质体大小。参见例如美
国专利第4737323号 (1988年4月12日)。在某些实施方案中，试剂比如DharmaFECT®和
Lipofectamine®可用于将多核苷酸或蛋白质引入到细胞中。

[0214] 本发明制剂的释放特征取决于包封材料、所包封药物的浓度和释放调节剂的存在。例如，释放可被调整成pH依赖性的，例如使用仅在低pH (如在胃中)或较高pH(如在肠
中)下释放的pH敏感性包衣。可使用肠溶包衣来防止释放发生直至通过胃之后。可使用多种包衣或包封在不同材料中的氰胺混合物来获得胃中的初始释放，随后为肠中的稍后释放。
释放还可通过包含盐或成孔剂操纵，盐或成孔剂可通过从胶囊扩散来增加水吸收或释放药
物。改变药物溶解度的赋形剂也可用于控制释放速率。还可掺入增强基质降解或从基质释
放的物质。其可加入到药物中，作为单独相(即作为颗粒)加入，或者可共同溶解于聚合物相中，这取决于化合物。在大多数情况下，量应在0.1-30% (w/w聚合物)之间。降解增强剂的类型包括无机盐比如硫酸铵和氯化铵；有机酸比如枸橼酸、苯甲酸和抗坏血酸；无机碱比如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸锌和氢氧化锌；及有机碱比如硫酸鱼精蛋白、精胺、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺及表面活性剂比如Tween®和Pluronic®。将微观结构添加到基质
中的成孔剂(即水溶性化合物比如无机盐和糖)作为颗粒加入。该范围一般地在1-30% (w/w
聚合物)之间。

[0215] 摄取还可通过改变颗粒在肠道中的停留时间操纵。这可例如通过用粘膜粘附聚合物包衣颗粒或者选择其作为包封材料来实现。实例包括大多数具有游离羧基的聚合物，比
如壳聚糖、纤维素，并且尤其是聚丙烯酸酯(本文使用的聚丙烯酸酯指的是包括丙烯酸酯基团和修饰的丙烯酸酯基团比如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物)。

[0216] eteplirsen可配制成包含在手术或医疗装置或植入物内，或者适合于通过其释放。在某些方面，植入物可用eteplirsen涂覆或者处理。例如，水凝胶或其他聚合物(比如生物相容性和/或可生物降解聚合物)可用于用本发明的组合物涂覆植入物(即组合物可通过
使用水凝胶或其他聚合物适用于医疗装置)。用于与药物涂覆医疗装置的聚合物和共聚物
为本领域熟知的。植入物的实例包括(但不限于)支架、药物洗脱支架、缝合线、假体、血管导管、透析导管、血管移植物、假体心脏瓣膜、心脏起搏器、植入式心律转复除颤器、IV针、正骨和骨形成装置(比如钉、螺钉、板和其他装置)以及用于伤口愈合的人工组织基质。

[0217] 除了本文提供的方法之外，可通过与其他药物类似的方式将eteplirsen配制成以任何便利的方式给予以用于人或兽医学。eteplirsen及其相应制剂可单独或与其他治疗策
略组合给予用于治疗肌营养不良，比如成肌细胞移植、干细胞治疗、给予氨基糖苷类抗生
素、蛋白酶体抑制剂和上调治疗(例如上调utrophin，其为肌营养不良蛋白的常染色体旁系同源物(paralogue))。

[0218] 所描述的给予途径仅旨在作为指导，因为熟练的执业医生将能够易于确定最佳给予途径和用于任何特定动物和病症的任何剂量。已经尝试多种将功能性新遗传物质体外和
体内引入到细胞中的方法(Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280。这些方法包括将
待表达的基因整合到到修饰的逆转录病毒中(Friedmann (1989) 同上; Rosenberg 
(1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S)；整合到非逆转录病毒载体(例
如腺伴随病毒载体)中(Rosenfeld,等人 (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld,等人 
(1991) Science, 252:431-434)；或经脂质体递送与异源启动子-增强子元件连接的转基
因(Friedmann (1989), 同上; Brigham,等人 (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281; 
Nabel,等人 (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski,等人 (1991) Am. J. Resp. 
Cell Molec. Biol., 4:206-209;以及Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 
(USA), 84:7851-7855)；与配体特异性基于阳离子的转运系统结合(Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624)或使用裸DNA表达载体(Nabel等人 (1990), 同上); 
Wolff等人 (1990) Science, 247:1465-1468)。将转基因直接注射到组织中仅产生局部表
达(Rosenfeld (1992) 同上); Rosenfeld等人 (1991) 同上; Brigham等人 (1989) 同
上; Nabel (1990) 同上; 和Hazinski等人 (1991) 同上)。Brigham等人研究小组(Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281和Clinical Research (1991) 39 (摘要))已经报道了在
静脉内或气管内给予DNA脂质体复合物后只体内转染小鼠肺。人基因治疗程序的综述文章
的一个实例为：Anderson, Science (1992) 256:808-813。

[0219] III. 药盒本发明还提供用于治疗患有遗传性疾病的患者的药盒，该药盒至少包含包装在合适容
器中的eteplirsen连同其使用说明书。药盒还可含有外围试剂比如缓冲剂、稳定剂等。

[0220] IV. 实施例材料和方法
患者
对于eteplirsen治疗组，符合条件的患者介于7-13岁之间(包括7岁和13岁在内)，并且
具有可通过跳跃51号外显子纠正的DMD基因的框外(out-of-frame)缺失。患者被确认在入
选之前至少24周具有稳定的心肺功能及稳定剂量的糖皮质激素。只有在基线6分钟步行试
验(6MWT)可步行200-400米(±10%)的患者入选。

[0221] 研究设计eteplirsen治疗组
这项4年试验分两个阶段实施：(1) 在整个24周治疗为双盲的，和(2) 之后为开放标签
的。主要终点为如通过6分钟步行试验(6MWT)测量的离床活动变化。

[0222] 研究201  (研究编号4658-us-201; 临床试验政府标识符：NCT01396239)为eteplirsen的单位点、随机、双盲、安慰剂对照的、多剂量功效、安全性和耐受性试验。将12名DMD患者随机分到3组中的1组：eteplirsen 30 mg/kg/周(组1)；eteplirsen 50 mg/kg/
周(组2)；或安慰剂/延迟eteplirsen(组3)。所有患者每周接受静脉内eteplirsen或安慰
剂/延迟eteplirsen给药。安慰剂治疗的患者在第25周时交叉为每周eteplirsen 30 (n=2)
或50 mg/kg (n=2)。在预定的访问时评价功效和安全性，并且独立的数据安全监测委员会
(Data Safety Monitoring Board)确保所有患者的福利。所有患者在基线时具有二头肌活
检。在第12周时对50 mg/kg组和2名安慰剂治疗的患者和在第24周时对30 mg/kg组和2名安
慰剂治疗的患者，在对侧臂(二头肌)实施随访活检。

[0223] 患者在研究202 (研究编号4658-us-202; 临床试验政府标识符：NCT01540409)下持续每周给药30或50 mg/kg eteplirsen，这是一项长期的开放标签延长研究。在研究202
期间持续实施所有功效评价，包括所有患者在第48周时进行第3次活检(在左侧三角肌)。在第180周时实施自愿的第4次活检(11/12患者)。在整个研究中持续监测不良事件。研究设计的示意图显示在图1中。

[0224] 匹配的外部对照组为了比较eteplirsen组与匹配的外部对照组的结果，意大利Telethon (n=97)和鲁汶
神经肌肉研究中心(Neuromuscular Research Center, NMRC) (n=89)登记处用于编制对
照数据。选择这些登记处是因为以下数据可用：51号外显子顺从患者的纵向6MWT数据、长达
36个月的纵向6MWT数据及基因突变数据。在这些登记处还有等同护理标准，包括类固醇类。
患者数据基于以下因素进行选择：基线6MTW和类固醇治疗、7岁或更大并且顺从51号外显子跳跃(图2)。

[0225] 研究药物eteplirsen以一次性使用的磷酸缓冲盐水小瓶(100  mg/ml)由Sarepta 
Therapeutics, Inc供给。eteplirsen用150 ml生理盐水重构并经60分钟输注。在研究201
的前24周期间给予的安慰剂作为相同的磷酸盐缓冲盐水小瓶供给，并以与eteplirsen相同
的方式给予。

[0226] 安全性和耐受性监测安全性通过评估不良事件、生命体征、身体检查、心电图、超声心动图和临床实验室测
试评价。另外，肾功能经定期评价血清胱抑素C和尿胱抑素C和KIM-1监测。

[0227] 生化功效评价基于MANDYS106 [Glen Morris的赠品，MDA单克隆抗体文库] (eteplirsen和其他外显
子跳跃候选物的先前研究中使用的肌营养不良蛋白的高度敏感标志物)，在eteplirsen治
疗组和匹配的外部对照组中测定了肌营养不良蛋白表达水平。分开至少200 μm的3个10 μm冷冻切片先后用MANDYS106和用二次抗体(Alexa Fluor 594山羊抗小鼠抗体)染色。4名病
理学家回顾了盲法组织并报道了肌营养不良蛋白阳性纤维百分比，其通过将阳性纤维数目
除以所计数的总纤维来计算。因为正常肌肉样品具有100%肌营养不良蛋白阳性纤维，因此
肌营养不良蛋白阳性纤维百分比表示为正常值的百分比。

[0228] 临床功效评价除了没有使用StepWatch actimetry装置以外，6MWT使用McDonald,等人 (Muscle 
Nerve, 2010; 42:966-74; Muscle Nerve, 2010; 41:500-10, 本文通过参照结合)对DMD
患者确立的方案进行管理。探索性功能结果包括北极星移动评价量表、定量肌肉测试、九孔柱测试(9-Hole Peg Test)、肺功能测试(PFT)、定时功能测试和生活质量评价。

[0229] 实施例1：受试者特征eteplirsen治疗组的12名患者和外部匹配对照组的13名患者的基线特征概述在表1
中。在eteplirsen和对照群体中均表现出顺从51号外显子跳跃的5种不同基因型。基线6分
钟步行试验(6MWT)的平均距离与DMD儿童的其他研究中的那些类似，并且如预计的那样，远低于一般地在年龄匹配的健康儿童中观察到的600+米。

[0230] 表1. 基线人口统计和疾病特征缩写：6MWT = 6分钟步行试验；SD =标准偏差。

[0231] 实例2：安全性和缺乏不良事件eteplirsen在整个216周治疗中耐受性良好，不存在治疗相关不良事件、严重不良事
件、停药或错过剂量。此外，在身体检查或生命体征中未观察到临床显著变化。心电图、超声心动图和PFT保持稳定，并且化学成分在血液学、肾脏、凝血或肝功能方面没有显示临床显著变化。在单一安慰剂治疗的受试者中观察到轻度和短暂的蛋白尿。

[0232] 实施例3：外部对照组的自然历史一旦开发了外部对照组并且患者数据特征为年龄和顺从外显子跳跃，则进行对照组内
比较。图2显示通过前瞻性定义的过滤器获得匹配的外部对照组。<7岁且顺从外显子跳跃的患者(n=17)步行能力在整个24个月得到初步改善，并且然后在整个36个月保持6MWT距离高
于基线。然而，7岁或更大且顺从外显子跳跃的患者(n=50)在36个月内6MWT距离显著减少。
年龄小于7岁的患者与7岁或更大的患者之间的统计学显著差异为194 m (p<0.001) (图
3)。

[0233] 当观察具有任何基因型的外部对照组患者的趋势时，这一点更加明显。年龄小于7岁的患者(n=25)的步行能力在整个24个月得到初步改善，并且在整个36个月保持6MWT距离
高于基线，而7岁或更大的患者(n=91)在整个36个月6MWT距离显著减少。年龄组之间的差异为统计学显著的167 m (p<0.001) (图4)。这些数据表明，相对于年龄较小的患者，7岁或更大的患者的离床活动下降快得多。

[0234] 除了比较年龄组之间的差异之外，还在7岁或更大的患者中引起DMD的突变之间进行了比较。如图5中显示的那样，与具有顺从外显子跳跃的突变的患者、通常或者具有任何突变的DMD患者相比，具有顺从51号外显子跳跃的突变的患者在36个月内具有更大的6MWT
距离丧失。该数据显示，具有51号外显子突变的患者比任何其他基因型下降更快。

[0235] 实施例4：功能结果步行能力的渐进性丧失为DMD的普遍特点，大多数患者到7或8岁时显示功能损害并且
到10-14岁时变得依赖轮椅。与此一致的是，来自匹配的外部对照患者的数据显示出步行能力在36个月内下降，最终丧失约250米。形成鲜明对比的是，eteplirsen治疗的患者在研究期间保持稳定的步行距离(图6)。在eteplirsen治疗的患者与匹配的外部对照组中那些患
者之间的差异在通过从基线的百分比变化分析6MWT距离时也是明显的。在外部对照患者
(在第36个月时)观察到下降-74%，而eteplirsen治疗的患者在42个月时仅下降-42%。当排
除了安慰剂-延迟eteplirsen治疗的患者(n=8)时，在治疗第48个月时观察到下降-43% (图
7)。如图7中显示的那样，出乎意料地eteplirsen治疗在168-192周(42个月-48个月)之间稳定患者离床活动，如以下描述的那样，其还与持续稳定的肺功能和肌营养不良蛋白表达相
关。

[0236] 通过观察在36个月内的累积离床活动丧失，eteplirsen治疗的益处更加明显。匹配的外部对照组中13名患者中的6名丧失了离床活动，而eteplirsen组中12名患者中仅有2
名丧失离床活动(图8)。总体而言，匹配的外部对照组中46.2%丧失离床活动，和eteplirsen组中只有16.7%。并且，如以上指出的那样，在治疗192周时，10/12的eteplirsen治疗的患者为能离床活动的。

[0237] 实施例5：与匹配的外部对照组相比的功效180周之后，如通过免疫组织化学测定的那样，与匹配的外部对照患者相比，
eteplirsen治疗的患者具有显著更大量的肌营养不良蛋白阳性纤维。4名独立的不知情的
病理学家各自在eteplirsen治疗的患者中发现了统计学显著的更高百分比的肌营养不良
蛋白阳性纤维(p<0.001) (图9)。

[0238] 实施例6：肺功能如通过最大吸气和呼气压力(MIP和MEP)及用力肺活量(FVC)测量的那样(图10)，在两
个组中测定了整个第192周从基线的呼吸肌功能。在研究期间，eteplirsen治疗的患者在所有MIP、MEP和FVC方面或者保持，或者仅略微下降。然而，匹配的外部对照患者随着时间的推移在所有3项测量中均稳步下降。这表明eteplirsen能够防止肺功能随着时间的推移丧失。

[0239] 实施例7：功能结果的扩展测量如在实施例4中实施的那样，在216周时并且与外部对照受试者相比，进一步评估了
eteplirsen治疗的患者的离床活动能力。表2显示在eteplirsen治疗组中216周时呈现为
6MWD(以米为单位)的6MWT的结果。表3显示在匹配的外部对照组中216周时6MWT的结果。

[0240] 表2：研究201/202受试者(n=12)在4年时的6MWT结果表3：匹配的外部对照组(n=13)在第4年时的6MWT结果
*第4年时缺失6MWT数据的外部对照患者
**值得注意的是，随后报道了患者MI15和SL在 4.5年时基于6MWT的离床活动丧失“0”
~
米。另外，已知外部对照患者PV12在4.8年时丧失了“0”的6MWT离床活动。

[0241] 比较并分析了eteplirsen治疗组和外部匹配对照组的6MWT结果的统计学显著性差异。与实施例4中描述的数据一致，如通过MMRM (用于重复测量的混合模型)和ANCOVA 
(协方差分析)测定的那样，在eteplirsen治疗组与外部匹配对照组之间从基线的平均变化
存在显著差异，概述在表4中。对于MMRM方法，使用了来自eteplirsen治疗组的所有12名患者和来自外部匹配对照组的所有13名患者的数据。对于ANCOVA方法，使用了来自
eteplirsen治疗组的所有12名患者和来自外部匹配组的11名患者(排除了缺失数据的患
者)的数据。

[0242] 表4：第4年6MWT平均变化差异的概述模型 MMRM ANCOVA
协变量：基线6MWT 146.5, p=0.003 150.3, p=0.002
协变量：基线6MWT，年龄 143.1, p=0.004 156.1, p=0.002
秩变换数据分析的协变量： 8.4, p=0.004 8.7, p=0.001
此外，如图12中所示的那样，与外部匹配对照组相比，在eteplirsen治疗的患者组之间
从基线的平均变化之间的差异从3年时的151米增加到第4年时的162米。这些数据提供了进
一步的证据表明，eteplirsen治疗减缓DMD患者随着时间推移的疾病进展。

[0243] 通过观察在216周内的累积离床活动丧失，eteplirsen治疗的益处更加明显。匹配的外部对照组的13名患者中有10名丧失了离床活动，而eteplirsen组的12名患者中仅有2
名丧失了离床活动(图11)。在192周时能离床活动的所有10名eteplirsen治疗的患者在216
周时保持能够步行。总体而言，匹配的外部对照组中89.7%丧失离床活动，和eteplirsen组中仅有16.7%。参见图13，其示出了每个组中无离床活动患者按时间的百分比。在外部匹配对照组中，离床活动丧失的年龄中位数为12.8岁，而eteplirsen治疗组中离床活动丧失的
年龄不能估计。该数据进一步支持了，eteplirsen治疗的患者以统计学显著的方式比外部
对照匹配的患者表现更好。

[0244] 实施例8：已经丧失独立地从仰卧起身的能力的患者中的功效一些文献表明DMD患者在独立地从地板起身的能力丧失与接着在随后的1年内离床活
动丧失之间的关联。如以下表5中显示的那样，4名eteplirsen治疗的患者在第1-3年丧失了在没有外部支持的情况下起身的能力。然而，尽管丧失了从仰卧起身的能力，但是这些基于eteplirsen治疗的患者在第4年时保持能离床活动。

[0245] 表5：第3年起身时间与第4年6MWT距离受试者ID* 第3年起身时间(s) 第4年6MWT 第4年年龄
012 无法独立地起身(第1年) 237 14.6
005 无法独立地起身(第2年) 143 11.7
003 无法独立地起身(第3年) 192 1 1.0
007 无法独立地起身(第3年) 197 11.7
013 24.1 230 14.3
006 17.9 332 14.2
004 13.1 221 12.5
008 8.9 55† 14.2
015 8.2 400 13.3
002 6.2 349 12.7
* n=10名能离床活动受试者；受试者009和010由于在第36周时LOA而未包括在内。

[0246] †受试者008在第84周时胫骨腓骨骨折。

[0247] 这些数据表明，如通过6MWT测量的那样，eteplirsen治疗甚至在已经丧失独立地从仰卧起身的能力的患者中也保持离床活动能力。

[0248] 实施例9. eteplirsen和类固醇使用的强度已经显示使用类固醇会影响DMD患者的疾病进展。重要的是，eteplirsen治疗的患者以
及所有外部对照在入选之前至少6个月时正在进行稳定剂量的类固醇治疗，并且在整个研
究中保持类固醇。

[0249] eteplirsen和外部对照患者以等比例使用地夫可特和泼尼松。图14描绘了通过持续或间歇方案接受地夫可特或泼尼松的患者数目。在每种类固醇方案内，显示了平均推荐
类固醇剂量的百分比计算。与eteplirsen治疗的患者相比(范围在75-79%)，外部对照组实
际上接受了CDC/TREAT-NMD指南确立的标准推荐剂量的较高百分比(范围在88-100%)。

[0250] 实施例10. 在北极星移动评价量表(NSAA)评分降低的eteplirsen患者中保持的离床活动
与以上描述的6MWT结果类似，eteplirsen治疗的患者在治疗后2年和3年时显示出NSAA
评分下降速率较慢，导致与外部对照组相比，在3年时相差2.6分。该结果代表保持一种或多种日常生活活动。预计在eteplirsen治疗组中第3年时有两名患者(003和005)降至低于
NSAA阈值，预测1年内离床活动丧失[Ricotti等人 (2015) J Neurol Neurosurg 
Psychiatry0:1-7]，然而在第4年时两者仍保持离床活动(分别为143和192米)。参见以下表
6。

[0251] 表6. 第3年NSAA与第4年6MWT* n=10名能离床活动受试者；受试者009和010由于在36周时LOA而未包括在内。

[0252] †受试者008在第84周时胫骨腓骨骨折。

[0253] *********************该说明书中引用的所有出版物和专利申请在此通过参照结合，如同每个单独的出版物
或专利申请具体和单独地表明通过参照结合。

[0254] 参考文献1. Emery AEH. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-
a world survey. Neuromuscul Disord 1991;1:19-29.
2. Mendell JR, Shilling C, Leslie ND, Flanigan KM, al-Dahhak R, Gastier-
Foster, J,等人 Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular 
dystrophy. Ann Neurol 2012;71:304-13.
3. McDonald CM, Abresch RT, Carter GT, Fowler WM Jr, Johnson ER, Kilmer 
DD,等人 Profiles of neuromuscular diseases. Duchenne muscular dystrophy. Am J 
Phys Med Rehabil 1995;74:S70-S92.
4. Bushby K, Finkel R, Birnkrant DJ, Case LE, Clemens PR, Cripe L,等人 
Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, 
and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol 2010;9:77-93.
5. Kohler M, Clarenbach CF, Böni L, Brack T, Russi EW, Bloch KE. Quality 
of life, physical disability and respiratory impairment in Duchenne muscular 
dystrophy. Am J Respir Crit Care Med 2005;172:1032-6.
6. Mendell JR, Moxley RT, Griggs RC, Brooke MH, Fenichel GM, Miller JP,等
人 Randomized, double-blind six-month trial of prednisone in Duchenne's 
muscular dystrophy. N Engl J Med 1989;320:1592-97.
7. Manzur AY, Kuntzer T, Pike M, Swan A. Glucocorticoid corticosteroids 
for Duchenne muscular dystrophy. Cochrane Database Syst Rev. 2004;(2):
CD003725.
8. van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, Frankhuizen WS, Aartsma-Rus A, 
Bremmer-Bout  M,等人  Local dystrophin restoration  with antisense 
oligonucleotide PRO051. N Engl J Med 2007;357:2677-86.
9. Kinali M, Arechavala-Gomeza V, Feng L, Cirak S, Hunt D, Adkin C,等人 
Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-
4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, 
dose-escalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol 2009;8:918-28.
10. Goemans NM, Tulinius M, van den Akker JT, Burm BE, Ekhart PF, 
Heuvelmans N,等人 Systemic administration of PRO051 in Duchenne’s muscular 
dystrophy. N Engl J Med 2011;364:1513-22.
11. Cirak S, Arechavala-Gomeza V, Guglieri M, Feng L, Torelli S, Anthony 
K,等人 Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne 
muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer 
treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet 2011;378:
595-605.
12. Aartsma-Rus A, Fokkema I, Verschuuren J, Ginjaar I, van Deutekom J, 
van Ommen GJ,等人 Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping 
for Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum Mutat 2009;30:293-99.
13. Muntoni F, Torelli S, Ferlini A. Dystrophin and mutations: one gene, 
several proteins, multiple phenotypes. Lancet Neurol. 2003;2:731-40.
14. Bushby KM, Gardner-Medwin D. The clinical, genetic and dystrophin 
characteristics of Becker muscular dystrophy. I. Natural history. J Neurol 
1993;240:98-104.
15. Arechavala-Gomeza V, Graham IR, Popplewell LJ, Adams AM, Aartsma-Rus 
A, Kinali M,等人 Comparative analysis of antisense oligonucleotide sequences 
for targeted skipping of exon 51 during dystrophin pre-mRNA splicing in human 
muscle. Hum Gene Ther 2007;18:798-810.
16. Mendell JR, Campbell K, Rodino-Klapac L, Sahenk Z, Shilling C, Lewis 
S,等人 Dystrophin immunity revealed by gene therapy in Duchenne muscular 
dystrophy. N Engl J Med 2010;363:1429-37.
17. Nguyen TM, Morris GE. Use of epitope libraries to identify exon-
specific monoclonal antibodies for characterization of altered dystrophins in 
muscular dystrophy. Am J Hum Genet1993;52:1057-66.
18. Arechavala-Gomeza V, Kinali M, Feng L, Brown SC, Sewry C, Morgan JE,
等人 Immunohistological intensity measurements as a tool to assess 
sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol2010;36:
265-74.
19. McDonald CM, Henricson EK, Han JJ, Abresch RT, Nicorici A, Elfring 
GL,等人 The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular 
dystrophy. Muscle Nerve 2010;41:500-10.
20. Mazzone E, Vasco G, Sormani MP, Torrente Y, Berardinelli A, Messina 
S,等人 Functional changes in Duchenne muscular dystrophy: a 12-month 
longitudinal cohort study. Neurology 2011;77(3):250-6.
21. McDonald CM, Henricson EK, Han JJ, Abresch RT, Nicorici A, Atkinson 
L,等人 The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: 
longitudinal observations. Muscle Nerve2010;42:966-74.
22. Strober JB. Therapeutics in Duchenne muscular dystrophy. NeuroRX 
2006;3:225-34.
23. Hoffman EP, Fischbeck KH, Brown RH, Johnson M, Medori R, Loike JD,等
人 Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients 
with Duchenne’s or Becker’s muscular dystrophy. N Engl J Med 1988;318:1363-
68.
24. Azofeifa J, Voit T, Hubner C, Cremer M. X-chromosome methylation in 
manifesting and healthy carriers of dystrophinopathies: concordance of 
activation ratios among first degree female relatives and skewed inactivation 
as cause of the affected phenotypes. Hum Genet 1995;96:167-76.
25. van Putten M, Hulsker M, Nadarajah VD, van Heiningen SH, van Huizen 
E, van Iterson M,等人 The Effects of Low Levels of Dystrophin on Mouse Muscle 
Function and Pathology. PLoS ONE 2012;7:e31937.
26. Brooke MH, Fenichel GM, Griggs RC, Mendell JR, Moxley R, Miller JP,等
人 Clinical investigation in Duchenne dystrophy: 2. Determination of the "
power" of therapeutic trials based on the natural history. Muscle Nerve. 
1983;6:91-103.
27. Ahmad A, Brinson M, Hodges BL, Chamberlain JS, Amalfitano A. Mdx mice 
inducibly expressing dystrophin provide insights into the potential of gene 
therapy for Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet 2000;9:2507-15.
28. Hoffman EP, Bronson A, Levin AA, Takeda S, Yokota T, Baudy AR, Connor 
EM.. Restoring dystrophin expression in Duchenne muscular dystrophy muscle: 
Progress in exon skipping and stop codon read through. Am J Path 2011;179:12-
22.
29. Merlini L, Gennari M, Malaspina E, Cecconi I, Armaroli A, Gnudi S,等
人 Early corticosteroid treatment in 4 Duchenne muscular dystrophy patients: 
14-year follow-up. Muscle Nerve 2012;45:796-802.
30. Fletcher S, Honeyman K, Fall AM, Harding PL, Johnsen RD, Steinhaus 
JP,等人 Morpholino oligomer-mediated exon skipping averts the onset of 
dystrophic pathology in the mdx mouse. Mol Ther 2007;15:1587-92.
31. Yokota T, Lu QL, Partridge T, Kobayashi M, Nakamura A, Takeda S,,等人 
Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Ann 
Neurol 2009;65:667-76.
32. Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, van Ommen GJ, den 
Dunnen JT,等人 Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular 
dystrophy makes more sense. Am J Hum Genet 2004;74:83-92.