本发明涉及出现在血液和尿中的新的肾病蛋白生物标志在检测、监测和评价人或哺乳动物肾病或肾损伤的严重性以及释放该蛋白的其它器官、组织或细胞类型的疾病或损失的严重性的诊断用途。所述蛋白生物标志是嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(NGAL)——也称为嗜中性粒细胞脂质运载蛋白(neutrophil lipocalin)(NL；在人嗜中性粒细胞脂质运载蛋白的情况下为HNL)、在包括人的多种哺乳动物中的脂质运载蛋白2(LCN2)或siderocalin(一种铁运载蛋白)、大鼠中的25-kDa的α2-微球蛋白相关的蛋白或neu-相关的脂质运载蛋白(NRL)或小鼠中的24P3、24-kDa分泌型可诱导蛋白(SIP24)或uterocalin。人NGAL是首先分离于嗜中性粒细胞多形核白细胞颗粒的糖蛋白，在本文后面将嗜中性粒细胞多形核白细胞称为嗜中性粒细胞(Allen等人，1989；Venge等人，1990，Triebel等人，1992；Kjeldsen等人，1993)。成熟的蛋白质由178个氨基酸残基的单条蛋白链组成并且在糖基化状态时，其分子量被可变地估计为24或25kDa。该蛋白质含有链内二硫键，并且其人源化形式含有额外的半胱氨酰残基，该半胱氨酰残基被认为参与与其自身或与嗜中性粒细胞凝胶酶形成复合体。该额外的半胱氨酰残基不存在于非人种的NGAL，目前其非人种的cDNA序列是可以得到的(黑猩猩、猕猴、狗、猪、马、大鼠和小鼠)。分离自嗜中性粒细胞的NGAL通常含有大比例的同源二聚体并且有时含有更高分子量的已假定为同源三聚体的材料。另外还检测到了分子量从大约150kDa到200kDa以上变化的痕量的更高级的NGAL同源寡聚物。体外分离或分泌自人嗜中性粒细胞的NGAL含有高比例的同源二聚体的事实使得其分子量被报告为40或45kDa(Venge等人，1990；Xu等人，1994)。
少量或可变比例的体外分离自或分泌自人嗜中性粒细胞的总NGAL与92-kDa人嗜中性粒细胞明胶酶(也称为明胶酶B)、IV型胶原酶或基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 9)(MMP-9)缔合，其作为NGAL单体时形成表观KDa115的复合体(Monier等人，2000；Yan等人，2001)或作为NGAL二聚体时，形成表观kDa 125的复合体(Yan等人，2001)。也在患有各种癌症包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌或乳腺癌的患者尿液中鉴定出了这些复合体。
NGAL同源二聚体、同源三聚体、更高级的同源寡聚体和NGAL/MMP-9复合体可以通过还原作用解离为它们的组分单体，这说明这些复合体至少部分地通过二硫桥共价连接。然而，人NGAL中单个半胱氨酰残基(其不参与链内二硫桥)的存在不能解释二硫键连接的三聚体或更高级寡聚体的形成，不论这些三聚体或寡聚体由单独的NGAL组成或是由与MMP-9复合的NGAL组成。这些假定的同源三聚体、更高级的寡聚体或MMP-9和NGAL同源二体之间的复合体得以保持在一起的机制有待阐明。在含有钙和锌离子的缓冲液存在下通过共温育重组人NGAL单体和重组人MMP-9可以在体外可产生NGAL/MMP-9复合体(Yan等人，2001)。据报道，这些复合体具有115kDa的分子量并且能够短暂存在，然而，在患有癌症的患者中的尿液中发现的最常见复合体形式是125-kDa的形式。
Allen等人(1989)也观察到在钙离子存在下，来自人嗜中性粒细胞的NGAL的表观分子量从24kDa增加到50-70kDa，这表明二聚体或三聚体的形成，根据本发明人的观点，这些二聚体和三聚体可能是非共价连接的，至少最初是这样的。
因此，显而易见的是，人NGAL以多种分子形式出现在嗜中性粒细胞中，包括单体、同源二聚体(是主要的组分)、同源三聚体、更高级的同源寡聚体、与MMP-9复合的单体以及与MMP-9复合的同源二聚体。另外，观察到更高表观分子量200kDa级的NGAL/MMP-9复合体。这些复合体可能含有MMP-9同源二聚体和未确定数目的NGAL分子。这些分子形式的各个亚基至少部分通过链间二硫桥保持在一起，尽管在不同复合体中没有确切地发现参与这些二硫桥形成的半胱氨酰残基。也可能为非共价力参与了复合体的形成。
对非人哺乳动物如大鼠和小鼠中的多分子形式的NGAL了解地很少。然而，Bu等人(2006)已经证实对血管造形术损伤或白细胞介素1β的刺激反应的大鼠血管平滑肌细胞同时合成NGAL和MMP-9。Western印迹表明大鼠NGAL以单体、二聚体或三聚体以及150-kDa的形式存在。MMP-9以单体和二聚体的形式存在。尽管在裂解的大鼠内膜平滑肌细胞中没有发现大鼠NGAL和MMP-9的复合体，却在这些细胞条件化的培养基中观察到了大约115和125kDa的NGAL/MMP-9复合体，这表明在胞外而不是在胞内形成NGAL/MMP-9复合体。大鼠NGAL的蛋白链只含有两个半胱氨酰残基，这两个半胱氨酰残基被认为形成了链内二硫桥。然而，蛋白链中没有可利用的额外的半胱氨酰残基似乎没有影响大鼠中多分子形式的NGAL的形成，在非还原和还原状态的Western印迹中多分子形式的NGAL表现为似乎它们依赖于链间二硫键的存在。在大鼠中发现的多分子形式的亚基是如何连接的还不清楚。一种可能是发生二硫键的交换来破坏链内二硫键，这样可以形成链间二硫键。
Zhao等人(2006)也证实了在野生型小鼠和容易患主动脉扩张的RECS-1敲除小鼠血浆中存在NGAL/MMP-9复合体。和大鼠NGAL相似，小鼠NGAL蛋白链只含有两个半胱氨酰残基。
由此，尽管在到目前为止分析的非人哺乳动物的NGAL蛋白链中不存在第三个半胱氨酰残基，但是来自大鼠和小鼠的证据表明在非人哺乳动物中的NGAL以相当于在人中观察到的多分子形式存在。
作为诊断生物标志，人NGAL最初根据其名称HNL将其公开为嗜中性细胞活化的特异标志(美国专利6,136,526；PCT申请WO95/29404)，当侵入微生物尤其是化脓细菌时，其释放到血液中导致嗜中性粒细胞的脱粒和颗粒蛋白的胞吐。因此，人们提出人血浆或血清样品中升高水平的的NGAL的测量值指示了个体正在遭受炎性过程，尤其是细菌感染导致的炎性过程。这个文件公开了从嗜中性粒细胞体外释放的非还原材料的免疫印迹含有三条表观分子量为＞200kDa、45kDa和24kDa的HNL免疫反应带。释放的材料还原后只看到一条表观分子量24kDa的条带。在进行HNL测定的体液样品中没有关于同时存在不同分子形式的蛋白质的公开内容，也没有公开关于使用可能对所公开的分子形式之一具有选择性或特异性的定量方法。
在小鼠中，NGAL(名称为SIP24或24P3)被鉴定为1型急性期蛋白。在急性期反应期间，其主要在肝中表达(Liu和Nilsen-Hamilton，1995)。该文件没有公开存在多分子形式的蛋白质。在另一物种中这与美国专利6,136,526中所述的主张即NGAL是一种对嗜中性粒细胞完全特异的蛋白质相矛盾。
美国专利申请2004/0219603公开了NGAL用作尿生物标志用于检测早期肾小管细胞损伤的用途。美国专利申请2005/0272101公开了NGAL在血清中的同样目的的用途。然而，没有公开内容描述如何将肾小管细胞损伤与全身炎症或细菌感染或由于NGAL水平升高导致的癌症区分。没有文件公开多分子形式的NGAL的存在，也没有文件公开使用特定分子形式的NGAL的任何选择性的或特异性测定。
本发明人以前已经提交了PCT申请WO2006/066587，其公开在尿中或血浆中或血清中NGAL水平如何通过一个截止水平能够被分为不能诊断导致ARF的肾损伤的低水平和能够诊断的高水平。WO2006/066587，通过引用其全部内容被并入本申请中，其考虑了体液中的NGAL水平在炎症、感染和某些癌症中也会升高但是通常升高到低于导致ARF的肾损伤相关水平的值这一事实。
本发明人也提交了也提交了US临时专利申请(No.60/919,277)，该申请公开了区分由肾损伤导致的体液NGAL的升高和由非肾损伤导致的体液NGAL的升高而不借助于使用给定体液中的NGAL浓度的截止值的方法。该方法包括测定尿样中NGAL浓度比血浆或血清中同时存在的NGAL浓度的比值。超过近似一的比值表明取样个体患有导致ARF的肾损伤或预示个体发展ARF的直接危险。
本发明人的上述公开内容都不依赖于检测或测定特定分子形式的NGAL，正像上述其它作者关于NGAL测定的诊断用途的公开内容没有公开测定不与MMP-9复合的特定个体分子形式的NGAL。
定义
本公开内容使用了以下术语，由于在现有技术中这些术语使用时具有各种专门的或限制性的含义，因此需要以在本文使用它们的意义上来定义它们。
肾失调：影响肾功能的任何异常或病理性状况，不论该状况是在肾内或肾外引起。
肾病：被认为构成分类疾病实体的任何肾失调。
肾损伤：对肾脏的任何损伤，不论其起源是物理性(例如创伤)、化学的(肾中毒)或病理性(疾病相关)的，特别是影响足量的肾细胞以至于产生可检测的肾功能损伤的任何损伤。
急性肾损伤：快速通常在几个小时内产生的肾损伤。
急性肾衰竭(ARF)：快速产生的、不同程度(即未必是完全的)的肾主要排泄和稳态功能的损害或丧失，通常表现为除了代谢改变导致的波动外的血清肌苷的升高和/或排尿速度的降低。

通过分析来自显示肾失调(包括急性肾损伤)的临床和生化证据的患者体液样本以及没有显示肾失调(包括急性肾损伤)的临床和生化证据的对照个体体液样本，我们惊奇地发现由患病肾脏释放到血液和尿中的NGAL主要为游离的单体形式。该发现与我们在正常个体的血清中发现的更低水平的免疫反应性NGAL相反，血清中的更低水平的免疫反应性NGAL被认为主要来自非肾源如循环嗜中性粒细胞，并且可能来自某些上皮细胞，并且由包括NGAL/MMP-9复合体、NGAL同源三聚体、NGAL同源二聚体和NGAL单体在内的更高级的NGAL复合体组成。它也与在其它病理性状况如某些腺癌的体液中发现的NGAL相反，这些NGAL特征为除了NGAL单体外还存在NGAL/MMP-9复合体和NGAL寡聚体。
该发现有可能提高血浆或血清或尿中NGAL测定对诊断包括肾损伤的肾失调的特异性，血浆或者是测量前分离自防凝全血，或者作为测量程序的一部分从防凝全血过滤。显而易见的是，测定个体分子形式的NGAL的同样原理可以适用于诊断释放与肾脏不同模式的这些分子形式的其它器官、组织和细胞类型的失调或损伤。
因此，本发明涉及通过测定哺乳动物体液样品中个体分子形式的嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(NGAL)的浓度来诊断、监测或评价哺乳动物器官、组织或细胞类型的疾病或损伤的严重性。在具体的实施方案中，哺乳动物是人个体。在一个具体的实施方案中，个体分子形式的NGAL是游离的NGAL单体。
可以通过特异性结合到给予所述方法的哺乳动物种类的游离NGAL单体但不结合到复合形式的NGAL的分子来测定游离NGAL单体。一旦通过快速且适于自动化的物理或化学方法从复合形式分离出游离NGAL单体，那么也可以通过既结合游离NGAL单体又结合复合形式的NGAL的NGAL结合分子或这些分子的组合来测定游离NGAL单体，这些要求不包括凝胶电泳。也可以从样品中总NGAL和复合的NGAL之间的差来间接测定游离NGAL单体，总NGAL通过既结合游离NGAL单体又结合复合形式的NGAL的NGAL结合分子或这样的分子的组合测定，而复合的NGAL通过不能同时结合游离NGAL单体的NGAL结合分子的组合来测定。
在另一个实施方案中，个体分子形式的NGAL是NGAL同源二聚体。
在另一个实施方案中，测定了NGAL同源二聚体和更高级的寡聚体的组合但不包括游离NGAL单体。NGAL分子形式的这种组合可以通过不能同时结合游离NGAL单体的结合分子的组合来测定。
本发明的进一步方面是使用个体分子形式的NGAL作为哺乳动物中疾病或细胞或组织损伤的诊断标志分子的用途，其中所述分子形式的NGAL是已通过其来源细胞以特定的方式糖基化的NGAL，所述特定的方式区别于已通过不同的来源细胞以另一种方式糖基化的NGAL。
本发明的一个方面包括使用对游离的NGAL单体形式特异的或选择性的测定体液中NGAL的方法。这些方法会比测定在正常个体或由于非肾损伤或失调的其它原因导致NGAL水平升高的患者中的NGAL的非选择性方法记录更低的NGAL水平。同时，由于肾损伤或失调导致的NGAL单体的增加也会通过单体特异性测定方法被完全读出。因此，对于检测肾损伤或失调，单体特异性的NGAL测定方法的使用会比那些很少显示或不显示对NGAL不同分子形式具有选择性的测定NGAL的方法更具有选择性。
相反地，专门测定同源二聚体的方法或专门测定NGAL同源二聚体和更高级的NGAL寡聚体的方法可以用于诊断特征在于由合成这些分子形式的NGAL的非肾组织分泌的NGAL水平升高的病症。
因此，本发明的另一个方面涉及通过测定体液样品中的两种或以上个体分子形式的NGAL的浓度来诊断、监测或评价哺乳动物的疾病或对器官、组织或细胞类型的损伤的严重性，所述疾病或损伤的特征在于存在于所述哺乳动物体液中的个体分子形式的NGAL的特定谱。
NGAL/MMP-9复合体的测定是现有技术公知的，不构成本发明的组成部分，除非所述测定是为了将所述结果与根据本发明获得的结果进行比较。NGAL/MMP-9复合体的测定被描述在例如R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA的目录号为DM9L20的Quantikine Human MMP-9/NGAL复合体免疫测定试剂盒中的产品说明书中。
已经设计特异性的配体结合方法，其分别特异性地测定游离NGAL单体或同源二聚体和更高级的NGAL寡聚体。
附图说明
图1
在柱Superdex 200(GE Healthcare)上对急性肾小管坏死患者的血浆进行分子大小排阻层析。图线在280nm显示对应于巨球蛋白(在大约54mL时出现的峰)、免疫球蛋白(在约69mL时出现的峰)和白蛋白(在约79mL时出现的峰)(从左到右)的UV(紫外)吸收峰。块状条显示了用ELISA分析的收集的组分的NGAL免疫反应性，ELISA检测单体和寡聚形式的NGAL。观察到具有NGAL免疫反应性的四个区域：在约60-65mL出现的小峰，其由较高级的复合形式的NGAL引起(1.0％的总NGAL免疫反应性归属于个体分子形式)；在约74-79mL出现的痕量，其归属于NGAL同源三聚体(占总可分配的NGAL免疫反应性的0.8％)；在约79-87mL时出现的较大的峰，归属于NGAL同源二聚体(22.3％的总可分配的NGAL免疫反应性)；和在约88-101mL时出现的大峰，归属于游离NGAL单体(75.9％的可分配的总NGAL免疫反应性)。
图2
如图1所述对另一个患有急性肾小管坏死的患者的尿进行分子大小排阻层析。观察到两个NGAL免疫反应性峰：在约78-86mL时出现的小峰，其归属于NGAL同源二聚体(3.0％的可分配的总NGAL免疫反应性)和在约87-99mL时出现的大峰，其归属于游离NGAL单体(97.0％的总可分配的NGAL免疫反应性)。
图3
如图1所述对正常人血清进行的分子大小排阻层析。观察到四个NGAL免疫反应性峰：在约56-65mL时出现的小峰，其归属于较高级的NGAL复合形式(24.1％的总可分配的NGAL免疫反应性)；在约70-78mL时出现的峰，其归属于NGAL同源三聚体(24.5％的总可分配的NGAL免疫反应性)；在约78-86mL时出现的峰，其归属于NGAL同源二聚体(33.1％的总可分配的NGAL免疫反应性)；和在约88-100mL时出现的峰，其归属于游离NGAL单体(18.3％的总可分配的NGAL免疫反应性)。
图4
NGAL单体(十字)、NGAL同源二聚体(菱形)和“总”NGAL(三角形)的血浆水平的接受者操作特性曲线(ROC)，“总”NGAL包括单体和同源二聚体形式以及可能的来自更高级的寡聚体形式的贡献。峰血浆水平从以特护接纳的38名患者中获得，其中19名被诊断为患有急性肾损伤。NGAL同源二聚体的血浆水平被认为不适于用于诊断急性肾损伤。

在一系列的接受特护的垂危患者中，我们已经观察到，由肾失调或损伤导致的NGAL体液浓度的升高而产生的血浆和尿中的NGAL的分子形式的谱不同于通常在健康个体或没有肾失调或损伤的患者中观察的谱。
在健康的个体中，血浆或血清中的NGAL免疫反应性以对应于游离NGAL单体(10-50％)、通常较大量的NGAL同源二聚体(25-60％)和较小量的NGAL同源三聚体(5-35％)以及包括NGAL/MMP-9复合体的更高级复合形式的NGA(5-35％)的分子形式(括号中为估计的浓度范围)发生。在健康个体的尿液中，总NGAL免疫反应性的基线水平很低，并且目前分析上述的分子形式的相对含量是不可行的。
在由于非肾疾病导致的NGAL水平适度升高的患者中，血浆中NGAL分子形式的谱与在正常基线状态中观察的基本形似。在这些患者中，尿中NGAL分子形式的谱如下：单体形式占优势，但是仍然有适度量的NGAL同源二聚体存在。尿中NGAL/MMP-9复合体的存在没有规律。
在由于急性肾损伤导致的NGAL水平的升高的患者中，血浆中NGAL分子形式的谱与在正常状态或在非肾病中看到的很不同。在血浆中的主要分子形式是游离NGAL单体(70-80％)、相对少量的NGAL同源二聚体(20-30％)、痕量的NGAL同源三聚体(0-2％)，以及存在微量的和不规则的包括NGAL/MMP-9复合体的更高级的分子大小形式(0-2％)。
这些观察数据表明，肾应答肾损伤而分泌的NGAL的主要分子形式是NGAL的游离单体形式。仅仅分泌相对少量的同源二聚体，包括NGAL/MMP-9复合体的更高级分子形式的NGAL的分泌是微量的并且无规律地发生。
到目前为止，人们已经提议将NGAL作为包括急性肾损伤在内的肾失调的标志分子，但没有规定所涉及的NGAL的具体分子形式。我们现在提出肾损伤的分子标志是NGAL单体，因为也释放NGAL到周围环境的嗜中性粒细胞和其它细胞类型通常也释放大量的NGAL同源二聚体以及不同量的包括NGAL/MMP-9复合体的更高级的NGAL寡聚体。
因此，我们提出，如果游离NGAL单体的浓度通过对该分子形式特异的方法测定而不是通过已有的方法测定不同分子形式的NGAL的混合物，能够以更大的诊断特异性诊断肾损伤，并不知晓所述已有的方法对这些分子形式的任何形式具有选择性。鉴于急性肾损伤的快速进展，关于所述方法的诊断适用性，期望的是所述测量方法应该快速，使得能够在短时间内得到结果，诸如在4个小时或更短的时间。这就排除了通过凝胶电泳分离分子形式的NGAL，在现有技术中凝胶电泳用于追溯分析NGAL的分子形式。
因此，本发明包括诊断或监测已导致ARF或预示哺乳动物发展ARF的直接危险的肾损伤、肾病或肾失调的方法，所述方法包括以下步骤：
i)测定哺乳动物体液样品中游离NGAL单体的浓度，和
ii)比较所述浓度值与截止值，所述截止值通过不显示肾损伤、肾病或肾失调证据的哺乳动物种的其它个体中的游离NGAL单体浓度范围确定，这样大于截止值的值表示存在所述肾损伤、肾病或肾失调。
在优选实施方案中，上述公开的方法的步骤i)不包括使用凝胶电泳。
在所述方法的特定实施方案中，血浆样品或血清样品的截止值可以是60ng/mL与600ng/mL之间的值，如65ng/mL或以上、如70ng/mL或以上、如80ng/mL或以上、如90ng/mL或以上、如100ng/mL或以上、如120ng/mL或以上、如150ng/mL或以上、如200ng/mL或以上、如250ng/mL或以上、如300ng/mL或以上、如350ng/mL或以上、如400ng/mL或以上、如450ng/mL或以上、如500ng/mL或以上、如550ng/mL或以上；并且尿样中的截止值可以为10ng/mL与600ng/mL之间的值，如15ng/mL或以上、如20ng/mL或以上、如30ng/mL或以上、如40ng/mL或以上、如50ng/mL或以上、如60ng/mL或以上、如70ng/mL或以上、如80ng/mL或以上、如90ng/mL或以上、如100ng/mL或以上、如120ng/mL或以上、如150ng/mL或以上、如200ng/mL或以上、如250ng/mL或以上、如300ng/mL或以上、如350ng/mL或以上、如400ng/mL或以上、如450ng/mL或以上、如500ng/mL或以上和如550ng/mL或以上。
另外，本发明涉及诊断、监测或测定哺乳动物发展急性肾衰竭危险的方法，其中所述方法分辨没有急性肾衰竭且不处于发展急性肾衰竭直接危险的个体与可能患有急性肾衰竭或处于发展急性肾衰竭的个体，所述方法包括步骤：
i)测定哺乳动物体液样本中游离NGAL单体的浓度，和
ii)将所述浓度与选择的预定截止值比较，这样低于所述截止值的游离NGAL单体浓度将哺乳动物归类为不患有急性肾衰竭并不处于发展急性肾衰竭的直接危险的哺乳动物。
在优选的实施方案中，上述公开的方法的步骤i)不包括使用凝胶电泳。在该方法的优选的实施方案中，血浆或血清样品的截止值可以为600ng/mL和60ng/mL之间的值，如550ng/mL或以下、如500ng/mL或以下、如450ng/mL或以下、如400ng/mL或以下、如350ng/mL或以下、如300ng/mL或以下、如250ng/mL或以下、如200ng/mL或以下、如150ng/mL或以下、如120ng/mL或以下、如100ng/mL或以下、如90ng/mL或以下、如80ng/mL或以下、如70ng/mL或以下、如65ng/mL或以下；并且尿样的截止值可以为600ng/mL和10ng/mL之间的值，如550ng/mL或以下、如500ng/mL或以下、如450ng/mL或以下、如400ng/mL或以下、如350ng/mL或以下、如300ng/mL或以下、如250ng/mL或以下、如200ng/mL或以下、如150ng/mL或以下、如120ng/mL或以下、如100ng/mL或以下、如90ng/mL或以下、如80ng/mL或以下、如70ng/mL或以下、如60ng/mL或以下、如50ng/mL或以下、如40ng/mL或以下、如30ng/mL或以下、如20ng/mL或以下和如15ng/mL或以下。
在本发明的具体实施方案中，上述监测方法包括重复步骤i)和步骤ii)一次或多次的进一步的步骤，特别是在垂危病期间、在已知引起肾损伤危险的医学程序或外科程序之后、或在急性肾衰竭的治疗已经开始或完成之后。
在一个具体的实施方案中，所述步骤i)和ii)可以在24小时内，如12小时内、如12小时内、如6小时内、如3小时内、如1小时内、如30分钟内或如15分钟内重复。
所述方法的实施要求对游离NGAL单体特异的测定方法。在本发明的优选实施方案中，所述测定方法是使用不论如何产生的特异性单克隆抗体或其它特异性结合分子来特异性结合游离单体形式的NGAL并测定它们但不测定其它分子形式的NGAL的配体结合测定，如免疫化学测定。下面的实施例4给出了这样的方法的具体内容。
相反地，在本发明的另一个实施方案中，测定哺乳动物体液样品中的NGAL同源二聚体的浓度也是可能的。下面的实施例5详细地说明了这些方法。证实NGAL同源二聚体可以用于诊断其它释放NGAL同源二聚体的器官或组织的疾病，如嗜中性粒细胞和一系列的非肾上皮，包括呼吸道上皮、包括肝的胃肠道上皮和包括乳腺的泌尿生殖道上皮。NGAL同源二聚体的测定可以与全身性的或局部的炎症的检测相关，以及与感染所述道的细胞、组织或器官或者实际上发现分泌NGAL同源二聚体的任何细胞类型、组织或器官的病理状况的诊断相关。
通过以快速和方便的方式得到两者的结果但无需分离两种分子形式的组合分析来一方面测定体液样品中游离NGAL单体的浓度而另一方面测定NGAL同源二聚体加更高级的寡聚体的浓度是可能的。这描述在下面的实施例6中。游离NGAL单体、NGAL同源二聚体和更高级的分子大小形式的NGAL也可以在样品中通过蛋白分离方法分离这些形式然后通过现有技术已知的非特异性的测定NGAL的方法之一测定各分子形式的量来加以分析。将通过非分离方法对游离NGAL单体和NGAL同源二聚体加更高级的寡聚体的测定结合已知的测定NGAL/MMP-9复合体的方法会得到存在于样品中NGAL分子形式的适度完全的谱，不需要例如通过层析分析进行蛋白分离。该NGAL分子形式谱可以诊断性地用于鉴定特定器官的病患或侵袭不同器官的并发疾病。
分析NGAL分子形式的谱的一个方面包括如上所述测定NGAL单体和同源二聚体的绝对浓度并计算它们之间的比率。从给定个体的样品中获得的比率可以用于区分由确定范围的NGAL单体：同源二聚体比值表征的病理。例如，急性肾损伤的血浆或血清中观察到的NGAL单体与同源二聚体之比大于1，如该值为1.5或以上、如2或以上、如3或以上、如4或以上、如5或以上和高达10或以上。在急性肾损伤的尿中观察到NGAL单体与同源二聚体之比也完全大于1并且通常大于血浆中的比值，该比通常包括2与100之间的任何值或以上、如3或以上、如4或以上、如5或以上、如7或以上、如10或以上、如20或以上、如30或以上和如50或以上。
分析NGAL分子形式的谱的进一步的方法是通过本文公开的方法测定不与MMP-9复合的那些NGAL形式的一种或以上的浓度，并将该浓度与通过其它方法测定的NGAL/MMP-9复合体的浓度比较。可以计算不与MMP-9复合的那些NGAL形式的浓度与NGAL/MMP-9复合体的浓度之比。在血浆、血清或尿中这些比例在不同的病理状况中可以在低于1的值到高于1的任何值之间的范围。预期低比值(例如从低于1到值5)在某些肿瘤疾病中的，而预期更高的比值(如大于5)在非肿瘤病症中。实际上在许多情况下没有检测到NGAL/MMP-9复合体。
本发明的一般原理是通过利用应答疾病或有害刺激的不同的来源细胞产生的NGAL分子形式的特异性差异使得NGAL测定的用途对不同器官或组织的疾病具有诊断特异性。本发明的进一步方面是不同细胞类型或组织类型的NGAL糖基化的差异也可以用来诊断性测定起源于特定组织或器官的NGAL。
本发明的方法特别可用于接受特别护理或重症护理的患者并且也可用于尽管没有重症但遭受明确的创伤如可导致肾缺血损伤的外科手术的患者或用于已经暴露于肾毒药物如用于诊断成像的静脉施用的造影介质的患者或者已经暴露于肾毒害化学治疗剂的患者。本发明的方法也特别可用于测定发展由于缺血引起的肾损伤、或由于炎性、感染性或赘生性疾病的并发症、或任何需要特别护理或手术干预尤其是在手术介入会导致肾缺血损伤的任何原因所导致而发展ARF的危险。在这些情况下，早期识别肾脏已经被疾病进程或医疗或手术操作影响并且因此处于ARF危险的患者可以考虑较早的和更加深入的介入以防止ARF的发展。本发明的方法也用于诊断和检测其它释放不同于肾所释放的NGAL分子形式的谱的器官、组织和细胞类型的失调或损伤。另外，所述方法也用于测定来自外部物理或化学原因的损伤或来自暴露于射线导致的器官和组织损伤。
本发明的方法也用于兽医学、实验动物中的肾病理生理的研究以及用于实验动物中肾中毒的候选治疗药物或诊断药物的测试。
本发明的另一个方面是所述方法可以用于在整个疾病进程或在可以缓解疾病或具有引发器官或组织损伤的危险的医学或手术介入后的不同时间的疾病进程中监测患者。获取用于监测的体液样品的间隔可以是短的，由此提供最早的、可能的器官损伤的指示并允许较早建立预防或治疗措施方案。为此目的监测个体分子形式的NGAL的血浆或尿液浓度优选地在不长于24小时的间隔时间进行，更优选地以更短的间隔时间，如16小时或12小时、更优选地9小时、低至推荐的不长于3个小时或甚至更短，如15分钟或30分钟或1小时，例如如果已知已经发生可能的创伤，例如在手术或医学操作期间。
测定包括但不限于尿、血浆或血清的体液样品中游离NGAL单体或NGAL同源二聚体可以通过任何提供满意的分析特异性、灵敏度和准确度的方法进行。优选的方法是使用对游离NGAL单体具有特异性的结合分子或对NGAL同源二聚体具有特异性的结合分子或结合分子的组合进行的结合分析，所有的所述结合分子能够结合到来自取样的哺乳动物种的NGAL上。这些结合分子包括但不限于抗NGAL的单克隆抗体或通过其它途径产生的特异性NGAL结合分子。
在优选的方法中，使用了从要分析的哺乳动物种产生的抗重组NGAL的单克隆抗体。对游离NGAL单体特异性的抗体可以通过不同的方法筛选，这些方法的非限定的示例描述在下面的实施例3中。一种抗体连接到固体载体上以俘获样品中的NGAL，样品如尿样、血浆样品或血清样品，而另一种抗体例如对游离的NGAL单体形式特异的抗体连接到标记如染料复合体、荧光团、电化学检测部分、生物素或酶上，这些标记可以通过本领域技术人员所知的任何方法检测。固体载体可以是，例如用于酶联免疫吸附测定(ELISA)的聚苯乙烯或聚氯乙烯表面、乳胶(聚苯乙烯)颗粒、顺磁颗粒、由压缩的聚乙烯颗粒组成的过滤玻料、或多孔的硝酸纤维素基质，或实际上用于免疫化学分析的任何合适的支持物。以所述测定的分子形式特异性所需要的方式用特异性结合NGAL的分子包被的颗粒也可以用于通过颗粒增强的比浊方法或浊度方法测定样品中特定分子形式的NGAL的浓度，不论是人工进行或是用自动化装置进行。
根据本发明测定尿样或血样中的NGAL的优选方式包括浸量尺、侧向流动检测(免疫层析)检测或微柱(minicolumn)检测，其允许快速、近对象(near-subject)分析样品。然而，本领域技术人员在阅读了本公开内容后将会理解，可以使用其它的测定个体分子形式的NGAL的手段，包括在其中装置允许随机获取样品进行紧急分析的中心实验室中的自动化方法。
在优选的实施方案中，本发明的方法不包括在人体上实施的手术、治疗或诊断步骤。
在另一个实施方案中，本发明包括根据结合NGAL单体制剂的能力和无结合NGAL同源二聚体的能力从一系列的候选结合分子筛选所述分子来筛选包括能够特异性结合NGAL的单克隆抗体在内的结合分子的方法。
提供以下非限定的实施例来进一步例证本发明。
实施例
实施例1：正常样品和患者样品中存在的NGAL分子形式的测定
将含有已知量的人NGAL免疫反应性的一定体积的样品(血浆、血清、尿或重组人NGAL)进行分子大小排阻层析(凝胶过滤)，人NGAL免疫反应性用检测单体形式和寡聚形式NGAL的ELISA检测。样品在柱缓冲液(磷酸盐缓冲盐水：PBS，pH 7.4)中稀释并加到在同样的缓冲液中平衡的制备级Superdex 200(GEHealthcare)柱(1.6cm x 60cm)中。加载柱并通过GE Healthcare色谱装置运行，收集级分。在280nm监测洗脱物的UV吸收。在各运行之间，根据厂家的说明洗涤并消毒柱。通过同样的ELISA测定级分中的NGAL免疫反应性。绘制NGAL免疫反应峰并测定免疫反应性的收率。
图1说明了从患有肾小管坏死导致的ARF的患者的血浆进行的分子大小排阻层析。观察到对应于血浆巨球蛋白、免疫球蛋白和白蛋白的UV吸收峰并将它们用作近似分子大小的标志。出现的第一个NGAL免疫反应性峰是一个很小的峰，其出现在免疫球蛋白峰的前缘。其含有更高级的复合形式的NGAL，包括NGAL/MMP-9复合体和更高级的NGAL寡聚体。通过NGAL/MMP-9ELISA(R&D系统)证实了NGAL/MMP-9复合体的含量。这个峰含有1.0％的总可分配到层析峰的NGAL免疫反应性。痕量的NGAL同源三聚体出现在白蛋白峰的前面和前缘，总计总可分配的NGAL免疫反应性的0.8％。在白蛋白峰之后出现一个更大的NGAL免疫反应性峰。这对应于NGAL同源二聚体并含有22.3％的总可分配NGAL免疫反应性。在其后是一个大很多的NGAL免疫反应性峰，其对应于游离NGAL单体并含有75.9％的总可分配的NGAL免疫反应性。最后这两个峰的分离证实了NGAL的单体和二聚体形式相互之间没有很快地平衡。
图2说明了从患有肾小管坏死导致的ARF的另一个患者的尿进行的分子大小排阻层析。其显示一个很小的NGAL同源二聚体峰，含有3.0％的总可分配的NGAL免疫反应性，其后是一个很大的游离NGAL单体峰，含有97.0％的可分配的NGAL免疫反应性。没有观察到对应于更高级的NGAL复合形式的峰。
对正常人的血清进行的分子大小排阻层析(图3)产生了更高级的复合形式的NGAL(24.1％的可分配的NGAL免疫反应性)、NGAL同源三聚体(24.5％的可分配的NGAL免疫反应性)、NGAL同源二聚体(33.1％的可分配的NGAL免疫反应性)和游离NGAL单体(18.3％的可分配的NGAL免疫反应性).
实施例2：人游离NGAL单体和同源二聚体的制备
天然的或重组的人NGAL通过本领域公知的蛋白质分离技术分别分离自嗜中性粒细胞或用编码人NGAL氨基酸序列的载体转化或转染的原核或真核细胞的培养物上清液。对于天然的和重组的人NGAL，各制备物都含有游离NGAL单体和NGAL同源二聚体。单体和同源二聚体形式通过离子交换层析分离，并且分别含有单体和同源二聚体的峰通过在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分析还原的和未还原的样品从各峰识别出来。合并含有NGAL单体的级分并在1-4天内使用，使得任何新形成的二聚体最少。可选地，用碘乙酰胺或N-乙基马来酰亚胺封闭任何游离的巯基并使二硫桥形成的可能性最小来处理该合并物。溶液通过三次更换的用盐酸调节到pH 6.5的PBS透析，并贮存在4℃。也合并含有NGAL同源二聚体的级分。同源二聚体比单体更稳定，但如果必要，可在透析前通过用20倍摩尔过量的二硫-双-(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP；Pierce)处理而进一步稳定，如Yan等人(2001)所述，并如上所述贮存。
实施例3：筛选对游离NGAL单体具有特异性的单克隆抗体
来自用主要是单体形式的重组人NGAL免疫的Balb-C小鼠的杂交瘤上清液通过ELISA筛选能够结合到包被的重组人NGAL的抗体。然后从阳性孔重新筛选针对i)结合到链霉亲和素包衣的轻度生物素化的人NGAL单体和ii)结合到同样包衣的轻度生物素化的人NGAL二聚体的抗体。只选择那些显示有结合单体且不结合二聚体的抗体的上清液。假设这些抗体结合到人NGAL的被二聚体所阻断的表位。
可选地，可以用连接到合成肽的载体进行免疫，所述合成肽具有与人NGAL蛋白链的部分序列相同或紧密相关的序列，所述序列包括在成熟蛋白的87位的半胱氨酰残基，所述半胱氨酸残基被认为参与了NGAL同源二聚体的形成，然后进行与如上所述相似的筛选操作。
实施例4：对游离NGAL单体特异的夹心ELISA
用能够结合单体和二聚体的NGAL单克隆抗体包被ELISA孔。在涂敷样品和洗涤后，结合的NGAL单体通过根据实施例3筛选的对NGAL单体特异并被适当标记以实现灵敏检测的单克隆抗体进行检测。
可选地，用根据实施例3筛选的对NGAL单体特异的单克隆抗体包被ELISA孔，并且结合的NGAL单体通过另一个标记的NGAL单克隆抗体检测。所述另一个标记的NGAL单克隆抗体能够结合到已结合单体特异性抗体的NGAL单体。
所述方法能够包含在用于测定游离NGAL单体的试剂盒或装置中，所述试剂盒或装置包括固体载体和根据上述原理筛选的单克隆抗体或其它结合分子。
实施例5：对NGAL同源二聚体和更高级的寡聚体特异的夹心ELISA
用能够结合单体和二聚体的NGAL单克隆抗体包被ELISA孔。在涂敷样品和洗涤后，结合的NGAL单体通过已被适当标记以实现灵敏检测的同样的单克隆抗体进行检测。相同的抗体用于俘获和检测这一事实意味着如果它们在相互之间足够远的位置上含有两个或以上拷贝的相同表位以能够同时结合相同抗体，NGAL的形式将只给出一个信号。这实现了对同源二聚体和更高级的NGAL寡聚体特异的分析。
所用的两个单克隆抗体不必相同。可能发现不同的抗体对，尽管其表位不同，但是它们的表位在NGAL分子上的排列使得第一抗体与NGAL单体的结合阻断了第二抗体与NGAL单体的任何结合。
所述方法能够包含在用于测定NGAL同源二聚体和更高级的寡聚体的试剂盒或装置中，所述试剂盒或装置包括固体载体和根据上述原理筛选的单克隆抗体或其它结合分子。
实施例6：允许并行测定游离NGAL单体和NGAL同源二聚体加更高级的寡聚体的夹心ELISA
用能够结合单体和二聚体的NGAL的单克隆抗体包被ELISA孔。在涂敷样品和洗涤后，结合的NGAL单体通过根据实施例3筛选的对NGAL单体特异并被适当标记以实现灵敏检测的单克隆抗体进行检测。在已经涂敷相同样品的平行孔中，结合的NGAL同源二聚体和更高级的寡聚体如实施例5用标记形式的与用于涂敷孔的相同抗体或另一种其与NGAL单体的结合被包被抗体的先前结合所阻断的抗体检测。
所述方法能够包含在用于并行测定游离NGAL单体和NGAL同源二聚体加更高级的寡聚体的试剂盒或装置中，所述试剂盒或装置包括固体载体和根据上述原理筛选的单克隆抗体或其它结合分子。
实施例7：用于测定游离NGAL单体和NGAL同源二聚体总和的夹心ELISA
现有的单体、同源二聚体和更高级的同源寡聚体形式的NGAL的NGALELISA的反应性没有被公开。NGAL的多克隆抗体与所有分子形式的NGAL反应，并且大多数的NGAL单克隆抗体也与单体和二聚体形式反应。描述在实施例4和5中的适合特异性ELISA的抗体的组合需要特别选择。因此可以期望的是，大多数现有的NGAL ELISA会与各种所述的分子形式反应到某种程度。通过用实施例2中所述的游离NGAL单体和NGAL同源二聚体的制备物，可以如以下a)和b)所述通过定量这两个分子形式的NGAL来表征NGAL单克隆抗体对。
a)用能够结合NGAL单体和同源二聚体的第一NGAL单克隆抗体包被ELISA孔。在涂覆样品和冲洗后，用也能够结合NGAL单体和同源二聚体并已被适当标记以实现灵敏检测的第二单克隆抗体检测结合的NGAL。不同的第一和第二抗体对用分别含有已知浓度的纯化的NGAL单体和NGAL同源二聚体的制备物的样品检测。选择对于给定的质量浓度的NGAL，不管为单体或二聚体形式，给出同样信号的第一和第二抗体对。这暗示这样的抗体对的表位排列在NGAL蛋白链上，使得当NGAL单体或二聚体结合到第一抗体时，第二抗体结合到各NGAL亚基。对于给定质量浓度的NGAL，不管其单体和二聚体的相对含量如何，最终的分析将获得相同的结果。忽略更高级的NGAL寡聚体的可能的小影响，所述更高级的NGAL寡聚体的反应性在分析中没有被定量，这种类型的夹心ELISA可以被不严格地称为“总”NGAL ELISA。
b)也可能选择对NGAL二聚体分子和单体分子给出相同信号的第一和第二抗体对。在这种情况下，获得的信号与NGAL质量浓度不成比例，但是与NGAL单体和二聚体的摩尔浓度成比例。这暗示了这样的抗体对的表位在NGAL蛋白链的配置方式使得NGAL的二聚化阻断了第二抗体与所述二聚体的两个亚基的结合。这种类型的夹心ELISA显示对NGAL单体在质量浓度上的中度选择性，因为需要两倍的二聚体质量来获得与给定质量的单体相同的信号。
实施例8：对游离NGAL单体的NGAL浸量尺测定
用能够结合单体和同源二聚体形式的人NGAL两者的单克隆捕获抗体包被包括聚苯乙烯表面的浸量尺分析区域。将等份的离心、稀释的样品加入到在第一管中对游离NGAL单体特异的酶标记检测抗体的溶液，浸量尺浸没在该管中。酶标记检测抗体与NGAL的复合体结合到浸量尺，接着用自来水冲洗浸量尺并将其放在第二管中的生色底物溶液中。在规定时间内底物溶液中显色通过肉眼读取并和指示尿样中NGAL浓度的颜色强度图比较，或在可例如被编程来直接指示NGAL浓度的简易比色计中读取。
实施例9：用于测定游离单体NGAL的侧流装置
包括多孔硝酸纤维素或具有能够通过毛细管力促进液体迁移的通道的其它材料的条带的侧流装置在其远端附近用能够结合单体和二聚体形式的NGAL的捕获抗体包被，所述抗体作为横向带涂覆。另一个抗检测抗体所来源的物种的抗体的抗体横向带放在捕获抗体带的远侧，充当条带功能(strip function)的对照。该条带的近端含有对游离NGAL单体特异的检测抗体，该检测抗体被吸收到或连接到标记的聚苯乙烯颗粒或染料复合物的颗粒。当等分的离心的或过滤的样品被涂敷到条带的近端时，附着到检测抗体的标记颗粒通过毛细吸引沿着该条带移动。当到达捕获抗体的带时，只有已经结合样品中NGAL单体的那些颗粒将会被保留，产生可检测的带。到达抗检测抗体的抗体的对照带的颗粒会产生可检测的带，不论是否已经结合任何NGAL。标记带的强度在着色颗粒的情况下可以通过肉眼读取，或利用所用标记的合适检测装置读取。阳性结果通过显色或两条带中标记的累积来指示，而阴性结果通过生色或只在对照带中的其它标记来指示。没有生色或对照带中没有其它标记表明没有足够的条带功能。该检测的灵敏度能够通过稀释所涂敷的样品加以调节，调节所涂敷的样品使得只有高于确定的截止值的NGAL单体浓度产生阳性结果。该检测的灵敏度也可以通过将检测抗体连接到标记和未标记的颗粒的混合物来调节。各批次的条带可以被预先校准并配备有能够被检测装置读取的校准码，使得能够从该装置读取定量或半定量结果。这种侧向流动技术的各个方面的许多变化是可能的，其为本领域技术人员公知。
实施例10：微柱检测游离NGAL单体
微柱含有由压缩的能通过流体和细胞的聚乙烯颗粒制成的玻料。所述玻料包被有抗人NGAL的能够结合NGAL单体和二聚体的捕获抗体。将微柱并入到一个装置中，所述装置通过自动化液体处理实现将稀释的样品以固定的速率和体积施加，然后施加对游离NGAL单体特异的与染料复合的检测抗体。在洗涤溶液通过后，玻料的颜色强度(color intensity)通过光散射光度测定进行读数。预校准各玻料批次，并且微柱配备有可被装置读取的校准码，使得定量结果能够被仪器显示而无需事先用标准物校准。
实施例11：比较测定血浆样品中NGAL单体、NGAL同源二聚体和“总”NGAL在急性肾损伤方面的诊断性能
EDTA-血浆样品选自38位接受特别护理装置护理的患者，他们中的19位在临床和生物化学上诊断为患有急性肾损伤，其它的患者不显示这样的损伤的证据。先前显示根据实施例7b)测定的各患者最高的NGAL浓度的样品根据实施例5再分析NGAL同源二聚体和根据实施例7a)测定“总”NGAL，从实施例7a)也可以计算NGAL单体的浓度。图4显示了NGAL单体、二聚体和“总”值的接受者操作特征(ROC)曲线。
就诊断急性肾损伤而言，用NGAL单体值获得最好的性能，曲线下面积(AUC)为0.853并且使用截止值450ng/mL的诊断敏感性和特异性都为84％。“总”NGAL值的诊断性能较差(截止值为580ng/mL时，AUC 0.812，灵敏度74％，特异性89％)。NGAL二聚体值的诊断性能很差(AUC 0.609)，以至于不能用于诊断急性肾损伤。另外，NGAL同源二聚体结果显示其与NGAL单体结果没有显著的相关性。这些发现表明NGAL单体的血浆水平而非NGAL同源二聚体的血浆水平与这些患者中存在急性肾损伤与否相关。
作为NGAL单体的血浆浓度的450ng/mL的截止值，其该小组患者中必须被超过以实现急性肾损伤的高的诊断特异性，但其未必代表了适于其它组患者的截止值。本患者组特征在于在几乎每个患者中，发生严重的已知与非肾释放NGAL相关的伴随病症，如包括脓毒的严重感染、全身炎症和腺癌。这将诊断急性肾损伤的合适截止值增加到高水平，可能是在任何患者组中可能发现的最高水平。其它患者组可以由患有很少或没有影响NGAL水平的伴随病症的个体组成，但是所述个体可以例如处于由涉及心肺转流术的选择性手术介入导致的急性肾损伤危险。在这些组中，在血浆中NGAL单体浓度的截止水平可以达到正常范围的上限，对NGAL单体为大约60ng/mL，超过该截止水平的浓度能够诊断急性肾损伤。就尿浓度而言，基于同样的原因，可以诊断急性肾损伤的NGAL单体浓度的截止值也可以达到正常值的上限，约12ng/mL。
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