用禽多杀性巴氏杆菌B26－T1200弱毒菌株制备疫苗的方法
专利汇可以提供用禽多杀性巴氏杆菌B26－T1200弱毒菌株制备疫苗的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株制备 疫苗 的方法，首先要制备生产用 种子 ，再保存、繁殖、培养、检验、计数、配苗、分装、冻干、保存、成品检验、待用。用本 发明 的方法制成的禽巴氏杆菌弱毒疫苗安全性高、 稳定性 好，免疫持续时间长。经测定，该菌的最小免疫剂量为130万活菌，3000万免疫鸡近期保护率达100%。，下面是用禽多杀性巴氏杆菌B26－T1200弱毒菌株制备疫苗的方法专利的具体信息内容。
1.用禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株制备疫苗的方法，其特征是工艺步骤为：
a、马丁肉汤制备：pH值为7.4，供培养和稀释菌液用；
b、菌种：菌种为禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株；
c、生产用种子制备：
(1)一级种子保存：在2-8℃，使用期不超过14日；
(2)二级种子繁殖及检验：取一级种子接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中， 36-37℃培养24小时，作纯粹检验后，置2-8℃保存，使用期不超过4日；
(3)制苗用培养基：马丁肉汤，根据需要量制备马丁肉汤；
(4)制苗用菌液培养：用培养罐或玻璃瓶通气培养，按容积装入培养基、消泡剂， 灭菌后按培养基总量的1-2％接种二级种子液，并按重量或体积百分比为0.1％加入裂解血 球全血；以逐渐增大通气量的方法，37-38℃培养8-12小时，当pH达到8.0-8.4时，停止 培养；
(5)半成品检验：
A.纯粹检验：取培养物进行涂片镜检，如无杂菌，立即配苗；同时用马丁琼脂作 纯粹检验；
B.活菌计数：用含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培 养，按常规活菌计数方法计算活菌数，作为配苗参考；
(6)配苗与分装：将检验合格的若干瓶菌液，混合于同一容器中，加入适量明胶、蔗 糖保护剂，充分混合，定量分装，每头份活菌数/鸡应不少于3000万个；分装过程中，随时 振荡，必要时可采取保温措施；
(7)冻干：分装后立即冷冻真空干燥，按照生产该疫苗的温度曲线进行升温，冻干完 成后，在真空状态下压紧胶塞，封铝盖后，置于2-8℃保存；
(8)贮藏：在2-8℃保存，有效期为1年；
d.成品检验：
(1)物理性状：该产品为淡褐色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解；
(2)纯粹检验：应无杂菌生长；
(3)鉴别检验：在含0.1％裂解血球全血及10％羊血清的改良马丁琼脂平板上，37℃ 培养16-22小时，肉眼观察，菌落表面光滑，有淡淡的蓝色，在低倍显微镜下，45度折光 观察，菌落结构细致，边缘整齐，呈蓝色，边缘有虹光；
(4)活菌计数：取疫苗3瓶，按瓶签注明的羽份，用含0.1％裂解血球全血及4％健康 动物血清的改良马丁琼脂平板培养，按常规活菌计数方法计算活菌数，每头份活菌/鸡应不 少于3000万个，鸭应不少于9000万个，鹅应不少于1亿个；
(5)安全检验：取疫苗1瓶，按瓶注明的羽份，以20％铝胶生理盐水稀释为1mL100 羽份；用2-10月龄的健康易感鸡4只，各肌肉注射1mL，观察15日，应全部健活；
(6)效力检验：取疫苗1瓶，按瓶签注明的羽份，以20％铝胶生理盐水稀释为1mL含1 羽份；用2-10月龄的健康易感鸡4只，各肌肉注射1mL；14日后，连同条件相同的对照鸡 2只，各肌肉注射致死量的C48-1强毒菌液，观察15日，对照鸡全部死亡，免疫鸡至少保 护3只为合格；
(7)剩余水份测定：用真空烘干法检测，应符合规定；
(8)真空度测定：用高频火花真空测定器进行密封后容器内的真空度测定；如果容器内 出现白色、粉色和紫色辉光，则真空度均属合格。
技术领域
本发明属用禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株制备疫苗的方法领域。
背景技术
国外对禽巴氏杆菌弱毒疫(菌)苗的研究始于1881年，自Pasteur首次研制成功用于 预防禽霍乱的弱毒疫苗以来，各种免疫力不同的禽巴氏杆菌弱毒菌株不断涌现。1918年 Mannigen用培养基中加入化学诱变剂的方法选育出一株无毒的突变株，免疫后两天开始有 免疫力，免疫期为6-8周；1950年Barker通过含结晶紫的血清琼脂培养基连续培养，获 得一株无毒的变种；Carter(1950，1951)通过鸡胚继代致弱了的禽巴氏杆菌菌株，获得一 突变株；但效果都不够好。Rice(1979)用Cu株制成弱毒疫苗，通过饮水、点眼、皮内注射 等多种途径进行免疫，免疫期8-10周左右，Cu株具有抵抗巴氏杆菌异源株攻击的特点。
在20世纪六十至八十年代，对禽巴氏杆菌病的预防多采用禽霍乱氢氧化铝胶(灭活) 苗，但该苗免疫期短，运输保存不方便。我国对禽霍乱弱毒疫苗的研究已达十几株之多， 如G190-E40株(黑龙江兽药一厂)，华农系(华南农学院)，1010株(江苏家禽研究所)，731株(中 国农科院哈尔滨兽医研究所)，C762株(广西兽药厂)，CNCOI株(广西农学院)，N系(江西 生物制药厂)，G190-3(广东生物制药厂)，PTR株，PC株(中国农科院兰州兽医研究所)等， 以上菌株的致弱方法多样，通过豚鼠、小白鼠或其它动物传代(如G190-E40，G190-3，C762)， 或通过低温或高温选育(如731，PTR，华农系等)，或加化学诱变剂(如N系，PC株)，或经 Co60-r射线处理(如CNCOZ)等。上述弱毒菌株均有一定的免疫效果，但普遍存在一些问题， 例如菌苗的安全性差，免疫期短，菌株遗传性能差，不稳定；还有些菌苗副作用大，对禽 产蛋率有一定影响。
尽管当前国内外对禽巴氏杆菌弱毒疫苗研究比较多，但由于禽巴氏杆菌弱毒疫苗生产 工艺路线、工艺参数难掌握，使疫苗的生产成本普遍较高、产品质量不稳定、合格率低、 免疫原性差、疫苗保存期短、疫苗产生免疫的时间慢等，满足不了家禽业健康发展的需要。
发明内容
本发明以如下技术方案解决上述技术问题：
用禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株制备疫苗的方法，其特征是工艺步骤为：
a、马丁肉汤制备：pH值为7.4，供培养和稀释菌液用；
b、菌种：菌种为禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株；
c、生产用种子制备：
(1)一级种子保存：在2-8℃，使用期不超过14日；
(2)二级种子繁殖及检验：取一级种子接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中， 36-37℃培养24小时，作纯粹检验后，置2-8℃保存，使用期不超过4日；
(3)制苗用培养基：马丁肉汤，根据需要量制备马丁肉汤；
(4)制苗用菌液培养：用培养罐或玻璃瓶通气培养，按容积装入培养基、消泡剂， 灭菌后按培养基总量的1-2％接种二级种子液，并按重量或体积百分比为0.1％加入裂解 血球全血；以逐渐增大通气量的方法，37-38℃培养8-12小时，当pH达到8.0-8.4时， 停止培养；
(5)半成品检验：
A.纯粹检验：取培养物进行涂片镜检，如无杂菌，立即配苗；同时用马丁琼脂作 纯粹检验；
B.活菌计数：用含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板 培养，按常规活菌计数方法计算活菌数，作为配苗参考；
(6)配苗与分装：将检验合格的若干瓶菌液，混合于同一容器中，加入适量明胶、 蔗糖保护剂，充分混合，定量分装，每头份活菌数(鸡)应不少于3000万个；分装过程中， 随时振荡，必要时可采取保温措施；
(7)冻干：分装后立即冷冻真空干燥，按照生产该疫苗的温度曲线进行升温，冻干 完成后，在真空状态下压紧胶塞，封铝盖后，置于2-8℃保存；
(8)贮藏：在2-8℃保存，有效期为1年；
d.成品检验：
(1)物理性状：该产品为淡褐色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶 解；
(2)纯粹检验：应无杂菌生长；
(3)鉴别检验：在含0.1％裂解血球全血及10％羊血清的改良马丁琼脂平板上，37℃ 培养16-22小时，肉眼观察，菌落表面光滑，有淡淡的蓝色，在低倍显微镜下，45度折光 观察，菌落结构细致，边缘整齐，呈蓝色，边缘有虹光；
(4)活菌计数：取疫苗3瓶，按瓶签注明的羽份，用含0.1％裂解血球全血及4％健康 动物血清的改良马丁琼脂平板培养，按常规活菌计数方法计算活菌数，每头份活菌/鸡应不 少于3000万个；鸭应不少于9000万个；鹅应不少于1亿个；
(5)安全检验：取疫苗1瓶，按瓶注明的羽份，以20％铝胶生理盐水稀释为1mL 100 羽份。用2-10月龄的健康易感鸡4只，各肌肉注射1mL，观察15日，应全部健活；
(6)效力检验：取疫苗1瓶，按瓶签注明的羽份，以20％铝胶生理盐水稀释为1mL含 1羽份；用2-10月龄的健康易感鸡4只，各肌肉注射1mL；14日后，连同条件相同的对 照鸡2只，各肌肉注射致死量的C48-1强毒菌液，观察15日，对照鸡全部死亡，免疫鸡至 少保护3只为合格；
(7)剩余水份测定：用真空烘干法检测，应符合规定；
(8)真空度测定：用高频火花真空测定器进行密封后容器内的真空度测定；如果容器 内出现白色、粉色和紫色辉光，则真空度均属合格。
本发明研制成功的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株的疫苗安全性高、稳定性好，免 疫持续时间长。经测定，该菌的最小免疫剂量为130万活菌，但41万活菌免疫鸡就有部分 鸡已得到保护，3000万免疫鸡近期保护率达100％。实验室测定6批禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200 弱毒苗免疫期，6批苗免疫4个月平均保护率为79.2％，5个月平均保护率为75％。田间试 验5批苗免疫鸡140天平均保护率达80％。该弱毒苗于2000年已被国家农业部批准为正式 规程苗，可在全国范围内生产及推广使用。
B26-T1200株与国内广泛使用G190-E40株，“731”株及美国广泛应用的Cu株弱毒苗比较结 果如下：
B26-T1200株、G100-E40株、“731”株、Cu株性能比较
疫苗名 称 性能比较 近期 保护率 远期保护率 对鸡产蛋率 影响 二个免 疫剂量局 部注射不 良反应cm2 稳定性、安全 性(田间试 验) 4.5个月 5.5个月 免疫 10天 减少 免疫 11-20 天减少
G190-E40 株 70％ (7/10) 50％ (5/10) 60％ (6/10) 59.1％ 43.3％ 14.1 Cu株 90％ (9/10) 0％ (0/8) 43％ (3/7) 28.4％ 10％ 6.9 4.2％免疫火 鸡死亡 “731” 株 90％ (9/10) 30％ (3/10) 70％ (7/10) 23.7％ 26.3％ 8.5 7.4％的免疫 鸡死亡 B26-T1200 株 100％ (10/10) 60％ (6/10) 60％ (6/10) 28.1％ 11％ 5.7 精神稍差， 食料减少仅 为3.38％.
在应用范围上已从鸡的单一使用进一步推广到水禽。
本发明人选育的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株已于2005年4月27日保藏在中国武 汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号CCTCC No M205042]。
具体实施方式
本发明以如下方式获得禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒冻干疫苗：
采用常规的倾注平板培养法进行活菌计数。将禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株置入常 规的培养物，按常规的比例加入保护剂，经过真空冻干制成禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒 冻干苗。
本发明人采用禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株作为菌种，经大瓶通气培养、真空冻 干生产冻干苗，该冻干苗通过血斜连传30代和敏感鸡体连传5代，其毒力无返祖(强)现 象；且产生免疫力迅速，菌株免疫鸡后，4-5天产生坚强免疫力，80-100％的免疫鸡能抵 抗强毒攻击；免疫期长，可达4-5个月，免疫鸡4个月总保护率79.2％，5个月总保护率达 75％。
以下是用禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株生产疫苗的工艺步骤：
1、马丁肉汤制备：pH值为7.4，供培养和稀释菌液用。
2、菌种：菌种为禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株，该菌株由申请人鉴定、保管和 供应。效检用C48-1强毒株，由中国兽药监察所提供。
3、生产用种子制备：
(1)一级种子保存：在2-8℃，使用期不超过14日。
(2)二级种子繁殖及检验：取一级种子接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中， 36-37℃培养24小时，作纯粹检验后，置2-8℃保存，使用期不超过4日。
(3)制苗用培养基：马丁肉汤，根据需要量制备马丁肉汤。
(4)制苗用菌液培养：用培养罐或玻璃瓶通气培养，按容积装入适量培养基(70％ 左右)、消泡剂，灭菌后按培养基总量的1-2％接种二级种子液，并按0.1％(重量百分比 或体积百分比均可，以下同)加入裂解血球全血。以逐渐增大通气量的方法，37-38℃培 养8-12小时，当pH达到8.0-8.4时，停止培养。
(5)半成品检验：
A.纯粹检验：取培养物进行涂片镜检，如无杂菌，立即配苗。同时用马丁琼脂作纯 粹检验，应纯粹。
B.活菌计数：用含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养， 按常规活菌计数方法计算活菌数，作为配苗参考。
(6)配苗与分装：将检验合格的若干瓶菌液，混合于同一容器中，加入适量明胶、 蔗糖保护剂，充分混合，定量分装，每头份活菌数(鸡)应不少于3000万个。分装过程中， 随时振荡，必要时可采取保温措施。
(7)冻干：分装后立即冷冻真空干燥，按照生产该疫苗的温度曲线进行升温，冻干 完成后，在真空状态下压紧胶塞，封铝盖后，置于2-8℃保存。
(8)贮藏：在2-8℃保存，有效期为1年。
4成品检验：
(1)物理性状：该产品为淡褐色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶 解。
(2)纯粹检验：应无杂菌生长。
(3)鉴别检验：在含0.1％裂解血球全血及10％羊血清的改良马丁琼脂平板上，37℃ 培养16-22小时，肉眼观察，菌落表面光滑，有淡淡的蓝色，在低倍显微镜下，45度折光 观察，菌落结构细致，边缘整齐，呈蓝色，边缘有虹光。
(4)活菌计数：取疫苗3瓶，按瓶签注明的羽份，用含0.1％裂解血球全血及4％健康 动物血清的改良马丁琼脂平板培养，按常规活菌计数方法计算活菌数，每头份活菌(鸡) 应不少于3000万个。
(5)安全检验：取疫苗1瓶，按瓶注明的羽份，以20％铝胶生理盐水稀释为1mL 100 羽份。用2-10月龄的健康易感鸡4只，各肌肉注射1mL，观察15日，应全部健活。
(6)效力检验：取疫苗1瓶，按瓶签注明的羽份，以20％铝胶生理盐水稀释为1mL含 1羽份。用2-10月龄的健康易感鸡4只，各肌肉注射1mL。14日后，连同条件相同的对 照鸡2只，各肌肉注射致死量的C48-1强毒菌液，观察15日，对照鸡全部死亡，免疫鸡至 少保护3只为合格。
(7)剩余水份测定：用真空烘干法检测，应符合规定。
(8)真空度测定：用高频火花真空测定器进行密封后容器内的真空度测定。如果容器 内出现白色、粉色和紫色辉光，则真空度均属合格。
5.作用与用途：用于预防2个月以上的鸡、鸭、鹅巴氏杆菌病。免疫期为120天。
6.用法与用量：疫苗用20％铝胶生理盐水稀释为0.5mL/羽份，各肌肉注射0.5mL， 鸡免疫注射含活菌3000万个/羽，鸭免疫注射含活菌9000万个/羽，鹅免疫注射含活菌1 亿个/羽。
在配制疫苗过程中，攻毒剂量要适当，可通过试验鸡的测毒来确定剂量。
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