小反刍兽疫诊断试剂盒
阅读：490发布：2020-05-12
专利汇可以提供小反刍兽疫诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及小反刍兽疫 诊断 试剂 盒 。本发明的检测试剂盒包括基底，以及独立地连接于所述基底上的特定多肽或特定多肽组合。，下面是小反刍兽疫诊断试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种多肽组合1，其由SEQ ID NO：1～6所示的多肽组成，其中，
SEQ ID NO：1的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE；
SEQ ID NO：2的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA；
SEQ ID NO：3的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL；
SEQ ID NO：4的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS；
SEQ ID NO：5的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL；
SEQ ID NO：6的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG。
2.一种小反刍兽疫诊断试剂盒，其包括：
权利要求1所述的多肽组合，其中，
将所述多肽组合用于固定在基底上，与基底共同制成一种小反刍兽疫诊断试剂盒，所述试剂盒用于通过检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的IgG抗体，诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
3.根据权利要求2所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述对象生物小反刍动物。
4.根据权利要求2所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
5.根据权利要求2所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
6.下述多肽组合1在制备小反刍兽疫诊断试剂盒中的用途；
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，
SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，
SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，
SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，
SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，以及SEQ ID NO：6所示的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG的多肽。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述小反刍兽疫诊断试剂盒用于通过检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的IgG抗体，诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述对象生物小反刍动物。
9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
10.根据权利要求7所述的用途，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
小反刍兽疫诊断试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 小反刍兽疫(Pestedespetitsruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病，因其较高的发病率和死亡率，对山羊、绵羊、白尾鹿、野生的瞪羚羊和藏羚羊等动物具有极大的威胁，是世界范围内公认的烈性传染病，我国也将该病列为一类动物传染病。1942年，西非的科特迪瓦首次报道小反刍兽疫后，非洲大部分国家相继报道过本病的发生。近几年来，小反刍兽疫呈进一步蔓延的趋势。2007年我国首次发现本病已通过边境从印度传入我国西藏局部地区，引起局部地区流行，对我国动物卫生安全尤其是小反刍兽的卫生安全构成了严重威胁，因此，灵敏度高、特异性强的小反刍兽疫诊断方法的建立就显得尤为迫切。
[0003] 小反当兽疫病毒(PPRV)属于副粘病毒科(Paramyxoviriade)麻疹病毒属(Morbollivirus)，同属的其他成员有牛瘟病毒(RPV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豹瘟病毒(PDV)、海豚瘟病毒(DDV)、牛麻疹病毒(MVKI)和人麻疹病毒(MV)等。PPRV的基因组结构为单股负链、无节段RNA。
[0006] 世界动物卫生组织推荐采用的小反刍兽疫病毒抗体检测方法主要有病毒中和试验(VNT)和酶联免疫测定(ELISA)。其中，病毒中和试验方法的检测结果准确，是检测小反刍兽疫病毒的金标准，但该方法检测时间长且不适于检测大量样本。与此相对，酶联免疫测定的特异性和敏感性较高、检测时间比病毒中和试验短且适合检测大量样品，因此，被广泛应用于小反刍兽疫病毒抗体的检测。
[0007] 用于小反刍兽疫病毒抗体检测的酶联免疫测定方法主要包括竞争酶联免疫测定(c-ELISA)、阻断酶联免疫测定(b-ELISA)和间接酶联免疫测定(间接ELISA)。c-ELISA和b-ELISA的特异性和敏感性都比较高，是被临床普遍接受的小反刍兽疫病毒抗体检测方法，例如国际上通用的法国BIRAD实验室的小反刍兽疫诊断试剂盒就采用了c-ELISA方法。但是，c-ELISA和b-ELISA均需使用单克隆抗体，这造成检测成本大幅提高；而且，c-ELISA和b-ELISA的操作繁琐、检测时间长(虽然相对于VNT已经有所缩短)、判据复杂。另一方面，传统的间接ELISA使用源自小反刍兽疫病毒的完整蛋白(例如H蛋白、N蛋白、F蛋白等)或重组蛋白作为包被抗原来检测血清中的抗体，其成本低于c-ELISA和b-ELISA；但是，由于该方法使用完整蛋白作为抗原，容易发生抗体的错误识别和非特异性识别，因此，其特异性和敏感性都不及c-ELISA和b-ELISA。
[0008] 因此，需要开发出检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的小反刍兽疫诊断试剂盒。
发明内容
[0009] 鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的小反刍兽疫诊断试剂盒，以及能够用于制备该试剂盒的多肽或多肽组合。
[0010] 基于抗原表位多肽的间接ELISA方法使用抗原表位多肽(20个氨基酸左右的单条多肽通常只包含一个抗原表位)作为包被抗原。发明人发现：该方法的敏感性往往偏低，单条多肽的敏感性一般不会超过50％；而灵敏性高的多肽，假阳性率也高，即特异性低。如果能够通过某种方式同时提高检测的特异性和敏感性，就可以克服传统的间接ELISA的缺点，开发出特异性和敏感性均可媲美c-ELISA和b-ELISA、甚至更高的小反刍兽疫诊断试剂盒。
[0011] 发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现了下述多肽组合1。当以该下述多肽组合1中的至少任意一条对对象生物来源的生物样本有响应作为指标时，可以以92.2％的敏感性和93.5％的特异性诊断小反刍兽疫，完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。
[0012] 因此，本发明包括：
[0013] 1.一种小反刍兽疫诊断试剂盒，其包括基底，以及独立地固定于所述基底上的下述多肽组合1；
[0014] 多肽组合1
[0015] SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，
[0016] SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，
[0017] SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，
[0018] SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，
[0019] SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，以及[0020] SEQ ID NO：6所示的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG的多肽。
[0021] 2.根据项1所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其用于通过检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)，诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
[0023] 4.根据项2或3所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
[0025] 6.下述多肽组合1在制备小反刍兽疫诊断试剂盒中的用途；
[0026] 多肽组合1
[0027] SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，
[0028] SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，
[0029] SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，
[0030] SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，
[0031] SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，以及[0032] SEQ ID NO：6所示的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG的多肽。
[0033] 7.根据项6所述的用途，其中，所述小反刍兽疫诊断试剂盒用于通过检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)，诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
[0034] 8.根据项7所述的用途，其中，所述对象生物小反刍动物。
[0035] 9.根据项7或8所述的用途，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
[0036] 10.根据项7～9中任一项所述的用途，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
[0037] 上述多肽及试剂盒可以用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)。通常，生物样本中的小反刍兽疫病毒抗体(IgG)是由于对象生物被小反刍兽疫病毒感染或被小反刍兽疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
[0038] 发明的具体实施方式
[0039] 首先，本发明提供下述多肽组合1：
[0040] 多肽组合1
[0041] SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多肽，
[0042] SEQ ID NO：2所示的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA的多肽，
[0043] SEQ ID NO：3所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，
[0044] SEQ ID NO：4所示的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS的多肽，
[0045] SEQ ID NO：5所示的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL的多肽，以及[0046] SEQ ID NO：6所示的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG的多肽。
[0047] 与基于抗原表位多肽的间接ELISA方法中，单条多肽的一般不超过50％的敏感性相比，在以该多肽组合1中的至少任意一条对对象生物来源的生物样本有响应作为指标的情况下，可以以92.2％的敏感性和93.5％的特异性诊断小反刍兽疫。
[0048] 本说明书中，敏感性是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。特异性是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阴性样本的比例。对于小反刍兽疫病毒抗体的检测而言，本技术领域的“金标准”是病毒中和试验(VNT)。
[0049] 上述多肽组合可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒。通常，生物样本中的小反刍兽疫病毒抗体(IgG)是由于对象生物被小反刍兽疫病毒感染或被小反刍兽疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽组合及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
[0050] 因此，本发明还提供一种小反刍兽疫诊断试剂盒，其包括基底，以及独立地连接于所述基底上的上述多肽组合1。
[0051] 在本说明书中，基底通常为固体，可以是一个，也可以是多个，但优选为一个，即全部多肽独立地连接于同一基底上。在本发明中，对基底没有特殊限制，只要是固体或不溶性材料载体即可。多肽与基底的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体材料的连接方法来进行。
[0052] 在本说明书中，所述对象生物优选为小反刍动物，更优选为山羊或绵羊。
[0053] 在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。
[0054] 在使用上述试剂盒诊断小反刍兽疫的情况下，当所述多肽组合1中的任意或一条以上多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定该对象生物已被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫(即阳性)；反之，判定该对象生物未被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫(即阴性)。
[0056] 1.多肽的制备与确认
[0057] SEQ ID NO：1～6的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
[0058] SEQ ID NO：1的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE；
[0059] SEQ ID NO：2的序列为N49：SSQNPREAQRSAEALFRLQA；
[0060] SEQ ID NO：3的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL；
[0061] SEQ ID NO：4的序列为F13：VATAAQITAGVALHQSLMNS；
[0062] SEQ ID NO：5的序列为N41：TGDERTVRGTGPRQAQVSFL；
[0063] SEQ ID NO：6的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG。
[0064] 2.试剂盒(多肽芯片)1的制备
[0065] 试剂盒1
[0066] 多肽芯片是将SEQ ID NO：1～6的多肽的溶液分别点样在固体支撑材料——“0+X”膜(iPDMS膜)上制备而成的(同时点样一个山羊IgG作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点)。“0+X”膜是将带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂加入到聚二甲基硅氧烷材料中，随后以热交联(硅氢键键合)的方式固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到的一种材料。其制作过程可参见国际公开专利WO2014/044184。
[0067] 3.用试剂盒进行检测
[0068] 将多肽芯片置于室温20min，肉眼观察芯片表面，将有缺损的多肽芯片淘汰，同时确定多肽芯片的正确方向，夹于凸槽，按照血清的数量进行芯片的编号，然后在合格的多肽芯片内注满TBST(0.4M Tris-HCl，2.74M NaCl，2％Tween20，pH7.2±0.2)，室温放置2-4min，检查有无漏夜，将漏液的多肽芯片弃去。填补空缺的多肽芯片，操作同上。将检验合格的多肽芯片夹于凸槽上，每8个芯片为一组，用TBST润洗2次，喷壶淋洗，一孔进一孔出，形成流动，最后在纱布上轻轻拍打，再一个一个取盖甩干，但要注意保持多肽芯片表面湿润，备用。
[0069] 在超净台内将血清稀释50倍(5μl血清样本+245μl血清稀释液)分别做编号，震荡混匀，使芯片编号与血清编号互相一致，在已经润洗的芯片上上样，200μl/孔，避免产生气泡，加入经稀释后的血清200μl，室温，摇床150rpm，孵育30min。
[0070] 弃液，淋洗4次(方法同上)，甩干，加入二抗(兔抗山羊IgG)，室温，摇床150rpm，孵育30min。
[0071] 弃液，弃盖，淋洗4次，甩干，每8个芯片为一组，加20μl/孔的发光液(Thermo，Prod#37074)，曝光2min。使用GenePix Pro6.0采集数据。
[0072] 对于每一份血清，分别统计该试剂盒中的每一条多肽是否有响应(即，信噪比(SNR)大于等于2)，并进行判定。
[0073] 对于上述试剂盒1，当检测到SEQ ID NO：1～6所示的多肽中的任意一条或一条以上有响应时，判定为小反刍兽疫阳性；反之，判定为阴性。
[0075] 对于755份来自中国各地区的山羊和绵羊血清样本，分别采用上述步骤2中制备的试剂盒(按上述3的步骤)以及病毒中和试验(VNT，按OIE(2010)《小反刍兽疫病毒中和试验》所述方法)进行检测，检测结果如下所示。
[0076] 表1
[0077]
[0078]
[0079] 敏感性＝368/399*100％＝92.2％
[0080] 特异性＝333/356＝93.5％
[0081] 由以上可知，试剂盒1的敏感性和特异性均在90％以上(且是采用VNT方法验证，不是采用对照试剂盒方法验证)，足以媲美采用c-ELISA方法或b-ELISA方法的试剂盒。
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