PODN作为诊断甲状腺癌的分子标志物
阅读：336发布：2020-05-12
专利汇可以提供PODN作为诊断甲状腺癌的分子标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于甲状腺癌早期诊断的分子标志物-PODN。本发明研究证明与癌旁组织相比，甲状腺癌患者中PODN基因的mRNA表达 水 平显著下降。根据PODN基因与甲状腺癌之间的存在的相关性，可以制备诊断甲状腺癌的 试剂 盒 ，该试剂盒可在临床上广泛应用。，下面是PODN作为诊断甲状腺癌的分子标志物专利的具体信息内容。
1.检测PODN基因或PODN蛋白的产品在制备甲状腺癌诊断工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测PODN基因或PODN蛋白的产品包括检测PODN基因或PODN蛋白的表达水平的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的PODN基因或PODN蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的PODN基因或PODN蛋白的表达水平下调，则诊断该受试者为甲状腺癌患者或者诊断该受试者患有甲状腺癌的风险高。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是组织。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合PODN基因的核酸或者能够结合PODN蛋白的物质；所述核酸能够检测PODN基因的表达水平；所述物质能够检测PODN蛋白的表达水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增PODN基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
7.一种诊断甲状腺癌的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测受试者样本中的PODN基因或PODN蛋白的表达水平的工具。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合PODN基因的核酸或者能够结合PODN蛋白的物质；所述核酸能够检测PODN基因的表达水平；所述物质能够检测PODN蛋白的表达水平。
9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增PODN基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述受试者样本的来源是组织。
PODN作为诊断甲状腺癌的分子标志物
技术领域
[0001] 本发明涉及甲状腺癌诊断领域，更具体地，本发明涉及PODN基因作为甲状腺癌的诊断工具。
背景技术
[0002] 甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤，临床发现的甲状腺结节中有5％-10％为甲状腺癌。分化型甲状腺癌约占所有甲状腺癌的90％，包括乳头状腺癌和滤泡状腺癌，其他较少见的有甲状腺未分化癌以及甲状腺髓样癌等。调查显示我国甲状腺癌发病率逐年增加。甲状腺良性结节除外有压迫等不适症状，可不必手术，而甲状腺癌则需尽早手术切除。因此，如何早期准确地对甲状腺结节作出诊断，显得尤为重要。甲状腺细针穿刺细胞学检查(FNAB)目前被认为是最有效的鉴别结节性质的方法，但是该方法也只能为70-85％的甲状腺结节提供明确诊断。而且该方法受到穿刺医生和病理诊断医生临床经验的制约，有些结节性质难以从细胞学上鉴别。因此，寻找一种灵敏度高、特异性强，制约因素少的诊断方法是亟待解决的问题。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种通过检测PODN基因或蛋白表达差异来诊断甲状腺癌的方法。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0005] 本发明提供了检测PODN基因或PODN蛋白的产品在制备甲状腺癌诊断工具中的用途。
[0006] 进一步，所述检测PODN基因或PODN蛋白的产品包括检测PODN基因或PODN蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合PODN基因的核酸或者能够结合PODN蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测PODN基因的表达水平；所述物质能够检测PODN蛋白的表达水平。
[0007] 本发明的检测PODN基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0008] 包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0009] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification Refractory Mutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
[0010] 上面所述的核酸包括扩增PODN基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
[0011] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
[0012] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
[0013] 本发明的检测PODN蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
[0014] 本发明的检测PODN蛋白的产品包括特异性结合PODN蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测PODN蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0015] 抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的PODN蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对PODN蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
[0016] 标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)
555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
[0017] 进一步，所述检测PODN基因或PODN蛋白的产品可以是检测PODN基因或PODN蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
[0018] 利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的PODN基因或PODN蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的PODN基因或PODN蛋白的表达水平降低，则诊断该受试者为甲状腺癌患者或诊断该受试者患有甲状腺癌的风险高。
[0019] 作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
[0020] 在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的组织。
[0021] 本发明还提供了一种诊断甲状腺癌的工具，所述工具能够检测受试者样本中PODN基因或PODN蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合PODN基因的核酸或者能够结合PODN蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测PODN基因的表达水平；所述物质能够检测PODN蛋白的表达水平。
[0022] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0023] 进一步，所述诊断甲状腺癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断甲状腺癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PODN基因的异常与甲状腺癌相关也属于PODN基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0024] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗PODN抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合PODN即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制PODN功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。
[0025] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗PODN抗体的其他性质同前面所述。
[0026] 进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的组织。
[0027] 本发明还提供了一种诊断甲状腺癌的方法，所述方法包括如下步骤：
[0028] (1)获取甲状腺癌受试者的样品；
[0029] (2)检测受试者样品中PODN基因或蛋白的表达水平；
[0030] (3)将测得的PODN基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
[0031] (4)与正常对照相比，PODN基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为甲状腺癌，或该受试者被诊断为将来患有甲状腺癌的风险高。
[0032] 在本发明的上下文中，“诊断甲状腺癌”既包括判断受试者是否已经患有甲状腺癌、也包括判断受试者是否存在患有甲状腺癌的风险。
[0033] 本发明的“PODN基因”在NCBI上的信息为：Chromosome 1,NC_000001.11(53062052..53085502)。
[0034] 本发明的优点和有益效果：
[0035] 本发明为甲状腺癌疾病的早期诊断、预后判断和早期干预治疗提供重要的参考依据，具有较大的实际临床价值，可以用于筛选出甲状腺癌疾病的高危人群和复发人群，以期及早进行干预和治疗，减少非高危复发病人不必要的治疗和医疗花费。附图说明
[0036] 图1显示利用QPCR检测组织中PODN基因在癌组织和癌旁组织中的表达差异。
[0037] 具体的实施方式
[0038] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0039] 实施例1癌旁组织和甲状腺癌组织中PODN基因的表达差异
[0040] 1、研究对象：
[0041] 收集30例经医院确诊为甲状腺癌的患者的甲状腺癌组织以及相应的癌旁组织。
[0042] 2、在转录水平上检测PODN基因的差异表达
[0043] 2.1组织RNA的提取
[0045] 2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中；
[0046] 3)加入300μl Lysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；
[0047] 4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5mL的离心管中；
[0048] 5)加入600μl RNase-Free Water，用漩涡器混匀；
[0049] 6)加入20μl蛋白酶K，在55℃温浴15min，不断涡旋混匀；
[0050] 7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5mL的离心管中；
[0051] 8)加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀；
[0052] RNA吸附：
[0053] 9)取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；
[0054] 10)弃下层，重置收集管于柱上；
[0055] 11)依照裂解液的容量，重复9)～10)步；
[0056] 12)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；
[0057] 13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；
[0058] DNase处理：
[0059] 14)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min；
[0060] 15)将收集管中的溶液重新移入柱中；
[0061] 16)室温放置15min；
[0062] RNA洗涤：
[0063] 17)加入400μl Wash solution，14000g离心1min，弃下层，重置收集管于柱上；
[0064] 18)加入400μl Wash solution，14000g离心2min，弃收集管；
[0065] RNA洗脱：
[0066] 19)把柱子放入1.7mL Elution管中；
[0067] 20)加入30μl Elution Buffer；
[0068] 21)200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心1min。
[0069] 2.2逆转录
[0070] 利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
[0071] 2.3QPCR
[0072] (1)引物设计
[0073] 根据Genbank中PODN基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0074] PODN基因：
[0075] 正向引物为5’-AGAACAACAAGATTAGTG-3’(SEQ ID NO.1)；
[0076] 反向引物为5’-GTTAAACCTGAGAAAGAT-3’(SEQ ID NO.2),
[0077] GAPDH基因：
[0078] 正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.3)；
[0079] 反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。
[0080] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0081] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0082] 表1PCR反应体系
[0083]试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
[0084] (3)PCR反应条件：95℃5min，(95℃20s，57℃40s)*40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
[0085] 2.4统计学方法
[0087] 2.5结果
[0088] 结果显示，30例甲状腺癌患者中有29例患者癌组织中PODN基因的mRNA显著低于癌旁组织，统计结果见图1所示，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0089] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
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