减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法
阅读：667发布：2021-12-25
专利汇可以提供减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供痘苗病毒的克隆毒株。还提供从病毒制备物中 鉴别 及分离减毒的溶瘤克隆毒株的方法。还提供克隆毒株的修饰的重组形式。所述克隆毒株及病毒制备物可以用于诊断和 治疗 方法，特别是治疗和诊断或者监测增生性病症的治疗，包括 肿瘤 疾病 ，例如但不限于实体肿瘤和血液癌症。，下面是减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法专利的具体信息内容。
1.分离的克隆LIVP毒株，其不同于基因组包含SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的克隆毒株。
2.权利要求1的分离的克隆LIVP毒株，其与GLV-1h68相比具有更高的抗肿瘤发生能力和/或降低的毒性，其中GLV-1h68具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。
3.权利要求1或2的分离的克隆LIVP毒株，其基因组中进一步包含非病毒异源核酸或者包含开放读框的缺失。
4.权利要求1-3任一项的分离的克隆LIVP毒株，其与名称为GLV-1h68并具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的病毒相比具有降低的毒性。
5.权利要求1-3任一项的分离的克隆LIVP毒株，其与名称为GLV-1h68并具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的病毒相比具有更高的抗肿瘤发生能力。
6.权利要求1-3任一项的分离的克隆LIVP毒株，其与名称为GLV-1h68并具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的病毒相比具有降低的毒性及更高的抗肿瘤发生能力。
7.权利要求1-6任一项的分离的克隆LIVP毒株，其包含与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列具有至少85％序列相同性的核苷酸序列，但是不包含SEQ ID NO：10所示核苷酸序列。
8.权利要求7的分离的克隆LIVP毒株，其包含与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列具
有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列相同性的核苷酸序列。
9.权利要求7或8的分离的克隆毒株，其中序列相同性是通过比对含有相应于反向末端重复(ITR)的核苷酸的核苷酸序列并使用由GAP序列比对程序确定的全局比对而确定的，其中末端缺口不罚分。
10.权利要求1-9任一项的分离的克隆毒株，其包含选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1的核苷酸10,073-180,095、SEQ ID NO：2的核苷酸11,243-182,721、SEQ ID NO：4的核苷酸6,264-181,390、SEQ ID NO：5的核苷酸7,044-181,820、SEQ ID NO：
6的核苷酸6,674-181,409、SEQ ID NO：7的核苷酸6,716-181,367或者SEQ ID NO：8的核苷酸6,899-181,870；或者
b)与SEQ ID NO：1的核苷酸10,073-180,095、SEQ ID NO：2的核苷酸11,243-182,721、SEQ ID NO：4的核苷酸6,264-181,390、SEQ ID NO：5的核苷酸7,044-181,820、SEQ ID NO：
6的核苷酸6,674-181,409、SEQ ID NO：7的核苷酸6,716-181,367或者SEQ ID NO：8的核苷酸6,899-181,870的序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列。
11.权利要求10的分离的克隆毒株，其包含左侧和/或右侧反向末端重复。
12.权利要求1-11任一项的分离的克隆毒株，其包含SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列，与SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列。
13.通过繁殖权利要求1-12任一项的分离的克隆LIVP毒株产生的LIVP制备物。
14.细胞培养物或分离的细胞，其包含权利要求1-12任一项的克隆毒株。
15.分离的克隆毒株，其如下产生：
繁殖权利要求14的细胞或细胞培养物；及
从所得细胞中分离LIVP克隆。
16.重组LIVP病毒株，包含：
权利要求1-12或15任一项的LIVP克隆毒株的基因组；及
在所述基因组中的编码异源基因产物的核酸。
17.权利要求16的重组LIVP病毒株，其中编码异源基因产物的核酸被插入或者置换病毒基因组中的非必需基因或区域。
18.权利要求16或17的重组LIVP病毒株，其中编码异源基因产物的核酸被插入在病毒基因组中的血凝素(HA)、胸苷激酶(TK)、F14.5L、痘苗病毒生长因子(VGF)、A35R、N1L、E2L/E3L、K1L/K2L、过氧化物歧化酶基因座、7.5K、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。
19.权利要求16-18任一项的重组LIVP病毒株，其中所述异源基因产物是治疗剂或诊断剂。
20.权利要求16-19任一项的重组LIVP病毒株，其中所述异源基因产物选自抗癌剂、抗转移剂、抗血管发生剂、免疫调节分子、抗原、细胞基质降解基因、组织再生及人类体细胞多能性重塑基因、修饰底物产生可检测产物或信号的酶或者可被抗体检测的酶、可以结合造影剂的蛋白质、用于光学成像或检测的基因、用于PET成像的基因以及用于MRI成像的基因。
21.权利要求20的重组LIVP病毒株，其中抗转移剂抑制转移定植或者在体外细胞侵袭测定中抑制细胞侵袭。
22.权利要求20的重组LIVP病毒株，其中抗血管发生剂抑制肿瘤中血管形成。
23.权利要求16-22任一项的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是治疗剂，其选自激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、共刺激分子、核酶、转运蛋白、单链抗体、反义RNA、前体药物转化酶、siRNA、microRNA、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管发生抑制剂、肿瘤抑制物、细胞毒性蛋白、细胞抑制蛋白和组织因子。
24.权利要求16-23任一项的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是治疗剂，其选自粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-24(IL-24)、干扰素γ诱导的蛋白质10(IP-10)、与HSV糖蛋白D竞争T-淋巴细胞上表达的受体HVEM的淋巴毒素诱导表达物(LIGHT)、p60超抗原、OspF、OspG、信号转导及转录激活蛋白(STAT1alpha)、STAT1beta、血纤维蛋白溶酶原k5结构域(hK5)、色素上皮分化因子(PEDF)、单链抗VEGF抗体、单链抗DLL4抗体、单链抗成纤维细胞活化蛋白(FAP)、NM23、钙粘着蛋白1(ECAD或cdh1)、松弛素1(RLN1)、基质金属肽酶9(MMP9)、红细胞生成素(EPO)、microRNA126(miR-126)、microRNA181、microRNA335，锰过氧化物歧化酶(MnSOD)、E3泛素蛋白连接酶1(HACE1)、钠尿肽前体A(nppa1)、羧肽酶G2(CPG2)、醇脱氢酶(ADH)、CDC6和骨形态发生蛋白4(BMP4)。
25.权利要求24的重组LIVP病毒株，其中单链抗VEGF抗体命名为G6。
26.权利要求16-20任一项的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是诊断剂，其为可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质。
27.权利要求16-20或26任一项的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是诊断剂，其选自萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、受体或转运蛋白，所述受体或转运蛋白结合于和/或转运可检测的造影剂、生色团、化合物或配体。
28.权利要求27的重组LIVP病毒株，其中结合于和/或转运造影剂的受体或转运蛋白是铁受体、铁转运蛋白、铜摄取转运蛋白。
29.权利要求27或28的重组LIVP病毒株，其中异源基因产物是诊断剂，其选自绿色磕头虫萤光素酶、lux操纵子、红外荧光蛋白、黄素还原酶蛋白，mNeptune远红光荧光蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、腔肠素结合蛋白(CBP)、人肾上腺素受体(hNET)、碘化钠同向转运蛋白(NIS)、细胞色素p450家族酶、allostatinA受体(AlstR)、Pep1受体(PEPR-1)、LAT-4、固醇14α-去甲基酶(Cyp51)、转移受体(TR)、铁蛋白、二价金属转运蛋白(DMT)、趋磁性蛋白A(MagA)和顺铂内流转运蛋白(CTR1)。
30.权利要求20的重组LIVP病毒株，其中组织再生及人类体细胞多能性重塑基因选自newt AG(nAG)、Oct4、NANOG、Ngn3、Pdx1和Mafa。
31.权利要求16-30任一项的重组LIVP病毒株，其中编码异源基因产物的核酸可操纵地与启动子连接。
32.权利要求31的重组LIVP病毒株，其中启动子是哺乳动物启动子或病毒启动子。
33.权利要求31或32的重组LIVP病毒株，其中启动子选自P7.5k、P11k、PSE、PSEL、PSL、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4b或K1启动子。
34.组合物，包含权利要求1-33任一项的病毒株。
35.药物组合物，包含权利要求1-33任一项的病毒株。
36.权利要求35的药物组合物，进一步包含药物学可接受的载体。
37.权利要求35或36的药物组合物，其被配制用于局部或全身施用。
38.权利要求34-37任一项的组合物或药物组合物，包含一或多种不同病毒株。
39.权利要求35-38任一项的药物组合物，其被配制为用作抗病毒或抗癌疫苗施用。
40.治疗对象中的增生性病症的方法，包括施用权利要求35-39任一项的药物组合物。
41.权利要求40的方法，进一步包括施用用于治疗增生性病症的第二种治疗剂。
42.权利要求40或41的方法，其中增生性疾病是癌症。
43.权利要求42的方法，其中癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌或胰腺癌。
44.权利要求40-42任一项的方法，其中增生性病症是肿瘤或转移。
45.权利要求40-44任一项的方法，其中对象是人类或非人类动物。
46.权利要求45的方法，其中非人类动物选自马、猫、犬、牛、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔、鸡、大鼠和豚鼠。
47.权利要求40-46任一项的方法，其中病毒的施用量是至少或者大约或者是
5
1x10pfu，在一个施用周期至少一次。
48.权利要求40-47任一项的方法，其中病毒的施用量是至少或者大约或者是
5 6 7 8 9 10 11 12
1x10 pfu、1x10 pfu、1x10pfu、1x10pfu、1x10pfu、1x10 pfu、1x10 pfu、1x10 pfu、
13 14
1x10 pfu或1x10 pfu，在一个施用周期至少一次。
49.权利要求47或48的方法，其中所述量的病毒在一个施用周期施用二次、三次、四次、五次、六次或七次。
50.权利要求47-49任一项的方法，其中所述量的病毒在周期的第一天、周期的第一和第二天、周期的前三个连续日子的每一天、周期的前四个连续日子的每一天、周期的前五个连续日子的每一天、周期的前六个连续日子的每一天或者周期的前七个连续日子的每一天施用。
51.权利要求47-50任一项的方法，其中施用周期是7天、14天、21天或28天。
52.权利要求47-51任一项的方法，其中施用周期重复多次。
53.权利要求40-52任一项的方法，进一步包括另一种治疗，其选自外科手术、放疗、免疫抑制治疗和施用抗癌剂，其中所述进一步治疗是在病毒之前、之后、同时或相间进行。
54.权利要求53的方法，其中所述进一步治疗是施用抗癌剂，所述抗癌剂选自细胞因子、趋化因子、生长因子、光增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗剂及前述任何抗癌剂的组合。
55.权利要求53或54的方法，其中抗癌剂选自顺铂、卡铂、吉西他滨、伊立替康、抗EGFR抗体和抗VEGF抗体。
56.权利要求54或55的方法，其中病毒和抗癌剂相继、同时或者相间施用。
57.权利要求40-56任一项的方法，其中病毒经全身性、静脉内、动脉内、肿瘤内、内窥镜、病变内、肌肉内、皮内、腹膜内、囊内、关节内、胸膜内、经皮、皮下、口服、胃肠外、鼻内、气管内、经吸入、颅内、前列腺内、玻璃体内、局部、眼部、阴道或直肠施用。
58.权利要求40-57任一项的方法，其中病毒经静脉内施用。
59.检测对象中的肿瘤或转移的方法，包括：
给对象施用权利要求1-33任一项的LIVP病毒或克隆毒株，其中所述病毒包含编码可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质的核酸；以及
检测所述可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质，其中检测指示对象中肿瘤或转移的存在。
60.权利要求59的方法，其中检测通过给对象成像而实现。
61.权利要求59的方法，其中检测通过检测组织或体液样品中的蛋白质或信号而实现。
62.权利要求59-61任一项的方法，其中所述可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质选自萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、受体或者转运蛋白，所述受体或者转运蛋白结合和/或转运可检测的造影剂、生色团、化合物或配体。
63.权利要求62的方法，其中所述可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、铁受体、铁转运蛋白、人肾上腺素受体(hNET)和碘化钠同向转运蛋白(NIS)。
64.权利要求59-63任一项的方法，其中所述可检测蛋白质或者可检测信号通过微光成像、荧光光谱、X-光成像、磁共振成像(MRI)、磁共振光谱(MRS)、正电子成像术(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)检测。
65.检测宿主中病毒复制的方法，包括：
给对象施用权利要求1-33任一项的病毒，其中所述病毒包含编码可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质的核酸；以及
检测所述可检测蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质，其中检测指示病毒在对象中复制。
66.权利要求65的方法，其中所述对象具有肿瘤或者癌症。
67.权利要求65或66的方法，其包括在施用病毒后，从所述对象获得体液样品；及检测体液中的可检测蛋白质或信号。
68.权利要求67的方法，其中所述体液选自尿、血液、泪或者脑脊液。
69.分离的宿主细胞或细胞培养物，包含权利要求1-33任一项的LIVP病毒株。
70.用于治疗对象中的增生性疾病的组合物，其中所述组合物包含权利要求1-33任一项的LIVP病毒或克隆毒株。
71.权利要求1-33任一项的LIVP病毒或克隆毒株在制备用于治疗对象中的增生性病症的药物组合物中的用途。
6 16
72.权利要求70或71的组合物或用途，其中病毒株的浓度是1x10-1x10 pfu/ml或者
6 7 8 9 10
是至少或者大约或者是1x10pfu/ml、1x10pfu/ml、1x10pfu/ml、1x10pfu/ml、1x10 pfu/
11 12 13 14 15 16
ml、1x10 pfu/ml、1x10 pfu/ml、1x10 pfu/ml、1x10 pfu/ml、1x10 pfu/ml 或 1x10 pfu/ml。
73.权利要求70-72任一项的组合物或用途，其中所述组合物进一步包含抗癌剂。
74.权利要求73的组合物或用途，其中所述抗癌剂选自细胞因子、趋化因子、生长因子、光增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗剂及前述任何抗癌剂的组合。
75.权利要求73或74的组合物或用途，其中抗癌剂选自顺铂、卡铂、吉西他滨、伊立替康、抗EGFR抗体和抗VEGF抗体。
76.权利要求70-75任一项的组合物或用途，其中所述增生性病症是癌症。
77.权利要求76的组合物或用途，其中癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌或胰腺癌。
78.权利要求70-77任一项的组合物或用途，其中癌症是实体瘤癌症或者转移癌。
79.权利要求78的组合物或用途，其中肿瘤或转移是乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤或胰腺肿瘤。
80.权利要求70-79任一项的组合物或用途，其中所述组合物配制为用于全身或局部施用。
81.权利要求70-80任一项的组合物或用途，其中所述组合物配制为用于静脉内施用。
82.选择用于癌症治疗和诊断的LIVP克隆毒株的方法，包括：
(i)提供第一个LIVP病毒样品，其含有具有不同基因组序列的病毒颗粒的混合物；
(ii)从所述样品选择和分离单个克隆分离株；
(iii)测定每个克隆分离株的毒性；
(iv)测定每个克隆分离株的抗肿瘤发生能力；及
(v)选择与参照LIVP病毒株相比显示更高的抗肿瘤发生能力及降低的毒性的克隆毒株，其中将显示降低的毒性和更高的抗肿瘤发生能力的克隆分离株鉴定为用于癌症治疗和诊断的LIVP克隆毒株。
83.权利要求82的方法，其中所述参照LIVP病毒是减毒重组LIVP病毒。
84.权利要求82或83的方法，其中所述参照LIVP病毒是命名为GLV-1h68的病毒，其基因组包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列(GLV-1h68)。
85.权利要求82-84任一项的方法，其中所述第一个LIVP病毒样品是LIVP病毒株，其包含具有SEQ ID NO：10所示基因组或者与SEQ ID NO：10至少99％相同的基因组的LIVP。
86.权利要求82-85任一项的方法，其中第一个LIVP病毒样品是通过繁殖用LIVP毒株和另一种病毒株、基因组DNA或克隆的DNA感染的细胞，随后从培养物中分离病毒样品而获得的混合物，其中所述样品包含由感染产生的子代病毒。
87.权利要求86的方法，其中另一种病毒株选自DNA病毒、双链RNA病毒、单链正义RNA病毒和单链负义RNA病毒。
88.权利要求87的方法，其中DNA病毒选自痘病毒，如禽痘病毒、粘液瘤病毒或痘苗病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、嗜肝DNA病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；以及单链DNA病毒如细小病毒。
89.权利要求86-88任一项的方法，其中另一种病毒株是痘苗病毒株。
90.权利要求87的方法，其中双链RNA病毒是呼肠孤病毒如轮状病毒。
91.权利要求87的方法，其中单链正义RNA病毒选自小RNA病毒如Seneca valley病
毒、柯萨基病毒或脊髓灰质炎病毒、肠道病毒；披膜病毒如西门利克森林病毒；和逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)、鼠Maloney白血病病毒(MMLV)和慢病毒。
92.权利要求91的方法，其中单链负义RNA病毒选自正粘病毒如流感病毒；副粘病毒如新城疫病毒、麻疹病毒或腮腺炎病毒；以及棒状病毒如水泡性口炎病毒(VSV)。
93.权利要求82-92任一项的方法，其中通过噬斑测定选择来自样品的单个克隆分离株。
94.权利要求93的方法，其中选择噬斑测定中最大的噬斑。
95.权利要求94的方法，其中至少选择最大的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20个噬斑并且作为克隆分离株而分离，每一个均在步骤(iii)和(iv)中测定毒性和抗肿瘤发生能力。
96.权利要求93-95任一项的方法，其中所选择的噬斑大于LIVP病毒样品产生的噬斑的平均噬斑大小。
97.由权利要求82-96任一项的方法产生的克隆毒株。
减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2011年4月15日申请的美国临时申请系列号61/517,297、2011年11月4日申请的美国临时申请系列号61/628,684的优先权，每个申请属于Aladar
A.Szalay，Nanhai Chen，Yong A.Yu and Qian Zhang并且发明名称是“Clonal Strains of
Attenuated Vaccinia Viruses and Methods of Use Thereof”。
A.Szalay，Nanhai Chen，Yong A.Yu and Qian Zhang并且发明名称是“Clonal Strains of
Attenuated Vaccinia Viruses and Methods of Use Thereof”。
[0003] 本申请与同日申请的美国专利申请号(Attorney Dkt.No.33316.04832.US03/4832)，发明名称为“Clonal Strains ofAttenuated Vaccinia Viruses and Methods
ofUse Thereof”相关，该申请要求美国临时申请系列号61/517,297和61/628,684的优先
权。
ofUse Thereof”相关，该申请要求美国临时申请系列号61/517,297和61/628,684的优先
权。
[0004] 当允许时，每个上述申请的主题全文引入本文。
[0006] 在此提交序列表电子版本，其内容全部引入本文。电子文件大小4.44Mb，名称为4832seqPC1.txt。
发明领域
发明领域
[0007] 痘苗病毒分离株。
[0008] 发明背景
[0009] 痘苗病毒是一种溶瘤病毒，在肿瘤中积聚。针对治疗性和诊断性应用已经开发了减毒的痘苗病毒毒株。例如，减毒的病毒包括修饰重组病毒，其一或多个病毒基因被修饰导
致病毒基因的表达丧失或降低或者病毒蛋白质失活。然而，减毒病毒的方法可降低或减弱
该病毒的溶瘤性质。因此，仍需要减毒的溶瘤病毒及鉴别减毒的溶瘤病毒的方法。
致病毒基因的表达丧失或降低或者病毒蛋白质失活。然而，减毒病毒的方法可降低或减弱
该病毒的溶瘤性质。因此，仍需要减毒的溶瘤病毒及鉴别减毒的溶瘤病毒的方法。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供来自LIVP制备物的分离的克隆毒株。本发明提供基本上同质的LIVP病毒制备物的制备物。本发明还提供通过繁殖分离的克隆毒株而获得的制备物。本发明特
别提供了分离的克隆LIVP毒株，其基因组含有核苷酸序列，该核苷酸序列不同于基因组中
含有SEQ ID NO：10所示序列的克隆毒株。在一些实例中，本发明提供的LIVP克隆毒株具
有与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列具有至少85％序列相同性但是不包括SEQ ID NO：10所
示核苷酸序列的核苷酸序列。例如，本发明提供的分离的克隆LIVP毒株具有与SEQ ID NO：
10所示核苷酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或
99.9％序列相同性的核苷酸序列。在这样的实例中，序列相同性是指通过比对含有相应于
反向末端重复序列(ITR)(如果其存在的话)的核苷酸的核苷酸序列及使用GAP全局比对
并且末端缺口不罚分而确定的序列相同性。特别地，本发明提供的LIVP克隆毒株与具有
SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的LIVP毒株相比具有较高的抗肿瘤发生能
力和/或降低的毒性。
别提供了分离的克隆LIVP毒株，其基因组含有核苷酸序列，该核苷酸序列不同于基因组中
含有SEQ ID NO：10所示序列的克隆毒株。在一些实例中，本发明提供的LIVP克隆毒株具
有与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列具有至少85％序列相同性但是不包括SEQ ID NO：10所
示核苷酸序列的核苷酸序列。例如，本发明提供的分离的克隆LIVP毒株具有与SEQ ID NO：
10所示核苷酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或
99.9％序列相同性的核苷酸序列。在这样的实例中，序列相同性是指通过比对含有相应于
反向末端重复序列(ITR)(如果其存在的话)的核苷酸的核苷酸序列及使用GAP全局比对
并且末端缺口不罚分而确定的序列相同性。特别地，本发明提供的LIVP克隆毒株与具有
SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的LIVP毒株相比具有较高的抗肿瘤发生能
力和/或降低的毒性。
[0012] 在本发明提供的LIVP克隆毒株的实例中，分离的克隆LIVP毒株是存在于LIVP分离株中或者存在于从LIVP中繁殖的病毒制备物中的毒株，所述克隆毒株与具有SEQ ID NO：
9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒毒株相比具有降低的毒性和/或较高的抗肿瘤发
生能力。
9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒毒株相比具有降低的毒性和/或较高的抗肿瘤发
生能力。
[0013] 在本发明提供的LIVP克隆毒株的其它实例中，分离的克隆LIVP毒株是具有如后述的基因组的毒株，所述基因组不含有非病毒异源核酸，该非病毒异源核酸具有编码非病
毒异源蛋白质的开放读框，所述分离的克隆LIVP毒株与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列
的称作GLV-1h68的病毒毒株相比还呈现出降低的毒性和/或改良的抗肿瘤发生能力。
毒异源蛋白质的开放读框，所述分离的克隆LIVP毒株与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列
的称作GLV-1h68的病毒毒株相比还呈现出降低的毒性和/或改良的抗肿瘤发生能力。
[0014] 本发明提供的LIVP克隆毒株包括与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒相比具有降低的毒性的克隆毒株。在其它实例中，本发明提供的LIVP克隆
毒株包括与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒相比具有更高抗肿
瘤发生能力的克隆毒株。在进一步的实例中，本发明提供的LIVP克隆毒株包括与具有SEQ
ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒相比具有降低的毒性及更高的抗肿瘤发
生能力的克隆毒株。
毒株包括与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒相比具有更高抗肿
瘤发生能力的克隆毒株。在进一步的实例中，本发明提供的LIVP克隆毒株包括与具有SEQ
ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒相比具有降低的毒性及更高的抗肿瘤发
生能力的克隆毒株。
[0015] 在本发明提供的任何LIVP克隆毒株中，所述LIVP克隆毒株的基因组具有与SEQID NO：10所示核苷酸序列具有至少85％序列相同性的核苷酸序列，但是不含有SEQ ID
NO：10所示完整核苷酸序列。例如，所述分离的克隆LIVP毒株具有至少86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、
99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列相同性。在这样的实例中，序列相
同性是指通过比对含有相应于反向末端重复序列(ITR)的核苷酸的核苷酸序列及使用与
SEQ ID NO：10所示核苷酸序列进行GAP全局比对并且末端缺口不罚分而确定的。
NO：10所示完整核苷酸序列。例如，所述分离的克隆LIVP毒株具有至少86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、
99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列相同性。在这样的实例中，序列相
同性是指通过比对含有相应于反向末端重复序列(ITR)的核苷酸的核苷酸序列及使用与
SEQ ID NO：10所示核苷酸序列进行GAP全局比对并且末端缺口不罚分而确定的。
[0016] 在本发明提供的呈现出降低的毒性的任何LIVP克隆毒株中，降低的毒性可以在施用于对象时显现。例如，所述对象可以是人或非人动物，特别是驯化动物。降低的毒性可
以通过任何评估毒性作用的方法确定，例如但不限于指示毒性的参数，如对象的存活降低、
体重降低、发热、皮疹、过敏反应、疲劳、腹痛、对象体内免疫应答的诱发、痘痕形成和/或所述病毒在非肿瘤组织的积累显著低于LIVP(具有SEQ ID NO：10所示或者基本如SEQ ID
NO：10所示基因组的病毒，典型为至少99％)或者GLV-1h68(具有SEQ ID NO：9所示或者
基本如SEQ ID NO：9所示基因组的病毒，典型为至少99％)。积累可以通过任何合适方法
检测，如对所述对象进行成像以检测病毒积累，特别是在其中所述病毒表达可检测蛋白质
或者诱导可检测信号或其它这种标志物的情况下。积累也可以通过对身体组织和/或体液
取样进行检测。在一些实例中，降低的毒性是指对象与施用了具有SEQ ID NO：9所示核苷
酸序列的称作GLV-1h68的病毒的对象相比经历较低的毒性作用或者无毒性作用，其中称
作GLV-1h68的病毒以与所述克隆毒株相似的量及在相同给药方案下施用。在其它实例中，
降低的毒性是指对象不死于施用病毒的施用所诱导的毒性作用。
以通过任何评估毒性作用的方法确定，例如但不限于指示毒性的参数，如对象的存活降低、
体重降低、发热、皮疹、过敏反应、疲劳、腹痛、对象体内免疫应答的诱发、痘痕形成和/或所述病毒在非肿瘤组织的积累显著低于LIVP(具有SEQ ID NO：10所示或者基本如SEQ ID
NO：10所示基因组的病毒，典型为至少99％)或者GLV-1h68(具有SEQ ID NO：9所示或者
基本如SEQ ID NO：9所示基因组的病毒，典型为至少99％)。积累可以通过任何合适方法
检测，如对所述对象进行成像以检测病毒积累，特别是在其中所述病毒表达可检测蛋白质
或者诱导可检测信号或其它这种标志物的情况下。积累也可以通过对身体组织和/或体液
取样进行检测。在一些实例中，降低的毒性是指对象与施用了具有SEQ ID NO：9所示核苷
酸序列的称作GLV-1h68的病毒的对象相比经历较低的毒性作用或者无毒性作用，其中称
作GLV-1h68的病毒以与所述克隆毒株相似的量及在相同给药方案下施用。在其它实例中，
降低的毒性是指对象不死于施用病毒的施用所诱导的毒性作用。
[0017] 在一些情况中，所述LIVP克隆毒株与参照LIVP毒株相比呈现出降低的毒性及较高的抗肿瘤活性或者这些活性的组合，所述参照LIVP毒株如具有SEQ ID NO：9所示基因
组的毒株，特别是称作GLV-1h68的毒株，也称作GL-ONCl。对于任何提供的呈现出较高的
抗肿瘤发生能力的LIVP克隆毒株，其抗肿瘤发生能力可以在施用对象时在体外或体内显
示或评估。较高的抗肿瘤发生能力可以通过在体外或体内评估指示抗肿瘤发生能力的参数
而确定，所述参数选自如肿瘤细胞的感染性、病毒在肿瘤组织中的积累、病毒核酸复制、病
毒产生、病毒基因表达、对宿主细胞的影响、细胞毒性、肿瘤细胞选择性、肿瘤细胞类型选择
性、免疫原性以及在肿瘤细胞中的复制量。在一些实例中，较高的抗肿瘤发生能力是指，在
相同或相似条件下进行相同的体外或体内实验，该实验对指示抗肿瘤发生能力的参数(例
如在给定时间内改变肿瘤大小)进行评估，所述克隆毒株呈现出与具有SEQ ID NO：9所示
核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒的抗肿瘤发生能力相比至少或大约至少110％、120％、
130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、
600％、700％、800％或更高的抗肿瘤发生能力。
组的毒株，特别是称作GLV-1h68的毒株，也称作GL-ONCl。对于任何提供的呈现出较高的
抗肿瘤发生能力的LIVP克隆毒株，其抗肿瘤发生能力可以在施用对象时在体外或体内显
示或评估。较高的抗肿瘤发生能力可以通过在体外或体内评估指示抗肿瘤发生能力的参数
而确定，所述参数选自如肿瘤细胞的感染性、病毒在肿瘤组织中的积累、病毒核酸复制、病
毒产生、病毒基因表达、对宿主细胞的影响、细胞毒性、肿瘤细胞选择性、肿瘤细胞类型选择
性、免疫原性以及在肿瘤细胞中的复制量。在一些实例中，较高的抗肿瘤发生能力是指，在
相同或相似条件下进行相同的体外或体内实验，该实验对指示抗肿瘤发生能力的参数(例
如在给定时间内改变肿瘤大小)进行评估，所述克隆毒株呈现出与具有SEQ ID NO：9所示
核苷酸序列的称作GLV-1h68的病毒的抗肿瘤发生能力相比至少或大约至少110％、120％、
130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、
600％、700％、800％或更高的抗肿瘤发生能力。
[0018] 与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列中相应开放读框(ORF)的核苷酸序列相比，本发明提供的LIVP克隆毒株包括在ORF中具有一或多个核苷酸差异的任何毒株。其它的可以在
其它区域中有差异。例如，一或多个核苷酸差异是一或多个核苷酸缺失、取代或添加(即插
入)，特别是改变编码的蛋白质的序列的核苷酸改变。在另一实例中，所述差异是在ORF的
启动子区域中缺失、取代或添加一或多个核苷酸。在进一步的实例中，与SEQ ID NO：10所
示核苷酸序列中相应ORF不同的ORF编码截短的蛋白质，失活蛋白质或者消除所述病毒产
生的该蛋白质。在任何上述实例中，所述差异可以是在选自名称如下的ORF中：g1001/290、
g1009/283、g1010/282、g1011/280、g1015、g1032、g1034、g1035、g1037、g1069、g1077、
g1079、g1082、g1084、g1088、g1093、g1225、g1230、g1239、g1241、g1257、g1264、g1270、g1273、g1274、g1277/105、g1280/010及g1283/009。可以存在多个差异。关于精确差异的
知识不是必需的，关键的是所述毒株是呈现出降低的毒性和/或抗肿瘤活性或者这二者的
组合，使得所述病毒作为肿瘤治疗或诊断剂的性质优于GLV-1h68(即由于所述性质之一明
显改进或者由于这两种性质组合相比于GLV-1h68的性质有所改良)。
其它区域中有差异。例如，一或多个核苷酸差异是一或多个核苷酸缺失、取代或添加(即插
入)，特别是改变编码的蛋白质的序列的核苷酸改变。在另一实例中，所述差异是在ORF的
启动子区域中缺失、取代或添加一或多个核苷酸。在进一步的实例中，与SEQ ID NO：10所
示核苷酸序列中相应ORF不同的ORF编码截短的蛋白质，失活蛋白质或者消除所述病毒产
生的该蛋白质。在任何上述实例中，所述差异可以是在选自名称如下的ORF中：g1001/290、
g1009/283、g1010/282、g1011/280、g1015、g1032、g1034、g1035、g1037、g1069、g1077、
g1079、g1082、g1084、g1088、g1093、g1225、g1230、g1239、g1241、g1257、g1264、g1270、g1273、g1274、g1277/105、g1280/010及g1283/009。可以存在多个差异。关于精确差异的
知识不是必需的，关键的是所述毒株是呈现出降低的毒性和/或抗肿瘤活性或者这二者的
组合，使得所述病毒作为肿瘤治疗或诊断剂的性质优于GLV-1h68(即由于所述性质之一明
显改进或者由于这两种性质组合相比于GLV-1h68的性质有所改良)。
[0019] 作为克隆毒株的实例，本发明提供LIVP克隆毒株，其含有SEQ ID NO：1的10,073-180,095位核苷酸序列、SEQ ID NO：2的11,243-182,721位核苷酸序列、SEQ ID
NO：4的6,264-181,390位核苷酸序列、SEQ ID NO：5的7,044-181,820位核苷酸序列、SEQ
ID NO：6的6,674-181,409位核苷酸序列、SEQ ID NO：7的6,716-181,367位核苷酸序列
或者SEQ ID NO：8的6,899-181,870位核苷酸序列。本发明还提供LIVP克隆毒株，其含
有与如下核苷酸序列具有至少大约或至少99％序列相同性的核苷酸序列：SEQ ID NO：1的
10,073-180,095位核苷酸序列、SEQ ID NO：2的11,243-182,721位核苷酸序列、SEQ ID NO：
4的6,264-181,390位核苷酸序列、SEQ ID NO：5的7,044-181,820位核苷酸序列、SEQ ID
NO：6的6,674-181,409位核苷酸序列、SEQ ID NO：7的6,716-181，367位核苷酸序列或者
SEQ ID NO：8的6,899-181,870位核苷酸序列。
NO：4的6,264-181,390位核苷酸序列、SEQ ID NO：5的7,044-181,820位核苷酸序列、SEQ
ID NO：6的6,674-181,409位核苷酸序列、SEQ ID NO：7的6,716-181,367位核苷酸序列
或者SEQ ID NO：8的6,899-181,870位核苷酸序列。本发明还提供LIVP克隆毒株，其含
有与如下核苷酸序列具有至少大约或至少99％序列相同性的核苷酸序列：SEQ ID NO：1的
10,073-180,095位核苷酸序列、SEQ ID NO：2的11,243-182,721位核苷酸序列、SEQ ID NO：
4的6,264-181,390位核苷酸序列、SEQ ID NO：5的7,044-181,820位核苷酸序列、SEQ ID
NO：6的6,674-181,409位核苷酸序列、SEQ ID NO：7的6,716-181，367位核苷酸序列或者
SEQ ID NO：8的6,899-181,870位核苷酸序列。
[0020] 在其它实例中，本发明提供的LIVP克隆毒株含有包括左侧和/或右侧反向末端重复的核苷酸序列。例如，本发明提供含有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列的
LIVP克隆毒株。本发明还提供含有与SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列具有至
少99％序列相同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在LIVP克隆毒株中，本发明提供的是
含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少99％相
同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在其它实例中，在LIVP克隆毒株中，本发明提供的是
含有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列或者与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列具有至少99％序
列相同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在本发明提供的LIVP克隆毒株的任何实例中，
所述LIVP克隆毒株可以通过从细胞培养物中分离LIVP克隆而获得，在所述细胞培养物中
繁殖了具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或者具有与SEQ ID NO：1、2、4、
5、6、7或8所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的毒株。
LIVP克隆毒株。本发明还提供含有与SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列具有至
少99％序列相同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在LIVP克隆毒株中，本发明提供的是
含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少99％相
同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在其它实例中，在LIVP克隆毒株中，本发明提供的是
含有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列或者与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列具有至少99％序
列相同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在本发明提供的LIVP克隆毒株的任何实例中，
所述LIVP克隆毒株可以通过从细胞培养物中分离LIVP克隆而获得，在所述细胞培养物中
繁殖了具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或者具有与SEQ ID NO：1、2、4、
5、6、7或8所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的毒株。
[0021] 本发明提供LIVP病毒制备物或者病毒，其含有本发明提供的上述任何LIVP克隆毒株的基因组。
[0022] 本发明提供重组或修饰的LIVP病毒毒株，其含有上述任何LIVP克隆毒株的基因组，上述LIVP克隆毒株被修饰为在基因组中还含有异源核酸，如编码异源基因产物的
核酸。在一些实例中，所述异源核酸(如编码异源基因产物的核酸)被插入或置换病毒
基因组中非必需基因或区域中。例如，编码异源基因产物的核酸被插入在病毒基因组中
的血凝素(HA)、胸腺激酶(TK)、F14.5L、痘苗病毒生长因子(VGF)、A35R、N1L、E2L/E3L、
K1L/K2L、过氧化物歧化酶基因座、7.5K、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或者I4L基因座。本发
明提供的病毒通过本领域技术人员已知的任何方法修饰和/或使用，如治疗肿瘤，作为针
对来自插入基因组中的抗原的病原体的疫苗，用于诊断以及用于诊断和治疗，所述方法包
括例如国际PCT申请No.WO2009/054996、国际PCT申请No.WO2009/139921、美国专利申
请No.US-2009-0081639、US-2009-0053244、US-2009-0098529和美国专利No.7,754,221、
7,588,767、7,588,771和7,662,398中所描述的修饰以及方法/用途。
核酸。在一些实例中，所述异源核酸(如编码异源基因产物的核酸)被插入或置换病毒
基因组中非必需基因或区域中。例如，编码异源基因产物的核酸被插入在病毒基因组中
的血凝素(HA)、胸腺激酶(TK)、F14.5L、痘苗病毒生长因子(VGF)、A35R、N1L、E2L/E3L、
K1L/K2L、过氧化物歧化酶基因座、7.5K、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或者I4L基因座。本发
明提供的病毒通过本领域技术人员已知的任何方法修饰和/或使用，如治疗肿瘤，作为针
对来自插入基因组中的抗原的病原体的疫苗，用于诊断以及用于诊断和治疗，所述方法包
括例如国际PCT申请No.WO2009/054996、国际PCT申请No.WO2009/139921、美国专利申
请No.US-2009-0081639、US-2009-0053244、US-2009-0098529和美国专利No.7,754,221、
7,588,767、7,588,771和7,662,398中所描述的修饰以及方法/用途。
[0023] 在本发明提供的重组或修饰的LIVP病毒毒株中，异源基因产物包括一或多种治疗和/或诊断的制剂或试剂。在一些实例中，所述异源基因产物是抗癌剂、抗转移剂、抗血
管发生剂、免疫调节分子、抗原、细胞基质降解基因、组织再生及人类体细胞多能性重塑基
因、修饰底物以产生可检测产物或信号或者通过抗体可检测的酶、可结合造影剂的蛋白质、
光学成像或检测的基因、PET成像的基因及MRI成像的基因。例如，抗转移剂是抑制转移
或者在体外细胞侵袭测定中抑制细胞侵袭的物质。在另一实例中，抗血管发生剂是抑制肿
瘤中血管形成的物质。在进一步的实例中，组织再生和人类体细胞多能性重塑基因是newt
AG(nAG)、Oct4、NANOG、Ngn3、Pdxl或Mafa。
管发生剂、免疫调节分子、抗原、细胞基质降解基因、组织再生及人类体细胞多能性重塑基
因、修饰底物以产生可检测产物或信号或者通过抗体可检测的酶、可结合造影剂的蛋白质、
光学成像或检测的基因、PET成像的基因及MRI成像的基因。例如，抗转移剂是抑制转移
或者在体外细胞侵袭测定中抑制细胞侵袭的物质。在另一实例中，抗血管发生剂是抑制肿
瘤中血管形成的物质。在进一步的实例中，组织再生和人类体细胞多能性重塑基因是newt
AG(nAG)、Oct4、NANOG、Ngn3、Pdxl或Mafa。
[0024] 在本发明提供的重组或修饰的LIVP病毒毒株的实例中，异源基因产物是选自如下的一种治疗剂：激素、生长因子、细胞因子、共刺激分子、核酶、转运蛋白、单链抗体、反义RNA、前体药物转化酶、siRNA、microRNA、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管发生抑制剂、肿瘤阻抑物、细胞毒性蛋白、细胞抑制蛋白和组
织因子。例如，所述异源基因产物是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞趋
化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-24(IL-24)、干扰素-γ诱导的蛋白
质10(IP-10)、与HSV糖蛋白D竞争T-淋巴细胞上表达的受体HVEM的淋巴毒素诱导表达
物(LIGHT)、p60超抗原、OspF、OspG、信号转导及转录激活蛋白(STATlalpha)、STATlbeta、
血纤蛋白溶酶原k5结构域(hK5)、色素上皮细胞-分化因子(PEDF)、单链抗-VEGF抗体、单
链抗-DLL4抗体、单链抗成纤维细胞激活蛋白(FAP)、NM23、钙粘着蛋白1(ECAD或cdhl)、
松弛肽1(RLNl)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、红细胞生成素(EPO)、microRNA126(miR-126)、
microRNA181、microRNA335、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、E3泛素蛋白连接酶1(HACEl)、
钠尿肽前体蛋白A(nppa1)、羧肽酶G2(CPG2)、醇脱氢酶(ADH)、CDC6、或者骨形态生成蛋白
4(BMP4)。例如、单链抗-VEGF抗体称作G6。
织因子。例如，所述异源基因产物是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞趋
化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-24(IL-24)、干扰素-γ诱导的蛋白
质10(IP-10)、与HSV糖蛋白D竞争T-淋巴细胞上表达的受体HVEM的淋巴毒素诱导表达
物(LIGHT)、p60超抗原、OspF、OspG、信号转导及转录激活蛋白(STATlalpha)、STATlbeta、
血纤蛋白溶酶原k5结构域(hK5)、色素上皮细胞-分化因子(PEDF)、单链抗-VEGF抗体、单
链抗-DLL4抗体、单链抗成纤维细胞激活蛋白(FAP)、NM23、钙粘着蛋白1(ECAD或cdhl)、
松弛肽1(RLNl)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、红细胞生成素(EPO)、microRNA126(miR-126)、
microRNA181、microRNA335、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、E3泛素蛋白连接酶1(HACEl)、
钠尿肽前体蛋白A(nppa1)、羧肽酶G2(CPG2)、醇脱氢酶(ADH)、CDC6、或者骨形态生成蛋白
4(BMP4)。例如、单链抗-VEGF抗体称作G6。
[0025] 在本发明的含有编码诊断剂的异源基因产物的重组或修饰的LIVP毒株的实例中，所述诊断剂是可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质。例如，所述诊断剂是萤光素
酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、结合和/或转运造影剂、生色团、可检测的化合物或配体的受
体或转运蛋白。在这样的实例中，结合和/或转运造影剂的受体或转运蛋白是铁受体、铁转
运蛋白、或者铜摄取转运蛋白。在特定的实例中，所述诊断剂是绿色磕头虫(click beetle)
萤光素酶、lux操纵子、红外线荧光蛋白、黄素还原酶蛋白、mNeptune远红光荧光蛋白、绿色
荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、腔肠素结合蛋白(CBP)、人肾上腺素受体(hNET)、碘
化钠同向转运(NIS)蛋白、细胞色素p450家族酶、allostatin A受体(AlstR)、Pep1受体
(PEPR-1)、LAT-4、固醇14α-去甲基化酶(Cyp51)，转移受体(TR)、铁蛋白、二价金属转运蛋
白(DMT)、趋磁性蛋白A(MagA)或者顺铂内流转运蛋白(CTR1)。
酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、结合和/或转运造影剂、生色团、可检测的化合物或配体的受
体或转运蛋白。在这样的实例中，结合和/或转运造影剂的受体或转运蛋白是铁受体、铁转
运蛋白、或者铜摄取转运蛋白。在特定的实例中，所述诊断剂是绿色磕头虫(click beetle)
萤光素酶、lux操纵子、红外线荧光蛋白、黄素还原酶蛋白、mNeptune远红光荧光蛋白、绿色
荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、腔肠素结合蛋白(CBP)、人肾上腺素受体(hNET)、碘
化钠同向转运(NIS)蛋白、细胞色素p450家族酶、allostatin A受体(AlstR)、Pep1受体
(PEPR-1)、LAT-4、固醇14α-去甲基化酶(Cyp51)，转移受体(TR)、铁蛋白、二价金属转运蛋
白(DMT)、趋磁性蛋白A(MagA)或者顺铂内流转运蛋白(CTR1)。
[0026] 在本发明提供的重组或修饰的LIVP病毒毒株中，编码异源基因产物的核酸与启动子可操纵地连接。例如，所述启动子是哺乳动物启动子，包括病毒启动子。在一些实例
中，所述启动子是P7.5k、P11k、PSE、PSEL、PSL、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4b或者K1启动子。
中，所述启动子是P7.5k、P11k、PSE、PSEL、PSL、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4b或者K1启动子。
[0027] 本发明提供含有上述本发明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的组合物。本发明还提供含有上述本发明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的药物组合物。在其它实例中，本
发明提供的组合物或药物组合物可含有一或多种不同的病毒毒株。在一些实例中，所述药
物组合物含有药物学可接受的载体。本发明提供的药物组合物可以配制用于局部或全身施
用。在其它实例中，所述药物组合物配制物用于抗病毒或抗癌疫苗或者抗癌治疗施用。
发明提供的组合物或药物组合物可含有一或多种不同的病毒毒株。在一些实例中，所述药
物组合物含有药物学可接受的载体。本发明提供的药物组合物可以配制用于局部或全身施
用。在其它实例中，所述药物组合物配制物用于抗病毒或抗癌疫苗或者抗癌治疗施用。
[0028] 本发明提供含有本发明提供的任何克隆毒株或病毒毒株与治疗剂或诊断剂的组合。在一些实例中，所述治疗剂选自化疗剂、免疫抑制剂和抗病毒剂。例如，所述化疗剂是
抗转移剂或抗血管发生剂。在一些实例中，所述化疗剂是细胞因子、趋化因子、生长因子、光
增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗或治疗剂、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗
癌抗生素、免疫治疗剂或者前述任何化疗剂的组合。在其它实例中，所述化疗剂是顺铂、卡
铂、吉西他滨、伊立替康、抗-EGFR抗体或者抗-VEGF抗体。在一些实例中，所述免疫抑制
剂是糖皮质激素、烷化剂、抗代谢物或抗体。在其它实例中，所述抗病毒剂是西多福韦、格列
卫、更昔洛韦、阿昔洛韦或ST-246。例如，所述抗病毒剂是化疗剂。在本发明提供的药剂组
合的任何实例中，所述病毒和化疗剂和/或抗病毒剂配制为单一组合物或者分别配制为两
或多个组合物。
抗转移剂或抗血管发生剂。在一些实例中，所述化疗剂是细胞因子、趋化因子、生长因子、光
增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗或治疗剂、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗
癌抗生素、免疫治疗剂或者前述任何化疗剂的组合。在其它实例中，所述化疗剂是顺铂、卡
铂、吉西他滨、伊立替康、抗-EGFR抗体或者抗-VEGF抗体。在一些实例中，所述免疫抑制
剂是糖皮质激素、烷化剂、抗代谢物或抗体。在其它实例中，所述抗病毒剂是西多福韦、格列
卫、更昔洛韦、阿昔洛韦或ST-246。例如，所述抗病毒剂是化疗剂。在本发明提供的药剂组
合的任何实例中，所述病毒和化疗剂和/或抗病毒剂配制为单一组合物或者分别配制为两
或多个组合物。
[0030] 本发明提供用于治疗对象中增生性病症的方法、用途或组合物，所述治疗通过施用上述任何药物组合物进行，例如含有本发明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的上述任何
药物组合物。所述增生性疾病可以是癌症。例如，所述癌症可以是乳腺癌、前列腺癌、卵巢
癌、肺癌、结肠癌或者胰腺癌。所述增生性病症可以是肿瘤或转移。在本发明的方法中，所
述对象可以是人或者非人对象。
药物组合物。所述增生性疾病可以是癌症。例如，所述癌症可以是乳腺癌、前列腺癌、卵巢
癌、肺癌、结肠癌或者胰腺癌。所述增生性病症可以是肿瘤或转移。在本发明的方法中，所
述对象可以是人或者非人对象。
[0031] 在用于治疗增生性病症的典型的方法、用途或组合物的实例中，所述病毒可以施5
用或者配制为一个量施用，所述量为至少或者大约或者是1×10pfu，在施用周期至少一
5 6
次。例如，施用的或者配制的病毒的量为至少或者至少大约或者是1×10pfu、1×10pfu、
7 8 9 10 11 12 13
1×10 pfu、1×10pfu、1×10pfu、1×10 pfu、1×10 pfu、1×10 pfu、1×10 pfu 或
14
1×10 pfu，施用至少一次或者在一个施用周期至少一次。例如，用于本发明的方法、用
6 16
途或组合物的配制物中的病毒毒株的浓度可以是1×10 至1×10 pfu/ml，或者至少或
6 7 8 9 10
者 大 约 或 者 是 1×10pfu/ml、1×10pfu/ml、1×10pfu/ml、1×10pfu/ml、1×10 pfu/
11 12 13 14 15
ml、1×10 pfu/ml、1×10 pfu/ml、1×10 pfu/ml、1×10 pfu/ml、1×10 pfu/ml 或 者
16
1×10 pfu/ml。在这样的实例中，在施用周期中施用所述量的病毒2次，3次、4次、5次、6
次或7次。例如，所述量的病毒在施用周期第一天、周期的第一天和第二天、周期的连续前
三天的每一天、周期的连续前四天的每一天、周期的连续前五天的每一天、周期的连续前六
天的每一天或者周期的连续前七天的每一天施用。所述施用周期可以是7天、14天、21天
或者28天。
用或者配制为一个量施用，所述量为至少或者大约或者是1×10pfu，在施用周期至少一
5 6
次。例如，施用的或者配制的病毒的量为至少或者至少大约或者是1×10pfu、1×10pfu、
7 8 9 10 11 12 13
1×10 pfu、1×10pfu、1×10pfu、1×10 pfu、1×10 pfu、1×10 pfu、1×10 pfu 或
14
1×10 pfu，施用至少一次或者在一个施用周期至少一次。例如，用于本发明的方法、用
6 16
途或组合物的配制物中的病毒毒株的浓度可以是1×10 至1×10 pfu/ml，或者至少或
6 7 8 9 10
者 大 约 或 者 是 1×10pfu/ml、1×10pfu/ml、1×10pfu/ml、1×10pfu/ml、1×10 pfu/
11 12 13 14 15
ml、1×10 pfu/ml、1×10 pfu/ml、1×10 pfu/ml、1×10 pfu/ml、1×10 pfu/ml 或 者
16
1×10 pfu/ml。在这样的实例中，在施用周期中施用所述量的病毒2次，3次、4次、5次、6
次或7次。例如，所述量的病毒在施用周期第一天、周期的第一天和第二天、周期的连续前
三天的每一天、周期的连续前四天的每一天、周期的连续前五天的每一天、周期的连续前六
天的每一天或者周期的连续前七天的每一天施用。所述施用周期可以是7天、14天、21天
或者28天。
[0032] 在本发明的方法中，也可以施用治疗增生性病症的第二种治疗剂。其可以与所述病毒单独、相继或相间施用。技术人员熟知治疗增生性病症如癌症的各种治疗剂。例如，在
本发明的方法中，对增生性病症的进一步治疗包括但不限于手术、放射性治疗、免疫抑制治
疗或者施用抗癌剂。例如，抗癌剂包括细胞因子、趋化因子、生长因子、光增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗或
治疗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗
剂或者前述任何物质的组合。所述抗癌剂可以是顺铂、卡铂、吉西他滨、伊立替康、抗-EGFR
抗体或者抗-VEGF抗体。在这样的实例中，所述病毒和抗癌剂是相继、同时或者相间施用
的。
本发明的方法中，对增生性病症的进一步治疗包括但不限于手术、放射性治疗、免疫抑制治
疗或者施用抗癌剂。例如，抗癌剂包括细胞因子、趋化因子、生长因子、光增敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性同位素、血管发生抑制剂、信号调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗或
治疗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗
剂或者前述任何物质的组合。所述抗癌剂可以是顺铂、卡铂、吉西他滨、伊立替康、抗-EGFR
抗体或者抗-VEGF抗体。在这样的实例中，所述病毒和抗癌剂是相继、同时或者相间施用
的。
[0033] 在上述方法或使用中，包括但不限于用于治疗增生性病症，所述病毒是在局部(locally)、体表(topically)或全身性施用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、经内窥镜、病变
内(intralesionally)、肌肉注射、皮内、腹膜内、囊内(intravesicularly)、关节内、胸膜
内、经皮、皮下、口服、胃肠外、鼻内、气管内、通过吸入、颅内、前列腺内、玻璃体内、体表、眼内、阴道或者直肠。例如，所述病毒是静脉内或者腹膜内施用的。
内(intralesionally)、肌肉注射、皮内、腹膜内、囊内(intravesicularly)、关节内、胸膜
内、经皮、皮下、口服、胃肠外、鼻内、气管内、通过吸入、颅内、前列腺内、玻璃体内、体表、眼内、阴道或者直肠。例如，所述病毒是静脉内或者腹膜内施用的。
[0034] 本发明提供检测对象体内肿瘤或者转移的方法，通过给对象施用本发明提供的任何LIVP病毒或者克隆毒株或者含有本发明提供的任何LIVP病毒毒株或克隆毒株的组合
物或药物组合物进行检测。为了进行诊断或检测，所述病毒含有编码可检测蛋白或者诱导
可检测信号的蛋白质的核酸，检测所述可检测的蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质，通过
检测表明对象体内肿瘤或转移的存在情况。在本发明的检测方法中，所述可检测蛋白或者
诱导可检测信号的蛋白质选自萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、受体或转运蛋白，所述
受体或转运蛋白结合和/或转运造影剂、生色团、可被检测的化合物或配体。例如，所述可
检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、铁受
体、铁转运蛋白、钠或其它离子转运蛋白如人肾上腺素受体(hNET)或者碘化钠同向转运蛋
白(NIS)。在本发明提供的检测方法中，所述可检测蛋白或可检测信号是通过微光成像、荧
光光谱、X-光成像、磁共振成像(MRI)、磁共振光谱(MRS)、正电子成像术(PET)或者单光子
发射计算机断层扫描(SPECT)。
物或药物组合物进行检测。为了进行诊断或检测，所述病毒含有编码可检测蛋白或者诱导
可检测信号的蛋白质的核酸，检测所述可检测的蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质，通过
检测表明对象体内肿瘤或转移的存在情况。在本发明的检测方法中，所述可检测蛋白或者
诱导可检测信号的蛋白质选自萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、受体或转运蛋白，所述
受体或转运蛋白结合和/或转运造影剂、生色团、可被检测的化合物或配体。例如，所述可
检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、铁受
体、铁转运蛋白、钠或其它离子转运蛋白如人肾上腺素受体(hNET)或者碘化钠同向转运蛋
白(NIS)。在本发明提供的检测方法中，所述可检测蛋白或可检测信号是通过微光成像、荧
光光谱、X-光成像、磁共振成像(MRI)、磁共振光谱(MRS)、正电子成像术(PET)或者单光子
发射计算机断层扫描(SPECT)。
[0035] 本发明提供检测宿主体内病毒活性的方法，该方法通过给对象施用本发明提供的任何LIVP病毒或克隆毒株进行。所述病毒含有编码可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋
白质的核酸，检测所述可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质，通过检测表明所述病毒
是活化的或者具有溶瘤活性。在这样的实例中，所述对象患有肿瘤或癌症。在所述方法的
实例中，检测可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质的步骤是来自对象的体液样品。例
如，所述体液是尿，血液，泪或者脑脊液。
白质的核酸，检测所述可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质，通过检测表明所述病毒
是活化的或者具有溶瘤活性。在这样的实例中，所述对象患有肿瘤或癌症。在所述方法的
实例中，检测可检测蛋白或者诱导可检测信号的蛋白质的步骤是来自对象的体液样品。例
如，所述体液是尿，血液，泪或者脑脊液。
[0036] 本发明提供含有本发明提供的任何LIVP病毒毒株或克隆毒株的宿主细胞。
[0037] 本发明提供一种选择用于癌症治疗和诊断的LIVP克隆毒株的方法，包括(i)提供第一个LIVP病毒样品，其含有具有不同基因组序列的病毒颗粒的混合物；(ii)从所述样品
中选择及分离单个克隆分离株；(iii)测定每个克隆分离株的毒性；(iv)测定每个克隆分
离株的抗肿瘤发生能力；及(v)选择与参照LIVP病毒毒株相比呈现出更高抗肿瘤发生能
力和降低的毒性的克隆毒株，其中将呈现出降低的毒性和更高的抗肿瘤发生能力的克隆分
离株鉴定为用于癌症治疗或诊断的LIVP克隆毒株。在选择LIVP克隆毒株的方法中，参照
LIVP病毒可以是第一个LIVP病毒样品。在一些实例中，参照LIVP病毒是减毒的重组LIVP
病毒。例如，参照LIVP病毒是称作GLV-1h68的病毒，其基因组具有SEQ ID NO：9所示核苷
酸序列(GLV-1h68)。
中选择及分离单个克隆分离株；(iii)测定每个克隆分离株的毒性；(iv)测定每个克隆分
离株的抗肿瘤发生能力；及(v)选择与参照LIVP病毒毒株相比呈现出更高抗肿瘤发生能
力和降低的毒性的克隆毒株，其中将呈现出降低的毒性和更高的抗肿瘤发生能力的克隆分
离株鉴定为用于癌症治疗或诊断的LIVP克隆毒株。在选择LIVP克隆毒株的方法中，参照
LIVP病毒可以是第一个LIVP病毒样品。在一些实例中，参照LIVP病毒是减毒的重组LIVP
病毒。例如，参照LIVP病毒是称作GLV-1h68的病毒，其基因组具有SEQ ID NO：9所示核苷
酸序列(GLV-1h68)。
[0038] 在选择或鉴定本发明提供的LIVP克隆毒株的方法中，第一个LIVP病毒样品可以是LIVP病毒毒株或者任何其它本发明提供的其他毒株，所述LIVP病毒毒株具有SEQ
ID NO：10所示基因组或者与SEQ ID NO：10至少99％相同的基因组。在其它实例中，第
一个LIVP病毒样品是一种混合物，其通过繁殖用LIVP毒株及另一病毒毒株、基因组DNA
或克隆的DNA感染的细胞，随后从培养物中分离病毒样品而获得，其中所述样品包含通
过感染产生的后代病毒。例如，另一病毒毒株可以是DNA病毒、双链RNA病毒、单链正义
(single-stranded positive sense)RNA病毒或者单链负义RNA病毒。所述DNA病毒可以
是痘病毒，如禽痘病毒、粘液瘤病毒或者痘苗病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒(HSV)、巨细
胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、嗜肝DNA病毒(例如乙型肝炎病毒)、多瘤病毒、乳
头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；或者单链DNA病毒，如细小病毒。例如，另一病毒毒株是痘
苗病毒毒株。在一些实例中，另一病毒是双链RNA病毒，所述双链RNA病毒是呼肠孤病毒如
轮状病毒。在实例中，其中另一病毒是单链正义RNA病毒，所述单链正义RNA病毒是小RNA
病毒(picornoviruses)如Seneca valley病毒、柯萨奇病毒或脊髓灰质炎病毒、肠道病毒；
披膜病毒如西门利克森林病毒；以及逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠Maloney白血
病病毒(MMLV)或者慢病毒。在进一步的实例中，其中另一个病毒是单链负义RNA病毒，所
述单链负义RNA病毒是正粘病毒，如流感病毒；副粘病毒如新城疫病毒、麻疹病毒或腮腺炎
病毒；或者棒状病毒如水泡性口炎病毒(VSV)。
ID NO：10所示基因组或者与SEQ ID NO：10至少99％相同的基因组。在其它实例中，第
一个LIVP病毒样品是一种混合物，其通过繁殖用LIVP毒株及另一病毒毒株、基因组DNA
或克隆的DNA感染的细胞，随后从培养物中分离病毒样品而获得，其中所述样品包含通
过感染产生的后代病毒。例如，另一病毒毒株可以是DNA病毒、双链RNA病毒、单链正义
(single-stranded positive sense)RNA病毒或者单链负义RNA病毒。所述DNA病毒可以
是痘病毒，如禽痘病毒、粘液瘤病毒或者痘苗病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒(HSV)、巨细
胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、嗜肝DNA病毒(例如乙型肝炎病毒)、多瘤病毒、乳
头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；或者单链DNA病毒，如细小病毒。例如，另一病毒毒株是痘
苗病毒毒株。在一些实例中，另一病毒是双链RNA病毒，所述双链RNA病毒是呼肠孤病毒如
轮状病毒。在实例中，其中另一病毒是单链正义RNA病毒，所述单链正义RNA病毒是小RNA
病毒(picornoviruses)如Seneca valley病毒、柯萨奇病毒或脊髓灰质炎病毒、肠道病毒；
披膜病毒如西门利克森林病毒；以及逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠Maloney白血
病病毒(MMLV)或者慢病毒。在进一步的实例中，其中另一个病毒是单链负义RNA病毒，所
述单链负义RNA病毒是正粘病毒，如流感病毒；副粘病毒如新城疫病毒、麻疹病毒或腮腺炎
病毒；或者棒状病毒如水泡性口炎病毒(VSV)。
[0039] 在本发明的选择或鉴别克隆毒株的方法中，从样品中选择单个克隆分离株的步骤可以通过噬斑测定进行。例如，选择噬斑测定中最大的噬斑。在这样的实例中，可以选择最
大的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个噬斑，并分离为克隆分离株，在所述方法的步骤(iii)和(iv)中测定每个噬斑的毒性和抗肿瘤发生能力。在其它实
例中，选择的噬斑大于由LIVP病毒样品产生的噬斑的平均大小。
大的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个噬斑，并分离为克隆分离株，在所述方法的步骤(iii)和(iv)中测定每个噬斑的毒性和抗肿瘤发生能力。在其它实
例中，选择的噬斑大于由LIVP病毒样品产生的噬斑的平均大小。
[0040] 在本发明提供的选择克隆毒株的方法的步骤iii)中，毒性是在将选择的克隆分离株施用于第一个对象及将参照病毒施用第二个对象时在体内评估的，其中第一个和第二
个对象是相同物种、大小和性别的，所述病毒是以相同或相似量在相同或相似给药方案下
施用于每个对象的；在对象中评估及测量指示毒性的参数，作为毒性作用的指示。例如，指
示毒性的参数是对象的存活降低或变弱、体重降低、发热、皮疹、过敏反应、疲劳、腹痛、对象体内免疫应答诱导或者痘痕形成。在本发明的选择克隆毒株的方法的步骤v)中，选择呈现
出毒性降低的病毒包括：a)在第一个和第二个对象之间对比测量的指示毒性的参数，及b)
鉴定或选择与参照病毒呈现的毒性作用相比呈现出毒性作用降低的克隆分离株。例如，呈
现出毒性降低的克隆分离株是第一个对象的体重不降低，或者与第二个对象对比第一个对
象的体重降低减少。在其它实例中，呈现出毒性降低的克隆分离株是第一个对象与第二个
对象相比在治疗过程中的存活增加。在另外的实例中，选择呈现出毒性降低的克隆分离株，
其在治疗过程中不导致对象死亡。
个对象是相同物种、大小和性别的，所述病毒是以相同或相似量在相同或相似给药方案下
施用于每个对象的；在对象中评估及测量指示毒性的参数，作为毒性作用的指示。例如，指
示毒性的参数是对象的存活降低或变弱、体重降低、发热、皮疹、过敏反应、疲劳、腹痛、对象体内免疫应答诱导或者痘痕形成。在本发明的选择克隆毒株的方法的步骤v)中，选择呈现
出毒性降低的病毒包括：a)在第一个和第二个对象之间对比测量的指示毒性的参数，及b)
鉴定或选择与参照病毒呈现的毒性作用相比呈现出毒性作用降低的克隆分离株。例如，呈
现出毒性降低的克隆分离株是第一个对象的体重不降低，或者与第二个对象对比第一个对
象的体重降低减少。在其它实例中，呈现出毒性降低的克隆分离株是第一个对象与第二个
对象相比在治疗过程中的存活增加。在另外的实例中，选择呈现出毒性降低的克隆分离株，
其在治疗过程中不导致对象死亡。
[0041] 在本发明提供的选择克隆病毒毒株的方法的步骤iv)中，选择的克隆分离株和参照病毒的抗肿瘤发生能力是在施用于对象时在体外或体内评估的；评估及测量指示抗肿瘤
发生能力的参数。例如，当施用以在体内评估其抗肿瘤发生能力时，将选择的克隆分离株施
用于第一个对象，并将参照病毒施用于第二个对象，其中第一个和第二个对象是相同物种、
大小和性别，所述病毒以相同或相似量及在相同或相似给药方案下施用于每个对象。指示
抗肿瘤发生能力的参数可包括肿瘤的感染性、病毒在肿瘤组织内的积累、肿瘤细胞内的病
毒核酸复制、肿瘤细胞内的病毒产生、肿瘤细胞内的病毒基因表达、肿瘤细胞的细胞毒性、
肿瘤细胞选择性、肿瘤细胞类型选择性、降低的肿瘤大小、增加的肿瘤体积、降低的肿瘤重
量或者特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答的起始。在本发明提供的选择克隆病毒毒株的方
法的步骤v)中，选择呈现出更高抗肿瘤发生能力的病毒包括：c)对比由选择的克隆分离株
及参照病毒呈现的指示抗肿瘤发生能力的参数；及d)鉴定或选择与参照病毒呈现的抗肿
瘤发生能力相比呈现出更高抗肿瘤发生能力的克隆分离株。例如，更高的抗肿瘤发生能力
是指，在评估指示抗肿瘤发生能力的参数的体外或体内实验中，在相同测定中并在相同或
相似条件下，所述克隆分离株与参照病毒的抗肿瘤发生能力相比呈现出至少或大约或大约
至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、
500％、600％、700％、800％或更高的抗肿瘤发生能力。
发生能力的参数。例如，当施用以在体内评估其抗肿瘤发生能力时，将选择的克隆分离株施
用于第一个对象，并将参照病毒施用于第二个对象，其中第一个和第二个对象是相同物种、
大小和性别，所述病毒以相同或相似量及在相同或相似给药方案下施用于每个对象。指示
抗肿瘤发生能力的参数可包括肿瘤的感染性、病毒在肿瘤组织内的积累、肿瘤细胞内的病
毒核酸复制、肿瘤细胞内的病毒产生、肿瘤细胞内的病毒基因表达、肿瘤细胞的细胞毒性、
肿瘤细胞选择性、肿瘤细胞类型选择性、降低的肿瘤大小、增加的肿瘤体积、降低的肿瘤重
量或者特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答的起始。在本发明提供的选择克隆病毒毒株的方
法的步骤v)中，选择呈现出更高抗肿瘤发生能力的病毒包括：c)对比由选择的克隆分离株
及参照病毒呈现的指示抗肿瘤发生能力的参数；及d)鉴定或选择与参照病毒呈现的抗肿
瘤发生能力相比呈现出更高抗肿瘤发生能力的克隆分离株。例如，更高的抗肿瘤发生能力
是指，在评估指示抗肿瘤发生能力的参数的体外或体内实验中，在相同测定中并在相同或
相似条件下，所述克隆分离株与参照病毒的抗肿瘤发生能力相比呈现出至少或大约或大约
至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、
500％、600％、700％、800％或更高的抗肿瘤发生能力。
[0042] 在本发明的选择克隆病毒毒株的方法中，施用于对象以在体内评估毒性或抗肿瘤发生能力的步骤的对象是非人动物或者是人。在本发明的方法中，所述对象可具有肿瘤或
癌症。例如，所述肿瘤是乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤或者胰腺肿瘤。
所述肿瘤可以是异种移植物、同种异体移植物或者自发/天然肿瘤。
癌症。例如，所述肿瘤是乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤或者胰腺肿瘤。
所述肿瘤可以是异种移植物、同种异体移植物或者自发/天然肿瘤。
[0043] 在本发明的选择克隆病毒毒株的方法中，可以分析选择的克隆毒株的基因组，以评估序列的同源性，由此仅选择具有同源基因组序列的那些分离株。例如，通过如测序、限
制性分析、PCR、Southern印迹或者蛋白质表达等方法分析基因组。
制性分析、PCR、Southern印迹或者蛋白质表达等方法分析基因组。
[0044] 本发明提供通过本发明的任何选择克隆毒株的方法产生或选择的克隆毒株。
[0045] 发明详述
[0046] 大纲
[0047] A.定义
[0048] B.分离克隆痘苗病毒毒株的方法
[0049] 1.亲代病毒制备物或混合物
[0050] 2.分离克隆毒株
[0051] 3.抗肿瘤发生
[0052] a.肿瘤相关复制指示物
[0053] b.细胞毒性
[0054] c.肿瘤生长
[0055] 4.毒性/安全性
[0056] 5.基因组分析
[0057] C.分离的克隆病毒毒株
[0058] 1.LIVP
[0059] 2.LIVP克隆毒株
[0060] 典型的LIVP克隆毒株
[0061] D.LIVP毒株的修饰
[0062] 1.异源核酸
[0063] 2.典型的修饰
[0064] a.诊断性基因产物
[0065] b.治疗性基因产物
[0066] c.抗原
[0067] d.改变病毒的减毒的修饰
[0068] 3.异源基因表达的控制
[0069] 4.产生修饰的病毒的方法
[0070] E.病毒的繁殖和产生
[0071] 1.繁殖的宿主细胞
[0072] 2.浓度确定
[0073] 3.保藏方法
[0074] 4.病毒的制备
[0075] F.药物组合物、组合和试剂盒
[0076] 1.药物组合物
[0077] 2.宿主细胞
[0078] 3.组合
[0079] 4.试剂盒
[0080] G.治疗、诊断和监测方法
[0081] 1.治疗方法
[0082] 2.诊断和监测方法
[0083] 3.施用
[0084] a.施用所述病毒之前的步骤
[0085] b.施用模式
[0086] c.剂量和给药方案
[0087] d.共同施用
[0088] i.施用多个病毒
[0089] ii.治疗性化合物
[0090] iii.免疫治疗和生物治疗
[0091] e.对象状态
[0092] 4.监测
[0093] a.监测病毒基因表达
[0094] b.监测肿瘤大小
[0095] c.监测抗体效价
[0096] d.监测一般健康状况诊断
[0097] e.监测协同治疗
[0098] H.实施例
[0099] A.定义
[0100] 除非特别指出，本发明所用的所有技术和学术用语均与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。除非特别指出，在本申请书中提及的所有专利、专利申请、公开的申
请和出版物、网站及其他公开的材料均通过引用的方式以其全部内容并入本文。当本文术
语有多个定义时，本章节中的定义优先。当述及URL或其它这种标示符或地址时，应理解为
这种标示符可改变并且互联网上的特定信息可以出现或消失，但是等价信息是已知的并且
可以容易获得，例如通过搜索互联网和/或合适数据库。其引用表明这种信息的可获得性
和公共传播。
请和出版物、网站及其他公开的材料均通过引用的方式以其全部内容并入本文。当本文术
语有多个定义时，本章节中的定义优先。当述及URL或其它这种标示符或地址时，应理解为
这种标示符可改变并且互联网上的特定信息可以出现或消失，但是等价信息是已知的并且
可以容易获得，例如通过搜索互联网和/或合适数据库。其引用表明这种信息的可获得性
和公共传播。
[0101] 如本文所用，病毒制备物研究所的李斯特毒株(LIVP)或者LIVP病毒毒株是指减毒的李斯特毒株(ATCC Catalog No.VR-1549)，由俄罗斯莫斯科的病毒制备物研究所通过
适应小牛皮而产生(Al’tshtein et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR285：696-699)。所述
LIVP毒株可例如得自俄罗斯莫斯科的病毒制备物研究所(见例如Kutinova et al.(1995)
Vaccine13：487-493)；the Microorganism Collection of FSRI SRC VB Vector(Kozlova
et al.(2010)Environ.Sci.Technol.44：5121-5126)；或者可以得自莫斯科伊万诺夫斯基
病毒学研究所(C0355K0602；Agranovski et al.(2006)Atmospheric Environment 40：
3924-3929)。其也为本领域技术人员熟知，其是在USSR及亚洲和印度用于免疫接种的疫
苗毒株。所述毒株目前由研究人员使用并熟知(见例如Altshteyn et al.(1985)Dokl.
Akad.Nauk USSR285：696-699；Kutinova et al.(1994)Arch.Virol.134：1-9；Kutinova et
al.(1995)Vaccine13：487-493；Shchelkunov et al.(1993)Virus Research28：273-283；
Sroller et al.(1998)Archives Virology143：1311-1320；Zinoviev et al.，(1994)
Gene147：209-214；and Chkheidze et al.(1993)FEBS336：340-342)。在LIVP毒株中有一
种毒株，其含有具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列或者与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列
至少或者至少大约99％相同的序列的基因组。LIVP病毒毒株涵盖了通过在细胞系中重复
传代繁殖LIVP获得的任何病毒毒株或者病毒制备物。
适应小牛皮而产生(Al’tshtein et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR285：696-699)。所述
LIVP毒株可例如得自俄罗斯莫斯科的病毒制备物研究所(见例如Kutinova et al.(1995)
Vaccine13：487-493)；the Microorganism Collection of FSRI SRC VB Vector(Kozlova
et al.(2010)Environ.Sci.Technol.44：5121-5126)；或者可以得自莫斯科伊万诺夫斯基
病毒学研究所(C0355K0602；Agranovski et al.(2006)Atmospheric Environment 40：
3924-3929)。其也为本领域技术人员熟知，其是在USSR及亚洲和印度用于免疫接种的疫
苗毒株。所述毒株目前由研究人员使用并熟知(见例如Altshteyn et al.(1985)Dokl.
Akad.Nauk USSR285：696-699；Kutinova et al.(1994)Arch.Virol.134：1-9；Kutinova et
al.(1995)Vaccine13：487-493；Shchelkunov et al.(1993)Virus Research28：273-283；
Sroller et al.(1998)Archives Virology143：1311-1320；Zinoviev et al.，(1994)
Gene147：209-214；and Chkheidze et al.(1993)FEBS336：340-342)。在LIVP毒株中有一
种毒株，其含有具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列或者与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列
至少或者至少大约99％相同的序列的基因组。LIVP病毒毒株涵盖了通过在细胞系中重复
传代繁殖LIVP获得的任何病毒毒株或者病毒制备物。
[0102] 如本文所用，LIVP克隆毒株或LIVP克隆分离株是指源于通过噬斑分离或者繁殖单个克隆的其它方法得到的LIVP病毒毒株的病毒，其具有序列同源的基因组。因此，LIVP
克隆毒株包括一种病毒，该病毒的基因组存在于从LIVP中繁殖的病毒制备物中。LIVP克
隆毒株不包括通过重组方式使用重组DNA方法遗传工程化导入异源核酸的重组LIVP病毒。
特别地，LIVP克隆毒株的基因组不含有具有编码异源蛋白质的开放读框的异源核酸。例如，
LIVP克隆毒株的基因组不含有具有编码非病毒异源蛋白质的开放读框的非病毒异源核酸。
然而，如本文所述，应理解为本发明提供的任何LIVP克隆毒株在其基因组中可以通过重组
方式修饰以产生重组病毒。例如，可以修饰LIVP克隆毒株以产生重组LIVP病毒，其含有具
有编码异源蛋白质的开放读框的插入的核苷酸。
克隆毒株包括一种病毒，该病毒的基因组存在于从LIVP中繁殖的病毒制备物中。LIVP克
隆毒株不包括通过重组方式使用重组DNA方法遗传工程化导入异源核酸的重组LIVP病毒。
特别地，LIVP克隆毒株的基因组不含有具有编码异源蛋白质的开放读框的异源核酸。例如，
LIVP克隆毒株的基因组不含有具有编码非病毒异源蛋白质的开放读框的非病毒异源核酸。
然而，如本文所述，应理解为本发明提供的任何LIVP克隆毒株在其基因组中可以通过重组
方式修饰以产生重组病毒。例如，可以修饰LIVP克隆毒株以产生重组LIVP病毒，其含有具
有编码异源蛋白质的开放读框的插入的核苷酸。
[0103] 如本文所用，LIVP1.1.1是具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的基因组或者具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP
克隆毒株。
克隆毒株。
[0104] 如本文所用，LIVP2.1.1是具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的基因组或者具有与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP
克隆毒株。
克隆毒株。
[0105] 如本文所用，LIVP4.1.1是具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的基因组或者具有与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP
克隆毒株。
克隆毒株。
[0106] 如本文所用，LIVP5.1.1是具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的基因组或者具有与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP
克隆毒株。
克隆毒株。
[0107] 如本文所用，LIVP6.1.1是具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的基因组或者具有与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP
克隆毒株。
克隆毒株。
[0108] 如本文所用，LIVP7.1.1是具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的基因组或者具有与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP
克隆毒株。
克隆毒株。
[0109] 如本文所用，LIVP8.1.1是具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的基因组或者具有与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列的基因组的LIVP
克隆毒株。
克隆毒株。
[0110] 如本文所用，修饰的LIVP病毒毒株是指具有在LIVP中不含有的基因组的LIVP病毒，而是通过修饰衍生自LIVP的毒株的基因组产生的病毒。典型地，所述病毒的基因组通
过核苷酸的取代(置换)、插入(添加)或者缺失(截短)进行修饰。修饰可以使用本领域
技术人员已知的任何方法进行，如遗传工程和重组DNA方法。因此，修饰的病毒是其基因组
与亲代病毒的基因组相比有改变的病毒。典型的修饰的病毒具有插入病毒基因组中的一或
多个异源核酸序列。典型地，异源核酸含有编码异源蛋白质的开放读框。例如，本发明的修
饰的病毒可含有基因表达盒形式的一或多个异源核酸序列以表达异源基因。
过核苷酸的取代(置换)、插入(添加)或者缺失(截短)进行修饰。修饰可以使用本领域
技术人员已知的任何方法进行，如遗传工程和重组DNA方法。因此，修饰的病毒是其基因组
与亲代病毒的基因组相比有改变的病毒。典型的修饰的病毒具有插入病毒基因组中的一或
多个异源核酸序列。典型地，异源核酸含有编码异源蛋白质的开放读框。例如，本发明的修
饰的病毒可含有基因表达盒形式的一或多个异源核酸序列以表达异源基因。
[0111] 如本文所用，“通过重组方法产生”或者“使用重组DNA方法的方法”或者其变化用语是指使用公知的分子生物学方法以表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
[0112] 如本文所用，“基因表达盒”或者“表达盒”是一种核酸构建体，含有能引起基因在与这种序列相容的宿主中表达的核酸元件。表达盒包括至少启动子及可选地，转录终止信
号。典型地，表达盒包括与启动子可操纵地连接的被转录的核酸。表达盒可含有编码如治
疗性基因产物或者可检测的蛋白质或者可选择的标记基因的基因。
号。典型地，表达盒包括与启动子可操纵地连接的被转录的核酸。表达盒可含有编码如治
疗性基因产物或者可检测的蛋白质或者可选择的标记基因的基因。
[0113] 如本文所用，LIVP GLV-1h68是一种LIVP病毒，其含有ruc-gfp(萤光素酶和绿色荧光蛋白融合基因(见例如美国专利No.5,976,796)，β-半乳糖苷酶(LacZ)和β-葡糖
苷酸酶(gusA)报道基因，分别插入在F14.5L、J2R(胸苷激酶)和A56R(血凝素)基因座
中。GLV-1h68的基因组具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：9所示核苷
酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列。
苷酸酶(gusA)报道基因，分别插入在F14.5L、J2R(胸苷激酶)和A56R(血凝素)基因座
中。GLV-1h68的基因组具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：9所示核苷
酸序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列。
[0114] 如本文所用，病毒制备物，如LIVP病毒制备物，是指通过病毒毒株如LIVP病毒毒株、LIVP克隆毒株或者修饰或重组的病毒毒株在体内或体外在培养系统中繁殖获得的病毒
组合物。例如，LIVP病毒制备物是指通过在宿主细胞中繁殖病毒毒株获得的病毒组合物，典
型是通过从培养系统中使用本领域已知的标准方法进行纯化。病毒制备物通常由许多病毒
颗粒或毒粒组成。如果需要，样品或制备物中病毒颗粒的数目可以使用噬斑实验确定，该实
验假定每个形成的噬斑代表一种感染性病毒颗粒，计算每单位体积的样品噬斑形成单位的
数目(pfu/mL)。制备物中每个病毒颗粒或毒粒与其它病毒颗粒相比可具有相同的基因组序
列(即所述制备物的序列是同源的)，或者可具有不同的基因组序列(即所述制备物的序列
是异源的)。本领域技术人员已知在不存在克隆分离的情况中，病毒基因组的异源性或多样
性可随着病毒的再生而发生，如通过在病毒毒株的天然选择过程中发生的同源重组事件而
发生(Plotkin&Orenstein(eds)“Recombinant Vaccinia Virus Vaccines”in Vaccines，
rd
3 edition(1999))。
组合物。例如，LIVP病毒制备物是指通过在宿主细胞中繁殖病毒毒株获得的病毒组合物，典
型是通过从培养系统中使用本领域已知的标准方法进行纯化。病毒制备物通常由许多病毒
颗粒或毒粒组成。如果需要，样品或制备物中病毒颗粒的数目可以使用噬斑实验确定，该实
验假定每个形成的噬斑代表一种感染性病毒颗粒，计算每单位体积的样品噬斑形成单位的
数目(pfu/mL)。制备物中每个病毒颗粒或毒粒与其它病毒颗粒相比可具有相同的基因组序
列(即所述制备物的序列是同源的)，或者可具有不同的基因组序列(即所述制备物的序列
是异源的)。本领域技术人员已知在不存在克隆分离的情况中，病毒基因组的异源性或多样
性可随着病毒的再生而发生，如通过在病毒毒株的天然选择过程中发生的同源重组事件而
发生(Plotkin&Orenstein(eds)“Recombinant Vaccinia Virus Vaccines”in Vaccines，
rd
3 edition(1999))。
[0115] 如本文所用，病毒混合物是一种病毒制备物，其含有基因组序列不同的许多病毒颗粒。所述病毒混合物可以通过用两或多个不同病毒毒株或者一个病毒毒株和基因组DNA
或克隆的DNA感染培养系统如宿主细胞，随后对所得病毒进行繁殖和纯化而获得。对于本
发明而言，LIVP病毒制备物可包括通过繁殖用LIVP毒株及另一病毒、基因组DNA或克隆的
DNA感染细胞，及随后从培养物中分离病毒制备物而获得的病毒混合物，其中所述制备物含
有通过感染产生的后代病毒。例如，另一病毒毒株可以是痘病毒，如禽痘病毒，粘液瘤病毒
或其它痘苗病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒
(EBV)、嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病毒)、多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；以
及单链DNA病毒，如细小病毒。另一病毒可以是减毒的病毒、溶瘤病毒或者具有已知的抗肿
瘤活性和/或中等至轻度毒性的其它病毒。
或克隆的DNA感染培养系统如宿主细胞，随后对所得病毒进行繁殖和纯化而获得。对于本
发明而言，LIVP病毒制备物可包括通过繁殖用LIVP毒株及另一病毒、基因组DNA或克隆的
DNA感染细胞，及随后从培养物中分离病毒制备物而获得的病毒混合物，其中所述制备物含
有通过感染产生的后代病毒。例如，另一病毒毒株可以是痘病毒，如禽痘病毒，粘液瘤病毒
或其它痘苗病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒
(EBV)、嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病毒)、多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；以
及单链DNA病毒，如细小病毒。另一病毒可以是减毒的病毒、溶瘤病毒或者具有已知的抗肿
瘤活性和/或中等至轻度毒性的其它病毒。
[0116] 如本文所用，“病毒”是指离开宿主细胞不能生长或复制的任何一大群感染性实体。病毒典型含有在遗传物质RNA或DNA核心周围的蛋白质外壳，但是没有半透膜，仅能在
活细胞中生长和增殖。病毒包括但不限于痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、
逆转录病毒、棒状病毒、乳头瘤病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、小核糖核酸
病毒、辛德毕斯病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、柯萨基病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、及西门利克森林病毒。
活细胞中生长和增殖。病毒包括但不限于痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、
逆转录病毒、棒状病毒、乳头瘤病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、小核糖核酸
病毒、辛德毕斯病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、柯萨基病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、及西门利克森林病毒。
[0117] 如本文所用，溶瘤病毒是指在患有肿瘤的对象中在肿瘤细胞中选择性复制的病毒。一些溶瘤病毒在感染肿瘤细胞之后可杀死该肿瘤细胞。例如，溶瘤病毒可通过裂解肿
瘤细胞或者诱导肿瘤细胞死亡而导致肿瘤细胞死亡。
瘤细胞或者诱导肿瘤细胞死亡而导致肿瘤细胞死亡。
[0119] 如本文所用，病毒的“毒性”(在本文也称作毒力或致病原性)是指在施用该病毒时对宿主的有害或毒性作用。对于溶瘤病毒，如LIVP，病毒的毒性与其在非肿瘤器官或组织
中的积累相关，该积累可影响宿主的存活或者导致有害或毒性作用。毒性可以通过评估指
示毒性的一或多个参数进行测量。这些参数包括在非肿瘤组织中的积累及对于已经施用该
病毒的对象的存活或健康的影响，如对体重的影响。
中的积累相关，该积累可影响宿主的存活或者导致有害或毒性作用。毒性可以通过评估指
示毒性的一或多个参数进行测量。这些参数包括在非肿瘤组织中的积累及对于已经施用该
病毒的对象的存活或健康的影响，如对体重的影响。
[0120] 如本文所用，“指示毒性的参数”是指与其毒性、毒力或致病原性相关的由病毒介导的性质。指示毒性的参数通常在施用对象时在体内评估。典型的指示毒性的参数包括但
不限于对象的存活降低，体重降低，发热，皮疹，过敏反应，疲乏，腹痛，对象体内免疫应答的诱导及痘痕形成。评估任何上述参数或本领域技术人员已知的其它毒性性质的测定或测量
法在本说明书中描述或者为本领域技术人员已知。因此，在宿主中介导任一或多种上述活
性或性质的病毒呈现出一定程度的毒性。
不限于对象的存活降低，体重降低，发热，皮疹，过敏反应，疲乏，腹痛，对象体内免疫应答的诱导及痘痕形成。评估任何上述参数或本领域技术人员已知的其它毒性性质的测定或测量
法在本说明书中描述或者为本领域技术人员已知。因此，在宿主中介导任一或多种上述活
性或性质的病毒呈现出一定程度的毒性。
[0121] 如本文所用，“降低的毒性”是指在将病毒施用宿主时的毒性或有害作用与未用该病毒处理的宿主相比或者与施用另一参照或对照病毒的宿主相比减弱或减少。对于本发明
的目的，典型的参照或对照病毒是称作GLV-1h68的LIVP病毒。毒性是否降低或减少可以
通过评估病毒及如果需要也评估对照或参照病毒对于指示毒性的参数的作用而确定。应理
解为当对比两或多个病毒的活性时，在体外测定中使用的或者在体内施用的病毒的量(例
如pfu)是相同或相似的，并且体外测定或体内评估的条件(例如体内给药方案)是相同或
相似的。例如，当对比在体内施用病毒和对照或参照病毒的作用时，所述对象是相同物种、
大小、性别的，并且所述病毒是在相同或相似给药方案下以相同或相似量施用的。特别地，
具有降低的毒性的病毒可意味着当将该病毒施用于宿主时，如治疗疾病，该病毒在宿主的
非肿瘤器官和组织中不积累至导致损害或伤害宿主的程度，或者其使宿主的存活与对照或
参照病毒相比至更高程度。例如，具有降低的毒性的病毒包括在治疗期间不导致对象死亡
的病毒。
的目的，典型的参照或对照病毒是称作GLV-1h68的LIVP病毒。毒性是否降低或减少可以
通过评估病毒及如果需要也评估对照或参照病毒对于指示毒性的参数的作用而确定。应理
解为当对比两或多个病毒的活性时，在体外测定中使用的或者在体内施用的病毒的量(例
如pfu)是相同或相似的，并且体外测定或体内评估的条件(例如体内给药方案)是相同或
相似的。例如，当对比在体内施用病毒和对照或参照病毒的作用时，所述对象是相同物种、
大小、性别的，并且所述病毒是在相同或相似给药方案下以相同或相似量施用的。特别地，
具有降低的毒性的病毒可意味着当将该病毒施用于宿主时，如治疗疾病，该病毒在宿主的
非肿瘤器官和组织中不积累至导致损害或伤害宿主的程度，或者其使宿主的存活与对照或
参照病毒相比至更高程度。例如，具有降低的毒性的病毒包括在治疗期间不导致对象死亡
的病毒。
[0122] 如本文所用，病毒在特定组织中的积累是指在将病毒施用于宿主足以感染宿主器官或组织的一段时间之后，该病毒在宿主生物体的特定组织的分布。正如本领域技术人员
所知，病毒的感染时间根据病毒、器官或组织、宿主的免疫活性剂病毒的剂量而变化。通常
地，积累可以在病毒感染后少于1天、大约1天至大约2、3、4、5、6或7天，大约1周至大约
2、3或4周，大约1个月至大约2、3、4、5、6个月或更长时间的时间点确定。对于本发明，病
毒优先在宿主的免疫豁免的组织中积累，如炎症组织或肿瘤组织，但是从其它组织和器官
如非肿瘤组织中清除，该病毒的毒性是轻度或者可耐受程度，至多也不致命。
所知，病毒的感染时间根据病毒、器官或组织、宿主的免疫活性剂病毒的剂量而变化。通常
地，积累可以在病毒感染后少于1天、大约1天至大约2、3、4、5、6或7天，大约1周至大约
2、3或4周，大约1个月至大约2、3、4、5、6个月或更长时间的时间点确定。对于本发明，病
毒优先在宿主的免疫豁免的组织中积累，如炎症组织或肿瘤组织，但是从其它组织和器官
如非肿瘤组织中清除，该病毒的毒性是轻度或者可耐受程度，至多也不致命。
[0123] 如本文所用，“优先积累”是指病毒在第一个位置比在第二个位置以更高水平积累(即在第一个位置病毒颗粒的浓度或效价高于在第二个位置病毒颗粒的浓度)。因此，相对
于正常组织或器官优先在免疫豁免组织(躲避免疫系统的组织)如炎症组织和肿瘤组织中
积累的病毒，是指与在正常组织或器官中的病毒积累相比，在免疫豁免组织如肿瘤中以更
高水平(即浓度或病毒效价)积累的病毒。
于正常组织或器官优先在免疫豁免组织(躲避免疫系统的组织)如炎症组织和肿瘤组织中
积累的病毒，是指与在正常组织或器官中的病毒积累相比，在免疫豁免组织如肿瘤中以更
高水平(即浓度或病毒效价)积累的病毒。
[0124] 如本文所用，“抗肿瘤活性”或者“抗肿瘤发生的”是指病毒毒株在对象中在体外或体内阻止或抑制肿瘤形成或生长。抗肿瘤活性可以通过评估指示抗肿瘤活性的一或多个参
数而确定。
数而确定。
[0125] 如本文所用，“指示抗肿瘤活性或抗肿瘤发生活性的参数”是指由病毒介导的与抗肿瘤活性相关的性质。指示抗肿瘤活性的参数可以在施用于对象时在体外或体内评估。典
型的指示抗肿瘤活性的参数包括但不限于肿瘤细胞的感染性，病毒在肿瘤组织中的积累，
肿瘤细胞中病毒核酸复制，肿瘤细胞中病毒产生，肿瘤细胞中病毒基因表达，肿瘤细胞的细
胞毒性，肿瘤细胞选择性，肿瘤细胞类型选择性，降低的肿瘤大小，增加的肿瘤体积，降低的
肿瘤重量及特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答的起始。评估任何上述参数或其它抗肿瘤发
生性质的实验是本领域技术人员已知的。本文描述了典型的典型的实验。因此，呈现出任
一或多种上述活性或性质的病毒呈现出抗肿瘤活性。
型的指示抗肿瘤活性的参数包括但不限于肿瘤细胞的感染性，病毒在肿瘤组织中的积累，
肿瘤细胞中病毒核酸复制，肿瘤细胞中病毒产生，肿瘤细胞中病毒基因表达，肿瘤细胞的细
胞毒性，肿瘤细胞选择性，肿瘤细胞类型选择性，降低的肿瘤大小，增加的肿瘤体积，降低的
肿瘤重量及特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答的起始。评估任何上述参数或其它抗肿瘤发
生性质的实验是本领域技术人员已知的。本文描述了典型的典型的实验。因此，呈现出任
一或多种上述活性或性质的病毒呈现出抗肿瘤活性。
[0126] 如本文所用，“更高的”或“改良的”抗肿瘤活性或抗肿瘤发生能力是指病毒毒株能在体外或体内阻止或抑制对象中肿瘤的形成或生长至高于参照或对照病毒的程度或者高
于未用病毒处理的程度。对于本发明，典型的参照或对照病毒是称作GLV-1h68的LIVP病
毒。抗肿瘤活性是否“更高”或“改良”可以通过评估病毒，如果需要也评估对照或参照病
毒对指示抗肿瘤活性的参数的作用而确定。应理解为当对比两或多个不同病毒的活性时，
体外测定中使用的或者体内施用的病毒的量(如pfu)是相同或相似的，及在体外测定或体
内评估的条件(如体内给药方案)是相同或相似的。
于未用病毒处理的程度。对于本发明，典型的参照或对照病毒是称作GLV-1h68的LIVP病
毒。抗肿瘤活性是否“更高”或“改良”可以通过评估病毒，如果需要也评估对照或参照病
毒对指示抗肿瘤活性的参数的作用而确定。应理解为当对比两或多个不同病毒的活性时，
体外测定中使用的或者体内施用的病毒的量(如pfu)是相同或相似的，及在体外测定或体
内评估的条件(如体内给药方案)是相同或相似的。
[0127] 如本文所用，异源核酸(也称作外源核酸或外来核酸)是指不是由表达其的生物体或病毒在体内正常产生的，或者由生物体或病毒在不同的基因座产生的核酸，或者该
核酸介导或编码中介物，通过影响转录、翻译或者其它可调生物化学过程而改变内源核酸
(如DNA)表达。因此，异源核酸通常对于其导入的病毒而言不是天然内源的。异源核酸可
以是指来自另一病毒的核酸分子，该病毒在相同生物体或另一生物体中，包括相同物种或
另一物种。然而，异源核酸可以是内源的，不过是在不同基因座中表达的或者其表达或序列
改变了的核酸(如质粒)。因此，异源核酸包括不与基因组中发现的对应的核酸分子(如
DNA)精确定向或定位存在的核酸分子。通常地，但是非必然，这种核酸编码不是由所述病
毒正常产生的或者同样不是其表达的病毒中的RNA和蛋白质。任何核酸(如DNA)在病毒
中表达，而本领域技术人员承认或认为该核酸相对于该病毒是异源、外源或外来的，则该核
酸在本文涵盖在异源核酸范围内。异源核酸的范例包括但不限于编码外源肽/蛋白质的核
酸，该肽/蛋白包括诊断剂和/或治疗剂。由异源核酸编码的蛋白质可以在病毒内表达，分
泌或表达在已经导入异源核酸的病毒的表面上。
核酸介导或编码中介物，通过影响转录、翻译或者其它可调生物化学过程而改变内源核酸
(如DNA)表达。因此，异源核酸通常对于其导入的病毒而言不是天然内源的。异源核酸可
以是指来自另一病毒的核酸分子，该病毒在相同生物体或另一生物体中，包括相同物种或
另一物种。然而，异源核酸可以是内源的，不过是在不同基因座中表达的或者其表达或序列
改变了的核酸(如质粒)。因此，异源核酸包括不与基因组中发现的对应的核酸分子(如
DNA)精确定向或定位存在的核酸分子。通常地，但是非必然，这种核酸编码不是由所述病
毒正常产生的或者同样不是其表达的病毒中的RNA和蛋白质。任何核酸(如DNA)在病毒
中表达，而本领域技术人员承认或认为该核酸相对于该病毒是异源、外源或外来的，则该核
酸在本文涵盖在异源核酸范围内。异源核酸的范例包括但不限于编码外源肽/蛋白质的核
酸，该肽/蛋白包括诊断剂和/或治疗剂。由异源核酸编码的蛋白质可以在病毒内表达，分
泌或表达在已经导入异源核酸的病毒的表面上。
[0128] 如本文所用，含有异源核酸的病毒克隆毒株或病毒毒株制备物是指这样的毒株，其含有在亲代克隆毒株中不存在的核酸。例如，其序列如SEQ ID NO：10所示的病毒是克隆
毒株，但是称作GLV-1h68的SEQ ID NO：9所示的病毒含有异源核酸，如称作RUC-GFP的插
入体。
毒株，但是称作GLV-1h68的SEQ ID NO：9所示的病毒含有异源核酸，如称作RUC-GFP的插
入体。
[0129] 如本文所用，异源蛋白质或异源多肽(也称作外源蛋白质、外源多肽、外来蛋白质或外来多肽)是指不是由病毒正常产生的蛋白质。
[0130] 如本文所用，异源核酸与核苷酸序列的调节子和效应子如启动子、增强子、转录和反义终止位点及其它信号序列的可操纵连接，是指这种核酸(如DNA)与这种核苷酸序列之
间的关系。因此，可操纵地连接或操纵关联是指核酸如DNA与核苷酸的调节或效应序列如
启动子、增强子、转录和反义终止位点及其它信号序列的功能关系。例如，异源DNA与启动
子的可操纵连接是指DNA与启动子之间的物理关系，于是这个DNA的转录通过特异性识别、
结合及转录该DNA的RNA聚合酶从该启动子起始。为了优化表达和/或转录，必须除去、添
加或改变克隆的5’非翻译区，以消除额外的、潜在不合适的可变翻译起始(即开始)密码
子或者在转录或翻译水平可干扰或降低表达的其它序列。此外，共有的核糖体结合位点可
以直接地插入在起始密码子的5’端，并且可以增强表达(见例如Kozak J.Biol.Chem.266：
19867-19870(1991)及Shine and Delgarno，Nature254(5495)：34-38(1975))。这种修饰
的可取性(或者需求)可以根据经验确定。
间的关系。因此，可操纵地连接或操纵关联是指核酸如DNA与核苷酸的调节或效应序列如
启动子、增强子、转录和反义终止位点及其它信号序列的功能关系。例如，异源DNA与启动
子的可操纵连接是指DNA与启动子之间的物理关系，于是这个DNA的转录通过特异性识别、
结合及转录该DNA的RNA聚合酶从该启动子起始。为了优化表达和/或转录，必须除去、添
加或改变克隆的5’非翻译区，以消除额外的、潜在不合适的可变翻译起始(即开始)密码
子或者在转录或翻译水平可干扰或降低表达的其它序列。此外，共有的核糖体结合位点可
以直接地插入在起始密码子的5’端，并且可以增强表达(见例如Kozak J.Biol.Chem.266：
19867-19870(1991)及Shine and Delgarno，Nature254(5495)：34-38(1975))。这种修饰
的可取性(或者需求)可以根据经验确定。
[0131] 如本文所用，异源启动子是指不是在野生型生物体或病毒中正常发现的或者与野生型生物体或病毒相比在不同基因座的启动子。异源启动子通常对于其导入之中的病毒不
是内源的，而是得自另一病毒或者是合成制备的。异源启动子可以是指来自相同生物体或
另一生物体、包括相同物种或另一物种的另一病毒的启动子。然而，异源启动子可以是内源
的，但是其序列有改变的或者在不同基因座(例如在基因组中不同位置或在质粒上)出现
的启动子。因此，异源启动子包括与基因组中发现的对应启动子相比其精确方向或位置不
完全相同的启动子。
是内源的，而是得自另一病毒或者是合成制备的。异源启动子可以是指来自相同生物体或
另一生物体、包括相同物种或另一物种的另一病毒的启动子。然而，异源启动子可以是内源
的，但是其序列有改变的或者在不同基因座(例如在基因组中不同位置或在质粒上)出现
的启动子。因此，异源启动子包括与基因组中发现的对应启动子相比其精确方向或位置不
完全相同的启动子。
[0132] 合成的启动子是异源启动子，其具有非天然发现的核苷酸序列。合成的启动子可以是具有合成的序列或者衍生自天然启动子或其一部分的序列的核酸分子。合成的启动子
也可以是杂种启动子，由衍生自不同的天然启动子的不同元件组成。
也可以是杂种启动子，由衍生自不同的天然启动子的不同元件组成。
[0134] 如本文所用，施用频率是指在施用周期期间施用的物质的次数。例如，施用频率可以是天、周或月。例如，频率可以是在施用期间施用一次，两次，三次，四次，五次，六次或七次。所述频率可以是指在施用周期期间的连续天数。特定的频率与治疗的特定疾病或病症
相关。
相关。
[0135] 如本文所用，“施用周期”是指重复的施用病毒的给药方案，其在连续的施用中重复。例如，典型的施用周期是28天循环。
[0136] 如本文所用，治疗患有病症、失调或疾病的对象是指改善或者另外有益地改变所述病症、失调或疾病的症状的任何方式。治疗涵盖本发明描述和提供的病毒的任何药物学
应用。
应用。
[0137] 如本文所用，疾病或失调是指生物体中得自如感染或遗传缺陷的病理学状况，特征在于可鉴别的症状。如本发明所述典型的疾病是肿瘤疾病，如癌症。
[0138] 如本文所用，肿瘤疾病是指包括癌症的任何病症，包括肿瘤发生、生长、转移和进展。
[0139] 如本文所用，癌症是以任何类型恶性肿瘤为原因或者特征的疾病，包括转移癌，淋巴肿瘤和血癌。典型的癌症包括但不限于白血病，淋巴瘤，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，
子宫颈癌，膀胱癌，前列腺癌，胶质瘤，腺癌，肝癌和皮肤癌。在人体中的癌症例如包括膀胱
癌，乳腺癌，前列腺癌，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌和CNS癌(如胶质瘤)，子宫颈癌，绒毛膜癌结肠癌和直肠癌，结缔组织癌，消化系统癌症；子宫内膜癌，食管癌；眼癌；
头颈癌；胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肺癌(如小细胞和非小细胞肺癌)；淋巴
瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤，成神经细胞瘤，口腔癌(如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌，眼癌；横纹肌肉瘤；直肠癌，肾癌，呼吸系统癌；肉瘤，皮肤癌；胃癌，睾丸癌，甲状腺癌；子宫癌，泌尿系统癌，以及其它癌和肉瘤。通常在狗、猫及其它宠物中诊
断的癌症例如包括但不限于淋巴肉瘤，骨肉瘤，乳腺肿瘤，肥大细胞瘤，脑肿瘤，黑素瘤，腺
鳞癌，肺类癌，支气管腺癌，细支气管腺癌，纤维瘤，粘液软骨瘤，肺肉瘤，神经肉瘤，骨瘤，乳头瘤，眼癌，Ewing′s肉瘤，Wilm′s肿瘤，Burkitt′s淋巴瘤，小神经胶质细胞瘤，成神
经细胞瘤，破骨细胞瘤，口腔瘤形成，纤维肉瘤，骨肉瘤和横纹肌肉瘤，生殖器鳞状细胞癌，
可传染性性病瘤，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，睾丸支持细胞瘤，血管外皮细胞瘤，组织细胞瘤，
绿色瘤(如粒细胞性肉瘤)，角膜乳头瘤，角膜鳞状细胞癌，血管肉瘤，胸膜间皮瘤，基底细
胞瘤，胸腺瘤，胃肿瘤，肾上腺癌，口腔乳头瘤病，血管内皮瘤和囊腺瘤，滤泡性淋巴瘤，肠道淋巴肉瘤，纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌。典型的在啮齿类动物如雪貂中诊断的癌症包括但不
限于胰岛瘤，淋巴瘤，肉瘤，神经瘤，胰岛细胞肿瘤，胃MALT淋巴瘤及胃腺癌。典型的影响农
业牲畜的瘤形成包括但不限于白血病，血管外皮细胞瘤和牛眼瘤形成(在牛中)；包皮纤维
肉瘤，溃疡性鳞状细胞癌，包皮癌，结缔组织瘤形成和肥大细胞瘤(在马中)；肝细胞性肝癌
(在猪中)；淋巴瘤和肺腺瘤病(在绵羊中)；肺肉瘤，淋巴瘤，Rous肉瘤，网状内皮组织增殖
症，纤维肉瘤，肾母细胞瘤，B细胞淋巴瘤和类淋巴白血病(在禽类中)；眼癌，肝脏瘤形成，
淋巴肉瘤(成淋巴细胞性淋巴瘤)，浆细胞样白血病和鱼鳔肉瘤(在鱼中)，干酪样淋巴结
炎(CLA)：由假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)细菌导致的绵羊和
山羊的慢性，传染性，接触性疾病，及由南非羊肺炎导致的绵羊的传染性肺部肿瘤。
子宫颈癌，膀胱癌，前列腺癌，胶质瘤，腺癌，肝癌和皮肤癌。在人体中的癌症例如包括膀胱
癌，乳腺癌，前列腺癌，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌和CNS癌(如胶质瘤)，子宫颈癌，绒毛膜癌结肠癌和直肠癌，结缔组织癌，消化系统癌症；子宫内膜癌，食管癌；眼癌；
头颈癌；胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肺癌(如小细胞和非小细胞肺癌)；淋巴
瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤，成神经细胞瘤，口腔癌(如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌，眼癌；横纹肌肉瘤；直肠癌，肾癌，呼吸系统癌；肉瘤，皮肤癌；胃癌，睾丸癌，甲状腺癌；子宫癌，泌尿系统癌，以及其它癌和肉瘤。通常在狗、猫及其它宠物中诊
断的癌症例如包括但不限于淋巴肉瘤，骨肉瘤，乳腺肿瘤，肥大细胞瘤，脑肿瘤，黑素瘤，腺
鳞癌，肺类癌，支气管腺癌，细支气管腺癌，纤维瘤，粘液软骨瘤，肺肉瘤，神经肉瘤，骨瘤，乳头瘤，眼癌，Ewing′s肉瘤，Wilm′s肿瘤，Burkitt′s淋巴瘤，小神经胶质细胞瘤，成神
经细胞瘤，破骨细胞瘤，口腔瘤形成，纤维肉瘤，骨肉瘤和横纹肌肉瘤，生殖器鳞状细胞癌，
可传染性性病瘤，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，睾丸支持细胞瘤，血管外皮细胞瘤，组织细胞瘤，
绿色瘤(如粒细胞性肉瘤)，角膜乳头瘤，角膜鳞状细胞癌，血管肉瘤，胸膜间皮瘤，基底细
胞瘤，胸腺瘤，胃肿瘤，肾上腺癌，口腔乳头瘤病，血管内皮瘤和囊腺瘤，滤泡性淋巴瘤，肠道淋巴肉瘤，纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌。典型的在啮齿类动物如雪貂中诊断的癌症包括但不
限于胰岛瘤，淋巴瘤，肉瘤，神经瘤，胰岛细胞肿瘤，胃MALT淋巴瘤及胃腺癌。典型的影响农
业牲畜的瘤形成包括但不限于白血病，血管外皮细胞瘤和牛眼瘤形成(在牛中)；包皮纤维
肉瘤，溃疡性鳞状细胞癌，包皮癌，结缔组织瘤形成和肥大细胞瘤(在马中)；肝细胞性肝癌
(在猪中)；淋巴瘤和肺腺瘤病(在绵羊中)；肺肉瘤，淋巴瘤，Rous肉瘤，网状内皮组织增殖
症，纤维肉瘤，肾母细胞瘤，B细胞淋巴瘤和类淋巴白血病(在禽类中)；眼癌，肝脏瘤形成，
淋巴肉瘤(成淋巴细胞性淋巴瘤)，浆细胞样白血病和鱼鳔肉瘤(在鱼中)，干酪样淋巴结
炎(CLA)：由假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)细菌导致的绵羊和
山羊的慢性，传染性，接触性疾病，及由南非羊肺炎导致的绵羊的传染性肺部肿瘤。
[0140] 如本文所用，“转移”是指癌症从身体的一部分至另一部分的传播。例如，在转移的过程中，恶性细胞可以在恶性细胞从中出现的原发肿瘤部位传播，移动至淋巴管和血管中，
其将细胞转运至生物体内的正常组织，在此所述细胞继续增殖。由已经转移传播的细胞形
成的肿瘤称作“转移瘤”、“继发肿瘤”或者“转移”。
其将细胞转运至生物体内的正常组织，在此所述细胞继续增殖。由已经转移传播的细胞形
成的肿瘤称作“转移瘤”、“继发肿瘤”或者“转移”。
[0141] 如本文所用，对患有肿瘤疾病、包括肿瘤或转移瘤的对象的治疗，是指其中肿瘤病的症状得以减轻或另外有益地改变的任何治疗方式。典型地，对象中肿瘤或转移瘤的治疗
涵盖了导致如下改变的任何治疗方式：肿瘤生长减缓、肿瘤细胞裂解、肿瘤大小降低、预防
新肿瘤生长、或者预防原发转移，包括已知肿瘤血管化、肿瘤细胞分化、肿瘤细胞迁移或者
基底膜或胞外基质降解。
涵盖了导致如下改变的任何治疗方式：肿瘤生长减缓、肿瘤细胞裂解、肿瘤大小降低、预防
新肿瘤生长、或者预防原发转移，包括已知肿瘤血管化、肿瘤细胞分化、肿瘤细胞迁移或者
基底膜或胞外基质降解。
[0142] 如本文所用，特定病症的改善或减轻，如通过施用特定的药物，是指任何减轻，无论永久还是暂时的，持久还是短暂的，其可归因于或者与所述组合物的施用相关。
[0143] 如本文所用，病毒或化合物治疗特定疾病的有效量或者治疗有效量是改善或者以某些方式减轻与该疾病相关症状的量。所述有效量根据个体不同而变化，依赖于许多因素，
包括但不限于年龄、体重、患者的整体身体状况以及疾病的严重度。治疗有效量可以作为单
一剂量施用，或者可以根据给药方案以多剂量施用，所述剂量是有效的。所述剂量可以治愈
疾病，但是典型是为了改善疾病的症状而施用的。可需要重复施用以实现希望的症状减轻。
包括但不限于年龄、体重、患者的整体身体状况以及疾病的严重度。治疗有效量可以作为单
一剂量施用，或者可以根据给药方案以多剂量施用，所述剂量是有效的。所述剂量可以治愈
疾病，但是典型是为了改善疾病的症状而施用的。可需要重复施用以实现希望的症状减轻。
[0144] 如本文所用，治疗肿瘤病、包括肿瘤或转移瘤的病毒或化合物的有效量或者治疗有效量是改善或者以某些方式减轻与肿瘤病相关症状的量，包括但不限于减缓肿瘤生长，
肿瘤细胞裂解，肿瘤大小降低，预防新肿瘤生长，或者预防原发肿瘤的转移。
肿瘤细胞裂解，肿瘤大小降低，预防新肿瘤生长，或者预防原发肿瘤的转移。
[0145] 如本文所用，关于肿瘤治疗的“治疗指数”是指治疗的能力，包括用本发明提供的病毒治疗或者与本发明提供的病毒的组合治疗，以导致肿瘤生长减慢和/或肿瘤体积降
低。典型地，治疗指数以与对照治疗如未用病毒治疗的比率表示。治疗指数越高，表示减慢
肿瘤生长和/或降低肿瘤体积的治疗更有效。
低。典型地，治疗指数以与对照治疗如未用病毒治疗的比率表示。治疗指数越高，表示减慢
肿瘤生长和/或降低肿瘤体积的治疗更有效。
[0146] 如本文所用，“延迟的复制”是指治疗性病毒在肿瘤中不能有效复制。呈现出延迟复制的治疗性病毒可具有在肿瘤细胞中复制的能力，但是以较慢的复制速度复制。在感染
肿瘤之后在肿瘤中呈现出延迟复制的病毒与未呈现出延迟复制的病毒的治疗效力不一样。
肿瘤之后在肿瘤中呈现出延迟复制的病毒与未呈现出延迟复制的病毒的治疗效力不一样。
[0147] 如本文所用，术语“治疗性病毒”是指用于治疗疾病或病症如肿瘤病如癌症、肿瘤和/或转移瘤或者炎症或者创伤或者用于诊断或者用于治疗和诊断这二者而施用的病毒。
通常地，本发明的治疗性病毒是呈现出抗肿瘤活性和最小毒性的病毒。
通常地，本发明的治疗性病毒是呈现出抗肿瘤活性和最小毒性的病毒。
[0148] 如本文所用，肿瘤(tumor)，也称作瘤(neoplasm)，是当细胞以异常高速度增殖时产生的一种异常组织团块。肿瘤可示出部分或全部缺失正常组织的结构组构及与功能协
调。肿瘤可以是良性(非癌性)或者恶性的(癌性)。如本文所用，肿瘤是指涵盖了造血组
织肿瘤以及实体肿瘤。
调。肿瘤可以是良性(非癌性)或者恶性的(癌性)。如本文所用，肿瘤是指涵盖了造血组
织肿瘤以及实体肿瘤。
[0149] 恶性肿瘤可以大体分为三种主要类型。癌瘤是从上皮结构(如乳腺、前列腺、肺、结肠、胰腺)中产生的恶性肿瘤。肉瘤是源自结缔组织或者间充质细胞如肌肉、软骨、脂肪
或骨的恶性肿瘤。白血病和淋巴瘤是影响造血组织(关于血细胞形成的结构)包括免疫系
统成分的恶性肿瘤。其它恶性肿瘤包括但不限于神经系统肿瘤(例如纤维神经瘤)，生殖细
胞肿瘤，及母细胞(blastic)肿瘤。
或骨的恶性肿瘤。白血病和淋巴瘤是影响造血组织(关于血细胞形成的结构)包括免疫系
统成分的恶性肿瘤。其它恶性肿瘤包括但不限于神经系统肿瘤(例如纤维神经瘤)，生殖细
胞肿瘤，及母细胞(blastic)肿瘤。
[0150] 如本文所用，增生性病症包括涉及细胞异常增殖的任何病症(即与正常组织生长相比细胞增殖更快速)，例如但不限于肿瘤疾病。
[0151] 如本文所用，“肿瘤细胞”是肿瘤细一部分的任何细胞。典型地，本发明提供的病毒优先感染对象中的肿瘤细胞而非正常细胞。
[0152] 如本文所用，“转移细胞”是具有转移潜力的细胞。转移细胞具有从对象的第一个转移的能力及可以在不同部位植入组织，在此部位形成第二个肿瘤。
[0153] 如本文所用，“肿瘤发生细胞”是当导入对象的合适部位中时可以形成肿瘤的细胞。所述细胞可以是非转移或转移的。
[0154] 如本文所用，“正常细胞”是非衍生自肿瘤的细胞。
[0155] 如本文所用，术语“细胞”是指活的生物体的结构和功能的基本单位，与生物科学中的通常理解相同。细胞可以是单细胞生物，其是自足的及可以独立于其它细胞的功能整
体而存在。细胞也可以是当未分离自其天然存在的环境中时，是由一种以上类型细胞组成
的多细胞生物体的一部分。这种细胞，可被认为是“非生物体”或“非生物”细胞，通常是专
门化的，其仅履行多细胞生物作为整体所履行的功能的亚集合。因此，这种类型的细胞不是
单细胞生物。这种细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括动物细胞，如哺乳动物细胞，人细
胞和非人动物细胞或者非人哺乳动物细胞。动物细胞可包括可在动物中发现的任何动物来
源细胞。因此，动物细胞包括如组成动物的各种器官、组织和系统的细胞。
体而存在。细胞也可以是当未分离自其天然存在的环境中时，是由一种以上类型细胞组成
的多细胞生物体的一部分。这种细胞，可被认为是“非生物体”或“非生物”细胞，通常是专
门化的，其仅履行多细胞生物作为整体所履行的功能的亚集合。因此，这种类型的细胞不是
单细胞生物。这种细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括动物细胞，如哺乳动物细胞，人细
胞和非人动物细胞或者非人哺乳动物细胞。动物细胞可包括可在动物中发现的任何动物来
源细胞。因此，动物细胞包括如组成动物的各种器官、组织和系统的细胞。
[0156] 如本文所用，“分离的细胞”是在体外存在的细胞，与其最初衍生自之中的生物体分离。
[0157] 如本文所用，“细胞系”是衍生自在体外能稳定生长许多世代的原代细胞的一群细胞。细胞系通常被称作“永生化”细胞系以描述其在体外持续增殖的能力。
[0158] 如本文所用，“肿瘤细胞系”是最初衍生自肿瘤的一群细胞。这种细胞典型已经经历了在体内的一些改变，由此其理论上在培养中具有无限生长能力；与原代细胞不同，其仅
可以培养有限的一段时间。此外，这种细胞在被注射进易感动物体内之后优选可以形成肿
瘤。
可以培养有限的一段时间。此外，这种细胞在被注射进易感动物体内之后优选可以形成肿
瘤。
[0159] 如本文所用，“原代细胞”是已经分离自对象的细胞。
[0160] 如本文所用，“宿主细胞”或“靶细胞”可互换使用，是指可以由病毒感染的细胞。
[0161] 如本文所用，术语“组织”是指通常起作用以在生物体内进行特定功能的相似细胞的组合、集合或聚集体。
[0162] 如本文所用，术语免疫豁免的细胞和免疫豁免的组织是指这样的细胞和组织，如实体肿瘤，其从免疫系统中逃脱。通常地，将病毒施用对象激发从该对象清除病毒的免疫应
答。然而，免疫豁免的部位是免疫应答屏蔽或逃脱的，使得病毒存活及通常进行复制。免疫
豁免的组织包括增殖中的组织，如肿瘤组织。
答。然而，免疫豁免的部位是免疫应答屏蔽或逃脱的，使得病毒存活及通常进行复制。免疫
豁免的组织包括增殖中的组织，如肿瘤组织。
[0163] 如本文所用，治疗剂是改善疾病或病症的症状或改善疾病或病症的物质。治疗剂、治疗性化合物或者治疗方案包括常规的药物和药物疗法，包括进行治疗或预防的疫苗(即
降低获得特定疾病或病症的危险)，这些物质为本领域技术人员已知的且在本文中也有描
述。治疗肿瘤病的治疗剂包括但不限于抑制细胞生长或促进细胞死亡的成分，其可以被激
活以抑制细胞生长或促进细胞死亡，或者激活另一制剂以抑制细胞生长或促进细胞死亡。
用于本发明提供的方法中的治疗剂可以是例如抗癌剂。典型的治疗剂包括例如治疗性微
生物，如治疗性病毒和细菌、细胞因子、生长因子、光增敏剂、放射性同位素、毒素、抗转移剂物、信号调节物、抗癌抗生素、抗癌性抗体、血管发生抑制剂、放射性治疗、化疗化合物或者
其组合。
降低获得特定疾病或病症的危险)，这些物质为本领域技术人员已知的且在本文中也有描
述。治疗肿瘤病的治疗剂包括但不限于抑制细胞生长或促进细胞死亡的成分，其可以被激
活以抑制细胞生长或促进细胞死亡，或者激活另一制剂以抑制细胞生长或促进细胞死亡。
用于本发明提供的方法中的治疗剂可以是例如抗癌剂。典型的治疗剂包括例如治疗性微
生物，如治疗性病毒和细菌、细胞因子、生长因子、光增敏剂、放射性同位素、毒素、抗转移剂物、信号调节物、抗癌抗生素、抗癌性抗体、血管发生抑制剂、放射性治疗、化疗化合物或者
其组合。
[0164] 如本文所用，抗癌剂或化合物(可与“抗肿瘤或抗瘤剂”互换使用)是指用于抗癌治疗的任何物质或化合物。这些物质包括当单独使用或者与其它化合物或治疗组合使用时
可减轻、降低、改善、预防或者稳定或维持临床症状或者与肿瘤病、肿瘤和癌症相关的诊断
标记的缓和状态，并可用于本发明提供的方法、组合和组合物中。抗癌剂包括抗转移剂。典
型的抗癌剂包括但不限于化疗化合物(如毒素、烷化剂、亚硝基脲、抗癌抗生素、抗转移制
剂、抗有丝分裂剂、局部异构酶抑制剂)、细胞因子、生长因子、激素、光增敏剂、放射性同位素、信号调节物、抗癌抗体、抗癌寡肽、抗癌寡核苷酸(如反义RNA和siRNA)、血管发生抑制
剂、放射性治疗或者其组合。典型的化疗化合物包括但不限于Ara-C、顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、吉西他滨、喜树碱、伊立替康、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、长春新碱、5-氟尿嘧啶及氨甲
喋呤。如本文所用，除非特别指出，提及的抗癌或化疗剂包括多种抗癌或化疗剂的组合。
可减轻、降低、改善、预防或者稳定或维持临床症状或者与肿瘤病、肿瘤和癌症相关的诊断
标记的缓和状态，并可用于本发明提供的方法、组合和组合物中。抗癌剂包括抗转移剂。典
型的抗癌剂包括但不限于化疗化合物(如毒素、烷化剂、亚硝基脲、抗癌抗生素、抗转移制
剂、抗有丝分裂剂、局部异构酶抑制剂)、细胞因子、生长因子、激素、光增敏剂、放射性同位素、信号调节物、抗癌抗体、抗癌寡肽、抗癌寡核苷酸(如反义RNA和siRNA)、血管发生抑制
剂、放射性治疗或者其组合。典型的化疗化合物包括但不限于Ara-C、顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、吉西他滨、喜树碱、伊立替康、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、长春新碱、5-氟尿嘧啶及氨甲
喋呤。如本文所用，除非特别指出，提及的抗癌或化疗剂包括多种抗癌或化疗剂的组合。
[0165] 如本文所用，“化疗敏化剂”是调节、减弱、逆转或者影响细胞或生物体对指定化疗药物或化合物的抗性的物质。术语“调节物”、“调节剂”、“减毒物”、“减毒剂”或者“化疗增敏剂”可互换使用，是指“化疗敏化剂”。在一些实例中，化疗敏化剂也可以是化疗剂。典
型的化疗敏化剂包括但不限于放射，钙通道阻断剂(如异搏定)，钙调蛋白抑制剂(如三氟
吡啦嗪(trifluoperazine))，吲哚生物碱(如利血平)，喹啉(如奎宁)，亲溶酶体剂(如
氯喹)，类固醇(如孕酮)，三苯乙醇类似物(如三苯氧胺)，洗涤剂(如Cremophor EL)，
texaphyrins，及环形抗生素(如环孢菌素)。
型的化疗敏化剂包括但不限于放射，钙通道阻断剂(如异搏定)，钙调蛋白抑制剂(如三氟
吡啦嗪(trifluoperazine))，吲哚生物碱(如利血平)，喹啉(如奎宁)，亲溶酶体剂(如
氯喹)，类固醇(如孕酮)，三苯乙醇类似物(如三苯氧胺)，洗涤剂(如Cremophor EL)，
texaphyrins，及环形抗生素(如环孢菌素)。
[0166] 如本文所用，在肿瘤或其它免疫豁免部位产生的化合物是指在肿瘤或肿瘤环境中由于导入的病毒、通常是表达一或多个基因产物的重组病毒的存在而产生的任何化合物。
例如，在肿瘤中产生的化合物可例如是由重组多肽产生的编码的多肽或RNA，代谢物，或者
由重组多肽及肿瘤或免疫豁免的组织或细胞的细胞机构产生的化合物。
例如，在肿瘤中产生的化合物可例如是由重组多肽产生的编码的多肽或RNA，代谢物，或者
由重组多肽及肿瘤或免疫豁免的组织或细胞的细胞机构产生的化合物。
[0167] 如本文所用，对象包括任何生物体，包括考虑对其进行诊断、筛选、监测或治疗的动物。动物包括哺乳动物如灵长类动物和驯化动物。典型的灵长类动物是人。患者是指患
有疾病或者其疾病待确定或者经确定处于疾病危险中的对象，如哺乳动物、灵长类动物、人
或家畜对象。
有疾病或者其疾病待确定或者经确定处于疾病危险中的对象，如哺乳动物、灵长类动物、人
或家畜对象。
[0169] 如本文所用，载体(或者质粒)是指核酸构建体，其含有用于将异源核酸导入细胞中以表达所述核酸或核酸复制的分立的元件。所述载体典型保持附加型，但是可以设计为
实现基因或其一部分稳定整合进基因组染色体中。这种载体的选择和使用为本领域技术人
员熟知。表达载体包括能表达与调节序列可操纵地连接的DNA的载体，如启动子区域，其能
实现所述DNA片段的表达。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重
组病毒或其它载体，在导入合适的宿主细胞中时使得克隆的DNA表达。合适的表达载体为
本领域技术人员熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些载体，及保持附加
型的那些载体，或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
实现基因或其一部分稳定整合进基因组染色体中。这种载体的选择和使用为本领域技术人
员熟知。表达载体包括能表达与调节序列可操纵地连接的DNA的载体，如启动子区域，其能
实现所述DNA片段的表达。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重
组病毒或其它载体，在导入合适的宿主细胞中时使得克隆的DNA表达。合适的表达载体为
本领域技术人员熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些载体，及保持附加
型的那些载体，或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
[0170] 如本文所用，术语“病毒载体”根据其在本领域公认的含义使用。其是指核酸载体，包括至少一个病毒源元件，并可以包装进病毒载体颗粒中。所述病毒载体颗粒可用于将
DNA、RNA或者其它核酸转移至在体外或体内的细胞中。病毒载体包括但不限于痘病毒载体
(如痘苗病毒载体)、逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体(如HSV)、杆状病毒载体、
巨细胞病毒(CMV)载体、乳头瘤病毒载体、猿猴病毒(SV40)载体、西门利克森林病毒载体、
噬菌体载体、腺病毒载体及腺相关病毒(AAV)载体。
DNA、RNA或者其它核酸转移至在体外或体内的细胞中。病毒载体包括但不限于痘病毒载体
(如痘苗病毒载体)、逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体(如HSV)、杆状病毒载体、
巨细胞病毒(CMV)载体、乳头瘤病毒载体、猿猴病毒(SV40)载体、西门利克森林病毒载体、
噬菌体载体、腺病毒载体及腺相关病毒(AAV)载体。
[0171] 如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。核酸可编码基因产物，如多肽、调节RNA、microRNA、siRNA和功能
RNA。
RNA。
[0172] 如本文所用，在提及反义寡核苷酸时，与RNA的至少一部分互补的序列是指具有足够互补性的能与所述RNA杂交、通常在中等或高严格条件下杂交形成稳定双链体的核苷
酸序列；在双链反义核酸的情况中，可因此测定双链DNA(即dsRNA)的单一链，或者可以测
定三链体形成。杂交的能力依赖于互补程度及反义核酸的长度。通常地，杂交核酸越长，与
其可含有的编码RNA的碱基错配越多，仍形成稳定的双链体(或者三链体，根据具体情况而
定)。本领域技术人员可以确定错配的可耐受程度，通过使用标准程序确定杂交的复合物的
解链点而确定。
酸序列；在双链反义核酸的情况中，可因此测定双链DNA(即dsRNA)的单一链，或者可以测
定三链体形成。杂交的能力依赖于互补程度及反义核酸的长度。通常地，杂交核酸越长，与
其可含有的编码RNA的碱基错配越多，仍形成稳定的双链体(或者三链体，根据具体情况而
定)。本领域技术人员可以确定错配的可耐受程度，通过使用标准程序确定杂交的复合物的
解链点而确定。
[0173] 如本文所用，可检测的标记或者可检测的组分或者诊断组分(也称作成像标记、成像剂或者成像组分)是指一种原子、分子或者组合物，其中所述原子、分子或组合物的存
在可以直接或间接测量到。可检测标记可用于使本发明提供的任一或多个病毒成像。可检
测标记可用于本发明提供的任何方法中。可检测标记包括例如化学发光组分，生物光组分，
荧光组分，放射性同位素和金属。检测标记的方法为本领域熟知。这种标记可以例如通过
目测、荧光光谱、反射测量、流式细胞计量术、X-射线、各种磁共振方法如磁共振成像(MRI)
和磁共振波谱(MRS)检测。检测方法也包括任何多种的断层X光摄影方法包括计算机断
层扫描(CT)，轴向计算层析成象技术(CAT)，电子束计算机体层摄影(EBCT)，高分辨率计算
机断层扫描(HRCT)，内摆线断层X射线照相术(hypocycloidal tomography)、正电子成像
术(PET)、单一光子发射计算机断层X射线照相术(SPECT)、螺旋计算机断层X射线照相术
和超声断层X射线照相术。可检测标记的直接检测是指例如可检测标记自身的物理现象的
测量，如所述标记自身的能量或离子发射或吸收，例如通过X-射线或MRI测量。间接检测
是指测量原子、分子或组合物直接或间接结合可检测标记的物理现象，如直接或间接结合
可检测标记的原子、分子或组合物的能量和离子发射或吸收。在间接检测的非限制性实例
中，可检测标记可以是生物素，其可以通过与抗生物素蛋白的结合进行检测。非标记的抗生
物素蛋白可以全身性施用以阻断非特异性结合，随后全身性施用标记的抗生物素蛋白。因
此，可检测标记或可检测组分的范围包括可结合的标记或者可结合的组分，其是指原子、分
子或组合物，其中所述原子、分子或组合物的存在可以根据所述标记或组分结合另一原子、
分子或组合物的结果进行检测。典型的可检测标记包括例如金属如胶态金，铁，钆和镓-67，
荧光组分，及放射性同位素。典型的荧光组分和放射性同位素在本文别处提供。
在可以直接或间接测量到。可检测标记可用于使本发明提供的任一或多个病毒成像。可检
测标记可用于本发明提供的任何方法中。可检测标记包括例如化学发光组分，生物光组分，
荧光组分，放射性同位素和金属。检测标记的方法为本领域熟知。这种标记可以例如通过
目测、荧光光谱、反射测量、流式细胞计量术、X-射线、各种磁共振方法如磁共振成像(MRI)
和磁共振波谱(MRS)检测。检测方法也包括任何多种的断层X光摄影方法包括计算机断
层扫描(CT)，轴向计算层析成象技术(CAT)，电子束计算机体层摄影(EBCT)，高分辨率计算
机断层扫描(HRCT)，内摆线断层X射线照相术(hypocycloidal tomography)、正电子成像
术(PET)、单一光子发射计算机断层X射线照相术(SPECT)、螺旋计算机断层X射线照相术
和超声断层X射线照相术。可检测标记的直接检测是指例如可检测标记自身的物理现象的
测量，如所述标记自身的能量或离子发射或吸收，例如通过X-射线或MRI测量。间接检测
是指测量原子、分子或组合物直接或间接结合可检测标记的物理现象，如直接或间接结合
可检测标记的原子、分子或组合物的能量和离子发射或吸收。在间接检测的非限制性实例
中，可检测标记可以是生物素，其可以通过与抗生物素蛋白的结合进行检测。非标记的抗生
物素蛋白可以全身性施用以阻断非特异性结合，随后全身性施用标记的抗生物素蛋白。因
此，可检测标记或可检测组分的范围包括可结合的标记或者可结合的组分，其是指原子、分
子或组合物，其中所述原子、分子或组合物的存在可以根据所述标记或组分结合另一原子、
分子或组合物的结果进行检测。典型的可检测标记包括例如金属如胶态金，铁，钆和镓-67，
荧光组分，及放射性同位素。典型的荧光组分和放射性同位素在本文别处提供。
[0174] 如本文所用，放射性核素、放射性同位元素或者放射性同位素可互换使用，是指具有不稳定核的原子。所述核特征在于可用于传递给核内新产生的放射粒子或者传递给原
子电子的过量的能量。所述放射性同位素在这个过程中经历放射活性衰退，并发射γ射
线和/或亚原子粒子。这种发射可以在体内检测，通过例如但不限于正电子成像术(PET)，
单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或者平面γ射线成像等方法进行。放射性同位素可
以天然存在，但是也可以是人工产生的。用于体内成像的典型的放射性同位素包括但不限
11 13 13 15 15 18 19 32 52 51 55 55 57 58 57 59 60 64 67 68
于 C，C，N，N，O，F，F，P，Fe，Cr，Co，Fe，Co，Co，Ni，Fe Co，Gu，Ga，Ga，
60 67 90 99 103 106 111 117 123 124 125 131 137 153 153 186
Cu(II)，Cu(II)，Y，Tc， pd， Ru，In，Lu， I， I， I，I， Cs， Gd， Sm，Re，
188 192 198 211 212 213 241
Re， Ir，Au， At，Bi， Bi和 Am。放射性同位素可以掺入或者附着于化合物，如代
谢化合物。可以掺入或者与代谢化合物如核苷类似物连接的典型的放射性同位素包括但不
23 124 125 131 18 19 11 13 14 75 76 3
限于 I，I， I，I，F，F，C，C，C，Br，Br和 H。典型的放射标记的化合物包括核苷
类似物，例如但不限于放射标记形式的1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-碘
尿嘧啶(FIAU)，1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-乙基尿嘧啶(FEAU)，
1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-甲基尿嘧啶(FMAU)，3′-脱氧-3′-氟代
胸苷(FLT)，9-[4′-氟-3′-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤(FHBG)和9-[(3′-氟-1′-羟
125
基-2′-丙氧基)甲基]鸟嘌呤(FHPG)，例如[ I]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿
125 124
糖呋喃基)-5-碘尿嘧啶([ I]-FIAU)，[ I]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃
124 18
基)-5-碘尿嘧啶([ I]-FIAU)，[ F]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-碘
18 18
尿嘧啶([ F]-FIAU)，[ F]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-乙基尿嘧
18 18
啶([ F]-FEAU)，[ F]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-甲基尿嘧啶
18 18 18 18
([ F]-FMAU)，[ F]-3′-脱氧-3′-氟代胸苷([ F]-FLT)，[ F]-9-[4′-氟-3′-(羟
18 18
基甲基)丁基]鸟嘌呤([ F]-FHBG)及[ F]-9-[(3′-氟-1′-羟基-2′-丙氧基)甲
18
基]鸟嘌呤([ F]-FHPG)。
子电子的过量的能量。所述放射性同位素在这个过程中经历放射活性衰退，并发射γ射
线和/或亚原子粒子。这种发射可以在体内检测，通过例如但不限于正电子成像术(PET)，
单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或者平面γ射线成像等方法进行。放射性同位素可
以天然存在，但是也可以是人工产生的。用于体内成像的典型的放射性同位素包括但不限
11 13 13 15 15 18 19 32 52 51 55 55 57 58 57 59 60 64 67 68
于 C，C，N，N，O，F，F，P，Fe，Cr，Co，Fe，Co，Co，Ni，Fe Co，Gu，Ga，Ga，
60 67 90 99 103 106 111 117 123 124 125 131 137 153 153 186
Cu(II)，Cu(II)，Y，Tc， pd， Ru，In，Lu， I， I， I，I， Cs， Gd， Sm，Re，
188 192 198 211 212 213 241
Re， Ir，Au， At，Bi， Bi和 Am。放射性同位素可以掺入或者附着于化合物，如代
谢化合物。可以掺入或者与代谢化合物如核苷类似物连接的典型的放射性同位素包括但不
23 124 125 131 18 19 11 13 14 75 76 3
限于 I，I， I，I，F，F，C，C，C，Br，Br和 H。典型的放射标记的化合物包括核苷
类似物，例如但不限于放射标记形式的1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-碘
尿嘧啶(FIAU)，1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-乙基尿嘧啶(FEAU)，
1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-甲基尿嘧啶(FMAU)，3′-脱氧-3′-氟代
胸苷(FLT)，9-[4′-氟-3′-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤(FHBG)和9-[(3′-氟-1′-羟
125
基-2′-丙氧基)甲基]鸟嘌呤(FHPG)，例如[ I]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿
125 124
糖呋喃基)-5-碘尿嘧啶([ I]-FIAU)，[ I]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃
124 18
基)-5-碘尿嘧啶([ I]-FIAU)，[ F]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-碘
18 18
尿嘧啶([ F]-FIAU)，[ F]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-乙基尿嘧
18 18
啶([ F]-FEAU)，[ F]-1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖呋喃基)-5-甲基尿嘧啶
18 18 18 18
([ F]-FMAU)，[ F]-3′-脱氧-3′-氟代胸苷([ F]-FLT)，[ F]-9-[4′-氟-3′-(羟
18 18
基甲基)丁基]鸟嘌呤([ F]-FHBG)及[ F]-9-[(3′-氟-1′-羟基-2′-丙氧基)甲
18
基]鸟嘌呤([ F]-FHPG)。
[0175] 如本文所用，磁共振成像(MRI)是指使用核磁共振光谱仪在固体、特别是在人细胞、组织和器官中产生特异原子和分子结构的电子图像。MRI是一种非侵入性诊断技术，其
使用核磁共振产生器官及其它身体内部结构的横切面图像。所述对象躺在含有强电磁铁的
1 13 19
大的空心圆筒内部，这样导致身体中某些原子的核(如 H、C和 F)磁性排列。然后施予所
述对象无线电波，这导致排成一列的核跳跃；当收回无线电波时，所述核恢复其原始位置，
发射的无线电波然后通过接受仪检测，并由计算机翻译成二维图片。对于一些MRI程序，使
用造影剂如钆以增加成像的精确性。
使用核磁共振产生器官及其它身体内部结构的横切面图像。所述对象躺在含有强电磁铁的
1 13 19
大的空心圆筒内部，这样导致身体中某些原子的核(如 H、C和 F)磁性排列。然后施予所
述对象无线电波，这导致排成一列的核跳跃；当收回无线电波时，所述核恢复其原始位置，
发射的无线电波然后通过接受仪检测，并由计算机翻译成二维图片。对于一些MRI程序，使
用造影剂如钆以增加成像的精确性。
[0177] 如本文所用，与一种组分缀合的化合物称作复合物，其包括与组分结合的化合物，其中所述化合物与组分之间的结合可以产生自一或多个共价键或者非共价相互作用如氢
键，或者静电相互作用。缀合物也可包含连接化合物与组分的接头。典型的化合物包括但
不限于纳米粒子和含铁细胞。典型的组分包括但不限于可检测的组分和治疗剂。
键，或者静电相互作用。缀合物也可包含连接化合物与组分的接头。典型的化合物包括但
不限于纳米粒子和含铁细胞。典型的组分包括但不限于可检测的组分和治疗剂。
[0178] 如本文所用，发光是指可检测的电磁(EM)射线，一般是当释能的化学过程的激发态产物伴随光发射而恢复其基态时产生的紫外线(UV)、红外线(IR)或可见的EM射线。化
学发光是得自化学反应的发光。生物发光是得自使用生物分子(或者其合成形式或类似
物)作为底物和/或酶的化学反应的化学发光。荧光是其中在光或其它形式射线刺激或激
发下从一种物质中发射的可见光，如紫外线(UV)、红外线(IR)或可见的EM射线。
学发光是得自化学反应的发光。生物发光是得自使用生物分子(或者其合成形式或类似
物)作为底物和/或酶的化学反应的化学发光。荧光是其中在光或其它形式射线刺激或激
发下从一种物质中发射的可见光，如紫外线(UV)、红外线(IR)或可见的EM射线。
[0180] 如本文所用，生物发光是化学发光的一种类型，是指由生物分子特别是蛋白质发射光。生物发光的基本条件是分子氧，其在存在加氧酶(一种萤光素酶)的情况下是结合
的或游离的，所述萤光素酶作用于底物-萤光素。生物发光是由酶或是一种加氧酶的其他
蛋白质(萤光素酶)产生的，所述加氧酶在存在分子氧的情况中作用于底物萤光素(一种
生物发光底物)，并将底物转化为激发态，当恢复至较低能量水平时以光的形式释放能量。
的或游离的，所述萤光素酶作用于底物-萤光素。生物发光是由酶或是一种加氧酶的其他
蛋白质(萤光素酶)产生的，所述加氧酶在存在分子氧的情况中作用于底物萤光素(一种
生物发光底物)，并将底物转化为激发态，当恢复至较低能量水平时以光的形式释放能量。
[0181] 如本文所用，产生生物发光的底物和酶一般分别是指萤光素和萤光素酶。当对于特殊物种提及时，为清楚起见，每个专业术语与其衍生自其中的生物的名称一起使用，例如
磕头虫萤光素酶或萤火虫萤光素酶。
磕头虫萤光素酶或萤火虫萤光素酶。
[0182] 如本文所用，萤光素酶是指催化发光反应的加氧酶。例如，细菌萤光素酶催化黄素单核苷酸(FMN)和脂族醛的氧化，这个反应产生光。在海洋节肢动物中发现的另一类萤
光素酶催化海萤(Cypridina)(Vargula)荧光素的氧化，另一类萤光素酶催化鞘翅目昆虫
(Coleoptera)荧光素的氧化。因此，萤光素酶是指催化生物发光反应(产生生物发光的反
应)的一种酶或发光蛋白。萤光素酶如萤火虫和角尖水蚤(Gaussia)及海肾(Renilla)萤
光素酶是在产生生物发光反应期间起催化作用并且无变化的酶。萤光素酶发光蛋白如荧光
素非共价结合的水母发光蛋白在产生生物发光反应期间被改变，如通过荧光素的释放而改
变。萤光素酶是一种在生物体中天然存在的蛋白质或蛋白质混合物(如细菌萤光素酶)或
其变体或突变体，所述变体或突变体例如是通过诱变产生的具有一或多种与天然存在的蛋
白质不同的性质如热稳定性的变体。萤光素酶及其修饰的突变体或变体形式为本领域所熟
知。对于本发明的目的，提及的萤光素酶是指发光蛋白或萤光素酶。
光素酶催化海萤(Cypridina)(Vargula)荧光素的氧化，另一类萤光素酶催化鞘翅目昆虫
(Coleoptera)荧光素的氧化。因此，萤光素酶是指催化生物发光反应(产生生物发光的反
应)的一种酶或发光蛋白。萤光素酶如萤火虫和角尖水蚤(Gaussia)及海肾(Renilla)萤
光素酶是在产生生物发光反应期间起催化作用并且无变化的酶。萤光素酶发光蛋白如荧光
素非共价结合的水母发光蛋白在产生生物发光反应期间被改变，如通过荧光素的释放而改
变。萤光素酶是一种在生物体中天然存在的蛋白质或蛋白质混合物(如细菌萤光素酶)或
其变体或突变体，所述变体或突变体例如是通过诱变产生的具有一或多种与天然存在的蛋
白质不同的性质如热稳定性的变体。萤光素酶及其修饰的突变体或变体形式为本领域所熟
知。对于本发明的目的，提及的萤光素酶是指发光蛋白或萤光素酶。
[0183] 例如海肾(Renilla)萤光素酶是指分离自海肾属成员的一种酶或者得自任何其他来源如另一种相关桡足类动物或者合成制备的一种等价分子。其涵盖具有保守氨基酸取
代而基本不改变活性的海肾萤光素酶。本领域技术人员已知合适的保守氨基酸取代，通常
不改变所得分子的生物学活性而产生。本领域技术人员意识到通常在多肽的非必需区域中
的单氨基酸取代基本不改变生物学活性(见例如Watsonet al.Molecular Biology of the
Gene，4th Edition，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
代而基本不改变活性的海肾萤光素酶。本领域技术人员已知合适的保守氨基酸取代，通常
不改变所得分子的生物学活性而产生。本领域技术人员意识到通常在多肽的非必需区域中
的单氨基酸取代基本不改变生物学活性(见例如Watsonet al.Molecular Biology of the
Gene，4th Edition，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
[0184] 如本文所用，生物发光底物是指在存在萤光素酶及任何必需的激活物的情况中被氧化并产生光的化合物。这些底物在本文中是指例如荧光素，是在生物发光反应中经历
氧化的底物。这些生物发光底物包括任何荧光素或其类似物或者萤光素酶与之相互作用
产生光的任何合成的化合物。典型的底物包括在产生光的反应中在存在萤光素酶或蛋白
质的情况中被氧化的那些底物。生物发光底物因此包括本领域公认为荧光素的那些化合
物。荧光素例如包括萤火虫荧光素、海萤(Cypridina，也称作Vargula)荧光素(腔肠素
(coelenterazine))、细菌荧光素，以及这些底物的合成类似物或者在产生生物发光的反应
中在存在萤光素酶的情况中被氧化的其他化合物。
氧化的底物。这些生物发光底物包括任何荧光素或其类似物或者萤光素酶与之相互作用
产生光的任何合成的化合物。典型的底物包括在产生光的反应中在存在萤光素酶或蛋白
质的情况中被氧化的那些底物。生物发光底物因此包括本领域公认为荧光素的那些化合
物。荧光素例如包括萤火虫荧光素、海萤(Cypridina，也称作Vargula)荧光素(腔肠素
(coelenterazine))、细菌荧光素，以及这些底物的合成类似物或者在产生生物发光的反应
中在存在萤光素酶的情况中被氧化的其他化合物。
[0185] 如本文所用，能转变为生物发光底物是指易受化学反应如氧化或还原反应影响，由此产生生物发光底物。例如，生物发光细菌的发光反应包含黄素单核苷酸基团(FMN)通
过黄素还原酶还原为还原的黄素单核苷酸(FMNH2)的反应。还原的黄素单核苷酸(底物)
然后与氧(激活物)和细菌萤光素酶反应，形成一种中间状态的过氧化黄素，其在存在长链
醛的条件下经历进一步反应产生光。对于这个反应，还原的黄素和长链醛是生物发光底物。
过黄素还原酶还原为还原的黄素单核苷酸(FMNH2)的反应。还原的黄素单核苷酸(底物)
然后与氧(激活物)和细菌萤光素酶反应，形成一种中间状态的过氧化黄素，其在存在长链
醛的条件下经历进一步反应产生光。对于这个反应，还原的黄素和长链醛是生物发光底物。
[0186] 如本文所用，生物发光产生系统是指进行生物发光反应所需要的一系列试剂。因此，完成生物发光反应需要的特异性萤光素酶、荧光素及其他底物、溶剂及其他试剂组成生
物发光系统。因此，生物发光产生系统是指在合适的反应条件下产生生物光的任何系列试
剂。适当的反应条件是指发生生物发光反应必需的条件，如pH、盐浓度及温度。通常地，
生物发光系统包括生物发光底物、荧光素、萤光素酶(包括萤光素酶及发光蛋白)，及一或
多种激活物。特定的生物发光系统可参考衍生萤光素酶的特异生物体而鉴别；例如海肾
(Renilla)生物发光系统包括海肾萤光素酶，如分离自海肾或者使用重组方式或者对这些
萤光素酶进行修饰产生的萤光素酶。这个系统还包括完成生物发光反应必需的特定激活
物，如氧和在存在氧的条件下萤光素酶与之反应产生光的底物。
物发光系统。因此，生物发光产生系统是指在合适的反应条件下产生生物光的任何系列试
剂。适当的反应条件是指发生生物发光反应必需的条件，如pH、盐浓度及温度。通常地，
生物发光系统包括生物发光底物、荧光素、萤光素酶(包括萤光素酶及发光蛋白)，及一或
多种激活物。特定的生物发光系统可参考衍生萤光素酶的特异生物体而鉴别；例如海肾
(Renilla)生物发光系统包括海肾萤光素酶，如分离自海肾或者使用重组方式或者对这些
萤光素酶进行修饰产生的萤光素酶。这个系统还包括完成生物发光反应必需的特定激活
物，如氧和在存在氧的条件下萤光素酶与之反应产生光的底物。
[0187] 如本文所用，荧光蛋白(FP)是指具有发出荧光能力的蛋白质(即在一个波长吸收能量并在另一个波长发射能量)。例如，绿色荧光蛋白(GFP)是指发射光谱峰值为510nm
或大约510nm的一种多肽。本领域已知在不同波长发射的多种FP。典型的FP包括但不限
于绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、橙色荧光蛋白(OFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝
色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、远红外荧光蛋白或者近红外荧光蛋白。从有关光
蛋白的可用色光谱扩展至蓝色、青色、橙色、黄色和红色变体提供了多色跟踪融合蛋白的方
法。
或大约510nm的一种多肽。本领域已知在不同波长发射的多种FP。典型的FP包括但不限
于绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、橙色荧光蛋白(OFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝
色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、远红外荧光蛋白或者近红外荧光蛋白。从有关光
蛋白的可用色光谱扩展至蓝色、青色、橙色、黄色和红色变体提供了多色跟踪融合蛋白的方
法。
[0188] 如本文所用，Aequorea GFP是指来自Aequorea属的GFP及其突变体或变体。来自其它物种的这种变体和GFP如Anthozoa造礁珊瑚、Anemonia海葵、Renilla海肾、
Galaxea珊瑚、Acropora褐色珊瑚、Trachyphyllia及Pectiniidae石珊瑚及其它物种是
熟知的，可为本领域技术人员利用和已知。典型的GFP变体包括但不限于BFP、CFP、YFP和
OFP。典型的荧光蛋白及其变体包括GFP蛋白，如Emerald(Invitrogen，Carlsbad，CA)，
EGFP(Clontech，Palo Alto，CA)，Azami-Green(MBL International，Woburn，MA)，Kaede(MBL International，Woburn，MA)，ZsGreen1(Clontech，Palo Alto，CA) 和 CopGFP(Evrogen/
Axxora，LLC，San Diego，CA)；CFP蛋白，如Cerulean (Rizzo，Nat Biotechnol.22(4)：
445-9(2004))，mCFP(Wang et al.，PNAS US.A.101(48)：16745-9(2004))，
AmCyanl(Clontech，Palo Alto，CA)，MiCy (MBL International，Woburn，MA)， 及
CyPet(Nguyen and Daugherty，Nat Biotechnol.23(3)：355-60(2005))；BFP 蛋 白，如
EBFP(Clontech，Palo Alto，CA)；YFP蛋白如EYFP(Clontech，Palo Alto，CA)，YPet(Nguyen and Daugherty，Nat Biotechnol.23(3)：355-60(2005))，Venus(Nagai et al.，Nat.
Biotechnol.20(1)：87-90(2002))，ZsYellow(Clontech，Palo Alto，CA)，及mCitrine(Wang et al..，PNAS U S A.101(48)：16745-9(2004))；OFP蛋白如cOFP(Strategene，La Jolla，
CA)，mKO(MBL International，Woburn，MA)，及mOrange；以及其它蛋白(见例如Shaner NC，
Steinbach PA，and Tsien RY.，Nat Methods.2(12)：905-9(2005))。
Galaxea珊瑚、Acropora褐色珊瑚、Trachyphyllia及Pectiniidae石珊瑚及其它物种是
熟知的，可为本领域技术人员利用和已知。典型的GFP变体包括但不限于BFP、CFP、YFP和
OFP。典型的荧光蛋白及其变体包括GFP蛋白，如Emerald(Invitrogen，Carlsbad，CA)，
EGFP(Clontech，Palo Alto，CA)，Azami-Green(MBL International，Woburn，MA)，Kaede(MBL International，Woburn，MA)，ZsGreen1(Clontech，Palo Alto，CA) 和 CopGFP(Evrogen/
Axxora，LLC，San Diego，CA)；CFP蛋白，如Cerulean (Rizzo，Nat Biotechnol.22(4)：
445-9(2004))，mCFP(Wang et al.，PNAS US.A.101(48)：16745-9(2004))，
AmCyanl(Clontech，Palo Alto，CA)，MiCy (MBL International，Woburn，MA)， 及
CyPet(Nguyen and Daugherty，Nat Biotechnol.23(3)：355-60(2005))；BFP 蛋 白，如
EBFP(Clontech，Palo Alto，CA)；YFP蛋白如EYFP(Clontech，Palo Alto，CA)，YPet(Nguyen and Daugherty，Nat Biotechnol.23(3)：355-60(2005))，Venus(Nagai et al.，Nat.
Biotechnol.20(1)：87-90(2002))，ZsYellow(Clontech，Palo Alto，CA)，及mCitrine(Wang et al..，PNAS U S A.101(48)：16745-9(2004))；OFP蛋白如cOFP(Strategene，La Jolla，
CA)，mKO(MBL International，Woburn，MA)，及mOrange；以及其它蛋白(见例如Shaner NC，
Steinbach PA，and Tsien RY.，Nat Methods.2(12)：905-9(2005))。
[0189] 如本文所用，红色荧光蛋白或RFP是指已经分离自corallimorph Discosoma的Discosoma RFP(DsRed)(Matz et al.，Nature Biotechnology17：969-973(1999))，及来自
任何其它物种的红色或远红荧光蛋白，如Heteractis造礁珊瑚和Actinia或Entacmaea海
葵，以及其变体。RFP包括例如Discosoma变体，如单体红色荧光蛋白1(mRFPl)，mCherry，
tdTomato，mStrawberry，mTangerine(Wang et al.，PNAS U S A.101(48)：16745-9(2004))，DsRed2(Clontech，Palo Alto，CA)及DsRed-T1(Bevis and Glick，Nat.Biotechnol.，20：
83-87(2002))，Anthomedusa J-Red(Evrogen)和Anemonia AsRed2(Clontech，Palo Alto，
CA)。远红外荧光蛋白包括例如Actinia AQ143(Shkrob et al.，Biochem J.392(Pt3)：
649-54(2005))，Entacmaea eqFP611(Wiedenmann et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U S
A.99(18)：11646-51(2002))，Discosoma变体如mPlum和mRasberry(Wang et al..，PNAS U
S A.101(48)：16745-9(2004))，以及Heteractis HcRed1和t-HcRed(Clontech，Palo Alto，
CA)。
任何其它物种的红色或远红荧光蛋白，如Heteractis造礁珊瑚和Actinia或Entacmaea海
葵，以及其变体。RFP包括例如Discosoma变体，如单体红色荧光蛋白1(mRFPl)，mCherry，
tdTomato，mStrawberry，mTangerine(Wang et al.，PNAS U S A.101(48)：16745-9(2004))，DsRed2(Clontech，Palo Alto，CA)及DsRed-T1(Bevis and Glick，Nat.Biotechnol.，20：
83-87(2002))，Anthomedusa J-Red(Evrogen)和Anemonia AsRed2(Clontech，Palo Alto，
CA)。远红外荧光蛋白包括例如Actinia AQ143(Shkrob et al.，Biochem J.392(Pt3)：
649-54(2005))，Entacmaea eqFP611(Wiedenmann et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U S
A.99(18)：11646-51(2002))，Discosoma变体如mPlum和mRasberry(Wang et al..，PNAS U
S A.101(48)：16745-9(2004))，以及Heteractis HcRed1和t-HcRed(Clontech，Palo Alto，
CA)。
[0190] 如本文所用，体内方法是指在活的对象的身体内进行的方法。
[0191] 如本文所用，遗传治疗或者基因治疗包括将异源核酸如DNA或RNA转移至患有尝试用这种疗法治疗的病症或病变的哺乳动物、特别是人的某些细胞、靶细胞中。如本文所
用，遗传治疗或基因治疗可包括将异源核酸如DNA转移至微生物(如病毒)中，该微生物
可以被转移至患有尝试用这种疗法治疗的病症或病变的哺乳动物、特别是人体中。核酸如
DNA以某种方式被导入选择的靶细胞中，如直接或间接导入，由此所述异源核酸如DNA被表
达及由其编码的治疗性产物产生。或者，异源核酸如DNA可以以某些方式介导编码治疗性
产物的DNA的表达，或者其可编码在某些方式中是治疗性产物的一种产物如肽或RNA(如
RNAi，包括siRNA)，或者其直接或间接介导治疗性产物的表达。基因治疗也可用于输送编码
基因产物的核酸，其置换缺陷的基因或者增补由哺乳动物或者之中导入其的细胞产生的基
因产物。导入的核酸可以编码治疗性化合物。所述编码治疗性产物的异源核酸如DNA可以
在导入受累宿主的细胞之前修饰，以增强或者另外改变所述产物或其表达。基因治疗法也
可包括输送基因表达的抑制剂或阻抑物或其它调节剂。
用，遗传治疗或基因治疗可包括将异源核酸如DNA转移至微生物(如病毒)中，该微生物
可以被转移至患有尝试用这种疗法治疗的病症或病变的哺乳动物、特别是人体中。核酸如
DNA以某种方式被导入选择的靶细胞中，如直接或间接导入，由此所述异源核酸如DNA被表
达及由其编码的治疗性产物产生。或者，异源核酸如DNA可以以某些方式介导编码治疗性
产物的DNA的表达，或者其可编码在某些方式中是治疗性产物的一种产物如肽或RNA(如
RNAi，包括siRNA)，或者其直接或间接介导治疗性产物的表达。基因治疗也可用于输送编码
基因产物的核酸，其置换缺陷的基因或者增补由哺乳动物或者之中导入其的细胞产生的基
因产物。导入的核酸可以编码治疗性化合物。所述编码治疗性产物的异源核酸如DNA可以
在导入受累宿主的细胞之前修饰，以增强或者另外改变所述产物或其表达。基因治疗法也
可包括输送基因表达的抑制剂或阻抑物或其它调节剂。
[0192] 如本文所用，术语过产生或者过表达当用于描述在细胞中产生的一种物质、分子、化合物或组合物时，是指以高于所述细胞产生所述物质、分子、化合物或组合物的基线、正
常或一般的水平产生或者表达。产生或表达的基线、正常或一般水平包括无产生/表达或
者有限的、限制的或调节的产生/表达。这种过产生或过表达典型通过细胞的修饰实现。
常或一般的水平产生或者表达。产生或表达的基线、正常或一般水平包括无产生/表达或
者有限的、限制的或调节的产生/表达。这种过产生或过表达典型通过细胞的修饰实现。
[0193] 如本文所用，调节蛋白质活性或者基因或核酸的表达的物质或化合物降低或增加或者另外改变所述蛋白质的活性，或者以某些方式正调节或负调节或者另外改变核酸在细
胞中的表达。
胞中的表达。
[0194] 如本文所用，“核酸”包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当提及探针或引物时，涵盖单链分子，所述探针或引物任选是标记
的，如用可检测标记如荧光标记或放射性标记物标记。这种分子的长度典型是统计学唯一
的或者是低拷贝数的(典型少于5个，通常少于3个)以探查或引发文库。通常地，探针或
引物含有与感兴趣的基因互补或相同的序列的至少14、16或30个连续核苷酸。探针和引
物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。
的，如用可检测标记如荧光标记或放射性标记物标记。这种分子的长度典型是统计学唯一
的或者是低拷贝数的(典型少于5个，通常少于3个)以探查或引发文库。通常地，探针或
引物含有与感兴趣的基因互补或相同的序列的至少14、16或30个连续核苷酸。探针和引
物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。
[0195] 如本文所用，肽是指长度大于或等于2个氨基酸及少于或等于40个氨基酸的多肽。
[0196] 如本文所用，在本发明提供的氨基酸的各个序列中出现的氨基酸根据其已知的三字母或单字母缩写方式识别(表1)。在各个核酸片段中出现的核苷酸以本领域常规使用的
标准命名法命名。
标准命名法命名。
[0197] 如本文所用，“氨基酸”是指含有氨基基团和羧基基团的有机化合物。多肽含有两或多个氨基酸。对于本发明，氨基酸包括20种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸
类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
[0198] 如本文所用，“氨基酸残基”是指多肽在其肽键经化学消化(水解)时形成的氨基酸。本文描述的氨基酸残基推定为是“L”异构形式。如此命名的“D”异构体形式中的残基
可以取代任何L-氨基酸，只要所述多肽保留希望的功能性质即可。NH2是指在多肽的氨基末
端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的羧基基团。为了与在J.Biol.
Chem.243：3557-3559(1968)及采用的37C.F.R.§§1.821-1.822中描述的标准多肽命名
法一致，氨基酸残基的缩写在表1中示出：
可以取代任何L-氨基酸，只要所述多肽保留希望的功能性质即可。NH2是指在多肽的氨基末
端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的羧基基团。为了与在J.Biol.
Chem.243：3557-3559(1968)及采用的37C.F.R.§§1.821-1.822中描述的标准多肽命名
法一致，氨基酸残基的缩写在表1中示出：
[0199] 表1：对应表
[0200]
[0201]
[0202] 本文用化学式所示所有氨基酸残基序列均具有氨基末端至羧基末端的常规方向中从左至右的方向。此外，短语“氨基酸残基”定义为包括对应表(表1)中列举的氨基酸
及修饰的和不常见的氨基酸，如并入本文作参考的37C.F.R.§§1.821-1.822中所示那些
氨基酸。此外，应注意在氨基酸残基序列的起始和末端的破折号表示与一或多个氨基酸残
基的进一步的序列、与氨基末端基团如NH2或者与羧基末端基团如COOH的肽键。
及修饰的和不常见的氨基酸，如并入本文作参考的37C.F.R.§§1.821-1.822中所示那些
氨基酸。此外，应注意在氨基酸残基序列的起始和末端的破折号表示与一或多个氨基酸残
基的进一步的序列、与氨基末端基团如NH2或者与羧基末端基团如COOH的肽键。
[0203] 如本文所用，“天然存在的α-氨基酸”是天然发现的那些20个α-氨基酸的残基，其通过荷电的dRNA分子与人体中其关联密码子的特异性识别而掺入蛋白质中。非天然
存在的氨基酸因此包括例如除了20个天然存在的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，
包括但不限于氨基酸的D-异立体异构体(D-isostereomers)。典型的非天然氨基酸在本文
描述且为本领域技术人员已知。
存在的氨基酸因此包括例如除了20个天然存在的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，
包括但不限于氨基酸的D-异立体异构体(D-isostereomers)。典型的非天然氨基酸在本文
描述且为本领域技术人员已知。
[0204] 如本文所用，DNA构建体是单链或双链的、线性或环形DNA分子，其含有以在天然未发现的方式组合及并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果存在，包括人工分子的
克隆及其它拷贝。
克隆及其它拷贝。
[0205] 如本文所用，DNA节段是具有特定属性的较大的DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，当从5’至3’末端读取时，
编码指定多肽的氨基酸序列。
编码指定多肽的氨基酸序列。
[0206] 如本文所用，术语多核苷酸是指脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，从5’至3’末端读取。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源，在体外合
成，或者从天然与合成分子的组合中制备。多核苷酸分子的长度在本文根据核苷酸(缩写
为nt)或碱基对(缩写为bp)提供。术语核苷酸在上下文语境允许情况中用于描述单链和
双链分子。当该术语用于描述双链分子时，其用于表示全长分子，应理解其等价于术语碱基
对。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两个链的长度可略微不同，其末端可以错列，因
此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以不是配对的。这种未配对的末端通常长度不超过
20个核苷酸。
成，或者从天然与合成分子的组合中制备。多核苷酸分子的长度在本文根据核苷酸(缩写
为nt)或碱基对(缩写为bp)提供。术语核苷酸在上下文语境允许情况中用于描述单链和
双链分子。当该术语用于描述双链分子时，其用于表示全长分子，应理解其等价于术语碱基
对。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两个链的长度可略微不同，其末端可以错列，因
此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以不是配对的。这种未配对的末端通常长度不超过
20个核苷酸。
[0207] 如本文所用，核苷酸或氨基酸“相应于”揭示的序列如序列表中所示序列中的核苷酸或氨基酸，是指基于与揭示的序列排列比对以使相同性最大化鉴别的核苷酸或氨基酸，
使用标准的排列比对算法如GAP算法进行。通过排列序列，技术人员可鉴别相应的残基，
例如使用保守和相同氨基酸残基作为指导。通常地，为了鉴别相应位置，排列氨基酸的序
列，以便获得最高级别的匹配(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，
ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of
Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，
1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；
及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，
New York，1991；Carillo et al.(1988)SIAMJApplied Math48：1073)。
使用标准的排列比对算法如GAP算法进行。通过排列序列，技术人员可鉴别相应的残基，
例如使用保守和相同氨基酸残基作为指导。通常地，为了鉴别相应位置，排列氨基酸的序
列，以便获得最高级别的匹配(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，
ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of
Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，
1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；
及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，
New York，1991；Carillo et al.(1988)SIAMJApplied Math48：1073)。
[0208] 如本文所用，“序列相同性”是指检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间比对相同或相似的氨基酸或核苷酸碱基数。序列相同性可以通过核酸或蛋白质序列的序列
排列比对以鉴别相似性或相同性区域而确定。对于本发明，序列相同性通常是通过排列比
对以鉴别相同的残基而确定的。所述排列比对可以是局部或整体排列比对。在比对的序列
之间可以鉴别匹配、错配和缺口。缺口可以是插入在排列的序列的残基之间的失效氨基酸
或核苷酸，由此排列相同或相似特征。通常地，可以存在内部或末端缺口。序列相同性可以
考虑缺口而确定为相同残基数/最短序列的长度×100。当使用缺口罚分时，序列相同性可
以用末端缺口不罚分确定(例如末端缺口不罚分)。或者，序列相同性可以不考虑缺口确定
为相同位置数/排列序列总长度×100。
排列比对以鉴别相似性或相同性区域而确定。对于本发明，序列相同性通常是通过排列比
对以鉴别相同的残基而确定的。所述排列比对可以是局部或整体排列比对。在比对的序列
之间可以鉴别匹配、错配和缺口。缺口可以是插入在排列的序列的残基之间的失效氨基酸
或核苷酸，由此排列相同或相似特征。通常地，可以存在内部或末端缺口。序列相同性可以
考虑缺口而确定为相同残基数/最短序列的长度×100。当使用缺口罚分时，序列相同性可
以用末端缺口不罚分确定(例如末端缺口不罚分)。或者，序列相同性可以不考虑缺口确定
为相同位置数/排列序列总长度×100。
[0209] 如本文所用，“整体排列比对”是从头至尾排列比对两个序列，每个序列中每个字母仅排列一次。无论序列之间是否存在相似性或相同性，产生排列比对。例如，基于“整
体排列比对”呈现出50％序列相同性意味着在两个比对序列的全长序列排列比对中，在每
100个核苷酸长度，有50％的残基是相同的。应理解整体排列比对也可在甚至排列的序列
的长度不相同时用于确定序列相同性。在确定序列相同性中考虑序列的末端差异，除非选
择“末端缺口不罚分”。通常地，对在其最大长度共享显著相似性的序列使用整体排列比对。
典型的进行整体排列比对的算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman et al.J.Mol.
Biol.48：443(1970)。典型的进行整体排列比对的程序是可公开获得的，包括在National
Center for Biotechnology Information(NCBI)网站(ncbi.nlm.nih.gov/)可获得的
Global Sequence Alignment Tool，及 在 deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.
html可获得的程序。
体排列比对”呈现出50％序列相同性意味着在两个比对序列的全长序列排列比对中，在每
100个核苷酸长度，有50％的残基是相同的。应理解整体排列比对也可在甚至排列的序列
的长度不相同时用于确定序列相同性。在确定序列相同性中考虑序列的末端差异，除非选
择“末端缺口不罚分”。通常地，对在其最大长度共享显著相似性的序列使用整体排列比对。
典型的进行整体排列比对的算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman et al.J.Mol.
Biol.48：443(1970)。典型的进行整体排列比对的程序是可公开获得的，包括在National
Center for Biotechnology Information(NCBI)网站(ncbi.nlm.nih.gov/)可获得的
Global Sequence Alignment Tool，及 在 deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.
html可获得的程序。
[0210] 如本文所用，“局部排列比对”是这样的排列，即排列两个序列，但是仅排列比对共享相似性或相同性的那部分序列。因此，局部排列比对确定了一个序列的亚节段是
否存在于另一序列中。如果无相似性，无排列被返回。局部排列比对算法包括BLAST或
Smith-Waterman算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981))。例如，基于“局部排列比对”呈现
50％序列相同性意味着在任意长度的两个比对序列的全长序列的排列比对中，长度为100
个核苷酸的相似性或相同性区域中具有50％的残基在该相似性或相同性区域中是相同的。
否存在于另一序列中。如果无相似性，无排列被返回。局部排列比对算法包括BLAST或
Smith-Waterman算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981))。例如，基于“局部排列比对”呈现
50％序列相同性意味着在任意长度的两个比对序列的全长序列的排列比对中，长度为100
个核苷酸的相似性或相同性区域中具有50％的残基在该相似性或相同性区域中是相同的。
[0211] 对于本发明，序列相同性可以通过标准排列算法程序确定，使用由每个供应商提制定的默认参数罚分。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比对矩阵(unary comparison
inatrix)(含有对于相同性数值为1及对于非相同性数值为0)及Gribskov et al.Nucl.
Acids Res.14：6745(1986)的加权的比对矩阵，如Schwartz and Dayhoff，eds，，Atlas
of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，
pp.353-358(1979)中所描述；(2)对于每个缺口罚分为3.0，以及对于每一个缺口中的每
一个符号附加0.10的罚分；及(3)对于末端缺口无罚分。任两个核酸分子是否具有至
少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性或者描述相同性百分比的其它
相似变量的核苷酸序列(或者具有氨基酸序列的任两个多肽)，可以使用已知的基于局部
或整体排列比对的计算机算法确定(见例如wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_
software，提供了很多已知的和公开的可利用的排列比对数据库和程序的链接)。通常地，
对于本发明的目的而言，序列相同性是使用基于整体排列比对的计算机算法确定的如得自
NCBI/BLAST的Needleman-Wunsch整体序列比对工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.
cgi ？ CMD ＝ Web&Page_TYPE ＝ BlastHome)；LAlign(William Pearson implementing
the Huang and Miller algorithm(Adv.Appl.Math.(1991)12：337-357))；及来自Xiaoqui
Huang在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html上可获得的程序。通常地，当比
对核苷酸序列时，使用末端缺口无罚分的排列比对(例如终末缺口不罚分)。
inatrix)(含有对于相同性数值为1及对于非相同性数值为0)及Gribskov et al.Nucl.
Acids Res.14：6745(1986)的加权的比对矩阵，如Schwartz and Dayhoff，eds，，Atlas
of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，
pp.353-358(1979)中所描述；(2)对于每个缺口罚分为3.0，以及对于每一个缺口中的每
一个符号附加0.10的罚分；及(3)对于末端缺口无罚分。任两个核酸分子是否具有至
少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性或者描述相同性百分比的其它
相似变量的核苷酸序列(或者具有氨基酸序列的任两个多肽)，可以使用已知的基于局部
或整体排列比对的计算机算法确定(见例如wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_
software，提供了很多已知的和公开的可利用的排列比对数据库和程序的链接)。通常地，
对于本发明的目的而言，序列相同性是使用基于整体排列比对的计算机算法确定的如得自
NCBI/BLAST的Needleman-Wunsch整体序列比对工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.
cgi ？ CMD ＝ Web&Page_TYPE ＝ BlastHome)；LAlign(William Pearson implementing
the Huang and Miller algorithm(Adv.Appl.Math.(1991)12：337-357))；及来自Xiaoqui
Huang在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html上可获得的程序。通常地，当比
对核苷酸序列时，使用末端缺口无罚分的排列比对(例如终末缺口不罚分)。
[0212] 因此，如本文所用，术语“相同性”是指检测多肽与参考多肽或多核苷酸之间的比对或排列比对。在一个非限制性实例中，“至少90％相同”是指相对于参考多肽或多核苷酸
的90-100％的相同性百分比。在90％或更高水平的相同性是指这样的事实，即假定为了典
型的目的，比对长度为100个氨基酸或核苷酸的检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷
酸，在检测多肽或多核苷酸中不超过10％(即100中的10个)的氨基酸或核苷酸与参考多
肽中的不同。可以在检测多核苷酸与参考多核苷酸之间进行相似比对。这种差异可以用在
氨基酸序列全长随机分布的点突变表示，或者其可以集中在一或多个不同长度的位置直至
最大许可值，如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异根据核酸或氨基酸的取代、插
入或缺失定义。根据比对的序列的长度，在大约85-90％以上的同源或相同性水平，结果可
以与所述程序和缺口参数系列无关；这种高水平相同性可易于评估，通常不依靠软件测定。
的90-100％的相同性百分比。在90％或更高水平的相同性是指这样的事实，即假定为了典
型的目的，比对长度为100个氨基酸或核苷酸的检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷
酸，在检测多肽或多核苷酸中不超过10％(即100中的10个)的氨基酸或核苷酸与参考多
肽中的不同。可以在检测多核苷酸与参考多核苷酸之间进行相似比对。这种差异可以用在
氨基酸序列全长随机分布的点突变表示，或者其可以集中在一或多个不同长度的位置直至
最大许可值，如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异根据核酸或氨基酸的取代、插
入或缺失定义。根据比对的序列的长度，在大约85-90％以上的同源或相同性水平，结果可
以与所述程序和缺口参数系列无关；这种高水平相同性可易于评估，通常不依靠软件测定。
[0213] 如本文所用，当就核酸的两个序列而言时，等价物是指所述两个序列编码氨基酸的相同序列或等价的蛋白质。当用于指两个蛋白质或肽或其他分子时，等价物是指所述两
个蛋白质或肽具有基本相同的仅具有氨基酸取代(例如但非限于保守改变)的氨基酸序
列或相同结构，并且所述改变均基本上不改变所述蛋白质或肽的活性或功能。当等价物是
指性质时，所述性质不需要相同程度存在(例如两种肽可呈现相同类型的酶活性的不同速
率)，但所述活性通常是相同的。当指两个核苷酸序列时，互补是指核苷酸的两个序列能杂
交，相对的核苷酸之间典型具有少于25％、15％或5％的错配。如果需要，可以指定互补百
分比。典型地，选择可以在高度严格条件下杂交的两个分子。
个蛋白质或肽具有基本相同的仅具有氨基酸取代(例如但非限于保守改变)的氨基酸序
列或相同结构，并且所述改变均基本上不改变所述蛋白质或肽的活性或功能。当等价物是
指性质时，所述性质不需要相同程度存在(例如两种肽可呈现相同类型的酶活性的不同速
率)，但所述活性通常是相同的。当指两个核苷酸序列时，互补是指核苷酸的两个序列能杂
交，相对的核苷酸之间典型具有少于25％、15％或5％的错配。如果需要，可以指定互补百
分比。典型地，选择可以在高度严格条件下杂交的两个分子。
[0214] 如本文所用，基本纯的是指足够均一地显示不含有通过本领域技术人员使用的评估这种纯度的标准分析方法易于检测的杂质，所述分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和
高效液相层析(HPLC)，或者是指足够纯的，进一步的纯化不会可检测到地改变该物质的物
理和化学性质，如酶活性和生物学活性。纯化化合物以产生基本为化学纯的化合物的方法
为本领域技术人员所已知。然而，基本为化学纯的化合物可以是立体异构体或异构体的混
合物。在这种情况中，进一步纯化可提高所述化合物的比活性。
高效液相层析(HPLC)，或者是指足够纯的，进一步的纯化不会可检测到地改变该物质的物
理和化学性质，如酶活性和生物学活性。纯化化合物以产生基本为化学纯的化合物的方法
为本领域技术人员所已知。然而，基本为化学纯的化合物可以是立体异构体或异构体的混
合物。在这种情况中，进一步纯化可提高所述化合物的比活性。
[0215] 如本文所用，术语评估或确定是指包括定量或定性确定，获得产物活性的绝对值，也获得表示活性水平的指数、比率、百分比、图形或者其它数值。评估可以是直接或间接评
估。
估。
[0216] 如本文所用，活性是指本发明提供的化合物或病毒在体外或体内的活性。例如，体内活性是指在提及施用其(或者组合物或其它混合物)之后获得的生理学应答。因此，活
性涵盖了这种化合物、组合物和混合物的获得的治疗作用和药物活性。活性可以在设计为
检测或使用这种活性的体外和/或体内系统中观测。
性涵盖了这种化合物、组合物和混合物的获得的治疗作用和药物活性。活性可以在设计为
检测或使用这种活性的体外和/或体内系统中观测。
[0217] 如本文所用，“组合物”是指两或多种产物或化合物的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊、水溶液、非水溶液，或者其任意组合。
[0218] 如本文所用，“组合”是指两或多种项目(item)或元件的任何联合。典型的组合包括但不限于两或多种药物组合物，含有两或多种活性成分的组合物，如两种病毒，或者一种
病毒和一种抗癌剂如化疗化合物，两或多种病毒，一种病毒与一种治疗剂，一种病毒与一种
成像剂，一种病毒与多种治疗剂和/或成像剂，或者其任何联合。这种组合可以包装为试剂
盒。
病毒和一种抗癌剂如化疗化合物，两或多种病毒，一种病毒与一种治疗剂，一种病毒与一种
成像剂，一种病毒与多种治疗剂和/或成像剂，或者其任何联合。这种组合可以包装为试剂
盒。
[0219] 如本文所用，试剂盒是一种包装的组合物，任选地包括所述组合物和/或其他反应及用于这种应用的成分的使用说明书。
[0220] 如本文所用，“对照”或“标准物”是指与检测样品基本相同的样品，但是其未用检测参数处理，或者其是血浆样品，可以来自未受累于感兴趣的病症的正常志愿者。对照物也
可以是内部对照。例如，对照物可以是具有已知性质或活性的样品，如病毒。
可以是内部对照。例如，对照物可以是具有已知性质或活性的样品，如病毒。
[0221] 如本文所用，除非根据上下文明确指出，单数形式“一个”包括多个指示物。因此，例如“一种物质”包括一或多种物质。
[0222] 如本文所用，术语“或者”用于意味着“和/或”，除非明确指出是指唯一选择的或者选择是互斥的。
[0223] 如本文所用，范围和数量可以“大约”的特定数值或范围表示。大约也包括精确量。因此，“大约5个碱基”意味着“大约5个碱基”，也意味着“5个碱基”。
[0224] 如本文所用，“任选”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，所述描述包括所述事件或情况发生和不发生的实例。例如，任选取代的基团是指该基团不被取代或被取代。
[0225] 如本文所用，除非特别指出，任何保护性基团、氨基酸和其它化合物的缩写与其一般用法、公认的缩写或者IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(见
(1972)Biochem.11：1726)一致。
(1972)Biochem.11：1726)一致。
[0226] 为了更清晰地公开本发明，但无限制之意，将详细描述分为如下部分。
[0227] B.分离克隆痘苗病毒毒株的方法
[0228] 本发明提供从痘苗病毒制备物或混合物中分离病毒的克隆分离株的方法，其与起始病毒制备物或混合物或者其它参考毒株或分离株相比具有更好的抗肿瘤应答以及相似
或较低的致病原性/毒性。所述方法用于选择和鉴别与现有病毒毒株相比具有降低的毒性
和改良的或较高的抗肿瘤发生性质的痘苗病毒毒株。
或较低的致病原性/毒性。所述方法用于选择和鉴别与现有病毒毒株相比具有降低的毒性
和改良的或较高的抗肿瘤发生性质的痘苗病毒毒株。
[0229] 痘苗病毒由于其有效的复制、细胞裂解、传播、宿主范围和针对肿瘤组织的天然向性而用作溶瘤载体(Shen et al.(2004)Mol.Ther.，11：180)。例如，痘苗病毒在复制和传
播中较腺病毒载体更具潜力。然而，尽管痘苗病毒是已知具有抗肿瘤发生性质的减毒的病
毒，但是许多现有的痘苗病毒毒株、包括重组毒株均呈现出毒力和安全性的变化，使得许多
毒株不适于临床应用。同样，现有溶瘤痘苗病毒候选物是重组病毒，其含有插入病毒基因组
中的外源基因，例如为了使病毒的毒性最小化或者增强或扩大抗肿瘤发生性质。本发明发
现可以选择在不存在导入的外源基因情况中其自身即具有在高抗肿瘤发生能力及最小毒
性的病毒。因此，例如所述方法的目的是选择具有改良的安全性包括致病原性和毒性、同时
保留或也具有改良的抗肿瘤发生性质的克隆分离株，其不依赖于插入异源基因。特别地，选
择的克隆毒株是进行肿瘤诊断和治疗的溶瘤病毒候选物。痘苗病毒的分离的克隆毒株可用
作治疗性病毒，用于治疗增生性病症，如癌症，及用于如本文所述其它治疗和/或诊断方法
中。此外，所述克隆毒株也可用于接种方法中。选择的或鉴别的克隆毒株在重组溶瘤病毒
的构建中也可用作亲代痘苗病毒。
播中较腺病毒载体更具潜力。然而，尽管痘苗病毒是已知具有抗肿瘤发生性质的减毒的病
毒，但是许多现有的痘苗病毒毒株、包括重组毒株均呈现出毒力和安全性的变化，使得许多
毒株不适于临床应用。同样，现有溶瘤痘苗病毒候选物是重组病毒，其含有插入病毒基因组
中的外源基因，例如为了使病毒的毒性最小化或者增强或扩大抗肿瘤发生性质。本发明发
现可以选择在不存在导入的外源基因情况中其自身即具有在高抗肿瘤发生能力及最小毒
性的病毒。因此，例如所述方法的目的是选择具有改良的安全性包括致病原性和毒性、同时
保留或也具有改良的抗肿瘤发生性质的克隆分离株，其不依赖于插入异源基因。特别地，选
择的克隆毒株是进行肿瘤诊断和治疗的溶瘤病毒候选物。痘苗病毒的分离的克隆毒株可用
作治疗性病毒，用于治疗增生性病症，如癌症，及用于如本文所述其它治疗和/或诊断方法
中。此外，所述克隆毒株也可用于接种方法中。选择的或鉴别的克隆毒株在重组溶瘤病毒
的构建中也可用作亲代痘苗病毒。
[0230] 在所述方法中，选择亲代痘苗病毒制备物或混合物，其含有具有不同基因组序列的基因组的许多病毒颗粒。所述亲代病毒制备物或混合物可以是任何痘苗病毒毒株，其是
混合的一群毒株，即其是非克隆或非序列同质的。如下文进一步论述，所述制备物可得自病
毒在培养系统中的重复繁殖。病毒制备物也可以通过将不同的痘苗病毒毒株混合在一起作
为混合物而获得，以使得重组在体外或体内发生。所述混合物也可以是得自不同类型病毒
的混合，如混合单纯疱疹病毒(HSV)毒株与痘苗病毒毒株。在所述方法中，亲代病毒制备物
在体外或体内繁殖或扩增，获得克隆分离株(例如通过噬斑测定)。在体外和/或体内测
定中检测分离的和选择的病毒克隆的抗肿瘤发生性质和致病原性/毒性。一种性质在溶瘤
病毒候选物的选择中是非决定性的，因此检测克隆的抗肿瘤发生能力和毒性或者安全性性
质。例如，呈现出显著的抗肿瘤发生性质，但是是极端毒性的病毒克隆不是理想的溶瘤病毒
候选物。因此，需要这些性质的平衡。选择具有最佳抗肿瘤应答但是具有最小毒性的病毒
克隆作为候选物。特别地，鉴别的或选择的病毒克隆是与参考病毒毒株相比具有较好毒性
和抗肿瘤发生性质的病毒。
混合的一群毒株，即其是非克隆或非序列同质的。如下文进一步论述，所述制备物可得自病
毒在培养系统中的重复繁殖。病毒制备物也可以通过将不同的痘苗病毒毒株混合在一起作
为混合物而获得，以使得重组在体外或体内发生。所述混合物也可以是得自不同类型病毒
的混合，如混合单纯疱疹病毒(HSV)毒株与痘苗病毒毒株。在所述方法中，亲代病毒制备物
在体外或体内繁殖或扩增，获得克隆分离株(例如通过噬斑测定)。在体外和/或体内测
定中检测分离的和选择的病毒克隆的抗肿瘤发生性质和致病原性/毒性。一种性质在溶瘤
病毒候选物的选择中是非决定性的，因此检测克隆的抗肿瘤发生能力和毒性或者安全性性
质。例如，呈现出显著的抗肿瘤发生性质，但是是极端毒性的病毒克隆不是理想的溶瘤病毒
候选物。因此，需要这些性质的平衡。选择具有最佳抗肿瘤应答但是具有最小毒性的病毒
克隆作为候选物。特别地，鉴别的或选择的病毒克隆是与参考病毒毒株相比具有较好毒性
和抗肿瘤发生性质的病毒。
[0231] 在一个实例中，选择这样的病毒，其与亲代病毒制备物或者其它参考病毒毒株(例如重组病毒)相比具有较低毒性，其在评估指示毒性的参数的测定和方法中呈现出
为亲代病毒制备物或混合物或者其它参考病毒毒株的在0％-99％之间，例如低于99％、
98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更低的毒性。在其它实例中，选择这样的病毒，其与亲代病毒制备物或混合物或者其它参考病毒毒
株(例如重组病毒)相比具有改良的或较好的抗肿瘤发生能力，其在评估指示抗肿瘤发生
能力的参数的测定或方法中呈现出为亲代病毒制备物或混合物或者其它参考病毒毒株的
在120％-1000％之间，例如至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、
200％、250％、300％、400％、500％、1000％或更高的抗肿瘤发生能力。在一些实例中，在评估指示毒性的参数的测定或方法中选择这样的病毒，其与亲代病毒制备物或混合物或者其
它参考病毒毒株(例如重组毒株)相比保留或具有相似毒性和/或抗肿瘤发生能力，如
在70％-120％之间，例如至少或大约或者为70％、80％、90％、95％、100％、110％、115％或
120％的亲代病毒制备物或混合物或者其它参考病毒毒株的毒性或抗肿瘤发生能力。
为亲代病毒制备物或混合物或者其它参考病毒毒株的在0％-99％之间，例如低于99％、
98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更低的毒性。在其它实例中，选择这样的病毒，其与亲代病毒制备物或混合物或者其它参考病毒毒
株(例如重组病毒)相比具有改良的或较好的抗肿瘤发生能力，其在评估指示抗肿瘤发生
能力的参数的测定或方法中呈现出为亲代病毒制备物或混合物或者其它参考病毒毒株的
在120％-1000％之间，例如至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、
200％、250％、300％、400％、500％、1000％或更高的抗肿瘤发生能力。在一些实例中，在评估指示毒性的参数的测定或方法中选择这样的病毒，其与亲代病毒制备物或混合物或者其
它参考病毒毒株(例如重组毒株)相比保留或具有相似毒性和/或抗肿瘤发生能力，如
在70％-120％之间，例如至少或大约或者为70％、80％、90％、95％、100％、110％、115％或
120％的亲代病毒制备物或混合物或者其它参考病毒毒株的毒性或抗肿瘤发生能力。
[0232] 所述方法步骤的描述在下文提供。应理解下文所述步骤可以以任何顺序进行。例如，所述病毒制备物或混合物或者各个分离株的指示毒性的参数可以在评估指示抗肿瘤发
生能力的参数之前评估。在另一实例中，克隆可以在评估所述病毒制备物的抗肿瘤发生能
力之后单独分离，从而预选择具有抗肿瘤发生性质的克隆，之后再分离各个克隆。在另一个
实例中，可以先从病毒制备物中分离各个克隆分离株，之后再评估每个克隆的抗肿瘤发生
或毒力性质。在特定的实例中，所述方法是通过选择病毒制备物或混合物，使所述制备物或
混合物在细胞培养中传代，及分离单一克隆(例如通过体外噬斑测定)，从培养系统中繁殖
并纯化每个克隆，并评估每个克隆毒株的指示抗肿瘤发生能力的参数，选择具有抗肿瘤发
生能力的克隆毒株，及从这些选择的克隆毒株中评估指示毒性的参数，选择具有最小毒性
的亚类(subset)。评估抗肿瘤发生能力和毒性的步骤可以在体外或体内进行。典型地，在
动物模型中在体内检测选择的克隆毒株的抗肿瘤发生能力和毒性性质。可以对所述克隆毒
株的基因组进行测序，以证实其是同质的。
生能力的参数之前评估。在另一实例中，克隆可以在评估所述病毒制备物的抗肿瘤发生能
力之后单独分离，从而预选择具有抗肿瘤发生性质的克隆，之后再分离各个克隆。在另一个
实例中，可以先从病毒制备物中分离各个克隆分离株，之后再评估每个克隆的抗肿瘤发生
或毒力性质。在特定的实例中，所述方法是通过选择病毒制备物或混合物，使所述制备物或
混合物在细胞培养中传代，及分离单一克隆(例如通过体外噬斑测定)，从培养系统中繁殖
并纯化每个克隆，并评估每个克隆毒株的指示抗肿瘤发生能力的参数，选择具有抗肿瘤发
生能力的克隆毒株，及从这些选择的克隆毒株中评估指示毒性的参数，选择具有最小毒性
的亚类(subset)。评估抗肿瘤发生能力和毒性的步骤可以在体外或体内进行。典型地，在
动物模型中在体内检测选择的克隆毒株的抗肿瘤发生能力和毒性性质。可以对所述克隆毒
株的基因组进行测序，以证实其是同质的。
[0233] 此外，在具有指定性质的克隆毒株的选择或鉴别中，为了进行对比，所述方法的全部或一些步骤可以在参考毒株中平行进行，以有助于病毒的选择。例如，在评估抗肿瘤发生
或毒性的步骤中，可以评估起始病毒制备物或混合物的抗肿瘤发生或毒性性质，可以对比
检测的克隆毒株，以鉴别与起始病毒制备物或混合物相比保留(即具有相似活性)或具有
改良或更好的抗肿瘤发生或毒性性质的那些毒株。
或毒性的步骤中，可以评估起始病毒制备物或混合物的抗肿瘤发生或毒性性质，可以对比
检测的克隆毒株，以鉴别与起始病毒制备物或混合物相比保留(即具有相似活性)或具有
改良或更好的抗肿瘤发生或毒性性质的那些毒株。
[0234] 在另一实例中，可以评估已知减毒的重组病毒的抗肿瘤发生或毒性性质，可以对比检测的克隆分离株，以鉴别与所述重组病毒相比保留(即具有相似活性)或具有改良或
更好的抗肿瘤发生或毒性性质的那些毒株。使用重组DNA技术产生重组病毒的方法为本领
域熟知(见例如美国专利No.4,769,330；4,603,112；4,722,848；4,215,051；5,110,587；
5,174,993；5,922,576；6,319,703；5,719,054；6,429,001；6,589,531；6,573,090；
6,800,288；7,045,313；He et al.(1998)PNAS95(5)：2509-2514；Racaniello et
al.(1981)Science214：916-919；及Hruby et al.(1990)Clin Micro Rev.3：153-170)。减
毒的和抗肿瘤发生的重组痘苗病毒为本领域已知，包括但不限于GLV-1h68(如SEQ ID NO：
9所示；LIVP的衍生物，见例如Zhang et al.(2009)Mol.Genet.Genomics，282：417-435)，
GLV-1h64(如SEQ ID NO：326所示)，及在公开的专利或申请中描述的任何病毒(见例
如美国专利申请US2003-0059400，US2003-0228261，US2009-0117034，US2009-0098529，
US2009-0053244，US2009-0081639和US2009-0136917；美国专利7,588,767和7,763,420；
及国际专利申请WO2009/139921)。其它重组痘苗病毒包括但不限于VVhEA(Lister的衍
生物，见例如Tysome et al.(2009)Gene Ther.，16：1223-1233)，rVV-p53(Lister的衍生
物；见例如Timiryasova et al.(1999)Int.J.Oncol.，14：845-854；JX-594(Wyeth毒株的
衍生物，见例如Kim et al.(2006)Mol.Ther.14：370)及JX-963(WR毒株的衍生物，见例如
Thorne et al.(2007)J.Clin.Inves.，117：3350)。
更好的抗肿瘤发生或毒性性质的那些毒株。使用重组DNA技术产生重组病毒的方法为本领
域熟知(见例如美国专利No.4,769,330；4,603,112；4,722,848；4,215,051；5,110,587；
5,174,993；5,922,576；6,319,703；5,719,054；6,429,001；6,589,531；6,573,090；
6,800,288；7,045,313；He et al.(1998)PNAS95(5)：2509-2514；Racaniello et
al.(1981)Science214：916-919；及Hruby et al.(1990)Clin Micro Rev.3：153-170)。减
毒的和抗肿瘤发生的重组痘苗病毒为本领域已知，包括但不限于GLV-1h68(如SEQ ID NO：
9所示；LIVP的衍生物，见例如Zhang et al.(2009)Mol.Genet.Genomics，282：417-435)，
GLV-1h64(如SEQ ID NO：326所示)，及在公开的专利或申请中描述的任何病毒(见例
如美国专利申请US2003-0059400，US2003-0228261，US2009-0117034，US2009-0098529，
US2009-0053244，US2009-0081639和US2009-0136917；美国专利7,588,767和7,763,420；
及国际专利申请WO2009/139921)。其它重组痘苗病毒包括但不限于VVhEA(Lister的衍
生物，见例如Tysome et al.(2009)Gene Ther.，16：1223-1233)，rVV-p53(Lister的衍生
物；见例如Timiryasova et al.(1999)Int.J.Oncol.，14：845-854；JX-594(Wyeth毒株的
衍生物，见例如Kim et al.(2006)Mol.Ther.14：370)及JX-963(WR毒株的衍生物，见例如
Thorne et al.(2007)J.Clin.Inves.，117：3350)。
[0235] 1.亲代病毒制备物或混合物
[0236] 在所述方法中，选择痘苗病毒或者痘苗病毒混合物及不具有序列同源性的其它病毒的起始或亲代制备物用于所述方法中。在制备物或混合群中的痘苗病毒典型是非重组病
毒毒株，其未经工程化含有异源基因。因此，所述方法使得可以鉴别不依赖于插入的基因而
呈现出抗肿瘤发生能力和最小毒性的痘苗病毒。如下文论述，可以对所得选择的毒株通过
插入外源基因而进一步修饰或工程化，以进一步调节该病毒的性质。
毒毒株，其未经工程化含有异源基因。因此，所述方法使得可以鉴别不依赖于插入的基因而
呈现出抗肿瘤发生能力和最小毒性的痘苗病毒。如下文论述，可以对所得选择的毒株通过
插入外源基因而进一步修饰或工程化，以进一步调节该病毒的性质。
[0237] 典型地，起始的病毒制备物或混合物是或者含有减毒的病毒，如减毒的痘病毒毒株(如痘苗病毒)。本领域技术人员已知及可利用许多痘苗病毒毒株。典型的痘苗病毒在
表2中列出，包括但不限于Lister、Western Reserve (WR)、Copenhagen(Cop)、Bern、Paris、Tashkent、Tian Tan、Wyeth(DRYVAX)、IHD-J、IHD-W、Brighton、Ankara、CVA382、Modified Vaccinia Ankara(MVA)、Dairen I、LC16m8、LC16M0、LIVP、ACAM2000、WR65-16、Connaught、New York City Board of Health(NYCBH)、EM-63或者NYVAC痘苗病毒。LIVP源自毒株，由
在俄罗斯莫斯科的Institute of Viral Preparations使其适应于小牛皮肤(Al’tshtein
et al.(1985)Dokl Akad Nauk SSSR，285：696-699)。Western Reserve(WR)衍生自New
York City Board of Health(NYCBH)毒株，通过在小鼠脑中重复传代进行(Henderson
and Moss(1999)Smallpox and Vaccinia.In：Plotkin S，Orenstein W(eds)Vaccines.
W.B.Saunders，Philadelphia，pp.74-97)。
表2中列出，包括但不限于Lister、Western Reserve (WR)、Copenhagen(Cop)、Bern、Paris、Tashkent、Tian Tan、Wyeth(DRYVAX)、IHD-J、IHD-W、Brighton、Ankara、CVA382、Modified Vaccinia Ankara(MVA)、Dairen I、LC16m8、LC16M0、LIVP、ACAM2000、WR65-16、Connaught、New York City Board of Health(NYCBH)、EM-63或者NYVAC痘苗病毒。LIVP源自毒株，由
在俄罗斯莫斯科的Institute of Viral Preparations使其适应于小牛皮肤(Al’tshtein
et al.(1985)Dokl Akad Nauk SSSR，285：696-699)。Western Reserve(WR)衍生自New
York City Board of Health(NYCBH)毒株，通过在小鼠脑中重复传代进行(Henderson
and Moss(1999)Smallpox and Vaccinia.In：Plotkin S，Orenstein W(eds)Vaccines.
W.B.Saunders，Philadelphia，pp.74-97)。
[0238]
[0239] 序列异源的痘苗病毒的病毒制备物，包括混合的群，是通过本领域已知的各种方法产生的。例如，病毒制备物中的多样性可以基于发生在病毒毒株的天然选择过程中的同
源重组事件产生。例如，已知痘病毒之间的同源重组在当细胞用两种病毒共感染时发生，或
者用一种病毒和基因组DNA或克隆的DNA感染时发生(Plotkin&Orenstein(eds)“Recomb
rd
inant Vaccinia Virus Vaccines”in Vaccines，3 edition(1999))。因此，在一个实例
中，病毒制备物可以通过一或多个病毒毒株在组织培养物中或者在体内通过感染肿瘤样组
织或其他哺乳动物组织(例如在小牛皮肤上传代)重复传代而产生，这样可导致点突变或
重组事件的积累。在一些实例中，可以产生病毒毒株的两或多个传代。用病毒如痘苗病毒
在体外感染细胞及在体内感染动物对象的方法为本领域已知。含有肿瘤的以传代病毒或病
毒混合物的动物模型的产生也为本领域熟知，在本文别处描述。
源重组事件产生。例如，已知痘病毒之间的同源重组在当细胞用两种病毒共感染时发生，或
者用一种病毒和基因组DNA或克隆的DNA感染时发生(Plotkin&Orenstein(eds)“Recomb
rd
inant Vaccinia Virus Vaccines”in Vaccines，3 edition(1999))。因此，在一个实例
中，病毒制备物可以通过一或多个病毒毒株在组织培养物中或者在体内通过感染肿瘤样组
织或其他哺乳动物组织(例如在小牛皮肤上传代)重复传代而产生，这样可导致点突变或
重组事件的积累。在一些实例中，可以产生病毒毒株的两或多个传代。用病毒如痘苗病毒
在体外感染细胞及在体内感染动物对象的方法为本领域已知。含有肿瘤的以传代病毒或病
毒混合物的动物模型的产生也为本领域熟知，在本文别处描述。
[0240] 在另一实例中，可以进行一或多个病毒毒株的诱变，以产生具有多种遗传修饰的表达制备物。在这个实例中，病毒原种的各种诱变策略可用于随机诱变一组集合的病毒。
例如，亚硝酸可用于实现随机诱变(见例如Williams et al.(1971)J.Gen.Virol.，11：
95-101)。所得病毒制备物可以是具有异源基因组的病毒。
例如，亚硝酸可用于实现随机诱变(见例如Williams et al.(1971)J.Gen.Virol.，11：
95-101)。所得病毒制备物可以是具有异源基因组的病毒。
[0241] 典型地，亲代病毒制备物或混合物是其中在用于所述方法之前未尝试进行克隆纯化接种体。在一些实例中，所述病毒制备物是通过病毒毒株在体内传代一或多次获得的。在
一些实例中，所述病毒制备物是通过在体外传代一或多次获得的。在一些实例中，所述病毒
制备物是通过在体外传代一或多次及在体内另外传代一或多次而获得的。在另一实例中，
所述病毒制备物是通过繁殖通过用一群病毒毒株感染培养系统得到的混合物而获得的，所
述病毒日痘苗病毒的克隆毒株、痘苗病毒的非克隆毒株，或者痘苗病毒的克隆与非克隆毒
株的组合。
一些实例中，所述病毒制备物是通过在体外传代一或多次获得的。在一些实例中，所述病毒
制备物是通过在体外传代一或多次及在体内另外传代一或多次而获得的。在另一实例中，
所述病毒制备物是通过繁殖通过用一群病毒毒株感染培养系统得到的混合物而获得的，所
述病毒日痘苗病毒的克隆毒株、痘苗病毒的非克隆毒株，或者痘苗病毒的克隆与非克隆毒
株的组合。
[0242] 在特定的实例中，亲代病毒制备物或混合物包括Lister痘苗病毒毒株。在另一实例中，亲代病毒毒株制备物或混合物包括衍生自在细胞培养中传代的Lister痘苗病毒毒
株的病毒毒株。在特定的实例中，所述亲代病毒毒株制备物或混合物衍生自在细胞培养如
在肿瘤细胞培养物中传代的Lister痘苗病毒毒株。在特定的实例中，所述亲代病毒毒株制
备物或混合物衍生自在体内如在移植的肿瘤中传代的Lister痘苗病毒毒株。在特定的实
例中，通过对对象进行皮肤接种，如小牛皮肤接种，自在体内传代的Lister痘苗病毒毒株
衍生出亲代病毒毒株混合物。
株的病毒毒株。在特定的实例中，所述亲代病毒毒株制备物或混合物衍生自在细胞培养如
在肿瘤细胞培养物中传代的Lister痘苗病毒毒株。在特定的实例中，所述亲代病毒毒株制
备物或混合物衍生自在体内如在移植的肿瘤中传代的Lister痘苗病毒毒株。在特定的实
例中，通过对对象进行皮肤接种，如小牛皮肤接种，自在体内传代的Lister痘苗病毒毒株
衍生出亲代病毒毒株混合物。
[0243] 用于所述方法中的典型的亲代病毒毒株制备物或混合物包括LIVP痘苗病毒，其具有序列非同质的基因组。LIVP源自Lister毒株(ATCC Catalog No.VR-1549)，由位于
俄罗斯莫斯科的Institute of Viral Preparations使其适应于小牛皮肤(Al’tshtein
et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR285：696-699)。所述LIVP毒株可得自位于俄罗斯
莫 斯 科 的 Institute of Viral Preparations(Kutinova et al.(1995)Vaccine，13：
487-493)；Microorganism Collection of FSRI SRC VB Vector(Kozlova et al.(2010)
Environ.Sci.Technol.，44：5121-5126)；或者可以得自Moscow Ivanovsky Institute
of Virology(C0355K0602；Agranovski et al.(2006)Atmospheric Environment，40：
3924-3929)。本领域技术人员熟知其是在USSR和亚洲及印度用于免疫接种的疫苗毒株。
该毒株目前由研究人员使用并熟知(见例如Altshteyn et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk
USSR285：696-699；Kutinova et al.(1994)Arch Virol134：1-9；Kutinova et al.，(1995)
Vaccine13：487-493；Shchelkunov et al.，(1993)Virus Research28：273-283；Sroller
et al.(1998)Archives Virology 143：1311-1320；Zinoviev et al.，(1994)Gene147：
209-214；Chkheidze et al.(1993)FEBS336：340-342)。LIVP较WR毒株呈现出较低毒力。
称作GLV-1h68(如SEQ ID NO：9所示；GenBank Acc.No.EU410304)和GLV-1h64(如SEQ ID
NO：326所示)的LIVP的重组衍生物与其亲代LIVP毒株(如SEQ ID NO：10所示)和WR毒
株相比呈现出肿瘤靶向性质和改良的安全性(Zhang et al.(2009)Mol.Genet.Genomics，
282：417-435)。
俄罗斯莫斯科的Institute of Viral Preparations使其适应于小牛皮肤(Al’tshtein
et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR285：696-699)。所述LIVP毒株可得自位于俄罗斯
莫 斯 科 的 Institute of Viral Preparations(Kutinova et al.(1995)Vaccine，13：
487-493)；Microorganism Collection of FSRI SRC VB Vector(Kozlova et al.(2010)
Environ.Sci.Technol.，44：5121-5126)；或者可以得自Moscow Ivanovsky Institute
of Virology(C0355K0602；Agranovski et al.(2006)Atmospheric Environment，40：
3924-3929)。本领域技术人员熟知其是在USSR和亚洲及印度用于免疫接种的疫苗毒株。
该毒株目前由研究人员使用并熟知(见例如Altshteyn et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk
USSR285：696-699；Kutinova et al.(1994)Arch Virol134：1-9；Kutinova et al.，(1995)
Vaccine13：487-493；Shchelkunov et al.，(1993)Virus Research28：273-283；Sroller
et al.(1998)Archives Virology 143：1311-1320；Zinoviev et al.，(1994)Gene147：
209-214；Chkheidze et al.(1993)FEBS336：340-342)。LIVP较WR毒株呈现出较低毒力。
称作GLV-1h68(如SEQ ID NO：9所示；GenBank Acc.No.EU410304)和GLV-1h64(如SEQ ID
NO：326所示)的LIVP的重组衍生物与其亲代LIVP毒株(如SEQ ID NO：10所示)和WR毒
株相比呈现出肿瘤靶向性质和改良的安全性(Zhang et al.(2009)Mol.Genet.Genomics，
282：417-435)。
[0244] 在特定的实例中，含有混合的痘苗病毒群的病毒制备物是通过用痘苗病毒毒株如LIVP及用另一类型病毒或者用基因组DNA或克隆的DNA感染细胞或组织而产生的。典型的
其它病毒类型包括但不限于DNA病毒，如其它痘病毒(如禽痘病毒、粘液瘤病毒)、疱疹病毒
(如单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、嗜肝DNA病毒(如
乙型肝炎病毒)、多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；单链DNA病毒，如细小病毒；
双链RNA病毒，如呼肠孤病毒(如轮状病毒)；单链正义RNA病毒，如小RNA病毒(如Seneca
valley病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒)、披膜病毒(如西门利克森林病毒)
及逆转录病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)、Maloney鼠白血病病毒(MMLV)，慢病毒)；单链
负义RNA病毒，如正粘病毒(如流感病毒)、副粘病毒(如新城疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病
毒)和棒状病毒(如水泡性口炎病毒(VSV))。
其它病毒类型包括但不限于DNA病毒，如其它痘病毒(如禽痘病毒、粘液瘤病毒)、疱疹病毒
(如单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、嗜肝DNA病毒(如
乙型肝炎病毒)、多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒；单链DNA病毒，如细小病毒；
双链RNA病毒，如呼肠孤病毒(如轮状病毒)；单链正义RNA病毒，如小RNA病毒(如Seneca
valley病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒)、披膜病毒(如西门利克森林病毒)
及逆转录病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)、Maloney鼠白血病病毒(MMLV)，慢病毒)；单链
负义RNA病毒，如正粘病毒(如流感病毒)、副粘病毒(如新城疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病
毒)和棒状病毒(如水泡性口炎病毒(VSV))。
[0245] 2.分离克隆毒株
[0246] 从含有混合的痘苗病毒群的病毒制备物中，选择克隆分离株。从病毒混合物中分离各个克隆的方法为本领域技术人员熟知。典型的这种方法是标准噬斑测定。噬斑测定是
测量病毒噬斑的形成，其是在病毒感染单层后病毒对细胞的裂解区域。每个噬斑代表一个
单一克隆病毒毒株。
测量病毒噬斑的形成，其是在病毒感染单层后病毒对细胞的裂解区域。每个噬斑代表一个
单一克隆病毒毒株。
[0247] 在典型的噬斑测定中，使细胞单层生长为接近铺满，然后用如本文所述的系列稀释的病毒制备物或混合物感染。用病毒感染细胞导致细胞裂解并感染相邻的细胞，由此噬
斑反映了一组细胞的感染。通常地，每个噬斑代表具有同源基因组序列的一个病毒。使用系
列稀释的病毒以保证充分定义的代表单个克隆病毒毒株的噬斑的分离。典型地，使用琼脂
糖覆盖以保持细胞稳定及限制病毒的传播。克隆病毒毒株可以通过分离各个噬斑而纯化。
斑反映了一组细胞的感染。通常地，每个噬斑代表具有同源基因组序列的一个病毒。使用系
列稀释的病毒以保证充分定义的代表单个克隆病毒毒株的噬斑的分离。典型地，使用琼脂
糖覆盖以保持细胞稳定及限制病毒的传播。克隆病毒毒株可以通过分离各个噬斑而纯化。
[0248] 任何多种细胞类型均可用于感染。本领域技术人员可鉴别适当的靶细胞系以用于噬斑测定中。针对噬斑测定的适当细胞系的选择可依赖于已知因素，如细胞感染性和病毒
在靶细胞中繁殖及裂解该靶细胞的能力。在噬斑测定中常用于DNA病毒感染的典型的细胞
系包括但不限于CV-1(猴肾)，Vero(猴肾)，BHK(仓鼠肾)，RK13(兔肾)和HEK-293(人
胚肾)细胞。在一些实例中，所述病毒可以通过感染肿瘤细胞系的细胞单层而选择，例如
HT29(结肠)，A549(肺)，H2009(肺)，DU145(前列腺)，PC-3(前列腺)，MB231(乳腺)，
GI-101A(乳腺)，Panc-1(胰腺)，Hlac(头颈)或者可形成细胞单层的其它肿瘤细胞系。
在靶细胞中繁殖及裂解该靶细胞的能力。在噬斑测定中常用于DNA病毒感染的典型的细胞
系包括但不限于CV-1(猴肾)，Vero(猴肾)，BHK(仓鼠肾)，RK13(兔肾)和HEK-293(人
胚肾)细胞。在一些实例中，所述病毒可以通过感染肿瘤细胞系的细胞单层而选择，例如
HT29(结肠)，A549(肺)，H2009(肺)，DU145(前列腺)，PC-3(前列腺)，MB231(乳腺)，
GI-101A(乳腺)，Panc-1(胰腺)，Hlac(头颈)或者可形成细胞单层的其它肿瘤细胞系。
[0249] 在一个实例中，将细胞用痘苗病毒制备物或混合物感染，并如所述生长细胞单层。所述噬斑通常选自含有少于50个噬斑的平板，以避免污染来自其它噬斑的病毒。一旦已经
选择了特定噬斑，可以使用标准方法通过回收纯化克隆病毒毒株。例如，可以使用无菌微量
吸管或试管通过除去在噬斑上的琼脂糖覆盖物而将选择的噬斑直接挑取置于含有组织培
养基的新鲜试管中。通过混合或旋转该试管可以将病毒颗粒从琼脂糖中洗脱出。洗脱的介
质可以在含有细胞的细胞培养皿或平板的孔中稀释，并保温以使得所述病毒繁殖。可以收
集病毒上清，离心以除去杂物并贮存。对于另外的原种(stocks)可进行连续传代，传代数
应最小化并记录。可应用一或多次连续噬斑选择循环，以保证分离单一克隆病毒毒株。病
毒的相同性可以通过测序、限制分离、PCR、Southern印迹或者通过蛋白质表达而证实。
选择了特定噬斑，可以使用标准方法通过回收纯化克隆病毒毒株。例如，可以使用无菌微量
吸管或试管通过除去在噬斑上的琼脂糖覆盖物而将选择的噬斑直接挑取置于含有组织培
养基的新鲜试管中。通过混合或旋转该试管可以将病毒颗粒从琼脂糖中洗脱出。洗脱的介
质可以在含有细胞的细胞培养皿或平板的孔中稀释，并保温以使得所述病毒繁殖。可以收
集病毒上清，离心以除去杂物并贮存。对于另外的原种(stocks)可进行连续传代，传代数
应最小化并记录。可应用一或多次连续噬斑选择循环，以保证分离单一克隆病毒毒株。病
毒的相同性可以通过测序、限制分离、PCR、Southern印迹或者通过蛋白质表达而证实。
[0250] 在本发明方法的特定实例中，基于治疗肿瘤或转移所需的性质选择克隆病毒毒株。例如，在噬斑测定中形成的噬斑是由于病毒的复制或感染性质形成的。噬斑的大小是感
染性和病毒产生的指征。例如，噬斑越大，则细胞裂解和病毒传播的速度就越高。对于肿瘤
治疗，通常需要所述病毒具有高感染率和/或高细胞裂解速度。因此，选择的病毒噬斑典型
较大(即直径较大)。因此，在本发明方法的一些实例中，选择在噬斑测定(如在平板上)
中最大的噬斑。例如，在噬斑的选择中，在噬斑大小不同的情况中，选择最大的噬斑，如选择
至少最大的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个、15或更多个、20或更多个、25个或更多个噬斑。将每个选择的噬斑分离、繁殖，恢复克隆病毒。可以检测每个病毒克隆原种的抗肿瘤发
生能力和毒性。
染性和病毒产生的指征。例如，噬斑越大，则细胞裂解和病毒传播的速度就越高。对于肿瘤
治疗，通常需要所述病毒具有高感染率和/或高细胞裂解速度。因此，选择的病毒噬斑典型
较大(即直径较大)。因此，在本发明方法的一些实例中，选择在噬斑测定(如在平板上)
中最大的噬斑。例如，在噬斑的选择中，在噬斑大小不同的情况中，选择最大的噬斑，如选择
至少最大的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个、15或更多个、20或更多个、25个或更多个噬斑。将每个选择的噬斑分离、繁殖，恢复克隆病毒。可以检测每个病毒克隆原种的抗肿瘤发
生能力和毒性。
[0251] 在另一实例中，在分离克隆病毒之前，可以针对病毒的抗肿瘤发生能力或毒性预选病毒制备混合物。例如，可以通过将病毒混合物在体外在肿瘤细胞系中传代(Yan
et al.(2003)J Virol.77：2640-2650)，或者在体内在肿瘤动物模型中传代(Gros et
al.(2008)Cancer Res.68：8928)或者通过在健康动物模型在体内传代进行预选。本领域
技术人员已知多种肿瘤细胞系或肿瘤动物模型，在本文对其加以描述。例如，病毒混合物
可用于感染在体外或动物的肿瘤细胞，并进行多次选择循环。例如，对于在体外选择，可以
将病毒在肿瘤细胞系中连续传代，并从与致细胞病变(CPE)相关的细胞中回收病毒。在另
一实例中，对于在体内选择，可以将病毒连续用于感染携带肿瘤的动物，监测体重和肿瘤体
积，并从具有肿瘤生长抑制的小鼠的血液或肿瘤中回收病毒。在进一步的实例中，对于体内
选择以预选毒性，可以将病毒连续用于感染正常动物，监测体重，并从体重降低最小的小鼠
的血液中回收病毒。随后可以使用噬斑测定分离根据其抗肿瘤发生能力和/或毒性预选的
回收的病毒。如上所述，可以选择最大的噬斑以分离具有高复制性或感染性的病毒克隆。
et al.(2003)J Virol.77：2640-2650)，或者在体内在肿瘤动物模型中传代(Gros et
al.(2008)Cancer Res.68：8928)或者通过在健康动物模型在体内传代进行预选。本领域
技术人员已知多种肿瘤细胞系或肿瘤动物模型，在本文对其加以描述。例如，病毒混合物
可用于感染在体外或动物的肿瘤细胞，并进行多次选择循环。例如，对于在体外选择，可以
将病毒在肿瘤细胞系中连续传代，并从与致细胞病变(CPE)相关的细胞中回收病毒。在另
一实例中，对于在体内选择，可以将病毒连续用于感染携带肿瘤的动物，监测体重和肿瘤体
积，并从具有肿瘤生长抑制的小鼠的血液或肿瘤中回收病毒。在进一步的实例中，对于体内
选择以预选毒性，可以将病毒连续用于感染正常动物，监测体重，并从体重降低最小的小鼠
的血液中回收病毒。随后可以使用噬斑测定分离根据其抗肿瘤发生能力和/或毒性预选的
回收的病毒。如上所述，可以选择最大的噬斑以分离具有高复制性或感染性的病毒克隆。
[0252] 在从病毒制备物或混合物中分离一或多个病毒毒株之后，基于抗肿瘤发生能力和毒性性质可以进一步选择克隆病毒毒株作为进行治疗的候选物。
[0253] 3.抗肿瘤发生能力
[0254] 进一步检测分离的病毒的指示其抗肿瘤发生能力的参数。通常地，选择的参数是治疗增生性疾病和病症、包括治疗肿瘤和转移所需的。例如，病毒可通过复制而破坏肿瘤细
胞，由此病毒的持续扩增导致相邻细胞的感染及其随后被破坏。溶瘤病毒通过对于癌细胞
具有细胞毒性的蛋白质的表达也呈现出抗肿瘤发生能力。在进一步的实例中，病毒可以通
过起始特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答而呈现出抗肿瘤发生能力，例如起始感染的细胞
中细胞因子(如TNF)表达或者通过特异性应答(例如CTL应答)呈现。因此，可以评估任
何上述参数作为病毒的抗肿瘤发生能力的指征。
胞，由此病毒的持续扩增导致相邻细胞的感染及其随后被破坏。溶瘤病毒通过对于癌细胞
具有细胞毒性的蛋白质的表达也呈现出抗肿瘤发生能力。在进一步的实例中，病毒可以通
过起始特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答而呈现出抗肿瘤发生能力，例如起始感染的细胞
中细胞因子(如TNF)表达或者通过特异性应答(例如CTL应答)呈现。因此，可以评估任
何上述参数作为病毒的抗肿瘤发生能力的指征。
[0255] 例如，在一或多个进一步的体外和/或体内测定中检测分离的病毒，评估感染性、病毒核酸复制、病毒产生、肿瘤细胞中病毒基因表达、最宿主细胞的作用、肿瘤细胞的细胞
毒性、肿瘤细胞选择性、肿瘤细胞类型选择性、特异性和非特异性免疫应答，及治疗效力。可
以在体外或体内评估指示抗肿瘤发生能力的参数。在特定的实例中，在体内评估抗肿瘤发
生能力。抗肿瘤发生能力的体内参数包括但不限于在癌症动物模型中希望的治疗指数，肿
瘤抗原的释放及在施用病毒后其在肿瘤组织中的优先积累。评估这种参数的典型的测定或
方法在下文描述。
毒性、肿瘤细胞选择性、肿瘤细胞类型选择性、特异性和非特异性免疫应答，及治疗效力。可
以在体外或体内评估指示抗肿瘤发生能力的参数。在特定的实例中，在体内评估抗肿瘤发
生能力。抗肿瘤发生能力的体内参数包括但不限于在癌症动物模型中希望的治疗指数，肿
瘤抗原的释放及在施用病毒后其在肿瘤组织中的优先积累。评估这种参数的典型的测定或
方法在下文描述。
[0256] a.肿瘤相关的复制指示物
[0257] 对于选择作为治疗的候选物，所述病毒通常呈现出在肿瘤细胞中的复制和/或感染性。因此，选择在肿瘤细胞中复制的克隆毒株。测量的所述复制指示物是任何参数，从
中可以评估或推断病毒复制的水平或量或相对量，典型在施用肿瘤细胞一天内测量。在一
些实例中，可以通过测量病毒复制指示物如病毒效价(即通过在噬斑测定中产生的噬斑数
评估)或者病毒基因表达或宿主基因表达中的改变而评估复制情况(见例如美国专利申请
2009-0136917)。例如，可以通过用检测病毒感染肿瘤细胞或者将检测病毒导入肿瘤细胞
中，在特定时间或者随着时间评估复制指示物，从而确定复制情况。这可以与预先确定的标
准进行对比，例如与亲代病毒制备物或混合物或者与其它参考毒株(例如重组病毒)对比，
或者与其它检测的候选克隆毒株对比。选择在肿瘤细胞中复制的病毒，如在体外或体内评
估。在特定的实例中，选择与在正常细胞中相比在肿瘤细胞中选择性复制的病毒。
中可以评估或推断病毒复制的水平或量或相对量，典型在施用肿瘤细胞一天内测量。在一
些实例中，可以通过测量病毒复制指示物如病毒效价(即通过在噬斑测定中产生的噬斑数
评估)或者病毒基因表达或宿主基因表达中的改变而评估复制情况(见例如美国专利申请
2009-0136917)。例如，可以通过用检测病毒感染肿瘤细胞或者将检测病毒导入肿瘤细胞
中，在特定时间或者随着时间评估复制指示物，从而确定复制情况。这可以与预先确定的标
准进行对比，例如与亲代病毒制备物或混合物或者与其它参考毒株(例如重组病毒)对比，
或者与其它检测的候选克隆毒株对比。选择在肿瘤细胞中复制的病毒，如在体外或体内评
估。在特定的实例中，选择与在正常细胞中相比在肿瘤细胞中选择性复制的病毒。
[0258] 评估复制的测定可以对在各种肿瘤细胞系、原始组织或细胞以及肿瘤细胞如来自活检的细胞中在体外繁殖的病毒的细胞裂解物进行。例如，可以从对象(如人或非人动物
对象)获得组织或细胞样品(如活检组织)，及可以将该样品用一或多种类型病毒感染。在
其它实例中，可以使用肿瘤细胞系。肿瘤细胞系为本领域技术人员已知及可利用，例如得自
American Type Culture Collection(ATTC；Manassas，VA)或者得自European Collection
of Cell Cultures(ECACC)。肿瘤细胞系也可得自Division of Cancer Treatment and
Diagnosis(DCTD)Tumor Repository(National Cancer Institute/National Institute
of Health；dtp.nih.gov/index.html.)。典型的肿瘤细胞系包括人及其它动物细胞系，包
括但不限于DU145人前列腺癌细胞、LNCaP人前列腺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MRC-5人
肺成纤维细胞、MDA-MB-438人乳腺癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞、PC3人前列腺癌细
胞、T47D人乳腺癌细胞、THP-1人急性髓性白血病细胞、U87人成胶质细胞瘤细胞、SH-SY5Y
人成神经细胞瘤细胞、Saos-2人细胞、A549人肺癌细胞、A2780人卵巢癌细胞、HCT116人结
肠细胞、HT-29人结肠细胞、SW260人结肠细胞、HT-180人纤维肉瘤、MIA PaCa-2人胰腺癌
细胞、PANC-1人胰腺细胞、CMT64C57BL/6小鼠细胞、JC小鼠乳腺细胞、TIB-75小鼠肝细胞、
CT26WT小鼠结肠癌细胞、MC-38小鼠腺癌细胞、B16-F10小鼠黑素瘤细胞、4T1鼠乳腺癌细胞
及仓鼠胰腺肿瘤HP-1细胞。
对象)获得组织或细胞样品(如活检组织)，及可以将该样品用一或多种类型病毒感染。在
其它实例中，可以使用肿瘤细胞系。肿瘤细胞系为本领域技术人员已知及可利用，例如得自
American Type Culture Collection(ATTC；Manassas，VA)或者得自European Collection
of Cell Cultures(ECACC)。肿瘤细胞系也可得自Division of Cancer Treatment and
Diagnosis(DCTD)Tumor Repository(National Cancer Institute/National Institute
of Health；dtp.nih.gov/index.html.)。典型的肿瘤细胞系包括人及其它动物细胞系，包
括但不限于DU145人前列腺癌细胞、LNCaP人前列腺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MRC-5人
肺成纤维细胞、MDA-MB-438人乳腺癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞、PC3人前列腺癌细
胞、T47D人乳腺癌细胞、THP-1人急性髓性白血病细胞、U87人成胶质细胞瘤细胞、SH-SY5Y
人成神经细胞瘤细胞、Saos-2人细胞、A549人肺癌细胞、A2780人卵巢癌细胞、HCT116人结
肠细胞、HT-29人结肠细胞、SW260人结肠细胞、HT-180人纤维肉瘤、MIA PaCa-2人胰腺癌
细胞、PANC-1人胰腺细胞、CMT64C57BL/6小鼠细胞、JC小鼠乳腺细胞、TIB-75小鼠肝细胞、
CT26WT小鼠结肠癌细胞、MC-38小鼠腺癌细胞、B16-F10小鼠黑素瘤细胞、4T1鼠乳腺癌细胞
及仓鼠胰腺肿瘤HP-1细胞。
[0259] 例如，可以将细胞或细胞系种植在平板的孔上。然后加入病毒，并使其感染细胞。在感染结束时，可以改变介质以除去任何剩余的病毒，并将细胞进一步保温。然后，可以将
细胞刮入介质中并收集。细胞可以例如通过冷冻-解冻和/或超声处理裂解，以获得含有
病毒的裂解物。复制程度可以例如通过如下文所述的确定病毒效价或表达而测量。应理解
病毒的复制和/或感染性的范围(extent)和程度(degree)在不同肿瘤细胞类型之间是不
同的。
细胞刮入介质中并收集。细胞可以例如通过冷冻-解冻和/或超声处理裂解，以获得含有
病毒的裂解物。复制程度可以例如通过如下文所述的确定病毒效价或表达而测量。应理解
病毒的复制和/或感染性的范围(extent)和程度(degree)在不同肿瘤细胞类型之间是不
同的。
[0260] 评估复制的测定也可以对在感染携带肿瘤的动物时在体内增殖的肿瘤-收获的病毒进行。这种测定是测量病毒在肿瘤组织中的积累。如下文所述，可以通过植入不同类
型的肿瘤细胞在动物中建立肿瘤。例如，可以用病毒、在肿瘤中繁殖的病毒及从中提取的病
毒或肿瘤感染携带肿瘤的动物。复制程度可以例如通过确定病毒效价或者基因的表达进行
测量，如下文进一步描述。
型的肿瘤细胞在动物中建立肿瘤。例如，可以用病毒、在肿瘤中繁殖的病毒及从中提取的病
毒或肿瘤感染携带肿瘤的动物。复制程度可以例如通过确定病毒效价或者基因的表达进行
测量，如下文进一步描述。
[0261] 在一个实例中，来自感染的细胞或肿瘤细胞提取物的细胞培养上清或细胞裂解物可以在感染后获得，并进行测定以测量病毒效价。例如，可以使用标准噬斑测定。所述噬斑
测定可以指示在不同细胞类型中的生物学活性，包括不同的肿瘤细胞类型。本领域技术人
员已知通过噬斑测定测量的病毒滴定。在噬斑测定的一个实例中，收获用所述病毒感染的
-2 -10
肿瘤或细胞的上清或细胞裂解物，进行噬斑测定。典型地，产生在10 (1：100)至10 范围
-5 -10
的所述病毒上清或裂解物的系列稀释液，特别是10 至10 范围。将稀释的病毒加入细胞
单层中，例如容许细胞系的单层，如CV-1、Vero、BHK、RK13或HEK-293细胞系，并与病毒一
起保温。在一些实例中，所述噬斑测定可以直接对肿瘤细胞的细胞单层进行，条件是所述肿
瘤细胞可以形成单层。在保温之后，将琼脂糖覆盖物加入所述细胞单层，不移动细胞，将平
板进一步保温直至噬斑变得可见。在每个孔或平板中加入被健康细胞嗜好但死亡细胞不嗜
的染料或着色剂溶液，如中性红。在保温后，除去所述染料或着色剂，由此清晰观测噬斑，而
未裂解的细胞保持染色。效价(pfu/mL)是通过计数孔中噬斑数，除以稀释因子(d)及加入
孔中的稀释的病毒的体积(V)而计算(#噬斑/d×V)。通过将样品中存在的病毒的总量除
以样品中最初感染的细胞数可以将病毒产量转变为pfu/细胞。
测定可以指示在不同细胞类型中的生物学活性，包括不同的肿瘤细胞类型。本领域技术人
员已知通过噬斑测定测量的病毒滴定。在噬斑测定的一个实例中，收获用所述病毒感染的
-2 -10
肿瘤或细胞的上清或细胞裂解物，进行噬斑测定。典型地，产生在10 (1：100)至10 范围
-5 -10
的所述病毒上清或裂解物的系列稀释液，特别是10 至10 范围。将稀释的病毒加入细胞
单层中，例如容许细胞系的单层，如CV-1、Vero、BHK、RK13或HEK-293细胞系，并与病毒一
起保温。在一些实例中，所述噬斑测定可以直接对肿瘤细胞的细胞单层进行，条件是所述肿
瘤细胞可以形成单层。在保温之后，将琼脂糖覆盖物加入所述细胞单层，不移动细胞，将平
板进一步保温直至噬斑变得可见。在每个孔或平板中加入被健康细胞嗜好但死亡细胞不嗜
的染料或着色剂溶液，如中性红。在保温后，除去所述染料或着色剂，由此清晰观测噬斑，而
未裂解的细胞保持染色。效价(pfu/mL)是通过计数孔中噬斑数，除以稀释因子(d)及加入
孔中的稀释的病毒的体积(V)而计算(#噬斑/d×V)。通过将样品中存在的病毒的总量除
以样品中最初感染的细胞数可以将病毒产量转变为pfu/细胞。
[0262] 通常地，在本发明的方法中，如果pfu/ml是或者大约是1×102至1×1010，如3 9 4 8 3 4 5 6
5×10 至1×10，例如1×10 至1×10，特别是或者至少是1×10、1×10、1×10、1×10、
7 8 9
1×10、1×10 或者1×10，则选择呈现出指示抗肿瘤发生能力的参数的病毒。在其它实例
中，在本发明的方法中，如果pfu/细胞是或者大约是2-10000，如10-5000，例如100-2000，
及特别是或者至少是10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、
5000或更多，则选择呈现出指示抗肿瘤发生能力的参数的病毒。典型地，选择呈现出指示抗
肿瘤发生能力的病毒，如果复制(pfu/ml或pfu/细胞)与参考病毒制备物或混合物或者其
它参考病毒(如重组蛋白)相似或较好。
5×10 至1×10，例如1×10 至1×10，特别是或者至少是1×10、1×10、1×10、1×10、
7 8 9
1×10、1×10 或者1×10，则选择呈现出指示抗肿瘤发生能力的参数的病毒。在其它实例
中，在本发明的方法中，如果pfu/细胞是或者大约是2-10000，如10-5000，例如100-2000，
及特别是或者至少是10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、
5000或更多，则选择呈现出指示抗肿瘤发生能力的参数的病毒。典型地，选择呈现出指示抗
肿瘤发生能力的病毒，如果复制(pfu/ml或pfu/细胞)与参考病毒制备物或混合物或者其
它参考病毒(如重组蛋白)相似或较好。
[0263] 也可以评估其它复制指示物。例如，可以评估在肿瘤细胞中与病毒复制和/或感染性相关的病毒基因、肿瘤蛋白和/或管家基因的表达(见例如美国专利申请
2009-0136917)。例如，可以评估在肿瘤细胞中与复制和感染性相关的管家基因或其它基因
的表达(美国专利申请2009-0136917)。例如，评估多个这样的基因的表达，如管家基因，在
用病毒感染时在肿瘤细胞中的表达增加。可以评估的典型的这种的基因包括编码选自如下
的蛋白质的一或多个基因的表达：IL-18(白细胞介素-18)，MCP-5(单核细胞趋化蛋白-5；
CCL12)，IL-11(白细胞介素-11)，MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)、MPO(髓过氧物酶)、Apo
A1(载脂蛋白A1)、TIMP-1(金属蛋白的组织抑制剂类型-1)、CRP(C反应蛋白)、纤维蛋白
原、MMP-9(基质金属蛋白酶-9)、Eotaxin(CCL11)、GCP-2(粒细胞趋化蛋白-2；CXCL6)、
IL-6(白细胞介素-6)、组织因子(TF)、SAP(血清淀粉样蛋白P)、FGF-basic(成纤维细胞
生长因子-basic)、MCP-3(单核细胞趋化蛋白-3；CCL7)、IP-10(CXCL10)、MIP-2、血小板生
成素、癌抗原125、CD40、CD40配体、ENA-78、糖蛋白、IL-12p40、IL-12p70、IL-16、MMP-2、PAI-1、TNF RII、TNF-β和VCAM-1。在另一实例中，评估多个基因的表达，如管家基因，在
用病毒感染时其在肿瘤细胞中表达降低。典型的这种基因包括编码选自如下的蛋白质的一
或多个基因：MIP-1β(巨噬细胞炎症蛋白-1β)、MDC(巨噬细胞产生的趋化因子；CCL22)、
MIP-1α(巨噬细胞炎症蛋白-1α；CCL3)、KC/GROalpha(黑素瘤生长刺激活性蛋白)、
VEGF(血管内皮细胞生长因子)、内皮素-1、MIP-3β(巨噬细胞炎症蛋白-3β；Exodus-3或
ELC)、β-2微球蛋白、IL-5(白细胞介素-5)、IL-1α(白细胞介素-1α)、EGF(表皮生长因
子)、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子)、MIP-1γ(巨噬
细胞炎症蛋白-1γ；CCL4)、IL-lbeta(白细胞介素-1β)、BDNF(脑源神经生长因子)、癌抗
原19-9、癌胚抗原、C反应蛋白、EGF、脂肪酸结合蛋白、因子VII、生长激素、IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-7、IL-8、MDC、前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、游离的干细胞因子、组织因子、TNF-α、VEGF和Von Willebrand因子。
2009-0136917)。例如，可以评估在肿瘤细胞中与复制和感染性相关的管家基因或其它基因
的表达(美国专利申请2009-0136917)。例如，评估多个这样的基因的表达，如管家基因，在
用病毒感染时在肿瘤细胞中的表达增加。可以评估的典型的这种的基因包括编码选自如下
的蛋白质的一或多个基因的表达：IL-18(白细胞介素-18)，MCP-5(单核细胞趋化蛋白-5；
CCL12)，IL-11(白细胞介素-11)，MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)、MPO(髓过氧物酶)、Apo
A1(载脂蛋白A1)、TIMP-1(金属蛋白的组织抑制剂类型-1)、CRP(C反应蛋白)、纤维蛋白
原、MMP-9(基质金属蛋白酶-9)、Eotaxin(CCL11)、GCP-2(粒细胞趋化蛋白-2；CXCL6)、
IL-6(白细胞介素-6)、组织因子(TF)、SAP(血清淀粉样蛋白P)、FGF-basic(成纤维细胞
生长因子-basic)、MCP-3(单核细胞趋化蛋白-3；CCL7)、IP-10(CXCL10)、MIP-2、血小板生
成素、癌抗原125、CD40、CD40配体、ENA-78、糖蛋白、IL-12p40、IL-12p70、IL-16、MMP-2、PAI-1、TNF RII、TNF-β和VCAM-1。在另一实例中，评估多个基因的表达，如管家基因，在
用病毒感染时其在肿瘤细胞中表达降低。典型的这种基因包括编码选自如下的蛋白质的一
或多个基因：MIP-1β(巨噬细胞炎症蛋白-1β)、MDC(巨噬细胞产生的趋化因子；CCL22)、
MIP-1α(巨噬细胞炎症蛋白-1α；CCL3)、KC/GROalpha(黑素瘤生长刺激活性蛋白)、
VEGF(血管内皮细胞生长因子)、内皮素-1、MIP-3β(巨噬细胞炎症蛋白-3β；Exodus-3或
ELC)、β-2微球蛋白、IL-5(白细胞介素-5)、IL-1α(白细胞介素-1α)、EGF(表皮生长因
子)、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子)、MIP-1γ(巨噬
细胞炎症蛋白-1γ；CCL4)、IL-lbeta(白细胞介素-1β)、BDNF(脑源神经生长因子)、癌抗
原19-9、癌胚抗原、C反应蛋白、EGF、脂肪酸结合蛋白、因子VII、生长激素、IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-7、IL-8、MDC、前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、游离的干细胞因子、组织因子、TNF-α、VEGF和Von Willebrand因子。
[0264] 基因表达可以在将肿瘤样品与病毒在体外或体内接触一段时间，及测量一或多个管家基因或其它基因的表达水平之后测定。可以使用本领域已知的任何方法测定基因在肿
瘤细胞中的表达。例如，可以使用的测量蛋白质表达水平的方法包括但不限于微阵列分析，
ELISA测定，Western印迹，或者量化特定蛋白质的任何其它技术。对于RNA水平，可以使用
的典型的技术包括微阵列分析，定量PCR，Northern杂交，或者量化特定蛋白质的任何其它
技术。在一些实例中，接触及未接触的生物样品之间相同标记的表达中的差异为大约低于
2-倍、大约2-倍、大约3-倍、大约4-倍、大约5-倍、大约6-倍、大约7-倍、大约8-倍、大
约9-倍、大约10-倍、大约20-倍、大约30-倍、大约40-倍、大约50-倍、大约60-倍、大约
70-倍、大约80-倍、大约90-倍、大约100-倍或者高于大约100-倍，表示肿瘤细胞的特异
性复制和/感染性。在本发明的方法中，选择呈现出指示抗肿瘤发生能力的参数，如果所述
复制(增加或降低的基因表达)与参考病毒制备物或混合物或者其它参考病毒(例如重组
蛋白)相似或更好。
瘤细胞中的表达。例如，可以使用的测量蛋白质表达水平的方法包括但不限于微阵列分析，
ELISA测定，Western印迹，或者量化特定蛋白质的任何其它技术。对于RNA水平，可以使用
的典型的技术包括微阵列分析，定量PCR，Northern杂交，或者量化特定蛋白质的任何其它
技术。在一些实例中，接触及未接触的生物样品之间相同标记的表达中的差异为大约低于
2-倍、大约2-倍、大约3-倍、大约4-倍、大约5-倍、大约6-倍、大约7-倍、大约8-倍、大
约9-倍、大约10-倍、大约20-倍、大约30-倍、大约40-倍、大约50-倍、大约60-倍、大约
70-倍、大约80-倍、大约90-倍、大约100-倍或者高于大约100-倍，表示肿瘤细胞的特异
性复制和/感染性。在本发明的方法中，选择呈现出指示抗肿瘤发生能力的参数，如果所述
复制(增加或降低的基因表达)与参考病毒制备物或混合物或者其它参考病毒(例如重组
蛋白)相似或更好。
[0265] 为了对比病毒感染和复制率，典型随着时间进行测定。例如，评估病毒复制的样品典型在病毒感染细胞之后选择的时间获得，例如1小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24
小时、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天或更长时间。本领域技术人员可以选择合适
的时间点基于所述病毒与其它已知病毒毒株对比的相对感染性以评估病毒复制。
小时、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天或更长时间。本领域技术人员可以选择合适
的时间点基于所述病毒与其它已知病毒毒株对比的相对感染性以评估病毒复制。
[0266] 可以确定检测病毒与亲代病毒制备物或混合物或者其它参考或标准病毒之间和之中复制的延迟。预测在感染后呈现出在肿瘤细胞中延迟的复制的病毒对于特定细胞类
型的治疗不是有效的。同样，在体外或体内感染肿瘤细胞之后病毒的有效及提早复制表示
该病毒在体内对于肿瘤治疗的有利应答。因此，呈现出非延迟的复制的病毒通常是选择可
取的，作为治疗增生性疾病和病症的候选病毒。如果需要，可以根据经验确定选择的特定
时间价值(time value)。因此，所述复制指示物可以确定并例如可以与延迟的复制或非延
迟的复制的标准指示物对比。所述标准可以是预先确定的，如表示非延迟的复制或延迟的
复制的指示物值数据库。因此，例如可以将所述复制指示物与肿瘤细胞类型的预定值的数
据库对比，以确定所述复制指示物是否具有指示非延迟的复制的值(见例如美国专利申请
2009-0136917)。
型的治疗不是有效的。同样，在体外或体内感染肿瘤细胞之后病毒的有效及提早复制表示
该病毒在体内对于肿瘤治疗的有利应答。因此，呈现出非延迟的复制的病毒通常是选择可
取的，作为治疗增生性疾病和病症的候选病毒。如果需要，可以根据经验确定选择的特定
时间价值(time value)。因此，所述复制指示物可以确定并例如可以与延迟的复制或非延
迟的复制的标准指示物对比。所述标准可以是预先确定的，如表示非延迟的复制或延迟的
复制的指示物值数据库。因此，例如可以将所述复制指示物与肿瘤细胞类型的预定值的数
据库对比，以确定所述复制指示物是否具有指示非延迟的复制的值(见例如美国专利申请
2009-0136917)。
[0267] 可以确定病毒的不同剂量/感染复数(MOI，病毒与细胞的比率)，以评估病毒感染率及在不同感染水平的病毒产生。在较低MOI呈现出高复制率的病毒通常是选择可取的，
作为治疗增生性病症或疾病的候选病毒。例如，细胞可以在MOI为或在0.1-10，如0.5-5，
例如0.5-2之间感染，例如MOI为至少0.25、0.5、1、1.5、2或更高。
作为治疗增生性病症或疾病的候选病毒。例如，细胞可以在MOI为或在0.1-10，如0.5-5，
例如0.5-2之间感染，例如MOI为至少0.25、0.5、1、1.5、2或更高。
[0268] 在本发明的评估病毒复制或感染性的任何实例中，也可以评估病毒的肿瘤细胞选择性。例如，可以用病毒感染正常细胞和肿瘤细胞，随后使用本文所述或本领域技术人
员已知的任何测定法评估复制和感染性。例如，通过如下文描述的噬斑测定或通过基因表
达测量病毒效价可以在病毒感染的肿瘤细胞及病毒感染的正常细胞中确定。正常或非转
化的细胞包括但不限于MRC-5肺成纤维细胞，Beas-2B支气管上皮细胞，正常人支气管上
皮(NHBE)，小气道支气管上皮(SAEC)。肿瘤细胞包括本文描述的或者本领域技术人员已
知的任何细胞，包括但不限于A2780、A549、HCT116、HT1080、LNCaP或SW620细胞。在一些
实例中，成对的肿瘤和非肿瘤细胞系可以用病毒感染并对比。典型的相应的或成对的肿
瘤和非肿瘤细胞系为本领域技术人员已知(见例如Gazdar et al.(1998)Int.J.Cancer，
78：766-774，Theodore et al.(2010)Int.J Oncology，37：1477-1482；Niedbala et
al.(2001)Radiation Research，155：297-303)。在其它实例中，可以收获在体内感染的肿
瘤，并可以与也从相同感染的动物中提取的正常细胞或组织对比。可以评估并对比病毒在
正常细胞和肿瘤细胞中的感染与复制。病毒的治疗指数可以通过在肿瘤细胞与在正常细胞
中复制的比率确定(例如每个细胞产生的病毒；pfu/细胞)。在本发明的方法中，选择治疗
指数或比率为或者大约为2-5000如10-5000、100-2000及特别为至少100、200、300、400、
500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000，例如至少1000或至少2000的病毒。
员已知的任何测定法评估复制和感染性。例如，通过如下文描述的噬斑测定或通过基因表
达测量病毒效价可以在病毒感染的肿瘤细胞及病毒感染的正常细胞中确定。正常或非转
化的细胞包括但不限于MRC-5肺成纤维细胞，Beas-2B支气管上皮细胞，正常人支气管上
皮(NHBE)，小气道支气管上皮(SAEC)。肿瘤细胞包括本文描述的或者本领域技术人员已
知的任何细胞，包括但不限于A2780、A549、HCT116、HT1080、LNCaP或SW620细胞。在一些
实例中，成对的肿瘤和非肿瘤细胞系可以用病毒感染并对比。典型的相应的或成对的肿
瘤和非肿瘤细胞系为本领域技术人员已知(见例如Gazdar et al.(1998)Int.J.Cancer，
78：766-774，Theodore et al.(2010)Int.J Oncology，37：1477-1482；Niedbala et
al.(2001)Radiation Research，155：297-303)。在其它实例中，可以收获在体内感染的肿
瘤，并可以与也从相同感染的动物中提取的正常细胞或组织对比。可以评估并对比病毒在
正常细胞和肿瘤细胞中的感染与复制。病毒的治疗指数可以通过在肿瘤细胞与在正常细胞
中复制的比率确定(例如每个细胞产生的病毒；pfu/细胞)。在本发明的方法中，选择治疗
指数或比率为或者大约为2-5000如10-5000、100-2000及特别为至少100、200、300、400、
500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000，例如至少1000或至少2000的病毒。
[0269] b.细胞毒性
[0270] 为了选择作为治疗候选物，所述病毒通常呈现出针对肿瘤细胞的细胞毒性致细胞病变活性。因此，选择对于肿瘤细胞具有细胞毒性或者杀死肿瘤细胞的克隆毒株。可以根
据其通过诱导细胞死亡和/或肿瘤细胞裂解(即瘤细胞溶解)的消除肿瘤细胞的能力选择
克隆分离株。所述病毒的杀死细胞的活性可以通过本领域已知的各种技术评估，包括但不
限于细胞毒性/细胞存活性测定，其可用于测量在病毒感染后的细胞坏死和/或细胞凋亡，
如MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯基四唑溴化物)测定及其它相关的基于四
唑盐测定(例如XTT、MTS或WST)，ATP测定，细胞凋亡测定，如感染细胞的TUNEL染色，DNA
片段化测定，DNA梯测定，及细胞色素C释放测定。这种测定为本领域技术人员熟知。
据其通过诱导细胞死亡和/或肿瘤细胞裂解(即瘤细胞溶解)的消除肿瘤细胞的能力选择
克隆分离株。所述病毒的杀死细胞的活性可以通过本领域已知的各种技术评估，包括但不
限于细胞毒性/细胞存活性测定，其可用于测量在病毒感染后的细胞坏死和/或细胞凋亡，
如MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯基四唑溴化物)测定及其它相关的基于四
唑盐测定(例如XTT、MTS或WST)，ATP测定，细胞凋亡测定，如感染细胞的TUNEL染色，DNA
片段化测定，DNA梯测定，及细胞色素C释放测定。这种测定为本领域技术人员熟知。
[0271] 例如，可以评估病毒感染的细胞的存活力。可以将各种肿瘤细胞系，如任何上述或者本领域技术人员已知的肿瘤细胞系，种植在96孔平板中(例如密度为或者大约为5,000
个细胞/孔)或者其它规格的平板孔中，生长过夜，然后用系列稀释的病毒感染。例如，可以
检测病毒的各个MOI。MOI的范围可以是从例如1000至0.0001，如100-0.001或者10-0.01。
本领域技术人员可以根据经验选择或确定合适的MOI范围以使用。一旦感染，则将细胞保
温一段时间，之后评估细胞毒性。例如，评估细胞毒性的样品典型在病毒感染细胞之后选择
的时间点获得，例如1小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时、1.5天、2天、2.5天、3
天、4天、5天、6天或更长时间。本领域技术人员可以选择合适的时间点基于与其它已知病
毒毒株相比的所述病毒的相关感染性评估病毒复制。通常地，使感染进行至少12小时、24
小时、36小时、48小时、72小时、84小时、96小时或更长时间。
个细胞/孔)或者其它规格的平板孔中，生长过夜，然后用系列稀释的病毒感染。例如，可以
检测病毒的各个MOI。MOI的范围可以是从例如1000至0.0001，如100-0.001或者10-0.01。
本领域技术人员可以根据经验选择或确定合适的MOI范围以使用。一旦感染，则将细胞保
温一段时间，之后评估细胞毒性。例如，评估细胞毒性的样品典型在病毒感染细胞之后选择
的时间点获得，例如1小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时、1.5天、2天、2.5天、3
天、4天、5天、6天或更长时间。本领域技术人员可以选择合适的时间点基于与其它已知病
毒毒株相比的所述病毒的相关感染性评估病毒复制。通常地，使感染进行至少12小时、24
小时、36小时、48小时、72小时、84小时、96小时或更长时间。
[0272] 在感染指定一段时间之后，更换介质，基于本领域技术人员已知的任何测定或程序确定细胞存活力。评估存活力的典型的测定是比色测定，其使得可以基于代谢活性目
测细胞，并测量四唑盐对于有色甲臜(formazan)产物的还原潜力(如MTT测定，MTS测定
或XTT测定)。其它氧化还原反应测定包括测量细胞使氧化还原作用染料刃天青转变为荧
光终末产物试卤灵的能力的测定(McMillian et al.(2002)Cell Biol.Toxicology，18：
TM
157-173；CellTiter-Blue Cell Viability Assay，Promega)。在其它实例中，存活力可
以使用CASY细胞计数计数评估，这是基于与正常细胞相比存在通过损伤或死亡的细胞传
输的电场的电场多通道细胞计数系统(如 Model TT；Roche Innovatis AG)。其
它实例包括但不限于台盼蓝或碘化丙啶染料排阻测定，乳酸脱氢酶测定(LDH；见例如LDH
Cytotoxicity Detection Kit，Clontech，Cat.#630117)，磺酰罗丹明B(SRB)测定(如
TM
CytoScan SRB Cytotoxicity Assay，GBiosciences，Cat.No.786-213)，WST测定( 如
TM
Cytoscan WST-1Cell Proliferation Assay，GBiosciences，Cat No.786-212)，成克隆
TM
测定及基于萤光素酶的基于ATP测定(如CelTiter-Glo Luminexcent Cell Viability
Assay；Promega)。
测细胞，并测量四唑盐对于有色甲臜(formazan)产物的还原潜力(如MTT测定，MTS测定
或XTT测定)。其它氧化还原反应测定包括测量细胞使氧化还原作用染料刃天青转变为荧
光终末产物试卤灵的能力的测定(McMillian et al.(2002)Cell Biol.Toxicology，18：
TM
157-173；CellTiter-Blue Cell Viability Assay，Promega)。在其它实例中，存活力可
以使用CASY细胞计数计数评估，这是基于与正常细胞相比存在通过损伤或死亡的细胞传
输的电场的电场多通道细胞计数系统(如 Model TT；Roche Innovatis AG)。其
它实例包括但不限于台盼蓝或碘化丙啶染料排阻测定，乳酸脱氢酶测定(LDH；见例如LDH
Cytotoxicity Detection Kit，Clontech，Cat.#630117)，磺酰罗丹明B(SRB)测定(如
TM
CytoScan SRB Cytotoxicity Assay，GBiosciences，Cat.No.786-213)，WST测定( 如
TM
Cytoscan WST-1Cell Proliferation Assay，GBiosciences，Cat No.786-212)，成克隆
TM
测定及基于萤光素酶的基于ATP测定(如CelTiter-Glo Luminexcent Cell Viability
Assay；Promega)。
[0273] 通常地，使用不同对照物进行测定。例如，评估存活力的任何测定通常是用仅含有细胞(如100％存活)的未处理的孔以及无细胞的孔(0％存活)进行的。同样，除了检测
的克隆毒株的孔之外，可以检测其它对照病毒。例如，可以检测起始病毒制备物或混合物的
细胞毒性作用。在另一实例中，可以检测参考病毒毒株，如已知减毒的重组毒株。典型的这
种毒株是GLV-1h68或其含有插入的异源基因的衍生物。在加入病毒作对照的实例中，使用
的病毒的MOI的范围与检测的病毒克隆分离株相同。
的克隆毒株的孔之外，可以检测其它对照病毒。例如，可以检测起始病毒制备物或混合物的
细胞毒性作用。在另一实例中，可以检测参考病毒毒株，如已知减毒的重组毒株。典型的这
种毒株是GLV-1h68或其含有插入的异源基因的衍生物。在加入病毒作对照的实例中，使用
的病毒的MOI的范围与检测的病毒克隆分离株相同。
[0274] 选择呈现出致细胞病变或细胞毒性作用的病毒。例如，如果确定呈现出细胞存活力相对于仅含有细胞(100％存活)的未处理的孔中细胞存活力下降，则选择的检测克隆毒
株呈现出致细胞病变作用。在其它实例中，如果确定呈现出细胞存活力相对于用亲代病毒
混合物处理的孔中的细胞存活力降低，则选择的检测克隆毒株呈现出致细胞病变作用。在
进一步的实例中，如果确定呈现出细胞存活力相对于用已知参考的减毒的病毒毒株如减毒
的重组病毒(如GLV-1h68或其衍生物)处理的孔中细胞的存活力降低，选择的检测克隆毒
株呈现出致细胞病变作用。在任何上述实例中，如果在指定的MOI，细胞存活力低于对照细
胞(未处理的细胞，病毒混合物处理的或对照病毒毒株处理的细胞)存活力的100％，如为
对照处理的细胞的存活力的大约0％to99％，则选择的检测克隆毒株呈现出细胞毒性。
株呈现出致细胞病变作用。在其它实例中，如果确定呈现出细胞存活力相对于用亲代病毒
混合物处理的孔中的细胞存活力降低，则选择的检测克隆毒株呈现出致细胞病变作用。在
进一步的实例中，如果确定呈现出细胞存活力相对于用已知参考的减毒的病毒毒株如减毒
的重组病毒(如GLV-1h68或其衍生物)处理的孔中细胞的存活力降低，选择的检测克隆毒
株呈现出致细胞病变作用。在任何上述实例中，如果在指定的MOI，细胞存活力低于对照细
胞(未处理的细胞，病毒混合物处理的或对照病毒毒株处理的细胞)存活力的100％，如为
对照处理的细胞的存活力的大约0％to99％，则选择的检测克隆毒株呈现出细胞毒性。
[0275] 细胞存活力减少或降低是指检测的克隆分离株呈现出与对照处理的细胞相比细胞毒性增加。细胞毒性可以对照处理的细胞与检测的克隆毒株处理的细胞的细胞存活力比
率确定(对照处理的细胞存活百分比/检测的克隆毒株处理的细胞的存活百分比)。选择
呈现出细胞毒性比率高于1.0的克隆病毒毒株，例如高于1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，
1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90或100。在特定的实例中，结果以MOI表示，在此50％的细胞层是存活的(ED50)。细胞毒性可以对照处理的细胞的与检测
的克隆毒株处理的细胞的ED50比率确定(ED50对照处理的细胞/ED50检测克隆毒株处理的细
胞)。选择呈现出细胞毒性比率高于1.0的克隆病毒毒株，例如高于1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，
2 3 4 5 6
1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80.90，10，10，10，10，10或更高。应理解活性比为1.2或5等是指病毒呈现出是参考或对照毒株细胞毒性的120％
或500％等。
率确定(对照处理的细胞存活百分比/检测的克隆毒株处理的细胞的存活百分比)。选择
呈现出细胞毒性比率高于1.0的克隆病毒毒株，例如高于1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，
1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90或100。在特定的实例中，结果以MOI表示，在此50％的细胞层是存活的(ED50)。细胞毒性可以对照处理的细胞的与检测
的克隆毒株处理的细胞的ED50比率确定(ED50对照处理的细胞/ED50检测克隆毒株处理的细
胞)。选择呈现出细胞毒性比率高于1.0的克隆病毒毒株，例如高于1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，
2 3 4 5 6
1.6，1.7，1.8，1.9，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80.90，10，10，10，10，10或更高。应理解活性比为1.2或5等是指病毒呈现出是参考或对照毒株细胞毒性的120％
或500％等。
[0276] c.肿瘤生长
[0277] 为了选择作为治疗候选物，如果病毒导致肿瘤大小皱缩和/或延迟肿瘤进展，则选择的病毒呈现出指示抗肿瘤发生能力的参数。因此，选择呈现出肿瘤生长或大小降低的
克隆毒株。肿瘤大小可以在用所述病毒处理的携带肿瘤的人或动物模型中在体内评估。肿
瘤皱缩或肿瘤大小可以通过本领域已知的各种测定评估，如通过重量、体积或物理学测量。
克隆毒株。肿瘤大小可以在用所述病毒处理的携带肿瘤的人或动物模型中在体内评估。肿
瘤皱缩或肿瘤大小可以通过本领域已知的各种测定评估，如通过重量、体积或物理学测量。
[0278] 可以产生携带肿瘤的动物模型。体内的肿瘤可以通过任何已知方法产生，包括通过将肿瘤细胞接种或植入(如通过皮下注射)免疫缺陷的啮齿类动物中而产生的异种移植
物，通过将小鼠或大鼠肿瘤细胞系接种(例如通过皮下注射)于相应的免疫感受态小鼠或
大鼠品系中产生的同基因肿瘤，通过将原发肿瘤植入动物模型中的转移产生的转移肿瘤，
通过将肿瘤细胞植入与肿瘤细胞的来源相同的物种中产生的同种异基因移植肿瘤，以及通
过对动物进行遗传操纵产生的自发肿瘤。肿瘤模型可以通过将肿瘤细胞注射进其来源的组
织或器官中而原位移植产生，例如将乳腺肿瘤细胞植入小鼠乳房脂肪垫中。任何上述方法
提供了评估肿瘤细胞生长的一致的及可再生的工具，以及允许便于评估肿瘤的团块。
物，通过将小鼠或大鼠肿瘤细胞系接种(例如通过皮下注射)于相应的免疫感受态小鼠或
大鼠品系中产生的同基因肿瘤，通过将原发肿瘤植入动物模型中的转移产生的转移肿瘤，
通过将肿瘤细胞植入与肿瘤细胞的来源相同的物种中产生的同种异基因移植肿瘤，以及通
过对动物进行遗传操纵产生的自发肿瘤。肿瘤模型可以通过将肿瘤细胞注射进其来源的组
织或器官中而原位移植产生，例如将乳腺肿瘤细胞植入小鼠乳房脂肪垫中。任何上述方法
提供了评估肿瘤细胞生长的一致的及可再生的工具，以及允许便于评估肿瘤的团块。
[0279] 在特定的实例中，使用异种移植物或同基因移植物模型。例如，可以通过将不同6 6
肿瘤细胞类型的细胞悬浮液(如1×10 至5×10 细胞/动物)在右侧腋窝处注射进免疫
感受态宿主(同基因移植)或者免疫缺陷的宿主(如裸鼠或SCID小鼠；异种移植)中建
立肿瘤。典型的在小鼠如裸鼠或SCID小鼠中的人肿瘤异种移植模型包括但不限于人肺癌
(A549细胞，ATCC No.CCL-185)，人乳腺肿瘤(GI-101A细胞，Rathinavelu et al.，Cancer
Biochem.Biophys.，17：133-146(1999))，人卵巢癌(OVCAR-3细胞，ATCC No.HTB-161)，人
胰腺癌(PANC-1细胞，ATCC No.CRL-1469和MIA PaCa-2细胞，ATCC No.CRL-1420)，DU145
细胞(人前列腺癌细胞，ATCC No.HTB-81)，人前列腺癌(PC-3细胞，ATCC#CRL-1435)，结肠
癌(HT-29细胞)，人黑素瘤(888-MEL细胞，1858-MEL细胞或1936-MEL细胞；见例如Wang
et al.，(2006)J.Invest.Dermatol.126：1372-1377)，及人纤维肉瘤(HT-1080细胞，ATCC
No.CCL-121)及人间皮瘤(MSTO-211H cells)。典型的在小鼠中的大鼠肿瘤异种移植模型
包括但不限于神经胶质瘤(C6细胞，ATCC No.CCL-107)。典型的小鼠肿瘤同种移植模型包
括但不限于小鼠黑素瘤(B16-F10细胞，ATCC No.CRL-6475)。典型的在小鼠中的猫肿瘤异
种移植模型包括但不限于猫纤维肉瘤(FC77.T细胞，ATCC No.CRL-6105)。典型的在小鼠中
的狗肿瘤异种移植模型包括但不限于狗骨肉瘤(D17细胞，ATCCNo.CCL-183)。人异种移植
模型和同基因肿瘤模型的非限制性实例如下表3和4示出。
肿瘤细胞类型的细胞悬浮液(如1×10 至5×10 细胞/动物)在右侧腋窝处注射进免疫
感受态宿主(同基因移植)或者免疫缺陷的宿主(如裸鼠或SCID小鼠；异种移植)中建
立肿瘤。典型的在小鼠如裸鼠或SCID小鼠中的人肿瘤异种移植模型包括但不限于人肺癌
(A549细胞，ATCC No.CCL-185)，人乳腺肿瘤(GI-101A细胞，Rathinavelu et al.，Cancer
Biochem.Biophys.，17：133-146(1999))，人卵巢癌(OVCAR-3细胞，ATCC No.HTB-161)，人
胰腺癌(PANC-1细胞，ATCC No.CRL-1469和MIA PaCa-2细胞，ATCC No.CRL-1420)，DU145
细胞(人前列腺癌细胞，ATCC No.HTB-81)，人前列腺癌(PC-3细胞，ATCC#CRL-1435)，结肠
癌(HT-29细胞)，人黑素瘤(888-MEL细胞，1858-MEL细胞或1936-MEL细胞；见例如Wang
et al.，(2006)J.Invest.Dermatol.126：1372-1377)，及人纤维肉瘤(HT-1080细胞，ATCC
No.CCL-121)及人间皮瘤(MSTO-211H cells)。典型的在小鼠中的大鼠肿瘤异种移植模型
包括但不限于神经胶质瘤(C6细胞，ATCC No.CCL-107)。典型的小鼠肿瘤同种移植模型包
括但不限于小鼠黑素瘤(B16-F10细胞，ATCC No.CRL-6475)。典型的在小鼠中的猫肿瘤异
种移植模型包括但不限于猫纤维肉瘤(FC77.T细胞，ATCC No.CRL-6105)。典型的在小鼠中
的狗肿瘤异种移植模型包括但不限于狗骨肉瘤(D17细胞，ATCCNo.CCL-183)。人异种移植
模型和同基因肿瘤模型的非限制性实例如下表3和4示出。
[0280]
[0281]
[0282] 可以基于本领域技术人员已知的技术监测肿瘤大小和体积。例如，肿瘤大小和体18
积可以通过放射线照相、超声成像、尸检、使用测径器、通过microCT或者通过 F-FDG-PET
监测。肿瘤大小也可以目测。在特定的实例中，肿瘤大小(直径)是使用测径器直接测量
的。在其它实例中，肿瘤体积可以使用通过测径器或超声评估获得的肿瘤直径(D)的平均
3
测量值测量。肿瘤体积可以根据公式V＝D×π/6(使用测径器测量的直径)或者V＝
2
D×d×π/6(使用超声测量的直径，其中d是深度或厚度)确定。例如，测径器可以测量肿
2
瘤长度(l)和宽度(w)及以长度×宽度 ×0.52计算的肿瘤体积。在另一实例中，可以使
用microCT扫描测量肿瘤体积(见例如Huang et al.(2009)PNAS，106：3426-3430)。在这
样的实例中，可以为小鼠注射Optiray Pharmacy loversol注射液74％造影剂(如741mg
loversol/mL)，使小鼠麻醉，使用MicroCat1A扫描仪或者其它相似扫描仪(如IMTek)进
行CT扫描(40kV，600μA，196步旋转，总角度或旋转＝196)。图像可以使用软件(如RVA3
软件程序；ImTek)重建。肿瘤体积可以通过使用可获得的软件确定(如Amira3.1软件；
Mercury Computer Systems)。
积可以通过放射线照相、超声成像、尸检、使用测径器、通过microCT或者通过 F-FDG-PET
监测。肿瘤大小也可以目测。在特定的实例中，肿瘤大小(直径)是使用测径器直接测量
的。在其它实例中，肿瘤体积可以使用通过测径器或超声评估获得的肿瘤直径(D)的平均
3
测量值测量。肿瘤体积可以根据公式V＝D×π/6(使用测径器测量的直径)或者V＝
2
D×d×π/6(使用超声测量的直径，其中d是深度或厚度)确定。例如，测径器可以测量肿
2
瘤长度(l)和宽度(w)及以长度×宽度 ×0.52计算的肿瘤体积。在另一实例中，可以使
用microCT扫描测量肿瘤体积(见例如Huang et al.(2009)PNAS，106：3426-3430)。在这
样的实例中，可以为小鼠注射Optiray Pharmacy loversol注射液74％造影剂(如741mg
loversol/mL)，使小鼠麻醉，使用MicroCat1A扫描仪或者其它相似扫描仪(如IMTek)进
行CT扫描(40kV，600μA，196步旋转，总角度或旋转＝196)。图像可以使用软件(如RVA3
软件程序；ImTek)重建。肿瘤体积可以通过使用可获得的软件确定(如Amira3.1软件；
Mercury Computer Systems)。
[0283] 一旦植入的肿瘤达到预定大小或体积，可以将该模型用于用病毒处理。精确的最终的肿瘤体积可以根据经验确定，与肿瘤的特定类型以及分析的终点相关。通常地，如果肿
3
瘤体积大于3cm，则将小鼠处死。
3
瘤体积大于3cm，则将小鼠处死。
[0284] 将携带肿瘤的动物用病毒感染。感染的施用途径可以是腹膜内施用，如皮下注射，或者可以肿瘤内或静脉内施用。所述病毒可以在不同剂量施用。例如，施用携带肿瘤的动
4 8 5 7
物的所述病毒为大约1×10 至1×10pfu，如1×10 至1×10pfu，例如至少或大约或者为
6 6 6 6 6
1x10、2×10、3×10、4×10 或者5×10pfu。目测进展中的肿瘤，肿瘤大小和肿瘤体积可
以使用本领域技术人员已知的任何技术测量。例如，肿瘤体积或肿瘤大小可以使用本文描
述的任何技术测量。肿瘤体积和大小可以在病毒感染后以一定的时间间隔评估或测量，例
如每小时，每6小时，每12小时，每24小时，每36小时，每2天，每3天，每4天，每5天，每
6天，每7天，每周，每3周，每个月或者更长时间测量。可以产生肿瘤体积随着时间的中值
改变的图，及可以计算曲线下总面积(AUC)。这在实施例4中例证。治疗指数也可以使用如
下公式计算：AUC未处理动物-AUC病毒处理的动物/AUC未处理的×100。
4 8 5 7
物的所述病毒为大约1×10 至1×10pfu，如1×10 至1×10pfu，例如至少或大约或者为
6 6 6 6 6
1x10、2×10、3×10、4×10 或者5×10pfu。目测进展中的肿瘤，肿瘤大小和肿瘤体积可
以使用本领域技术人员已知的任何技术测量。例如，肿瘤体积或肿瘤大小可以使用本文描
述的任何技术测量。肿瘤体积和大小可以在病毒感染后以一定的时间间隔评估或测量，例
如每小时，每6小时，每12小时，每24小时，每36小时，每2天，每3天，每4天，每5天，每
6天，每7天，每周，每3周，每个月或者更长时间测量。可以产生肿瘤体积随着时间的中值
改变的图，及可以计算曲线下总面积(AUC)。这在实施例4中例证。治疗指数也可以使用如
下公式计算：AUC未处理动物-AUC病毒处理的动物/AUC未处理的×100。
[0285] 通常地，以相同方式在相同时间及使用相同类型的肿瘤细胞产生的携带肿瘤的动物用作对照动物。这种携带肿瘤的对照动物包括保持未处理(未感染病毒)的那些动物。
其它的对照动物包括用亲代病毒制备物或混合物或者用参考病毒毒株如已知减毒的重组
毒株感染的那些动物。这种毒株例如是GLV-1h68或者其含有插入的异源基因的衍生物。在
用亲代病毒制备物或混合物或者气体参考毒株感染携带肿瘤的动物作为对照的情况中，施
用的病毒的量(如pfu)与检测的病毒克隆毒株相同。
其它的对照动物包括用亲代病毒制备物或混合物或者用参考病毒毒株如已知减毒的重组
毒株感染的那些动物。这种毒株例如是GLV-1h68或者其含有插入的异源基因的衍生物。在
用亲代病毒制备物或混合物或者气体参考毒株感染携带肿瘤的动物作为对照的情况中，施
用的病毒的量(如pfu)与检测的病毒克隆毒株相同。
[0286] 选择与对照处理的或者未处理的携带肿瘤的动物相比介导肿瘤大小(如直径)、体积或重量降低的病毒。应理解与对照处理的或未处理的携带肿瘤的动物相比肿瘤大小、
体积或重量的降低是指病毒自身介导肿瘤衰退或皱缩，或者与对照处理或未处理的携带肿
瘤的动物相比所述病毒介导肿瘤进展延缓。肿瘤进展中的肿瘤皱缩或延迟是指示抗肿瘤发
生能力的参数。
体积或重量的降低是指病毒自身介导肿瘤衰退或皱缩，或者与对照处理或未处理的携带肿
瘤的动物相比所述病毒介导肿瘤进展延缓。肿瘤进展中的肿瘤皱缩或延迟是指示抗肿瘤发
生能力的参数。
[0287] 例如，基于目测到与对照处理的或未处理的携带肿瘤的动物相比在动物中肿瘤大小评估，选择的检测克隆毒株介导肿瘤大小或体积降低。在其它实例中，通过与未处理的携
带肿瘤的动物相比或者与用亲代病毒混合物或者用另一参考病毒毒株(如减毒的重组病
毒)处理的携带肿瘤的动物相比，如果通过本领域已知的任何测量方法(如使用测径器)
评估与未处理的携带肿瘤的动物相比或者与用亲代病毒混合物或用另一参考病毒毒株处
理的携带肿瘤的动物相比肿瘤直径降低，则选择的检测克隆毒株介导肿瘤大小或体积降
低。在进一步的实例中，如果与未处理的携带肿瘤的动物相比或者与用亲代病毒制备物或
混合物或用另一参考病毒毒株(如减毒的重组病毒)处理的携带肿瘤的动物相比，通过本
领域技术人员已知的任何技术评估肿瘤体积降低，则选择的检测的克隆分离株介导肿瘤大
小或体积降低。应理解肿瘤大小或体积的对比可以在感染后的任何预定时间进行，可以由
本领域技术人员根据经验确定。在一些实例中，可以在处死未处理对照动物的当天进行对
比。在其它实例中，可以进行总AUC的分析，对比AUC值对比作为随着感染时间的肿瘤大小
和体积的指示物。
带肿瘤的动物相比或者与用亲代病毒混合物或者用另一参考病毒毒株(如减毒的重组病
毒)处理的携带肿瘤的动物相比，如果通过本领域已知的任何测量方法(如使用测径器)
评估与未处理的携带肿瘤的动物相比或者与用亲代病毒混合物或用另一参考病毒毒株处
理的携带肿瘤的动物相比肿瘤直径降低，则选择的检测克隆毒株介导肿瘤大小或体积降
低。在进一步的实例中，如果与未处理的携带肿瘤的动物相比或者与用亲代病毒制备物或
混合物或用另一参考病毒毒株(如减毒的重组病毒)处理的携带肿瘤的动物相比，通过本
领域技术人员已知的任何技术评估肿瘤体积降低，则选择的检测的克隆分离株介导肿瘤大
小或体积降低。应理解肿瘤大小或体积的对比可以在感染后的任何预定时间进行，可以由
本领域技术人员根据经验确定。在一些实例中，可以在处死未处理对照动物的当天进行对
比。在其它实例中，可以进行总AUC的分析，对比AUC值对比作为随着感染时间的肿瘤大小
和体积的指示物。
[0288] 病毒对于肿瘤大小或体积的作用可以用对照处理的动物与检测(对照处理的动物的肿瘤大小或体积/克隆分离株处理的动物的肿瘤大小或体积)。选择呈现出肿瘤皱缩
比高于1.0的克隆病毒，例如高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、20、30、40、50或更高。在特定的实例中，结果以在处理期间总AUC面积的比率表示(对照处理的动物的肿瘤大小或体积的AUC/克隆分离株处理的动物的AUC肿瘤大小或体
积)。选择呈现出通过AUC测量的肿瘤皱缩比高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、
1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更高的克隆。应理解1.2或5等的比值是指所述病毒导致肿瘤大小或体积降低，及呈现出与参考或对照物相比120％或500％等的抗肿瘤
发生能力。
比高于1.0的克隆病毒，例如高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、20、30、40、50或更高。在特定的实例中，结果以在处理期间总AUC面积的比率表示(对照处理的动物的肿瘤大小或体积的AUC/克隆分离株处理的动物的AUC肿瘤大小或体
积)。选择呈现出通过AUC测量的肿瘤皱缩比高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、
1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更高的克隆。应理解1.2或5等的比值是指所述病毒导致肿瘤大小或体积降低，及呈现出与参考或对照物相比120％或500％等的抗肿瘤
发生能力。
[0289] 在特定的实例中，治疗指数以测量病毒对于肿瘤大小或体积的作用而确定。选择呈现出治疗指数与亲代病毒制备物或混合物或者对照的参考病毒毒株(如减毒的重组
病毒)的治疗指数相比为至少或大约至少或是120％、130％、140％、150％、160％、170％、
180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或更高的克隆病毒。
病毒)的治疗指数相比为至少或大约至少或是120％、130％、140％、150％、160％、170％、
180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或更高的克隆病毒。
[0290] 在另外的实例中，可以从动物中获取肿瘤病称重。可以选择与从未用病毒感染的对照的携带肿瘤的动物中获取的肿瘤相比导致肿瘤重量降低的病毒。所述重量也可以与从
对照处理的动物在同一感染后时间获取的肿瘤相比。重量的改变可以用肿瘤比表示(对
照处理的动物的肿瘤重量/克隆分离株处理的动物的肿瘤重量)。选择呈现出肿瘤重量比
高于1.0的克隆毒株，如高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、20、30、40、50或更高。应理解肿瘤重量比为1.2或5等是指所述病毒使肿瘤重量降低及
与参考或对照物相比呈现出120％或500％等的抗肿瘤发生能力。
对照处理的动物在同一感染后时间获取的肿瘤相比。重量的改变可以用肿瘤比表示(对
照处理的动物的肿瘤重量/克隆分离株处理的动物的肿瘤重量)。选择呈现出肿瘤重量比
高于1.0的克隆毒株，如高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、20、30、40、50或更高。应理解肿瘤重量比为1.2或5等是指所述病毒使肿瘤重量降低及
与参考或对照物相比呈现出120％或500％等的抗肿瘤发生能力。
[0291] 在进一步的实例中，可以裂解获得的肿瘤。例如，肿瘤的裂解可以通过在从动物中移除肿瘤之后立即对获得的肿瘤进行几次冷冻-解冻循环(如至少2次，3次或4次)进
行。例如，将肿瘤在移除2小时内进行3次冷冻-解冻循环而裂解。肿瘤裂解物中的病毒
可以如上述滴定，确定每个肿瘤样品中病毒的量。在一些实例中，病毒效价可以表示为根据
组织重量标准化的组织培养物感染剂量(TCID50/mg组织)。
行。例如，将肿瘤在移除2小时内进行3次冷冻-解冻循环而裂解。肿瘤裂解物中的病毒
可以如上述滴定，确定每个肿瘤样品中病毒的量。在一些实例中，病毒效价可以表示为根据
组织重量标准化的组织培养物感染剂量(TCID50/mg组织)。
[0292] 在特定的实例中，可以评估所述病毒在动物中对其它器官或组织的作用。例如，可以从动物获得其它器官，称重和/或裂解，以进行病毒效价确定。
[0293] 4.毒性/安全性
[0294] 进一步检测分离的病毒的指示其毒性/安全性性质的参数。病毒通过产生使宿主健康状况恶化的一或多种化合物而对于其宿主是毒性的。对于宿主的毒性可以根据多种方
式显示，包括感染性休克，神经学影响或者肌影响。选择对宿主毒性降低的本发明提供的病
毒。本发明方法和组合物的病毒的降低的毒性可以在从宿主不经历毒性作用至其中宿主通
常不死于所述微生物的毒性作用的范围内。
式显示，包括感染性休克，神经学影响或者肌影响。选择对宿主毒性降低的本发明提供的病
毒。本发明方法和组合物的病毒的降低的毒性可以在从宿主不经历毒性作用至其中宿主通
常不死于所述微生物的毒性作用的范围内。
[0295] 指示病毒的毒性或安全性的参数可以在体外或体内检测。典型地，在体内进行评估。典型的方法包括将病毒施用对象(如动物模型)并评估与毒性相关的一或多种性质，
包括但不限于对象的存活，体重的降低，副作用如发热、皮疹或其它过敏反应的存在，疲乏
或腹痛，对象体内免疫应答的诱导，病毒的组织破坏作用，释放的肿瘤抗原的量痘痕形成速
度降低。因此，可以评估指示病毒的毒性/安全性的任何上述参数。选择呈现出最小毒性
的病毒。
包括但不限于对象的存活，体重的降低，副作用如发热、皮疹或其它过敏反应的存在，疲乏
或腹痛，对象体内免疫应答的诱导，病毒的组织破坏作用，释放的肿瘤抗原的量痘痕形成速
度降低。因此，可以评估指示病毒的毒性/安全性的任何上述参数。选择呈现出最小毒性
的病毒。
[0296] 如上所述，用病毒感染对象(如动物，如携带肿瘤的动物模型)。注射施用途径可以是腹膜内注射，如皮下注射，或者可以是肿瘤内或静脉内注射。所述病毒可以在不
4 8
同剂量施用。例如，可以施用携带肿瘤的动物的病毒的量为大约1×10-1×10pfu，如
5 7 6 6 6 6 6
1×10-1×10pfu，例如至少或大约或者1x10，2×10，3×10，4×10 或者5×10pfu。对于
7 14 7 10 9 10
人体，所述病毒可以施用大约1x10-1x10 pfu，如1x10-1×10 pfu或者1x10-1×10 pfu，
9 9 9 9 9
例如至少或大约1×10，2×10，3×10，4×10 或者5×10pfu。可以随着时间监测指示毒
性的参数如对象的存活和体重。例如，可以在病毒感染后一段时间以固定间隔监测对象存
活和体重，例如在感染后每小时，每6小时，每12小时，每24小时，每36小时，每2天，每3
天，每4天，每5天，每6天，每7天，每周，每3周，每个月或者更长时间监测。
4 8
同剂量施用。例如，可以施用携带肿瘤的动物的病毒的量为大约1×10-1×10pfu，如
5 7 6 6 6 6 6
1×10-1×10pfu，例如至少或大约或者1x10，2×10，3×10，4×10 或者5×10pfu。对于
7 14 7 10 9 10
人体，所述病毒可以施用大约1x10-1x10 pfu，如1x10-1×10 pfu或者1x10-1×10 pfu，
9 9 9 9 9
例如至少或大约1×10，2×10，3×10，4×10 或者5×10pfu。可以随着时间监测指示毒
性的参数如对象的存活和体重。例如，可以在病毒感染后一段时间以固定间隔监测对象存
活和体重，例如在感染后每小时，每6小时，每12小时，每24小时，每36小时，每2天，每3
天，每4天，每5天，每6天，每7天，每周，每3周，每个月或者更长时间监测。
[0297] 通常地，相似地监测对照对象(如动物模型，如携带肿瘤的动物模型)。这种对照对象包括保持未处理的(未用病毒感染)的那些对象。另外的对照对象包括用亲代病毒制
备物或混合物或者参考病毒毒株如已知的减毒的重组毒株感染的那些对象。典型的这种毒
株是GLV-1h68或者其含有插入的异源基因的衍生物。在对象用亲代病毒制备物或混合物
或者其它参考毒株感染作为对照的实例中，施用的病毒的量(如pfu)与检测的病毒克隆分
离株相同。
备物或混合物或者参考病毒毒株如已知的减毒的重组毒株感染的那些对象。典型的这种毒
株是GLV-1h68或者其含有插入的异源基因的衍生物。在对象用亲代病毒制备物或混合物
或者其它参考毒株感染作为对照的实例中，施用的病毒的量(如pfu)与检测的病毒克隆分
离株相同。
[0298] 在一些实施方案中，所述病毒的毒性降低，由此宿主由于所述病毒在宿主中的存在除了对于肿瘤性、转移的或坏死的器官或组织的任何作用之外典型不具有明显长期作
用。例如，降低的毒性可以是略微发热或略微感染，其持续少于大约1个月，在所述发热或
感染后，宿主不再经历得自发热或感染的副作用。在另一实例中，降低的毒性可以根据在施
用所述微生物之后宿主的体重无意地降低大约5％或者更低而测量。在其它实例中，所述病
毒对于宿主是无毒性的。
用。例如，降低的毒性可以是略微发热或略微感染，其持续少于大约1个月，在所述发热或
感染后，宿主不再经历得自发热或感染的副作用。在另一实例中，降低的毒性可以根据在施
用所述微生物之后宿主的体重无意地降低大约5％或者更低而测量。在其它实例中，所述病
毒对于宿主是无毒性的。
[0299] 例如，基于与对照或参考毒株相比对于对象的存活的影响选择病毒。选择导致对象与用亲代病毒制备物或混合物或其它参考毒株(如减毒毒株)处理的对象相比具有相似
存活的病毒。特别地，选择导致对象与用亲代病毒制备物或混合物或者其它参考毒株(如
减毒毒株)处理的对象相比具有较好的或改良的存活的病毒。通常地，选择在处理期间使
得对象100％存活的病毒。例如，选择在对照的未处理的对象0％存活时间导致所述对象
100％存活的病毒。
存活的病毒。特别地，选择导致对象与用亲代病毒制备物或混合物或者其它参考毒株(如
减毒毒株)处理的对象相比具有较好的或改良的存活的病毒。通常地，选择在处理期间使
得对象100％存活的病毒。例如，选择在对照的未处理的对象0％存活时间导致所述对象
100％存活的病毒。
[0300] 在一些实例中，基于与对照或参考病毒相比对于对象体重的影响选择病毒。通常地，在处理期间对象体重降低或减少与所述处理的毒性或者致病原性相关。在一些实例中，
选择与用亲代病毒制备物或混合物或者其它参考毒株(如重组毒株)处理的对象相似地影
响对象体重的病毒。在其它实例中，选择这样的病毒，其与用亲代病毒制备物或混合物或其
它参考毒株(如重组毒株)处理的对象相比不导致对象体重降低或者导致体重略微降低。
特别地，选择在用病毒处理期间导致对象体重增加的克隆病毒。
选择与用亲代病毒制备物或混合物或者其它参考毒株(如重组毒株)处理的对象相似地影
响对象体重的病毒。在其它实例中，选择这样的病毒，其与用亲代病毒制备物或混合物或其
它参考毒株(如重组毒株)处理的对象相比不导致对象体重降低或者导致体重略微降低。
特别地，选择在用病毒处理期间导致对象体重增加的克隆病毒。
[0301] 5.基因组分析
[0302] 任选地，可以对克隆分离株进行纯化，并分析基因组以评估选择的分离株的序列同质性。通常地，选择序列同质的克隆毒株。可以使用各种方法证实病毒的相同性/同质
性，例如但不限于测序、限制分析、PCR、Southern印迹或者通过蛋白质表达。例如，选择的克隆分离株可以在容许细胞中繁殖，收获细胞，并回收病毒颗粒。基因组病毒DNA可以使用本
领域技术人员已知的各种方法提取。例如，蛋白酶K及随后苯酚-氯仿提取法可用于从纯
化的毒粒中提取DNA(见Earl et al.，in Ausubel et al.，(eds)Current protocols in
molecular biology，vol.3，pages16.17.1-16.19-7(1998))。可以通过本领域技术人员已
知的任何方法完成DNA测序。例如，可以通过鸟枪法及随后使用各种软件装配进行测序，如
TIGRAssembler软件(Sutton et al.(1995)Genome Science&Tech.，1：9-19)或者在Linux
平台包装的Staden软件(Staden(1991)Nucleic Acids Res.19：3907-3911；Bontield et
al.(1995)Nucleic Acids.Res.，23：4992-4999)，及使用各种缺口充填策略(见例如Flint
et al.(1998)DNA Seq.，8：241-245)；通过随机引发方法(见例如Djikeng et al.(2008)
BMC Genomics，9：5)；或者通过全基因组扩增及直接测序技术(Mizutani et al.(2007)
Emerging Infectious Diseases，13：322-324)进行。
性，例如但不限于测序、限制分析、PCR、Southern印迹或者通过蛋白质表达。例如，选择的克隆分离株可以在容许细胞中繁殖，收获细胞，并回收病毒颗粒。基因组病毒DNA可以使用本
领域技术人员已知的各种方法提取。例如，蛋白酶K及随后苯酚-氯仿提取法可用于从纯
化的毒粒中提取DNA(见Earl et al.，in Ausubel et al.，(eds)Current protocols in
molecular biology，vol.3，pages16.17.1-16.19-7(1998))。可以通过本领域技术人员已
知的任何方法完成DNA测序。例如，可以通过鸟枪法及随后使用各种软件装配进行测序，如
TIGRAssembler软件(Sutton et al.(1995)Genome Science&Tech.，1：9-19)或者在Linux
平台包装的Staden软件(Staden(1991)Nucleic Acids Res.19：3907-3911；Bontield et
al.(1995)Nucleic Acids.Res.，23：4992-4999)，及使用各种缺口充填策略(见例如Flint
et al.(1998)DNA Seq.，8：241-245)；通过随机引发方法(见例如Djikeng et al.(2008)
BMC Genomics，9：5)；或者通过全基因组扩增及直接测序技术(Mizutani et al.(2007)
Emerging Infectious Diseases，13：322-324)进行。
[0303] C.分离的克隆病毒毒株
[0304] 本发明提供分离的克隆病毒痘苗病毒毒株LIVP。所述克隆毒株衍生自痘苗病毒毒株LIVP。
[0305] 1.LIVP
[0306] LIVP是衍生自Lister(ATCC Catalog No.VR-1549)的一种痘苗病毒毒株。痘苗病毒具有线性、双链的DNA基因组，长度为大约180,000个碱基对，由单一连续的多核苷酸
链组成(Baroudy et al.(1982)Cell，28：315-324)。所述结构由于存在10,000个碱基对
的反向末端重复序列(ITR)所致。所述ITR参与基因组复制。确信基因组复制包含自身
引发(self-priming)，导致高分子量串联体形成(分离自感染的细胞)，其随后被裂解及
修复以产生病毒基因组。见例如Traktman，P.，Chapter27，Poxvirus DNA Replication，
pp.775-798，in DNA Replication in Eukaryotic Cells，Cold Spring Harbor Laboratory
Press(1996)。所述基因组编码大约250个基因。通常地，排列非节段化的、非感染性的基因
组，由此位于中心的基因是病毒复制所需的(及因此是保守的)，同时在两个末端附近的基
因影响更多的周围功能，如宿主范围和毒力。痘苗病毒通过利用系列排列的开放读框(ORF)
实施差异的基因表达，根据一般原理是不重叠的。
链组成(Baroudy et al.(1982)Cell，28：315-324)。所述结构由于存在10,000个碱基对
的反向末端重复序列(ITR)所致。所述ITR参与基因组复制。确信基因组复制包含自身
引发(self-priming)，导致高分子量串联体形成(分离自感染的细胞)，其随后被裂解及
修复以产生病毒基因组。见例如Traktman，P.，Chapter27，Poxvirus DNA Replication，
pp.775-798，in DNA Replication in Eukaryotic Cells，Cold Spring Harbor Laboratory
Press(1996)。所述基因组编码大约250个基因。通常地，排列非节段化的、非感染性的基因
组，由此位于中心的基因是病毒复制所需的(及因此是保守的)，同时在两个末端附近的基
因影响更多的周围功能，如宿主范围和毒力。痘苗病毒通过利用系列排列的开放读框(ORF)
实施差异的基因表达，根据一般原理是不重叠的。
[0307] 如本文别处所述，LIVP毒株可得自Lister Institute of Viral Preparations，Moscow，Russia；the Microorganism Collection of FSRI SRC VB Vector；或者可得自
Moscow Ivanovsky Institute of Virology(C0355K0602)。已经报道了亲代LIVP毒株是
序列异源的(见例如Zhang et al.(2009)Mol.Genet.Genomics，282：417-435)。LIVP的亲
代基因组序列在SEQ ID NO：10中示出。
Moscow Ivanovsky Institute of Virology(C0355K0602)。已经报道了亲代LIVP毒株是
序列异源的(见例如Zhang et al.(2009)Mol.Genet.Genomics，282：417-435)。LIVP的亲
代基因组序列在SEQ ID NO：10中示出。
[0308] 本发明提供LIVP克隆毒株，其在没有插入的异源DNA的条件下呈现出较现有的重组LIVP病毒改良的性质。重组LIVP病毒已经产生。例如，GLV-1h68(也称作RVGL21，SEQ ID
NO：9；在美国专利申请2005-0031643中及在美国专利7,588,767、7,588,771、7,662,398
中描述)是一种减毒病毒，其在基因座中含有DNA插入，所述DNA插入是在F14.5L(在LIVP
中也称作F3)基因座、胸腺激酶(TK)基因座和血凝素(HA)基因座中编码可检测的标记蛋
白的表达盒。特别地，GLV-1h68含有这样的表达盒，即含有在插入F14.5L基因座中的痘苗
病毒早期/晚期启动子PSEL((PSEL)Ruc-GFP)控制下的Ruc-GFP cDNA分子(编码Renilla萤
光素酶的DNA与编码GFP的DNA的融合蛋白)的表达盒；含有在痘苗病毒早期/晚期启动子
P7.5k((P7.5k)LacZ)控制下的编码β-半乳糖苷酶的DNA分子及插入TK基因座中编码位于相
对于痘苗病毒合成的早期/晚期启动子PSEL((PSEL)rTrfR)相反方向的大鼠运铁蛋白受体的
DNA的表达盒(所得病毒不表达运铁蛋白受体蛋白，因为编码所述蛋白质的DNA分子位于相
对于表达盒中的启动子相反的转录方向)；以及含有插入HA基因座中的痘苗病毒晚期启动
子P11k((P11k)gusA)控制下的编码β-葡糖苷酸酶DNA分子的表达盒。其它重组LIVP病毒
衍生自GLV-1h68，并含有编码基因产物的异源DNA(见例如美国专利申请US2003-0059400、
US2003-0228261、US2009-0117034、US2009-0098529、US2009-0053244、US2009-0081639及
US2009-0136917；美国专利7,588,767和7,763,420；以及国际专利申请WO2009/139921)。
典型的这种重组病毒是GLV-1h64(如SEQ ID NO：326所示)。
NO：9；在美国专利申请2005-0031643中及在美国专利7,588,767、7,588,771、7,662,398
中描述)是一种减毒病毒，其在基因座中含有DNA插入，所述DNA插入是在F14.5L(在LIVP
中也称作F3)基因座、胸腺激酶(TK)基因座和血凝素(HA)基因座中编码可检测的标记蛋
白的表达盒。特别地，GLV-1h68含有这样的表达盒，即含有在插入F14.5L基因座中的痘苗
病毒早期/晚期启动子PSEL((PSEL)Ruc-GFP)控制下的Ruc-GFP cDNA分子(编码Renilla萤
光素酶的DNA与编码GFP的DNA的融合蛋白)的表达盒；含有在痘苗病毒早期/晚期启动子
P7.5k((P7.5k)LacZ)控制下的编码β-半乳糖苷酶的DNA分子及插入TK基因座中编码位于相
对于痘苗病毒合成的早期/晚期启动子PSEL((PSEL)rTrfR)相反方向的大鼠运铁蛋白受体的
DNA的表达盒(所得病毒不表达运铁蛋白受体蛋白，因为编码所述蛋白质的DNA分子位于相
对于表达盒中的启动子相反的转录方向)；以及含有插入HA基因座中的痘苗病毒晚期启动
子P11k((P11k)gusA)控制下的编码β-葡糖苷酸酶DNA分子的表达盒。其它重组LIVP病毒
衍生自GLV-1h68，并含有编码基因产物的异源DNA(见例如美国专利申请US2003-0059400、
US2003-0228261、US2009-0117034、US2009-0098529、US2009-0053244、US2009-0081639及
US2009-0136917；美国专利7,588,767和7,763,420；以及国际专利申请WO2009/139921)。
典型的这种重组病毒是GLV-1h64(如SEQ ID NO：326所示)。
[0309] 2.LIVP克隆毒株
[0310] 本发明提供的克隆毒株衍生自LIVP，具有与SEQ ID NO：10所示亲代序列不同的基因组。本发明提供的克隆毒株与称作的程序或修饰的病毒毒株GLV-1h68(具有SEQ ID
NO：9所示基因组)相比呈现出更好的抗肿瘤发生能力和/或降低的毒性。特别地，本发明
提供的克隆毒株存在于从LIVP中繁殖的病毒制备物中。因此，克隆毒株不含有非病毒异源
核酸，所述核酸含有编码非病毒异源蛋白质的开放读框。
NO：9所示基因组)相比呈现出更好的抗肿瘤发生能力和/或降低的毒性。特别地，本发明
提供的克隆毒株存在于从LIVP中繁殖的病毒制备物中。因此，克隆毒株不含有非病毒异源
核酸，所述核酸含有编码非病毒异源蛋白质的开放读框。
[0311] 本发明提供的克隆毒株具有与SEQ ID NO：10具有至少70％、如至少75％、80％、85％或90％序列相同性的核苷酸序列。例如，所述克隆毒株与SEQ ID NO：10具有至
少91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、
99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％但是低于100％相同性的核苷酸序列。本发明提供
的这种LIVP克隆病毒包括与具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的亲代LIVP毒株相比在
一或多个开放读框(ORF)有不同的病毒。例如，本发明提供的LIVP克隆病毒包括与具有
SEQ ID NO：10所示氨基酸序列亲代LIVP毒株相比在一或多个ORF有不同的病毒。本发
明提供的LIVP克隆毒株与SEQ ID NO：10相比在任何ORF中可含有人一或多个核苷酸的
核苷酸缺失或突变，或者与SEQ ID NO：10相比可以含有病毒DNA的添加或插入。例如，本
发明提供的LIVP克隆病毒毒株与SEQ ID NO：10相比在ORF中可含有一或多个核苷酸的
核苷酸缺失、突变或添加(即插入)，称作gl001/290、gl009/283、gl010/282、gl011/280、
gl015、gl032、gl034、gl035、gl037、gl069、gl077、gl079、gl082、gl084、gl088、gl093、gl225、gl230、gl239、gl241、gl257、gl264、gl270、gl273、gl274、gl277/105、gl280/011、gl282/010、gl283/009。在一个实例中，本发明提供具有编码截短的蛋白质的ORF的LIVP
克隆病毒毒株。在其它实例中，本发明提供在ORF的启动子区域中含有插入、缺失或突变的
LIVP克隆病毒毒株。在特定的实例中，ORF中一或多个核苷酸的插入、缺失或突变导致非功
能性(例如非活性)蛋白质的产生或者消除由所述病毒产生的蛋白质。
少91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、
99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％但是低于100％相同性的核苷酸序列。本发明提供
的这种LIVP克隆病毒包括与具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的亲代LIVP毒株相比在
一或多个开放读框(ORF)有不同的病毒。例如，本发明提供的LIVP克隆病毒包括与具有
SEQ ID NO：10所示氨基酸序列亲代LIVP毒株相比在一或多个ORF有不同的病毒。本发
明提供的LIVP克隆毒株与SEQ ID NO：10相比在任何ORF中可含有人一或多个核苷酸的
核苷酸缺失或突变，或者与SEQ ID NO：10相比可以含有病毒DNA的添加或插入。例如，本
发明提供的LIVP克隆病毒毒株与SEQ ID NO：10相比在ORF中可含有一或多个核苷酸的
核苷酸缺失、突变或添加(即插入)，称作gl001/290、gl009/283、gl010/282、gl011/280、
gl015、gl032、gl034、gl035、gl037、gl069、gl077、gl079、gl082、gl084、gl088、gl093、gl225、gl230、gl239、gl241、gl257、gl264、gl270、gl273、gl274、gl277/105、gl280/011、gl282/010、gl283/009。在一个实例中，本发明提供具有编码截短的蛋白质的ORF的LIVP
克隆病毒毒株。在其它实例中，本发明提供在ORF的启动子区域中含有插入、缺失或突变的
LIVP克隆病毒毒株。在特定的实例中，ORF中一或多个核苷酸的插入、缺失或突变导致非功
能性(例如非活性)蛋白质的产生或者消除由所述病毒产生的蛋白质。
[0312] 本发明提供的LIVP克隆毒株不包括被修饰为包含具有编码异源蛋白质的开放读框的异源核酸的修饰的或重组的病毒毒株。例如，本发明提供的LIVP克隆毒株不包括在
称作GLV-1h68(如SEQ ID NO：9所示)的重组病毒或者衍生自其中的其它重组病毒毒株
如称作GLV-164(如SEQ ID NO：326所示)的病毒或者称作GLV-1i69(如SEQ ID NO：3所
示)的病毒中含有的核苷酸序列。在一个实例中，本发明提供的克隆毒株与得自Lister
Institute of Viral Preparations，Moscow，Russia的LIVP毒株、具有SEQ ID NO：10所
示核苷酸序列的LIVP毒株和/或具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的重
组LIVP毒株相比呈现出改良的或更好的抗肿瘤发生能力。在特定的实例中，本发明提供的
克隆毒株与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的重组LIVP毒株GLV-1h68相比呈现出相似
的抗肿瘤发生能力或较低的肿瘤发生活性(即改良的或更好的抗肿瘤发生能力)。例如，
本发明提供的LIVP克隆毒株与得自Lister Institute of Viral Preparations，Moscow，
Russia的LIVP毒株、与具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的LIVP毒株和/或具有SEQ
ID NO：9所示核苷酸序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株相比呈现出改良的或更好的抗
肿瘤发生能力，如具有120％-1000％、例如至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、
180％、190％、200％、2550％、300％、400％、500％、1000％或更高的抗肿瘤发生能力。抗肿瘤发生能力可以使用任何体外或体内检测法，确定指示抗肿瘤发生能力的参数，如上文章
节B中所述。例如，与得自Lister Institute of Viral Preparations，Moscow，Russia的
LIVP毒株相比，与具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的LIVP毒株相比，和/或具有SEQ ID
NO：9所示序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株相比，本发明提供的LIVP克隆毒株呈现出在
体外或体内测定或模型中增加的对肿瘤细胞的细胞毒性，在体外或体内测定或模型中降低
的肿瘤生长或增加的肿瘤皱缩，在体外或体内测定或模型中降低的肿瘤体积、大小或重量，
在体外或体内测定中增加的在肿瘤细胞中的复制或积累，以及在体外或体内测定或模型中
与肿瘤细胞中病毒复制和/或感染性相关的病毒基因、肿瘤蛋白质和/或管家基因的增加
的表达。
称作GLV-1h68(如SEQ ID NO：9所示)的重组病毒或者衍生自其中的其它重组病毒毒株
如称作GLV-164(如SEQ ID NO：326所示)的病毒或者称作GLV-1i69(如SEQ ID NO：3所
示)的病毒中含有的核苷酸序列。在一个实例中，本发明提供的克隆毒株与得自Lister
Institute of Viral Preparations，Moscow，Russia的LIVP毒株、具有SEQ ID NO：10所
示核苷酸序列的LIVP毒株和/或具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的重
组LIVP毒株相比呈现出改良的或更好的抗肿瘤发生能力。在特定的实例中，本发明提供的
克隆毒株与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的重组LIVP毒株GLV-1h68相比呈现出相似
的抗肿瘤发生能力或较低的肿瘤发生活性(即改良的或更好的抗肿瘤发生能力)。例如，
本发明提供的LIVP克隆毒株与得自Lister Institute of Viral Preparations，Moscow，
Russia的LIVP毒株、与具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的LIVP毒株和/或具有SEQ
ID NO：9所示核苷酸序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株相比呈现出改良的或更好的抗
肿瘤发生能力，如具有120％-1000％、例如至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、
180％、190％、200％、2550％、300％、400％、500％、1000％或更高的抗肿瘤发生能力。抗肿瘤发生能力可以使用任何体外或体内检测法，确定指示抗肿瘤发生能力的参数，如上文章
节B中所述。例如，与得自Lister Institute of Viral Preparations，Moscow，Russia的
LIVP毒株相比，与具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的LIVP毒株相比，和/或具有SEQ ID
NO：9所示序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株相比，本发明提供的LIVP克隆毒株呈现出在
体外或体内测定或模型中增加的对肿瘤细胞的细胞毒性，在体外或体内测定或模型中降低
的肿瘤生长或增加的肿瘤皱缩，在体外或体内测定或模型中降低的肿瘤体积、大小或重量，
在体外或体内测定中增加的在肿瘤细胞中的复制或积累，以及在体外或体内测定或模型中
与肿瘤细胞中病毒复制和/或感染性相关的病毒基因、肿瘤蛋白质和/或管家基因的增加
的表达。
[0313] 在另一实例中，本发明提供的克隆毒株与得自Lister Institute of ViralPreparations，Moscow，Russia的LIVP毒株、具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的LIVP
毒株和/或具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株相比具有
较低的毒性(即低毒力)。在其它实例中，本发明提供的克隆毒株与具有SEQ ID NO：9所
示核苷酸序列的重组LIVP毒株GLV-1h68相比呈现出相似毒性或者较低毒性。指示毒性
或毒力的参数包括但不限于减少或降低的对象存活率，降低的体重，存在如发热、皮疹或
其它过敏反应、疲乏或腹痛等的副作用，诱导对象体内免疫应答，病毒的组织破坏作用，释
放的肿瘤抗原的量及降低的痘痕形成率。所述毒性或毒力可以使用如上文章节B中所述
任何体外或体内检测法确定。本发明提供的LIVP克隆毒株与得自Lister Institute of
Viral Preparations，Moscow，Russia的LIVP毒株、具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列
的LIVP毒株和/或具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株
相比呈现出0％-99％、例如低于其99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％、
50％、40％、30％、20％、10％、5％或更低的毒性。在其它实例中，在评估指示毒性的参数的测定或方法中，本发明提供的LIVP克隆毒株与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的LIVP
毒株GLV-1h68相比呈现出其70％-120％、例如至少或大约70％、80％、90％、95％、100％、
110％、115％或120％的毒性或抗肿瘤发生能力。
毒株和/或具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株相比具有
较低的毒性(即低毒力)。在其它实例中，本发明提供的克隆毒株与具有SEQ ID NO：9所
示核苷酸序列的重组LIVP毒株GLV-1h68相比呈现出相似毒性或者较低毒性。指示毒性
或毒力的参数包括但不限于减少或降低的对象存活率，降低的体重，存在如发热、皮疹或
其它过敏反应、疲乏或腹痛等的副作用，诱导对象体内免疫应答，病毒的组织破坏作用，释
放的肿瘤抗原的量及降低的痘痕形成率。所述毒性或毒力可以使用如上文章节B中所述
任何体外或体内检测法确定。本发明提供的LIVP克隆毒株与得自Lister Institute of
Viral Preparations，Moscow，Russia的LIVP毒株、具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列
的LIVP毒株和/或具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株
相比呈现出0％-99％、例如低于其99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％、
50％、40％、30％、20％、10％、5％或更低的毒性。在其它实例中，在评估指示毒性的参数的测定或方法中，本发明提供的LIVP克隆毒株与具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的LIVP
毒株GLV-1h68相比呈现出其70％-120％、例如至少或大约70％、80％、90％、95％、100％、
110％、115％或120％的毒性或抗肿瘤发生能力。
[0314] 在特定的实例中，本发明提供的克隆毒株与得自Lister Institute of ViralPreparations，Moscow，Russia的LIVP毒株、具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的LIVP
毒株和/或具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株相比是低毒
性的(即低毒力)，及呈现出改良的抗肿瘤发生能力。例如，本发明提供的克隆毒株与称作
GLV-1h68(SEQ ID NO：9)的重组LIVP毒株相比是低毒性的，及呈现出改良或更好的抗肿瘤
发生毒性。
毒株和/或具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列称作GLV-1h68的重组LIVP毒株相比是低毒
性的(即低毒力)，及呈现出改良的抗肿瘤发生能力。例如，本发明提供的克隆毒株与称作
GLV-1h68(SEQ ID NO：9)的重组LIVP毒株相比是低毒性的，及呈现出改良或更好的抗肿瘤
发生毒性。
[0315] 例如，所述克隆毒株当以有效诱导抗肿瘤发生能力的量施用对象时是低毒性的(即较低毒力)。这个量可以由本领域技术人员根据经验确定，依赖于多种因素如特定
对象、治疗的疾病或病症、肿瘤或癌症类型、疾病的节段或进展，及其它相似因素。对于
4 8
治疗小鼠或其它相似大小的对象，克隆毒株治疗量例如是大约或在1×10-1×10pfu之
5 7 4 5 6 6 6 6
间，如1×10-1×10pfu，例如至少或大约1×10、1×10、1×10、2×10、3×10、4×10
6
或5×10pfu。对于治疗人对象或其它相似大小的对象，克隆毒株的治疗量例如是大约
7 14 7 10 9 10
或在1×10-1×10 pfu之间，1×10-1×10 pfu，如1×10-1×10 pfu，例如至少或大约
7 8 9 9 9 9 9
1×10、1×10、1×10、2×10、3×10、4×10 或5×10pfu。给药方案可以如本文别处所
述改变。特别地，本发明提供的LIVP克隆毒株在治疗方案实施期间，呈现出对象100％
存活率，及与在治疗期间对象体重降低或减少不相关联。在一个实例中，本发明提供的
克隆毒株当施用对象时，与施用相同或相似治疗量的得自Lister Institute of Viral
Preparations，Moscow，Russia、具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的LIVP毒株和/或具
有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的重组LIVP毒株的LIVP毒株的对象的
存活率相比呈现出存活率增加。
对象、治疗的疾病或病症、肿瘤或癌症类型、疾病的节段或进展，及其它相似因素。对于
4 8
治疗小鼠或其它相似大小的对象，克隆毒株治疗量例如是大约或在1×10-1×10pfu之
5 7 4 5 6 6 6 6
间，如1×10-1×10pfu，例如至少或大约1×10、1×10、1×10、2×10、3×10、4×10
6
或5×10pfu。对于治疗人对象或其它相似大小的对象，克隆毒株的治疗量例如是大约
7 14 7 10 9 10
或在1×10-1×10 pfu之间，1×10-1×10 pfu，如1×10-1×10 pfu，例如至少或大约
7 8 9 9 9 9 9
1×10、1×10、1×10、2×10、3×10、4×10 或5×10pfu。给药方案可以如本文别处所
述改变。特别地，本发明提供的LIVP克隆毒株在治疗方案实施期间，呈现出对象100％
存活率，及与在治疗期间对象体重降低或减少不相关联。在一个实例中，本发明提供的
克隆毒株当施用对象时，与施用相同或相似治疗量的得自Lister Institute of Viral
Preparations，Moscow，Russia、具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的LIVP毒株和/或具
有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的称作GLV-1h68的重组LIVP毒株的LIVP毒株的对象的
存活率相比呈现出存活率增加。
[0316] 本发明提供的分离的LIVP克隆病毒可以衍生自通过在细胞系中重复传代繁殖的LIVP的噬斑分离。例如，LIVP克隆分离株可以通过病毒在含胚鸡卵培养物、在鸡胚成纤维
细胞(CEF)、HeLA S3细胞、CV-1细胞或BHK-21细胞中传代而获得。本发明提供的LIVP克
隆分离株是序列同源的。典型的本发明提供的LIVP克隆病毒是在本发明方法中选择的克
隆分离株，呈现出抗肿瘤发生能力或降低的毒性。
细胞(CEF)、HeLA S3细胞、CV-1细胞或BHK-21细胞中传代而获得。本发明提供的LIVP克
隆分离株是序列同源的。典型的本发明提供的LIVP克隆病毒是在本发明方法中选择的克
隆分离株，呈现出抗肿瘤发生能力或降低的毒性。
[0317] 典型的LIVP克隆毒株
[0318] 本发明提供的LIVP克隆毒株包括具有如下核苷酸序列的那些毒株，所述核苷酸序列相应于SEQ ID NO：1的10,073-180,095位核苷酸、SEQ ID NO：2的11,243-182,721
位核苷酸、SEQ ID NO：4的6,264-181,390位核苷酸、SEQ ID NO：5的7,044-181,820位核
苷酸、SEQ ID NO：6的6,674-181,409位核苷酸、SEQ ID NO：7的6,716-181,367位核苷酸、
SEQ ID NO：8的6,899-181,870位核苷酸，或者其互补体。本发明提供的LIVP克隆毒株通
常还包括相应于左侧和/或右侧反向末端重复(ITR)的末端核苷酸。典型的本发明提供的
LIVP克隆毒株包括具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或其互补体的那些
毒株，或者与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列的克隆毒株呈现出相似毒
性和抗肿瘤发生能力的那些毒株。
位核苷酸、SEQ ID NO：4的6,264-181,390位核苷酸、SEQ ID NO：5的7,044-181,820位核
苷酸、SEQ ID NO：6的6,674-181,409位核苷酸、SEQ ID NO：7的6,716-181,367位核苷酸、
SEQ ID NO：8的6,899-181,870位核苷酸，或者其互补体。本发明提供的LIVP克隆毒株通
常还包括相应于左侧和/或右侧反向末端重复(ITR)的末端核苷酸。典型的本发明提供的
LIVP克隆毒株包括具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或其互补体的那些
毒株，或者与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列的克隆毒株呈现出相似毒
性和抗肿瘤发生能力的那些毒株。
[0319] 本发明提供的LIVP克隆毒株还包括任何这些病毒的变体，其具有与具有SEQ IDNO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列的病毒相似但不相同的序列。特别地，变体病毒可
包含与SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或其互补体具有例如至少97％、98％
或99％或更高相同性如至少99％相同性的核苷酸序列。例如，变体病毒可包含与SEQ ID
NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或其互补体例如具有至少99.1％、99.2％、99.3％、
99.4％、99.5％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％或更高相同性的核苷酸序列。所述变体克隆毒株呈现出与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核
苷酸序列的克隆毒株相似的毒性和抗肿瘤发生能力。
包含与SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或其互补体具有例如至少97％、98％
或99％或更高相同性如至少99％相同性的核苷酸序列。例如，变体病毒可包含与SEQ ID
NO：1、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或其互补体例如具有至少99.1％、99.2％、99.3％、
99.4％、99.5％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％或更高相同性的核苷酸序列。所述变体克隆毒株呈现出与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7或8所示核
苷酸序列的克隆毒株相似的毒性和抗肿瘤发生能力。
[0320] 本发明提供的示例性LIVP克隆毒株是LIVP1.1.1、LIVP2.1.1、LIVP4.1.1、LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1或LIVP8.1.1，或者与任何LIVP1.1.1、LIVP2.1.1、
LIVP4.1.1、LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1或LIVP8.1.1克隆毒株呈现出相似毒性和
抗肿瘤发生能力的克隆毒株。所述克隆毒株或其制备物可以分离自培养的细胞，其中已经
培养了亲代LIVP、LIVP1.1.1、LIVP2.1.1、LIVP4.1.1、LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1
或LIVP8.1.1或其变体。例如，所述克隆毒株或制备物可以通过从细胞培养物中分离LIVP
克隆而获得，所述细胞培养物中已经繁殖了亲代LIVP、LIVP1.1.1、LIVP2.1.1、LIVP4.1.1、
LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1或LIVP8.1.1或其变体。在一些实例中，所述克隆毒株
通过本文上述方法自病毒混合物中分离，以鉴别与亲代病毒制备物或混合物或其它参考毒
株相比呈现出改良的抗肿瘤发生能力和最小毒性的克隆毒株。典型的本发明提供的分离的
克隆LIVP病毒毒株是选自通过使Lister毒株适应于小牛皮肤产生的LIVP混合物的分离
的克隆LIVP病毒毒株(由Lister Institute of Viral preparations，Moscow，Russia产
生的LIVP)。
LIVP4.1.1、LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1或LIVP8.1.1克隆毒株呈现出相似毒性和
抗肿瘤发生能力的克隆毒株。所述克隆毒株或其制备物可以分离自培养的细胞，其中已经
培养了亲代LIVP、LIVP1.1.1、LIVP2.1.1、LIVP4.1.1、LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1
或LIVP8.1.1或其变体。例如，所述克隆毒株或制备物可以通过从细胞培养物中分离LIVP
克隆而获得，所述细胞培养物中已经繁殖了亲代LIVP、LIVP1.1.1、LIVP2.1.1、LIVP4.1.1、
LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1或LIVP8.1.1或其变体。在一些实例中，所述克隆毒株
通过本文上述方法自病毒混合物中分离，以鉴别与亲代病毒制备物或混合物或其它参考毒
株相比呈现出改良的抗肿瘤发生能力和最小毒性的克隆毒株。典型的本发明提供的分离的
克隆LIVP病毒毒株是选自通过使Lister毒株适应于小牛皮肤产生的LIVP混合物的分离
的克隆LIVP病毒毒株(由Lister Institute of Viral preparations，Moscow，Russia产
生的LIVP)。
[0321] D.LIVP毒株的修饰
[0322] 本发明提供在其基因组序列中修饰的修饰的LIVP病毒毒株。痘苗病毒的线性dsDNA病毒基因组为大约200kb，编码共大约250个基因。所述痘苗病毒基因组具有
较大的携带外源基因的能力，其中可以插入直至25kb的外源DNA片段(大约12％的痘
苗病毒基因组大小)。一些痘苗病毒毒株的基因组可以被完全测序，鉴别一些必需和非
必需的基因。由于不同毒株之中的高序列同源性，来自一个痘苗病毒毒株的基因组信息
可用于在其它毒株中设计和产生修饰的病毒。最后，通过遗传工程产生修饰的痘苗病毒
毒株的技术已经充分确立(Moss，Curr.Opin.Genet.Dev.3：86-90(1993)；Broder and
Earl，Mol.Biotechnol.13：223-245(1999)；Timiryasova et al.，Biotechniques31：
534-540(2001))。
较大的携带外源基因的能力，其中可以插入直至25kb的外源DNA片段(大约12％的痘
苗病毒基因组大小)。一些痘苗病毒毒株的基因组可以被完全测序，鉴别一些必需和非
必需的基因。由于不同毒株之中的高序列同源性，来自一个痘苗病毒毒株的基因组信息
可用于在其它毒株中设计和产生修饰的病毒。最后，通过遗传工程产生修饰的痘苗病毒
毒株的技术已经充分确立(Moss，Curr.Opin.Genet.Dev.3：86-90(1993)；Broder and
Earl，Mol.Biotechnol.13：223-245(1999)；Timiryasova et al.，Biotechniques31：
534-540(2001))。
[0323] 例如，本发明提供这样的LIVP病毒，其基因组序列与SEQ ID NO：1(LIVP1.1.1)、SEQ ID NO：2(LIVP2.1.1)、SEQ ID NO：4(LIVP4.1.1)、SEQ ID NO：5(LIVP5.1.1)、SEQ ID
NO：6(LIVP6.1.1)、SEQ ID NO：7(LIVP7.1.1)、SEQ ID NO：8(LIVP8.1.1)或SEQ ID NO：
9(GLV1h68)所示基因组序列相比被修饰。修饰可包括病毒基因组的任何改变，如核酸的突
变、插入、缺失或者取代(置换)或者病毒基因组序列的其它修饰。例如，本发明提供的病
毒可以修饰为含有插入病毒基因组中的或置换的一或多个异源核酸分子。在一个实例中，
修饰可包括一或多个核苷酸的插入或置换，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、
60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个核苷酸。
NO：6(LIVP6.1.1)、SEQ ID NO：7(LIVP7.1.1)、SEQ ID NO：8(LIVP8.1.1)或SEQ ID NO：
9(GLV1h68)所示基因组序列相比被修饰。修饰可包括病毒基因组的任何改变，如核酸的突
变、插入、缺失或者取代(置换)或者病毒基因组序列的其它修饰。例如，本发明提供的病
毒可以修饰为含有插入病毒基因组中的或置换的一或多个异源核酸分子。在一个实例中，
修饰可包括一或多个核苷酸的插入或置换，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、
60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个核苷酸。
[0324] 异源核酸分子可含有一个开放读框或者可以是非编码序列。在一些情况中个，所述异源核酸置换全部或一部分病毒基因。所述病毒基因可以用来自另一病毒的同源基因或
者用不同基因置换。在其它实例中，本发明提供的病毒可以通过插入一或多个异源核酸分
子而被修饰。例如，可以插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸分子。通常地，插入的异源核酸是连续的核苷酸序列，其含有一个开放读框及相应于基因的编码区。例如，可以插
入编码异源基因的异源核酸分子。通常地，所述异源基因是编码非病毒蛋白质的基因。插
入或置换的基因在感染宿主细胞如肿瘤细胞之后可以从病毒基因组中转录和/或翻译。如
下文描述，异源核酸可含有调节序列以控制基因的表达。例如，所述异源核酸可以与启动子
可操纵地连接，以表达开放读框。
者用不同基因置换。在其它实例中，本发明提供的病毒可以通过插入一或多个异源核酸分
子而被修饰。例如，可以插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸分子。通常地，插入的异源核酸是连续的核苷酸序列，其含有一个开放读框及相应于基因的编码区。例如，可以插
入编码异源基因的异源核酸分子。通常地，所述异源基因是编码非病毒蛋白质的基因。插
入或置换的基因在感染宿主细胞如肿瘤细胞之后可以从病毒基因组中转录和/或翻译。如
下文描述，异源核酸可含有调节序列以控制基因的表达。例如，所述异源核酸可以与启动子
可操纵地连接，以表达开放读框。
[0325] 本发明提供的病毒的修饰可导致病毒特性或性质的修饰，包括与指示毒性或抗肿瘤发生能力的参数相关的那些修饰。典型的插入、突变或缺失是产生相对于不含有修饰的
克隆毒株减毒的痘苗病毒的那些修饰。例如，插入、突变或缺失可降低克隆毒株的致病原
性，例如通过降低毒性、降低感染性、降低复制能力或者减少痘苗病毒可积累的非肿瘤器官
或组织的数目。其它典型的插入、突变或缺失包括但不限于增加病毒抗原性、允许检测或成
像、改变病毒的减毒剂改变感染性的那些修饰。修饰可例如在参与核苷酸代谢、宿主相互作
用和病毒形成的基因中产生。
克隆毒株减毒的痘苗病毒的那些修饰。例如，插入、突变或缺失可降低克隆毒株的致病原
性，例如通过降低毒性、降低感染性、降低复制能力或者减少痘苗病毒可积累的非肿瘤器官
或组织的数目。其它典型的插入、突变或缺失包括但不限于增加病毒抗原性、允许检测或成
像、改变病毒的减毒剂改变感染性的那些修饰。修饰可例如在参与核苷酸代谢、宿主相互作
用和病毒形成的基因中产生。
[0326] 例如，本发明提供的修饰的克隆毒株与不含有所述修饰的克隆毒株相比可呈现出降低的毒性或致病原性。在另一实例中，本发明提供的修饰的克隆毒株与不含有所述修饰
的克隆毒株相比可呈现出改良的抗肿瘤发生能力。例如，修饰的克隆毒株可呈现出改良的
在肿瘤中优先积累的能力、裂解细胞或者导致细胞死亡的能力、激发针对肿瘤细胞的免疫
应答的能力、免疫原性和复制能力。在其它实例中，修饰的克隆毒株呈现出降低的毒性和增
加的抗肿瘤发生能力。
的克隆毒株相比可呈现出改良的抗肿瘤发生能力。例如，修饰的克隆毒株可呈现出改良的
在肿瘤中优先积累的能力、裂解细胞或者导致细胞死亡的能力、激发针对肿瘤细胞的免疫
应答的能力、免疫原性和复制能力。在其它实例中，修饰的克隆毒株呈现出降低的毒性和增
加的抗肿瘤发生能力。
[0327] 在其它实例中，修饰可以是通过插入编码表达蛋白质表达和/或RNA分子表达的基因的异源核酸分子产生的。所述一或多个异源核酸分子可编码如治疗性基因产物，可检
测的基因产物或者能诱导可检测信号的基因产物，如可用于诊断、监测或成像的基因产物，
抗原(如超抗原)如用于肿瘤治疗的抗原。由本发明提供的病毒表达的任何异源基因均可
以为了收获表达的基因产物的目的而产生。
测的基因产物或者能诱导可检测信号的基因产物，如可用于诊断、监测或成像的基因产物，
抗原(如超抗原)如用于肿瘤治疗的抗原。由本发明提供的病毒表达的任何异源基因均可
以为了收获表达的基因产物的目的而产生。
[0328] 1.异源核酸
[0329] 痘病毒如本发明提供的病毒的较大的基因组规格使得较大的异源DNA插入体和/或多个异源DNA插入体可以掺入基因组中(Smith and Moss(1983)Gene25(1)：21-28)。本
发明提供的病毒，如本发明提供的任何克隆毒株，可以通过插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个异源DNA分子而修饰。通常地，一或多个异源DNA分子被插入病毒基因组的非必需
区域中。例如，所述一或多个异源DNA分子插入病毒基因组的对于在增殖细胞如肿瘤细胞
中复制非必需的基因座中。典型的插入在下文提供，这些插入为本领域已知。
发明提供的病毒，如本发明提供的任何克隆毒株，可以通过插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个异源DNA分子而修饰。通常地，一或多个异源DNA分子被插入病毒基因组的非必需
区域中。例如，所述一或多个异源DNA分子插入病毒基因组的对于在增殖细胞如肿瘤细胞
中复制非必需的基因座中。典型的插入在下文提供，这些插入为本领域已知。
[0330] 在一些实例中，所述病毒可以被修饰为表达外源或异源基因。典型的外源基因产物包括蛋白质和RNA分子。修饰的病毒可表达治疗性基因产物、可检测的基因产物、为生产
或收获的基因产物、为收获抗体的抗原性基因产物，或者病毒基因产物。这种基因产物的特
性在本文及别处描述。
或收获的基因产物、为收获抗体的抗原性基因产物，或者病毒基因产物。这种基因产物的特
性在本文及别处描述。
[0331] 在一些实例中，所述病毒可以被修饰为表达两或多个基因产物，如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个基因产物，其中所述两或多个基因产物的任何组合可以是一或多种的可检
测的基因产物、治疗性基因产物、为生产或收获的基因产物或者为收获抗体的抗原性基因
产物或者病毒基因产物。在一个实例中，病毒可以被修饰为表达抗癌基因产物。在另一实
例中，病毒可以被修饰为表达两或多个基因产物以进行检测或者表达两或多个治疗性基因
产物。在一些实例中，参与萤光素酶底物的生物合成的一或多种蛋白质可以随着萤光素酶
一起表达。当导入两或多个外源基因时，所述基因可以在相同或不同的调节序列下调节，所
述基因可以插入病毒基因组的相同或不同区域，在一个或多个遗传操纵步骤中进行。在一
些实例中，一个基因如编码可检测基因产物的基因可以在组成型启动子的控制下，而另一
个基因如编码治疗性基因产物的基因可以在可诱导启动子的控制下。在病毒中插入两或多
个基因的方法为本领域已知，可以便利地使用各种外源基因、调节序列和/或其它核酸序
列针对各种病毒进行。
测的基因产物、治疗性基因产物、为生产或收获的基因产物或者为收获抗体的抗原性基因
产物或者病毒基因产物。在一个实例中，病毒可以被修饰为表达抗癌基因产物。在另一实
例中，病毒可以被修饰为表达两或多个基因产物以进行检测或者表达两或多个治疗性基因
产物。在一些实例中，参与萤光素酶底物的生物合成的一或多种蛋白质可以随着萤光素酶
一起表达。当导入两或多个外源基因时，所述基因可以在相同或不同的调节序列下调节，所
述基因可以插入病毒基因组的相同或不同区域，在一个或多个遗传操纵步骤中进行。在一
些实例中，一个基因如编码可检测基因产物的基因可以在组成型启动子的控制下，而另一
个基因如编码治疗性基因产物的基因可以在可诱导启动子的控制下。在病毒中插入两或多
个基因的方法为本领域已知，可以便利地使用各种外源基因、调节序列和/或其它核酸序
列针对各种病毒进行。
[0332] 特别地，本发明提供的病毒可以被修饰以在体内和体外表达基因。在一些实例中，所述病毒可表达从宿主细胞中分泌的异源基因。在一些实例中，所述病毒可表达在感染期
间在细胞死亡、裂解或者从细胞膜渗漏时从宿主细胞中释放的异源基因。在一些实例中，所
述病毒可以在足够高的水平表达异源基因，以允许从肿瘤或其它患者病理学样品如血液或
淋巴样品中收获异源基因产物。在一些实例中，所述病毒可表达肿瘤抗原以在对象体内诱
导免疫应答。在这种实例中，可以收获针对所述抗原的抗体。
间在细胞死亡、裂解或者从细胞膜渗漏时从宿主细胞中释放的异源基因。在一些实例中，所
述病毒可以在足够高的水平表达异源基因，以允许从肿瘤或其它患者病理学样品如血液或
淋巴样品中收获异源基因产物。在一些实例中，所述病毒可表达肿瘤抗原以在对象体内诱
导免疫应答。在这种实例中，可以收获针对所述抗原的抗体。
[0333] 例如，典型的基因包括这样的基因列表，包括由Johns Hopkins University的Dr.VictorA.McKusick及其同事撰写和编辑的人体基因和遗传病症列表，由NCBI(National
Center for Biotechnology Information)的World Wide Web开发的那些基因，在线
TM
Mendelian Inheritance in Man，OMIM Center for Medical Genetics，Johns Hopkins
University(Baltimore，Md.)，及 National Center for Biotechnology Information，
National Library of Medicine (Bethesda，Md.)，1999；以及在公众数据库如PubMed and
GenBank(见例如(ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)中可获得的那些
基因。这些基因包括但不限于：239f2h9、3pk、4ebp1、4ebp2、al1、al2m1、al2m2、al2m3、
al2m4、al5、a1b、albg、alst、a2m、a2mr、a2mrap、aa、aaa、aaa、aabt、aac1、aac2、aact、aadac、aanat、aars、aas、aat、aavs1、abc1、abc2、abc3、abc7、abc8、abcr、abi1、abl1、abl2、abl1、abo、abp、abp1、abpa、abpx、abr、acaa、acac、acaca、acacb、acad1、acadm、acads、acadsb、acadv1、acat、acat1、acat2、acc、accb、accn1、accn2、accpn、ace1、ach、ache、achm1、achm2、achrb、achrd、achrg、acls、acly、aco1、aco2、acox、acox1、acox2、acox3、acp1、acp2、acp5、acpp、acr、acrv1、acs3、acs3、acs4、act2、act35、acta1、acta2、acta3、actb、actc、actg1、actg2、act11、actn1、actn2、actn3、actsa、acug、acvr1、acvr2b、acvrl1、acvrlk1、acvrlk2、acvrlk3、acy1、ad1、ad2、ad3、ad4、ad5、ada、adam10、adam11、adam12、adam3、adam3a、adam3b、adam8、adar、adarb1、adarb2、adcp1、adcp2、adcy1、adcy2、adcy3、adcy3、adcy4、adcy5、adcy6、adcy7、adcy8、adcy9、adcyap1、adcyaplr1、add1、add2、add3、add1、adfn、adh1、adh2、adh3、adh4、adh5、adh7、adhaps、adhc1@、adhr、adhr、adk、ad1、adm、admlx、adora1、adora2a、adora2b、adora21、adora21、adora3、adprt、adra1a、adra1b、adra1c、adra1d、adra2a、adra2b、adra2c、adra211、adra212、adra2r、adrb1、adrb1r、adrb2、
adrb2rl1、adrb3、adrbk1、adrbk2、ads1、adss、adtb1、adx、adxr、ae1、ae2、ae3、aegl1、aemk、aes、af10、af17、af4、af6、af8t、af9、afd1、afdn、afg3、afg311、afm、afp、afx1、aga、agc1、ager、ag1、agmx1、agmx2、agp1、agp7、agps、agm、agrp、agrt、ags、agt、agti1、agtr1、agtr1a、agtr2、agtrl1、agxt、ahc、ahcy、ahd、ahds、ahnak、aho2、ahr、ahsg、ahx、aib1、aic、aic1、aied、aih1、aih2、aih3、aim1、air、airc、aire、ak1、ak2、ak3、akap149、akt1、akt2、aku、alad、alas1、alas2、alb、alb2、alba、alcam、ald、aldh1、aldh10、aldh2、aldh3、aldh4、aldh5、aldh6、aldh9、ald11、aldoa、aldoh、aldoc、aldr1、alds、alk、alk1、alk2、alk3、alk6、alms1、alox12、alox15、alox5、alp、alpi、alp1、alpp、alpp12、alr、alr、als1、als2、als4、als5、alss、ambn、ambp、amcd1、amcd2b、amcn、amcn1、amcx1、amd1、amdm、amelx、amely、amfr、amg、amg1、amgx、amh、amhr、amhr2、aml1、aml1t1、aml2、aml3、amog、ampd1、ampd2、ampd3、amph、amph1、ampk、amt、amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、an2、anc、ancr、ang、ang1、anh1、ank1、ank2、ank3、anop1、anova、anp、anpep、anpra、anprb、anprc、ans、ant1、ant2、ant3、ant3y、anx1、anx11、anx13、anx2、anx214、anx3、anx4、anx5、anx6、anx7、anx8、aoah、aoc2、aox1、ap2tf、apah1、apba1、apba2、apbb1、apbb2、apc、apcs、ape、apeced、apeh、apex、api1、api2、api3、apj、aplp、aplp1、aplp2、apnh、apo31、apoa1、apoa2、apoa4、apob、apobec1、apoc1、apoc2、apoc3、apoc4、apod、apoe、apoer2、apoh、apolmt、apolp1@、apolp2@、app、appbp1、appl1、aprf、aprt、aps、apt1、aptl1g1、apx1、apy、aqdq、aqp0、aqp1、aqp2、aqp21、aqp3、aqp4、aqp5、aqp6、aqp7、ar、ar1、ara、araf1、araf2、arcn1、ard1、ard1、areg、arf1、arf2、arf3、arf41、arf5、arg、arg1、args、arh12、arh6、arh9、arha、arhb、arhc、arhg、arhgap2、arhgap3、arhgap6、arhgdia、arhgdib、arhh、arix、arl2、armd1、arnt、arnt1、aro、arp、arp1、arpkd、arr3、arrb1、arrb2、arsa、arsacs、arsb、arsc1、arsc2、arsd、arse、arsf、art、art1、art3、art4、arts、arvd1、arvd2、arvd3、arvd4、as、asat、asb、ascl1、ascl2、asct1、asd1、asd2、asgr1、asgr2、ash1、asip、as1、asln、asm1、asma、asmd、asmt、asmtlx、asmty、asnrs、asns、aspa、ass、astm1、astn、asv、at、at1、at2r1、at3、ata、atbf1、atcay、atf1、ath1、aths、atm、atoh1、atox1、atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a11、atp1b1、atp1b2、atp1b3、atp1b11、atp1g1、atp2a1、atp2a2、atp2a3、atp2b、atp2b1、atp2b2、atp2b2、atp2b3、atp2b4、atp4a、atp4b、atp5、atp5a、atp5b、atp5g1、atp5g2、atp5g3、atp5o、atp6a、atp6b1、atp6c、atp6e、atp6n1、atp7a、atp7b、atpm、atpsb、atpsk1、atpsk2、atq1、atr、atr、atr1、atr1、atr2、atrc1、atrc2、atrx、ats、atsv、atx1、atx2、au、auf1、auf1a、aut、avcd、aved、avp、avpr1a、avpr1b、avpr2、avpr3、avrp、avsd、awa1、ax1、axl1g、axsf、azf1、azf2、azgp1、azu1、b120、b144、blg1、b29、b2m、b2mr、b3galt4、b4galt1、ba2r、bab1、bag1、bai1、bai2、bai3、bak1、bam22、bap1、bap135、bapx1、bard1、bark2、bas、bat1、bat2、bat3、bat4、bat5、bax、bb1、bbbg1、bbbg2、bbs1、bbs2、bbs3、bbs4、bbs5、bcas1、bcat1、bcat2、bcate2、bcd1、bcei、bche、bckdha、bckdhb、bcl1、bcl10、bcl2、bcl2a1、bcl212、bcl3、bcl5、bcl6、bcl7、bcl7a、bcl8、bcl9、bclw、bcm、bcm1、bcma、bcns、bcns、bcp、bcpm、bcpr、bcr、bcrl2、bcrl3、bcrl4、bcsg1、bct1、bct2、bdb、bdb1、bdc、bde、bdkrb1、bdkrb2、bdmf、bdmr、bdnf、bed、bedp、bek、bene、bevi、bf、bf1、bf2、bfhd、bfic、bfls、bfnc2、bfp、bfsp1、bft、bglap、bgmr、bgn、bgp、bhd、bhpcdh、bhr1、bicd1、bid、bigh3、bin1、bir、bjs、bkma1、blast1、blau、blk、blm、blmh、bltr、blvra、blvrb、blym、bmal1、bmd、bmh、bmi1、bmp1、bmp2、bmp2a、bmp2b1、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8、bmpr1a、bmpr1b、bmx、bmyb、bn51t、bnc、bnc1、bnp、bor、bpad、bpag1、bpag2、bpes、bpes1、bpes2、bpgm、bph1、bpi、br、br140、braf、brca1、brca2、brca3、brcacox、brcd1、brcd2、brdt、brf1、brhc、bric、brks、brn3a、brn3b、brn3c、brrn1、brw1c、bs、bsap、bsep、bsf2、bsg、bsnd、bss1、bst1、bst2、btak、btc、btd、bteb、bteb1、btg1、btg2、bths、btk、btk1、btn、bts、bub1b、bubr1、bwr1a、bwr1b、bws、bwscr1a、bwscr1b、bzrp、bzx、c11orf13、c1nh、c1qa、c1qb、c1qbp、c1qg、c1r、c1s、c2、c21orf1、c21orf2、c21orf3、c2ta、c3、c3br、c3dr、c3g、c4a、c4b、c4bpa、c4bpb、c4f、c4s、c5、c5ar、c5r1、c6、c7、c8a、c8b、c8g、c9、ca1、ca12、ca125、ca2、ca21h、ca3、ca4、ca5、ca6、ca7、ca8、ca9、caaf1、cabp9k、cac、cac@、caca、cacd、cacna1a、cacna1b、cacna1c、cacna1d、cacna1e、cacna1f、cacna1s、cacna2、cacnb1、cacnb2、cacnb3、cacnb4、cacng、cacnl1a1、cacnl1a2、cacnl1a3、cacnl1a4、cacnl1a5、cacnl1a6、cacnl2a、cacnlb1、cacnlg、cacp、cact、cacy、cad、cad11、cadasi1、cae1、cae3、caf、caf1a、caga、cagb、cain、cak、cak1、cal11、calb1、calb2、calb3、calc1、calc2、calca、calcb、calcr、cald1、calla、calm1、calm2、calm3、calm11、calm13、calna、calna3、calnb、calnb1、calr、cals、calt、calu、cam、camk4、camkg、caml1、camlg、camp、can、canp3、canx、cap2、cap3、cap37、capb、capg、cap1、capn1、capn2、capn3、capn4、cappa2、cappb、capr、caps、capza2、capzb、car、carp、cars、cart1、cas、cas2、casi1、casp1、casp10、casp2、casp3、casp3、casp4、casp5、casp6、casp7、casp8、casq1、casq2、casr cast、cat、cat1、cat4、catf1、catm、cav1、cav2、cav3、cbbm、cbd、cbfa1、cbfa2、cbfa2t1、cbfa3、cbfb、cbg、cb1、cbl2、cbln2、cbp、cbp、cbp2、cbp68、cbr1、cbs、cbt、cbt1、cc10、cca、cca1、cca11、cca12、ccb11、ccckr5、ccg1、ccg2、cchl1a1、cchl1a2、cchl1a3、cch1b1、cck、cckar、cckbr、cc1、ccm1、ccm2、ccm3、ccn1、ccna、ccnb1、ccnc、ccnd1、ccnd2、ccnd3、ccne、ccnf、ccng1、ccnh、ccnt、ccnt1、cco、ccr10、ccr2、ccr3、ccr9、ccsp、cct、ccv、cczs、cd、cd10、cd11a、cd11b、cd11c、cd13、cd137、cd14、cd15、cd151、cd156、cd16、cd164、cd18、cd19、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、cd1e、cd2、cd20、cd22、cd23、cd24、cd26、cd27、cd271、cd28、cd281g、cd281g2、cd30、cd32、cd33、cd34、cd36、cd3611、cd3612、cd37、cd38、cd39、cd3911、cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd40、cd401g、cd41b、cd43、cd44、cd45、cd46、cd47、cd48、cd49b、cd49d、cd5、cd53、cd57、cd58、cd59、cd51、cd6、cd63、cd64、cd68、cd69、cd7、cd70、cd71、cd72、cd74、cd79a、cd79b、cd80、cd81、cd82、cd82、cd86、cd8a、cd8b、cd8b1、cd9、cd94、cd95、cd97、cd99、cda、cda1、cda3、cdan1、cdan2、cdan3、cdb2、cdc2、cdc20、cdc25a、cdc25b、cdc25c、cdc27、cdc211、cdc212、cdc214、cdc34、cdc42、cdc51、cdc7、
cdc711、cdcd1、cdcd2、cdcd3、cdc11、cdcre1、cdg1、cdgd1、cdgg1、cdgs2、cdh1、cdh11、cdh12、cdh13、cdh14、cdh15、cdh16、cdh16、cdh17、cd2、cdh3、cdh3、cdh5、cdh7、cdh8、cdhb、cdhh、cdhp、cdhs、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk7、cdk8、cdk9、cdkn1、cdkn1a、cdkn1b、cdkn1c、cdkn2a、cdkn2b、cdkn2d、cdkn3、cdkn4、cdl1、cdm、cdmp1、cdmt、cdpx1、cdpx2、cdpxr、cdr1、cdr2、cdr3、cdr62a、cdsn、cdsp、cdtb、cdw50、cdx1、cdx2、cdx3、cdx4、cea、cebp、cebpa、cebpb、cebpd、cebpe、cecr、ce1、cel1、cen1、cenpa、cenpb、cenpc、cenpc1、cenpe、cenpf、cerd4、ces、ces1、cetn1、cetp、cf、cf2r、cfag、cfag、cfc、cfd1、cfeom1、cfeom2、cfh、cfl1、cfl2、cfnd、cfns、cftr、cg1、cga、cgat、cgb、cgd、cgf1、cgh、cgrp、cgs23、cgt、cgthba、chac、chat、chc1、chd1、chd2、chd3、chd4、chd5、chdr、che1、che2、ched、chek1、chga、chgb、chgc、chh、chi311、chip28、chit、chk1、chlr1、chlr2、chm、chm1、chn、chn1、chn2、chop10、chr、chr39a、chr39b、chr39c、chrm1、chrm2、chrm3、chrm4、chrm5、chrna1、chrna2、chrna3、chrna4、chrna5、chrna7、chrnb1、chrnb2、chrnb3、chrnb4、chrnd、chrne、chrng、chrs、chs1、chx10、ciipx、cip1、cirbp、cish、ck2a1、ckap1、ckb、ckbb、ckbe、ckm、ckmm、ckmt1、ckmt2、ckn1、ckn2、ckr3、ckr11、ckr13、c1、c1100、cla1、cla1、clac、clapb1、clapm1、claps3、clc、clc7、clck2、clcn1、clcn2、clcn3、clcn4、clcn5、clcn6、clcn7、clcnka、clcnkb、cld、cldn3、cldn5、clg、clg1、clg3、clg4a、clg4b、cli、clim1、clim2、clk2、clk3、cln1、cln2、cln3、cln5、cln6、cln80、clns1a、clns1b、clp、clpp、clps、clta、cltb、cltc、cltc11、cltd、clth、clu、cma1、cmah、cmar、cmd1、cmd1a、cmd1b、cmd1c、cmd1d、cmd1e、cmd1f、cmd3a、cmdj、cmh1、cmh2、cmh3、cmh4、cmh6、cmkbr1、cmkbr2、cmkbr3、cmkbr5、cmkbr6、cmkbr7、cmkbr8、cmkbr9、cmkbr12、cmklr1、cmkr11、cmkr12、cml、cmm、cmm2、cmoat、cmp、cmpd1、cmpd2、cmpd2、cmpd3、cmpx1、cmt1a、cmt1b、cmt2a、cmt2b、cmt2d、cmt2d、cmt4a、cmt4b、cmtnd、cmtx1、cmtx2、cna1、cna2、cnbp1、cnc、cncg1、cncg2、cncg31、cnd、cng3、cnga1、cnga3、cngb1、cnn1、cnn2、cnn3、cnp、cnr1、cnsn、cntf、cntfr、cntn1、co、coca1、coca2、coch、cod1、cod2、coh1、coil、col10a1、col11a1、col11a2、col12a11、col13a1、col15a1、col16a1、col17a1、col18a1、
col19a1、col1a1、col1a2、col1ar、col2a1、col3a1、col4a1、col4a2、col4a3、col4a4、
col4a5、col4a6、col5a1、col5a2、col6a1、col6a2、col6a3、col7a1、col8a1、col8a2、col9a1、col9a1、col9a2、col9a3、colq、comp、comt、copeb、copt1、copt2、cord1、cord2、cord5、cord6、cort、cot、cox10、cox4、cox5b、cox6a1、cox6b、cox7a1、cox7a2、cox7a3、cox7am、cox8、cp、cp107、cp115、cp20、cp47、cp49、cpa1、cpa3、cpb2、cpb2、cpd、cpe、cpetr2、cpm、cpn、cpn1、cpn2、cpo、cpp、cpp32、cpp32、cppi、cps1、cpsb、cpsd、cpt1a、cpt1b、cpt2、cpu、cpx、cpx、cpxd、cr1、cr2、cr3a、crabp1、crabp2、crapb、crarf、crat、crbp1、crbp2、crd、crd1、creb1、creb2、crebbp、creb11、crem、crfb4、crfr2、crh、crhbp、crhr、crhr1、crhr2、crip、crk、crk1、crm1、crmp1、crmp2、crp、crp1、crs、crs1c、crs2、crs3、crsa、crt、crtl1、crtm、crx、cry1、cry2、crya1、crya2、cryaa、cryab、cryb1、cryb2、cryb3、cryba1、cryba2、cryba4、crybb1、crybb2、crybb3、cryg1、cryg2、cryg3、cryg4、cryg8、cryg@、cryga、crygb、crygc、crygd、crygs、crym、cryz、cs、csa、csb、csbp1、csci、csd、csd2、csda、cse、cse11、csf1、csf1r、csf2、csf2ra、csf2rb、csf2ry、csf3、csf3r、csh1、csh2、csk、csmf、csn1、csn10、csn2、csn3、csnb1、csnb2、csnb3、csnk1a1、csnk1d、csnk1e、csnk1g2、csnk2a1、csnk2a2、csnk2b、csnu3、cso、cspb、cspg1、cspg2、cspg3、csr、csrb、csrp、csrp1、csrp2、cst1、cst1、cst2、cst3、cst4、cst4、cst5、cst6、csta、csfb、csx、ct2、ctaa1、ctaa2、ctag、ctb、ctbp1、ctbp2、ctgf、cth、cthm、ctk、ctla1、ctla3、ctla4、ctla8、ctm、ctnna1、ctnna2、ctnnb1、ctnnd、ctnnd1、ctnr、ctns、ctp、ctpct、ctps、ctr1、ctr2、ctrb1、ctr1、ctsa、ctsb、ctsc、ctsd、ctse、ctsg、ctsg12、ctsh、ctsk、cts1、ctss、ctsw、ctsz、ctx、cubn、cul3、cul4b、cul5、cutl1、cvap、cvd1、cvl、cx26、cx31、cx32、cx37、cx40、cx43、cx46、cx50、cxb3s、cxcr4、cxorf4、cyb5、cyb561、cyba、cybb、cyc1、cyk4、cyld1、cymp、cyp1、cyp11a、cyp11b1、
cyp11b2、cyp17、cyp19、cyp1a1、cyp1a2、cyp1b1、cyp21、cyp24、cyp27、cyp27a1、cyp27b1、cyp2a、cyp2a3、cyp2a6、cyp2b、cyp2c、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d、cyp2d@、cyp2e、cyp2e1、cyp2f1、cyp2j2、cyp3a4、cyp4a11、cyp4b1、cyp51、cyp7、cyp7a1、cyr61、cyrn1、cyrn2、czp3、d10s105e、d10s170、d10s170、d11s302e、d11s636、d11s813e、d11s833e、d12s2489e、
d12s53e、d13s1056e、d13s25、d14s46e、d15s12、d15s226e、d15s227e、d16s2531e、d16s469e、d17s136e、d17s811e、d18s892e、d19s204、d19s381e、d1s111、d1s155e、d1s166e、d1s1733e、d1s2223e、d1s61、d2h、d2s201e、d2s448、d2s488e、d2s69e、d3s1231e、d3s1319e、d3s48e、d4、d4s90、d5s1708、d5s346、d6、d6s1101、d6s207e、d6s2245e、d6s228e、d6s229e、d6s230e、d6s231e、d6s51e、d6s52e、d6s54e、d6s81e、d6s82e、d7s437、d8s2298e、d9s46e、da1、da2b、dab2、dac、dad1、daf、dag、dag1、dag2、dagk1、dagk4、dam10、dam6、damox、dan、dao、dap、dap3、dap5、dapk1、dar、dat1、dax1、daxx、daz、dazh、daz1、dba、dbccr1、dbcn、dbh、dbi、dbi、db1、dbm、dbn1、dbp、dbp、dbp1、dbp2、dbpa、dbt、dbx、dby、dcc、dce、dci、dck、dcn、dcoh、dcp1、dcr、dcr3、dct、dctn1、dcx、ddb1、ddb2、ddc、ddh1、ddh2、ddit1、ddit3、ddost、ddp、ddpac、ddr、ddx1、ddx10、ddx11、ddx12、ddx15、ddx16、ddx2a、ddx3、ddx5、ddx6、ddx9、dec、decr、def1、def4、def5、def6、defa1、defa4、defa5、defa6、defb1、defb2、dek、denn、dents、dep1、der12、des、dff1、dffa、dffrx、dffry、dfn1、dfn2、dfn3、dfn4、dfn6、dfna1、dfna10、dfna11、dfna12、dfna13、dfna2、dfna2、dfna4、dfna5、dfna6、dfna7、dfna8、dfna9、dfnb1、dfnb12、dfnb13、dfnb14、dfnb16、dfnb17、dfnb18、dfnb2、dfnb3、dfnb4、dfnb5、dfnb6、dfnb7、dfnb8、dfnb9、dgcr、dgcr2、dgcr2、dgcr6、dgi1、dgka、dgkq、dgpt、dgpt、dgs、dgs2、dgsi、dgu、dhc2、dhcr7、dhfr、dhlag、dhp、dhpr、dhps、dhrd、dhtr、di、di1、dia、dia1、dia2、dia4、diaph1、diaph2、dif2、diff6、dipi、dir、dkc、dkc1、dlc1、dld、dlg1、dlg2、dlg3、dlg4、dlst、dlx1、dlx2、dlx2、dl3、dlx4、dlx5、dlx6、dlx7、dlx8、dm、dm2、dmahp、dmbt1、dmd、dmda1、dmd1、dmh、dmk、dmp1、dmpk、dmsfh、dmt、dmt1、dmtn、dna21、dnah、dnah1、dnah11、dnah12、dnah2、dnahc1、dnahc11、dnahc2、dnahc3、dnase1、dnase111、dnase113、dnase2、dnch2、dnc1、dncm、dnec1、dne11、dn1、dn11、dn111、dnm1、dnmt1、dnmt2、dnpk1、dns、dntt、do、doc1、doc2、dock1、dock180、dod、dok1、dom、dp1、dp1、dp2、dp3、dpagt2、dpc4、dpd、dpde1、dpde2、dpde3、dpde4、dpep1、dph212、dpp、dpp4、dpp6、dpt、dpyd、dpys、dpys11、dpys12、dr1、dr3、dr31g、dr5、dra、drad、drada、dra1、drd1、drd1b、drd1b、drd112、drd2、drd3、drd4、drd5、dri11、drp1、drp1、drp2、drp2、drp3、drp1a、drt、dsc1、dsc2、dsc3、dsc3、dsc4、dscam、dscr、dsg1、dsg2、dsg3、dsp、dspg3、dspp、dss、dss1、dtd、dtdp2、dtdst、dtna、dtr、dts、dus、dusp1、dusp11、dusp2、dusp3、dusp4、dusp5、dusp6、dusp7、dusp8、dut、dv1、dv11、dv11、dv13、dxf68s1e、dxs1272e、dxs128、dxs1283e、dxs423e、dxs435e、dxs522e、dxs648、dxs707、dxs8237e、dxys155e、dylx2、dyrk、dys、dysf、dyt1、dyt3、dyt5、dyt6、dyt7、dyt8、dyt9、dyx1、dyx2、e11s、e14、e1b、e2a、e2f1、e2f2、e2f3、e2f4、e3、e4f、e4f1、e4tf1a、e4tf1b、ea1、eaac1、eaat1、eaat2、eac、ead、eag、eap、ear1、ear2、ear3、ebaf、ebf、ebi1、ebm、ebn1、ebn1、ebn2、ebr2a、ebs1、ebvm1、ebvs1、ec1、eca1、ecb2、ece1、ecgf1、ech1、echs1、eck、ecm1、ecp、ecs1、ect2、ed1、ed2、ed3、ed4、eda、eda3、eddr1、edg3、edg6、edh、edh17b2、edh17b2、edh17b3、edm1、edm2、edm3、edmd、ednd2、edn、edn1、edn2、edn3、ednra、ednrb、eec1、eec2、eef1a1、eef1a2、eef1b1、eef1b2、eef1b3、eef1b4、eef2、eeg1、eegv1、eek、een、ef1a、ef2、efe2、efemp1、efl6、efmr、efna1、efna3、efna4、efnb1、efnb2、efnb3、efp、eftu、egf、egfr、egi、egr1、egr2、egr3、egr4、ehhadh、ehoc1、ei、eif1a、eif2g A、eif2s3A、eif3s10、eif3s6、eif4a1、eif4a2、eif4c、eif4e、eif4ebp1、eif4e2、eif4e11、eif4e12、eif4g、eif4g1、eif4g2、eif5a、ejm1、el1、ela1、ela2、elam1、elanh2、elav11、elav12、elav14、elc、ele1、elf3、elk1、elk2、elk3、elk4、el1、eln、em9、emap、emap1、emd、emd2、emk1、emp1、emp55、emr1、ems1、emt、emtb、emx1、emx2、en1、en2、ena78、end、endog、enfl2、eng、en1、eno1、eno2、eno3、enpep、ent1、entk、enur1、enur2、enx2、eos、ep3、ep300、epa、epb3、epb311、epb41、epb4112、epb42、epb49、epb72、epha1、epha2、epha3、epha8、ephb1、ephb2、ephb3、ephb4、ephb6、epht1、epht2、epht3、ephx1、ephx2、epim、eplg1、eplg2、eplg3、eplg4、eplg5、eplg8、epm1、epm2、epm2a、epmr、epo、epor、eppk、eprs、eps15、eps8、ept、erba1、erba2、erba12、erba13、erbb2、erbb3、erbb4、erc55、ercc1、ercc2、ercc3、ercc4、ercc5、ercc6、ercm1、erda1、erf1、erg、erg3、ergic53、erh、erk、erk1、erk2、erk3、erm、erp11、erv1、erv1、erv3、ervr、ervt1ervt2、ervt3、ervt4、ervt5、eryf1、es1、es130、esa、esa1、esa4、esat、esb3、esd、esg、esr、esr1、esr2、esr11、esr12、esrra、esrrb、esrrg、ess1、est、est、est2、est25263、esx、etfa、etfb、etfdh、etk1、etk2、etm1、etm2、eto、ets1、ets2、etv1、etv3、etv4、etv5、etv6、evc、evc1、evda、evdb、evi1、evi2、evi2a、evi2b、evp1、evr1、evx1、evx2、ews、ewsr1、exlm1、ext1、ext2、ext3、ext11、ext12、eya1、eya2、eya3、eyc11、eyc13、ezh1、ezh1、ezh2、f10、f11、f12、f13a、f13a1、f13b、f2、f2r、f2rl2、f2rl3、f3、f5、f5f8d、f7、f7e、f7r、f8a、f8b、f8c、f8vwf、f9、fa、fa1、faa、fabp1、fabp2fabp3、fabp4、fabp6、fac1、faca、facc、facd、face、fac11、fac12、fac13、fac14、facv11、fad、fadd、fadk、fah、fak2、faldh、fal139、falz、fanca、fancc、fancd、fance、fancg、fap、fapa、farr、fas、fas1、fasn、fast1、fat、fau、fbln1、fbln2、fbn1、fbn2、fbn1、fbp1、fcar、fcc1、fce、fce2、fcer1a、fcer1b、fcer1g、fcer2、fcgr1a、fcgr1b、fcgr1c、fcgr2a、fcgr3a、fcgrt、fcmd、fcn1、fcn2、fcp、fcp1、fcpx、fct3a、fdc、fdft1、fdh、fdps11、fdps12、fdps13、fdps14、fdps15、fdx1、fdxr、fe65、fe6511、fea、feb1、feb2、fecb、fech、fen1、feo、feom、feom1、feom2、fer、fes、fet1、fevr、ffm、fga、fgarat、fgb、fgc@、fgd1、fgdy、fgf1、fgf10、fgf11、fgf12、fgf13、fgf14、fgf2、fgf2、fgf3、fgf4、fgf5、fgf6、fgf7、fgf8、faf9、fgfa、fgfb、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、fgg、fgr、fgs1、fh、fh、fh3、fhc、fnf1、fhf3、fhf4、fhh2、fhit、fh11、fh12、fhr2、fic1、figf、fih、fim、fim1、fim3、fimg、fkbp12、fkbp1a、fkbp2、fkh2、fkh11、fkh110、fkh112、fkh115、fkh116、fkh117、fkh12、fkh15、fkh16、fkh17、fkh18、fkh19、fkhr、fkhr11、flg、fli1、flii、fln1、fln2、flna、flnb、flnms、flot2、flt1、flt2、flt3、flt4、fmf、fmn、fmo1、fmo2、fmo3、fmod、fmr1、fmr2、fms、fl1、fn12、fnra、fnrb、fnrb1、fnta、fntb、folh、folh1、folr1、folr2、folt、fos、fosb、fos11、fos12、fpah、fpc、fpd1、fpdmm、fpf、fpgs、fp1、fpp、fpr1、fprh1、fprh2、fpr11、fpr12、fprp、fps12、fps13、fps14、fps15、fr、frap1、fraxa、fraxe、fraxf、frda、freac2、freac6、freac9、frg1、frp1、frv1、frv2、frv3、fsg1、fsgs、fshb、fshd1a、fshmd1a、fshprh1、fshr、fssv、fth1、fth16、ft1、ftz1、ftzf1、fuca1、fuca2、fur、fus、fuse、fut1、fut2、fut3、fut4、fut5、fut6、fut7、fut8、fvt1、fxr1、fxy、fy、fyn、fzd1、fzd2、fzd3、fzd5、fzd6、fzd7、fzr、g0s8、g10p1、g10p2、g17、g17p1、g19p1、g1p1、g1p2、g1p3、g22p1、g6pc、g6pd、g6pd1、g6pd1、g6pt、g6pt1、g6s、g7p1、ga2、gaa、gabatr、gabpa、gabpb1、gabra1、gabra2、gabra3、gabra4、gabra5、gabra6、gabrb1、gabrb2、gabrb3、gabrd、gabre、gabrg1、gabrg2、gabrg3、gabrr1、gabrr2、gad1、gad2、gad3、gadd153、gadd45、gak、ga1、galbp、galc、gale、galgt、galk1、galk2、galn、galnact、galnr、galnr1、galns、galnt1、galnt2、galnt3、galr1、galt、gan、gan1、ganab、ganc、gap、gap1m、gap43、gapd、gar22、garp、gars、gart、gas、gas1、gas2、gas41、gas6、gas7、gasr、gast、gata1、gata2、gata3、gata4、gata6、gay1、gba、gbas、gbbb1、gbbb2、gbe1、gbp1、gbx2、gc、gcap、gcap2、gcdh、gcf1、gcf2、gcfx、gcg、gcgr、gch1、gck、gckr、gcn511、gcn512、gcnf、gcnt1、gcnt2、gcp、gcp2、gcs、gcs1、gcsf、gcsfr、gcsp、gctg、gcy、gda、gde、gdf5、gdf8、gdh、gdi1、gdi2、gdid4、gdld、gdnf、gdnfr、gdnfra、gdnfrb、gdx、gdxy、ge、gem、geney、gey、gf1、gf1、gfap、gfer、gfer、gfi1、gfpt、gfra1、gfra2、ggcx、ggt1、ggt2、ggta1、ggtb1、ggtb2、gh1、gh2、ghc.RTM.、ghdx、ghn、ghr、ghrf、ghrh、ghrhr、ghs、ghv、gif、gifb、gip、gip、gipr、girk1、girk2、girk3、girk4、gja1、gja3、gja4、gja5、gja8、gjb1、gjb2、gjb3、gk、gk2、gla、glat、glb1、glb2、glc1a、glc1b、glc1c、glc1d、glc1f、glc3a、glc3b、glc1c、glc1r、glct2、glct3、gldc、glepp1、glg1、gli、gli2、gli3、gli4、glnn、glns、glo1、glo2、glp1r、glra1、glra2、glra3、glrb、glrx、gls、glud1、glud2、glu1、glur1、glur2、glur3、glur4、glur5、glur6、glur7、glut1、glut2、glut3、glut4、glut5、glvr1、glvr2、gly96、glya、glyb、glys1、glyt1、glyt1、glyt2、gm2a、gma、gmcsf、gmds、gm1、gmpr、gmps、gna11、gna15、gna16、gnai1、gnai2、gnai2a、gnai2b、gnai21、gnai3、gna1、gnao1、gnaq、gnas、gnas1、gnat1、gnat2、gnaz、gnb1、gnb2、gnb3、gng5、gn11、gnpta、gnrh1、gnrh2、gnrhr、gns、gnt1、golga4、got1、got2、gp130、gp1ba、gp1bb、gp2、gp2b、gp39、gp3a、gp75、gp78、gp9、gpa、gpam、gpat、gpb、gpc、gpc1、gpc3、gpc4、gpd、gpd1、gpd2、gpds1、gpe、gpi、gpi2、gpm6a、gpm6b、gpoa、gpr1、gpr10、gpr11、gpr12、gpr13、gpr15、gpr17、gpr18、gpr19、gpr2、gpr20、gpr21、gpr22、gpr23、gpr25、gpr29、gpr3、gpr30、gpr31、gpr32、gpr35、gpr37、gpr39、gpr4、gpr5、gpr6、gpr7、gpr8、gpr9、gprcy4、gprk21、gprk4、gprk5、gprk6、gprv28、gpsa、gpsc、gpt、gpx1、gpx2、gpx3、gpx4、gr2、grb1、grb10、grb2、grf2、gria1、gria2、gria3、gria4、grid2、grik1、grik2、grik3、grik4、grik5、grin1、grin2a、grin2b、grin2c、grin2d、grina、grk1、grk5、grk6、gr1、gr111、grm3、grm8、grmp、grn、gro1、gro2、gro3、grp、grp58、grp78、grpr、grx、gs、gs1、gsas、gsc、gsc1、gse、gshs、gs1、gsm1、gsn、gsp、gspt1、gsr、gss、gst12、gst11、gst2、gst2、gst3、gst4、gst5、gsta1、gsta2、gstm1、gstm11、gstm2、gstm3、gstm4、gstm5、gstp1、gstt2、gt1、gt335、gta、gtb、gtbp、gtd、gtf2e2、gtf2f1、gtf2h1、gtf2h2、gtf2h4、gtf2i、gtf2s、gtf3a、gtg、guc1a2、guc1a3、guc1b3、guc2c、guc2d、guc2f、guca1a、guca1b、guca2、guca2、guca2a、guca2b、gucsa3、gucsb3、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b3、gucy2c、gucy2d、gucy2f、guk1、guk2、gulo、gulop、gusb、gusm、gust、gxp1、gypa、gypb、gypc、gype、gys、gys1、gys2、gzma、gzmb、gzmh、gzmm、h、h142t、h19、h1f0、h1f1、h1f2、h1f3、h1f4、h1f5、h1fv、h2a、h2ax、h2az、h2b、h2b、h3f2、h3f3b、h3ft、h3t、h4、h4f2、h4f5、h4fa、h4fb、h4fe、h4fg、h4fh、h4fi、h4fj、h4fk、h4f1、h4fm、h4m、h6、ha2、habp1、hadha、hadhb、hadhsc、haf、hagh、hah1、haip1、ha1、hap、hap1、hap2、hars、has2、hat1、hausp、hb1、hb1、hb6、hba1、hba2、hbac@、hbb、hbbc@、hbd、hbe1、hbegf、hbf2、hbg1、hbg2、hbgr、hbhr、hbm、hbp、hbq1、hbz、hc2、hc3、hca、hcat2、hccs、hcdh、hcf2、hcfc1、hcg、hck、h11、hc12、hc13、hcls1、hcp、hcp1、hcs、hcvs、hd、hdac1、hdc、hdgf、hdhc7、hdlbp、hdld、hdldt1、hdr、hed、hed、hegf1、hek、hek3、heln1、hem1、hema、hemb、hemc、hempas、hen1、hen2、hep、hep10、her2、her4、herg、herv1、hes1、hesx1、het、hexa、hexb、hf1、hf10、hfc1、hfe、hfe2、hfh11、hfsp、hgd、hgf、hgf、hgf1、hg1、hh、hh72、hhc1、hhc2、hhd、hhh、hhmjg、hhr23a、hht1、hht2、hiap2、higm1、hilda、hint、hiomt、hip、hip1、hip116、hip2、hir、hira、his1、his2、hive1、hivep1、hivep2、hjcd、hk1、hk2、hk3、hk33、hke4、hke6、hkr1、hkr2、hkr3、hkr4、hl11、h119、hla-a、hla-b、hla-c、hla-cda12、hla-dma、hla-dmb、hla-dna、hla-dob、hla-dpa1hla-dpb1、hla-dqa1、hla-drlb、hla-dra、hla-e、hla-f、hla-g、hla-ha2、hladp、hlaf、hlals、hlcs、hlm2、hlp、hlp3、hlr1、hlr2、hlt、hlx1、hlxb9、hmaa、hmab、hmat1、hmbs、hmcs、hmg1、hmg14、hmg17、hmg2、hmgc1、hmgcr、hmgcs1、hmgcs2、hmgic、hmgiy、hmgx、hmmr、hmn2、hmox1、hmox2、hmr、hms1、hmsn1、hmx1、hmx2、hnd、hnf1a、hnf2、hnf3a、hnf3b、hnf4a、hnp36、hnpcc6、hnrpa1、hnrpa2b1、hnrpd、hnrpf、hnrpg、hnrph1、hnrph2、hnrph3、hnrpk、homg、hops、hox10、hox11、hox12、hox1@、hox1a、hox1b、hox1c、hox1d、hox1e、hox1f、hox1g、hox1h、hox1i、hox1j、hox2@、hox2a、hox2b、hox2c、hox2d、hox2e、hox2f、hox2g、hox2h、hox2i、hox3@、hox3a、hox3b、hox3c、hox3d、hox3e、hox3f、hox3g、hox4@、hox4a、hox4b、hox4c、hox4d、hox4e、hox4f、hox4g、hox4h、hox4i、hox7、hox8、hoxa1、hoxa10、hoxa11、hoxa13、hoxa3、hoxa4、hoxa5、hoxa6、hoxa7、hoxa9、hoxa@、hoxb1、hoxb2、hoxb3、hoxb4、hoxb5、hoxb6、hoxb7、hoxb8、hoxb9、hoxb@、hoxc12、hoxc13、hoxc4、hoxc5、hoxc6、hoxc8、hoxc9、hoxc@、hoxd1、hoxd10、hoxd11、hoxd12、hoxd13、hoxd3、hoxd4、hoxd8、hoxd9、hoxd@、hoxhb9、hp、hp4、hpafp、hpc1、hpc2、hpca、hpca11、hpcx、hpd、hpdr1、hpdr2、hpe1、hpe2、hpe3、hpe4、hpe5、hpect1、hpfh、hpfh2、hpgd、hplh1、hplh2、hpn、hpr、hprt、hprt1、hps、hpt、hpt1、hptp、hptx、hpv18i1、hpv18i2、hpx、hr、hras、hrb、hrc、hrc1、hrca1、hrd、hres1、hrf、hrg、hrga、hrh1、hrh2、hrmt111、hrpt2、hrx、hrx、hry、hsa11、hsa12、hsan1、hsas1、hscr2、hsd11、hsd11b1、hsd11b2、hsd11k、hsd111、hsd17b1、hsd17b2、hsd17b3、hsd17b4、hsd3b1、hsd3b2、hsh、hsn1、hsorc1、hsp27、hsp73、hspa1a、hspa1b、hspa11、hspa2、hspa3、hspa4、hspa5、hspa6、hspa7、hspa8、hspa9、hspb1、hspb2、hspc2、hspca11、hspca12、hspca13、hspca14、hspcb、hspg1、hspg2、hsr1、hsst、hstd、hstt1、htc2、htf4、htk、htk1、ht1、ht1t、ht1vr、htn1、htn2、htn3、htnb、htor、htr1a、htr1b、htr1d、htr1e、htr1e1、htr1f、htr2a、htr2b、htr2c、htr3、htr4、htr5a、htr6、htr7、htrx1、hts1、htt、htx、htx1、hub、hud、hup2、hur、hus、hvls、hvbs1、hvbs6、hvbs7、hvem、hvh2、hvh3、hvh8、hxb、hxb1、hy、hya、hya11、hyd2、hygn1、hy1、hyp、hyplip1、hypp、hypx、hyr、hyrc1、hys、ia1、ia2、iap、iapp、iar、iars、ibd1、ibd2、ibm2、ibsp、ica1、icam1、icam2、icam3、icca、ich1、icr2、icr2b、ics1、id1、id2、id3、id4、ida、idd、iddm1、iddm10、iddm11、iddm12、iddm13、iddm15、iddm17、iddm2、iddm3、iddm4、iddm5、iddm6、iddm7、iddm8、iddmx、ide、idg2、idh1、idh2、idh3a、idh3g、ido、ids、idua、ier1、ier3、iex1、if、ifcr、ifgr2、ifi16、ifi27、ifi35、ifi4、ifi5111、ifi54、ifi56、ifi616、ifi78、ifna1、ifna10、ifna13、ifna14、ifna16、ifna17、ifna21、ifna6、ifna7、ifna8、ifna@、ifnai1、ifnar1、ifnar2、ifnb1、ifnb2、ifnb3、ifng、ifngr1、ifngr2、ifngt1、ifnr、ifnw1、ifrd2、iga、igat、igb、igbp1、igd1、igda1、igdc1、igds2、iger、iges、igf1、igf1r、igf2、igf2r、igfbp1、igfbp10、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp6、igfbp7、igfr1、igfr2、igfr3、igh@、igha1、igha2、ighd、ighdy2、ighe、ighg1、ighg2、ighg3、ighg4、ighj、ighm、ighmbp2、ighr、ighv@、igi、igj、igk@、igkc、igkde1、igkj、igkjrb1、igkv、iglc、iglc1、ig1j、iglp1、iglp2、iglv、igm、igo1、igsf1、ihh、ik1、ikba、il10、il10r、il11、il11ra、il12a、il12b、il12rb1、il12fb2、il13、il13ra1、il13ra2、il15、il15ra、il17、il1a、il1b、il1bc、il1r1、il1r2、il1ra、il1rap、il1fb、il1rn、il2、il2r、il2ra、il2rb、il2rg、il3、il3ra、il3ray、il4、il4r、il4ra、il5、il5ra、il6、il6r、il6st、il7、il7r、il8、il8ra、il8rb、il9、il9r、ila、ilf1、illbp、imd1、imd2、imd4、imd5、imd6、impa1、impdh1、impdh2、impdh11、impg1、impt1、indx、infa2、infa4、infa5、ing1、inha、inhba、inhbb、inhbc、ini1、ink4b、inlu、inp10、inpp1、inpp5a、inpp5b、inpp5d、inpp11、ins、insig1、ins1、ins13、ins14、insr、insrr、int1、int111、int2、int3、int4、int6、iosca、ip2、ipf1、ip1、ipm150、ipox、ipp、ipp2、ipw、iqgap1、ir10、ir20、ireb1、ireb2、irf1、irf2、irf4、irf4、irr、irs1、isa、iscw、is11、islr、isot、issx、it15、itba1、itba2、itf、itf2、itga1、itga2、itga2b、itga4、itga5、itga6、itga7、itgad、itga1、itgam、itgav、itgax、itgb1、itgb2、itgb3、itgb4、itgb6、itgb7、iti、itih1、itih2、itih3、itih4、itih11、iti1、itk、itm1、itpa、itpka、itpkb、itpr1、itpr2、itpr3、itsn、ivd、iv1、jag1、jak1、jak2、jak3、jbs、jcap、jh8、jip、jk、jme、jmj、joag、jpd、jrk、jrk1、jtk14、jtv1、jun、junb、jund、jup、jv18、jws、k12t、kai1、kal1、kar、kars、katp1、kcna1、kcna10、kcna1b、kcna2b、kcna3、kcna4、kcna5、kcna6、kcna7、kcna8、kcna9、kcnab1、kcnab2、kcnb1、kcnc1、kcnc2、kcnc3、kcnc4、kcne1、kcnh1、kcnh2、kcnj1、kcnj10、kcnj11、kcnj12、kcnj15、kcnj3、kcnj4、kcnj5、kcnj6、kcnj6、kcnj7、kcnj8、kcnjn1、kcnk1、kcnk2、kcnk3、kcnma1、kcnq1、kcnq2、kcnq3、kcnq4、kcns2、kd、kdr、ke1、kera、kf1、kfs、kfsd、kfs1、khk、kiaa0122、kid、kid1、kif2、kif3c、kif5b、kip1、kip2、kiss1、kit、klc2、klk1、klk2、klk3、klk3、klkb1、klkr、klrb1、klrc1、klrc2、klrc3、klrc4、klrd1、klst、kms、kms、kng、kno、kns1、kns2、kns11、kns14、kox1、kox11、kox12、kox13、kox15、kox16、kox18、kox19、kox2、kox2、kox22、kox25、kox30、kox32、kox4、kox5、kox6、kox7、kox9、kpna3、kpps1、kpps2、krag、kras1p、kras2、krev1、krg2、krn1、krn11、krox20、krt1、krt10、krt12、krt13、krt14、krt15、krt16、krt17、krt18、krt19、krt2a、krt2e、krt3、krt4、krt5、krt6a、krt6b、krt7、krt8、krt9、krtha2、krtha5、krthb1、krthb6、ks、ktn1、ku70、kup、kvlqt1、kwe、11.2、11cam、123mrp、lab7、lab72、lac、laci、lacs、lad、lad、lad1、laf4、lag3、lag5、lair1、lak1、lalba、lal1、lam1、lama1、lama2、lama3、lama3、lama4、lama5、lamb1、lamb2、lamb2、lamb2t、lamb3、lambr、lamc1、lamc2、lamm、lamnb2、lamp、lamp1、lamp2、lamr1、lams、lap、lap18、laptm5、lar、lar1、lard、large、lars、lbp、lbr、lca、lca1、Icad、Icamb、lcat、lccs、lcfs2、lch、lck、lcn1、lcn2、lco、lcp1、lcp2、lct、ld、ld78、ldb1、ldb2、ldc、ldh1、ldh3、ldha、ldhb、ldhc、ldlr、le、lect2、lef1、lefty1、lefty2、lep、lepr、lerk5、lerk8、leu1、leu7、leut、lfa1a、lfa3、lfh11、lfp、lga1s1、lga1s3、lga1s3bp、lga1s7、lgcr、Igmd1、lgmd1a、lgmd1b、lgmd1c、lgmd1d、lgmd2b、lgmd2c、lgmd2d、lgmd2e、lgmd2f、lgmd2g、lgmd2h、lgs、lgtn、lhb、lhcgr、lhs、lhx1、lhx3、li、li2、lif、lifr、lig1、lig3、lig4、lim1、lim2、limab1、limk1、limpii、lip2、lipa、lipb、lipc、lipd、lipe、lipo、lis1、lis2、lisx、litaf、lkb1、lkn1、llg11、lman1、lmn1、lmn2、lmna、lmnb1、lmnb2、lmo1、lmo2、lmo3、lmo4、lmo5、lmp10、lmp2、lmp7、lmpx、lms、lmx1、lmx1a、lmx1b、lmyc、lnhr、lnrh、locr、loh11cr2a、lor、lot1、lox、lox1、lox11、lpa、lpaab、lpaata、lpap lpc1、lpc2d、lpd1、lph、lpi、lp1、lpna3、lpp、lps、lpsa、lqt1、lqt2、lqt3、lqt4、lr3、lre1、lre2、lrp、lrp1、lrp2、lrp5、lrp7、lrp8、lrpap1、lrpr1、lrs1、lsamp、lsirf、ls1、lsn、Isp1、lss、lst1、lta、lta4h、ltb、ltb4r、ltbp1、ltbp2、ltbp2、ltbp3、ltbp3、ltbr、ltc4s、Itf、ltk、ltn、lu、lum、luxs、luzp、lw、ly64、ly6e、ly9、lyam1、lyb2、lyf1、ly11、lyn、lyp、lyst、lyt10、lyz、lztr1、m11s1、m130、m17s1、m17s2、m195、m1s1、m3s1、m4s1、m6a、m6b、m6p2、m6pr、m6s1、m7v1、m7vs1、mab211、mac1a、mac2、mac25、macam1、macs、mad、mad211、madd、madh1、madh2、madh3、madh4、madh5、madh6、madh6、madh7、madh9、madm、madr1、maf、mafd1、mafd2、mag、mage1、mageb3、mageb4、mage11、magoh、magp、magp1、magp2、mak、ma1、ma11、man2a2、mana1、mana2、mana2x、manb、manb1、manba、maoa、maob、map1a、map1a1c3、map1b、map1b1c3、map2、map4、map80、map97、mapk1、mapkap3、mapkkk4、mapt、mar、mark3、mars、mas1、masp1、mat1a、mat2a、mata1、mata2、matk、matn1、matn3、max、maz、mb、mbd1、mb1、mb12、mbp、mbp1、mbs、mbs2、mc1r、mc2r、mc3r、mc4r、mc5r、mcad、mcc、mcdc1、mcdr1、mcf2、mcf3、mcfd1、mch2、mch3、mch4、mch5、mckd、mc1、mc11、mcm、mcm2、mcm2、mcm3、mcm6、mcm7、mcmt、mcop、mcor、mcp、mcp1、mcp3、mcph1、mcr、mcs、mcsf、mcsp、mct1、md1、mdb、mdc、mdcr、mddc、mdeg、mdf1、mdg、mdg1、mdh1、mdh2、mdk、mdk、mdm2、mdm4、mdr1、mdr3、mdrs1、mdrv、mds、mds1、mdu1、mdu2、mdu3、mdx、me1、me2、mea、mea6、mec11、mecp2、med、mef、mef2a、mef2b、mef2c、mef2d、mefv、mehmo、meis1、meis2、mekk、mekk1、mekk4、me1、mel18、melf、memo1、men1、men2a、meox1、meox2、mep1a、mep1b、mer2、mer6、mest、met、metrs、mfap1、mfap2、mfap3、mfap4、mfd1、mfi2、mfs1、mfs2、mft、mfts、mg50、mga、mga1、mga3、mgat1、mgat2、mgat5、mgc1、mgcn、mgcr、mgct、mgdf、mgea、mgf、mgi、mgmt、mgp、mgsa、mgst1、mgst2、mhc、mhc2ta、mhp2、mhs、mhs2、mhs3、mhs4、mhs6、mia、mic10、mic11、mic12、mic17、mic18、mic2、mic2x、mic2y、mic3、mic4、mic7、mica、micb、mid1、midas、mif、mif、mig、mip、mip2a、mip2b、mip3b、mipep、mitf、miwc、mjd、mk、mki67、mkks、mkp2、mkp3、mkpx、mks、mks、mks1、mks2、mla1、mlck、mlf1、mlf2、mlh1、mlk1、mlk3、ml1、ml12、ml1t1、ml1t2、ml1t3、ml1t4、ml1t6、ml1t7、mlm、mlm、mln、mlp、mlr、mlrg、mlrw、mls、mltn、mlvar、mlvi2、mlvt、mmac1、mme、mmp1、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp2、mmp21、mmp22、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mn、mn、mnb、mnbh、mnda、mng1、mnk、mns、mnt、mocod、mocs1、mocs2、mody1、mody3、mog、mok2、mom1、mos、mot2、mov34、mox1、mox2、mox44、moz、mp19、mpb1、mpd1、mpdz、mpe、mpe16、mpg、mpi、mpif2、mp1、mp11g、mpo、mpp1、mpp2、mpp3、mppb、mpri、mpm、mps2、mps3a、mps3c、mps4a、mpsh、mpts、mpv17、mpz、mr1、mr77、mrbc、mrc1、mre11、mre11a、mrg1、mrgh、mros、mrp、mrp、mrp1、mrp123、mrs、mrsd、mrsr、mrst、mrx1、mrx14、mrx2、mrx20、mrx21、mrx23、mrx29、mrx41、mrx48、mrx49、mrx9、mrxa、mrxs1、mrxs2、mrxs3、mrxs4、mrxs5、mrxs6、mrxs8、ms3315、ms336、msg1、msh2、msh3、msh4、msh6、msi1、msk16、msk39、msk41、mslr1、msmb、msn、msr1、mss1、mss4、mss4、msse、mst、mst1、mst1r、mstd、mstn、msud1、msx1、msx2、mt1a、mt1b、mt1e、mt1f、mt1g、mt1h、mtli、mt1j、mt1k、mt1l、mt1x、mt2、mt2a、mt3、mtacr1、mtap、mtbt1、mtcp1、mterf、mtf1、mth1、mthfc、mthfd、mthfr、mtk1、mtm1、mtmr1、mtmx、mtnr1a、mtnr1b、mtp、mtpa、mtr、mtrns、mtrr、mts、mts、mts1、mts1、mts2、mttf1、mtx、mtxn、mu、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc5ac、muc5b、muc6、muc8、mu1、mum1、mupp1、musk、mut、mvk、mvlk、mvwf、mwfe、mx、mx1、mx2、mxi1、mxs1、myb、myb11、myb12、mybpc1、mybpc2、mybpc3、mybpcf、mybph、myc、myc11、myc12、myclk1、mycn、myd88、myf3、myf4、myf5、myf6、myh1、myh10、myh11、myh12、myh2、myh3、myh4、myh6、myh7、myh8、myh9、myk1、my1、my11、my12、my13、my14、my15、mylk、mymy、myo10、myo15、myo1a、myo1c、myo1d、myo1e、myo5a、myo6、myo7a、myo9b、myoc、myod1、myog、myp1、myp2、myp3、myr5、mzf1、n33、nab1、nab2、nabc1、nac1a、naca、nacae、nacp、nadmr、naga、nagc@、naglu、nagr1、naip、namsd、nanta3、nap114、nap2、nap21、napb、naptb、nars、nat1、nat1、nat2、nb、nb4s、nbat、nbc3、nbccs、nbccs、nbia1、nbs、nbs、nbs1、nca、ncad、ncam1、ncan、ncbp、ncc1、ncc2、ncc3、ncc4、ncct、ncf1、ncf2、ncf4、nck、nc1、ncst2、ncx1、ncx2、nd、ndhii、ndn、ndp、ndst1、ndufa1、ndufa2、ndufa5、ndufa6、ndufa7、ndufb8、ndufb9、ndufs1、ndufs2、ndufs4、ndufs7、ndufs8、ndufv1、ndufv2、ndufv3、neb、nec1、nec2、nedd1、nedd2、nedd4、nefh、nef1、negf1、negf2、ne111、neb112、nem1、neo1、nep、net、net1、neu、neu、neud4、neurod、neurod2、neurod3、nf1、nf1a、nf2、nfatc1、nfatc2、nfatp、nfe1、nfe2、nfe211、nfe212、nfe2u、nfia、nfib、nfic、nfix、nfkb1、nfkb2、nfkb3、nfkbia、nfkbi11、nfrkb、nfya、nfyb、nga1、ngbe、ngfb、ngfg、ngfic、ngfr、ng1、ngn、nhbp、nhcp1、nhcp2、nhe1、nhe3、nhe4、nhe5、nhlh1、nhlh2、nhp211、nhs、nid、niddm1、ninj1、nipp1、nipsnap1、nipsnap2、nis、nklr、nkcc1、nkcc2、nkg2、nkg2a、nkg2c、nkg2e、nkg2f、nkhc、nkna、nknar、nknb、nkrp1a、nks1、nksf2、nktr、nkx2a、nkx3.2、nkx3a、nkx6a、nli、nm、nm1、nm23、nmb、nmbr、nmdar1、nmdar2a、nmdar2b、nmdar2c、nmdar2d、nmdara1、nme1、nme2、nme4、nmor1、nmor2、nms1、nmyc、nnat、nmnt、nno1、nog、noll、nos1、nos2a、nos2b、nos2c、nos3、not、notch1、notch2、notch3、notch4、nov、nov、nov2、nova1、nova3、novp、np、np10、npat、npc、npc1、npd、nph1、nph2、nphl2、nphn、nphp1、nphp2、nphs1、npm1、nppa、nppb、nppc、npps、npr1、npr2、npr3、nps1、npt1、npt2、nptx2、npy、npy1r、npy2r、npy3r、npy5r、npy6r、nqo2、nramp、nramp1、nramp2、nrap、nras、nrb54、nrcam、nrd1、nrf1、nrf1、nrf2、nrgn、nrip1、nrk2、nr1、nrtn、nru、ns1、nsf、nsp、nsp11、nsrd9、nt4、nt5、nt5、ntcp1、ntcp2、ntf3、ntf4、ntf5、nth11、ntn、ntn、ntn21、ntrk1、ntrk2、ntrk3、ntrk4、ntrkr1、ntrkr3、nts、ntt、ntt、nuc1、nucb1、numa1、nup214、nup98、nurr1、nv1、nys1、nys2、nysa、oa1、oa2、oa3、oar、oasd、oat、oat11、oat22、oat23、oatp、oaz、ob、ob10、obf1、obp、obr、oca2、ocm、ocp2、ocr1、ocr11、oct、oct1、oct1、oct2、oct2、oct3、oct7、octn2、octs3、odc1、oddd、odf1、odg1、odod、ofc1、ofc2、ofc3、ofd1、ofe og22、ogdh、ogg1、ogr1、ogs1、ogs2、ohds、ohs、oias、oip1、ok、olf1、olfmf、olfr1、olfr2、omg、omgp、omp、on、op2、opa1、opa2、opa3、opca3、opcm1、opd1、opg1、ophn1、op11、opn、oppg、oprd1、oprk1、oprm1、oprt、opta2、opfb1、oqt1、orld2、orlt1、orc11、orc21、orc41、orc51、orfk、orm1、orm2、orw、osbp、osm、osp、ost、ost48、osx、otc、otf1、otf2、otf3、otm、otof、ots、otx1、otx2、ovc、ovcs、ovo11、ox40、oxa11、oxct、oxt、oxtr、ozf、p、p、p1、p15、p16、p167、p28、p2rx3、p2rx4、p2ry1、p2ry2、p2ry4、p2ry7、p2u、p2x3、p2x4、p2y1、p2y2、p2y2、p2y4、p3p40phox、p450c11、p450c17、p450c2a、p450c2d、p450c2e、p450scc、p4ha、p4ha1、p4ha1、p4hb、p5cdh、p79r、pa2g4、pab1、pab2、pabp2、pabp11、pac1、pac1、pacapr、pace、pace4、paep、paf1、paf2、pafah、pafah1b1、pafah1b2、pafah1b3、paga、pah、pahx、pai1、pai2、paics、pak1、pak3、palb、pals、pam、pang、pap、papa、papa2、pappa、par1、par1、par2、par3、par4、par4、par5、park1、park2、park3、pawr、pax1、pax2、pax3、pax4、pax5、pax6、pax7、pax8、pax9、pbca、pbcra、pbfe、pbg pbt、pbx1、pbx2、pbx3、pc、pc1、pc2、pc3、pc3、pca1、pcad、pcap、pcar1、pcbc、pcbd、pcbp1、pcbp2、pcca、pccb、pcdh7、pcdx、pchc、pchc1、pci、pck1、pc1、pc1p、pcm1、pcm1、pcmt1、pcna、pcnt、pcolce、pcp、pcp4、pcs、pcsk1、pcsk2、pcsk3、pcsk4、pcsk5、pcsk6、pctk1、pctk3、pcyt1、pdb、pdb2、pdc、pdc、pdcd1、pdcd2、pddr、pde1a、pde1b、pde1b1、pde3b、pde4a、pde4b、pde4c、pde4d、pde5a、pde6a、pde6b、pde6c、pde6d、pde6g、pde6h、pde7a、pdea、pdea2、pdeb pdeb、pdeg、pdeslb、pdgb、pdgfa、pdgfb、pdgfr、pdgfra、pdgfrb、pdha1、pdha2、pdhb、pdj、pdk4、pdnp1、pdnp2、pdnp3、pdr、pds、pds1、pdx1、pdyn、pe1、pea15、pebp2a1、pebp2a3、pecam1、ped、ped、pedf、pee、peg1、peg3、pemp、penk、pent、peo、peo1、peo2、pepa、pepb、pepc、pepd、pepe、pepn、peps、per、per2、peta3、pets1、pex1、pex5、pex6、pex7、pf4、pf4v1、pfas、pfbi、pfc、pfd、pfhb1、pfic1、pfic2、pfkfb1、pfkfb2、pfk1、pfk-mn、pfkp、pfkx、pf1、pfm、pfn1、pfn2、pfrx、pga3、pga4、pga5、pgam1、pgam2、pgamm、pgc、pgd、pgf、pgft、pgk1、pgk2、pgka、pg1、pgl1、pgl2、pgm1、pgm2、pgm3、pgm5、pgn、pgp、pgp1、pgr、pgs、pgt、pgy1、pgy3、pha1、pha2、pha2a、pha2b、phap1、phb、phc、phe1a、phe3、phex、phf1、phhi、phhi、phk、phka1、phka2、phkb、phkd、phkg1、phkg2、ph1、phl11、phog、phox1、phox2a、php、php1b、phpx、phyh、pi、pi10、pi3、pi4、pi5、pi6、pi7、pi8、pi9、piga、pigc、pigf、pigh、pigr、pik3c2b、pik3ca、pik3r1、pik4cb、pi1、pim1、pin、pin1、pin11、pip、pip5k1b、pir1、pir51、pit、pit1、pitpn、pitx1、pitx2、pitx3、pjs、pk1、pk120、pk3、pk428、pkca、pkcb、pkcc、pkcg、pkcs1、pkd1、pkd2、pkd4、pkdts、pkhd1、pklr、pkm2、pkp1、pks1、pks1、pks2、pku1、pl、pla2、pla2a、pla2b、pla2g1b、pla2g2a、pla2g4、pla2g4a、pla2g5、pla21、pla21、plag1、plag11、planh1、planh2、planh3、plat、plau、plaur、plb、plc、plc1、plcb3、plcb4、plcd1、plce、plcg1、plcg2、plc1、pld1、plec1、plg、plgf、plg1、pli、pln、plod、plod2、plos1、plp、pls、pls1、plt1、pltn、pltp、plzf、pmca1、pmca2、pmca3、pmca4、pmch、pmch11、pmch12、pmd、pme117、pmi1、pm1、pmm1、pmm2、pmp2、pnp22、pmp35、pmp69、pmp70、pms1、pms2、pms11、pms12、pmx1、pn1、pnd、pnem、pnkd、pnlip、pnmt、pnoc、pod1、podx1、pof、pof1、po12rb、pola、polb、pold1、pold2、pole、polg、polr2a、polr2c、polr2e、polr2g、polr2i、polrmt、polz、pomc、pon、pon1、pon2、pon3、por、porc、potx、pou1f1、pou2af1、pou3f1、pou3f2、pou3f3、pou3f4、pou4f1、pou4f3、pou5f1、pp、ppl4、pp2、pp4、pp5、ppac、ppard、pparg、pparg1、pparg2、ppat、ppbp、ppcd、ppd、ppef1、ppef2、ppfia3、ppgb、pph、pph1、ppia、ppid、ppil1、ppkb、ppks1、ppks2、pp1、ppla2、ppmx、ppnd、ppnoc、ppo1、ppox、ppp1a、ppp1ca、ppp1cb、ppp1cc、ppp1r2、ppp1r5、ppp1r7、pppd1r8、ppp2b、ppp2ca、ppp2cb、ppp2r1b、ppp2r4、ppp2r5a、ppp2r5b、ppp2r5c、ppp2r5d、ppp2r5e、ppp3ca、ppp3cb、ppp3cc、pp3r1、ppp4c、ppp5c、ppt、ppt2、ppx、ppy、ppyr1、pr@、prad1、prb1、prb2、prb3、prb4、prca1、prca2、prcc、prcp、pre1p、prep、prf1、prg、prg1、prg1、prgs、prh1、prh2、prim1、prim2a、prim2b、prip、prk1、prkaa1、prkaa2、prkab1、prkaca、prkacb、prkacg、prkag1、prkag2、prkar1a、prkar1b、prkar2b、prkca、prkcb1、prkcd、prkcg、prkci、prkcl1、prkcnh1、prkcq、prkcsh、prkdc、prkg1、prkg1b、prkg2、prkgr1b、prkgr2、prkm1、prkm3、prkm4、prkm9、prkn、prkr、prkx、prky、pr1、prlr、prm1、prm2、prmt2、prnp、proa、proc、prodh、prohb、prop1、pros1、pros30、prox1、prp8、prph、prps1、prps2、pipsap1、prr1、prr2、prs、prsc1、prss1、prssl1、prss2、prss7、prss8、prss11、prtn3、prts、psa、psa、psach、psap、psbg1、psbg2、psc2、psc5、psca、psd、psen1、psen2、psf1、psf2、psg1、psg11、psg12、psg13、psg2、psg3、psg4、psg5、psg6、psg7、psg8、psg11、pskh1、psm、psma1、psma2、psma3、psma5、psmb1、psmb10、psmb2、psmb3、psmb4、psmb5、psmb8、psmb9、psmc1、psmc2、psmc3、psmc5、psmd7、psmd9、psme1、psme2、psors1、psors2、psors3、psp、psps1、psps2、pss1、psst、pst、pst、pst1、psti、ptafr、ptc、ptc、ptc、ptch、ptd、pten、ptgds、ptger1、ptger2、ptger3、ptgfr、ptgfrn、ptgir、ptgs1、ptgs2、pth、pthlh、pthr、pthr1、pthr2、ptk1、ptk2、ptk2b、ptk3、ptk7、ptlah、ptma、ptms、ptn、ptos1、ptp18、ptp1b、ptp4a1、ptp4a2、ptpa、ptpa、ptpd、ptpg、ptpg1、ptpgmc1、ptpn1、ptpn10、ptpn11、ptpn12、ptpn13、ptpn14、ptpn2、ptpn5、ptpn6、ptpn7、ptpra、ptprb、ptprc、ptprcap、ptprd、ptpre、ptprf、ptprg、ptprh、ptprj、ptprk、ptpr11、ptprl2、ptprm、ptprn、ptpro、ptprs、ptprz1、ptpt、pts、pts1r、ptx1、ptx3、pujo、pum、pur1、pur1、pura、pvalb、pvr、pvr11、pvr12、pvrr1、pvrr2、pvs、pvt1、pwcr、pwp2、pwp2h、pws、pxaaa1、pxe、pxe1、pxf、pxmp1、pxmp11、pxmp3、pxr1、pycr1、pycs、pygb、pyg1、pygm、pyk2、pyst1、pyst2、pzp、qars、qdpr、qin、qm、qpc、qprs、rab、rab1、rab13、rab1a、rab21、rab3a、rab3b、rab4、rab5、rab5a、rab6、rab7、rabgdla、rabgdib、rabggta、rabggtb、rabif、rac2、rac3、rad1、rad17、rad23a、rad23b、rad51a、rad51c、rad51d、
rad5311、rad52、rad54、rad6a、rad6b、raf1、rafa1、rag1、rag2、rage、rala、ralb、ralgds、ramp、ranbp211、ranbp3、rao、rap1a、rap1b、rap1ga1、rap1gds1、rap2a、rap74、rapsn、rara、rarb、rarg、rars、rasa1、rasa2、rasgfr3、rask2、rb1、rbbp2、rbbp5、rbbp6、rb11、rb12、rbm1、rbm2、rbm3、rbmy1a1、rbp1、rbp2、rbp3、rbp4、rbp5、rbp56、rbp6、rbq3、rbtn1、rbtn11、rbtn12、rca1、rcac@、rcc1、rccp1、rccp2、rcd1、rcd2、rcdp1、rcn1、rcn2、rcp、rev1、rd、rdbp、rdc7、rdp、rdpa、rdrc、rds、rdt、rdx、reca、recc1、recq1、red1、red2、reg、reg1a、reg1、re1、rela、reln、ren、renbp、rens1、rent1、rep8、req、ret、rev3、rev31、rfc1、rfc2、rfc3、rfc4、rfc5、rfp、rfx1、rfx2、rfx5、rfxank、rfxap、rgc1、rgr、rgs、rgs1、rgs14、rgs16、rgs2、rgs2、rgs3、rgs5、rh50a、rhag、rhbd1、rhc、rhce、rhd、rheb2、rho、rho7、rhogap2、rhogap3、rhoh12、rhoh6、rhoh9、rhok、rhom1、rhom2、rhom3、rieg1、rieg2、rige、rigui、ring1、ring10、ring11、ring12、ring3、ring31、ring4、ring5、ring6、ring7、rip、rip140、riz、rk、r1、rlbp1、rlf、rln1、rln2、rmch1、rmd1、rmrp、rmrpr、rn5s1@、rnase1、rnase2、rnase3、rnase4、rnase5、rnase6、rnase1、rnaseli、rne1、rnf1、rnf3、rnf4、rnf5、rnh、rnpep、rnpulz、rnr1、rnr2、rnr3、rnr4、rnr5、rns1、rns2、rns3、rns4、rns4、rns4i、rntmi、rnu1、rnu15a、rnu17a、rnu17b、rnula、rnu2、rnu3、ro52、rom1、romk1、ron、ror1、rora、rorb、rorc、rorg、ros1、rosp1、rox、rp1、rp10、rp105、rp11、rp12、rp13、rp14、rp15、rp17、rp18、rp19、rp2、rp22、rp24、rp25、rp3、rp4、rp6、rp7、rp9、rpa1、rpa2、rpa3、rpd311、rpe、rpe65、rpe119rp122、rp123a、rp1231、rp129、rp130、rp135a、rp136a、rp17a、rpms12、rpn1、rpn2、rpo12、rps11、rps14、rps17、rps17a、rps17b、rps1711、rps1712、rps18、rps20a、rps20b、rps24、rps25、rps3、rps4x、rps4y、rps6、rps6ka1、rps6ka2、rps6ka3、rps8、rpsm12、rptpm、rpu1、rpx、rrad、rras、rrbp1、rreb1、rrm1、rrm2、rrp、rrp22、rs1、rs1、rscla1、rsk1、rsk2、rsk3、rsn、rss、rsts、rsu1、rt6、rtef1、rtkn、rtn1、rtn2、rts、rts、rtt、rws、rxra、rxrb、rxrg、ryr1、ryr2、ryr3、rzrb、rzrg、s100a1、s100a10、s100a11、s100a12、s100a13、s100a2、s100a3、s100a4、s100a5、s100a6、s100a7、s100a8、s100a9、s100b、s100d、s100e、s100、s100p、s152、s4、s7、saa1、saa2、saa4、sacs、safb、sag、sah、sahh、sai1、sakap84、sal11、sal12、sams1、sams2、sap、sap1、sap1、sap2、sap62、sar、sar1、sar2、sard、sas、sat、satb1、satt、sbma、sc、sc1、sc5d1、sca1、sca10、sca2、sca2、sca3、sca4、sca5、sca6、sca7、sca8、sca8、scar、scca1、scca2、sccd、scd、sceh、scg1、scg2、scg3、schad、scida、scidx、scidx1、sc1、sclc1、scl1、scn、scn1a、scn1b、scn2a、scn2a1、scn2a2、scn2b、scn3a、scn4a、scn5a、scn6a、scn8a、scnn1a、scnn1b、scnn1d、scnn1g、scot、scp、scp1、scp2、scpn、scra1、scra1、scs、sctr、scya1、scya11、scya13、scya14、scya15、scya16、scya19、scya2、scya21、scya22、scya24、scya25、scya3、scya311、scya4、scya5、scya7、scya8、scyb5、scyb6、scyd1、sczd1、sczd2、sczd3、sczd4、sczd5、sczd6、sczd7、sczd8、sdc1、sdc2、sdc4、sdf1、sdf2、sdh1、sdh2、sdha、sdhb、sdhc、sdhd、sdhf、sds22、sdty3、sdys、se、sea、sec1311、sec13r、sec14l、sec7、sed1、sedt、sef2、sel1l、sele、sel1、selp、selp1g、sema3f、sema4、sema5、semg、semg1、semg2、sen1、sep、sepp1、serca1、serca3、serk1、ses1、set、sex、sf、sf1、sfa1、sfd、sfmd、sfrs1、sfrs2、sfrs7、sftb3、sftp1、sftp2、sftp4、sftpa1、sftpa2、sftpb、sftpc、sftpd、sgb、sgca、sgcb、sgcd、sgcg、sgd、sgk、sglt1、sglt2、sgm1、sgne1、sgp2、sgpa、sgsh、sh2d1a、sh3bp2、sh3d1a、sh3gbr、sh3p17、shb、shbg、shc1、shc11、shfd1、shfd2、shfm1、shfm2、shfm3、shh、ship、shmt1、shmt2、shoc2、shot、shox、shox2、shps1、shs、shsf1、si、siah1、siah2、siasd、siat1、siat4、siat4c、siat8、sids、si1、silv、sim1、sim2、sipa1、sis、siv、six1、six5、sja、sjs、ski、ski2、ski2w、skiv21、skp1a、skp1b、skp2、sla、slap、slbp、slc、slc10a1、slc10a2、slc12a1、slc12a2、slc12a3、slc14a1、slc14a2、slc15a1、slc16a1、
slc16a2、slc17a1、slc17a2、slc18a1、slc18a2、slc18a3、slc19a1、slc1a1、slc1a2、slc1a3、slc1a4、slc1a5、slc20a1、slc20a2、slc20a3、slc21a2、slc21a3、slc22a1、slc22a2、
slc22a5、slc2a1、slc2a2、slc2a3、slc2a4、slc2a5、slc2c、slc3a1、slc4a1、slc4a2、slc4a6、slc5a1、slc5a2、slc5a3、slc5a5、slc6a1、slc6a10、slc6a12、slc6a2、slc6a3、slc6a4、
slc6a6、slc6a8、slc6a9、slc7a1、slc7a2、slc7a4、slc7a5、slc7a7、slc8a1、slc8a2、slc9a1、slc9a2、slc9a3、slc9a4、slc9a5、sld、sle1、sleb1、slim1、sln、slo、slos、slp76、sls、slug、sm1、sm22、sma4、smad1、smad1、smad2、smad3、smad4、smad5、smad6、smad7、smad9、sma1、smam1、smarca1、smarca2、smarca3、smarca5、smarcb1、smax2、smc1、smcc、smcr、smcx、smcy、sml1、smn、smn1、smn2、smnr、smo、smoh、smpd1、sms、smt3、smt3h1、smtn、smubp2、sn、snap25、snat、snca、sncb、sncg、snf2h、snf211、snf212、snf213、snf5、sn1、snn、snrp70、snrpa、snrpe、snrpn、snt1、snt2b1、snt2b2、sntb1、snt1、snx、soat、sod1、sod2、sod3、solh、son、sord、sor11、sos1、sos2、sox1、sox10、sox11、sox2、sox20、sox22、sox3、sox4、sox9、sp1、sp1、sp3、sp3、sp4、spa1、spag1、spag4、spam1、sparc、spat、spbp、spch1、spd、spf30、spg3a、spg4、spg5a、spg6、spg7、spg8、spg9、spgp、spgyla、sph2、spi1、spink1、spk、spmd、spn、spp1、spp2、sppm、spr、sprk、sprr1a、sprr1b、sprr2a、sprr2b、sprr2c、sprr3、sps1、spsma、spta1、sptan1、sptb、sptbn1、sra1、sra2、src、src1、src1、src2、srd5a1、srd5a2、srebf1、srebf2、sri、srk、srm、srn1、srp14、srp19、srp46、srpr、srpx、srs、srvx、sry、ss、ss、ssa、ssa1、ssa2、ssadh、ssav1、ssbp、ssdd、ssr2、ssrc、sst、sstr1、sstr2、sstr3、sstr4、sstr5、ssx1、ssxt、st2、st3、st4、st5、st6、st8、sta、stac、stam、star、stat、stat1、stat3、stat4、stat5、ssx1、stc1、stch、std、std、ste、step、stf1、stfa、stfb、stgd1、stgd2、stgd3、stgd4、sthe、stk1、stk11、stk15、stk2、stk6、st1、stm、stm2、stm7、stmy1、stmy2、stmy3、stp、stp1、stp2、sts、sts1、stx、stxlb、stx7、stxbp1、stxbp2、sultlc1、supt6h、sur、sur1、surf1、surf2、surf3、surf4、surf5、surf6、svct2、svmt、sw、sxi2、syb1、syb2、syb11、sycp1、syk、sym1、syn1、syn2、syn3、syngap、syns1、syp、syt、syt1、syt2、syt3、syt4、syt5、t、t3d、taa16、tac1r、tac2、tac2r、tac3、tacr1、tacr2、taf2、taf2a、taf2a、taf2d、taf2h、taf2n、tafii100、tagln、tak1、tal1、tal2、taldo1、tam、tan1、tap1、tap2、tapa1、tapbp、tapvr1、tars、tas、task、tat、taut、tax、tax1、taz、tbg、tbp、tbp1、tbs、tbx1、tbx2、tbx3、tbx5、tbxa2r、tbxas1、tc1、tc2、tcbp、tcd、tcea1、tceb11、tceb3、tcf1、tcf12、tcf13、tcf1311、tcf14、tcf15、tcf17、tcf19、tcf2、tcf20、tcf21、tcf3、tcf4、tcf5、tcf611、tcf612、tcf7、tcf8、tcf9、tcfeb、tcf11、tcf14、tcl1、tcl1a、tcl2、tcl3、tcl4、tcl5、tcn1、tcn2、tco、tcof1、tcp1、tcp10、tcp11、tcp228、tcpt、tcra、tcrb、tcrd、tcrg、tcrz、tcs1、tcta、tcte1、tcte3、tcte11、tdf、tdfa、tdfx、tdg、tdgf1、tdn、tdo、tdo2、tdt、tead4、tec、tec、teck、tecta、tef、tegt、tek、te1、tem、tep1、terc、terf1、tert、tes1、tesk1、tex28、tf、tf2s、tf6、tfa、tfam、tfap2a、tfap2b、tfap2c、tfap4、tfcoup1、tfcoup2、tfcp2、tfdp1、tfdp2、tfe3、tff1、tff2、tff3、tfiiia、tfn、tfpi、tfpi2、tfr、tfrc、tfs1、tft、tg、tg737、tgb1、tgb2、tgd、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、tgfb4、tgfbi、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr3、tgfbre、tgfr、tgm1、tgm2、tgm3、tgm4、tgn38、tgn46、th、thas、thbd、thbp1、thbs1、thbs2、thbs3、thc、thh、th1、thop1、thpo、thr1、thra、thra1、thra1、thrb、thrm、thrsp、thy1、tial1、tiam1、tiar、tic、tie、tie1、tie2、tigr、ti1、til3、til4、tim、timp、timp1、timp2、timp3、tinur、titf1、titf2、tjp1、tk1、tk2、tkc、tkcr、tkr、tkt、tkt2、tkt11、tla519、tlcn、tle1、tle2、tle3、tlh1、tln、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tm4sf1、tm4sf2、tm7sf2、tmc、tmd、tmdci、tmem1、tmf1、tmip、tmod、tmp、tmpo、tmprss2、tms、tmsa、tmsb、tmvcf、tna、tndm、tnf、tnfa、tnfaip1、tnfaip2、tnfaip4、tnfaip6、tnfar、tnfb、tnfbr、tnfc、tnfcr、tnfr1、tnfr2、tnfrsf10b、tnfrsf12、tnfrsf14、tnfrsf16、tnfrsf17、tnfrsf1a、tnfrsf1b、tnfrsf4、
tnfrsf5、tnfrsf6、tnfrsf6b、tnfrsf7、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfsf11、tnfsf12、tnfsf5、
tnfsf6、tnfsf7、tnnc1、tnnc2、tnni1、tnni2、tnni3、tnnt1、tnnt2、tnnt3、tnp1、tnp2、tnr、tns、tnx、tnxa、toc、top1、top2、top2a、top2b、top3、tp1、tp120、tp250、tp53、tp53bp2、tp63、tp73、tpa、tpbg、tpc、tpc、tph、tph2、tpi1、tp12、tpm1、tpm2、tpm3、tpm4、tpmt、tpo、tpo、tpp2、tpr、tpr1、tprd、tps1、tps2、tpsn、tpst1、tpst2、tpt、tpt1、tptps、tpx、tpx1、tr、tr2、tr4、tra1、traf1、traf5、trailr2、tran、trance、trap170、trc3、trc8、tre、treb36、trek、trf1、trg1、trh、trhr、tric5、trio、trip1、trip14、trip6、trk、trk1、trka、trkb、trkc、trke、trl1、trl2、trm1、trm1、trm2、trma、trmi1、trmi2、trn、trn1、tro、trp1、trp1、trp2、trp3、trpc1、trpm2、trpo、trps1、trps2、trq1、trr、trr3、trrap、trsp、trt1、trt2、trv1、trv2、trv3、trv4、trv5、try1、try2、ts、ts13、ts546、tsbn51、tsc tsc1、tsc2、tsd、tse1、tsg101、tsg7、tshb、tshr、tsix、tsp3、tspy、tssc3、tst1、tst1、tsta3、tsy、ttc1、ttc3、ttf、ttf1、ttf2、ttg2、ttim1、ttn、ttp、ttp1、ttpa、ttr、tuba3、tubal1、tubb、tufm、tuft1、tulp1、tuple1、tw、tweak、twik1、twist、txgp11、txk、txn、txnr、txnrd1、tyh、tyk1、tyk2、tyk3、tyms、tyr、tyr1、tyro3、tyrp1、tyrp2、tys、u17hg、ulrnp、u22hg、u2af1、u2aflrs1、u2aflrs2、u2aflrs3、uba52、ubb、ubc、ubc4、ubc7、ubc8、ubch2、ubc1、ube1、ube2、ube2a、ube2b、ube2e2、ube2g、ube2g2、ube2h、ube2i、ube211、ube2v1、ube3a、ubh1、ubid4、ub11、uch11、ucn、ucp1、ucp2、ucp3、udpgdh、uev1、ufd11、ufs、ugalt、ugb、ugcg、ugdh、ugn、ugp1、ugp2、ugpp2、ugt1、ugt1a1、ugt2b11、ugt2b15、ugt2b17、ugt2b4、ugt2b7、ugt2b8、ugt2b9、ugt1、uhg、uhx1、ukhc、umod、umph2、umpk、umps、unc18、unc18b、und、ung、unr、unr、uox、up、upk1b、ups、uqbp、uqcrb、uqcrc1、uqcrc2、uqcrfs1、uqor1、uqor13、uqor22、urk、urkr、uroc、urod、uros、usf1、usf2、ush1、ush1a、ush1b、ush1c、ush1d、ush1e、ush1f、ush2a、ush3、usp11、usp5、usp7、usp9x、usp9y、ut1、ut2、ute、utr、utrn、utx、uty、uv20、uv24、uvo、vacht、vacm1、vamp1、vamp2、vars1、vasp、vat1、vat2、vav、vav1、vav2、vbch、vbp1、vcam1、vcf、vc1、vcp、vdac1、vdac2、vdd1、vdi、vdr、vegf、vegfb、vegfd、vegfr3、vgf、vg1、vgr1、vh1、vhr、vil1、vil2、vim、vip、vipr1、vipr2、vis1、vla1、vla5a、vlacs、vlcad、vldlr、vmat1、vmcm、vmd1、vmd2、vnra、vnt、vp、vpp1、vpp3、vpreb1、vpreb2、vrf、vrk1、vrk2、vrnf、vrni、vsn11、vtn、vwf、vws、waf1、wars、was、wbs、wd1、wdr2、wee1、wfrs、wfs、wfs1、wgn1、whcr、wi、wisp1、wisp2、wisp3、wnd、wnt1、wnt10b、wnt13、wnt14、wnt15、wnt2、wnt3、wnt5a、wnt7a、wnt7b、wnt8b、wrb、wrn、ws1、ws2a、ws2b、ws4、wsn、wss、wss、wt1、wt2、wt3、wt4、wt5、wts、wts1、wws、x11、xbp1、xbp2、xce、xdh、xe169、xe7、xe7y、xg、xgr、xh2、xiap、xic、xist、xk、xla、xla2、xlp、xlpd、xlrs1、xm、xpa、xpb、xpc、xpcc、xpct、xpf、xpf、xpg、xpmc2h、xpnpep2、xpo1、xrcc1、xrcc2、xrcc3、xrcc4、xrcc5、xrcc9、xrs、xs、xwnt2、yb1、yes1、yk140、y11、yrrm1、yt、ywha1、ywhab、ywhah、ywhaz、yy1、zac、zag、zan、zap70、zf87、zfm1、zfp3、zfp36、zfp37、zfx、zfy、zic1、zic2、zic3、zipk、znf1、znf10、znf117、znf11a、znf11b、znf12、znf121、znf123、znf124、znf125、znf126、znf13、znf14、znf141、znf144、znf146、znf147、znf157、znf16、znf160、znf162、znf163、znf165、znf169、znf173、znf179、znf189、znf19、znf192、znf193、znf195、znf198、znf2、znf20、znf200、znf204、znf217、znf22、znf23、znf24、znf25、znf26、znf27、znf29、znf3、znf32、znf34、znf35、znf36、znf38、znf4、znf40、znf41、znf42、znf44、znf45、znf46、znf5、znf6、znf69、znf7、znf70、znf71、znf72、znf73、znf74、znf75、znf75a、znf75c、znf76、znf77、znf79、znf8、zn80、znf81、znf83、znf9、znfc150、znfc25、znfxy、znt3、znt4、zp3a、zp3b、zpk、zws1和zyx。
Center for Biotechnology Information)的World Wide Web开发的那些基因，在线
TM
Mendelian Inheritance in Man，OMIM Center for Medical Genetics，Johns Hopkins
University(Baltimore，Md.)，及 National Center for Biotechnology Information，
National Library of Medicine (Bethesda，Md.)，1999；以及在公众数据库如PubMed and
GenBank(见例如(ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)中可获得的那些
基因。这些基因包括但不限于：239f2h9、3pk、4ebp1、4ebp2、al1、al2m1、al2m2、al2m3、
al2m4、al5、a1b、albg、alst、a2m、a2mr、a2mrap、aa、aaa、aaa、aabt、aac1、aac2、aact、aadac、aanat、aars、aas、aat、aavs1、abc1、abc2、abc3、abc7、abc8、abcr、abi1、abl1、abl2、abl1、abo、abp、abp1、abpa、abpx、abr、acaa、acac、acaca、acacb、acad1、acadm、acads、acadsb、acadv1、acat、acat1、acat2、acc、accb、accn1、accn2、accpn、ace1、ach、ache、achm1、achm2、achrb、achrd、achrg、acls、acly、aco1、aco2、acox、acox1、acox2、acox3、acp1、acp2、acp5、acpp、acr、acrv1、acs3、acs3、acs4、act2、act35、acta1、acta2、acta3、actb、actc、actg1、actg2、act11、actn1、actn2、actn3、actsa、acug、acvr1、acvr2b、acvrl1、acvrlk1、acvrlk2、acvrlk3、acy1、ad1、ad2、ad3、ad4、ad5、ada、adam10、adam11、adam12、adam3、adam3a、adam3b、adam8、adar、adarb1、adarb2、adcp1、adcp2、adcy1、adcy2、adcy3、adcy3、adcy4、adcy5、adcy6、adcy7、adcy8、adcy9、adcyap1、adcyaplr1、add1、add2、add3、add1、adfn、adh1、adh2、adh3、adh4、adh5、adh7、adhaps、adhc1@、adhr、adhr、adk、ad1、adm、admlx、adora1、adora2a、adora2b、adora21、adora21、adora3、adprt、adra1a、adra1b、adra1c、adra1d、adra2a、adra2b、adra2c、adra211、adra212、adra2r、adrb1、adrb1r、adrb2、
adrb2rl1、adrb3、adrbk1、adrbk2、ads1、adss、adtb1、adx、adxr、ae1、ae2、ae3、aegl1、aemk、aes、af10、af17、af4、af6、af8t、af9、afd1、afdn、afg3、afg311、afm、afp、afx1、aga、agc1、ager、ag1、agmx1、agmx2、agp1、agp7、agps、agm、agrp、agrt、ags、agt、agti1、agtr1、agtr1a、agtr2、agtrl1、agxt、ahc、ahcy、ahd、ahds、ahnak、aho2、ahr、ahsg、ahx、aib1、aic、aic1、aied、aih1、aih2、aih3、aim1、air、airc、aire、ak1、ak2、ak3、akap149、akt1、akt2、aku、alad、alas1、alas2、alb、alb2、alba、alcam、ald、aldh1、aldh10、aldh2、aldh3、aldh4、aldh5、aldh6、aldh9、ald11、aldoa、aldoh、aldoc、aldr1、alds、alk、alk1、alk2、alk3、alk6、alms1、alox12、alox15、alox5、alp、alpi、alp1、alpp、alpp12、alr、alr、als1、als2、als4、als5、alss、ambn、ambp、amcd1、amcd2b、amcn、amcn1、amcx1、amd1、amdm、amelx、amely、amfr、amg、amg1、amgx、amh、amhr、amhr2、aml1、aml1t1、aml2、aml3、amog、ampd1、ampd2、ampd3、amph、amph1、ampk、amt、amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、an2、anc、ancr、ang、ang1、anh1、ank1、ank2、ank3、anop1、anova、anp、anpep、anpra、anprb、anprc、ans、ant1、ant2、ant3、ant3y、anx1、anx11、anx13、anx2、anx214、anx3、anx4、anx5、anx6、anx7、anx8、aoah、aoc2、aox1、ap2tf、apah1、apba1、apba2、apbb1、apbb2、apc、apcs、ape、apeced、apeh、apex、api1、api2、api3、apj、aplp、aplp1、aplp2、apnh、apo31、apoa1、apoa2、apoa4、apob、apobec1、apoc1、apoc2、apoc3、apoc4、apod、apoe、apoer2、apoh、apolmt、apolp1@、apolp2@、app、appbp1、appl1、aprf、aprt、aps、apt1、aptl1g1、apx1、apy、aqdq、aqp0、aqp1、aqp2、aqp21、aqp3、aqp4、aqp5、aqp6、aqp7、ar、ar1、ara、araf1、araf2、arcn1、ard1、ard1、areg、arf1、arf2、arf3、arf41、arf5、arg、arg1、args、arh12、arh6、arh9、arha、arhb、arhc、arhg、arhgap2、arhgap3、arhgap6、arhgdia、arhgdib、arhh、arix、arl2、armd1、arnt、arnt1、aro、arp、arp1、arpkd、arr3、arrb1、arrb2、arsa、arsacs、arsb、arsc1、arsc2、arsd、arse、arsf、art、art1、art3、art4、arts、arvd1、arvd2、arvd3、arvd4、as、asat、asb、ascl1、ascl2、asct1、asd1、asd2、asgr1、asgr2、ash1、asip、as1、asln、asm1、asma、asmd、asmt、asmtlx、asmty、asnrs、asns、aspa、ass、astm1、astn、asv、at、at1、at2r1、at3、ata、atbf1、atcay、atf1、ath1、aths、atm、atoh1、atox1、atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a11、atp1b1、atp1b2、atp1b3、atp1b11、atp1g1、atp2a1、atp2a2、atp2a3、atp2b、atp2b1、atp2b2、atp2b2、atp2b3、atp2b4、atp4a、atp4b、atp5、atp5a、atp5b、atp5g1、atp5g2、atp5g3、atp5o、atp6a、atp6b1、atp6c、atp6e、atp6n1、atp7a、atp7b、atpm、atpsb、atpsk1、atpsk2、atq1、atr、atr、atr1、atr1、atr2、atrc1、atrc2、atrx、ats、atsv、atx1、atx2、au、auf1、auf1a、aut、avcd、aved、avp、avpr1a、avpr1b、avpr2、avpr3、avrp、avsd、awa1、ax1、axl1g、axsf、azf1、azf2、azgp1、azu1、b120、b144、blg1、b29、b2m、b2mr、b3galt4、b4galt1、ba2r、bab1、bag1、bai1、bai2、bai3、bak1、bam22、bap1、bap135、bapx1、bard1、bark2、bas、bat1、bat2、bat3、bat4、bat5、bax、bb1、bbbg1、bbbg2、bbs1、bbs2、bbs3、bbs4、bbs5、bcas1、bcat1、bcat2、bcate2、bcd1、bcei、bche、bckdha、bckdhb、bcl1、bcl10、bcl2、bcl2a1、bcl212、bcl3、bcl5、bcl6、bcl7、bcl7a、bcl8、bcl9、bclw、bcm、bcm1、bcma、bcns、bcns、bcp、bcpm、bcpr、bcr、bcrl2、bcrl3、bcrl4、bcsg1、bct1、bct2、bdb、bdb1、bdc、bde、bdkrb1、bdkrb2、bdmf、bdmr、bdnf、bed、bedp、bek、bene、bevi、bf、bf1、bf2、bfhd、bfic、bfls、bfnc2、bfp、bfsp1、bft、bglap、bgmr、bgn、bgp、bhd、bhpcdh、bhr1、bicd1、bid、bigh3、bin1、bir、bjs、bkma1、blast1、blau、blk、blm、blmh、bltr、blvra、blvrb、blym、bmal1、bmd、bmh、bmi1、bmp1、bmp2、bmp2a、bmp2b1、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8、bmpr1a、bmpr1b、bmx、bmyb、bn51t、bnc、bnc1、bnp、bor、bpad、bpag1、bpag2、bpes、bpes1、bpes2、bpgm、bph1、bpi、br、br140、braf、brca1、brca2、brca3、brcacox、brcd1、brcd2、brdt、brf1、brhc、bric、brks、brn3a、brn3b、brn3c、brrn1、brw1c、bs、bsap、bsep、bsf2、bsg、bsnd、bss1、bst1、bst2、btak、btc、btd、bteb、bteb1、btg1、btg2、bths、btk、btk1、btn、bts、bub1b、bubr1、bwr1a、bwr1b、bws、bwscr1a、bwscr1b、bzrp、bzx、c11orf13、c1nh、c1qa、c1qb、c1qbp、c1qg、c1r、c1s、c2、c21orf1、c21orf2、c21orf3、c2ta、c3、c3br、c3dr、c3g、c4a、c4b、c4bpa、c4bpb、c4f、c4s、c5、c5ar、c5r1、c6、c7、c8a、c8b、c8g、c9、ca1、ca12、ca125、ca2、ca21h、ca3、ca4、ca5、ca6、ca7、ca8、ca9、caaf1、cabp9k、cac、cac@、caca、cacd、cacna1a、cacna1b、cacna1c、cacna1d、cacna1e、cacna1f、cacna1s、cacna2、cacnb1、cacnb2、cacnb3、cacnb4、cacng、cacnl1a1、cacnl1a2、cacnl1a3、cacnl1a4、cacnl1a5、cacnl1a6、cacnl2a、cacnlb1、cacnlg、cacp、cact、cacy、cad、cad11、cadasi1、cae1、cae3、caf、caf1a、caga、cagb、cain、cak、cak1、cal11、calb1、calb2、calb3、calc1、calc2、calca、calcb、calcr、cald1、calla、calm1、calm2、calm3、calm11、calm13、calna、calna3、calnb、calnb1、calr、cals、calt、calu、cam、camk4、camkg、caml1、camlg、camp、can、canp3、canx、cap2、cap3、cap37、capb、capg、cap1、capn1、capn2、capn3、capn4、cappa2、cappb、capr、caps、capza2、capzb、car、carp、cars、cart1、cas、cas2、casi1、casp1、casp10、casp2、casp3、casp3、casp4、casp5、casp6、casp7、casp8、casq1、casq2、casr cast、cat、cat1、cat4、catf1、catm、cav1、cav2、cav3、cbbm、cbd、cbfa1、cbfa2、cbfa2t1、cbfa3、cbfb、cbg、cb1、cbl2、cbln2、cbp、cbp、cbp2、cbp68、cbr1、cbs、cbt、cbt1、cc10、cca、cca1、cca11、cca12、ccb11、ccckr5、ccg1、ccg2、cchl1a1、cchl1a2、cchl1a3、cch1b1、cck、cckar、cckbr、cc1、ccm1、ccm2、ccm3、ccn1、ccna、ccnb1、ccnc、ccnd1、ccnd2、ccnd3、ccne、ccnf、ccng1、ccnh、ccnt、ccnt1、cco、ccr10、ccr2、ccr3、ccr9、ccsp、cct、ccv、cczs、cd、cd10、cd11a、cd11b、cd11c、cd13、cd137、cd14、cd15、cd151、cd156、cd16、cd164、cd18、cd19、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、cd1e、cd2、cd20、cd22、cd23、cd24、cd26、cd27、cd271、cd28、cd281g、cd281g2、cd30、cd32、cd33、cd34、cd36、cd3611、cd3612、cd37、cd38、cd39、cd3911、cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd40、cd401g、cd41b、cd43、cd44、cd45、cd46、cd47、cd48、cd49b、cd49d、cd5、cd53、cd57、cd58、cd59、cd51、cd6、cd63、cd64、cd68、cd69、cd7、cd70、cd71、cd72、cd74、cd79a、cd79b、cd80、cd81、cd82、cd82、cd86、cd8a、cd8b、cd8b1、cd9、cd94、cd95、cd97、cd99、cda、cda1、cda3、cdan1、cdan2、cdan3、cdb2、cdc2、cdc20、cdc25a、cdc25b、cdc25c、cdc27、cdc211、cdc212、cdc214、cdc34、cdc42、cdc51、cdc7、
cdc711、cdcd1、cdcd2、cdcd3、cdc11、cdcre1、cdg1、cdgd1、cdgg1、cdgs2、cdh1、cdh11、cdh12、cdh13、cdh14、cdh15、cdh16、cdh16、cdh17、cd2、cdh3、cdh3、cdh5、cdh7、cdh8、cdhb、cdhh、cdhp、cdhs、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk7、cdk8、cdk9、cdkn1、cdkn1a、cdkn1b、cdkn1c、cdkn2a、cdkn2b、cdkn2d、cdkn3、cdkn4、cdl1、cdm、cdmp1、cdmt、cdpx1、cdpx2、cdpxr、cdr1、cdr2、cdr3、cdr62a、cdsn、cdsp、cdtb、cdw50、cdx1、cdx2、cdx3、cdx4、cea、cebp、cebpa、cebpb、cebpd、cebpe、cecr、ce1、cel1、cen1、cenpa、cenpb、cenpc、cenpc1、cenpe、cenpf、cerd4、ces、ces1、cetn1、cetp、cf、cf2r、cfag、cfag、cfc、cfd1、cfeom1、cfeom2、cfh、cfl1、cfl2、cfnd、cfns、cftr、cg1、cga、cgat、cgb、cgd、cgf1、cgh、cgrp、cgs23、cgt、cgthba、chac、chat、chc1、chd1、chd2、chd3、chd4、chd5、chdr、che1、che2、ched、chek1、chga、chgb、chgc、chh、chi311、chip28、chit、chk1、chlr1、chlr2、chm、chm1、chn、chn1、chn2、chop10、chr、chr39a、chr39b、chr39c、chrm1、chrm2、chrm3、chrm4、chrm5、chrna1、chrna2、chrna3、chrna4、chrna5、chrna7、chrnb1、chrnb2、chrnb3、chrnb4、chrnd、chrne、chrng、chrs、chs1、chx10、ciipx、cip1、cirbp、cish、ck2a1、ckap1、ckb、ckbb、ckbe、ckm、ckmm、ckmt1、ckmt2、ckn1、ckn2、ckr3、ckr11、ckr13、c1、c1100、cla1、cla1、clac、clapb1、clapm1、claps3、clc、clc7、clck2、clcn1、clcn2、clcn3、clcn4、clcn5、clcn6、clcn7、clcnka、clcnkb、cld、cldn3、cldn5、clg、clg1、clg3、clg4a、clg4b、cli、clim1、clim2、clk2、clk3、cln1、cln2、cln3、cln5、cln6、cln80、clns1a、clns1b、clp、clpp、clps、clta、cltb、cltc、cltc11、cltd、clth、clu、cma1、cmah、cmar、cmd1、cmd1a、cmd1b、cmd1c、cmd1d、cmd1e、cmd1f、cmd3a、cmdj、cmh1、cmh2、cmh3、cmh4、cmh6、cmkbr1、cmkbr2、cmkbr3、cmkbr5、cmkbr6、cmkbr7、cmkbr8、cmkbr9、cmkbr12、cmklr1、cmkr11、cmkr12、cml、cmm、cmm2、cmoat、cmp、cmpd1、cmpd2、cmpd2、cmpd3、cmpx1、cmt1a、cmt1b、cmt2a、cmt2b、cmt2d、cmt2d、cmt4a、cmt4b、cmtnd、cmtx1、cmtx2、cna1、cna2、cnbp1、cnc、cncg1、cncg2、cncg31、cnd、cng3、cnga1、cnga3、cngb1、cnn1、cnn2、cnn3、cnp、cnr1、cnsn、cntf、cntfr、cntn1、co、coca1、coca2、coch、cod1、cod2、coh1、coil、col10a1、col11a1、col11a2、col12a11、col13a1、col15a1、col16a1、col17a1、col18a1、
col19a1、col1a1、col1a2、col1ar、col2a1、col3a1、col4a1、col4a2、col4a3、col4a4、
col4a5、col4a6、col5a1、col5a2、col6a1、col6a2、col6a3、col7a1、col8a1、col8a2、col9a1、col9a1、col9a2、col9a3、colq、comp、comt、copeb、copt1、copt2、cord1、cord2、cord5、cord6、cort、cot、cox10、cox4、cox5b、cox6a1、cox6b、cox7a1、cox7a2、cox7a3、cox7am、cox8、cp、cp107、cp115、cp20、cp47、cp49、cpa1、cpa3、cpb2、cpb2、cpd、cpe、cpetr2、cpm、cpn、cpn1、cpn2、cpo、cpp、cpp32、cpp32、cppi、cps1、cpsb、cpsd、cpt1a、cpt1b、cpt2、cpu、cpx、cpx、cpxd、cr1、cr2、cr3a、crabp1、crabp2、crapb、crarf、crat、crbp1、crbp2、crd、crd1、creb1、creb2、crebbp、creb11、crem、crfb4、crfr2、crh、crhbp、crhr、crhr1、crhr2、crip、crk、crk1、crm1、crmp1、crmp2、crp、crp1、crs、crs1c、crs2、crs3、crsa、crt、crtl1、crtm、crx、cry1、cry2、crya1、crya2、cryaa、cryab、cryb1、cryb2、cryb3、cryba1、cryba2、cryba4、crybb1、crybb2、crybb3、cryg1、cryg2、cryg3、cryg4、cryg8、cryg@、cryga、crygb、crygc、crygd、crygs、crym、cryz、cs、csa、csb、csbp1、csci、csd、csd2、csda、cse、cse11、csf1、csf1r、csf2、csf2ra、csf2rb、csf2ry、csf3、csf3r、csh1、csh2、csk、csmf、csn1、csn10、csn2、csn3、csnb1、csnb2、csnb3、csnk1a1、csnk1d、csnk1e、csnk1g2、csnk2a1、csnk2a2、csnk2b、csnu3、cso、cspb、cspg1、cspg2、cspg3、csr、csrb、csrp、csrp1、csrp2、cst1、cst1、cst2、cst3、cst4、cst4、cst5、cst6、csta、csfb、csx、ct2、ctaa1、ctaa2、ctag、ctb、ctbp1、ctbp2、ctgf、cth、cthm、ctk、ctla1、ctla3、ctla4、ctla8、ctm、ctnna1、ctnna2、ctnnb1、ctnnd、ctnnd1、ctnr、ctns、ctp、ctpct、ctps、ctr1、ctr2、ctrb1、ctr1、ctsa、ctsb、ctsc、ctsd、ctse、ctsg、ctsg12、ctsh、ctsk、cts1、ctss、ctsw、ctsz、ctx、cubn、cul3、cul4b、cul5、cutl1、cvap、cvd1、cvl、cx26、cx31、cx32、cx37、cx40、cx43、cx46、cx50、cxb3s、cxcr4、cxorf4、cyb5、cyb561、cyba、cybb、cyc1、cyk4、cyld1、cymp、cyp1、cyp11a、cyp11b1、
cyp11b2、cyp17、cyp19、cyp1a1、cyp1a2、cyp1b1、cyp21、cyp24、cyp27、cyp27a1、cyp27b1、cyp2a、cyp2a3、cyp2a6、cyp2b、cyp2c、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d、cyp2d@、cyp2e、cyp2e1、cyp2f1、cyp2j2、cyp3a4、cyp4a11、cyp4b1、cyp51、cyp7、cyp7a1、cyr61、cyrn1、cyrn2、czp3、d10s105e、d10s170、d10s170、d11s302e、d11s636、d11s813e、d11s833e、d12s2489e、
d12s53e、d13s1056e、d13s25、d14s46e、d15s12、d15s226e、d15s227e、d16s2531e、d16s469e、d17s136e、d17s811e、d18s892e、d19s204、d19s381e、d1s111、d1s155e、d1s166e、d1s1733e、d1s2223e、d1s61、d2h、d2s201e、d2s448、d2s488e、d2s69e、d3s1231e、d3s1319e、d3s48e、d4、d4s90、d5s1708、d5s346、d6、d6s1101、d6s207e、d6s2245e、d6s228e、d6s229e、d6s230e、d6s231e、d6s51e、d6s52e、d6s54e、d6s81e、d6s82e、d7s437、d8s2298e、d9s46e、da1、da2b、dab2、dac、dad1、daf、dag、dag1、dag2、dagk1、dagk4、dam10、dam6、damox、dan、dao、dap、dap3、dap5、dapk1、dar、dat1、dax1、daxx、daz、dazh、daz1、dba、dbccr1、dbcn、dbh、dbi、dbi、db1、dbm、dbn1、dbp、dbp、dbp1、dbp2、dbpa、dbt、dbx、dby、dcc、dce、dci、dck、dcn、dcoh、dcp1、dcr、dcr3、dct、dctn1、dcx、ddb1、ddb2、ddc、ddh1、ddh2、ddit1、ddit3、ddost、ddp、ddpac、ddr、ddx1、ddx10、ddx11、ddx12、ddx15、ddx16、ddx2a、ddx3、ddx5、ddx6、ddx9、dec、decr、def1、def4、def5、def6、defa1、defa4、defa5、defa6、defb1、defb2、dek、denn、dents、dep1、der12、des、dff1、dffa、dffrx、dffry、dfn1、dfn2、dfn3、dfn4、dfn6、dfna1、dfna10、dfna11、dfna12、dfna13、dfna2、dfna2、dfna4、dfna5、dfna6、dfna7、dfna8、dfna9、dfnb1、dfnb12、dfnb13、dfnb14、dfnb16、dfnb17、dfnb18、dfnb2、dfnb3、dfnb4、dfnb5、dfnb6、dfnb7、dfnb8、dfnb9、dgcr、dgcr2、dgcr2、dgcr6、dgi1、dgka、dgkq、dgpt、dgpt、dgs、dgs2、dgsi、dgu、dhc2、dhcr7、dhfr、dhlag、dhp、dhpr、dhps、dhrd、dhtr、di、di1、dia、dia1、dia2、dia4、diaph1、diaph2、dif2、diff6、dipi、dir、dkc、dkc1、dlc1、dld、dlg1、dlg2、dlg3、dlg4、dlst、dlx1、dlx2、dlx2、dl3、dlx4、dlx5、dlx6、dlx7、dlx8、dm、dm2、dmahp、dmbt1、dmd、dmda1、dmd1、dmh、dmk、dmp1、dmpk、dmsfh、dmt、dmt1、dmtn、dna21、dnah、dnah1、dnah11、dnah12、dnah2、dnahc1、dnahc11、dnahc2、dnahc3、dnase1、dnase111、dnase113、dnase2、dnch2、dnc1、dncm、dnec1、dne11、dn1、dn11、dn111、dnm1、dnmt1、dnmt2、dnpk1、dns、dntt、do、doc1、doc2、dock1、dock180、dod、dok1、dom、dp1、dp1、dp2、dp3、dpagt2、dpc4、dpd、dpde1、dpde2、dpde3、dpde4、dpep1、dph212、dpp、dpp4、dpp6、dpt、dpyd、dpys、dpys11、dpys12、dr1、dr3、dr31g、dr5、dra、drad、drada、dra1、drd1、drd1b、drd1b、drd112、drd2、drd3、drd4、drd5、dri11、drp1、drp1、drp2、drp2、drp3、drp1a、drt、dsc1、dsc2、dsc3、dsc3、dsc4、dscam、dscr、dsg1、dsg2、dsg3、dsp、dspg3、dspp、dss、dss1、dtd、dtdp2、dtdst、dtna、dtr、dts、dus、dusp1、dusp11、dusp2、dusp3、dusp4、dusp5、dusp6、dusp7、dusp8、dut、dv1、dv11、dv11、dv13、dxf68s1e、dxs1272e、dxs128、dxs1283e、dxs423e、dxs435e、dxs522e、dxs648、dxs707、dxs8237e、dxys155e、dylx2、dyrk、dys、dysf、dyt1、dyt3、dyt5、dyt6、dyt7、dyt8、dyt9、dyx1、dyx2、e11s、e14、e1b、e2a、e2f1、e2f2、e2f3、e2f4、e3、e4f、e4f1、e4tf1a、e4tf1b、ea1、eaac1、eaat1、eaat2、eac、ead、eag、eap、ear1、ear2、ear3、ebaf、ebf、ebi1、ebm、ebn1、ebn1、ebn2、ebr2a、ebs1、ebvm1、ebvs1、ec1、eca1、ecb2、ece1、ecgf1、ech1、echs1、eck、ecm1、ecp、ecs1、ect2、ed1、ed2、ed3、ed4、eda、eda3、eddr1、edg3、edg6、edh、edh17b2、edh17b2、edh17b3、edm1、edm2、edm3、edmd、ednd2、edn、edn1、edn2、edn3、ednra、ednrb、eec1、eec2、eef1a1、eef1a2、eef1b1、eef1b2、eef1b3、eef1b4、eef2、eeg1、eegv1、eek、een、ef1a、ef2、efe2、efemp1、efl6、efmr、efna1、efna3、efna4、efnb1、efnb2、efnb3、efp、eftu、egf、egfr、egi、egr1、egr2、egr3、egr4、ehhadh、ehoc1、ei、eif1a、eif2g A、eif2s3A、eif3s10、eif3s6、eif4a1、eif4a2、eif4c、eif4e、eif4ebp1、eif4e2、eif4e11、eif4e12、eif4g、eif4g1、eif4g2、eif5a、ejm1、el1、ela1、ela2、elam1、elanh2、elav11、elav12、elav14、elc、ele1、elf3、elk1、elk2、elk3、elk4、el1、eln、em9、emap、emap1、emd、emd2、emk1、emp1、emp55、emr1、ems1、emt、emtb、emx1、emx2、en1、en2、ena78、end、endog、enfl2、eng、en1、eno1、eno2、eno3、enpep、ent1、entk、enur1、enur2、enx2、eos、ep3、ep300、epa、epb3、epb311、epb41、epb4112、epb42、epb49、epb72、epha1、epha2、epha3、epha8、ephb1、ephb2、ephb3、ephb4、ephb6、epht1、epht2、epht3、ephx1、ephx2、epim、eplg1、eplg2、eplg3、eplg4、eplg5、eplg8、epm1、epm2、epm2a、epmr、epo、epor、eppk、eprs、eps15、eps8、ept、erba1、erba2、erba12、erba13、erbb2、erbb3、erbb4、erc55、ercc1、ercc2、ercc3、ercc4、ercc5、ercc6、ercm1、erda1、erf1、erg、erg3、ergic53、erh、erk、erk1、erk2、erk3、erm、erp11、erv1、erv1、erv3、ervr、ervt1ervt2、ervt3、ervt4、ervt5、eryf1、es1、es130、esa、esa1、esa4、esat、esb3、esd、esg、esr、esr1、esr2、esr11、esr12、esrra、esrrb、esrrg、ess1、est、est、est2、est25263、esx、etfa、etfb、etfdh、etk1、etk2、etm1、etm2、eto、ets1、ets2、etv1、etv3、etv4、etv5、etv6、evc、evc1、evda、evdb、evi1、evi2、evi2a、evi2b、evp1、evr1、evx1、evx2、ews、ewsr1、exlm1、ext1、ext2、ext3、ext11、ext12、eya1、eya2、eya3、eyc11、eyc13、ezh1、ezh1、ezh2、f10、f11、f12、f13a、f13a1、f13b、f2、f2r、f2rl2、f2rl3、f3、f5、f5f8d、f7、f7e、f7r、f8a、f8b、f8c、f8vwf、f9、fa、fa1、faa、fabp1、fabp2fabp3、fabp4、fabp6、fac1、faca、facc、facd、face、fac11、fac12、fac13、fac14、facv11、fad、fadd、fadk、fah、fak2、faldh、fal139、falz、fanca、fancc、fancd、fance、fancg、fap、fapa、farr、fas、fas1、fasn、fast1、fat、fau、fbln1、fbln2、fbn1、fbn2、fbn1、fbp1、fcar、fcc1、fce、fce2、fcer1a、fcer1b、fcer1g、fcer2、fcgr1a、fcgr1b、fcgr1c、fcgr2a、fcgr3a、fcgrt、fcmd、fcn1、fcn2、fcp、fcp1、fcpx、fct3a、fdc、fdft1、fdh、fdps11、fdps12、fdps13、fdps14、fdps15、fdx1、fdxr、fe65、fe6511、fea、feb1、feb2、fecb、fech、fen1、feo、feom、feom1、feom2、fer、fes、fet1、fevr、ffm、fga、fgarat、fgb、fgc@、fgd1、fgdy、fgf1、fgf10、fgf11、fgf12、fgf13、fgf14、fgf2、fgf2、fgf3、fgf4、fgf5、fgf6、fgf7、fgf8、faf9、fgfa、fgfb、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、fgg、fgr、fgs1、fh、fh、fh3、fhc、fnf1、fhf3、fhf4、fhh2、fhit、fh11、fh12、fhr2、fic1、figf、fih、fim、fim1、fim3、fimg、fkbp12、fkbp1a、fkbp2、fkh2、fkh11、fkh110、fkh112、fkh115、fkh116、fkh117、fkh12、fkh15、fkh16、fkh17、fkh18、fkh19、fkhr、fkhr11、flg、fli1、flii、fln1、fln2、flna、flnb、flnms、flot2、flt1、flt2、flt3、flt4、fmf、fmn、fmo1、fmo2、fmo3、fmod、fmr1、fmr2、fms、fl1、fn12、fnra、fnrb、fnrb1、fnta、fntb、folh、folh1、folr1、folr2、folt、fos、fosb、fos11、fos12、fpah、fpc、fpd1、fpdmm、fpf、fpgs、fp1、fpp、fpr1、fprh1、fprh2、fpr11、fpr12、fprp、fps12、fps13、fps14、fps15、fr、frap1、fraxa、fraxe、fraxf、frda、freac2、freac6、freac9、frg1、frp1、frv1、frv2、frv3、fsg1、fsgs、fshb、fshd1a、fshmd1a、fshprh1、fshr、fssv、fth1、fth16、ft1、ftz1、ftzf1、fuca1、fuca2、fur、fus、fuse、fut1、fut2、fut3、fut4、fut5、fut6、fut7、fut8、fvt1、fxr1、fxy、fy、fyn、fzd1、fzd2、fzd3、fzd5、fzd6、fzd7、fzr、g0s8、g10p1、g10p2、g17、g17p1、g19p1、g1p1、g1p2、g1p3、g22p1、g6pc、g6pd、g6pd1、g6pd1、g6pt、g6pt1、g6s、g7p1、ga2、gaa、gabatr、gabpa、gabpb1、gabra1、gabra2、gabra3、gabra4、gabra5、gabra6、gabrb1、gabrb2、gabrb3、gabrd、gabre、gabrg1、gabrg2、gabrg3、gabrr1、gabrr2、gad1、gad2、gad3、gadd153、gadd45、gak、ga1、galbp、galc、gale、galgt、galk1、galk2、galn、galnact、galnr、galnr1、galns、galnt1、galnt2、galnt3、galr1、galt、gan、gan1、ganab、ganc、gap、gap1m、gap43、gapd、gar22、garp、gars、gart、gas、gas1、gas2、gas41、gas6、gas7、gasr、gast、gata1、gata2、gata3、gata4、gata6、gay1、gba、gbas、gbbb1、gbbb2、gbe1、gbp1、gbx2、gc、gcap、gcap2、gcdh、gcf1、gcf2、gcfx、gcg、gcgr、gch1、gck、gckr、gcn511、gcn512、gcnf、gcnt1、gcnt2、gcp、gcp2、gcs、gcs1、gcsf、gcsfr、gcsp、gctg、gcy、gda、gde、gdf5、gdf8、gdh、gdi1、gdi2、gdid4、gdld、gdnf、gdnfr、gdnfra、gdnfrb、gdx、gdxy、ge、gem、geney、gey、gf1、gf1、gfap、gfer、gfer、gfi1、gfpt、gfra1、gfra2、ggcx、ggt1、ggt2、ggta1、ggtb1、ggtb2、gh1、gh2、ghc.RTM.、ghdx、ghn、ghr、ghrf、ghrh、ghrhr、ghs、ghv、gif、gifb、gip、gip、gipr、girk1、girk2、girk3、girk4、gja1、gja3、gja4、gja5、gja8、gjb1、gjb2、gjb3、gk、gk2、gla、glat、glb1、glb2、glc1a、glc1b、glc1c、glc1d、glc1f、glc3a、glc3b、glc1c、glc1r、glct2、glct3、gldc、glepp1、glg1、gli、gli2、gli3、gli4、glnn、glns、glo1、glo2、glp1r、glra1、glra2、glra3、glrb、glrx、gls、glud1、glud2、glu1、glur1、glur2、glur3、glur4、glur5、glur6、glur7、glut1、glut2、glut3、glut4、glut5、glvr1、glvr2、gly96、glya、glyb、glys1、glyt1、glyt1、glyt2、gm2a、gma、gmcsf、gmds、gm1、gmpr、gmps、gna11、gna15、gna16、gnai1、gnai2、gnai2a、gnai2b、gnai21、gnai3、gna1、gnao1、gnaq、gnas、gnas1、gnat1、gnat2、gnaz、gnb1、gnb2、gnb3、gng5、gn11、gnpta、gnrh1、gnrh2、gnrhr、gns、gnt1、golga4、got1、got2、gp130、gp1ba、gp1bb、gp2、gp2b、gp39、gp3a、gp75、gp78、gp9、gpa、gpam、gpat、gpb、gpc、gpc1、gpc3、gpc4、gpd、gpd1、gpd2、gpds1、gpe、gpi、gpi2、gpm6a、gpm6b、gpoa、gpr1、gpr10、gpr11、gpr12、gpr13、gpr15、gpr17、gpr18、gpr19、gpr2、gpr20、gpr21、gpr22、gpr23、gpr25、gpr29、gpr3、gpr30、gpr31、gpr32、gpr35、gpr37、gpr39、gpr4、gpr5、gpr6、gpr7、gpr8、gpr9、gprcy4、gprk21、gprk4、gprk5、gprk6、gprv28、gpsa、gpsc、gpt、gpx1、gpx2、gpx3、gpx4、gr2、grb1、grb10、grb2、grf2、gria1、gria2、gria3、gria4、grid2、grik1、grik2、grik3、grik4、grik5、grin1、grin2a、grin2b、grin2c、grin2d、grina、grk1、grk5、grk6、gr1、gr111、grm3、grm8、grmp、grn、gro1、gro2、gro3、grp、grp58、grp78、grpr、grx、gs、gs1、gsas、gsc、gsc1、gse、gshs、gs1、gsm1、gsn、gsp、gspt1、gsr、gss、gst12、gst11、gst2、gst2、gst3、gst4、gst5、gsta1、gsta2、gstm1、gstm11、gstm2、gstm3、gstm4、gstm5、gstp1、gstt2、gt1、gt335、gta、gtb、gtbp、gtd、gtf2e2、gtf2f1、gtf2h1、gtf2h2、gtf2h4、gtf2i、gtf2s、gtf3a、gtg、guc1a2、guc1a3、guc1b3、guc2c、guc2d、guc2f、guca1a、guca1b、guca2、guca2、guca2a、guca2b、gucsa3、gucsb3、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b3、gucy2c、gucy2d、gucy2f、guk1、guk2、gulo、gulop、gusb、gusm、gust、gxp1、gypa、gypb、gypc、gype、gys、gys1、gys2、gzma、gzmb、gzmh、gzmm、h、h142t、h19、h1f0、h1f1、h1f2、h1f3、h1f4、h1f5、h1fv、h2a、h2ax、h2az、h2b、h2b、h3f2、h3f3b、h3ft、h3t、h4、h4f2、h4f5、h4fa、h4fb、h4fe、h4fg、h4fh、h4fi、h4fj、h4fk、h4f1、h4fm、h4m、h6、ha2、habp1、hadha、hadhb、hadhsc、haf、hagh、hah1、haip1、ha1、hap、hap1、hap2、hars、has2、hat1、hausp、hb1、hb1、hb6、hba1、hba2、hbac@、hbb、hbbc@、hbd、hbe1、hbegf、hbf2、hbg1、hbg2、hbgr、hbhr、hbm、hbp、hbq1、hbz、hc2、hc3、hca、hcat2、hccs、hcdh、hcf2、hcfc1、hcg、hck、h11、hc12、hc13、hcls1、hcp、hcp1、hcs、hcvs、hd、hdac1、hdc、hdgf、hdhc7、hdlbp、hdld、hdldt1、hdr、hed、hed、hegf1、hek、hek3、heln1、hem1、hema、hemb、hemc、hempas、hen1、hen2、hep、hep10、her2、her4、herg、herv1、hes1、hesx1、het、hexa、hexb、hf1、hf10、hfc1、hfe、hfe2、hfh11、hfsp、hgd、hgf、hgf、hgf1、hg1、hh、hh72、hhc1、hhc2、hhd、hhh、hhmjg、hhr23a、hht1、hht2、hiap2、higm1、hilda、hint、hiomt、hip、hip1、hip116、hip2、hir、hira、his1、his2、hive1、hivep1、hivep2、hjcd、hk1、hk2、hk3、hk33、hke4、hke6、hkr1、hkr2、hkr3、hkr4、hl11、h119、hla-a、hla-b、hla-c、hla-cda12、hla-dma、hla-dmb、hla-dna、hla-dob、hla-dpa1hla-dpb1、hla-dqa1、hla-drlb、hla-dra、hla-e、hla-f、hla-g、hla-ha2、hladp、hlaf、hlals、hlcs、hlm2、hlp、hlp3、hlr1、hlr2、hlt、hlx1、hlxb9、hmaa、hmab、hmat1、hmbs、hmcs、hmg1、hmg14、hmg17、hmg2、hmgc1、hmgcr、hmgcs1、hmgcs2、hmgic、hmgiy、hmgx、hmmr、hmn2、hmox1、hmox2、hmr、hms1、hmsn1、hmx1、hmx2、hnd、hnf1a、hnf2、hnf3a、hnf3b、hnf4a、hnp36、hnpcc6、hnrpa1、hnrpa2b1、hnrpd、hnrpf、hnrpg、hnrph1、hnrph2、hnrph3、hnrpk、homg、hops、hox10、hox11、hox12、hox1@、hox1a、hox1b、hox1c、hox1d、hox1e、hox1f、hox1g、hox1h、hox1i、hox1j、hox2@、hox2a、hox2b、hox2c、hox2d、hox2e、hox2f、hox2g、hox2h、hox2i、hox3@、hox3a、hox3b、hox3c、hox3d、hox3e、hox3f、hox3g、hox4@、hox4a、hox4b、hox4c、hox4d、hox4e、hox4f、hox4g、hox4h、hox4i、hox7、hox8、hoxa1、hoxa10、hoxa11、hoxa13、hoxa3、hoxa4、hoxa5、hoxa6、hoxa7、hoxa9、hoxa@、hoxb1、hoxb2、hoxb3、hoxb4、hoxb5、hoxb6、hoxb7、hoxb8、hoxb9、hoxb@、hoxc12、hoxc13、hoxc4、hoxc5、hoxc6、hoxc8、hoxc9、hoxc@、hoxd1、hoxd10、hoxd11、hoxd12、hoxd13、hoxd3、hoxd4、hoxd8、hoxd9、hoxd@、hoxhb9、hp、hp4、hpafp、hpc1、hpc2、hpca、hpca11、hpcx、hpd、hpdr1、hpdr2、hpe1、hpe2、hpe3、hpe4、hpe5、hpect1、hpfh、hpfh2、hpgd、hplh1、hplh2、hpn、hpr、hprt、hprt1、hps、hpt、hpt1、hptp、hptx、hpv18i1、hpv18i2、hpx、hr、hras、hrb、hrc、hrc1、hrca1、hrd、hres1、hrf、hrg、hrga、hrh1、hrh2、hrmt111、hrpt2、hrx、hrx、hry、hsa11、hsa12、hsan1、hsas1、hscr2、hsd11、hsd11b1、hsd11b2、hsd11k、hsd111、hsd17b1、hsd17b2、hsd17b3、hsd17b4、hsd3b1、hsd3b2、hsh、hsn1、hsorc1、hsp27、hsp73、hspa1a、hspa1b、hspa11、hspa2、hspa3、hspa4、hspa5、hspa6、hspa7、hspa8、hspa9、hspb1、hspb2、hspc2、hspca11、hspca12、hspca13、hspca14、hspcb、hspg1、hspg2、hsr1、hsst、hstd、hstt1、htc2、htf4、htk、htk1、ht1、ht1t、ht1vr、htn1、htn2、htn3、htnb、htor、htr1a、htr1b、htr1d、htr1e、htr1e1、htr1f、htr2a、htr2b、htr2c、htr3、htr4、htr5a、htr6、htr7、htrx1、hts1、htt、htx、htx1、hub、hud、hup2、hur、hus、hvls、hvbs1、hvbs6、hvbs7、hvem、hvh2、hvh3、hvh8、hxb、hxb1、hy、hya、hya11、hyd2、hygn1、hy1、hyp、hyplip1、hypp、hypx、hyr、hyrc1、hys、ia1、ia2、iap、iapp、iar、iars、ibd1、ibd2、ibm2、ibsp、ica1、icam1、icam2、icam3、icca、ich1、icr2、icr2b、ics1、id1、id2、id3、id4、ida、idd、iddm1、iddm10、iddm11、iddm12、iddm13、iddm15、iddm17、iddm2、iddm3、iddm4、iddm5、iddm6、iddm7、iddm8、iddmx、ide、idg2、idh1、idh2、idh3a、idh3g、ido、ids、idua、ier1、ier3、iex1、if、ifcr、ifgr2、ifi16、ifi27、ifi35、ifi4、ifi5111、ifi54、ifi56、ifi616、ifi78、ifna1、ifna10、ifna13、ifna14、ifna16、ifna17、ifna21、ifna6、ifna7、ifna8、ifna@、ifnai1、ifnar1、ifnar2、ifnb1、ifnb2、ifnb3、ifng、ifngr1、ifngr2、ifngt1、ifnr、ifnw1、ifrd2、iga、igat、igb、igbp1、igd1、igda1、igdc1、igds2、iger、iges、igf1、igf1r、igf2、igf2r、igfbp1、igfbp10、igfbp2、igfbp3、igfbp4、igfbp6、igfbp7、igfr1、igfr2、igfr3、igh@、igha1、igha2、ighd、ighdy2、ighe、ighg1、ighg2、ighg3、ighg4、ighj、ighm、ighmbp2、ighr、ighv@、igi、igj、igk@、igkc、igkde1、igkj、igkjrb1、igkv、iglc、iglc1、ig1j、iglp1、iglp2、iglv、igm、igo1、igsf1、ihh、ik1、ikba、il10、il10r、il11、il11ra、il12a、il12b、il12rb1、il12fb2、il13、il13ra1、il13ra2、il15、il15ra、il17、il1a、il1b、il1bc、il1r1、il1r2、il1ra、il1rap、il1fb、il1rn、il2、il2r、il2ra、il2rb、il2rg、il3、il3ra、il3ray、il4、il4r、il4ra、il5、il5ra、il6、il6r、il6st、il7、il7r、il8、il8ra、il8rb、il9、il9r、ila、ilf1、illbp、imd1、imd2、imd4、imd5、imd6、impa1、impdh1、impdh2、impdh11、impg1、impt1、indx、infa2、infa4、infa5、ing1、inha、inhba、inhbb、inhbc、ini1、ink4b、inlu、inp10、inpp1、inpp5a、inpp5b、inpp5d、inpp11、ins、insig1、ins1、ins13、ins14、insr、insrr、int1、int111、int2、int3、int4、int6、iosca、ip2、ipf1、ip1、ipm150、ipox、ipp、ipp2、ipw、iqgap1、ir10、ir20、ireb1、ireb2、irf1、irf2、irf4、irf4、irr、irs1、isa、iscw、is11、islr、isot、issx、it15、itba1、itba2、itf、itf2、itga1、itga2、itga2b、itga4、itga5、itga6、itga7、itgad、itga1、itgam、itgav、itgax、itgb1、itgb2、itgb3、itgb4、itgb6、itgb7、iti、itih1、itih2、itih3、itih4、itih11、iti1、itk、itm1、itpa、itpka、itpkb、itpr1、itpr2、itpr3、itsn、ivd、iv1、jag1、jak1、jak2、jak3、jbs、jcap、jh8、jip、jk、jme、jmj、joag、jpd、jrk、jrk1、jtk14、jtv1、jun、junb、jund、jup、jv18、jws、k12t、kai1、kal1、kar、kars、katp1、kcna1、kcna10、kcna1b、kcna2b、kcna3、kcna4、kcna5、kcna6、kcna7、kcna8、kcna9、kcnab1、kcnab2、kcnb1、kcnc1、kcnc2、kcnc3、kcnc4、kcne1、kcnh1、kcnh2、kcnj1、kcnj10、kcnj11、kcnj12、kcnj15、kcnj3、kcnj4、kcnj5、kcnj6、kcnj6、kcnj7、kcnj8、kcnjn1、kcnk1、kcnk2、kcnk3、kcnma1、kcnq1、kcnq2、kcnq3、kcnq4、kcns2、kd、kdr、ke1、kera、kf1、kfs、kfsd、kfs1、khk、kiaa0122、kid、kid1、kif2、kif3c、kif5b、kip1、kip2、kiss1、kit、klc2、klk1、klk2、klk3、klk3、klkb1、klkr、klrb1、klrc1、klrc2、klrc3、klrc4、klrd1、klst、kms、kms、kng、kno、kns1、kns2、kns11、kns14、kox1、kox11、kox12、kox13、kox15、kox16、kox18、kox19、kox2、kox2、kox22、kox25、kox30、kox32、kox4、kox5、kox6、kox7、kox9、kpna3、kpps1、kpps2、krag、kras1p、kras2、krev1、krg2、krn1、krn11、krox20、krt1、krt10、krt12、krt13、krt14、krt15、krt16、krt17、krt18、krt19、krt2a、krt2e、krt3、krt4、krt5、krt6a、krt6b、krt7、krt8、krt9、krtha2、krtha5、krthb1、krthb6、ks、ktn1、ku70、kup、kvlqt1、kwe、11.2、11cam、123mrp、lab7、lab72、lac、laci、lacs、lad、lad、lad1、laf4、lag3、lag5、lair1、lak1、lalba、lal1、lam1、lama1、lama2、lama3、lama3、lama4、lama5、lamb1、lamb2、lamb2、lamb2t、lamb3、lambr、lamc1、lamc2、lamm、lamnb2、lamp、lamp1、lamp2、lamr1、lams、lap、lap18、laptm5、lar、lar1、lard、large、lars、lbp、lbr、lca、lca1、Icad、Icamb、lcat、lccs、lcfs2、lch、lck、lcn1、lcn2、lco、lcp1、lcp2、lct、ld、ld78、ldb1、ldb2、ldc、ldh1、ldh3、ldha、ldhb、ldhc、ldlr、le、lect2、lef1、lefty1、lefty2、lep、lepr、lerk5、lerk8、leu1、leu7、leut、lfa1a、lfa3、lfh11、lfp、lga1s1、lga1s3、lga1s3bp、lga1s7、lgcr、Igmd1、lgmd1a、lgmd1b、lgmd1c、lgmd1d、lgmd2b、lgmd2c、lgmd2d、lgmd2e、lgmd2f、lgmd2g、lgmd2h、lgs、lgtn、lhb、lhcgr、lhs、lhx1、lhx3、li、li2、lif、lifr、lig1、lig3、lig4、lim1、lim2、limab1、limk1、limpii、lip2、lipa、lipb、lipc、lipd、lipe、lipo、lis1、lis2、lisx、litaf、lkb1、lkn1、llg11、lman1、lmn1、lmn2、lmna、lmnb1、lmnb2、lmo1、lmo2、lmo3、lmo4、lmo5、lmp10、lmp2、lmp7、lmpx、lms、lmx1、lmx1a、lmx1b、lmyc、lnhr、lnrh、locr、loh11cr2a、lor、lot1、lox、lox1、lox11、lpa、lpaab、lpaata、lpap lpc1、lpc2d、lpd1、lph、lpi、lp1、lpna3、lpp、lps、lpsa、lqt1、lqt2、lqt3、lqt4、lr3、lre1、lre2、lrp、lrp1、lrp2、lrp5、lrp7、lrp8、lrpap1、lrpr1、lrs1、lsamp、lsirf、ls1、lsn、Isp1、lss、lst1、lta、lta4h、ltb、ltb4r、ltbp1、ltbp2、ltbp2、ltbp3、ltbp3、ltbr、ltc4s、Itf、ltk、ltn、lu、lum、luxs、luzp、lw、ly64、ly6e、ly9、lyam1、lyb2、lyf1、ly11、lyn、lyp、lyst、lyt10、lyz、lztr1、m11s1、m130、m17s1、m17s2、m195、m1s1、m3s1、m4s1、m6a、m6b、m6p2、m6pr、m6s1、m7v1、m7vs1、mab211、mac1a、mac2、mac25、macam1、macs、mad、mad211、madd、madh1、madh2、madh3、madh4、madh5、madh6、madh6、madh7、madh9、madm、madr1、maf、mafd1、mafd2、mag、mage1、mageb3、mageb4、mage11、magoh、magp、magp1、magp2、mak、ma1、ma11、man2a2、mana1、mana2、mana2x、manb、manb1、manba、maoa、maob、map1a、map1a1c3、map1b、map1b1c3、map2、map4、map80、map97、mapk1、mapkap3、mapkkk4、mapt、mar、mark3、mars、mas1、masp1、mat1a、mat2a、mata1、mata2、matk、matn1、matn3、max、maz、mb、mbd1、mb1、mb12、mbp、mbp1、mbs、mbs2、mc1r、mc2r、mc3r、mc4r、mc5r、mcad、mcc、mcdc1、mcdr1、mcf2、mcf3、mcfd1、mch2、mch3、mch4、mch5、mckd、mc1、mc11、mcm、mcm2、mcm2、mcm3、mcm6、mcm7、mcmt、mcop、mcor、mcp、mcp1、mcp3、mcph1、mcr、mcs、mcsf、mcsp、mct1、md1、mdb、mdc、mdcr、mddc、mdeg、mdf1、mdg、mdg1、mdh1、mdh2、mdk、mdk、mdm2、mdm4、mdr1、mdr3、mdrs1、mdrv、mds、mds1、mdu1、mdu2、mdu3、mdx、me1、me2、mea、mea6、mec11、mecp2、med、mef、mef2a、mef2b、mef2c、mef2d、mefv、mehmo、meis1、meis2、mekk、mekk1、mekk4、me1、mel18、melf、memo1、men1、men2a、meox1、meox2、mep1a、mep1b、mer2、mer6、mest、met、metrs、mfap1、mfap2、mfap3、mfap4、mfd1、mfi2、mfs1、mfs2、mft、mfts、mg50、mga、mga1、mga3、mgat1、mgat2、mgat5、mgc1、mgcn、mgcr、mgct、mgdf、mgea、mgf、mgi、mgmt、mgp、mgsa、mgst1、mgst2、mhc、mhc2ta、mhp2、mhs、mhs2、mhs3、mhs4、mhs6、mia、mic10、mic11、mic12、mic17、mic18、mic2、mic2x、mic2y、mic3、mic4、mic7、mica、micb、mid1、midas、mif、mif、mig、mip、mip2a、mip2b、mip3b、mipep、mitf、miwc、mjd、mk、mki67、mkks、mkp2、mkp3、mkpx、mks、mks、mks1、mks2、mla1、mlck、mlf1、mlf2、mlh1、mlk1、mlk3、ml1、ml12、ml1t1、ml1t2、ml1t3、ml1t4、ml1t6、ml1t7、mlm、mlm、mln、mlp、mlr、mlrg、mlrw、mls、mltn、mlvar、mlvi2、mlvt、mmac1、mme、mmp1、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp2、mmp21、mmp22、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mn、mn、mnb、mnbh、mnda、mng1、mnk、mns、mnt、mocod、mocs1、mocs2、mody1、mody3、mog、mok2、mom1、mos、mot2、mov34、mox1、mox2、mox44、moz、mp19、mpb1、mpd1、mpdz、mpe、mpe16、mpg、mpi、mpif2、mp1、mp11g、mpo、mpp1、mpp2、mpp3、mppb、mpri、mpm、mps2、mps3a、mps3c、mps4a、mpsh、mpts、mpv17、mpz、mr1、mr77、mrbc、mrc1、mre11、mre11a、mrg1、mrgh、mros、mrp、mrp、mrp1、mrp123、mrs、mrsd、mrsr、mrst、mrx1、mrx14、mrx2、mrx20、mrx21、mrx23、mrx29、mrx41、mrx48、mrx49、mrx9、mrxa、mrxs1、mrxs2、mrxs3、mrxs4、mrxs5、mrxs6、mrxs8、ms3315、ms336、msg1、msh2、msh3、msh4、msh6、msi1、msk16、msk39、msk41、mslr1、msmb、msn、msr1、mss1、mss4、mss4、msse、mst、mst1、mst1r、mstd、mstn、msud1、msx1、msx2、mt1a、mt1b、mt1e、mt1f、mt1g、mt1h、mtli、mt1j、mt1k、mt1l、mt1x、mt2、mt2a、mt3、mtacr1、mtap、mtbt1、mtcp1、mterf、mtf1、mth1、mthfc、mthfd、mthfr、mtk1、mtm1、mtmr1、mtmx、mtnr1a、mtnr1b、mtp、mtpa、mtr、mtrns、mtrr、mts、mts、mts1、mts1、mts2、mttf1、mtx、mtxn、mu、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc5ac、muc5b、muc6、muc8、mu1、mum1、mupp1、musk、mut、mvk、mvlk、mvwf、mwfe、mx、mx1、mx2、mxi1、mxs1、myb、myb11、myb12、mybpc1、mybpc2、mybpc3、mybpcf、mybph、myc、myc11、myc12、myclk1、mycn、myd88、myf3、myf4、myf5、myf6、myh1、myh10、myh11、myh12、myh2、myh3、myh4、myh6、myh7、myh8、myh9、myk1、my1、my11、my12、my13、my14、my15、mylk、mymy、myo10、myo15、myo1a、myo1c、myo1d、myo1e、myo5a、myo6、myo7a、myo9b、myoc、myod1、myog、myp1、myp2、myp3、myr5、mzf1、n33、nab1、nab2、nabc1、nac1a、naca、nacae、nacp、nadmr、naga、nagc@、naglu、nagr1、naip、namsd、nanta3、nap114、nap2、nap21、napb、naptb、nars、nat1、nat1、nat2、nb、nb4s、nbat、nbc3、nbccs、nbccs、nbia1、nbs、nbs、nbs1、nca、ncad、ncam1、ncan、ncbp、ncc1、ncc2、ncc3、ncc4、ncct、ncf1、ncf2、ncf4、nck、nc1、ncst2、ncx1、ncx2、nd、ndhii、ndn、ndp、ndst1、ndufa1、ndufa2、ndufa5、ndufa6、ndufa7、ndufb8、ndufb9、ndufs1、ndufs2、ndufs4、ndufs7、ndufs8、ndufv1、ndufv2、ndufv3、neb、nec1、nec2、nedd1、nedd2、nedd4、nefh、nef1、negf1、negf2、ne111、neb112、nem1、neo1、nep、net、net1、neu、neu、neud4、neurod、neurod2、neurod3、nf1、nf1a、nf2、nfatc1、nfatc2、nfatp、nfe1、nfe2、nfe211、nfe212、nfe2u、nfia、nfib、nfic、nfix、nfkb1、nfkb2、nfkb3、nfkbia、nfkbi11、nfrkb、nfya、nfyb、nga1、ngbe、ngfb、ngfg、ngfic、ngfr、ng1、ngn、nhbp、nhcp1、nhcp2、nhe1、nhe3、nhe4、nhe5、nhlh1、nhlh2、nhp211、nhs、nid、niddm1、ninj1、nipp1、nipsnap1、nipsnap2、nis、nklr、nkcc1、nkcc2、nkg2、nkg2a、nkg2c、nkg2e、nkg2f、nkhc、nkna、nknar、nknb、nkrp1a、nks1、nksf2、nktr、nkx2a、nkx3.2、nkx3a、nkx6a、nli、nm、nm1、nm23、nmb、nmbr、nmdar1、nmdar2a、nmdar2b、nmdar2c、nmdar2d、nmdara1、nme1、nme2、nme4、nmor1、nmor2、nms1、nmyc、nnat、nmnt、nno1、nog、noll、nos1、nos2a、nos2b、nos2c、nos3、not、notch1、notch2、notch3、notch4、nov、nov、nov2、nova1、nova3、novp、np、np10、npat、npc、npc1、npd、nph1、nph2、nphl2、nphn、nphp1、nphp2、nphs1、npm1、nppa、nppb、nppc、npps、npr1、npr2、npr3、nps1、npt1、npt2、nptx2、npy、npy1r、npy2r、npy3r、npy5r、npy6r、nqo2、nramp、nramp1、nramp2、nrap、nras、nrb54、nrcam、nrd1、nrf1、nrf1、nrf2、nrgn、nrip1、nrk2、nr1、nrtn、nru、ns1、nsf、nsp、nsp11、nsrd9、nt4、nt5、nt5、ntcp1、ntcp2、ntf3、ntf4、ntf5、nth11、ntn、ntn、ntn21、ntrk1、ntrk2、ntrk3、ntrk4、ntrkr1、ntrkr3、nts、ntt、ntt、nuc1、nucb1、numa1、nup214、nup98、nurr1、nv1、nys1、nys2、nysa、oa1、oa2、oa3、oar、oasd、oat、oat11、oat22、oat23、oatp、oaz、ob、ob10、obf1、obp、obr、oca2、ocm、ocp2、ocr1、ocr11、oct、oct1、oct1、oct2、oct2、oct3、oct7、octn2、octs3、odc1、oddd、odf1、odg1、odod、ofc1、ofc2、ofc3、ofd1、ofe og22、ogdh、ogg1、ogr1、ogs1、ogs2、ohds、ohs、oias、oip1、ok、olf1、olfmf、olfr1、olfr2、omg、omgp、omp、on、op2、opa1、opa2、opa3、opca3、opcm1、opd1、opg1、ophn1、op11、opn、oppg、oprd1、oprk1、oprm1、oprt、opta2、opfb1、oqt1、orld2、orlt1、orc11、orc21、orc41、orc51、orfk、orm1、orm2、orw、osbp、osm、osp、ost、ost48、osx、otc、otf1、otf2、otf3、otm、otof、ots、otx1、otx2、ovc、ovcs、ovo11、ox40、oxa11、oxct、oxt、oxtr、ozf、p、p、p1、p15、p16、p167、p28、p2rx3、p2rx4、p2ry1、p2ry2、p2ry4、p2ry7、p2u、p2x3、p2x4、p2y1、p2y2、p2y2、p2y4、p3p40phox、p450c11、p450c17、p450c2a、p450c2d、p450c2e、p450scc、p4ha、p4ha1、p4ha1、p4hb、p5cdh、p79r、pa2g4、pab1、pab2、pabp2、pabp11、pac1、pac1、pacapr、pace、pace4、paep、paf1、paf2、pafah、pafah1b1、pafah1b2、pafah1b3、paga、pah、pahx、pai1、pai2、paics、pak1、pak3、palb、pals、pam、pang、pap、papa、papa2、pappa、par1、par1、par2、par3、par4、par4、par5、park1、park2、park3、pawr、pax1、pax2、pax3、pax4、pax5、pax6、pax7、pax8、pax9、pbca、pbcra、pbfe、pbg pbt、pbx1、pbx2、pbx3、pc、pc1、pc2、pc3、pc3、pca1、pcad、pcap、pcar1、pcbc、pcbd、pcbp1、pcbp2、pcca、pccb、pcdh7、pcdx、pchc、pchc1、pci、pck1、pc1、pc1p、pcm1、pcm1、pcmt1、pcna、pcnt、pcolce、pcp、pcp4、pcs、pcsk1、pcsk2、pcsk3、pcsk4、pcsk5、pcsk6、pctk1、pctk3、pcyt1、pdb、pdb2、pdc、pdc、pdcd1、pdcd2、pddr、pde1a、pde1b、pde1b1、pde3b、pde4a、pde4b、pde4c、pde4d、pde5a、pde6a、pde6b、pde6c、pde6d、pde6g、pde6h、pde7a、pdea、pdea2、pdeb pdeb、pdeg、pdeslb、pdgb、pdgfa、pdgfb、pdgfr、pdgfra、pdgfrb、pdha1、pdha2、pdhb、pdj、pdk4、pdnp1、pdnp2、pdnp3、pdr、pds、pds1、pdx1、pdyn、pe1、pea15、pebp2a1、pebp2a3、pecam1、ped、ped、pedf、pee、peg1、peg3、pemp、penk、pent、peo、peo1、peo2、pepa、pepb、pepc、pepd、pepe、pepn、peps、per、per2、peta3、pets1、pex1、pex5、pex6、pex7、pf4、pf4v1、pfas、pfbi、pfc、pfd、pfhb1、pfic1、pfic2、pfkfb1、pfkfb2、pfk1、pfk-mn、pfkp、pfkx、pf1、pfm、pfn1、pfn2、pfrx、pga3、pga4、pga5、pgam1、pgam2、pgamm、pgc、pgd、pgf、pgft、pgk1、pgk2、pgka、pg1、pgl1、pgl2、pgm1、pgm2、pgm3、pgm5、pgn、pgp、pgp1、pgr、pgs、pgt、pgy1、pgy3、pha1、pha2、pha2a、pha2b、phap1、phb、phc、phe1a、phe3、phex、phf1、phhi、phhi、phk、phka1、phka2、phkb、phkd、phkg1、phkg2、ph1、phl11、phog、phox1、phox2a、php、php1b、phpx、phyh、pi、pi10、pi3、pi4、pi5、pi6、pi7、pi8、pi9、piga、pigc、pigf、pigh、pigr、pik3c2b、pik3ca、pik3r1、pik4cb、pi1、pim1、pin、pin1、pin11、pip、pip5k1b、pir1、pir51、pit、pit1、pitpn、pitx1、pitx2、pitx3、pjs、pk1、pk120、pk3、pk428、pkca、pkcb、pkcc、pkcg、pkcs1、pkd1、pkd2、pkd4、pkdts、pkhd1、pklr、pkm2、pkp1、pks1、pks1、pks2、pku1、pl、pla2、pla2a、pla2b、pla2g1b、pla2g2a、pla2g4、pla2g4a、pla2g5、pla21、pla21、plag1、plag11、planh1、planh2、planh3、plat、plau、plaur、plb、plc、plc1、plcb3、plcb4、plcd1、plce、plcg1、plcg2、plc1、pld1、plec1、plg、plgf、plg1、pli、pln、plod、plod2、plos1、plp、pls、pls1、plt1、pltn、pltp、plzf、pmca1、pmca2、pmca3、pmca4、pmch、pmch11、pmch12、pmd、pme117、pmi1、pm1、pmm1、pmm2、pmp2、pnp22、pmp35、pmp69、pmp70、pms1、pms2、pms11、pms12、pmx1、pn1、pnd、pnem、pnkd、pnlip、pnmt、pnoc、pod1、podx1、pof、pof1、po12rb、pola、polb、pold1、pold2、pole、polg、polr2a、polr2c、polr2e、polr2g、polr2i、polrmt、polz、pomc、pon、pon1、pon2、pon3、por、porc、potx、pou1f1、pou2af1、pou3f1、pou3f2、pou3f3、pou3f4、pou4f1、pou4f3、pou5f1、pp、ppl4、pp2、pp4、pp5、ppac、ppard、pparg、pparg1、pparg2、ppat、ppbp、ppcd、ppd、ppef1、ppef2、ppfia3、ppgb、pph、pph1、ppia、ppid、ppil1、ppkb、ppks1、ppks2、pp1、ppla2、ppmx、ppnd、ppnoc、ppo1、ppox、ppp1a、ppp1ca、ppp1cb、ppp1cc、ppp1r2、ppp1r5、ppp1r7、pppd1r8、ppp2b、ppp2ca、ppp2cb、ppp2r1b、ppp2r4、ppp2r5a、ppp2r5b、ppp2r5c、ppp2r5d、ppp2r5e、ppp3ca、ppp3cb、ppp3cc、pp3r1、ppp4c、ppp5c、ppt、ppt2、ppx、ppy、ppyr1、pr@、prad1、prb1、prb2、prb3、prb4、prca1、prca2、prcc、prcp、pre1p、prep、prf1、prg、prg1、prg1、prgs、prh1、prh2、prim1、prim2a、prim2b、prip、prk1、prkaa1、prkaa2、prkab1、prkaca、prkacb、prkacg、prkag1、prkag2、prkar1a、prkar1b、prkar2b、prkca、prkcb1、prkcd、prkcg、prkci、prkcl1、prkcnh1、prkcq、prkcsh、prkdc、prkg1、prkg1b、prkg2、prkgr1b、prkgr2、prkm1、prkm3、prkm4、prkm9、prkn、prkr、prkx、prky、pr1、prlr、prm1、prm2、prmt2、prnp、proa、proc、prodh、prohb、prop1、pros1、pros30、prox1、prp8、prph、prps1、prps2、pipsap1、prr1、prr2、prs、prsc1、prss1、prssl1、prss2、prss7、prss8、prss11、prtn3、prts、psa、psa、psach、psap、psbg1、psbg2、psc2、psc5、psca、psd、psen1、psen2、psf1、psf2、psg1、psg11、psg12、psg13、psg2、psg3、psg4、psg5、psg6、psg7、psg8、psg11、pskh1、psm、psma1、psma2、psma3、psma5、psmb1、psmb10、psmb2、psmb3、psmb4、psmb5、psmb8、psmb9、psmc1、psmc2、psmc3、psmc5、psmd7、psmd9、psme1、psme2、psors1、psors2、psors3、psp、psps1、psps2、pss1、psst、pst、pst、pst1、psti、ptafr、ptc、ptc、ptc、ptch、ptd、pten、ptgds、ptger1、ptger2、ptger3、ptgfr、ptgfrn、ptgir、ptgs1、ptgs2、pth、pthlh、pthr、pthr1、pthr2、ptk1、ptk2、ptk2b、ptk3、ptk7、ptlah、ptma、ptms、ptn、ptos1、ptp18、ptp1b、ptp4a1、ptp4a2、ptpa、ptpa、ptpd、ptpg、ptpg1、ptpgmc1、ptpn1、ptpn10、ptpn11、ptpn12、ptpn13、ptpn14、ptpn2、ptpn5、ptpn6、ptpn7、ptpra、ptprb、ptprc、ptprcap、ptprd、ptpre、ptprf、ptprg、ptprh、ptprj、ptprk、ptpr11、ptprl2、ptprm、ptprn、ptpro、ptprs、ptprz1、ptpt、pts、pts1r、ptx1、ptx3、pujo、pum、pur1、pur1、pura、pvalb、pvr、pvr11、pvr12、pvrr1、pvrr2、pvs、pvt1、pwcr、pwp2、pwp2h、pws、pxaaa1、pxe、pxe1、pxf、pxmp1、pxmp11、pxmp3、pxr1、pycr1、pycs、pygb、pyg1、pygm、pyk2、pyst1、pyst2、pzp、qars、qdpr、qin、qm、qpc、qprs、rab、rab1、rab13、rab1a、rab21、rab3a、rab3b、rab4、rab5、rab5a、rab6、rab7、rabgdla、rabgdib、rabggta、rabggtb、rabif、rac2、rac3、rad1、rad17、rad23a、rad23b、rad51a、rad51c、rad51d、
rad5311、rad52、rad54、rad6a、rad6b、raf1、rafa1、rag1、rag2、rage、rala、ralb、ralgds、ramp、ranbp211、ranbp3、rao、rap1a、rap1b、rap1ga1、rap1gds1、rap2a、rap74、rapsn、rara、rarb、rarg、rars、rasa1、rasa2、rasgfr3、rask2、rb1、rbbp2、rbbp5、rbbp6、rb11、rb12、rbm1、rbm2、rbm3、rbmy1a1、rbp1、rbp2、rbp3、rbp4、rbp5、rbp56、rbp6、rbq3、rbtn1、rbtn11、rbtn12、rca1、rcac@、rcc1、rccp1、rccp2、rcd1、rcd2、rcdp1、rcn1、rcn2、rcp、rev1、rd、rdbp、rdc7、rdp、rdpa、rdrc、rds、rdt、rdx、reca、recc1、recq1、red1、red2、reg、reg1a、reg1、re1、rela、reln、ren、renbp、rens1、rent1、rep8、req、ret、rev3、rev31、rfc1、rfc2、rfc3、rfc4、rfc5、rfp、rfx1、rfx2、rfx5、rfxank、rfxap、rgc1、rgr、rgs、rgs1、rgs14、rgs16、rgs2、rgs2、rgs3、rgs5、rh50a、rhag、rhbd1、rhc、rhce、rhd、rheb2、rho、rho7、rhogap2、rhogap3、rhoh12、rhoh6、rhoh9、rhok、rhom1、rhom2、rhom3、rieg1、rieg2、rige、rigui、ring1、ring10、ring11、ring12、ring3、ring31、ring4、ring5、ring6、ring7、rip、rip140、riz、rk、r1、rlbp1、rlf、rln1、rln2、rmch1、rmd1、rmrp、rmrpr、rn5s1@、rnase1、rnase2、rnase3、rnase4、rnase5、rnase6、rnase1、rnaseli、rne1、rnf1、rnf3、rnf4、rnf5、rnh、rnpep、rnpulz、rnr1、rnr2、rnr3、rnr4、rnr5、rns1、rns2、rns3、rns4、rns4、rns4i、rntmi、rnu1、rnu15a、rnu17a、rnu17b、rnula、rnu2、rnu3、ro52、rom1、romk1、ron、ror1、rora、rorb、rorc、rorg、ros1、rosp1、rox、rp1、rp10、rp105、rp11、rp12、rp13、rp14、rp15、rp17、rp18、rp19、rp2、rp22、rp24、rp25、rp3、rp4、rp6、rp7、rp9、rpa1、rpa2、rpa3、rpd311、rpe、rpe65、rpe119rp122、rp123a、rp1231、rp129、rp130、rp135a、rp136a、rp17a、rpms12、rpn1、rpn2、rpo12、rps11、rps14、rps17、rps17a、rps17b、rps1711、rps1712、rps18、rps20a、rps20b、rps24、rps25、rps3、rps4x、rps4y、rps6、rps6ka1、rps6ka2、rps6ka3、rps8、rpsm12、rptpm、rpu1、rpx、rrad、rras、rrbp1、rreb1、rrm1、rrm2、rrp、rrp22、rs1、rs1、rscla1、rsk1、rsk2、rsk3、rsn、rss、rsts、rsu1、rt6、rtef1、rtkn、rtn1、rtn2、rts、rts、rtt、rws、rxra、rxrb、rxrg、ryr1、ryr2、ryr3、rzrb、rzrg、s100a1、s100a10、s100a11、s100a12、s100a13、s100a2、s100a3、s100a4、s100a5、s100a6、s100a7、s100a8、s100a9、s100b、s100d、s100e、s100、s100p、s152、s4、s7、saa1、saa2、saa4、sacs、safb、sag、sah、sahh、sai1、sakap84、sal11、sal12、sams1、sams2、sap、sap1、sap1、sap2、sap62、sar、sar1、sar2、sard、sas、sat、satb1、satt、sbma、sc、sc1、sc5d1、sca1、sca10、sca2、sca2、sca3、sca4、sca5、sca6、sca7、sca8、sca8、scar、scca1、scca2、sccd、scd、sceh、scg1、scg2、scg3、schad、scida、scidx、scidx1、sc1、sclc1、scl1、scn、scn1a、scn1b、scn2a、scn2a1、scn2a2、scn2b、scn3a、scn4a、scn5a、scn6a、scn8a、scnn1a、scnn1b、scnn1d、scnn1g、scot、scp、scp1、scp2、scpn、scra1、scra1、scs、sctr、scya1、scya11、scya13、scya14、scya15、scya16、scya19、scya2、scya21、scya22、scya24、scya25、scya3、scya311、scya4、scya5、scya7、scya8、scyb5、scyb6、scyd1、sczd1、sczd2、sczd3、sczd4、sczd5、sczd6、sczd7、sczd8、sdc1、sdc2、sdc4、sdf1、sdf2、sdh1、sdh2、sdha、sdhb、sdhc、sdhd、sdhf、sds22、sdty3、sdys、se、sea、sec1311、sec13r、sec14l、sec7、sed1、sedt、sef2、sel1l、sele、sel1、selp、selp1g、sema3f、sema4、sema5、semg、semg1、semg2、sen1、sep、sepp1、serca1、serca3、serk1、ses1、set、sex、sf、sf1、sfa1、sfd、sfmd、sfrs1、sfrs2、sfrs7、sftb3、sftp1、sftp2、sftp4、sftpa1、sftpa2、sftpb、sftpc、sftpd、sgb、sgca、sgcb、sgcd、sgcg、sgd、sgk、sglt1、sglt2、sgm1、sgne1、sgp2、sgpa、sgsh、sh2d1a、sh3bp2、sh3d1a、sh3gbr、sh3p17、shb、shbg、shc1、shc11、shfd1、shfd2、shfm1、shfm2、shfm3、shh、ship、shmt1、shmt2、shoc2、shot、shox、shox2、shps1、shs、shsf1、si、siah1、siah2、siasd、siat1、siat4、siat4c、siat8、sids、si1、silv、sim1、sim2、sipa1、sis、siv、six1、six5、sja、sjs、ski、ski2、ski2w、skiv21、skp1a、skp1b、skp2、sla、slap、slbp、slc、slc10a1、slc10a2、slc12a1、slc12a2、slc12a3、slc14a1、slc14a2、slc15a1、slc16a1、
slc16a2、slc17a1、slc17a2、slc18a1、slc18a2、slc18a3、slc19a1、slc1a1、slc1a2、slc1a3、slc1a4、slc1a5、slc20a1、slc20a2、slc20a3、slc21a2、slc21a3、slc22a1、slc22a2、
slc22a5、slc2a1、slc2a2、slc2a3、slc2a4、slc2a5、slc2c、slc3a1、slc4a1、slc4a2、slc4a6、slc5a1、slc5a2、slc5a3、slc5a5、slc6a1、slc6a10、slc6a12、slc6a2、slc6a3、slc6a4、
slc6a6、slc6a8、slc6a9、slc7a1、slc7a2、slc7a4、slc7a5、slc7a7、slc8a1、slc8a2、slc9a1、slc9a2、slc9a3、slc9a4、slc9a5、sld、sle1、sleb1、slim1、sln、slo、slos、slp76、sls、slug、sm1、sm22、sma4、smad1、smad1、smad2、smad3、smad4、smad5、smad6、smad7、smad9、sma1、smam1、smarca1、smarca2、smarca3、smarca5、smarcb1、smax2、smc1、smcc、smcr、smcx、smcy、sml1、smn、smn1、smn2、smnr、smo、smoh、smpd1、sms、smt3、smt3h1、smtn、smubp2、sn、snap25、snat、snca、sncb、sncg、snf2h、snf211、snf212、snf213、snf5、sn1、snn、snrp70、snrpa、snrpe、snrpn、snt1、snt2b1、snt2b2、sntb1、snt1、snx、soat、sod1、sod2、sod3、solh、son、sord、sor11、sos1、sos2、sox1、sox10、sox11、sox2、sox20、sox22、sox3、sox4、sox9、sp1、sp1、sp3、sp3、sp4、spa1、spag1、spag4、spam1、sparc、spat、spbp、spch1、spd、spf30、spg3a、spg4、spg5a、spg6、spg7、spg8、spg9、spgp、spgyla、sph2、spi1、spink1、spk、spmd、spn、spp1、spp2、sppm、spr、sprk、sprr1a、sprr1b、sprr2a、sprr2b、sprr2c、sprr3、sps1、spsma、spta1、sptan1、sptb、sptbn1、sra1、sra2、src、src1、src1、src2、srd5a1、srd5a2、srebf1、srebf2、sri、srk、srm、srn1、srp14、srp19、srp46、srpr、srpx、srs、srvx、sry、ss、ss、ssa、ssa1、ssa2、ssadh、ssav1、ssbp、ssdd、ssr2、ssrc、sst、sstr1、sstr2、sstr3、sstr4、sstr5、ssx1、ssxt、st2、st3、st4、st5、st6、st8、sta、stac、stam、star、stat、stat1、stat3、stat4、stat5、ssx1、stc1、stch、std、std、ste、step、stf1、stfa、stfb、stgd1、stgd2、stgd3、stgd4、sthe、stk1、stk11、stk15、stk2、stk6、st1、stm、stm2、stm7、stmy1、stmy2、stmy3、stp、stp1、stp2、sts、sts1、stx、stxlb、stx7、stxbp1、stxbp2、sultlc1、supt6h、sur、sur1、surf1、surf2、surf3、surf4、surf5、surf6、svct2、svmt、sw、sxi2、syb1、syb2、syb11、sycp1、syk、sym1、syn1、syn2、syn3、syngap、syns1、syp、syt、syt1、syt2、syt3、syt4、syt5、t、t3d、taa16、tac1r、tac2、tac2r、tac3、tacr1、tacr2、taf2、taf2a、taf2a、taf2d、taf2h、taf2n、tafii100、tagln、tak1、tal1、tal2、taldo1、tam、tan1、tap1、tap2、tapa1、tapbp、tapvr1、tars、tas、task、tat、taut、tax、tax1、taz、tbg、tbp、tbp1、tbs、tbx1、tbx2、tbx3、tbx5、tbxa2r、tbxas1、tc1、tc2、tcbp、tcd、tcea1、tceb11、tceb3、tcf1、tcf12、tcf13、tcf1311、tcf14、tcf15、tcf17、tcf19、tcf2、tcf20、tcf21、tcf3、tcf4、tcf5、tcf611、tcf612、tcf7、tcf8、tcf9、tcfeb、tcf11、tcf14、tcl1、tcl1a、tcl2、tcl3、tcl4、tcl5、tcn1、tcn2、tco、tcof1、tcp1、tcp10、tcp11、tcp228、tcpt、tcra、tcrb、tcrd、tcrg、tcrz、tcs1、tcta、tcte1、tcte3、tcte11、tdf、tdfa、tdfx、tdg、tdgf1、tdn、tdo、tdo2、tdt、tead4、tec、tec、teck、tecta、tef、tegt、tek、te1、tem、tep1、terc、terf1、tert、tes1、tesk1、tex28、tf、tf2s、tf6、tfa、tfam、tfap2a、tfap2b、tfap2c、tfap4、tfcoup1、tfcoup2、tfcp2、tfdp1、tfdp2、tfe3、tff1、tff2、tff3、tfiiia、tfn、tfpi、tfpi2、tfr、tfrc、tfs1、tft、tg、tg737、tgb1、tgb2、tgd、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfb3、tgfb4、tgfbi、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr3、tgfbre、tgfr、tgm1、tgm2、tgm3、tgm4、tgn38、tgn46、th、thas、thbd、thbp1、thbs1、thbs2、thbs3、thc、thh、th1、thop1、thpo、thr1、thra、thra1、thra1、thrb、thrm、thrsp、thy1、tial1、tiam1、tiar、tic、tie、tie1、tie2、tigr、ti1、til3、til4、tim、timp、timp1、timp2、timp3、tinur、titf1、titf2、tjp1、tk1、tk2、tkc、tkcr、tkr、tkt、tkt2、tkt11、tla519、tlcn、tle1、tle2、tle3、tlh1、tln、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tm4sf1、tm4sf2、tm7sf2、tmc、tmd、tmdci、tmem1、tmf1、tmip、tmod、tmp、tmpo、tmprss2、tms、tmsa、tmsb、tmvcf、tna、tndm、tnf、tnfa、tnfaip1、tnfaip2、tnfaip4、tnfaip6、tnfar、tnfb、tnfbr、tnfc、tnfcr、tnfr1、tnfr2、tnfrsf10b、tnfrsf12、tnfrsf14、tnfrsf16、tnfrsf17、tnfrsf1a、tnfrsf1b、tnfrsf4、
tnfrsf5、tnfrsf6、tnfrsf6b、tnfrsf7、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfsf11、tnfsf12、tnfsf5、
tnfsf6、tnfsf7、tnnc1、tnnc2、tnni1、tnni2、tnni3、tnnt1、tnnt2、tnnt3、tnp1、tnp2、tnr、tns、tnx、tnxa、toc、top1、top2、top2a、top2b、top3、tp1、tp120、tp250、tp53、tp53bp2、tp63、tp73、tpa、tpbg、tpc、tpc、tph、tph2、tpi1、tp12、tpm1、tpm2、tpm3、tpm4、tpmt、tpo、tpo、tpp2、tpr、tpr1、tprd、tps1、tps2、tpsn、tpst1、tpst2、tpt、tpt1、tptps、tpx、tpx1、tr、tr2、tr4、tra1、traf1、traf5、trailr2、tran、trance、trap170、trc3、trc8、tre、treb36、trek、trf1、trg1、trh、trhr、tric5、trio、trip1、trip14、trip6、trk、trk1、trka、trkb、trkc、trke、trl1、trl2、trm1、trm1、trm2、trma、trmi1、trmi2、trn、trn1、tro、trp1、trp1、trp2、trp3、trpc1、trpm2、trpo、trps1、trps2、trq1、trr、trr3、trrap、trsp、trt1、trt2、trv1、trv2、trv3、trv4、trv5、try1、try2、ts、ts13、ts546、tsbn51、tsc tsc1、tsc2、tsd、tse1、tsg101、tsg7、tshb、tshr、tsix、tsp3、tspy、tssc3、tst1、tst1、tsta3、tsy、ttc1、ttc3、ttf、ttf1、ttf2、ttg2、ttim1、ttn、ttp、ttp1、ttpa、ttr、tuba3、tubal1、tubb、tufm、tuft1、tulp1、tuple1、tw、tweak、twik1、twist、txgp11、txk、txn、txnr、txnrd1、tyh、tyk1、tyk2、tyk3、tyms、tyr、tyr1、tyro3、tyrp1、tyrp2、tys、u17hg、ulrnp、u22hg、u2af1、u2aflrs1、u2aflrs2、u2aflrs3、uba52、ubb、ubc、ubc4、ubc7、ubc8、ubch2、ubc1、ube1、ube2、ube2a、ube2b、ube2e2、ube2g、ube2g2、ube2h、ube2i、ube211、ube2v1、ube3a、ubh1、ubid4、ub11、uch11、ucn、ucp1、ucp2、ucp3、udpgdh、uev1、ufd11、ufs、ugalt、ugb、ugcg、ugdh、ugn、ugp1、ugp2、ugpp2、ugt1、ugt1a1、ugt2b11、ugt2b15、ugt2b17、ugt2b4、ugt2b7、ugt2b8、ugt2b9、ugt1、uhg、uhx1、ukhc、umod、umph2、umpk、umps、unc18、unc18b、und、ung、unr、unr、uox、up、upk1b、ups、uqbp、uqcrb、uqcrc1、uqcrc2、uqcrfs1、uqor1、uqor13、uqor22、urk、urkr、uroc、urod、uros、usf1、usf2、ush1、ush1a、ush1b、ush1c、ush1d、ush1e、ush1f、ush2a、ush3、usp11、usp5、usp7、usp9x、usp9y、ut1、ut2、ute、utr、utrn、utx、uty、uv20、uv24、uvo、vacht、vacm1、vamp1、vamp2、vars1、vasp、vat1、vat2、vav、vav1、vav2、vbch、vbp1、vcam1、vcf、vc1、vcp、vdac1、vdac2、vdd1、vdi、vdr、vegf、vegfb、vegfd、vegfr3、vgf、vg1、vgr1、vh1、vhr、vil1、vil2、vim、vip、vipr1、vipr2、vis1、vla1、vla5a、vlacs、vlcad、vldlr、vmat1、vmcm、vmd1、vmd2、vnra、vnt、vp、vpp1、vpp3、vpreb1、vpreb2、vrf、vrk1、vrk2、vrnf、vrni、vsn11、vtn、vwf、vws、waf1、wars、was、wbs、wd1、wdr2、wee1、wfrs、wfs、wfs1、wgn1、whcr、wi、wisp1、wisp2、wisp3、wnd、wnt1、wnt10b、wnt13、wnt14、wnt15、wnt2、wnt3、wnt5a、wnt7a、wnt7b、wnt8b、wrb、wrn、ws1、ws2a、ws2b、ws4、wsn、wss、wss、wt1、wt2、wt3、wt4、wt5、wts、wts1、wws、x11、xbp1、xbp2、xce、xdh、xe169、xe7、xe7y、xg、xgr、xh2、xiap、xic、xist、xk、xla、xla2、xlp、xlpd、xlrs1、xm、xpa、xpb、xpc、xpcc、xpct、xpf、xpf、xpg、xpmc2h、xpnpep2、xpo1、xrcc1、xrcc2、xrcc3、xrcc4、xrcc5、xrcc9、xrs、xs、xwnt2、yb1、yes1、yk140、y11、yrrm1、yt、ywha1、ywhab、ywhah、ywhaz、yy1、zac、zag、zan、zap70、zf87、zfm1、zfp3、zfp36、zfp37、zfx、zfy、zic1、zic2、zic3、zipk、znf1、znf10、znf117、znf11a、znf11b、znf12、znf121、znf123、znf124、znf125、znf126、znf13、znf14、znf141、znf144、znf146、znf147、znf157、znf16、znf160、znf162、znf163、znf165、znf169、znf173、znf179、znf189、znf19、znf192、znf193、znf195、znf198、znf2、znf20、znf200、znf204、znf217、znf22、znf23、znf24、znf25、znf26、znf27、znf29、znf3、znf32、znf34、znf35、znf36、znf38、znf4、znf40、znf41、znf42、znf44、znf45、znf46、znf5、znf6、znf69、znf7、znf70、znf71、znf72、znf73、znf74、znf75、znf75a、znf75c、znf76、znf77、znf79、znf8、zn80、znf81、znf83、znf9、znfc150、znfc25、znfxy、znt3、znt4、zp3a、zp3b、zpk、zws1和zyx。
[0334] 此外，来自细菌、植物、酵母和哺乳动物(如小鼠)的基因可以与本发明提供的微生物一起使用。大肠杆菌基因的非限制性实例包括：aarF、aas、aat、abpS、abs、accA、accB、accC、accD、acd、aceA、aceB、aceE、aceF、aceK、ackA、ackB、acnA、achB、acpD、acpP、acpS、acpX、acrA、acrB、acrC、acrD、acrE、acrF、acrR、acs、ada、add、adhB、adhC、adhE、adhR、adiA、adiY、adk、aegA、aer、aes、agaA、agaB、agaC、agaD、agaI、agaR、agaS、agaV、agaW、agaZ、agp、ahpC、ahpF、aidB、ais、alaS、alaT、alaU、alaV、alaW、alaX、aldA、aldB、aldH、alkA、alkB、alpA、alr、alsA、alsB、alsC、alsE、alsK、alx、amiA、amiB、amn、ampC、ampD、ampE、ampG、ampH、amtB、amyA、ansA、ansB、apaG、apaH、aphA、appA、appB、appC、appY、apt、aqpZ、araA、araB、araC、araD、araE、araF、araG、araH、araJ、arcA、arcB、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argM、argP、argQ、argR、argS、argT、argU、argV、argW、argX、argY、argZ、aroA、aroB、aroC、aroD、aroE、aroF、aroG、aroH、aroI、aroK、aroL、aroM、aroP、aroT、arsB、arsC、arsR、artI、artJ、artM、artP、artQ、ascB、ascF、ascG、asd、aslA、aslB、asmA、asnA、asnB、asnC、asnS、asnT、asnU、asnV、asnW、aspA、aspC、aspS、aspT、aspU、aspV、asr、asu、atoA、atoB、atoC、atoD、atoS、atpA、atpB、atpC、atpD、atpE、atpF、atpG、atpH、atpI、avtA、azaA、azaB、azl、bacA、baeR、baeS、barA、basR、basS、bax、bcp、bcr、betA、betB、betI、betT、bfd、bfm、bfr、bglA、bglB、bglF、bglG、bglJ、bglT、bglX、bioA、bioB、bioC、bioD、bioF、bioH、bioP、bipA、birA、bisC、bisZ、blc、bolA、bRNQ、brnR、brnS brnT、btuB、btuc、btuD、btuE、btuR、bymA、cadA、cadB、cadC、cafA、caiA、caiB、caiC、caiD、caiE、caiF、caiT、calA、caiC、calD、can、carA、carB、cbl、cbpA、cbt、cca、ccmA、ccmB、ccmC、ccmD、ccmE、ccmF、ccmG、ccmH、cdd、cde、cdh、cdsA、cdsS、cedA、celA、celB、ceIC、celD、celF、cfa、cfcA、chaA、chaB、chaC、cheA、cheB、cheR、cheW、cheY、cheZ、chpA、chpB、chpR、chpS、cirA、citA、citB、cld、cipA、clpB、clpP、clpX、cls、cmk、cmlA、cmr、cmtA、cmtB、coaA、cobS、cobT、cobU、codA、codB、cof、cog？、corA、cpdA、cpdB、cpsA、cpsB、cpsC、cpsD、cpsE、cpsF、cpsG、cpxA、cpxB、cpxP、cpxR、crcA、crcB、creA、creB、creC、creD、crg、crl、crp、crr、csdA、csgA、csgB、csgD、csgE、csgF、csgG、csiA、csiB、csiC、csiD、csiE、csiF、cspA、cspB、cspC、cspD、cspE、cspG、csrA、csrB、cstA、cstC、cup、cutA、cutC、cutE、cutF、cvaA(ColV)、cvaB(ColV)、cvaC(Co-lV)、cvi(Colv)、cvpA、cxm、cyaA、cybB、cybC、cycA、cydA、cydB、cydC、cydD、cynR、cynS、cynT、cynX、cyoA、cyoB、cyoC、cyoD、cyoE、cysA、cysB、cysC、cysD、cysE、cysG、cysH、cysI、cysJ、cysK、cysM、cysN、cysP、cysQ、cysS、cysT、cysU、cysW、cysX？、cysZ？、cytR、dacA、dacB、dacC、dacD、dadA、dadB、dadQ、dadX、dam、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、dbpA、dcd、dcm、dcp、dcrB、dctA、dctB、dcuA、dcuB、dcuC、ddIA、ddlB、ddpA、ddpB、ddpC、ddpD、ddpF、ddpX、deaD、dedA、dedD、def、degP、degQ、degS、del、deoA、deoB、deoC、deoD、deoR、dfp、dgd、dgkA、dgkR、dgoA、dgoD、dgoK、dgoR、dgoT、dgsA、dgt、dicA、dicB、dicC、dicF、dinB、dinD、dinF、dinG、dinI、dinY、dipZ、djlA、dksA、dld、dmsA、dmsB、dmsC、dnaA、dnaB、dnaC、dnaE、dnaG、dnaI、dnaJ、dnaK、dnaL、dnaN、dnaQ、dnaT、dnaX、dppA、dppB、dppC、dppD、dppF、dppG、dps、dsbA、dsbB、dsbC、dsbG、dsdA、dsdC、dsdX、dsrA、dsrB、dut、dvl、dxs、ebgA、ebgB、ebgC、ebgR、ecfa、eco、ecpD、eda、edd、efp、enirA、emrB、emrD、emrE、endA、eno、entA、entB、entC、entD、entE、entF、envN envP、envQ、envR、envT、envY、envZ、epd、EppA、
minigene、EppB、minigene、EppC、minigene、EppD、minigene、EppE、minigene、EppG、
minigene、EppH、minigene、era、esp、evgA、evgS、exbB、exbC、exbD、expA、exuR、exuT、fabA、fabB、fabD、fabF、fabG、fabH、fabI、fabZ、fadA、fadB、fadD、fadE、fadH、fadL、fadR、farR、fatA、fbaA、fbaB、fbp、fcl、fcsA、fdhD、fdhE、fdhF、fdnG、fdnH、fdnI、fdoG、fdoH、fdoI、fdrA、fdx、feaB、feaR、fecA、fecB、fecC、fecD、fecE、fecI、fecR、feoA、feoB、fepA、fepB、fepC、fepD、fepE、fepG、fes、fexB、ffh、ffs、fhlA、fhlB、fhuA、fhuB、fhuD、fhuE、fhuF、fic、fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI、fipB、fipC、fis、fiu、fixA、fixB、fixC、fixX、fklB、fkpA、fldA、flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhc、flhD、fliA、fliC、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、flip、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、flk、flu、fmt、fnr、focA、focB、folA、folC、folD、folE、folK、folP、folX、fpr、frdA、frdB、frdC、frdD、frr、fruA、fruB、fruK、fruR、fsr、ftn、ftsA、ftsE、ftsI、ftsJ、ftsK、ftsL、ftsN、ftsQ、ftsW、ftsX、ftsY、ftsZ、fucA、fucI、fucK、fucO、fucP、fucR、fumA、fumB、fumC、fur、fusA、fusB、gabC gabD、gabP、gabT、gadA、gadB、gadR、galE、galF、galK、galM、galP、gaiR、galS、galT、galU、gapA、gapC、garA、garB、gatA、gatB、gatC、gatD、gatR、gatY、gatZ、gcd、gcl、gcpE、gcvA、gcvH、gcvP、gcvR、gcvT、gdhA、gef、ggt、gidA、gidB、gip、glcB、glcC、glcD、gIcE、glcG、gldA、glf、glgA、glgB、glgC、glgP、glgS、glgX、glk、glmM、glmS、glmU、glmX、glnA、glnB、glnD、glnE、glnG、glnH、glnK、glhL、glnP、glnQ、glnR、glnS、glnT、glnU、glnV、glnW、glnX、gloA、glpA、glpB、glpC、glpD、gipE、gipF、gipG、glpK、glpQ、gipR、glpT、glpX、gItA、gltB、gltD、gltE、gltF、gltH、gltJ、gltK、gltL、gltM、gltP、gltR、gltS、gltT、gltU、gltv、gltW、gltX、glyA、glyQ、glyS、glyT、glyU、glyv、glyW、glyX、glyY、gmd、gmk、gmm、gnd、gntK、gntP、gntR、gntS、gntT、gntU、gntV、goaG、gor、gph、gpmA、gpp、gprA、gprB、gpsA、gpt、greA、greB、groL、groS、grpE、grxA、grxB、grxC、gshA、gshB、gsk、gsp、gsp*、gst、guaA、guaB、guaC、gurB、gurC、gutM、gutQ、gyrA、gyrB、hcaB、hcaC、hcaD、hcaE、hcaF、hcaR、hcaT、hdeA、hdeB、hdeD、hdhA、helD、hemA、hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH、hemK、hemL、hemM、hemX、hemY、hepA、het、hflB、hflC、hflK、hflX、hfq、hha、hipA、hipB、hisA、hisB、hisC、hisD、hisF、hisG、hisH、hisI、hisJ、hisM、hisP、hisQ、hisR、hisS、hipA、hlyE、hmp、hns、holA、holB、holC、holD、holE、hopB、hopC、hopD、hpt、hrpA、hrpB、hrsA、hscA、hscB、hsdM、hsdR、hsdS、hslC、hslD？、hslE-H、hslJ、hslK、hsIL-N、hslO-R、hslU、hslV、hslW、htgA、htpG、htpX、htrB、htrC、htrE、htrL、hupA、hupB、hyaA、hyaB、hyaC、hyaD、hyaE、hyaF、hybA、hybB、hybC、hybD、hybE、hybF、hybG、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycI、hydA、hydG、hydH、hydN、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、iadA、iap、ibpA、ibpB、icd、iclR、ihfA、ihfB、ileR、ileS、ileT、ileU、ileV、ileX、ileY、ilvA、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvF、ilvG、ilvH、ilvI、ilvJ ilvM、ilvN、ilvR、ilvU、ilvY、imp、inaA、inaR？、infA、infB、infC、inm、insA(IS1)、intA、isb(IS1)、isfA、ispA、ispB、KanR、katE、katG、kba、kbl、kch、kdgK、kdgR、kdgT、kdpA、kdpB、kdpC、kdpD、kdpE、kdpF、kdsA、kdsB、kdtA、kdtB、kefB、kefC、kgtp、ksgA、ksgB、ksgC、ksgD、lacA、lacI、lacY、lacZ、lamB、lar、ldcC、ldhA、lepA、lepB、leuA、leuB、leuC、leuD、leuJ、leuO、leuP、leuQ、leuR、leuS、leuT、leuU、leuV、leuW、leuX、leuY、leuZ、lev、lexA、lgt、lhr、ligA、ligT、linB、lipA、lipB、lit、livF、livG、livH、livJ、livK、livM、lldD、IldP、lldR、lolA、lon、lpcA、lpcB、lpd、lplA、lpp、lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lrb、lrhA、lrp、Irs lspA、lysA、lysC、lysP、lysQ、lysR、lysS、lysT、lysU、lysV、lysW、lysX、lysY、lysZ、lytA、lytB、lyx、maa、mac、mae、mafA、mafB、malE、malF、malG、malI、malK、malM、malP、malQ、malS、malT、malX、malY、malZ、manA、manC、manX、manY、manZ、map、marA、marB、marR、mbrB、mcrA、mcrB、mcrC、mcrD、mdaB、mdh、mdoB、mdoG、mdoH、meb、melA、melB、melR、menA、menB、menC、menD、menE、menF、mepA、mesJ、metA、metB、metC、metD、metE、metF、metG、metH、metJ、metK、metL、metR、metT、metU、metV、metW、metY、metZ、mfd、mglA、mglB、mglC、mglR、mgsA、mgtA、mhpA、mhpB、mhpC、mhpD、mhpE、mhpF、mhpR、miaA、miaD、micF、minC、minD、minE、mioC、mltA、mltB、mltC、mltD、mmrA(rhlB？)、mng、mntA、moaA、moaB、moaC、moaD、moaE、mobA、mobB、moc、modA、modB、modC、modE、modF、moeA、moeB、mog、molR、motA、motB、mpl、mppA、mprA、mraA--？、mraY、mrcA、mrcB、mrdA、mrdB、mreB、mreC、mreD、mrp、mrr、msbA、msbB、mscL、msrA、msyB、mtg、mtgA、mtlA、mtlD、mtlR、mtr、mttA、mttB、mttC、mukB、mukE、mukF、mul、murA、murB、murC、murD、murE、murF、murG、murH、murI、mutG(putative)、mutH、mutL、mutM、mutS、mutT、mutY、nac、nadA、nadB、nadC、nadE、nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、nalB、nalD、nanA、nanE、nanK、nanR、nanT、napA、napB、napC、napD、napF、napG、napH、narG、narH、narI、narJ、narK、narL、narP、narQ、narU、narV、narW、narX、narY、narZ、ndh、ndk、neaB、nei、nemA、nfi、nfnA、nfnB、nfo、nfrA、nfrB、nfrD、nfsA、nhaA、nhaB、nhaR、nikA、nikB、nikC、nikD、nikE、nirB、nirC、nirD、nlpA、nlpB、nlpC、nlpD、nmpC(qsr′)、non、npr、nrdA、nrdB、nrdD、nrdE、nrdF、nrdG、nrfA、nrfB、nrfC、nrfD、nrfE、nrfF、nrfG、nth、ntpA、nuoA、nuoB、nuoC、nuoE、nuoF、nuoG、nuoH、nuoI、nuoJ、nuoK、nuoL、nuoM、nuoN、nupC、nupG、nusA、nusB、nusG、nuvA、nuvC、ogrK、ogt、ompA、ompC、ompF、ompG、ompR、ompT、ompX、oppA、oppB、oppC、oppD、oppE、oppF、opr、ops、oraA、ordL、orf-23(purB、reg)orfl95(nikA-reg)、orn、osmB、osmC、osmE、osmY、otsA、otsB、oxyR、oxyS、pabA、pabB、pabC、pac、pal、panB、panC、panD、panF、parC、parE、pat、pbpG、pck、pcm、pcnB、pdhR、pdxA、pdxB、pdxH、pdxJ、pdxK、pdxL、pdxY、pepA、pepD、pepE、pepN、pepP、pepQ、pepT、pfkA、pfkB、pflA、pflB、pflC、pflD、pfs、pgi、pgk、pgl、pgm、pgpA、pgpB、pgsA、pheA、pheP、pheS、pheT、pheU、pheV、phnC、phnD、phnE、phnF、phnG、phnH、phnI、phnJ、phnK、phnL、phnM、phnN、phnO、phnP、phoA、phoB、phoE、phoH、phoP、phoQ、phoR、phoU、phrB、phxB、pin、pioO、pit、pldA、pldB、plsB、plsC、plsX、pmbA、pncA、pncB、pnp、pntA、pntB、pnuC、poaR、polA、polB、popD、potA、potB、potC、potD、potE、potF、potG、potH、potI、poxA、poxB、ppa、ppc、pphA、pphB、ppiA、ppiB、ppiC、ppk、pppA、pps、ppx、pqiA、pqiB、pqqL、pqqM、prc、prfA、prfB、prfC、priA、priB、priC、prlC、prlZ、prmA、prmB、proA、proB、proC、proK、proL、proM、proP、proQ、proS、proT、proV、proW、proX、prpA、prpC、prpR、prr、prs、psd、psiF、pspA、pspB、pspC、pspE、pspF、pssA、pssR、pstA、pstB、pstC、pstS、psu、pta、pth、ptrA、ptrB、ptsG、ptsH、ptsI、ptsN″-″、ptsP、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purN、purP、purR、purT、purU、pus、putA、putP、pykA、pykF、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrI、qmeC、qmeD、qmeE、qor、queA、racC、racR、radA、radC、ranA、rarD、ras、rbfA、rbn、rbsA、rbsB、rbsC、rbsD、rbsK、rbsR、rcsA、rcsB、rcsC、rcsF、rdgA、rdgB、recA、recB、recC、recD、recE、recF、recG、recJ、recN、recO、recQ、recR、recT、relA、relB、relE、relF、relX、rep、rer、rfaB、rfaC、rfaD、rfaF、rfaG、rfaH、rfaI、rfaJ、rfaK、rfaL、rfaP、rfaQ、rfaS、rfaY、rfaZ、rfbA、rfbB、rfbC、rfbD、rfbX、rfc、rfe、rffA、rffC、rffD、rffE、rffG、rffH、rffM、rffT、rhaA、rhaB、rhaD、rhaR、rhaS、rhaT、rhlB、rhlE、rho、ribA、ribB、ribC、ribD、ribE、ribF、ridA、ridB、rimB、rimC、rimD、rimE、rimG、rimH、rimI、rimJ、rimK、rimL、rimM、rit、rlpA、rlpB、rluA、rluC、rluD、rmf、rna、rnb、rnc、rnd、rne、rnhA、rnhB、rnk、rnpA、rnpB、rnr、rnt、rob、rorB、rpe、rph、rpiA、rpiB、rpiR、rplA、rplB、rplC、rplD、rplE、rplF、rplI、rplJ、rplK、rplL、rplM、rplN、rplO、rplP、rplQ、rplR、rplS、rplT、rplU、rplV、rplW、rplX、rplY、rpmA、rpmB、rpmC、rpmD、rpmE、rpmF、rpmG、rpmH、rpmI、rpmJ、rpoA、rpoB、rpoC、rpoD、rpoE、rpoH、rpoN、rpoS、rpoZ、rpsA、rpsB、rpsC、rpsD、rpsE、rpsF、rpsG、rpsH、rpsI、rpsJ、rpsK、rpsL、rpsM、rpsN、rpsO、rpsP、rpsQ、rpsR、rpsS、rpsT、rpsU、rrfA、rrfB、rrfC、rrfD、rrfE、rrfF、rrfG、rrfH、rrlA、rrlB、rrlC、rrlD、rrlE、rrlG、rrlH、rrmA、rrsA、rrsB、rrsC、rrsD、rrsE、rrsG、rrsH、rsd、rseA、rseB、rseC、rspA、rspB、rssA、rssB、rsuA、rtcA、rtcB、rtcR、rtn、rus(qsr′)、ruvA、ruvB、ruvC、sad、sanA、sapA、sapB、sapC、sapD、sapF、sbaA、sbcB、sbcC、sbcD、sbmA、sbmC(gyrI)、sbp、sdaA、sdaB、sdaC、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sdiA、sds、secA、secB、secD、secE、secF、secG、secY、selA、selB、selC、selD、semA、seqA、serA、serB、serC、serR serS、serT、serU、serV、serW、serX、sfa、sfcA、sfiC、sfsA、sfsB、shiA、sipC、sipD、sir、sixA、sloB、slp、slr、slt、slyD、slyX、smp、smtA、sodA、sodB、sodC、sohA、sohB、solA、soxR、soxS、speA、speB、speC、speD、speE、speF、speG、spf、spoT、sppA、spr、srlA、srlB、srlD、srlE、srlR、srmB、srnA、ssaE、ssaG、ssaH、ssb、sseA、sseB、sspA、sspB、ssrA、ssrS、ssyA、ssyD stfZ、stkA、stkB、stkC、stkD、stpA、strC、strM、stsA、sucA、sucB、sucC、sucD、sufI、sugE、suhA、suhB、sulA、supQ、surA、surE、syd、tabC、tag、talA、talB、tanA、tanB、tap、tar、tas、tauA、tauB、tauC、tauD、tbpA、tdcA、tdcB、tdcC、tdcD、tdcE、tdcF、tdcG、tdcR、tdh、tdi tdk、tehA、tehB、tesA、tesB、tgt、thdA、thdC、thdD、thiB？、thiC、thiD、thiE、thiF、thiG、thiH、thiI、thiJ、thiK、thiL、thiM、thrA、thrB、thrC、thrS、thrT、thrU、thrV、thrW、thyA、tig、tktA、tktB、tldD、tlnA、tmk、tnaA、tnaB、tnaC、tnm、tol-orfl、tol-orf2、tolA、tolB、tolC、tolD、tolE、tolI、tolJ、tolM、tolQ、toIR、tonB、topA、topB、torA、torC、torD、torR、torS、torT、tpiA、tpr、tpx、treA、treB、treC、treF、treR、trg、trkA、trkD、trkG、trkH、trmA、trmB、trmC、trmD、trmE、trmF、trmH、trmU、trnA、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpR、trpS、trpT、truA、truB、trxA、trxB、tFxC、tsaA、tsf、tsmA、tsr、tsx、ttdA、ttdB、ttk、tufA、tuffB、tus、tynA、tyrA、tyrB、tyrP、tyrR、tyrS、tyrT、tyrU、tyrV、ubiA、ubiB、ubiC、ubiD、ubiE、ubiF、ubiG、ubiH、ubiX、ucpA[]、udk、udp、ugpA、ugpB、ugpC、ugpE、ugpQ、uhpA、uhpB、uhpC、uhpT、uidA、uidB、uidR、umuC、umuD、ung、upp、uppS、ups、uraA、usg-1、usbA、uspA、uup、uvh、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD、uvs、uxaA、uxaB、uxaC、uxuA、uxuB、uxuR、valS、valT、valU、valV、valW、valX、valY、valZ、vsr、wrbA、xapA、xapB、xapR、xasA、xerC、xerD、xni、xseA、xseB、xthA、xylA、xylB、xylE、xylF、xylG、xylH、xylR、yccA、yhhP、yihG、yjaB、fl47、yjaD、yohF、yqiE、yrfE、zipA、zntA、znuA、znuB、znuC、zur和zwf。
minigene、EppB、minigene、EppC、minigene、EppD、minigene、EppE、minigene、EppG、
minigene、EppH、minigene、era、esp、evgA、evgS、exbB、exbC、exbD、expA、exuR、exuT、fabA、fabB、fabD、fabF、fabG、fabH、fabI、fabZ、fadA、fadB、fadD、fadE、fadH、fadL、fadR、farR、fatA、fbaA、fbaB、fbp、fcl、fcsA、fdhD、fdhE、fdhF、fdnG、fdnH、fdnI、fdoG、fdoH、fdoI、fdrA、fdx、feaB、feaR、fecA、fecB、fecC、fecD、fecE、fecI、fecR、feoA、feoB、fepA、fepB、fepC、fepD、fepE、fepG、fes、fexB、ffh、ffs、fhlA、fhlB、fhuA、fhuB、fhuD、fhuE、fhuF、fic、fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI、fipB、fipC、fis、fiu、fixA、fixB、fixC、fixX、fklB、fkpA、fldA、flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhc、flhD、fliA、fliC、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、flip、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、flk、flu、fmt、fnr、focA、focB、folA、folC、folD、folE、folK、folP、folX、fpr、frdA、frdB、frdC、frdD、frr、fruA、fruB、fruK、fruR、fsr、ftn、ftsA、ftsE、ftsI、ftsJ、ftsK、ftsL、ftsN、ftsQ、ftsW、ftsX、ftsY、ftsZ、fucA、fucI、fucK、fucO、fucP、fucR、fumA、fumB、fumC、fur、fusA、fusB、gabC gabD、gabP、gabT、gadA、gadB、gadR、galE、galF、galK、galM、galP、gaiR、galS、galT、galU、gapA、gapC、garA、garB、gatA、gatB、gatC、gatD、gatR、gatY、gatZ、gcd、gcl、gcpE、gcvA、gcvH、gcvP、gcvR、gcvT、gdhA、gef、ggt、gidA、gidB、gip、glcB、glcC、glcD、gIcE、glcG、gldA、glf、glgA、glgB、glgC、glgP、glgS、glgX、glk、glmM、glmS、glmU、glmX、glnA、glnB、glnD、glnE、glnG、glnH、glnK、glhL、glnP、glnQ、glnR、glnS、glnT、glnU、glnV、glnW、glnX、gloA、glpA、glpB、glpC、glpD、gipE、gipF、gipG、glpK、glpQ、gipR、glpT、glpX、gItA、gltB、gltD、gltE、gltF、gltH、gltJ、gltK、gltL、gltM、gltP、gltR、gltS、gltT、gltU、gltv、gltW、gltX、glyA、glyQ、glyS、glyT、glyU、glyv、glyW、glyX、glyY、gmd、gmk、gmm、gnd、gntK、gntP、gntR、gntS、gntT、gntU、gntV、goaG、gor、gph、gpmA、gpp、gprA、gprB、gpsA、gpt、greA、greB、groL、groS、grpE、grxA、grxB、grxC、gshA、gshB、gsk、gsp、gsp*、gst、guaA、guaB、guaC、gurB、gurC、gutM、gutQ、gyrA、gyrB、hcaB、hcaC、hcaD、hcaE、hcaF、hcaR、hcaT、hdeA、hdeB、hdeD、hdhA、helD、hemA、hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH、hemK、hemL、hemM、hemX、hemY、hepA、het、hflB、hflC、hflK、hflX、hfq、hha、hipA、hipB、hisA、hisB、hisC、hisD、hisF、hisG、hisH、hisI、hisJ、hisM、hisP、hisQ、hisR、hisS、hipA、hlyE、hmp、hns、holA、holB、holC、holD、holE、hopB、hopC、hopD、hpt、hrpA、hrpB、hrsA、hscA、hscB、hsdM、hsdR、hsdS、hslC、hslD？、hslE-H、hslJ、hslK、hsIL-N、hslO-R、hslU、hslV、hslW、htgA、htpG、htpX、htrB、htrC、htrE、htrL、hupA、hupB、hyaA、hyaB、hyaC、hyaD、hyaE、hyaF、hybA、hybB、hybC、hybD、hybE、hybF、hybG、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycI、hydA、hydG、hydH、hydN、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、iadA、iap、ibpA、ibpB、icd、iclR、ihfA、ihfB、ileR、ileS、ileT、ileU、ileV、ileX、ileY、ilvA、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvF、ilvG、ilvH、ilvI、ilvJ ilvM、ilvN、ilvR、ilvU、ilvY、imp、inaA、inaR？、infA、infB、infC、inm、insA(IS1)、intA、isb(IS1)、isfA、ispA、ispB、KanR、katE、katG、kba、kbl、kch、kdgK、kdgR、kdgT、kdpA、kdpB、kdpC、kdpD、kdpE、kdpF、kdsA、kdsB、kdtA、kdtB、kefB、kefC、kgtp、ksgA、ksgB、ksgC、ksgD、lacA、lacI、lacY、lacZ、lamB、lar、ldcC、ldhA、lepA、lepB、leuA、leuB、leuC、leuD、leuJ、leuO、leuP、leuQ、leuR、leuS、leuT、leuU、leuV、leuW、leuX、leuY、leuZ、lev、lexA、lgt、lhr、ligA、ligT、linB、lipA、lipB、lit、livF、livG、livH、livJ、livK、livM、lldD、IldP、lldR、lolA、lon、lpcA、lpcB、lpd、lplA、lpp、lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lrb、lrhA、lrp、Irs lspA、lysA、lysC、lysP、lysQ、lysR、lysS、lysT、lysU、lysV、lysW、lysX、lysY、lysZ、lytA、lytB、lyx、maa、mac、mae、mafA、mafB、malE、malF、malG、malI、malK、malM、malP、malQ、malS、malT、malX、malY、malZ、manA、manC、manX、manY、manZ、map、marA、marB、marR、mbrB、mcrA、mcrB、mcrC、mcrD、mdaB、mdh、mdoB、mdoG、mdoH、meb、melA、melB、melR、menA、menB、menC、menD、menE、menF、mepA、mesJ、metA、metB、metC、metD、metE、metF、metG、metH、metJ、metK、metL、metR、metT、metU、metV、metW、metY、metZ、mfd、mglA、mglB、mglC、mglR、mgsA、mgtA、mhpA、mhpB、mhpC、mhpD、mhpE、mhpF、mhpR、miaA、miaD、micF、minC、minD、minE、mioC、mltA、mltB、mltC、mltD、mmrA(rhlB？)、mng、mntA、moaA、moaB、moaC、moaD、moaE、mobA、mobB、moc、modA、modB、modC、modE、modF、moeA、moeB、mog、molR、motA、motB、mpl、mppA、mprA、mraA--？、mraY、mrcA、mrcB、mrdA、mrdB、mreB、mreC、mreD、mrp、mrr、msbA、msbB、mscL、msrA、msyB、mtg、mtgA、mtlA、mtlD、mtlR、mtr、mttA、mttB、mttC、mukB、mukE、mukF、mul、murA、murB、murC、murD、murE、murF、murG、murH、murI、mutG(putative)、mutH、mutL、mutM、mutS、mutT、mutY、nac、nadA、nadB、nadC、nadE、nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、nalB、nalD、nanA、nanE、nanK、nanR、nanT、napA、napB、napC、napD、napF、napG、napH、narG、narH、narI、narJ、narK、narL、narP、narQ、narU、narV、narW、narX、narY、narZ、ndh、ndk、neaB、nei、nemA、nfi、nfnA、nfnB、nfo、nfrA、nfrB、nfrD、nfsA、nhaA、nhaB、nhaR、nikA、nikB、nikC、nikD、nikE、nirB、nirC、nirD、nlpA、nlpB、nlpC、nlpD、nmpC(qsr′)、non、npr、nrdA、nrdB、nrdD、nrdE、nrdF、nrdG、nrfA、nrfB、nrfC、nrfD、nrfE、nrfF、nrfG、nth、ntpA、nuoA、nuoB、nuoC、nuoE、nuoF、nuoG、nuoH、nuoI、nuoJ、nuoK、nuoL、nuoM、nuoN、nupC、nupG、nusA、nusB、nusG、nuvA、nuvC、ogrK、ogt、ompA、ompC、ompF、ompG、ompR、ompT、ompX、oppA、oppB、oppC、oppD、oppE、oppF、opr、ops、oraA、ordL、orf-23(purB、reg)orfl95(nikA-reg)、orn、osmB、osmC、osmE、osmY、otsA、otsB、oxyR、oxyS、pabA、pabB、pabC、pac、pal、panB、panC、panD、panF、parC、parE、pat、pbpG、pck、pcm、pcnB、pdhR、pdxA、pdxB、pdxH、pdxJ、pdxK、pdxL、pdxY、pepA、pepD、pepE、pepN、pepP、pepQ、pepT、pfkA、pfkB、pflA、pflB、pflC、pflD、pfs、pgi、pgk、pgl、pgm、pgpA、pgpB、pgsA、pheA、pheP、pheS、pheT、pheU、pheV、phnC、phnD、phnE、phnF、phnG、phnH、phnI、phnJ、phnK、phnL、phnM、phnN、phnO、phnP、phoA、phoB、phoE、phoH、phoP、phoQ、phoR、phoU、phrB、phxB、pin、pioO、pit、pldA、pldB、plsB、plsC、plsX、pmbA、pncA、pncB、pnp、pntA、pntB、pnuC、poaR、polA、polB、popD、potA、potB、potC、potD、potE、potF、potG、potH、potI、poxA、poxB、ppa、ppc、pphA、pphB、ppiA、ppiB、ppiC、ppk、pppA、pps、ppx、pqiA、pqiB、pqqL、pqqM、prc、prfA、prfB、prfC、priA、priB、priC、prlC、prlZ、prmA、prmB、proA、proB、proC、proK、proL、proM、proP、proQ、proS、proT、proV、proW、proX、prpA、prpC、prpR、prr、prs、psd、psiF、pspA、pspB、pspC、pspE、pspF、pssA、pssR、pstA、pstB、pstC、pstS、psu、pta、pth、ptrA、ptrB、ptsG、ptsH、ptsI、ptsN″-″、ptsP、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purN、purP、purR、purT、purU、pus、putA、putP、pykA、pykF、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrI、qmeC、qmeD、qmeE、qor、queA、racC、racR、radA、radC、ranA、rarD、ras、rbfA、rbn、rbsA、rbsB、rbsC、rbsD、rbsK、rbsR、rcsA、rcsB、rcsC、rcsF、rdgA、rdgB、recA、recB、recC、recD、recE、recF、recG、recJ、recN、recO、recQ、recR、recT、relA、relB、relE、relF、relX、rep、rer、rfaB、rfaC、rfaD、rfaF、rfaG、rfaH、rfaI、rfaJ、rfaK、rfaL、rfaP、rfaQ、rfaS、rfaY、rfaZ、rfbA、rfbB、rfbC、rfbD、rfbX、rfc、rfe、rffA、rffC、rffD、rffE、rffG、rffH、rffM、rffT、rhaA、rhaB、rhaD、rhaR、rhaS、rhaT、rhlB、rhlE、rho、ribA、ribB、ribC、ribD、ribE、ribF、ridA、ridB、rimB、rimC、rimD、rimE、rimG、rimH、rimI、rimJ、rimK、rimL、rimM、rit、rlpA、rlpB、rluA、rluC、rluD、rmf、rna、rnb、rnc、rnd、rne、rnhA、rnhB、rnk、rnpA、rnpB、rnr、rnt、rob、rorB、rpe、rph、rpiA、rpiB、rpiR、rplA、rplB、rplC、rplD、rplE、rplF、rplI、rplJ、rplK、rplL、rplM、rplN、rplO、rplP、rplQ、rplR、rplS、rplT、rplU、rplV、rplW、rplX、rplY、rpmA、rpmB、rpmC、rpmD、rpmE、rpmF、rpmG、rpmH、rpmI、rpmJ、rpoA、rpoB、rpoC、rpoD、rpoE、rpoH、rpoN、rpoS、rpoZ、rpsA、rpsB、rpsC、rpsD、rpsE、rpsF、rpsG、rpsH、rpsI、rpsJ、rpsK、rpsL、rpsM、rpsN、rpsO、rpsP、rpsQ、rpsR、rpsS、rpsT、rpsU、rrfA、rrfB、rrfC、rrfD、rrfE、rrfF、rrfG、rrfH、rrlA、rrlB、rrlC、rrlD、rrlE、rrlG、rrlH、rrmA、rrsA、rrsB、rrsC、rrsD、rrsE、rrsG、rrsH、rsd、rseA、rseB、rseC、rspA、rspB、rssA、rssB、rsuA、rtcA、rtcB、rtcR、rtn、rus(qsr′)、ruvA、ruvB、ruvC、sad、sanA、sapA、sapB、sapC、sapD、sapF、sbaA、sbcB、sbcC、sbcD、sbmA、sbmC(gyrI)、sbp、sdaA、sdaB、sdaC、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sdiA、sds、secA、secB、secD、secE、secF、secG、secY、selA、selB、selC、selD、semA、seqA、serA、serB、serC、serR serS、serT、serU、serV、serW、serX、sfa、sfcA、sfiC、sfsA、sfsB、shiA、sipC、sipD、sir、sixA、sloB、slp、slr、slt、slyD、slyX、smp、smtA、sodA、sodB、sodC、sohA、sohB、solA、soxR、soxS、speA、speB、speC、speD、speE、speF、speG、spf、spoT、sppA、spr、srlA、srlB、srlD、srlE、srlR、srmB、srnA、ssaE、ssaG、ssaH、ssb、sseA、sseB、sspA、sspB、ssrA、ssrS、ssyA、ssyD stfZ、stkA、stkB、stkC、stkD、stpA、strC、strM、stsA、sucA、sucB、sucC、sucD、sufI、sugE、suhA、suhB、sulA、supQ、surA、surE、syd、tabC、tag、talA、talB、tanA、tanB、tap、tar、tas、tauA、tauB、tauC、tauD、tbpA、tdcA、tdcB、tdcC、tdcD、tdcE、tdcF、tdcG、tdcR、tdh、tdi tdk、tehA、tehB、tesA、tesB、tgt、thdA、thdC、thdD、thiB？、thiC、thiD、thiE、thiF、thiG、thiH、thiI、thiJ、thiK、thiL、thiM、thrA、thrB、thrC、thrS、thrT、thrU、thrV、thrW、thyA、tig、tktA、tktB、tldD、tlnA、tmk、tnaA、tnaB、tnaC、tnm、tol-orfl、tol-orf2、tolA、tolB、tolC、tolD、tolE、tolI、tolJ、tolM、tolQ、toIR、tonB、topA、topB、torA、torC、torD、torR、torS、torT、tpiA、tpr、tpx、treA、treB、treC、treF、treR、trg、trkA、trkD、trkG、trkH、trmA、trmB、trmC、trmD、trmE、trmF、trmH、trmU、trnA、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpR、trpS、trpT、truA、truB、trxA、trxB、tFxC、tsaA、tsf、tsmA、tsr、tsx、ttdA、ttdB、ttk、tufA、tuffB、tus、tynA、tyrA、tyrB、tyrP、tyrR、tyrS、tyrT、tyrU、tyrV、ubiA、ubiB、ubiC、ubiD、ubiE、ubiF、ubiG、ubiH、ubiX、ucpA[]、udk、udp、ugpA、ugpB、ugpC、ugpE、ugpQ、uhpA、uhpB、uhpC、uhpT、uidA、uidB、uidR、umuC、umuD、ung、upp、uppS、ups、uraA、usg-1、usbA、uspA、uup、uvh、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD、uvs、uxaA、uxaB、uxaC、uxuA、uxuB、uxuR、valS、valT、valU、valV、valW、valX、valY、valZ、vsr、wrbA、xapA、xapB、xapR、xasA、xerC、xerD、xni、xseA、xseB、xthA、xylA、xylB、xylE、xylF、xylG、xylH、xylR、yccA、yhhP、yihG、yjaB、fl47、yjaD、yohF、yqiE、yrfE、zipA、zntA、znuA、znuB、znuC、zur和zwf。
[0335] 小鼠基因的非限制性实例包括：Ilr1、Ilr2、Gas10、Tnp1、Inhbb、Inha、Creb1、Mpmv34、Acrd、Acrg、Il110、Otf1、Rab11b-r、Abl1、ald、Amh-rs1、Bc12B、Cchlla3、
Ccnb1-rs2、Gpcr16、Htr5b、Idd5、Igfbp2、Igfbp5、I18rb、Kras2-rs1、Mov7、Mpmv6、Mpmv16、Mpmv22、Mpmv25、Mpmv29、Mpmv42、Mtv7、Mtv27、Mtv39、Oprk1、Otf3-rs1、Otf8、Otf11-rs1、Ptgs2、Ren1、Ren2、Ril3、Sxv、Taz4-rs1、Tgfb2、Wnt6、Xmmv6、Xmmv9、Xmmv36、Xmmv61、Xmmv74、Xmv21、Xmv32、Xmv41、I12ra、Ab1、Mpmv3、Rap1a-ps2、anx、Mpmv43、Ryr3、Ras12-4、Adra2b、Avp、Glvr1、Il1a、Il1b、Mpmv28、Oxt、Pcsk2、a、Xmv10、Tcf4、Acra、Acra4、Ak1、Bdnf、bs、Cyct、Cyp24、Dbh、Fshb、Gcg、Gdf5、Gnas、Gpcr8、Grin1、Hcs4、Hior2、Hsp84-2、Idd12、Ilrn、Jund2、Kras3、Mc3r、Mpmv14、Mtv40、Mxi1-rs1、Otf3-rs2、Ptgs1、Ptpra、Rapsn、Src、Svp1、Svp3、Tcf3b、Wt1、Xmmv71、Xmv48、Ccna、Fgf2、Fth-rs1、Csfm、Mov10、Egf、Acrb2、Cap1、Crh、Fim3、Fps11、Glut2、Gpcr2、Gria2、Hsd3b-1、Hsd3b-2、Hsd3b-3、Hsd3b-4、Hsp86-ps2、Idd3、I12、I17、Mpvmv9、Mpmv20、Mtv4.8、Ngfb、Npra、Nras、Nras、Ntrk、Otf3-rs3、Otf3-rs4、Rap1a、Tshb、Xmmv22、Xmmv65、Mos、Ras12-7、Lyr、Ifa、Ifb、Jun、azh、db、Ipp、Mp1、Do1、Ak2、Ccnb1-rs4、Cdc211、Cga、Fgr、Foc1、Fps12、Gabrr1、Gabrr2、Gdf6、Glut1、Gnb1、Gpcr14、Grb2-ps、Grik3、Grik5、Hsp86-1ps4、Htr1da、Htr1db、Idd9、Ifa1、Ifa2、Ifa3、Ifa4、Ifa5、Ifa6、Ifa7、Ifa8、Ifa9、Ifa10、Lap18、Lmyc1、Mpmv19、Mpmv44、Mtv13、Mtv14、Mtv17、Nppb、Otf6、Otf7、Ri12、Ski、Tnfr2、Wnt4、Xmmv8、Xmmv23、Xmmv62、Xmv1、Xmv2、Xmv8、Xmv9、Xmv14、Xmv44、Xpa、Tec、Fgf5、Nos1、Tcf1、Epo、Gnb2、Flt1、Flt3、Ache、Adra2c、Adrbk2、Afp、Alb1、Ccnb1-rs1、Clock、Cyp3、Cyp3a11、Cyp3a13、Drd1b、Drd5、Fgfr3、Flk1、Gc、Gnrhr、Gpcr1、Hcs5、Hnf1、Htr5a、I15r、I16、Kit、Ltrm3、Mgsa、Mpmv7、Mpmv13、Mpmv23、Mtv32、Mtv41、Pdgfa、Pdgfra、Por、Txk、Xmmv3、Xmmv5、Xmmv52、Xmv17、Xmv28、Xmv34、Xmv38、Xmv45、Zp3、Trh、Raf1、Fth-rs2、Ntf3、Kras2、Pthlh、Mov1、Alox5、Braf2、Cftr、Egr4、Fpsl10、Fgf6、Gdf3、Ghrfr、Glut3、Grin2a、Hior3、Hoxa10、hop、Ica1、I15r、Int41、Itpr1、Krag、Mad、Met、Mi、Mtv8、Mtv23、Mtv29、Mtv33、Mtv34、Nkna、Npy、ob、Otf3-rs5、Tgfa、Tnfr1、Wnt2、Wnt5B、Wnt7A、Xmmv27、Xmv24、Xmv61、Fosb、Ryr1、Ngfa、Ufo、Xrcc1、Abpa、Abpga、Gabra4、Gas2、Acra7、Ccnb1-rs7、Egfbp3、Xmv30、Zp2、Fes、Pcsk3、Calc、Ccnb1-rs10、Pth、Ad、Bc13、Cea、Cea2、Cea3、Cea4、Cea5、Cea6、Cebp、Dm9、Dm15、Drd4、Egfbp1、Egfbp2、Ercc2、Fgf3、Fgfr2、Gabra5、Gabrb3、Gtx、Hcs1、Igf1r、Igf2、I14r、Ins2、Int40、Lhb、Mpmv1、Mtv1、Mtv35、Ngfg、Ntf5、Otf2、2、Pkcc、Ras14、Rras、Ryr、Svp2、Tcf3g、Tgfb1、tub、Xmmv31、Xmmv35、Xmmv73、Xmv33、Xmv53、Taz83、Adrb3、Junb、Jund1、Me1、Gpcr19-rs2、Agt、Cadp、Ccnb1-rs9、E、Fgfr1、Gas6、Gnb-rs1、Hcs2、Insr、Maf、Mov34、Mpmv21、Mpmv41、Mtv21、Mtnr1a、Plat、Ras15-2、Ras16、Sntb2、Xmmv29、Xmv12、Xmv26、Xmv62、Epor、Gpcr13、Otf11、Pthr、Acra3、Acra5、Acrb4、Camk1、Cdc25Mm、Crbp、Crbp2、Csk、Cyp11a、Cyp19、Drd2、Ets1、Fli1、Gnai2、Gnat1、Gpcr6、Gria4、Hgf1、Hior1、Hpx、Hsp86-1ps3、Hst2、Idd2、I11bc、Lag-rs1、Lap18-rs1、M11、Mpmv27、Penk、Pgr、Ras12-2、Tp11、Trf、Xmmv2、Xmmv67、Xmv15、Xmv16、Xmv25、Xmv60、Mgf、Amh、Braf、Cdc2a、Dmd1、Estr、Fps13、Fps14、Fps15、Gli、Gpcr17、Grik2、Ifgr、Igf1、Mpmv5、Mpmv12、Mpmv40、Myb、Oprm、Pg、Pmch、Ros1、Xmv31、Xmv51、Xmv54、Camk2b、Egfr、Int6、Lif、Mtv44、Ews、Csfgm、Flt4、I13、I14、I15、Irf1、Gria1、Glut4、Crhr、Csfg、Mov9、Xmv20、Acrb、Mpmv4、Mpmv15、Ngfr、Nos2、Rara、Taz4、Tcf2、Xmv42、Mtv3、Adra1、Crko、df、Erbb2、Gabra1、Gabra6、Gabrg2、Gh、Glra1、Grb2、Hnf1b、Hsp86-ps1、Idd4、Igfbp1、Igfbp3、I113、Int4、Mpmv2、Mpmv8、Mpmv18、Mtv45、nu、Pkca、Rab1、Re1、Shbg、Tcf7、Thra、Tnz1、Trp53、Wnt3、Wnt3A、Xmv4、Xmv5、Xmv47、Xmv49、Xmv63、Akt、Amh-rs4、Ccs1、Fps16、Fos、Gdf7、Hcs3、Hsp70-2、Hsp84-3、Hsp86-1、hyt、Ltrm1、Max、Mpmv11、Mpmv24、Mtv9、Mtv30、Pomc1、Tcf3a、Tda2、Tgfb3、Tpo、Tshr、Xmmv21、Xmmv25、Xmmv34、Xmmv50、Gli3、Xmv55、Ryr2、Inhba、Gas1、Pcsk1、Amh-rs2、Ccnb1-rs6、Ccnb1-rs13、Crhpb、Dat1、Drd1a、Fgfr4、Fps17、Fim1、Gpcr15、Gpcr18、Hbvi、Hilda、Htr1a、Idd11、I19、Ltrm4、Mak、mes、P11、P12、Pr1、Ra1、Rasa、Srd5a1、Tpbp、Xmv13、Xmv27、Rarb、Rbp3、Htr2、Rb1、Acra2、Camkg、Cch11a2、Ccnb1-rs5、Ccnb1-rs12、Gnrh、Mtv11、Nras-ps、Otf3-rs6、Plau、Ptprg、Trp53-ps、Wnt5A、Xmv19、Ghr、I17r、Lifr、Mlvi2、Prlr、Myc、Ril1、cog、Amh-rs7、I12rb、Pdgfb、Acr、CP2、Rarg、Sp1-1、Wnt1、Afr1、Atf4、Bzrp、Ccnb1-rs11、Cyp11b、I13rb1、I13rb2、Ins3、Itga、Mlvi1、Mlvi3、Mtv36、Pdgfec、Svp5、Tef、Trhr、Wnt7B、Xmmv55、Xmmv72、Xmv37、Tnp2、Ets2、Casr、Chuck-rs1、din、Drd3、Erg、G22p1、Gap43、Gas4、Grik1、Htr1f、Ifgt、Int53、Ltrm2、Mpmv17、Mtv6、Mtvr1、Pit1、Xmv3、Xmv35、Xmv50、Igf2r、Mas、Tcd3、Glp1r、Idd1、Tla、Aeg1、Ccnb1-rs3、Cdc2b、Csi、Cyp21、Cyp21-ps1、Fps18、Gna-rs1、Gpcr19-rs1、Grr1、Grr2、Hom1、Hsc70t、Hsp70、Hsp70-1、Hsp70-3、Hsp84-1、Hst1、Hst4、Hst5、Hst6、Hye、Int3、Itpr3、Lap18-rs2、Otf3、Ptprs、Rab11b、Ras12-1、Ras12-3、Ras13、Rrs、Rxrb、Tas、Tcd1、Tcd2、Tera1、Tla-rs、Tnfa、Tnfb、Tpx1、Tpx2、Xmmv15、Xmv36、Xmv57、Csfmr、Pdgfrb、Adrb2、Apc、Camk2a、Camk4、Dcc、Fgf1、Gna1、Gpcr7、Gr11、Grp、Hsp74、Mcc、Mtv2、Mtv38、Ptpn2、Tp12、Xmv22、Xmv23、Xmv29、Fth、Csfgmra、Mxi1、Adra2a、Adrb1、Adrbk1、Chuck、Cyp17、Gna14、Gnb-ps1、Hcs6、Htr7、Ide、Ins1、Lpc1、Pomc2、Seao、Tlx1、Xmmv42、Xmv18、Tcfe3、Araf、Avpr2、mdx、Ar、Zfx、Otf9、Ccg1、Ccnb1-rs8、Fps19、Gabra3、Glra2、Glra4、Gria3、Grpr、Hsp74-ps1、Hst3、Htr1c、I12rg、Mov14、Mov15、Mtv28、Otf3-rs8、Sts、Sxa、Sxr、Xta、Tdy、Hya、Zfy1、Zfy2、Mov15、Mov24、Mtv31、Mtv42、Sdma、Spy、Sts、Sxa、Sxr、XmmvY、Xmv7、Xmv11和Xmv40。
Ccnb1-rs2、Gpcr16、Htr5b、Idd5、Igfbp2、Igfbp5、I18rb、Kras2-rs1、Mov7、Mpmv6、Mpmv16、Mpmv22、Mpmv25、Mpmv29、Mpmv42、Mtv7、Mtv27、Mtv39、Oprk1、Otf3-rs1、Otf8、Otf11-rs1、Ptgs2、Ren1、Ren2、Ril3、Sxv、Taz4-rs1、Tgfb2、Wnt6、Xmmv6、Xmmv9、Xmmv36、Xmmv61、Xmmv74、Xmv21、Xmv32、Xmv41、I12ra、Ab1、Mpmv3、Rap1a-ps2、anx、Mpmv43、Ryr3、Ras12-4、Adra2b、Avp、Glvr1、Il1a、Il1b、Mpmv28、Oxt、Pcsk2、a、Xmv10、Tcf4、Acra、Acra4、Ak1、Bdnf、bs、Cyct、Cyp24、Dbh、Fshb、Gcg、Gdf5、Gnas、Gpcr8、Grin1、Hcs4、Hior2、Hsp84-2、Idd12、Ilrn、Jund2、Kras3、Mc3r、Mpmv14、Mtv40、Mxi1-rs1、Otf3-rs2、Ptgs1、Ptpra、Rapsn、Src、Svp1、Svp3、Tcf3b、Wt1、Xmmv71、Xmv48、Ccna、Fgf2、Fth-rs1、Csfm、Mov10、Egf、Acrb2、Cap1、Crh、Fim3、Fps11、Glut2、Gpcr2、Gria2、Hsd3b-1、Hsd3b-2、Hsd3b-3、Hsd3b-4、Hsp86-ps2、Idd3、I12、I17、Mpvmv9、Mpmv20、Mtv4.8、Ngfb、Npra、Nras、Nras、Ntrk、Otf3-rs3、Otf3-rs4、Rap1a、Tshb、Xmmv22、Xmmv65、Mos、Ras12-7、Lyr、Ifa、Ifb、Jun、azh、db、Ipp、Mp1、Do1、Ak2、Ccnb1-rs4、Cdc211、Cga、Fgr、Foc1、Fps12、Gabrr1、Gabrr2、Gdf6、Glut1、Gnb1、Gpcr14、Grb2-ps、Grik3、Grik5、Hsp86-1ps4、Htr1da、Htr1db、Idd9、Ifa1、Ifa2、Ifa3、Ifa4、Ifa5、Ifa6、Ifa7、Ifa8、Ifa9、Ifa10、Lap18、Lmyc1、Mpmv19、Mpmv44、Mtv13、Mtv14、Mtv17、Nppb、Otf6、Otf7、Ri12、Ski、Tnfr2、Wnt4、Xmmv8、Xmmv23、Xmmv62、Xmv1、Xmv2、Xmv8、Xmv9、Xmv14、Xmv44、Xpa、Tec、Fgf5、Nos1、Tcf1、Epo、Gnb2、Flt1、Flt3、Ache、Adra2c、Adrbk2、Afp、Alb1、Ccnb1-rs1、Clock、Cyp3、Cyp3a11、Cyp3a13、Drd1b、Drd5、Fgfr3、Flk1、Gc、Gnrhr、Gpcr1、Hcs5、Hnf1、Htr5a、I15r、I16、Kit、Ltrm3、Mgsa、Mpmv7、Mpmv13、Mpmv23、Mtv32、Mtv41、Pdgfa、Pdgfra、Por、Txk、Xmmv3、Xmmv5、Xmmv52、Xmv17、Xmv28、Xmv34、Xmv38、Xmv45、Zp3、Trh、Raf1、Fth-rs2、Ntf3、Kras2、Pthlh、Mov1、Alox5、Braf2、Cftr、Egr4、Fpsl10、Fgf6、Gdf3、Ghrfr、Glut3、Grin2a、Hior3、Hoxa10、hop、Ica1、I15r、Int41、Itpr1、Krag、Mad、Met、Mi、Mtv8、Mtv23、Mtv29、Mtv33、Mtv34、Nkna、Npy、ob、Otf3-rs5、Tgfa、Tnfr1、Wnt2、Wnt5B、Wnt7A、Xmmv27、Xmv24、Xmv61、Fosb、Ryr1、Ngfa、Ufo、Xrcc1、Abpa、Abpga、Gabra4、Gas2、Acra7、Ccnb1-rs7、Egfbp3、Xmv30、Zp2、Fes、Pcsk3、Calc、Ccnb1-rs10、Pth、Ad、Bc13、Cea、Cea2、Cea3、Cea4、Cea5、Cea6、Cebp、Dm9、Dm15、Drd4、Egfbp1、Egfbp2、Ercc2、Fgf3、Fgfr2、Gabra5、Gabrb3、Gtx、Hcs1、Igf1r、Igf2、I14r、Ins2、Int40、Lhb、Mpmv1、Mtv1、Mtv35、Ngfg、Ntf5、Otf2、2、Pkcc、Ras14、Rras、Ryr、Svp2、Tcf3g、Tgfb1、tub、Xmmv31、Xmmv35、Xmmv73、Xmv33、Xmv53、Taz83、Adrb3、Junb、Jund1、Me1、Gpcr19-rs2、Agt、Cadp、Ccnb1-rs9、E、Fgfr1、Gas6、Gnb-rs1、Hcs2、Insr、Maf、Mov34、Mpmv21、Mpmv41、Mtv21、Mtnr1a、Plat、Ras15-2、Ras16、Sntb2、Xmmv29、Xmv12、Xmv26、Xmv62、Epor、Gpcr13、Otf11、Pthr、Acra3、Acra5、Acrb4、Camk1、Cdc25Mm、Crbp、Crbp2、Csk、Cyp11a、Cyp19、Drd2、Ets1、Fli1、Gnai2、Gnat1、Gpcr6、Gria4、Hgf1、Hior1、Hpx、Hsp86-1ps3、Hst2、Idd2、I11bc、Lag-rs1、Lap18-rs1、M11、Mpmv27、Penk、Pgr、Ras12-2、Tp11、Trf、Xmmv2、Xmmv67、Xmv15、Xmv16、Xmv25、Xmv60、Mgf、Amh、Braf、Cdc2a、Dmd1、Estr、Fps13、Fps14、Fps15、Gli、Gpcr17、Grik2、Ifgr、Igf1、Mpmv5、Mpmv12、Mpmv40、Myb、Oprm、Pg、Pmch、Ros1、Xmv31、Xmv51、Xmv54、Camk2b、Egfr、Int6、Lif、Mtv44、Ews、Csfgm、Flt4、I13、I14、I15、Irf1、Gria1、Glut4、Crhr、Csfg、Mov9、Xmv20、Acrb、Mpmv4、Mpmv15、Ngfr、Nos2、Rara、Taz4、Tcf2、Xmv42、Mtv3、Adra1、Crko、df、Erbb2、Gabra1、Gabra6、Gabrg2、Gh、Glra1、Grb2、Hnf1b、Hsp86-ps1、Idd4、Igfbp1、Igfbp3、I113、Int4、Mpmv2、Mpmv8、Mpmv18、Mtv45、nu、Pkca、Rab1、Re1、Shbg、Tcf7、Thra、Tnz1、Trp53、Wnt3、Wnt3A、Xmv4、Xmv5、Xmv47、Xmv49、Xmv63、Akt、Amh-rs4、Ccs1、Fps16、Fos、Gdf7、Hcs3、Hsp70-2、Hsp84-3、Hsp86-1、hyt、Ltrm1、Max、Mpmv11、Mpmv24、Mtv9、Mtv30、Pomc1、Tcf3a、Tda2、Tgfb3、Tpo、Tshr、Xmmv21、Xmmv25、Xmmv34、Xmmv50、Gli3、Xmv55、Ryr2、Inhba、Gas1、Pcsk1、Amh-rs2、Ccnb1-rs6、Ccnb1-rs13、Crhpb、Dat1、Drd1a、Fgfr4、Fps17、Fim1、Gpcr15、Gpcr18、Hbvi、Hilda、Htr1a、Idd11、I19、Ltrm4、Mak、mes、P11、P12、Pr1、Ra1、Rasa、Srd5a1、Tpbp、Xmv13、Xmv27、Rarb、Rbp3、Htr2、Rb1、Acra2、Camkg、Cch11a2、Ccnb1-rs5、Ccnb1-rs12、Gnrh、Mtv11、Nras-ps、Otf3-rs6、Plau、Ptprg、Trp53-ps、Wnt5A、Xmv19、Ghr、I17r、Lifr、Mlvi2、Prlr、Myc、Ril1、cog、Amh-rs7、I12rb、Pdgfb、Acr、CP2、Rarg、Sp1-1、Wnt1、Afr1、Atf4、Bzrp、Ccnb1-rs11、Cyp11b、I13rb1、I13rb2、Ins3、Itga、Mlvi1、Mlvi3、Mtv36、Pdgfec、Svp5、Tef、Trhr、Wnt7B、Xmmv55、Xmmv72、Xmv37、Tnp2、Ets2、Casr、Chuck-rs1、din、Drd3、Erg、G22p1、Gap43、Gas4、Grik1、Htr1f、Ifgt、Int53、Ltrm2、Mpmv17、Mtv6、Mtvr1、Pit1、Xmv3、Xmv35、Xmv50、Igf2r、Mas、Tcd3、Glp1r、Idd1、Tla、Aeg1、Ccnb1-rs3、Cdc2b、Csi、Cyp21、Cyp21-ps1、Fps18、Gna-rs1、Gpcr19-rs1、Grr1、Grr2、Hom1、Hsc70t、Hsp70、Hsp70-1、Hsp70-3、Hsp84-1、Hst1、Hst4、Hst5、Hst6、Hye、Int3、Itpr3、Lap18-rs2、Otf3、Ptprs、Rab11b、Ras12-1、Ras12-3、Ras13、Rrs、Rxrb、Tas、Tcd1、Tcd2、Tera1、Tla-rs、Tnfa、Tnfb、Tpx1、Tpx2、Xmmv15、Xmv36、Xmv57、Csfmr、Pdgfrb、Adrb2、Apc、Camk2a、Camk4、Dcc、Fgf1、Gna1、Gpcr7、Gr11、Grp、Hsp74、Mcc、Mtv2、Mtv38、Ptpn2、Tp12、Xmv22、Xmv23、Xmv29、Fth、Csfgmra、Mxi1、Adra2a、Adrb1、Adrbk1、Chuck、Cyp17、Gna14、Gnb-ps1、Hcs6、Htr7、Ide、Ins1、Lpc1、Pomc2、Seao、Tlx1、Xmmv42、Xmv18、Tcfe3、Araf、Avpr2、mdx、Ar、Zfx、Otf9、Ccg1、Ccnb1-rs8、Fps19、Gabra3、Glra2、Glra4、Gria3、Grpr、Hsp74-ps1、Hst3、Htr1c、I12rg、Mov14、Mov15、Mtv28、Otf3-rs8、Sts、Sxa、Sxr、Xta、Tdy、Hya、Zfy1、Zfy2、Mov15、Mov24、Mtv31、Mtv42、Sdma、Spy、Sts、Sxa、Sxr、XmmvY、Xmv7、Xmv11和Xmv40。
[0336] Phaseolus vulgaris基因的非限制性实例包括：Acc，ace，Adk，Am，Amv-1，Amv-2，Ane，aph，Arc，Are，arg，Ar1(Arc)，asp，B，bc-u，bc-1.sup.1，bc-1.sup.2，bc-2.sup.1，bc-2.sup.2，bc-3，Bcm，Beg，Bip，blu，Bpm，Bsm，By-1，By-2，C，C/c，c.sup.
cr，C.sup.cir，C.sup.ma(M，R.sup.ma)，C.sup.r，C.sup.res，C.sup.rho，C.sup.st，
[C.sup.st R Acc](Aeq)，c.sup.u(inh，i.sub.e)，[c.sup.u Prp.sup.i](Prp，c.sup.
ui，Nud)，[c.sup.uprp.sup.st](prp.sup.st)，[C Prp](Prp)，c.sup.v，[C R](R)，[C r]
(r)，Ca，Cam，Cav，cc，ch1，c1，cm1，Co-1(A)，Co-2(Are)，Co-3(Mexique1)，Co-3.sup.2，Co-4(Mexique2)，Co-5(Mexique3)，Co-6，Co-7，cr-1cr-2，cry，cs，Ct，ctv-1ctv-2，
cyv(by-3)，D(Can，Ins)，Da，Db，def，dgs(g1，le)，dia，Diap-1，Diap-2，diff，dis，
D1-1D1-2(DL.sub.1DL.sub.2)，do，ds(te)，dt-1.sup.a dt-2.sup.a，dt-1.sup.b dt-2.
sup.b，dw-1dw-2，Ea Eb，ers(restr)，ers-2，Est-1，Est-2，exp，F，Fa，fast，Fb Fc，fafb fc，Fcr，Fcr-2，fd，Fe-1Fe-2，Fin(in)，Fop-1，Fop-2，Fr，Fr-2，G(Flav，Ca，Och)，Ga，gas，glb，Gpi-c1，Gr，Hb1(L.sub.HB-1)，Hbnc(SC.sub.HB-1)，Hbp(PD.sub.HB-1)，hmb，Hss，
Hsw，Ht-1Ht-2(L-1L-2)，I，Ia Ib，ian-1ian-2(ia)，lbd，ico，Igr(Ih)，ilo，ip，iter，iv，iw，J(Sh)，Ke，L，la，Lan，Ld，Lds(Ds)，Lec，Li(L)，lo，Ir-1lr-2，mar，Me，Mel(Me)，Mel-2(Me-2)，mel-3(me-3)，Mf，mi，mia，Mic(Mip)，miv，Mrf，Mrf.sup.2，mrf，ms-1，Mue，mu mutator，Nag，Nd-1Nd-2(D-1D-2)，nie，nnd(sym-1)，nnd-2，No，nts(nod)，Nudus，ol，P，p.sup.gri(Gri，v.sup.Pal)，pa，pc，pg(pa.sub.1)，Pha，Pmv，ppd(neu)，Pr，prc(pc)，Prx，punc，ram，Rbcs(rbcS)，rf-1，rf-2，rf-3，rfi(i)，Rfs(m)，Rk，rk，rk.sup.d(lin)，rn-1rn-2(r r)，rnd，Ro，Sal，sb，sb.sup.ms，sb-2，sb-3，si1，Skdh，s1，Smv，St，Sur，sw-1sW-2，T，t(z-1)，Th-1Th-2，Tm，To，Tor(T)，Tr，tri，trv，Ts，tw，uni，Uni-2，uni.sup.nde，uni.sup.nie，Ur-1，Ur-2，Ur-2.sup.2，Ur-3(Ur-3，Ur-4)，Ur-3.sup.2，Ur-4，(Up-2，Ur-C)，Ur-5，(B-190)，Ur-6(Ur.sub.a，Ur-G)，Ur-7(R.sub.B11)，Ur-8(Up-1)，Ur-9(Ur.
sub.p)，us，V(B1)，v.sup.lae(Cor)，v，var，vi(vir.sub.f)，wb，Wmv，X.sup.su，y和Z。
cr，C.sup.cir，C.sup.ma(M，R.sup.ma)，C.sup.r，C.sup.res，C.sup.rho，C.sup.st，
[C.sup.st R Acc](Aeq)，c.sup.u(inh，i.sub.e)，[c.sup.u Prp.sup.i](Prp，c.sup.
ui，Nud)，[c.sup.uprp.sup.st](prp.sup.st)，[C Prp](Prp)，c.sup.v，[C R](R)，[C r]
(r)，Ca，Cam，Cav，cc，ch1，c1，cm1，Co-1(A)，Co-2(Are)，Co-3(Mexique1)，Co-3.sup.2，Co-4(Mexique2)，Co-5(Mexique3)，Co-6，Co-7，cr-1cr-2，cry，cs，Ct，ctv-1ctv-2，
cyv(by-3)，D(Can，Ins)，Da，Db，def，dgs(g1，le)，dia，Diap-1，Diap-2，diff，dis，
D1-1D1-2(DL.sub.1DL.sub.2)，do，ds(te)，dt-1.sup.a dt-2.sup.a，dt-1.sup.b dt-2.
sup.b，dw-1dw-2，Ea Eb，ers(restr)，ers-2，Est-1，Est-2，exp，F，Fa，fast，Fb Fc，fafb fc，Fcr，Fcr-2，fd，Fe-1Fe-2，Fin(in)，Fop-1，Fop-2，Fr，Fr-2，G(Flav，Ca，Och)，Ga，gas，glb，Gpi-c1，Gr，Hb1(L.sub.HB-1)，Hbnc(SC.sub.HB-1)，Hbp(PD.sub.HB-1)，hmb，Hss，
Hsw，Ht-1Ht-2(L-1L-2)，I，Ia Ib，ian-1ian-2(ia)，lbd，ico，Igr(Ih)，ilo，ip，iter，iv，iw，J(Sh)，Ke，L，la，Lan，Ld，Lds(Ds)，Lec，Li(L)，lo，Ir-1lr-2，mar，Me，Mel(Me)，Mel-2(Me-2)，mel-3(me-3)，Mf，mi，mia，Mic(Mip)，miv，Mrf，Mrf.sup.2，mrf，ms-1，Mue，mu mutator，Nag，Nd-1Nd-2(D-1D-2)，nie，nnd(sym-1)，nnd-2，No，nts(nod)，Nudus，ol，P，p.sup.gri(Gri，v.sup.Pal)，pa，pc，pg(pa.sub.1)，Pha，Pmv，ppd(neu)，Pr，prc(pc)，Prx，punc，ram，Rbcs(rbcS)，rf-1，rf-2，rf-3，rfi(i)，Rfs(m)，Rk，rk，rk.sup.d(lin)，rn-1rn-2(r r)，rnd，Ro，Sal，sb，sb.sup.ms，sb-2，sb-3，si1，Skdh，s1，Smv，St，Sur，sw-1sW-2，T，t(z-1)，Th-1Th-2，Tm，To，Tor(T)，Tr，tri，trv，Ts，tw，uni，Uni-2，uni.sup.nde，uni.sup.nie，Ur-1，Ur-2，Ur-2.sup.2，Ur-3(Ur-3，Ur-4)，Ur-3.sup.2，Ur-4，(Up-2，Ur-C)，Ur-5，(B-190)，Ur-6(Ur.sub.a，Ur-G)，Ur-7(R.sub.B11)，Ur-8(Up-1)，Ur-9(Ur.
sub.p)，us，V(B1)，v.sup.lae(Cor)，v，var，vi(vir.sub.f)，wb，Wmv，X.sup.su，y和Z。
[0337] Saccharomyces cerevisiae基因的非限制性实例包括：PRE3、PUP1、PUP3、PRE2、PRE10、PRE1、PRE8、SCL1、PUP2、PRE5、PRE7、PRE4、RPT2、RPT3、RPN3、RPN11、RPN12、RPT6、RPN1、RPN2、RPT1、RPT5、RPT4、SKI6、RRP4、DIS3、TSC10、RAT1、GND1、EXO70、ERG10、ACC1、RPP0、ACT1、ARP100、ARP3、PAN1、ARP2、ARP4、ARP9、SPE2、CYR1、ALA1、TPS1、TUB1、ABF1、DED81、NIP1、YHC1、SNU71、ATM1、MAK5、ROK1、DED1、SPB4、AUR1、PSE1、ALG1、TUB2、BPL1、MSL5、ERG24、ERG26、ERG25、CMD1、HCA4、SHE9、SHE10、CAK1、PIS1、CHO1、CDS1、ESR1、NUD1、CDC47、CDC13、CDC37、CDC1、CDC4、CDC20、CDC6、CDC46、CDC3、KAR1、BBP1、HRP1、CCT2、CCT3、HSP10、SMC1、SMC2、CHC1、CFT2、CLP1、COP1、SEC26、SEC27、RET2、SEC21、COF1、CCT4、CCT1、CCT6、SEC24、SEC7、PCF11、RNA15、RNA14、FIP1、YSH1、TFB4、TSM1、APC2、APC5、SEC31、TAF47、TAP42、MPP10、CDC53、CKS1、CDC28、KIN28、CNS1、ERG11、DBP10、DBP8、PRO3、DYS1、ALR1、TID3、DNA2、SSL2、RAD3、RFA3、RFA2、RFA1、RFC4、RFC5、RFC3、RFC2、RFC1、TOP2、RAP1、RPC25、PRI2、PRI1、POL1、POL12、HUS2、CDC2、POL2、DPB2、RPB10、RPA135、RPA190、RPA43、RPB8、RPO26、RPB5、RPC40、RPC19、SRB7、SRB4、RGR1、RPB11、SRB6、RPB2、RPB7、RPO21、RET1、RPO31、RPC31、RPC34、RPC53、RPC82、RPB12、RPB3、DPM1、DIP2、RNT1、CDC8、CDC14、DUT1、UBA2、UBA1、UBC9、CDC34、ENP1、ERD2、SSS1、SEC61、SEC63、SEC62、GNA1、GPI8、DAM1、DUO1、IRR1、PRP3、TIM9、HSH49、SUP35、EXM2、MEX67、ERG9、ERG20、FAS2、FAS1、NOP1、FAD1、AOS1、FBA1、NCB2、BRN1、TUB4、GDI1、GOG5、SRM1、CDC25、SPT16、YIF2、BET4、CDC43、MRS6、BET2、PRO1、GLN1、GLN4、GRS1、YIP1、FOL2、GPA1、CDC42、SAR1、YPT1、SEC4、GSP1、TEM1、RHO1、CDC24、RNA1、GUK1、VMA16、PMA1、HKR1、SIS1、MGE1、HSP60、HSF1、HAS1、MOT3、HTS1、ESA1、HSL7、HOM6、RIB7、SLY1、CSL4、PUR5、CSE1、IPP1、MDM1、USO1、SOF1、MAK11、LAS1、TEL2、DPB11、SGD1、FAL1、MTR3、MTR4、SPP2、SIK1、RRP7、POP4、RRP1、POP3、BFR2、CDC5、NRD1、MET30、MCM6、RRP46、SAS10、SCC2、ECO1、PRP43、BET3、BET5、STN1、NFS1、IDI1、SRP1、KAP95、CBF2、SKP1、CEP3、CTF13、ERG7、KRS1、PSA1、PMI40、ALG2、SSF1、MED7、RSC4、CDC54、MCM2、AFG2、ERG12、MVD1、CDC48、MHP1、ERV1、SSC1、TIM44、TIM17、TIM23、TOM22、TOM40、MAS1、MCD1、MMC1、STU1、JAC1、ABD1、CEG1、PAB1、MTR2、SEC16、ROT1、INO1、MLC1、MYO2、GPI2、SPT14、NAT2、NMT1、TRM1、NCP1、NBP1、ACF2、SPP41、NUT2、LCP5、PRP19、NMD3、RFT1、NNF1、NDC1、CRM1、KAR2、NIP29、NAB2、NIC96、NUP145、NUP49、NUP57、NUP159、NSP1、NUP82、CDC39、NPL4、POP7、NTF2、MAK16、NPL3、NOP2、NOP4、NHP2、NOP10、GAR1、NBP35、WBP1、STT3、SWP1、OST2、OST1、ORC1、ORC6、ORC5、ORC4、ORC3、RRR1、SAT2、PWP2、PEX3、TOR2、PIK1、SEC14、STT4、MSS4、PCM1、GPM1、SEC53、ERG8、YPD1、PAP1、NAB3、RRN7、SEN1、CFT1、PRP11、PRP21、PRP39、PRP24、PRP9、SLU7、PRP28、PRP31、IFH1、PTA1、SUB2、FMI1、MAS2、ESS1、PFY1、POL30、POP1、PDI1、RAM2、CDC7、SMP3、CDC15、YTH1、QRI2、YAE1、SFI1、SEC1、BET1、SEC6、SEC13、SEC2、SEC8、CBF5、CDC19、YRB1、RHC18、DBF4、SDS22、MCM3、CEF1、ALG11、GAA1、MOB1、NIP7、TIP20、SEC5、SEC10、GPI10、RRP3、CDC45、DIB1、MIF2、HOP2、PBN1、NOP5、RPP1、POP5、POP8、POP6、ERO1、MPT1、DNA43、ESP1、SMC3、LST8、STS1、RPM2、RNR1、RNR2、RNR4、RPS20、RPL25、RPL3、RPL30、RPL32、RPL37A、RPL43A、RPL5、RPL10、RPS3、CET1、YRA1、SNM1、GLE1、DBP5、DRS1、DBP6、BRR2、RRN3、RRN6、RRN11、MED6、PRP16、RPR2、DIM1、RRP43、RRP42、RRP45、SEC20、BOS1、CDC12、GLC7、PKC1、IPL1、SGV1、NRK1、RAD53、LCB2、LCB1、MPS1、SES1、SPC3、SEC11、RIO1、ARP7、NEO1、YJU2、POB3、ARH1、IQG1、HRT1、HYM1、MAK21、FUN20、FUN9、NBN1、STB5、YIF1、SMX4、YKT6、SFT1、SMD1、PRP6、LSM2、NUF1、SPC97、SPC42、SPC98、CDC31、SPC19、SPC25、SPC34、SPC24、NUF2、PRP40、MCD4、ERG1、SMC4、CSE4、KRR1、SME1、TRA1、RLP7、SCH9、SMD3、SNP2、SSF2、SPC72、CDC27、CDC23、CDC16、APC1、APC11、APC4、ARC19、RPN6、RPN5、RSC6、RSC8、STH1、SFH1、TIM12、TIM22、TIM10、SQT1、SLS1、JSN1、STU2、SCD5、SSU72、ASM4、SED5、UFE1、SYF1、SYF2、CCT5、TBF1、TOA2、TOA1、SUA7、TAF90、TAF61、TAF25、TAF60、TAF17、TAF145、TAF19、TAF40、TAF67、TFA2、TFA1、FCP1、TFG1、TFG2、TFB1、CCL1、SSL1、TFB3、TFB2、PZF1、BRF1、TFC5、TFC4、TFC3、TFC7、TFC6、TFC1、SPT15、THI80、THS1、SPT6、SPT5、ROX3、REB1、MCM1、MED4、MOT1、MED8、EFB1、YEF3、SUI1、CDC95、TIF11、SUI3、GCD11、SUI2、GCD6、GCD7、GCD2、GCD1、RPG1、GCD10、PRT1、TIF34、CDC33、TIF5、SUP45、GCD14、TIM54、SEC17、TPT1、TRL1、CCA1、SEN54、SEN2、SEN15、SEN34、WRS1、SLN1、TYS1、SNU56、PRP42、CUS1、PRP4、PRP8、SNU114、USS1、UFD1、SMT3、RSP5、QRI1、ALG7、UGP1、VTI1、VAS1、SEC18、CTR86和ZPR1。
[0338] 特别地，本发明提供的病毒可以被修饰为表达抗肿瘤抗体、抗转移基因或者转移阻抑物基因，细胞基质降解基因，激素，生长因子，免疫调节分子包括细胞因子如白细胞介
素或干扰素，趋化因子包括CXC趋化因子，共刺激分子，核酶，转运蛋白，抗体或其片段，反
义RNA，siRNA，microRNA，蛋白质配体，有丝分裂抑制剂蛋白，抗有丝分裂寡肽；抗癌多肽；
抗癌抗生素；血管发生抑制剂；抗肿瘤发生因子；组织因子；前体药物转化酶；用于组织再
生及重新编程人类体细胞为多能性的基因；修饰底物产生可检测产物或信号的酶或者可
被抗体检测的酶；病毒减毒因子；超抗原；可以结合造影剂、生色团或可被检测的化合物或
配体的蛋白质；肿瘤抑制物；细胞毒性蛋白；细胞静止蛋白；用于光学成像或检测的基因包
括萤光素酶、荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)或GFP样蛋白质、红色荧光蛋白(RFP)、远红
外荧光蛋白、近红外荧光蛋白、黄色荧光蛋白(YFP)、橙色荧光蛋白(OFP)、天蓝色荧光蛋白
(CFP)或者蓝色荧光蛋白(BFP)及来自一些蓝细菌和真核藻类的藻胆蛋白包括藻红蛋白
(红色)和藻青蛋白(蓝色)；用于PET成像的基因；用于MRI成像基因，或者改变病毒减毒
的基因。例如，修饰(如插入)本发明提供的病毒的异源基因的实例在表5中示出。
素或干扰素，趋化因子包括CXC趋化因子，共刺激分子，核酶，转运蛋白，抗体或其片段，反
义RNA，siRNA，microRNA，蛋白质配体，有丝分裂抑制剂蛋白，抗有丝分裂寡肽；抗癌多肽；
抗癌抗生素；血管发生抑制剂；抗肿瘤发生因子；组织因子；前体药物转化酶；用于组织再
生及重新编程人类体细胞为多能性的基因；修饰底物产生可检测产物或信号的酶或者可
被抗体检测的酶；病毒减毒因子；超抗原；可以结合造影剂、生色团或可被检测的化合物或
配体的蛋白质；肿瘤抑制物；细胞毒性蛋白；细胞静止蛋白；用于光学成像或检测的基因包
括萤光素酶、荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)或GFP样蛋白质、红色荧光蛋白(RFP)、远红
外荧光蛋白、近红外荧光蛋白、黄色荧光蛋白(YFP)、橙色荧光蛋白(OFP)、天蓝色荧光蛋白
(CFP)或者蓝色荧光蛋白(BFP)及来自一些蓝细菌和真核藻类的藻胆蛋白包括藻红蛋白
(红色)和藻青蛋白(蓝色)；用于PET成像的基因；用于MRI成像基因，或者改变病毒减毒
的基因。例如，修饰(如插入)本发明提供的病毒的异源基因的实例在表5中示出。
[0339] 修饰本发明提供的病毒的异源基因的实例为本领域已知(见例如美国专利申请US2003-0059400、US2003-0228261、US2009-0117034、US2009-0098529、US2009-0053244、
US2009-0081639和US2009-0136917；美国专利7,588,767和7,763,420；及国际专利申请
WO2009/139921)。编码异源蛋白质的基因以修饰本发明提供的病毒毒株的非限制性实例在
下表5中描述。所述基因及其编码的蛋白质的序列由本领域技术人员从文献中可获知。因
此，本发明提供病毒毒株，包括本发明提供的任何克隆病毒，其含有编码表5列出的异源蛋
白质的核苷酸。
US2009-0081639和US2009-0136917；美国专利7,588,767和7,763,420；及国际专利申请
WO2009/139921)。编码异源蛋白质的基因以修饰本发明提供的病毒毒株的非限制性实例在
下表5中描述。所述基因及其编码的蛋白质的序列由本领域技术人员从文献中可获知。因
此，本发明提供病毒毒株，包括本发明提供的任何克隆病毒，其含有编码表5列出的异源蛋
白质的核苷酸。
[0340]
[0341]
[0342]
[0343]
[0344]
[0345]
[0346]
[0347]
[0348]
[0349]
[0350]
[0351]
[0352]
[0353]
[0354] 2.典型的修饰
[0355] a.诊断性基因产物
[0356] 在一些实例中，本发明提供的病毒可表达一或多个另外的基因，其产物是可检测的或其产物能诱导可检测信号。在一些实例中，本发明提供的病毒含有编码可检测蛋白质
或者能诱导可检测信号的蛋白质。这种蛋白质的表达使得可以在体外和体内检测病毒。本
领域已知许多可检测的基因产物，如可检测的蛋白质，可以与本发明提供的病毒一起使用。
或者能诱导可检测信号的蛋白质。这种蛋白质的表达使得可以在体外和体内检测病毒。本
领域已知许多可检测的基因产物，如可检测的蛋白质，可以与本发明提供的病毒一起使用。
[0357] 典型的这种蛋白质是酶，其可以催化可检测的反应或者催化可检测产物的形成，例如萤光素酶，如磕头虫萤光素酶、Renilla萤光素酶、萤火虫萤光素酶或者β-透明质酸
酶(GusA)。这种蛋白质也例如是激发可检测信号的蛋白质，包括荧光蛋白质，如绿色荧光
蛋白(GFP)或者红色荧光蛋白(RFP)。已知编码可激发可检测信号或者可催化可检测反
应的蛋白质如发光蛋白或荧光蛋白质的许多DNA序列，可以用于本发明提供的病毒和方法
中。典型的编码发光蛋白质的基因包括例如来自哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)细菌萤光素
酶(Belas et al.，Science218(1982)，791-793)、来自Vibrio fischerii 的细菌萤光素酶
(Foran and Brown，Nucleic acids Res.16(1988)，177)、萤火虫萤光素酶(de Wet et al.，
Mol.Cell.Biol.7(1987)，725-737)、来自维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的
水母发光蛋白(Prasher et al.，Biochem.26(1987)，1326-1332)、来自Renilla renformis
的Renilla萤光素酶(Lorenz et al，PNAS USA88(1991)，4438-4442)及来自维多利亚多
管发光水母的绿色荧光蛋白(Prasher et al.，Gene111：229-233(1987))的基因。细菌萤
光素酶的luxA和luxB基因可以融合以产生融合基因(Fab2)，其可以表达产生完全功能的
萤光素酶蛋白(Escher et al.，PNAS86：6528-6532(1989))。这些基因在病毒中的转化和
表达可以允许例如通过使用弱光和/或荧光成像相机来检测病毒感染。在一些实例中，由
病毒表达的萤光素酶可需要外源加入的用于发光的底物如癸醛或腔肠素。在其它实例中，
病毒可以表达完整的lux操纵子，其可包括可提供萤光素酶底物如癸醛的蛋白质。例如，当
将含有完全lux操纵子序列的病毒经腹膜内、肌肉或静脉内注射时，使得可以对其在活的
小鼠中进行微生物的观测和定位，这表示萤光素酶光发射可以进入组织及可以在外部检测
(Contag et al.(1995)Mol.Microbiol.18：593-603)。
酶(GusA)。这种蛋白质也例如是激发可检测信号的蛋白质，包括荧光蛋白质，如绿色荧光
蛋白(GFP)或者红色荧光蛋白(RFP)。已知编码可激发可检测信号或者可催化可检测反
应的蛋白质如发光蛋白或荧光蛋白质的许多DNA序列，可以用于本发明提供的病毒和方法
中。典型的编码发光蛋白质的基因包括例如来自哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)细菌萤光素
酶(Belas et al.，Science218(1982)，791-793)、来自Vibrio fischerii 的细菌萤光素酶
(Foran and Brown，Nucleic acids Res.16(1988)，177)、萤火虫萤光素酶(de Wet et al.，
Mol.Cell.Biol.7(1987)，725-737)、来自维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的
水母发光蛋白(Prasher et al.，Biochem.26(1987)，1326-1332)、来自Renilla renformis
的Renilla萤光素酶(Lorenz et al，PNAS USA88(1991)，4438-4442)及来自维多利亚多
管发光水母的绿色荧光蛋白(Prasher et al.，Gene111：229-233(1987))的基因。细菌萤
光素酶的luxA和luxB基因可以融合以产生融合基因(Fab2)，其可以表达产生完全功能的
萤光素酶蛋白(Escher et al.，PNAS86：6528-6532(1989))。这些基因在病毒中的转化和
表达可以允许例如通过使用弱光和/或荧光成像相机来检测病毒感染。在一些实例中，由
病毒表达的萤光素酶可需要外源加入的用于发光的底物如癸醛或腔肠素。在其它实例中，
病毒可以表达完整的lux操纵子，其可包括可提供萤光素酶底物如癸醛的蛋白质。例如，当
将含有完全lux操纵子序列的病毒经腹膜内、肌肉或静脉内注射时，使得可以对其在活的
小鼠中进行微生物的观测和定位，这表示萤光素酶光发射可以进入组织及可以在外部检测
(Contag et al.(1995)Mol.Microbiol.18：593-603)。
[0358] 典型的可检测蛋白质也包括可结合造影剂、细胞色素或者可被检测的化合物或配体的蛋白质，如运铁蛋白受体或铁蛋白；及报道蛋白，如大肠杆菌β-半乳糖苷酶、β-葡糖
苷酸酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)。
苷酸酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)。
[0359] 可检测的蛋白质也例如是可特异性结合可检测的化合物的基因产物，包括但不限于受体，金属结合蛋白(例如含铁细胞，铁蛋白，运铁蛋白受体)，配体结合蛋白和抗体。可
检测的蛋白质也可例如是可结合并转运可检测分子的转运蛋白。这种分子可用于检测病
毒，如用于成像。可以使用任何多种的可检测化合物，可以通过任何已知成像方法成像。典
型的化合物包括受体配体和抗体的抗原。所述配体可以根据使用的成像方法标记。典型
的成像方法包括但不限于X-线照相，磁共振方法，如磁共振成像(MRI)和磁共振光谱分析
(MRS)，及X线断层成像法，包括计算机断层摄影术(CT)、计算机控制轴向X线断层摄影术
(CAT)、电子束计算断层摄影术(EBCT)、高分辨率计算机断层X射线照相术(HRCT)、内摆线
断层X射线照相术(hypocycloidal tomography)、正电子成像术(PET)、单光子发射计算机
断层扫描(SPECT)、螺旋计算机断层扫描和超声断层扫描。
检测的蛋白质也可例如是可结合并转运可检测分子的转运蛋白。这种分子可用于检测病
毒，如用于成像。可以使用任何多种的可检测化合物，可以通过任何已知成像方法成像。典
型的化合物包括受体配体和抗体的抗原。所述配体可以根据使用的成像方法标记。典型
的成像方法包括但不限于X-线照相，磁共振方法，如磁共振成像(MRI)和磁共振光谱分析
(MRS)，及X线断层成像法，包括计算机断层摄影术(CT)、计算机控制轴向X线断层摄影术
(CAT)、电子束计算断层摄影术(EBCT)、高分辨率计算机断层X射线照相术(HRCT)、内摆线
断层X射线照相术(hypocycloidal tomography)、正电子成像术(PET)、单光子发射计算机
断层扫描(SPECT)、螺旋计算机断层扫描和超声断层扫描。
[0360] 适于X-线照相的标记为本领域已知，包括例如铋(III)，金(III)，镧(III)或铅67 67 68 111 113 123 125 131 197 203 186 188
(II)；放射性离子，如 铜、 镓、镓、 铟、 铟、 碘、 碘、 碘、 汞、 汞、 铼、
97 103 99 90
铼、铷、 铷、锝、钇；核磁顺磁共振同位素，如钴(II)、铜(II)、铬(III)、镝(III)、铒
(III)、钆(III)、钬(III)、铁(II)、铁(III)、锰(II)、钕(III)、镍(II)、钐(III)、铽(III)、钒(II)或者镱(III)；或者罗丹明或荧光素。
(II)；放射性离子，如 铜、 镓、镓、 铟、 铟、 碘、 碘、 碘、 汞、 汞、 铼、
97 103 99 90
铼、铷、 铷、锝、钇；核磁顺磁共振同位素，如钴(II)、铜(II)、铬(III)、镝(III)、铒
(III)、钆(III)、钬(III)、铁(II)、铁(III)、锰(II)、钕(III)、镍(II)、钐(III)、铽(III)、钒(II)或者镱(III)；或者罗丹明或荧光素。
[0361] 适于磁共振成像的标记为本领域所已知，包括例如钆螯合剂和铁氧化物。螯合剂在造影剂中的应用为本领域所已知。适用于X线断层成像法的标记物为本领域所已知，包
11 13 15 64 123
括例如β-射线发射物如 C、N、O或 Cu，或者γ-射线发射物如 I。可以用作如PET
55 67 68 60 67 57 52 18
追踪物的其它典型的放射性同位素 Co、Ga、Ga、Cu(II)、Cu(II)、Ni、Fe和 F(例
18 64
如 F-氟脱氧葡萄糖(FDG))。典型的可用的放射性同位素标记的物质是 Cu-标记的工
64
程化抗体片段(Wu et al.(2002)PNAS USA97：8495-8500)、Cu-标记的生长激素抑制素
64
(Lewis et al.(1999)J.Med.Chem.42：1341-1347)、Cu-丙酮双脒腙(N4-甲基缩氨基硫
64 52
脲)( Cu-PTSM)(Adonai et al.(2002)PNAS USA99：3030-3035)、Fe-柠檬酸盐(Leenders
52 52m
et al.(1994)J.Neural.Transm.Suppl.43：123-132)、Fe/ Mn-柠檬酸盐(Calonder et
52
al.(1999)J.Neurochem.73：2047-2055)和 Fe-标记的铁(III)氢氧化物-蔗糖复合物
(Beshara et al.(1999)Br.J.Haematol.104：288-295,296-302)。
11 13 15 64 123
括例如β-射线发射物如 C、N、O或 Cu，或者γ-射线发射物如 I。可以用作如PET
55 67 68 60 67 57 52 18
追踪物的其它典型的放射性同位素 Co、Ga、Ga、Cu(II)、Cu(II)、Ni、Fe和 F(例
18 64
如 F-氟脱氧葡萄糖(FDG))。典型的可用的放射性同位素标记的物质是 Cu-标记的工
64
程化抗体片段(Wu et al.(2002)PNAS USA97：8495-8500)、Cu-标记的生长激素抑制素
64
(Lewis et al.(1999)J.Med.Chem.42：1341-1347)、Cu-丙酮双脒腙(N4-甲基缩氨基硫
64 52
脲)( Cu-PTSM)(Adonai et al.(2002)PNAS USA99：3030-3035)、Fe-柠檬酸盐(Leenders
52 52m
et al.(1994)J.Neural.Transm.Suppl.43：123-132)、Fe/ Mn-柠檬酸盐(Calonder et
52
al.(1999)J.Neurochem.73：2047-2055)和 Fe-标记的铁(III)氢氧化物-蔗糖复合物
(Beshara et al.(1999)Br.J.Haematol.104：288-295,296-302)。
[0362] 典型的可检测的蛋白质是可结合并转运可检测分子的转运蛋白，如人肾上腺素转运蛋白(hNET)或者碘化钠同向转运蛋白(NIS)，其可结合并转运可检测分子进入细胞中，
125
如MIBG及其它标记的分子(例如Na I)。
125
如MIBG及其它标记的分子(例如Na I)。
[0363] 其它典型的可检测蛋白质是由红色素合成基因表达的蛋白质。已知许多基因参与黑色素生物合成(见例如Simon et al.(2009)Pigment Cell Melanoma Res，22：563-79)。
黑色素是一种色素，可以再分为棕色/黑色真黑素和红褐色嗜黑色素。典型的这种基因包
括但不限于小鼠酪氨酸酶(mTYR)、人酪氨酸酶相关蛋白1(tyrp1)和人多巴色素互变异构
酶/酪氨酸酶相关蛋白2(DC2)。表达黑色素合成基因的病毒可用于感染宿主或细胞，以获
得在整个可见光谱具有高亮吸光率的细胞。所得细胞或动物可以用能检测整个可见光谱
的高亮吸光率和/或交叉不同的渗透评分的任何成像系统成像。例如，可以使用(多谱)
光-/光声X线断层摄影术-(MS)OAT(见例如Ntziachristos (2010)Nature Methods，7：
603-14；Li et al.(2007)J Biomed Optics Letters，12：1-3).
黑色素是一种色素，可以再分为棕色/黑色真黑素和红褐色嗜黑色素。典型的这种基因包
括但不限于小鼠酪氨酸酶(mTYR)、人酪氨酸酶相关蛋白1(tyrp1)和人多巴色素互变异构
酶/酪氨酸酶相关蛋白2(DC2)。表达黑色素合成基因的病毒可用于感染宿主或细胞，以获
得在整个可见光谱具有高亮吸光率的细胞。所得细胞或动物可以用能检测整个可见光谱
的高亮吸光率和/或交叉不同的渗透评分的任何成像系统成像。例如，可以使用(多谱)
光-/光声X线断层摄影术-(MS)OAT(见例如Ntziachristos (2010)Nature Methods，7：
603-14；Li et al.(2007)J Biomed Optics Letters，12：1-3).
[0364] 对病毒可以进行修饰以达到使用病毒成像的目的，包括在体外和/或体内双重成像目的，以检测两或多种可检测的基因产物、产生可检测信号的基因产物、可结合可检测化
合物的基因产物，或者可结合其它分子形成可检测产物的基因产物。在一些实例中，所述两
或多种基因产物由不同的病毒表达，而在其它实例中，所述两或多种基因产物是由相同病
毒产生的。例如，病毒可表达发出可检测信号的基因产物，及也表达催化可检测反应的基
因产物。在其它实例中，病毒可表达发出可检测信号的一或多种基因产物，催化可检测反应
的一或多种基因产物，可结合可检测化合物或者可以形成可检测产物的一或多种及基因产
物，或者其任意组合。这种基因产物的任意组合可以由本发明提供的病毒表达，并可以与本
发明提供的任何方法组合使用。可以例如通过如本文所述和本领域已知的各种成像方法对
这种基因产物成像(例如荧光成像、MRI、PET及许多其它检测方法)。基因产物的成像也
可以使用相同方法进行，通过其性质区分基因产物，如通过发出的光的波长差异而区分。例
如，一种病毒可表达发出的光波长不同的一种以上的荧光蛋白(例如GFP和RFP)。在另一
非限制性实例中，RFP可以与萤光素酶一起表达。在其它非限制性实例中，荧光基因产物可
以与用于磁共振成像的基因产物一起表达，如铁蛋白或运铁蛋白受体。表达两或多种可检
测基因产物的一种病毒或者表达两或多种可检测的基因产物的两或多种病毒可以使用这
种方法在体外或体内成像。在一些实例中，所述两或多种基因产物表达为单一多肽，如融合
蛋白。例如，荧光蛋白可以与萤光素酶蛋白表达为融合蛋白。
合物的基因产物，或者可结合其它分子形成可检测产物的基因产物。在一些实例中，所述两
或多种基因产物由不同的病毒表达，而在其它实例中，所述两或多种基因产物是由相同病
毒产生的。例如，病毒可表达发出可检测信号的基因产物，及也表达催化可检测反应的基
因产物。在其它实例中，病毒可表达发出可检测信号的一或多种基因产物，催化可检测反应
的一或多种基因产物，可结合可检测化合物或者可以形成可检测产物的一或多种及基因产
物，或者其任意组合。这种基因产物的任意组合可以由本发明提供的病毒表达，并可以与本
发明提供的任何方法组合使用。可以例如通过如本文所述和本领域已知的各种成像方法对
这种基因产物成像(例如荧光成像、MRI、PET及许多其它检测方法)。基因产物的成像也
可以使用相同方法进行，通过其性质区分基因产物，如通过发出的光的波长差异而区分。例
如，一种病毒可表达发出的光波长不同的一种以上的荧光蛋白(例如GFP和RFP)。在另一
非限制性实例中，RFP可以与萤光素酶一起表达。在其它非限制性实例中，荧光基因产物可
以与用于磁共振成像的基因产物一起表达，如铁蛋白或运铁蛋白受体。表达两或多种可检
测基因产物的一种病毒或者表达两或多种可检测的基因产物的两或多种病毒可以使用这
种方法在体外或体内成像。在一些实例中，所述两或多种基因产物表达为单一多肽，如融合
蛋白。例如，荧光蛋白可以与萤光素酶蛋白表达为融合蛋白。
[0365] b.治疗性基因产物
[0366] 本发明提供的病毒也可含有异源核酸分子，其编码一或多种治疗性基因产物。治疗性基因产物包括导致细胞死亡或者导致抗肿瘤免疫应答的产物。许多治疗性基因产物如
毒性或细胞凋亡蛋白或者siRNA为本领域所已知，并可以与本发明提供的病毒一起应用。
所述治疗性基因可以通过直接杀死宿主细胞而起作用，例如作为通道形成蛋白或其他裂解
蛋白，或者通过触发细胞凋亡，或者通过抑制必要的细胞过程，或者通过触发针对所述细胞
的免疫应答，或者通过与具有相似作用的化合物相互作用(例如通过将低活性的化合物转
变为胞毒性化合物)而起作用。
毒性或细胞凋亡蛋白或者siRNA为本领域所已知，并可以与本发明提供的病毒一起应用。
所述治疗性基因可以通过直接杀死宿主细胞而起作用，例如作为通道形成蛋白或其他裂解
蛋白，或者通过触发细胞凋亡，或者通过抑制必要的细胞过程，或者通过触发针对所述细胞
的免疫应答，或者通过与具有相似作用的化合物相互作用(例如通过将低活性的化合物转
变为胞毒性化合物)而起作用。
[0367] 可以由本发明提供的病毒表达的典型的治疗性基因产物包括但不限于基因产物(即蛋白质和RNA)，包括可用于肿瘤治疗的那些基因产物，例如但不限于抗癌剂、抗转移剂
或者抗血管发生剂。例如，可用于肿瘤治疗的典型的蛋白质包括但不限于肿瘤阻抑物、抑细
胞生长蛋白和共刺激分子，如细胞因子、趋化因子，或者其它免疫调节分子、抗癌抗体如单
链抗体、反义RNA、siRNA、前药转换酶、毒素、有丝分裂抑制剂蛋白、抗肿瘤寡肽、抗癌多肽抗生素、血管发生抑制剂或者组织因子。例如，可以被表达以在本发明的病毒和方法中治疗
肿瘤的大量治疗性蛋白为本领域已知，包括但不限于转运蛋白、细胞表面受体、细胞因子、
趋化因子、细胞凋亡蛋白、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗血管发生因子(例如
hk5)、血管发生抑制剂(例如纤溶酶原kringle5结构域、抗血管内皮生长因子(VEGF)scAb，
tTF-RGD、截短的人组织因子-αvβ3-整联蛋白RGD肽融合蛋白)、抗癌抗体如单链抗体(例
如抗肿瘤抗体或抗血管发生抗体，如抗-VEGF抗体或抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体)、毒
素、肿瘤抗原、前药转换酶、核酶、RNAi和siRNA。
或者抗血管发生剂。例如，可用于肿瘤治疗的典型的蛋白质包括但不限于肿瘤阻抑物、抑细
胞生长蛋白和共刺激分子，如细胞因子、趋化因子，或者其它免疫调节分子、抗癌抗体如单
链抗体、反义RNA、siRNA、前药转换酶、毒素、有丝分裂抑制剂蛋白、抗肿瘤寡肽、抗癌多肽抗生素、血管发生抑制剂或者组织因子。例如，可以被表达以在本发明的病毒和方法中治疗
肿瘤的大量治疗性蛋白为本领域已知，包括但不限于转运蛋白、细胞表面受体、细胞因子、
趋化因子、细胞凋亡蛋白、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗血管发生因子(例如
hk5)、血管发生抑制剂(例如纤溶酶原kringle5结构域、抗血管内皮生长因子(VEGF)scAb，
tTF-RGD、截短的人组织因子-αvβ3-整联蛋白RGD肽融合蛋白)、抗癌抗体如单链抗体(例
如抗肿瘤抗体或抗血管发生抗体，如抗-VEGF抗体或抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体)、毒
素、肿瘤抗原、前药转换酶、核酶、RNAi和siRNA。
[0368] 用于本发明提供的方法中的共刺激分子包括在体内和/或体外能增强对于抗原/致病原的免疫应答的任何分子。共刺激分子也涵盖促进淋巴细胞和/或其功能对于免疫应
答是重要的或必需的细胞的激活、增殖、分化、成熟或维持的任何分子。
答是重要的或必需的细胞的激活、增殖、分化、成熟或维持的任何分子。
[0369] 治疗性蛋白质非限制性实例包括肿瘤生长阻抑物如IL-24、WT1、p53、假单胞菌A内毒素、白喉毒素、Arf、Bax、HSV TK、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶、血管新生抑制素和内皮
抑素、p16、Rb、BRCA1、囊性纤维化跨膜调节传导调节蛋白(CFTR)、因子VIII、低密度脂蛋白
受体、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、胰岛素、甲状旁腺素、α-1-抗胰
蛋白酶、rsCD40L、Fas-配体、TRAIL、TNF、抗体、微生物素E492、白喉毒素、假单胞菌外毒素、大肠杆菌Shiga毒素、大肠杆菌志贺样毒素(Verotoxin)1和贯叶金丝桃素(hyperforin)。
典型的细胞因子包括但不限于趋化因子和经典细胞因子，如白细胞介素、包括如白细胞
介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-6和白细胞介素-12、肿瘤坏死因子如肿瘤坏死因
子-α(TNF-α)、干扰素如干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、
红细胞生成素，典型的趋化因子包括但不限于CXC趋化因子如IL-8GROα、GROβ、GROγ、
ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1α/β、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1；
CC趋化因子如MIP-1α、MIP-1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸粒细胞趋化蛋白(Eotaxin)、Eotaxin-2/MPIF-2、I-309、MIP-5/HCC-2、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC；淋巴细胞趋化因子；及fractalkine。典型的其它共刺激分子包括细胞因子的免疫球蛋白超家族，如B7.1、B7.2。
抑素、p16、Rb、BRCA1、囊性纤维化跨膜调节传导调节蛋白(CFTR)、因子VIII、低密度脂蛋白
受体、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、胰岛素、甲状旁腺素、α-1-抗胰
蛋白酶、rsCD40L、Fas-配体、TRAIL、TNF、抗体、微生物素E492、白喉毒素、假单胞菌外毒素、大肠杆菌Shiga毒素、大肠杆菌志贺样毒素(Verotoxin)1和贯叶金丝桃素(hyperforin)。
典型的细胞因子包括但不限于趋化因子和经典细胞因子，如白细胞介素、包括如白细胞
介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-6和白细胞介素-12、肿瘤坏死因子如肿瘤坏死因
子-α(TNF-α)、干扰素如干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、
红细胞生成素，典型的趋化因子包括但不限于CXC趋化因子如IL-8GROα、GROβ、GROγ、
ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1α/β、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1；
CC趋化因子如MIP-1α、MIP-1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸粒细胞趋化蛋白(Eotaxin)、Eotaxin-2/MPIF-2、I-309、MIP-5/HCC-2、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC；淋巴细胞趋化因子；及fractalkine。典型的其它共刺激分子包括细胞因子的免疫球蛋白超家族，如B7.1、B7.2。
[0370] 可以由本发明提供的病毒表达及用于本发明提供的方法中的治疗性蛋白质例如包括但不限于红细胞生成素(例如SEQ ID NO：329)、抗-VEGF单链抗体(例如SEQ ID NO：
21)、纤溶酶原K5结构域(例如SEQ ID NO：190)、人组织因子-αvβ3-整联蛋白RGD融
合蛋白(例如SEQ ID NO：14)、白细胞介素-24(例如SEQ ID NO：98)或者免疫刺激物如
SIL-6-SIL-6受体融合蛋白(例如SEQ ID NO：97)。
21)、纤溶酶原K5结构域(例如SEQ ID NO：190)、人组织因子-αvβ3-整联蛋白RGD融
合蛋白(例如SEQ ID NO：14)、白细胞介素-24(例如SEQ ID NO：98)或者免疫刺激物如
SIL-6-SIL-6受体融合蛋白(例如SEQ ID NO：97)。
[0371] 在一些实例中，本发明提供的病毒可表达一或多种治疗性基因产物，其是将低活性化合物转变为导致肿瘤细胞死亡的化合物的蛋白质。这种前药化合物的转变方法例如
包括包括酶转变和光解转变方法。许多蛋白质/化合物对为本领域所已知，包括但不限于
单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦、单纯疱疹病毒胸苷激酶/(E)-5-(2-溴乙烯)-2′-脱
氧尿苷(BVDU)、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦、水痘-带状疱疹病毒胸苷激
酶/BVDU、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶/(E)-5-(2-溴乙烯)-1-β-D阿糖呋喃-尿嘧
啶(BVaraU)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶、嘌呤核苷磷酸化
酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷、β-内酰胺酶/头孢菌素-阿霉素、羧肽酶G2/4-[(2-氯乙基)
(2-甲磺酰氧基乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸(CMDA)、羧肽酶A/氨甲喋呤-苯胺、细胞
色素P450/对乙酰氨基酚、细胞色素P450-2B1/环磷酰胺、细胞色素P450-4B1/2-蒽胺、
4-甘薯苦醇(ipomeanol)、辣根过氧化物酶/吲哚-3-乙酸、硝基还原酶/CB1954、兔羧酸
酯酶/7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]羰基氧基喜树碱(CPT-11)、蘑菇酪氨
酸酶/双-(2-氯乙基)氨基-4-羟苯基氨基甲酮28、β-半乳糖苷酶/1-氯甲基-5-羟
基-1，2-二氢-3H-苯基吲哚、β-葡糖苷酸酶/表柔比星(epirubicin)-葡糖苷酸、胸苷
磷酸化酶/5’-脱氧5-氟尿苷、脱氧胞苷激酶/胞嘧啶阿拉伯糖苷及linamerase/亚麻苦
苷(linamerin)。
包括包括酶转变和光解转变方法。许多蛋白质/化合物对为本领域所已知，包括但不限于
单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦、单纯疱疹病毒胸苷激酶/(E)-5-(2-溴乙烯)-2′-脱
氧尿苷(BVDU)、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦、水痘-带状疱疹病毒胸苷激
酶/BVDU、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶/(E)-5-(2-溴乙烯)-1-β-D阿糖呋喃-尿嘧
啶(BVaraU)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶、嘌呤核苷磷酸化
酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷、β-内酰胺酶/头孢菌素-阿霉素、羧肽酶G2/4-[(2-氯乙基)
(2-甲磺酰氧基乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸(CMDA)、羧肽酶A/氨甲喋呤-苯胺、细胞
色素P450/对乙酰氨基酚、细胞色素P450-2B1/环磷酰胺、细胞色素P450-4B1/2-蒽胺、
4-甘薯苦醇(ipomeanol)、辣根过氧化物酶/吲哚-3-乙酸、硝基还原酶/CB1954、兔羧酸
酯酶/7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]羰基氧基喜树碱(CPT-11)、蘑菇酪氨
酸酶/双-(2-氯乙基)氨基-4-羟苯基氨基甲酮28、β-半乳糖苷酶/1-氯甲基-5-羟
基-1，2-二氢-3H-苯基吲哚、β-葡糖苷酸酶/表柔比星(epirubicin)-葡糖苷酸、胸苷
磷酸化酶/5’-脱氧5-氟尿苷、脱氧胞苷激酶/胞嘧啶阿拉伯糖苷及linamerase/亚麻苦
苷(linamerin)。
[0372] 可以由本发明提供的病毒表达的其它治疗性基因产物包括siRNA和microRNA分子。所述siRNA和/或microRNA分子可针对肿瘤促进基因的表达，所述基因例如但不限于
致癌基因、生长因子、血管发生促进基因或者受体。所述siRNA分子和/或microRNA还可以
针对细胞生长、细胞复制或细胞存活的任何必需基因的表达。所述siRNA和/或microRNA
分子也可以针对稳定细胞膜或者另外限制从肿瘤细胞中释放的肿瘤细胞抗原数目的任何
基因。根据siRNA的选择的靶，可易于确定siRNA或microRNA的设计；本领域已知siRNA
和microRNA设计和基因下调的方法，如美国专利出版物20030198627和2007-0044164以
及Zeng et al.，Molecular Cell9：1327-1333(2002)中例证。
致癌基因、生长因子、血管发生促进基因或者受体。所述siRNA分子和/或microRNA还可以
针对细胞生长、细胞复制或细胞存活的任何必需基因的表达。所述siRNA和/或microRNA
分子也可以针对稳定细胞膜或者另外限制从肿瘤细胞中释放的肿瘤细胞抗原数目的任何
基因。根据siRNA的选择的靶，可易于确定siRNA或microRNA的设计；本领域已知siRNA
和microRNA设计和基因下调的方法，如美国专利出版物20030198627和2007-0044164以
及Zeng et al.，Molecular Cell9：1327-1333(2002)中例证。
[0373] 治疗性基因产物包括病毒减毒因子，如抗病毒蛋白。抗病毒蛋白或肽可以由本发明提供的病毒表达。抗病毒蛋白或肽的表达可以控制病毒致病原性。典型的病毒减毒因子
包括但不限于病毒特异性抗体、粘液素、血小板反应蛋白及可溶的蛋白质，如细胞因子，包
括但不限于TNFα、干扰素(例如IFNα、IFNβ或IFNγ)及白细胞介素(例如IL-1、IL-12
或IL-18)。
包括但不限于病毒特异性抗体、粘液素、血小板反应蛋白及可溶的蛋白质，如细胞因子，包
括但不限于TNFα、干扰素(例如IFNα、IFNβ或IFNγ)及白细胞介素(例如IL-1、IL-12
或IL-18)。
[0374] 可以由本发明提供的病毒表达的另一典型的治疗性基因产物是蛋白质配体，如抗肿瘤寡肽。抗肿瘤寡肽是与肿瘤具有高亲和性和特异性的短蛋白质肽。这种寡肽可
以使用肿瘤相关的噬菌体文库富集和鉴别(Akita et al.(2006)Cancer Sci.97(10)：
1075-1081)。这些寡肽已经示出增强化疗作用(美国专利号4,912,199)。所述寡肽
可以由本发明提供的病毒表达。寡肽的表达可独自或者组合其它化疗剂一起激发抗
癌活性。典型的抗肿瘤寡肽是抗有丝分裂肽，包括但不限于tubulysin(Khalil et
al.(2006)Chembiochem.7(4)：678-683)、phomopsin、哈米特林(hemiasterlin)、滔妥布林
(taltobulin)(HTI-286,3)及cryptophycin。Tubulysin来自粘细菌，可诱导细胞微管损耗
及触发细胞凋亡过程。抗有丝分裂肽可以由本发明提供的病毒表达，其独自或者与其它治
疗模式组合激发抗癌活性。
以使用肿瘤相关的噬菌体文库富集和鉴别(Akita et al.(2006)Cancer Sci.97(10)：
1075-1081)。这些寡肽已经示出增强化疗作用(美国专利号4,912,199)。所述寡肽
可以由本发明提供的病毒表达。寡肽的表达可独自或者组合其它化疗剂一起激发抗
癌活性。典型的抗肿瘤寡肽是抗有丝分裂肽，包括但不限于tubulysin(Khalil et
al.(2006)Chembiochem.7(4)：678-683)、phomopsin、哈米特林(hemiasterlin)、滔妥布林
(taltobulin)(HTI-286,3)及cryptophycin。Tubulysin来自粘细菌，可诱导细胞微管损耗
及触发细胞凋亡过程。抗有丝分裂肽可以由本发明提供的病毒表达，其独自或者与其它治
疗模式组合激发抗癌活性。
[0375] 可以由本发明提供的病毒表达的治疗性基因产物的另一实例是螯合肿瘤生长所需分子或营养素的蛋白质。例如，所述病毒可表达结合铁、转运铁或者贮存铁或者其组合的
一或多种蛋白质。通过这种蛋白质的表达增加的铁吸收和/或贮存不仅增强病毒积累的肿
瘤或组织的观测和检测的对比度，而且还从肿瘤环境中消耗铁。肿瘤环境中铁的消耗从肿
瘤中除去关键营养素，从而下调肿瘤细胞中的铁止血(iron hemostasis)，及延缓肿瘤进展
和/或杀死肿瘤。
一或多种蛋白质。通过这种蛋白质的表达增加的铁吸收和/或贮存不仅增强病毒积累的肿
瘤或组织的观测和检测的对比度，而且还从肿瘤环境中消耗铁。肿瘤环境中铁的消耗从肿
瘤中除去关键营养素，从而下调肿瘤细胞中的铁止血(iron hemostasis)，及延缓肿瘤进展
和/或杀死肿瘤。
[0376] 此外，铁或者其它标记的金属可以单独或以缀合形式被施用至携带肿瘤的对象。铁缀合物可包括如与成像部分(imaging moiety)或治疗剂缀合的铁。在一些情况中，所述
成像部分和治疗剂是相同的，如放射性同位素。铁在肿瘤、伤口、炎症或感染区域的内在化
使得单独的铁、补加的成像部分或者治疗剂内在化(其可以输送特异于肿瘤细胞的细胞毒
性或者输送治疗剂以治疗伤口、炎症或感染区域)。这些方法可以与本发明提供的其它任何
方法组合使用。
成像部分和治疗剂是相同的，如放射性同位素。铁在肿瘤、伤口、炎症或感染区域的内在化
使得单独的铁、补加的成像部分或者治疗剂内在化(其可以输送特异于肿瘤细胞的细胞毒
性或者输送治疗剂以治疗伤口、炎症或感染区域)。这些方法可以与本发明提供的其它任何
方法组合使用。
[0377] c.抗原
[0378] 本发明提供的病毒可以修饰为表达一或多种抗原。典型的抗原包括但不限于肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原和有丝分裂原。超抗原是可激活巨大免疫应答的抗原，通常引
起T细胞的巨大应答。本领域已知众多的超抗原，包括但非限于白喉毒素、葡萄球菌肠毒素
(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEE和SEH)、毒性休克综合征毒素1、剥脱性毒素(EXft)、链球
菌高热性外毒素A、B和C(SPE A，B和C)、小鼠乳腺肿瘤病毒蛋白(MMTV)、链球菌M蛋白、产
气荚膜梭菌肠毒素(CPET)、单核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)抗原p60，
及支原体关节炎超抗原。
起T细胞的巨大应答。本领域已知众多的超抗原，包括但非限于白喉毒素、葡萄球菌肠毒素
(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEE和SEH)、毒性休克综合征毒素1、剥脱性毒素(EXft)、链球
菌高热性外毒素A、B和C(SPE A，B和C)、小鼠乳腺肿瘤病毒蛋白(MMTV)、链球菌M蛋白、产
气荚膜梭菌肠毒素(CPET)、单核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)抗原p60，
及支原体关节炎超抗原。
[0379] 由于许多超抗原也是毒素，如果毒性降低的病毒的表达是需要的，则所述超抗原可以修饰为保留至少一些其超抗原性而毒性降低，产生如类毒素的化合物。本领域已知许
多重组的超抗原和超抗原的类毒素，其可易于在本发明提供的病毒中表达。类毒素例如包
括白喉毒素的类毒素，如美国专利6,455,673所例证，及葡萄球菌肠毒素的类毒素，如美国
专利出版物2003-0009015所例证。
多重组的超抗原和超抗原的类毒素，其可易于在本发明提供的病毒中表达。类毒素例如包
括白喉毒素的类毒素，如美国专利6,455,673所例证，及葡萄球菌肠毒素的类毒素，如美国
专利出版物2003-0009015所例证。
[0380] d.改变病毒减毒性的修饰
[0381] 本发明的病毒可以通过在病毒基因组中的添加、缺失和/或修饰核酸而进一步减毒。在一个实例中，所述病毒通过添加异源核酸而减毒，所述核酸含有编码一或多个基因
产物的开放读框(例如本文别处所述的诊断性基因产物或者治疗性基因产物)。在另一
实例中，所述病毒通过修饰异源核酸而被减毒，所述核酸含有编码一或多个基因产物的开
放读框。在进一步的实例中，异源核酸通过增加开放读框的长度、除去所有或部分开放读
框或者置换所有或部分开放读框而被修饰。这种修饰可通过破坏一或多个病毒基因或者
通过增加或降低病毒上的转录和/或翻译荷载而影响病毒毒性(见例如国际专利公开号
WO2008/100292)。
产物的开放读框(例如本文别处所述的诊断性基因产物或者治疗性基因产物)。在另一
实例中，所述病毒通过修饰异源核酸而被减毒，所述核酸含有编码一或多个基因产物的开
放读框。在进一步的实例中，异源核酸通过增加开放读框的长度、除去所有或部分开放读
框或者置换所有或部分开放读框而被修饰。这种修饰可通过破坏一或多个病毒基因或者
通过增加或降低病毒上的转录和/或翻译荷载而影响病毒毒性(见例如国际专利公开号
WO2008/100292)。
[0382] 在另一实例中，所述病毒可以通过修饰或置换病毒中含有的一或多个启动子而减毒。这种启动子可以由更强或更弱的启动子置换，其中置换导致病毒减毒的改变。在一个
实例中，本发明提供的病毒的启动子用天然启动子置换。在一个实例中，本发明提供的病毒
启动子用合成的启动子置换。可以置换病毒中含有的启动子的典型的启动子可以是病毒启
动子，如痘苗病毒启动子，及可包括痘苗病毒早期、中期、早期/晚期或者晚期启动子。另外
的典型的病毒启动子在本文提供且为本领域已知，可用于置换病毒中含有的启动子。
实例中，本发明提供的病毒的启动子用天然启动子置换。在一个实例中，本发明提供的病毒
启动子用合成的启动子置换。可以置换病毒中含有的启动子的典型的启动子可以是病毒启
动子，如痘苗病毒启动子，及可包括痘苗病毒早期、中期、早期/晚期或者晚期启动子。另外
的典型的病毒启动子在本文提供且为本领域已知，可用于置换病毒中含有的启动子。
[0383] 在另一实例中，所述病毒可以通过除去病毒中含有的全部或部分异源核酸而减毒。除去的异源核酸部分可以是1、2、3、4、5或更多个、10或更多个、15或更多个、20或更多个、50或更多个、100或更多个、1000或更多个、5000或更多个核苷酸碱基。在另一实例中，
所述病毒通过以下方式修饰病毒中包含的异源核酸而减毒，即通过除去全部或部分第一个
异源核酸分子及用第二个异源核酸分子置换，其中所述置换改变病毒减毒水平。第二个异
源核酸分子可含有编码蛋白质的核苷酸序列或者可以是非编码核酸分子。在一些实例中，
第二个异源核酸分子含有与启动子可操纵地连接的开放读框。第二个异源核酸分子可含有
一或多个开放读框或者一或多个启动子。此外，第二个异源核酸分子的一或多个启动子可
以是一或多个更强的启动子或者一或多个更弱的启动子，或者可以是组合或者二者均在。
所述病毒通过以下方式修饰病毒中包含的异源核酸而减毒，即通过除去全部或部分第一个
异源核酸分子及用第二个异源核酸分子置换，其中所述置换改变病毒减毒水平。第二个异
源核酸分子可含有编码蛋白质的核苷酸序列或者可以是非编码核酸分子。在一些实例中，
第二个异源核酸分子含有与启动子可操纵地连接的开放读框。第二个异源核酸分子可含有
一或多个开放读框或者一或多个启动子。此外，第二个异源核酸分子的一或多个启动子可
以是一或多个更强的启动子或者一或多个更弱的启动子，或者可以是组合或者二者均在。
[0384] 减毒的痘苗病毒为本领域已知，且在例如美国专利公开号US2005-0031643，美 国 专 利 号7,588,767、7,588,771和 7,662,398，US2008-0193373、US2009-0098529、
US2009-0053244、US2009-0155287、US2009-0081639、US2009-0117034和US2009-0136917
以及国际专利公开号WO2005/047458、WO2008/100292和WO2008/150496中描述。
US2009-0053244、US2009-0155287、US2009-0081639、US2009-0117034和US2009-0136917
以及国际专利公开号WO2005/047458、WO2008/100292和WO2008/150496中描述。
[0385] 本发明提供的病毒也可含有改变其感染性或者对于中和抗体抗性的修饰。在一个非限制性实例中，痘苗病毒LIVP毒株中A35R基因的缺失可降低病毒的感染性。在一些
实例中，本发明提供的病毒可以修饰为含有A35R基因缺失。产生这种病毒的典型的方法
在PCT公开号WO2008/100292中描述，其描述了含有A35R基因缺失的痘苗病毒LIVP病毒
GLV-1j87、GLV-1j88和GLV-1j89。
实例中，本发明提供的病毒可以修饰为含有A35R基因缺失。产生这种病毒的典型的方法
在PCT公开号WO2008/100292中描述，其描述了含有A35R基因缺失的痘苗病毒LIVP病毒
GLV-1j87、GLV-1j88和GLV-1j89。
[0386] 在另一非限制性的实例中，病毒包膜蛋白(例如A34R，其编码病毒包膜糖蛋白)用来自毒性更强或毒性更低的病毒毒株的包膜蛋白置换，可增加或降低所述病毒从对象中的
清除。在一个实例中，痘苗病毒LIVP毒株中A34R基因可以用来自痘苗病毒IHD-J毒株的
A34R基因置换。这种置换可增加痘苗病毒的胞外包膜病毒(EEV)形式，并且可增加病毒对
于中和抗体的抗性。
清除。在一个实例中，痘苗病毒LIVP毒株中A34R基因可以用来自痘苗病毒IHD-J毒株的
A34R基因置换。这种置换可增加痘苗病毒的胞外包膜病毒(EEV)形式，并且可增加病毒对
于中和抗体的抗性。
[0387] 3.异源基因表达的控制
[0388] 在一些实例中，异源核酸也可含有一或多个调节序列，以调节编码异源RNA和/或蛋白质的开放读框的表达。合适的调节序列如在哺乳动物宿主细胞中起作用的调节序列为
本领域熟知。表达也可以通过由所述病毒表达的一或多种蛋白质或者RNA分子影响。基因
调节元件如启动子和增强子，具有细胞类型特异性活性，可以由某些诱导因子(例如激素、
生长因子、细胞因子、抑细胞剂、放射、热休克)通过应答元件激活。这些基因的受控和受限
的表达可以使用这种作为内在启动子以驱动治疗性基因在病毒载体构建体中表达的调节
元件实现。
本领域熟知。表达也可以通过由所述病毒表达的一或多种蛋白质或者RNA分子影响。基因
调节元件如启动子和增强子，具有细胞类型特异性活性，可以由某些诱导因子(例如激素、
生长因子、细胞因子、抑细胞剂、放射、热休克)通过应答元件激活。这些基因的受控和受限
的表达可以使用这种作为内在启动子以驱动治疗性基因在病毒载体构建体中表达的调节
元件实现。
[0389] 例如，所述一或多个异源核酸分子可以与用于表达异源RNA和/或蛋白质的启动子可操纵地连接。例如，与启动子可操纵地连接的异源核酸也称作表达盒。因此，本发明提
供的病毒可具有表达一或多个异源基因的能力。基因表达可包括由基因编码的蛋白质的表
达和/由基因表达的RNA分子的表达。在一些实施方案中，本发明提供的病毒可以在足够高
的水平表达外源基因，使得可以从肿瘤中收获所述外源基因。异源基因的表达可以由组成
型启动子或者由可诱导启动子控制。在其它实例中，器官或组织特异性表达可以由调节序
列控制。为了实现仅在靶器官如治疗的肿瘤中表达，外来核苷酸序列可以与组织特异性启
动子连接并用于基因治疗中。这种启动子为本领域技术人员熟知(见例如Zimmermann et
al.，Neuron12：11-24(1994)；Vidal et al.，EMBOJ.9：833-840(1990)；Mayford et al.，
Cell81：891-904(1995)；及Pinkert et al.，Genes&Dev.1：268-76(1987))。
供的病毒可具有表达一或多个异源基因的能力。基因表达可包括由基因编码的蛋白质的表
达和/由基因表达的RNA分子的表达。在一些实施方案中，本发明提供的病毒可以在足够高
的水平表达外源基因，使得可以从肿瘤中收获所述外源基因。异源基因的表达可以由组成
型启动子或者由可诱导启动子控制。在其它实例中，器官或组织特异性表达可以由调节序
列控制。为了实现仅在靶器官如治疗的肿瘤中表达，外来核苷酸序列可以与组织特异性启
动子连接并用于基因治疗中。这种启动子为本领域技术人员熟知(见例如Zimmermann et
al.，Neuron12：11-24(1994)；Vidal et al.，EMBOJ.9：833-840(1990)；Mayford et al.，
Cell81：891-904(1995)；及Pinkert et al.，Genes&Dev.1：268-76(1987))。
[0390] 表达异源基因的启动子的实例为本领域已知。所述异源核酸可以与天然启动子或者对于病毒非天然的异源启动子可操纵地连接。任何合适的启动子、包括合成的和天然存
在的及修饰的启动子均可使用。典型的启动子包括合成启动子，包括合成的病毒和动物启
动子。天然启动子包括但不限于病毒启动子，如痘苗病毒和腺病毒启动子。
在的及修饰的启动子均可使用。典型的启动子包括合成启动子，包括合成的病毒和动物启
动子。天然启动子包括但不限于病毒启动子，如痘苗病毒和腺病毒启动子。
[0391] 在一个实例中，所述启动子是痘病毒启动子，例如痘苗病毒启动子。表达一或多个异源基因的痘苗病毒启动子可以是合成的或者天然的启动子，包括痘苗病毒早期、中期、早
期/晚期和晚期启动子。控制异源基因表达的典型的痘苗病毒启动子包括但不限于P7.5k、
P11k、PSF、PSEL、PSL、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4b或者K1启动子。其它病毒启动子包括但不限于腺病毒晚期启动子、牛痘ATI启动子或者T7启动子。强晚期启动子可用于实
现异源基因的高水平表达。也可以使用早期和中期启动子。在一个实例中，所述启动子含有
早期和晚期启动子元件，例如痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5k、痘苗病毒晚期启动子P11k、合
成的早期/晚期痘苗病毒PSEL启动子(Patel et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：
9431-9435；Davison and Moss，(1989)J Mol Biol210：749-769；Davison et al.(1990)
Nucleic Acids Res.18：4285-4286；Chakrabarti et al.(1997)，BioTechniques23：
1094-1097)。本发明提供的病毒由于使用较强的启动子及较弱的启动子而可呈现出特性如
减毒中的差异。例如，在痘苗病毒中，合成的早期/晚期及晚期启动子是相对较强的启动
子，而痘苗病毒合成的早期、P7.5k早期/晚期、P7.5k早期、及P28晚期启动子是相对较弱的启
动子(见例如Chakrabarti et al.(1997)BioTechniques23(6)1094-1097)。不同启动子的
组合可用于在相同病毒或者两个不同病毒中表达不同的基因产物。
期/晚期和晚期启动子。控制异源基因表达的典型的痘苗病毒启动子包括但不限于P7.5k、
P11k、PSF、PSEL、PSL、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4b或者K1启动子。其它病毒启动子包括但不限于腺病毒晚期启动子、牛痘ATI启动子或者T7启动子。强晚期启动子可用于实
现异源基因的高水平表达。也可以使用早期和中期启动子。在一个实例中，所述启动子含有
早期和晚期启动子元件，例如痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5k、痘苗病毒晚期启动子P11k、合
成的早期/晚期痘苗病毒PSEL启动子(Patel et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：
9431-9435；Davison and Moss，(1989)J Mol Biol210：749-769；Davison et al.(1990)
Nucleic Acids Res.18：4285-4286；Chakrabarti et al.(1997)，BioTechniques23：
1094-1097)。本发明提供的病毒由于使用较强的启动子及较弱的启动子而可呈现出特性如
减毒中的差异。例如，在痘苗病毒中，合成的早期/晚期及晚期启动子是相对较强的启动
子，而痘苗病毒合成的早期、P7.5k早期/晚期、P7.5k早期、及P28晚期启动子是相对较弱的启
动子(见例如Chakrabarti et al.(1997)BioTechniques23(6)1094-1097)。不同启动子的
组合可用于在相同病毒或者两个不同病毒中表达不同的基因产物。
[0392] 正如本领域所已知，调节序列使得外源基因可以组成型表达或者使得外源基因可以可诱导表达。此外，调节序列可以控制外源基因的表达水平。在一些实例中，如基因产物
的生产和收获，所述调节序列可使基因组成型高水平表达。在一些实例中，如抗-(基因产
物)抗体收获，所述调节序列可以使基因组成型较低水平表达。在肿瘤治疗实例中，治疗性
蛋白质可以在内在可诱导的启动子或者外部可诱导的启动子的控制下。
的生产和收获，所述调节序列可使基因组成型高水平表达。在一些实例中，如抗-(基因产
物)抗体收获，所述调节序列可以使基因组成型较低水平表达。在肿瘤治疗实例中，治疗性
蛋白质可以在内在可诱导的启动子或者外部可诱导的启动子的控制下。
[0393] 因此，异源基因的表达可以由组成型启动子或者由可诱导启动子控制。可诱导启动子可用于提供异源基因的组织特异性表达，或者可以通过添加调节分子以提供该启动子
的暂时特异性诱导而可诱导。在一些实例中，可诱导的表达可以在肿瘤细胞中存在的或者
在病毒感染的肿瘤细胞中存在的细胞性或其它因子的控制下。在进一步的实例中，可诱导
的表达可以在可施用的物质的控制下，包括IPTG、RU486或者其它已知的诱导化合物。另外
的调节序列可用于控制插入病毒中的一或多个异源基因的表达。本领域技术人员根据已知
因素和设计优选性可以利用任何各种调节序列。
的暂时特异性诱导而可诱导。在一些实例中，可诱导的表达可以在肿瘤细胞中存在的或者
在病毒感染的肿瘤细胞中存在的细胞性或其它因子的控制下。在进一步的实例中，可诱导
的表达可以在可施用的物质的控制下，包括IPTG、RU486或者其它已知的诱导化合物。另外
的调节序列可用于控制插入病毒中的一或多个异源基因的表达。本领域技术人员根据已知
因素和设计优选性可以利用任何各种调节序列。
[0394] 4.产生修饰的病毒的方法
[0395] 本发明提供的病毒可以通过如本文所述的插入、缺失、置换或突变进行修饰，例如插入或置换异源核酸，使用本领域熟知的修饰病毒的标准方法进行。修饰方法包括例如体
外重组技术、合成方法、直接克隆、以及体内重组方法，如在Sambrook et al.，Molecular
Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，
cold Spring Harbor NY(1989)及本发明实施例中描述的那些方法。
外重组技术、合成方法、直接克隆、以及体内重组方法，如在Sambrook et al.，Molecular
Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，
cold Spring Harbor NY(1989)及本发明实施例中描述的那些方法。
[0396] 例如，重组病毒包括重组痘病毒的产生为本领域熟知，典型包括使用分子生物学标准技术产生基因盒或者转移载体(见例如美国专利7,588,767和US2009-0053244-A1，其
描述了产生重组LIVP痘苗病毒的典型的方法)。这种技术包括各种核酸操纵技术、核酸转
移方案、核酸扩增方案、及本领域已知的其它分子生物学技术。例如，通过使用寡核苷酸介
导的定向诱变可以将点突变或小出入或缺失导入感兴趣的基因组中。在另一实例中，可使
用同源重组在核酸序列中导入突变，或者将核酸分子在感兴趣的序列中插入或缺失。在一
些实例中，在特定基因中的核酸的突变、插入或缺失可以使用阳性或阴性选择压力选择。见
例如Current Techniques in Molecular Biology，(Ed.Ausubel，et al.)所述。核酸扩增
方案包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，或者通过病毒或生物体扩增，例如但不限于细菌、
酵母、昆虫或哺乳动物细胞。大量各种病毒和细胞生物体的核酸工具如质粒、载体、启动子
及其它调节序列的应用为本领域熟知。核酸转移工具包括氯化钙转化/转染、电穿孔、脂质
体介导的核酸转移、N-[1-(2，3-dioloyloxy)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵介导的转化
等。大量各种核酸工具可从包括各种商业来源在内的许多不同来源获得。根据本领域的知
识和设计选择，本领域技术人员能选择合适的工具和方法对任何特定病毒进行遗传修饰。
描述了产生重组LIVP痘苗病毒的典型的方法)。这种技术包括各种核酸操纵技术、核酸转
移方案、核酸扩增方案、及本领域已知的其它分子生物学技术。例如，通过使用寡核苷酸介
导的定向诱变可以将点突变或小出入或缺失导入感兴趣的基因组中。在另一实例中，可使
用同源重组在核酸序列中导入突变，或者将核酸分子在感兴趣的序列中插入或缺失。在一
些实例中，在特定基因中的核酸的突变、插入或缺失可以使用阳性或阴性选择压力选择。见
例如Current Techniques in Molecular Biology，(Ed.Ausubel，et al.)所述。核酸扩增
方案包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，或者通过病毒或生物体扩增，例如但不限于细菌、
酵母、昆虫或哺乳动物细胞。大量各种病毒和细胞生物体的核酸工具如质粒、载体、启动子
及其它调节序列的应用为本领域熟知。核酸转移工具包括氯化钙转化/转染、电穿孔、脂质
体介导的核酸转移、N-[1-(2，3-dioloyloxy)丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵介导的转化
等。大量各种核酸工具可从包括各种商业来源在内的许多不同来源获得。根据本领域的知
识和设计选择，本领域技术人员能选择合适的工具和方法对任何特定病毒进行遗传修饰。
[0397] 因此，使用本领域已知的标准分子生物学方法可易于实现任何各种修饰。所述修饰典型是病毒基因组的一或多种的截短、缺失、突变或者插入。在一个实例中，所述修饰可
以特异性针对病毒基因组中的特定序列。所述修饰可以针对病毒基因组的任何各个区域，
包括但不限于调节序列、基因编码序列、基因间序列、无已知作用的序列，或者病毒基因组
的非必需区域。对于包括LIVP在内的许多病毒，可用于修饰的病毒基因组的任何各个区域
为本领域已知。
以特异性针对病毒基因组中的特定序列。所述修饰可以针对病毒基因组的任何各个区域，
包括但不限于调节序列、基因编码序列、基因间序列、无已知作用的序列，或者病毒基因组
的非必需区域。对于包括LIVP在内的许多病毒，可用于修饰的病毒基因组的任何各个区域
为本领域已知。
[0398] 异源核酸分子通常被插入病毒基因组中基因间区域或者编码非必需病毒基因产物的基因座中。异源核酸插入在如此位点通常不显著影响在靶组织中的病毒感染或者复
制。典型的插入位点为本领域已知，包括但不限于J2R(胸苷激酶(TK))、A56R(血凝素
(HA))、F14.5L、痘苗病毒生长因子(VGF)、A35R、N1L、E2L/E3L、K1L/K2L、超氧化物歧化酶基因座、7.5K、C7-K1L(宿主范围基因区)、B13R+B14R(出血区)、A26L(A型包涵体区(ATI))
或者I4L(大亚基，核糖核苷酸还原酶)基因座。本发明提供的病毒的插入位点也包括相应
于在其它痘病毒如修饰的痘苗病毒安卡拉株(MVA)病毒(在美国专利号7,550,147中所述
典型的位点)、NYVAC(在美国专利号5,762,938中所述典型的位点)所述基因间区域的位
点。
制。典型的插入位点为本领域已知，包括但不限于J2R(胸苷激酶(TK))、A56R(血凝素
(HA))、F14.5L、痘苗病毒生长因子(VGF)、A35R、N1L、E2L/E3L、K1L/K2L、超氧化物歧化酶基因座、7.5K、C7-K1L(宿主范围基因区)、B13R+B14R(出血区)、A26L(A型包涵体区(ATI))
或者I4L(大亚基，核糖核苷酸还原酶)基因座。本发明提供的病毒的插入位点也包括相应
于在其它痘病毒如修饰的痘苗病毒安卡拉株(MVA)病毒(在美国专利号7,550,147中所述
典型的位点)、NYVAC(在美国专利号5,762,938中所述典型的位点)所述基因间区域的位
点。
[0399] 使用重组DNA技术产生重组病毒的方法为本领域熟知(例如见美国专利4,769,330、4,603,112、4,722,848、4,215,051、5,110,587、5,174,993、5,922,576、
6,319,703、5,719,054、6,429,001、6,589,531、6,573,090、6,800,288、7,045,313，He et al.(1998)PNAS95(5)：2509-2514；Racaniello et al.，(1981)Science214：916-919，
及Hruby et al.，(1990)Clin Micro Rev.3：153-170)。产生重组痘苗病毒的方法为本
领域熟知(例如见Hruby et al.，(1990)Clin Micro Rev.3：153-170，美国专利公开
2005-0031643，美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和美国专利号7,045,313)。
6,319,703、5,719,054、6,429,001、6,589,531、6,573,090、6,800,288、7,045,313，He et al.(1998)PNAS95(5)：2509-2514；Racaniello et al.，(1981)Science214：916-919，
及Hruby et al.，(1990)Clin Micro Rev.3：153-170)。产生重组痘苗病毒的方法为本
领域熟知(例如见Hruby et al.，(1990)Clin Micro Rev.3：153-170，美国专利公开
2005-0031643，美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和美国专利号7,045,313)。
[0400] 例如，产生表达异源基因产物的重组痘苗病毒典型包括使用含有任选与启动子可操纵地连接的异源核酸的重组质粒，其中痘苗病毒DNA序列位于异源核酸两侧以促进同源
重组及将基因插入病毒基因组中。通常地，在异源基因两侧的病毒DNA与痘苗病毒DNA的非
必需节段互补，由此所述基因被插入非必需位置中。所述重组质粒可以从大肠杆菌中生长
和纯化，并导入合适的宿主细胞中，例如但不限于CV-1、BSC-40、BSC-1和TK-143细胞。然后
将转染的细胞用起始复制循环的痘苗病毒重复感染。异源DNA可以通过同源重组掺入痘苗
病毒基因组中，并包装进感染后代中。所述重组病毒可以通过本领域已知方法鉴别，如通过
检测异源基因产物的表达或者通过使用阳性或阴性选择方法进行(美国专利7,045,313)。
重组及将基因插入病毒基因组中。通常地，在异源基因两侧的病毒DNA与痘苗病毒DNA的非
必需节段互补，由此所述基因被插入非必需位置中。所述重组质粒可以从大肠杆菌中生长
和纯化，并导入合适的宿主细胞中，例如但不限于CV-1、BSC-40、BSC-1和TK-143细胞。然后
将转染的细胞用起始复制循环的痘苗病毒重复感染。异源DNA可以通过同源重组掺入痘苗
病毒基因组中，并包装进感染后代中。所述重组病毒可以通过本领域已知方法鉴别，如通过
检测异源基因产物的表达或者通过使用阳性或阴性选择方法进行(美国专利7,045,313)。
[0401] 在另一实例中表达异源基因产物的重组痘苗病毒可以通过直接克隆产生(见例如美国专利6,265,183和Scheiflinger et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：
9977-9981)。在这种方法中，任选与启动子可操纵地连接的异源核酸位于限制性内切核酸
酶裂解位点两侧，以用于插入靶病毒中独特的限制性内切核酸酶位点。使用标准技术纯化
病毒DNA，并用序列特异性限制性内切核酸酶裂解，其中所述序列是病毒基因组中独特位
点。病毒基因组中任何独特位点均可应用，条件是在该位点的修饰不干扰病毒复制。例如，
在痘苗病毒毒株LIVP中，NotI限制位点位于编码具有位置功能的F14.5L基因的ORF中
(Mikryukov et al.，Biotekhnologiya4：442-449(1988))。表6提供了典型的LIVP毒株中
含有的独特限制位点的概述及指明了每个核苷酸位置。这种LIVP毒株在此可以通过直接
克隆剂将异源DNA插入一或多个位点而修饰。通常地，插入是在位于病毒基因组的非必需
区域中。例如，典型的修饰包括将外源DNA序列插入NotI消化的病毒DNA中。
9977-9981)。在这种方法中，任选与启动子可操纵地连接的异源核酸位于限制性内切核酸
酶裂解位点两侧，以用于插入靶病毒中独特的限制性内切核酸酶位点。使用标准技术纯化
病毒DNA，并用序列特异性限制性内切核酸酶裂解，其中所述序列是病毒基因组中独特位
点。病毒基因组中任何独特位点均可应用，条件是在该位点的修饰不干扰病毒复制。例如，
在痘苗病毒毒株LIVP中，NotI限制位点位于编码具有位置功能的F14.5L基因的ORF中
(Mikryukov et al.，Biotekhnologiya4：442-449(1988))。表6提供了典型的LIVP毒株中
含有的独特限制位点的概述及指明了每个核苷酸位置。这种LIVP毒株在此可以通过直接
克隆剂将异源DNA插入一或多个位点而修饰。通常地，插入是在位于病毒基因组的非必需
区域中。例如，典型的修饰包括将外源DNA序列插入NotI消化的病毒DNA中。
[0402]
[0403]
[0404] 在一些实例中，病毒基因组DNA首先通过同源重组修饰，以在病毒中导入一或多个限制位点(见例如Mackett et al.(1984)J.Virol.857-864)。在用限制性内切核酸酶裂
解之后，将裂解的DNA任选用磷酸酶处理以从DNA节段末端除去由内切核酸酶裂解产生的
磷酸盐部分。典型地，产生含有用于在限制位点的两侧插入的异源DNA的质粒载体。在插
入病毒之前，将异源DNA通过用序列特异性限制性内切核酸酶裂解而从质粒中切除。然后
将该异源DNA与裂解的病毒DNA连接，通过用辅助病毒感染细胞而包装进容许细胞系中，所
述辅助病毒例如但不限于是禽痘病毒或者puv-失活的辅助病毒，及将连接的DNA转染进感
染的细胞中。
解之后，将裂解的DNA任选用磷酸酶处理以从DNA节段末端除去由内切核酸酶裂解产生的
磷酸盐部分。典型地，产生含有用于在限制位点的两侧插入的异源DNA的质粒载体。在插
入病毒之前，将异源DNA通过用序列特异性限制性内切核酸酶裂解而从质粒中切除。然后
将该异源DNA与裂解的病毒DNA连接，通过用辅助病毒感染细胞而包装进容许细胞系中，所
述辅助病毒例如但不限于是禽痘病毒或者puv-失活的辅助病毒，及将连接的DNA转染进感
染的细胞中。
[0405] 在一些实例中，所述方法包括同源重组和/或使用病毒中独特的限制位点。例如，具有如在F14.5L基因(例如在LIVP分离株的Not I限制位点)中插入的重组LIVP
痘苗病毒可以通过如下步骤制备：(a)产生：(i)痘苗病毒穿梭/转移质粒，其含有在限制
位点X(如Not I)插入的修饰(例如基因表达盒或者修饰的F14.5L基因)，其中载体中
的限制位点位于靶插入位点的亲代病毒序列两侧，及(ii)LIVP病毒DNA在限制位点X(如
Not I)消化，任选去磷酸化；(b)用PUV-失活的辅助痘苗病毒感染细胞，并用步骤a的
(i)和(ii)构建体混合物转染感染的宿主细胞；及(c)从转染体中分离重组痘苗病毒。本
领域技术人员已知如何进行这种方法(见例如Timiryasova et al.(Biotechniques31：
534-540(2001))。典型地，限制位点X是如上述病毒中独特限制位点。
痘苗病毒可以通过如下步骤制备：(a)产生：(i)痘苗病毒穿梭/转移质粒，其含有在限制
位点X(如Not I)插入的修饰(例如基因表达盒或者修饰的F14.5L基因)，其中载体中
的限制位点位于靶插入位点的亲代病毒序列两侧，及(ii)LIVP病毒DNA在限制位点X(如
Not I)消化，任选去磷酸化；(b)用PUV-失活的辅助痘苗病毒感染细胞，并用步骤a的
(i)和(ii)构建体混合物转染感染的宿主细胞；及(c)从转染体中分离重组痘苗病毒。本
领域技术人员已知如何进行这种方法(见例如Timiryasova et al.(Biotechniques31：
534-540(2001))。典型地，限制位点X是如上述病毒中独特限制位点。
[0406] 在一个实例中，所述方法包括在病毒中导入一或多个遗传修饰，随后根据修饰反映的性质或者其它希望的性质筛选病毒。在一些实例中，所述修饰可以是完全或部分随机
的，由此任何特别修饰的病毒的选择可以根据修饰病毒希望的性质确定。
的，由此任何特别修饰的病毒的选择可以根据修饰病毒希望的性质确定。
[0407] E.病毒的繁殖和产生
[0408] 本发明提供的病毒可以通过本领域技术人员已知的方法产生。本发明提供的所得病毒可用于如下文章节F中描述的治疗性和诊断性应用中。
[0409] 所述病毒在最后制备在本发明所述方法中使用之前在宿主细胞中繁殖，量化并为贮存做准备。所述病毒可以在合适的宿主细胞中繁殖，以扩大原种贮存，然后确定其浓度。
在一些实例中，确定感染性效价，如通过噬斑测定进行。也可以确定病毒颗粒的总数。所述
病毒贮存在促进病毒稳定性和完整性的条件下，由此感染性随着时间的降低达到最小化。
在一些实例中，产生大量病毒，并且以在延长的时间期限可用于多个步骤的已知浓度的小
等份贮存。最适于各种病毒的条件是不同的，这些条件为本领域已知，但是典型包括冷冻或
5 10 7 9 6
干燥，如冻干。病毒可以10-10 pfu/mL，例如10-10pfu/mL、如至少或大约或者10pfu/mL、
7 8 9
10pfu/mL、10pfu/mL或10pfu/mL浓度贮存。在立即用于本发明提供的方法中之前，将贮
存的病毒在合适的介质或溶液中重建(如果以干燥形式贮存)及稀释。如下章节通过了典
型的方法，可用于产生和制备用于本发明提供的任何方法中的病毒。
在一些实例中，确定感染性效价，如通过噬斑测定进行。也可以确定病毒颗粒的总数。所述
病毒贮存在促进病毒稳定性和完整性的条件下，由此感染性随着时间的降低达到最小化。
在一些实例中，产生大量病毒，并且以在延长的时间期限可用于多个步骤的已知浓度的小
等份贮存。最适于各种病毒的条件是不同的，这些条件为本领域已知，但是典型包括冷冻或
5 10 7 9 6
干燥，如冻干。病毒可以10-10 pfu/mL，例如10-10pfu/mL、如至少或大约或者10pfu/mL、
7 8 9
10pfu/mL、10pfu/mL或10pfu/mL浓度贮存。在立即用于本发明提供的方法中之前，将贮
存的病毒在合适的介质或溶液中重建(如果以干燥形式贮存)及稀释。如下章节通过了典
型的方法，可用于产生和制备用于本发明提供的任何方法中的病毒。
[0410] 1.用于繁殖的宿主细胞
[0411] 本发明提供的克隆病毒毒株或者其重组病毒毒株可以在合适的宿主细胞中繁殖。这种细胞可以是一组单一类型的细胞或者不同类型细胞的混合物。宿主细胞可包括培养
的细胞系、原代细胞和增殖性细胞。这些宿主细胞可包括对病毒如痘苗病毒感染易感的任
何各种动物细胞，如哺乳动物、禽类和昆虫细胞和组织，包括鸡胚、兔、仓鼠和猴肾细胞。合
适的宿主细胞包括但不限于造血细胞(全能细胞、干细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨
噬细胞、APC、树突状细胞、非人细胞等)、肺细胞、气管细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞(例如骨骼肌、心肌或平滑肌)、成纤维细胞、及细胞系包括例如CV-1、BSC40、Vero和
BSC-1，及人HeLa细胞。典型地，病毒在可以在单层或在悬浮生长的细胞系中繁殖。例如，繁
殖痘苗病毒的细胞系例如包括但不限于CV-1、BSC40、Vero、BGM、BSC-1和RK-13细胞。繁
殖腺病毒的细胞系例如包括但不限于HeLa、MK、HEK293和HDF细胞。繁殖疱疹病毒的细胞
系例如包括但不限于WI-38和HeLa细胞。适于繁殖各种病毒的其它细胞系为本领域熟知。
从所述系统中纯化培养的毒株可以使用标准方法实现。
的细胞系、原代细胞和增殖性细胞。这些宿主细胞可包括对病毒如痘苗病毒感染易感的任
何各种动物细胞，如哺乳动物、禽类和昆虫细胞和组织，包括鸡胚、兔、仓鼠和猴肾细胞。合
适的宿主细胞包括但不限于造血细胞(全能细胞、干细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨
噬细胞、APC、树突状细胞、非人细胞等)、肺细胞、气管细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞(例如骨骼肌、心肌或平滑肌)、成纤维细胞、及细胞系包括例如CV-1、BSC40、Vero和
BSC-1，及人HeLa细胞。典型地，病毒在可以在单层或在悬浮生长的细胞系中繁殖。例如，繁
殖痘苗病毒的细胞系例如包括但不限于CV-1、BSC40、Vero、BGM、BSC-1和RK-13细胞。繁
殖腺病毒的细胞系例如包括但不限于HeLa、MK、HEK293和HDF细胞。繁殖疱疹病毒的细胞
系例如包括但不限于WI-38和HeLa细胞。适于繁殖各种病毒的其它细胞系为本领域熟知。
从所述系统中纯化培养的毒株可以使用标准方法实现。
[0412] 2.浓度确定
[0413] 溶液中病毒的浓度或者病毒效价可以通过本领域已知的各种方法确定。在一些方法中，确定感染性病毒颗粒的数目(典型称作噬斑形成单位(PFU))，在其它方法中，确定病
毒颗粒(感染性或非感染性)的总数。计算感染性毒粒数目的方法包括但不限于噬斑测定，
其中病毒的滴定物在细胞单层上生长，在几天至几周后计数噬斑数目，及终点稀释方法，其
确定一定范围如一个对数内的效价。确定病毒颗粒(包括感染性或非感染性)总数的方法
包括但不限于免疫组织化学染色方法，其利用识别病毒抗原的抗体，及可以通过显微镜观
测或FACS分析；吸光度，如在260nm的吸光度；及测量病毒核酸，如通过PCR、RT-PCR测量，
或者通过用荧光染料标记定量。
毒颗粒(感染性或非感染性)的总数。计算感染性毒粒数目的方法包括但不限于噬斑测定，
其中病毒的滴定物在细胞单层上生长，在几天至几周后计数噬斑数目，及终点稀释方法，其
确定一定范围如一个对数内的效价。确定病毒颗粒(包括感染性或非感染性)总数的方法
包括但不限于免疫组织化学染色方法，其利用识别病毒抗原的抗体，及可以通过显微镜观
测或FACS分析；吸光度，如在260nm的吸光度；及测量病毒核酸，如通过PCR、RT-PCR测量，
或者通过用荧光染料标记定量。
[0414] 3.贮存方法
[0415] 一旦已经纯化(或者达到希望的纯度)及已经确定了效价，可以将病毒贮存在最佳维持其感染性完整性的条件中。典型地，将病毒在黑暗中贮存，因为光可在一段时间内使
病毒失活。病毒贮存稳定性通常依赖于温度。尽管一些病毒是热稳定性的，但是大多数病毒
在室温下一天以上时间是不稳定的，呈现出降低的存活力(Newman et al.，(2003)J.Inf.
Dis.187：1319-1322)。对于病毒的短期贮存，通常推荐大约4℃的温度下，例如1天、2天、
4天或7天。对于长期贮存，大多数病毒可保持在-20℃、-70℃或者-80℃。当在这些温度
下冷冻于简单溶液如PBS或Tris溶液(20mM Tris pH8.0，200NaCl，2-3％甘油或蔗糖)时，
病毒可以稳定6个月至一年，或者甚至更长时间。但是一般要避免重复冻融，因为这样可以
导致病毒效价降低。所述病毒也可以在贮存溶液中在含有其它补充物的介质中冷冻，其可
以进一步保持病毒的完整性。例如，向在贮存的病毒溶液中加入血清或牛血清白蛋白(BSA)
可帮助在长期贮存及经过几次冻融循环下保持病毒的存活力。在其它实例中，将病毒样品
干燥以在室温下长期贮存。病毒可以使用各种技术干燥，包括但不限于冻干、泡沫干燥、喷
雾干燥和脱水。在室温、冷藏或冷冻温度贮存病毒的其它方法为本领域已知，包括但不限于
在美国专利5,149,653；6,165,779；6,255,289；6,664,099；6,872,357；和7,091,030；及
在美国专利公开2003-0153065、2004-003841和2005-0032044中描述的那些方法。
病毒失活。病毒贮存稳定性通常依赖于温度。尽管一些病毒是热稳定性的，但是大多数病毒
在室温下一天以上时间是不稳定的，呈现出降低的存活力(Newman et al.，(2003)J.Inf.
Dis.187：1319-1322)。对于病毒的短期贮存，通常推荐大约4℃的温度下，例如1天、2天、
4天或7天。对于长期贮存，大多数病毒可保持在-20℃、-70℃或者-80℃。当在这些温度
下冷冻于简单溶液如PBS或Tris溶液(20mM Tris pH8.0，200NaCl，2-3％甘油或蔗糖)时，
病毒可以稳定6个月至一年，或者甚至更长时间。但是一般要避免重复冻融，因为这样可以
导致病毒效价降低。所述病毒也可以在贮存溶液中在含有其它补充物的介质中冷冻，其可
以进一步保持病毒的完整性。例如，向在贮存的病毒溶液中加入血清或牛血清白蛋白(BSA)
可帮助在长期贮存及经过几次冻融循环下保持病毒的存活力。在其它实例中，将病毒样品
干燥以在室温下长期贮存。病毒可以使用各种技术干燥，包括但不限于冻干、泡沫干燥、喷
雾干燥和脱水。在室温、冷藏或冷冻温度贮存病毒的其它方法为本领域已知，包括但不限于
在美国专利5,149,653；6,165,779；6,255,289；6,664,099；6,872,357；和7,091,030；及
在美国专利公开2003-0153065、2004-003841和2005-0032044中描述的那些方法。
[0416] 病毒对于每种贮存方法有不同反应。例如，脊髓灰质炎病毒在室温在水相悬浮液中易于降解，在0℃仅稳定2周，及通过冻干被破坏。对于这种特殊的病毒，贮存方法典型包
括在-70℃贮存或者在4℃冷藏。相反，痘苗病毒被认为是非常稳定的，可以在4℃中贮存，
在例如-20℃、-70℃或-80℃温度冷冻，或者略丧失存活力的冻干(Newman et al.，(2003)
J.Inf.Dis.187：1319-1322，Hruby et al.，(1990)Clin.Microb.Rev.3：153-170)。适于贮
存特殊病毒的方法和条件为本领域已知，可用于贮存在本发明方法中使用的病毒。
括在-70℃贮存或者在4℃冷藏。相反，痘苗病毒被认为是非常稳定的，可以在4℃中贮存，
在例如-20℃、-70℃或-80℃温度冷冻，或者略丧失存活力的冻干(Newman et al.，(2003)
J.Inf.Dis.187：1319-1322，Hruby et al.，(1990)Clin.Microb.Rev.3：153-170)。适于贮
存特殊病毒的方法和条件为本领域已知，可用于贮存在本发明方法中使用的病毒。
[0417] 水是在贮存中降解病毒的几乎所有破坏性途径中的反应物。此外，水作为增塑剂，其使得蛋白质伸展和聚集。由于水参与激活所有降解途径，因此使病毒的水溶液减少
至干粉状态提供了另一种配制方法，以增强这种样品的稳定性。冻干或冷冻-干燥是用
于贮存病毒的一种干燥技术(见例如Cryole et al.，(1998)Pharm.Dev.Technol.，3(3)，
973-383)。冻干有三个阶段：冷冻，初次干燥和二次干燥。在这些阶段期间，将材料在高度
真空下快速冷冻并脱水。一旦冻干，则可以将干燥的病毒在环境温度长期贮存，当需要时用
水溶液重建。在冻干之前在溶液中可包含各种稳定剂，以增强病毒的保持。例如已知高分
子量的结构添加剂如血清、血清白蛋白或者凝胶有助于防止病毒在冷冻期间聚集，并在冻
干或干燥状态提供结构和营养支持。氨基酸如精氨酸和谷氨酸盐，糖如海藻糖及醇如甘露
醇、山梨糖醇和肌醇，可以在冻干期间及在冻干状态下增强病毒感染性的保持。当在冻干前
加入病毒溶液时，尿素和抗坏血酸可稳定水合状态及在脱水期间维持渗透平衡。典型地，在
冻干期间维持相对恒定的大约7.0的pH。
至干粉状态提供了另一种配制方法，以增强这种样品的稳定性。冻干或冷冻-干燥是用
于贮存病毒的一种干燥技术(见例如Cryole et al.，(1998)Pharm.Dev.Technol.，3(3)，
973-383)。冻干有三个阶段：冷冻，初次干燥和二次干燥。在这些阶段期间，将材料在高度
真空下快速冷冻并脱水。一旦冻干，则可以将干燥的病毒在环境温度长期贮存，当需要时用
水溶液重建。在冻干之前在溶液中可包含各种稳定剂，以增强病毒的保持。例如已知高分
子量的结构添加剂如血清、血清白蛋白或者凝胶有助于防止病毒在冷冻期间聚集，并在冻
干或干燥状态提供结构和营养支持。氨基酸如精氨酸和谷氨酸盐，糖如海藻糖及醇如甘露
醇、山梨糖醇和肌醇，可以在冻干期间及在冻干状态下增强病毒感染性的保持。当在冻干前
加入病毒溶液时，尿素和抗坏血酸可稳定水合状态及在脱水期间维持渗透平衡。典型地，在
冻干期间维持相对恒定的大约7.0的pH。
[0418] 4.病毒的制备
[0419] 在立即使用之前，可以在合适的介质中制备合适浓度的病毒，可将其保持在低温下如保持在冰上直至使用。如果所述病毒是冻干的或者是另外干燥贮存的，则可将其在
合适的水溶液中重建。在其中制备病毒的水溶液典型是用于测定中的介质(例如DMEM或
RPMI)，或者是相容的介质如缓冲的盐水溶液(例如PBS、TBS、Hepes溶液)。对于药物应
用，可以在配药溶液中立即制备或者重建病毒。本领域熟知许多药物可接受的溶液(见
th
例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(18 edition)ed.A.Gennaro，1990，Mack
Publishing Co.，Easton，Pa)。在一个实例中，病毒可以在生理学可接受的溶液中稀释，如
在无菌盐水或无菌缓冲盐水中，有或无佐剂或载体。在其它实例中，药物溶液可含有提供粘
性的成分(如甘油)和/或具有杀菌性质的成分(如苯酚)。在一些实例中，以相对浓缩溶
6
液制备病毒，以便在测定仅需要较小体积。例如如果将1×10pfu病毒加入96孔平板的肿
8
瘤细胞中，然后以1×10pfu/mL浓度制备病毒，以便在每个孔中仅加入10μl。特定浓度可
以由本领域技术人员根据特定应用根据经验确定。
合适的水溶液中重建。在其中制备病毒的水溶液典型是用于测定中的介质(例如DMEM或
RPMI)，或者是相容的介质如缓冲的盐水溶液(例如PBS、TBS、Hepes溶液)。对于药物应
用，可以在配药溶液中立即制备或者重建病毒。本领域熟知许多药物可接受的溶液(见
th
例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(18 edition)ed.A.Gennaro，1990，Mack
Publishing Co.，Easton，Pa)。在一个实例中，病毒可以在生理学可接受的溶液中稀释，如
在无菌盐水或无菌缓冲盐水中，有或无佐剂或载体。在其它实例中，药物溶液可含有提供粘
性的成分(如甘油)和/或具有杀菌性质的成分(如苯酚)。在一些实例中，以相对浓缩溶
6
液制备病毒，以便在测定仅需要较小体积。例如如果将1×10pfu病毒加入96孔平板的肿
8
瘤细胞中，然后以1×10pfu/mL浓度制备病毒，以便在每个孔中仅加入10μl。特定浓度可
以由本领域技术人员根据特定应用根据经验确定。
[0420] F.药物组合物、组合和试剂盒
[0421] 本发明提供含有本发明提供的病毒的药物组合物、组合和试剂盒。药物组合物可包括本发明提供的一种病毒和一种药物载体。组合可包括两或多种病毒、一种病毒和一种
可检测化合物、一种病毒和一种治疗性化合物、一种病毒和一种病毒表达调节化合物或者
其任意组合。试剂盒可包括本发明提供的一或多种药物组合物或组合，及一或多种成分，如
使用说明书，将所述药物组合物或组合施用对象的一种装置，将治疗性或诊断性化合物施
用对象的一种装置或者检测对象内病毒的一种装置。
可检测化合物、一种病毒和一种治疗性化合物、一种病毒和一种病毒表达调节化合物或者
其任意组合。试剂盒可包括本发明提供的一或多种药物组合物或组合，及一或多种成分，如
使用说明书，将所述药物组合物或组合施用对象的一种装置，将治疗性或诊断性化合物施
用对象的一种装置或者检测对象内病毒的一种装置。
[0422] 药物组合物、组合或试剂盒中包含的病毒可以包括本发明提供的任何病毒，包括本文描述的任何分离的克隆病毒毒株。所述药物组合物、组合或试剂盒可包含一或多种另
外的病毒，其可选自本发明提供的病毒或者其它治疗性或诊断性病毒。
外的病毒，其可选自本发明提供的病毒或者其它治疗性或诊断性病毒。
[0423] 1.药物组合物
[0424] 本发明提供药物组合物，其含有本发明提供的病毒及合适的药物载体。药物可接受的载体包括作为病毒的运载体或介质的固体、半固体或液体材料。本发明提供的药物组
合物可以各种形式配制，例如固体、半固体、水溶液、液体、粉末或冻干形式。含有本发明提
供的病毒的典型的药物组合物包括但不限于无菌注射溶液、无菌包装的粉末、滴眼液、片
剂、药丸、散剂、锭剂、小袋、扁囊、酏剂、悬浮液、乳状液、溶液、糖浆、气雾剂(在固体或液体介质中)、软膏、软和硬明胶胶囊及栓剂。
合物可以各种形式配制，例如固体、半固体、水溶液、液体、粉末或冻干形式。含有本发明提
供的病毒的典型的药物组合物包括但不限于无菌注射溶液、无菌包装的粉末、滴眼液、片
剂、药丸、散剂、锭剂、小袋、扁囊、酏剂、悬浮液、乳状液、溶液、糖浆、气雾剂(在固体或液体介质中)、软膏、软和硬明胶胶囊及栓剂。
[0425] 合适的药物载体的实例为本领域已知，包括但不限于水、缓冲液、盐水溶液、磷酸盐缓冲的盐水溶液、各种类型的增湿剂、无菌溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、明胶、甘油、碳水化合物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、直链淀粉或淀粉、山梨糖醇、甘露醇、硬脂酸镁、滑石、硅酸、半流体石蜡(viscous paraffin)、芳香油、脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、季戊四醇
脂肪酸酯、羟甲基纤维素、粉末等。本发明提供的药物组合物可含有其它添加剂，包括如抗
氧化剂、防腐剂、镇痛剂、结合剂、崩解剂、色素、稀释剂、赋形剂、填充剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、张度剂、运载体、增稠剂、调味剂、甜味剂、乳状液、如油/水乳状液、乳化和悬浮剂、如阿拉伯胶、琼脂、褐藻酸、藻酸钠、膨润土(bentonite)、卡波姆、卡拉胶、羧甲基纤维素、纤维素、胆固醇、明胶、羧乙基纤维素、羧丙基甲基纤维素、甲基纤维素、辛苯昔醇-9、油醇、聚烯吡酮、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、山梨聚糖酯、硬脂醇、黄芪胶、黄原胶、及其衍生物、溶剂、和各种成分如但不限于晶状纤维素、微晶纤维素、柠檬酸、糊精、液体葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化镁、偏磷酸钾、淀粉等。这种载体和/或添加剂可以通过常规方法配制，并
且可以合适剂量施用对象。稳定剂如液体、核酸酶抑制剂、聚合物及螯合剂可以防止所述
组合物在身体内降解。用于药物组合物中的其它合适的配制物可见于如Remington：The
Science and Practice of Pharmacy(2005，Twenty-first edition，Gennaro&Gennaro，
eds.，Lippencott Williams and Wilkins)。
脂肪酸酯、羟甲基纤维素、粉末等。本发明提供的药物组合物可含有其它添加剂，包括如抗
氧化剂、防腐剂、镇痛剂、结合剂、崩解剂、色素、稀释剂、赋形剂、填充剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、张度剂、运载体、增稠剂、调味剂、甜味剂、乳状液、如油/水乳状液、乳化和悬浮剂、如阿拉伯胶、琼脂、褐藻酸、藻酸钠、膨润土(bentonite)、卡波姆、卡拉胶、羧甲基纤维素、纤维素、胆固醇、明胶、羧乙基纤维素、羧丙基甲基纤维素、甲基纤维素、辛苯昔醇-9、油醇、聚烯吡酮、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、山梨聚糖酯、硬脂醇、黄芪胶、黄原胶、及其衍生物、溶剂、和各种成分如但不限于晶状纤维素、微晶纤维素、柠檬酸、糊精、液体葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化镁、偏磷酸钾、淀粉等。这种载体和/或添加剂可以通过常规方法配制，并
且可以合适剂量施用对象。稳定剂如液体、核酸酶抑制剂、聚合物及螯合剂可以防止所述
组合物在身体内降解。用于药物组合物中的其它合适的配制物可见于如Remington：The
Science and Practice of Pharmacy(2005，Twenty-first edition，Gennaro&Gennaro，
eds.，Lippencott Williams and Wilkins)。
[0426] 通过注射或粘膜施用的包含本发明提供的病毒的药物配制物典型包含在适用于注射或粘膜施用的缓冲液中的病毒的水溶液，或者用以在合适的缓冲液中重建而通过注射
或粘膜施用的病毒的冻干形式。这种配制物任选可含有如本文所述或本领域已知的一或多
种药物可接受的载体和/或添加剂。口服施用的液体组合物通常包括水溶液，适当香味的
糖浆，水相或者油相悬浮液，及具有食用油的香味乳状液，所述食用油如玉米油、棉籽油、芝
麻油、椰子油或花生油，以及酏剂和相似的药物运载体。
或粘膜施用的病毒的冻干形式。这种配制物任选可含有如本文所述或本领域已知的一或多
种药物可接受的载体和/或添加剂。口服施用的液体组合物通常包括水溶液，适当香味的
糖浆，水相或者油相悬浮液，及具有食用油的香味乳状液，所述食用油如玉米油、棉籽油、芝
麻油、椰子油或花生油，以及酏剂和相似的药物运载体。
[0427] 通过应用本领域已知的方法，可配制本发明提供的药物组合物，以提供本发明所述病毒的快速、持久或延迟的释放。为了制备固体组合物如片剂，将本发明提供的病毒与药
物载体混合形成固体组合物。任选地，将片剂或药丸包衣或者复合以提供在对象体内赋予
延长作用时间的优势的剂型。例如，片剂或药丸包含内部的药剂和外层的配药成分，后者是
覆盖前者的形式。这两种成分可以由肠衣层分离，所述肠衣层起到的作用是例如对抗在胃
中分解及使得内部成分完整通过进入十二指肠或者延迟释放。许多材料用于这种肠衣或包
膜，包括例如许多聚合酸及聚合酸与这种材料的混合物，如虫胶(shellac)，十六醇和乙酸
纤维素。
物载体混合形成固体组合物。任选地，将片剂或药丸包衣或者复合以提供在对象体内赋予
延长作用时间的优势的剂型。例如，片剂或药丸包含内部的药剂和外层的配药成分，后者是
覆盖前者的形式。这两种成分可以由肠衣层分离，所述肠衣层起到的作用是例如对抗在胃
中分解及使得内部成分完整通过进入十二指肠或者延迟释放。许多材料用于这种肠衣或包
膜，包括例如许多聚合酸及聚合酸与这种材料的混合物，如虫胶(shellac)，十六醇和乙酸
纤维素。
[0428] 供吸入或吹入的组合物包括在药物可接受的水相或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液以及散剂。这些液体或固体组合物任选可含有如本文所述或本领域已知的合适
的药物可接受的赋形剂和/或添加剂。这种组合物例如通过口服或经鼻吸入途径施用以达
到局部或全身性作用。在药物可接受的溶剂中的组合物通过使用惰性气体被雾化。雾化的
溶液例如直接从雾化装置、从附着的面罩或者从间歇性正压呼吸机中被吸入。溶液、悬浮液
或者分泌组合物是通过口服或经鼻从例如以合适方式输送所述配制物的装置中施用的，例
如使用吸入器。
的药物可接受的赋形剂和/或添加剂。这种组合物例如通过口服或经鼻吸入途径施用以达
到局部或全身性作用。在药物可接受的溶剂中的组合物通过使用惰性气体被雾化。雾化的
溶液例如直接从雾化装置、从附着的面罩或者从间歇性正压呼吸机中被吸入。溶液、悬浮液
或者分泌组合物是通过口服或经鼻从例如以合适方式输送所述配制物的装置中施用的，例
如使用吸入器。
[0429] 本发明提供的药物组合物可以配制为通过经皮施用装置(贴皮剂)经皮输送。这种经皮施用的贴皮剂用于提供本发明提供的病毒连续或不连续的注入。输送药物制剂的经
皮施用贴皮剂的构建和使用根据本领域已知方法进行。见例如美国专利5,023,252。这种
贴皮剂构建为连续的、脉冲的或者根据需要输送本发明提供的病毒。
皮施用贴皮剂的构建和使用根据本领域已知方法进行。见例如美国专利5,023,252。这种
贴皮剂构建为连续的、脉冲的或者根据需要输送本发明提供的病毒。
[0430] 可以用于输送病毒的胶体分散系包括大分子复合物、纳米微囊(nanocapsule)、微球体、珠和基于脂质的系统包括水包油乳状液(混和的)、微团、脂质体和脂质-核酸复合
物(lipoplex)。胶体分散系例如是脂质体。可使用器官特异性或细胞特异性脂质体以达到
仅输送至所希望的组织。脂质体的靶向可以通过本领域技术人员已知的方法进行。这种靶
向包括被动靶向(利用脂质体倾向分布于含有窦状小管的器官中RES的细胞的自然倾向)
或主动靶向(例如通过熟知的方法将脂质体与特异性配体的偶联，所述配体如抗体、受体、
糖、糖脂、蛋白质等)。可以使用单克隆抗体通过特异性细胞表面配体将脂质体靶向于特异
组织例如肿瘤组织。
物(lipoplex)。胶体分散系例如是脂质体。可使用器官特异性或细胞特异性脂质体以达到
仅输送至所希望的组织。脂质体的靶向可以通过本领域技术人员已知的方法进行。这种靶
向包括被动靶向(利用脂质体倾向分布于含有窦状小管的器官中RES的细胞的自然倾向)
或主动靶向(例如通过熟知的方法将脂质体与特异性配体的偶联，所述配体如抗体、受体、
糖、糖脂、蛋白质等)。可以使用单克隆抗体通过特异性细胞表面配体将脂质体靶向于特异
组织例如肿瘤组织。
[0431] 2.宿主细胞
[0432] 本发明还提供含有本发明提供的病毒的宿主细胞。这些细胞可以在体外应用或在体内应用，如用于本发明提供的诊断或治疗方法中。宿主细胞可以是一组单一类型的细胞
或者不同类型细胞的混合物。宿主细胞可包括培养的细胞系、原代细胞和增殖性细胞。这
些宿主细胞可包括对所述病毒感染易感的任何动物细胞，如哺乳动物、禽类和昆虫细胞和
组织，包括但不限于人、灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)和鸡胚细胞。
合适的宿主细胞包括但不限于造血细胞(全能细胞、干细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、
巨噬细胞、APC、树突状细胞、非人细胞等)、肺细胞、气管细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞(例如骨骼肌、心肌或平滑肌)、成纤维细胞、肿瘤细胞及如CV-1、BSC40、Vero、BSC40
和BSC-1及人HeLa细胞等细胞系。本领域已知感染和/或转化宿主细胞、根据表型选择感
染的细胞或转化体的方法及其它这种方法。
或者不同类型细胞的混合物。宿主细胞可包括培养的细胞系、原代细胞和增殖性细胞。这
些宿主细胞可包括对所述病毒感染易感的任何动物细胞，如哺乳动物、禽类和昆虫细胞和
组织，包括但不限于人、灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)和鸡胚细胞。
合适的宿主细胞包括但不限于造血细胞(全能细胞、干细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、
巨噬细胞、APC、树突状细胞、非人细胞等)、肺细胞、气管细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞(例如骨骼肌、心肌或平滑肌)、成纤维细胞、肿瘤细胞及如CV-1、BSC40、Vero、BSC40
和BSC-1及人HeLa细胞等细胞系。本领域已知感染和/或转化宿主细胞、根据表型选择感
染的细胞或转化体的方法及其它这种方法。
[0433] 3.组合
[0434] 本发明提供本发明提供的病毒与另一种制剂如第二种病毒或者其它治疗剂或诊断剂的组合。组合可包括本发明提供的一种病毒及一或多种其它病毒，包括一或多种另外
的诊断性或治疗性病毒。组合可含有包含本发明提供的病毒或者包含本文所述病毒的宿主
细胞的药物组合物。组合也可包含根据本发明提供的方法实现减毒的任何病毒或试剂，如
抗病毒剂或化疗剂。组合也可包含用于调节从由病毒编码的内源或异源基因中的基因表达
的化合物。
的诊断性或治疗性病毒。组合可含有包含本发明提供的病毒或者包含本文所述病毒的宿主
细胞的药物组合物。组合也可包含根据本发明提供的方法实现减毒的任何病毒或试剂，如
抗病毒剂或化疗剂。组合也可包含用于调节从由病毒编码的内源或异源基因中的基因表达
的化合物。
[0435] 本发明提供的组合可包含一种病毒和一种治疗性化合物。本发明提供的组合物中的治疗性化合物可以是例如抗癌化合物或化疗化合物。典型的治疗化合物包括细胞因
子、生长因子、光敏剂、放射性同位素、毒素、siRNA分子、酶/前体药物对、抗代谢物、信号
调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管发生抑制剂、化疗化合物、抗转移化合物、或者其任意
组合。本发明提供的病毒可以与抗癌化合物如铂配位络合物组合。典型的铂配位络合物
包括例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、DWA2114R、NK121、IS3295和254-S。典型的化疗剂还包
括但不限于氨甲喋呤、长春新碱、阿霉素、含有氯代乙基亚硝基脲的非糖、5-氟尿嘧啶、丝
裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇(taxol)、fragyline、Meglamine GLA、戊
柔比星(valrubicin)、卡莫司汀、聚苯丙生、MM1270、BAY12-9566、RAS法尼基转移酶抑制
剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、洛美曲索/LY264618、Glamolec、CI-994、
TNP-470、和美新/托泊替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、诺肖林/米托蒽醌、Metaret/舒
拉明、BB-94/巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、IS1641、ODN698、TA2516/马立马司他、BB2516/马立马司他、CDP845、
D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP2202、FK317、picibanil/OK-432、戊柔比星/AD32、
锶-89/氯化锶、Temodal/替莫唑胺、Yewtaxan/paclitaxel、Taxol/paclitaxel、Paxex/
paclitaxel、Cyclopax/口服paclitaxel、希罗达/卡培他滨、氟铁龙/去氧氟尿苷、口服
紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR1275/flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS致
癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟/尿嘧啶)、左旋咪唑(Ergamisol)/左
旋咪唑(levamisole)、开普拓/左旋咪唑(levamisole)、恩尿嘧啶/776C85/5FU增强剂、
Camptosar/伊立替康、雷替曲塞(Tomudex)/雷替曲塞(raltitrexed)、克拉立平/克拉屈
滨、Caelyx/脂质体多柔比星、Myocet/脂质体多柔比星、Doxil/脂质体多柔比星、Evacet/
脂质体多柔比星、福达华/氟达拉滨、法玛新/表柔比星、DepoCyt、ZD1839、LU79553/
Bis-Naphthalimide、LU103793/Dolastain、健择/吉西他滨、ZD0473/Anormed、YM116、碘
种子、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/dex异环磷酰胺、Ifex/Mesnex/异环磷
酰胺、Vumon/替尼泊苷、伯尔定/卡铂、Platinol/顺铂、VePesid/Eposin/Etopophos/依
托泊苷、ZD9331、泰素帝/多西他赛、鸟嘌呤阿拉伯糖苷的前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、
烷化剂如美法仑和环磷酰胺、氨鲁米特、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、盐酸阿糖
胞苷、放线菌素、盐酸正丁霉素、雌氮芥磷酸钠、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶
(5-FU)、氟他胺、羟基脲、异环磷酰胺(异环磷酰胺)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、醋酸亮
丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、氮芥HCl(氮芥)、巯嘌呤、美司钠、米
托坦(o，p′-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普利霉素、盐酸甲基苄肼、链脲菌素、柠檬酸他
莫昔芬、硫鸟嘌呤、塞替派、硫酸长春碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、红细胞生成素、六甲蜜胺(HMM)、白细胞介素2、米托胍腙(甲基-GAG甲基乙二醛-双(脒腙)，MGBG)、喷司他丁
(2′deoxycoformycin)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)及硫酸长春地辛。用于
本发明提供的药物组合物和组合中的另外的治疗性化合物可例如见于本文别处(见例如
章节I，如细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性同位素、毒素、siRNA分子、成对的酶/前药、抗代谢物、信号调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管发生抑制剂及化疗化合物)。
子、生长因子、光敏剂、放射性同位素、毒素、siRNA分子、酶/前体药物对、抗代谢物、信号
调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管发生抑制剂、化疗化合物、抗转移化合物、或者其任意
组合。本发明提供的病毒可以与抗癌化合物如铂配位络合物组合。典型的铂配位络合物
包括例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、DWA2114R、NK121、IS3295和254-S。典型的化疗剂还包
括但不限于氨甲喋呤、长春新碱、阿霉素、含有氯代乙基亚硝基脲的非糖、5-氟尿嘧啶、丝
裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇(taxol)、fragyline、Meglamine GLA、戊
柔比星(valrubicin)、卡莫司汀、聚苯丙生、MM1270、BAY12-9566、RAS法尼基转移酶抑制
剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、洛美曲索/LY264618、Glamolec、CI-994、
TNP-470、和美新/托泊替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、诺肖林/米托蒽醌、Metaret/舒
拉明、BB-94/巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、IS1641、ODN698、TA2516/马立马司他、BB2516/马立马司他、CDP845、
D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP2202、FK317、picibanil/OK-432、戊柔比星/AD32、
锶-89/氯化锶、Temodal/替莫唑胺、Yewtaxan/paclitaxel、Taxol/paclitaxel、Paxex/
paclitaxel、Cyclopax/口服paclitaxel、希罗达/卡培他滨、氟铁龙/去氧氟尿苷、口服
紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR1275/flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS致
癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟/尿嘧啶)、左旋咪唑(Ergamisol)/左
旋咪唑(levamisole)、开普拓/左旋咪唑(levamisole)、恩尿嘧啶/776C85/5FU增强剂、
Camptosar/伊立替康、雷替曲塞(Tomudex)/雷替曲塞(raltitrexed)、克拉立平/克拉屈
滨、Caelyx/脂质体多柔比星、Myocet/脂质体多柔比星、Doxil/脂质体多柔比星、Evacet/
脂质体多柔比星、福达华/氟达拉滨、法玛新/表柔比星、DepoCyt、ZD1839、LU79553/
Bis-Naphthalimide、LU103793/Dolastain、健择/吉西他滨、ZD0473/Anormed、YM116、碘
种子、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/dex异环磷酰胺、Ifex/Mesnex/异环磷
酰胺、Vumon/替尼泊苷、伯尔定/卡铂、Platinol/顺铂、VePesid/Eposin/Etopophos/依
托泊苷、ZD9331、泰素帝/多西他赛、鸟嘌呤阿拉伯糖苷的前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、
烷化剂如美法仑和环磷酰胺、氨鲁米特、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、盐酸阿糖
胞苷、放线菌素、盐酸正丁霉素、雌氮芥磷酸钠、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶
(5-FU)、氟他胺、羟基脲、异环磷酰胺(异环磷酰胺)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、醋酸亮
丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、氮芥HCl(氮芥)、巯嘌呤、美司钠、米
托坦(o，p′-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普利霉素、盐酸甲基苄肼、链脲菌素、柠檬酸他
莫昔芬、硫鸟嘌呤、塞替派、硫酸长春碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、红细胞生成素、六甲蜜胺(HMM)、白细胞介素2、米托胍腙(甲基-GAG甲基乙二醛-双(脒腙)，MGBG)、喷司他丁
(2′deoxycoformycin)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)及硫酸长春地辛。用于
本发明提供的药物组合物和组合中的另外的治疗性化合物可例如见于本文别处(见例如
章节I，如细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性同位素、毒素、siRNA分子、成对的酶/前药、抗代谢物、信号调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管发生抑制剂及化疗化合物)。
[0436] 在一些实例中，所述组合可包括另外的治疗性化合物，例如所述化合物是例如由病毒编码和表达的酶的底物，或者本发明提供的或者本领域已知的与病毒相关的其它治疗
性化合物。例如，所述病毒可表达使前药转变为活性化疗药以杀死癌细胞的酶。因此，本发
明提供的组合可含有治疗性化合物，如前药。典型的病毒/治疗性化合物组合可包含编码
单纯疱疹病毒胸苷激酶的病毒及前药更昔洛韦。用于本发明提供的组合中的另外的典型
的成对的酶/前药包括但不限于水痘带状疱疹胸苷激酶/更昔洛韦、胞嘧啶脱氨酶/5-氟
尿嘧啶、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷、β内酰胺酶/头孢菌素-阿霉素、羧
肽酶G2/4-[(2-氯代乙基)(2-甲磺酰氧乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸、细胞色素P450/
对乙酰氨基酚、辣根过氧化物酶/吲哚-3-乙酸、硝基还原酶/CB1954、兔羧酸酯酶/7-乙
基-10-[4-(1-哌啶)-1-哌啶]羰基氧喜树碱(CPT-11)、蘑菇酪氨酸酶/二-(2-氯代乙
基)氨基-4-羟苯基氨基甲酮28、β半乳糖苷酶/1-氯甲基-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯
基吲哚、β葡糖苷酸酶/表柔比星-葡糖苷酸、胸苷磷酸化酶/5’-脱氧-5-氟尿嘧啶、脱
氧胞苷激酶/胞嘧啶阿拉伯糖苷、β-内酰胺酶及inamerase/亚麻苦苷(linamarin)。用
于组合中的另外的典型的前药也可在本文别处发现(见例如章节I)。本发明提供的或者本
领域另外已知的任何已知组合均可包含与本发明提供的组合中。
性化合物。例如，所述病毒可表达使前药转变为活性化疗药以杀死癌细胞的酶。因此，本发
明提供的组合可含有治疗性化合物，如前药。典型的病毒/治疗性化合物组合可包含编码
单纯疱疹病毒胸苷激酶的病毒及前药更昔洛韦。用于本发明提供的组合中的另外的典型
的成对的酶/前药包括但不限于水痘带状疱疹胸苷激酶/更昔洛韦、胞嘧啶脱氨酶/5-氟
尿嘧啶、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷、β内酰胺酶/头孢菌素-阿霉素、羧
肽酶G2/4-[(2-氯代乙基)(2-甲磺酰氧乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸、细胞色素P450/
对乙酰氨基酚、辣根过氧化物酶/吲哚-3-乙酸、硝基还原酶/CB1954、兔羧酸酯酶/7-乙
基-10-[4-(1-哌啶)-1-哌啶]羰基氧喜树碱(CPT-11)、蘑菇酪氨酸酶/二-(2-氯代乙
基)氨基-4-羟苯基氨基甲酮28、β半乳糖苷酶/1-氯甲基-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯
基吲哚、β葡糖苷酸酶/表柔比星-葡糖苷酸、胸苷磷酸化酶/5’-脱氧-5-氟尿嘧啶、脱
氧胞苷激酶/胞嘧啶阿拉伯糖苷、β-内酰胺酶及inamerase/亚麻苦苷(linamarin)。用
于组合中的另外的典型的前药也可在本文别处发现(见例如章节I)。本发明提供的或者本
领域另外已知的任何已知组合均可包含与本发明提供的组合中。
[0437] 在一些实例中，所述组合可包括杀死或抑制病毒生长或毒性的化合物。这种化合物可用于减轻由病毒感染所致的一或多种副作用(见例如美国专利公开
US2009-016228-A1)。本发明提供的组合可含有用于治疗感染的抗生素、抗真菌剂、抗
寄生虫或抗病毒混合物。在一些实例中，抗病毒化合物是抑制病毒生长或毒性的化疗
剂。可与病毒一起包含在本发明提供的组合物中的典型的抗生素包括但不限于头孢他
啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、亚胺培南(imipenem)、氨基糖苷类抗生素、万
古霉素和抗假单胞菌β-内酰胺。可以与本发明提供的病毒一起包含在组合中的典型
的抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、氨苯砜(dapsone)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧
啶、灰黄霉素(griseofulvin)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康
唑(miconazole)、克霉唑(clotrimazole)、制霉菌素、及其组合。可以与本发明酮的病毒
一起包含与组合中的典型的抗病毒剂包括但不限于西多福韦(cidofovir)、西多福韦的烷
氧基烷基酯(CDV)、环形CDV、及(S)-9-(3-羟基-2磷酰基甲氧基丙基)腺嘌呤、5-(二
甲氧基甲基)-2′-脱氧尿苷、靛红-β-缩氨基硫脲、N-methanocarbathymidine、溴夫
定(brivudine)、7-deazaneplanocin A、ST-246、Gleevec、2′-β-氟代-2′，3′-双脱
氧腺苷、印地那韦(indinavir)、那非那韦(nelfinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈韦拉平
(nevirapine)、AZT、ddI、ddC、及其组合。典型地，具有抗病毒剂的组合含有已知有效对抗
所述组合的病毒的抗病毒剂。例如，组合可含有痘苗病毒与抗病毒化合物，如西多福韦，西
多福韦的烷氧基烷基酯，更昔洛韦，阿昔洛韦(acyclovir)、ST-246、Gleevec、及其衍生物。
US2009-016228-A1)。本发明提供的组合可含有用于治疗感染的抗生素、抗真菌剂、抗
寄生虫或抗病毒混合物。在一些实例中，抗病毒化合物是抑制病毒生长或毒性的化疗
剂。可与病毒一起包含在本发明提供的组合物中的典型的抗生素包括但不限于头孢他
啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、亚胺培南(imipenem)、氨基糖苷类抗生素、万
古霉素和抗假单胞菌β-内酰胺。可以与本发明提供的病毒一起包含在组合中的典型
的抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、氨苯砜(dapsone)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧
啶、灰黄霉素(griseofulvin)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康
唑(miconazole)、克霉唑(clotrimazole)、制霉菌素、及其组合。可以与本发明酮的病毒
一起包含与组合中的典型的抗病毒剂包括但不限于西多福韦(cidofovir)、西多福韦的烷
氧基烷基酯(CDV)、环形CDV、及(S)-9-(3-羟基-2磷酰基甲氧基丙基)腺嘌呤、5-(二
甲氧基甲基)-2′-脱氧尿苷、靛红-β-缩氨基硫脲、N-methanocarbathymidine、溴夫
定(brivudine)、7-deazaneplanocin A、ST-246、Gleevec、2′-β-氟代-2′，3′-双脱
氧腺苷、印地那韦(indinavir)、那非那韦(nelfinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈韦拉平
(nevirapine)、AZT、ddI、ddC、及其组合。典型地，具有抗病毒剂的组合含有已知有效对抗
所述组合的病毒的抗病毒剂。例如，组合可含有痘苗病毒与抗病毒化合物，如西多福韦，西
多福韦的烷氧基烷基酯，更昔洛韦，阿昔洛韦(acyclovir)、ST-246、Gleevec、及其衍生物。
[0438] 在一些实例中，所述组合可包括可检测化合物。可检测的化合物可包括例如配体、底物或者可与所述病毒编码和表达的蛋白质或RNA分子相互作用和/或特异性结合，并且
可提供一种可检测的信号如可通过X线断层摄影、光谱或磁共振技术检测的信号的其他化
合物。在一些实例中，所述蛋白质或RNA是外源蛋白质或RNA。在一些实例中，由所述病
毒表达的蛋白质或RNA修饰可检测的化合物，其中所述修饰的化合物发射可检测信号。可
检测的化合物例如可以是或者可以含有一种显影剂如磁共振、超声或X线断层摄影的显影
剂，包括放射性同位素。可检测的化合物可包括本发明提供的及本领域已知的其他任何化
合物。可以由所述病毒表达的蛋白质及用于检测的可检测化合物组合的实例包括但不限于
萤光素酶和荧光素，β-半乳糖苷酶和(4，7，10-三(乙酸)-1-(2-β-半乳糖吡喃糖苷乙
氧基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)钆(Egad)，及本领域已知的其它组合。
可提供一种可检测的信号如可通过X线断层摄影、光谱或磁共振技术检测的信号的其他化
合物。在一些实例中，所述蛋白质或RNA是外源蛋白质或RNA。在一些实例中，由所述病
毒表达的蛋白质或RNA修饰可检测的化合物，其中所述修饰的化合物发射可检测信号。可
检测的化合物例如可以是或者可以含有一种显影剂如磁共振、超声或X线断层摄影的显影
剂，包括放射性同位素。可检测的化合物可包括本发明提供的及本领域已知的其他任何化
合物。可以由所述病毒表达的蛋白质及用于检测的可检测化合物组合的实例包括但不限于
萤光素酶和荧光素，β-半乳糖苷酶和(4，7，10-三(乙酸)-1-(2-β-半乳糖吡喃糖苷乙
氧基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)钆(Egad)，及本领域已知的其它组合。
[0439] 在一些实例中，所述组合可包含调节由所述病毒编码的一或多个基因表达的基因表达调节化合物。调节基因表达的化合物为本领域所已知，包括但不限于转录激活物、诱导
剂、转录抑制剂、RNA聚合酶抑制剂，及RNA结合化合物如siRNA或核酶。本领域已知的任何
基因表达调节化合物均可以包含在本发明提供的组合中。典型地，与病毒一起包含在本发
明提供的组合中的基因表达调节化合物是这样的化合物，其可结合、抑制或者一或多种化
合物反应，所述化合物在如所述组合的病毒的转录因子或RNA的基因表达中是活性的。典
型的病毒/表达调节剂组合可以是编码嵌合的转录因子复合物的病毒，所述复合物具有与
酵母GAL4DNA结合结构域和单纯疱疹病毒蛋白VP16的激活结构域融合的突变的人孕酮受
体，还含有具有腺病毒主要晚期E1B TATA盒上游的一系列GAL4识别序列的合成的启动子，
其中所述化合物可以是RU486(见例如Yu et al.，Mol Genet Genomics2002268：169-178)。
本领域已知的各种其他病毒/表达调节剂组合也可以包括在本发明提供的组合中。
剂、转录抑制剂、RNA聚合酶抑制剂，及RNA结合化合物如siRNA或核酶。本领域已知的任何
基因表达调节化合物均可以包含在本发明提供的组合中。典型地，与病毒一起包含在本发
明提供的组合中的基因表达调节化合物是这样的化合物，其可结合、抑制或者一或多种化
合物反应，所述化合物在如所述组合的病毒的转录因子或RNA的基因表达中是活性的。典
型的病毒/表达调节剂组合可以是编码嵌合的转录因子复合物的病毒，所述复合物具有与
酵母GAL4DNA结合结构域和单纯疱疹病毒蛋白VP16的激活结构域融合的突变的人孕酮受
体，还含有具有腺病毒主要晚期E1B TATA盒上游的一系列GAL4识别序列的合成的启动子，
其中所述化合物可以是RU486(见例如Yu et al.，Mol Genet Genomics2002268：169-178)。
本领域已知的各种其他病毒/表达调节剂组合也可以包括在本发明提供的组合中。
[0440] 在一些实例中，所述组合可含有纳米颗粒。纳米颗粒可以被设计为携带本发明提供的一或多种治疗剂。此外，纳米颗粒可是设计为携带使所述纳米颗粒靶向于肿瘤细胞的
分子。在一个非限制性实例中，纳米颗粒用放射性同位素及任选与肿瘤相关抗原免疫反应
的抗体包被。
分子。在一个非限制性实例中，纳米颗粒用放射性同位素及任选与肿瘤相关抗原免疫反应
的抗体包被。
[0441] 在一些实例中，所述组合可含有一或多种另外的治疗性和/或诊断性病毒或者其它治疗性和/或诊断性微生物(例如治疗性和/或诊断性细菌)以进行诊断或治疗。典型
的治疗性或诊断性病毒为本领域已知，包括但不限于治疗性和/或诊断性痘病毒、疱疹病
毒、腺病毒、腺相关病毒和呼肠孤病毒。
的治疗性或诊断性病毒为本领域已知，包括但不限于治疗性和/或诊断性痘病毒、疱疹病
毒、腺病毒、腺相关病毒和呼肠孤病毒。
[0442] 4.试剂盒
[0443] 本发明提供的病毒、细胞、药物组合物或组合可以包装为试剂盒。试剂盒可任选包括一或多种成分，如使用指导书、装置和另外的试剂，及实施本发明方法的如试管、容器和
注射器等成分。典型的试剂盒可包括本发明提供的病毒，及可任选包括使用指导书，检测对
象中的病毒的装置，将所述病毒施用对象的装置，或者施用对象另外的物质或化合物的装
置。
注射器等成分。典型的试剂盒可包括本发明提供的病毒，及可任选包括使用指导书，检测对
象中的病毒的装置，将所述病毒施用对象的装置，或者施用对象另外的物质或化合物的装
置。
[0444] 在一个实例中，试剂盒可含有说明书。说明书典型地包括描述所述病毒及任选地试剂盒中包括的其他成分的说明，及施用方法的说明，包括为施用所述病毒确定所述对象
的适当状态、适当的剂量及适当的施用方法的说明。说明书还可以包括在处理持续时期监
测所述对象的指导。
的适当状态、适当的剂量及适当的施用方法的说明。说明书还可以包括在处理持续时期监
测所述对象的指导。
[0445] 在另一实例中，试剂盒可含有检测对象中病毒的一种装置。检测对象中病毒的装置可包括弱光成像装置以检测例如萤光素酶发出的光或者从荧光蛋白如绿色或红色荧光
蛋白发出的荧光，磁共振测量装置如MRI或NMR装置，X光断层扫描仪如PET、CT、CAT、SPECT
或者其他相关扫描仪，超声装置、或者可用于检测对象体内所述病毒表达的蛋白质的其他
装置。典型地，所述试剂盒的装置能检测试剂盒中所述病毒表达的一或多种蛋白质。含有
病毒和检测装置的任何试剂盒可包括在本发明提供的试剂盒中，例如表达萤光素酶的病毒
和弱光成像仪、或者表达荧光蛋白如绿色或红色荧光蛋白的微生物和弱光成像仪。
蛋白发出的荧光，磁共振测量装置如MRI或NMR装置，X光断层扫描仪如PET、CT、CAT、SPECT
或者其他相关扫描仪，超声装置、或者可用于检测对象体内所述病毒表达的蛋白质的其他
装置。典型地，所述试剂盒的装置能检测试剂盒中所述病毒表达的一或多种蛋白质。含有
病毒和检测装置的任何试剂盒可包括在本发明提供的试剂盒中，例如表达萤光素酶的病毒
和弱光成像仪、或者表达荧光蛋白如绿色或红色荧光蛋白的微生物和弱光成像仪。
[0446] 本发明提供的试剂盒还可以包括施用对象一种病毒的装置。本领域已知的施用药物、药物组合物或疫苗的任何装置均可包括在本发明提供的试剂盒中。装置例如包括皮下
注射器针头、静脉内注射针、导管、无针注射器、吸入器、液体分配器如点眼药器。例如，通过静脉内注射全身性施用的病毒可以与皮下注射器针头和注射器一起包括在试剂盒中。典型
地，施用所述试剂盒的病毒的装置与所述试剂盒的病毒相适合，例如无针注射器如高压注
射器可以包括在微生物不被高压注射损害的试剂盒中，但在所述病毒被高压注射损害的试
剂盒中通常不包括这种高压注射器。
注射器针头、静脉内注射针、导管、无针注射器、吸入器、液体分配器如点眼药器。例如，通过静脉内注射全身性施用的病毒可以与皮下注射器针头和注射器一起包括在试剂盒中。典型
地，施用所述试剂盒的病毒的装置与所述试剂盒的病毒相适合，例如无针注射器如高压注
射器可以包括在微生物不被高压注射损害的试剂盒中，但在所述病毒被高压注射损害的试
剂盒中通常不包括这种高压注射器。
[0447] 本发明提供的试剂盒也可包括施用对象一种另外的物质或化合物的装置。本领域已知的施用对象药物的任何各种装置均可以包括在本发明提供的试剂盒中。装置例如包括
但不限于皮下注射器针头、静脉内注射针、导管、无针注射器、吸入器和液体分配器如点眼
药器。典型地施用所述试剂盒的化合物的装置与所希望的施用所述化合物的方法相适合，
例如全身性或皮下施用的化合物可包括在具有皮下注射器针头和注射器的试剂盒中。
但不限于皮下注射器针头、静脉内注射针、导管、无针注射器、吸入器和液体分配器如点眼
药器。典型地施用所述试剂盒的化合物的装置与所希望的施用所述化合物的方法相适合，
例如全身性或皮下施用的化合物可包括在具有皮下注射器针头和注射器的试剂盒中。
[0448] G.治疗、诊断和监测方法
[0449] 本发明提供的病毒，包括本发明提供的克隆病毒毒株，可用于诊断、监测和治疗方法中。例如，在治疗方法中，本发明提供的病毒、包括克隆病毒毒株，可用于治疗增生性疾病
或病症，包括治疗癌性细胞、新生物(neoplasm)、肿瘤、转移及其它免疫豁免细胞或组织，如
创伤或炎症组织。本发明提供的病毒、包括本发明提供的克隆病毒毒株，可用于诊断方法中
以检测和成像癌性细胞、肿瘤和转移的监测治疗。在其它实例中，本发明提供的病毒、包括
克隆病毒毒株，可用于诊断或监测方法中，以检测病毒在宿主中的活性。本发明提供的诊断
和治疗方法包括但不限于将本发明提供的病毒施用至含有肿瘤和/或转移的对象。在其它
实例中，本发明提供的病毒、包括本发明提供的克隆病毒毒株，在免疫接种方法中可用作疫
苗。
或病症，包括治疗癌性细胞、新生物(neoplasm)、肿瘤、转移及其它免疫豁免细胞或组织，如
创伤或炎症组织。本发明提供的病毒、包括本发明提供的克隆病毒毒株，可用于诊断方法中
以检测和成像癌性细胞、肿瘤和转移的监测治疗。在其它实例中，本发明提供的病毒、包括
克隆病毒毒株，可用于诊断或监测方法中，以检测病毒在宿主中的活性。本发明提供的诊断
和治疗方法包括但不限于将本发明提供的病毒施用至含有肿瘤和/或转移的对象。在其它
实例中，本发明提供的病毒、包括本发明提供的克隆病毒毒株，在免疫接种方法中可用作疫
苗。
[0450] 施用的病毒具有一或多种特性，包括减弱的致病性、低毒性、在肿瘤中优先积累、激活针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、免疫原性、复制能力、表达另外的外源诊断性和/或
治疗性基因的能力，以及激发表达的基因产物的抗体产生的能力。可以施用所述病毒以诊
断、监测如监测治疗和/或治疗对象，例如但不限于人和其它哺乳动物，包括但不限于啮齿
类动物、狗、猫、灵长类动物和家畜。本发明提供的病毒可用于或者被修饰以用于任何已知
方法(或应用)中，其中已经应用了或者可以应用LIVP病毒。任何LIVP病毒，包括GLV-1h68
病毒及其衍生物，可用于和/或被修饰以用于下文描述的治疗方法和诊断方法中，并在本
发明中予以论述。
治疗性基因的能力，以及激发表达的基因产物的抗体产生的能力。可以施用所述病毒以诊
断、监测如监测治疗和/或治疗对象，例如但不限于人和其它哺乳动物，包括但不限于啮齿
类动物、狗、猫、灵长类动物和家畜。本发明提供的病毒可用于或者被修饰以用于任何已知
方法(或应用)中，其中已经应用了或者可以应用LIVP病毒。任何LIVP病毒，包括GLV-1h68
病毒及其衍生物，可用于和/或被修饰以用于下文描述的治疗方法和诊断方法中，并在本
发明中予以论述。
[0451] 1.治疗方法
[0452] 本发明提供的病毒、包括克隆病毒毒株，可用于治疗增生性疾病或病症，包括治疗(如抑制)癌性细胞、致瘤性、肿瘤、转移、癌干细胞，及其它免疫豁免细胞或组织，如创伤或
炎症组织。本发明提供的病毒优先在肿瘤或转移中积累。在一些实例中，施用本发明提供
的病毒使得肿瘤生长减慢。在其它实例中，施用本发明提供的病毒使得肿瘤体积减小，包括
消除或根除肿瘤。然而，本发明提供的治疗方法和应用不需要施用病毒以杀死肿瘤细胞或
者减小肿瘤大小。相反，本发明提供的方法包括施用对象本发明提供的病毒，其可导致或增
强对象体内抗肿瘤免疫应答。在一些实例中，本发明提供的病毒可以给对象施用而不导致
对象体内发生病毒诱导的疾病。在一些实例中，所述病毒可激发对象体内抗肿瘤免疫应答，
其中典型地病毒介导的抗肿瘤免疫应答可在例如几天、一周或更长、10天或更长、两周或更
长或者一个月或更长时间发生。在一些典型的方法中，病毒可以在肿瘤中存在，可导致抗肿
瘤免疫应答而病毒自身不导致足够的肿瘤细胞死亡以防止肿瘤生长。在一些实例中，所述
肿瘤是单治疗性(monotherapeutic)肿瘤或者单治疗性癌症，其中肿瘤或癌症当用所述病
毒或者治疗剂单独治疗时体积不降低。
炎症组织。本发明提供的病毒优先在肿瘤或转移中积累。在一些实例中，施用本发明提供
的病毒使得肿瘤生长减慢。在其它实例中，施用本发明提供的病毒使得肿瘤体积减小，包括
消除或根除肿瘤。然而，本发明提供的治疗方法和应用不需要施用病毒以杀死肿瘤细胞或
者减小肿瘤大小。相反，本发明提供的方法包括施用对象本发明提供的病毒，其可导致或增
强对象体内抗肿瘤免疫应答。在一些实例中，本发明提供的病毒可以给对象施用而不导致
对象体内发生病毒诱导的疾病。在一些实例中，所述病毒可激发对象体内抗肿瘤免疫应答，
其中典型地病毒介导的抗肿瘤免疫应答可在例如几天、一周或更长、10天或更长、两周或更
长或者一个月或更长时间发生。在一些典型的方法中，病毒可以在肿瘤中存在，可导致抗肿
瘤免疫应答而病毒自身不导致足够的肿瘤细胞死亡以防止肿瘤生长。在一些实例中，所述
肿瘤是单治疗性(monotherapeutic)肿瘤或者单治疗性癌症，其中肿瘤或癌症当用所述病
毒或者治疗剂单独治疗时体积不降低。
[0453] 在一些实例中，本发明提供的治疗方法抑制对象体内肿瘤生长，其中所述方法包括给对象施用一种病毒，所述病毒可在肿瘤和/或转移中积累，及可导致或增强抗肿瘤免
疫应答。由于在肿瘤或转移中积累的病毒诱导的抗肿瘤免疫应答可导致肿瘤生长抑制。
疫应答。由于在肿瘤或转移中积累的病毒诱导的抗肿瘤免疫应答可导致肿瘤生长抑制。
[0454] 在一些实例中，本发明提供的治疗方法抑制对象体内转移的生长或形成，其中所述方法包括给对象施用本发明提供的病毒，所述病毒可积累在肿瘤和/或转移中，且可导
致或增强抗肿瘤免疫应答。由于在肿瘤或转移积累的病毒诱导的抗肿瘤免疫应答可导致肿
瘤和/或转移的生长或形成受抑制。
致或增强抗肿瘤免疫应答。由于在肿瘤或转移积累的病毒诱导的抗肿瘤免疫应答可导致肿
瘤和/或转移的生长或形成受抑制。
[0455] 在其它实例中，本发明提供的治疗方法减小对象体内肿瘤和/或转移的大小，其中所述方法包括给对象施用本发明提供的病毒，所述病毒可积累在肿瘤和/或转移中，且
可导致或增强抗肿瘤免疫应答。由于在肿瘤或转移积累的病毒诱导的抗肿瘤免疫应答可导
致肿瘤和/或转移的大小减小。
可导致或增强抗肿瘤免疫应答。由于在肿瘤或转移积累的病毒诱导的抗肿瘤免疫应答可导
致肿瘤和/或转移的大小减小。
[0456] 在一些实例中，本发明提供的治疗方法从对象体内消除肿瘤和/或转移，其中所述方法包括给对象施用本发明提供的病毒，所述病毒可积累在肿瘤和/或转移中，且可导
致或增强抗肿瘤免疫应答。由于在肿瘤或转移积累的病毒诱导的抗肿瘤免疫应答可导致从
对象体内消除肿瘤和/或转移。
致或增强抗肿瘤免疫应答。由于在肿瘤或转移积累的病毒诱导的抗肿瘤免疫应答可导致从
对象体内消除肿瘤和/或转移。
[0457] 本发明提供的降低或抑制肿瘤生长、抑制转移生长和/或形成、降低肿瘤或转移的大小、消除肿瘤或转移和/或癌干细胞或者其它肿瘤治疗方法，包括在宿主体内引起或
增强抗肿瘤免疫应答。宿主的免疫应答实际上是抗肿瘤的免疫应答，其可对抗其中已经积
累的该病毒的肿瘤和/或转移，也可以对抗其中未积累该病毒的肿瘤和/或转移，包括在给
对象施用所述病毒之后形成的肿瘤和/或转移。因此，其生长或形成被抑制的、或者其大小
减小的或者被消除的肿瘤和/或转移，可以是其中已经积累了所述病毒的肿瘤和/或转移
或者也可以是其中未积累所述病毒的肿瘤和/或转移。因此，本发明提供降低或抑制肿瘤
生长、抑制转移生长和/或形成、减低肿瘤或转移的大小、消除肿瘤或转移的方法或者其它
肿瘤治疗方法，其中所述方法包括给对象施用本发明提供的病毒，其中所述病毒积累在至
少一个肿瘤或转移中，并导致或增强对象体内抗肿瘤免疫应答，所述免疫应答也对抗其中
病毒细胞未积累的肿瘤和/或转移。在另一实例中，本发明提供的抑制或预防致瘤性复发
或者抑制或预防新肿瘤生长的方法，其中所述方法包括给对象施用本发明提供的病毒，所
述病毒可积累在肿瘤和/或转移中，且可导致或增强抗肿瘤免疫应答，所述抗肿瘤免疫应
答可抑制或防止致瘤性复发或者抑制或防止新肿瘤生长。
增强抗肿瘤免疫应答。宿主的免疫应答实际上是抗肿瘤的免疫应答，其可对抗其中已经积
累的该病毒的肿瘤和/或转移，也可以对抗其中未积累该病毒的肿瘤和/或转移，包括在给
对象施用所述病毒之后形成的肿瘤和/或转移。因此，其生长或形成被抑制的、或者其大小
减小的或者被消除的肿瘤和/或转移，可以是其中已经积累了所述病毒的肿瘤和/或转移
或者也可以是其中未积累所述病毒的肿瘤和/或转移。因此，本发明提供降低或抑制肿瘤
生长、抑制转移生长和/或形成、减低肿瘤或转移的大小、消除肿瘤或转移的方法或者其它
肿瘤治疗方法，其中所述方法包括给对象施用本发明提供的病毒，其中所述病毒积累在至
少一个肿瘤或转移中，并导致或增强对象体内抗肿瘤免疫应答，所述免疫应答也对抗其中
病毒细胞未积累的肿瘤和/或转移。在另一实例中，本发明提供的抑制或预防致瘤性复发
或者抑制或预防新肿瘤生长的方法，其中所述方法包括给对象施用本发明提供的病毒，所
述病毒可积累在肿瘤和/或转移中，且可导致或增强抗肿瘤免疫应答，所述抗肿瘤免疫应
答可抑制或防止致瘤性复发或者抑制或防止新肿瘤生长。
[0458] 本发明提供的肿瘤或致瘤性疾病的治疗方法，如降低或抑制肿瘤生长、抑制转移生长和/或形成、降低肿瘤或转移的大小、消除肿瘤或转移的方法或者其它肿瘤治疗方法，
也可包括给对象施用本发明提供的病毒，所述病毒可导致肿瘤细胞裂解或者肿瘤细胞死
亡。这种病毒与可导致或增强对象体内抗肿瘤免疫应答的病毒可以是相同病毒。病毒，如
本发明提供的病毒，由于内源基因表达或者外源基因表达的结果而可以导致细胞裂解或者
肿瘤细胞死亡。如本领域所以已知，内源或外源基因由于直接或间接作用的结果而可导致
肿瘤细胞裂解或者抑制细胞生长，包括裂解通道(lytic channel)形成或者细胞凋亡途径
激活。基因产物如外源基因产物，可发挥激活前药为活性、细胞毒性形式，导致表达这种基
因的细胞死亡。
也可包括给对象施用本发明提供的病毒，所述病毒可导致肿瘤细胞裂解或者肿瘤细胞死
亡。这种病毒与可导致或增强对象体内抗肿瘤免疫应答的病毒可以是相同病毒。病毒，如
本发明提供的病毒，由于内源基因表达或者外源基因表达的结果而可以导致细胞裂解或者
肿瘤细胞死亡。如本领域所以已知，内源或外源基因由于直接或间接作用的结果而可导致
肿瘤细胞裂解或者抑制细胞生长，包括裂解通道(lytic channel)形成或者细胞凋亡途径
激活。基因产物如外源基因产物，可发挥激活前药为活性、细胞毒性形式，导致表达这种基
因的细胞死亡。
[0459] 这种肿瘤和/或转移的治疗方法可包括施用本发明提供的病毒进行治疗，如基因治疗，癌症基因治疗或者疫苗治疗。这种病毒可用于在对象体内刺激体液和/或细胞免
疫应答，诱导强细胞毒性T淋巴细胞应答，所述对象可得益于这种应答。例如，通过使用
病毒从肿瘤或损害中排斥细胞，所述病毒可提供对于由所述病毒感染的肿瘤或者其它感
染性疾病的预防和治疗作用，所述病毒表达免疫反应性抗原(Earl et al.，Science234：
728-831(1986)；Lathe et al.，Nature(London)32：878-880(1987))、细胞肿瘤相关抗原
(Bernards et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：6854-6858(1987)；Estin et al.，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA85：1052-1056(1988)；Kantor et al.，J. Natl.Cancer Inst.84：
1084-1091(1992)；Roth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：4781-4786(1996))和/或
细胞因子(例如IL-2，IL-12)、共刺激分子(B7-1，B7-2)(Rao et al.，J. Immunol.156：
3357-3365(1996)；Chamberlain et al.，CancerRes.56：2832-2836(1996)；Oertli et
al.，J. Gen.Virol.77：3121-3125(1996)；Qin and Chatterjee，Human Gene Ther.7：
1853-1860(1996)；McAneny et al.，Ann.Surg.Oncol.3：495-500(1996))，或者其它治疗性
蛋白质。
疫应答，诱导强细胞毒性T淋巴细胞应答，所述对象可得益于这种应答。例如，通过使用
病毒从肿瘤或损害中排斥细胞，所述病毒可提供对于由所述病毒感染的肿瘤或者其它感
染性疾病的预防和治疗作用，所述病毒表达免疫反应性抗原(Earl et al.，Science234：
728-831(1986)；Lathe et al.，Nature(London)32：878-880(1987))、细胞肿瘤相关抗原
(Bernards et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：6854-6858(1987)；Estin et al.，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA85：1052-1056(1988)；Kantor et al.，J. Natl.Cancer Inst.84：
1084-1091(1992)；Roth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：4781-4786(1996))和/或
细胞因子(例如IL-2，IL-12)、共刺激分子(B7-1，B7-2)(Rao et al.，J. Immunol.156：
3357-3365(1996)；Chamberlain et al.，CancerRes.56：2832-2836(1996)；Oertli et
al.，J. Gen.Virol.77：3121-3125(1996)；Qin and Chatterjee，Human Gene Ther.7：
1853-1860(1996)；McAneny et al.，Ann.Surg.Oncol.3：495-500(1996))，或者其它治疗性
蛋白质。
[0460] 如先前示出，实体肿瘤可以用病毒如痘苗病毒治疗，产生大量肿瘤特异性病毒复制，这可导致在肿瘤中产生肿瘤蛋白质抗原和病毒蛋白质(美国专利申请公开号
2005-0031643，现为美国专利号7,588,767，7,588,771，7,662,398)，所述专利提供和例证
了GLV-1h68病毒及其衍生物。将痘苗病毒施用至小鼠导致感染的肿瘤细胞裂解及所得肿
瘤-细胞-特异性抗原释放。这些抗原持续渗入身体中导致小鼠体内对抗肿瘤蛋白质、病
毒蛋白和病毒编码的工程化蛋白质的非常高水平的抗体效价(在大约7-14天)。新合成的
抗肿瘤抗体及增强的巨噬细胞、中性粒细胞计数通过脉管系统持续输送给肿瘤，从而供给
对抗肿瘤的激活的免疫系统的募集。然后激活的免疫系统消除肿瘤的外来化合物，包括病
毒颗粒。外来抗原的这种互相联系的释放促进抗体产生及抗体对肿瘤蛋白的持续应答，发
挥如自身免疫接种系统功能，通过痘苗病毒感染和复制起始，随后细胞裂解，蛋白质渗出及
增强的抗体产生。因此，本发明提供的病毒及使用本发明提供的方法产生的病毒可以在一
个复合程序中施用，其可用于具有免疫豁免的肿瘤位点作为豁免的病毒生长位点的所有肿
瘤系统，通过宿主自身免疫系统可导致肿瘤消除。
2005-0031643，现为美国专利号7,588,767，7,588,771，7,662,398)，所述专利提供和例证
了GLV-1h68病毒及其衍生物。将痘苗病毒施用至小鼠导致感染的肿瘤细胞裂解及所得肿
瘤-细胞-特异性抗原释放。这些抗原持续渗入身体中导致小鼠体内对抗肿瘤蛋白质、病
毒蛋白和病毒编码的工程化蛋白质的非常高水平的抗体效价(在大约7-14天)。新合成的
抗肿瘤抗体及增强的巨噬细胞、中性粒细胞计数通过脉管系统持续输送给肿瘤，从而供给
对抗肿瘤的激活的免疫系统的募集。然后激活的免疫系统消除肿瘤的外来化合物，包括病
毒颗粒。外来抗原的这种互相联系的释放促进抗体产生及抗体对肿瘤蛋白的持续应答，发
挥如自身免疫接种系统功能，通过痘苗病毒感染和复制起始，随后细胞裂解，蛋白质渗出及
增强的抗体产生。因此，本发明提供的病毒及使用本发明提供的方法产生的病毒可以在一
个复合程序中施用，其可用于具有免疫豁免的肿瘤位点作为豁免的病毒生长位点的所有肿
瘤系统，通过宿主自身免疫系统可导致肿瘤消除。
[0461] 在一个实例中，治疗的肿瘤是癌症，如胰腺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤或白血病，所述癌症不限于此，通过本发明提供的组合可以治疗其它转移疾病。例如，治疗的
肿瘤可以是实体肿瘤，如肺癌和支气管癌，乳腺癌，结肠癌和直肠癌，肾癌，胃癌，食管癌，
肝癌和肝内胆管癌，膀胱癌，脑癌及其它神经系统癌症，头颈癌，口腔癌和咽癌，子宫颈癌，
子宫体癌，甲状腺癌，卵巢癌，睾丸癌，前列腺癌，恶性黑素瘤，肝胆管型肝癌，胸腺瘤，非黑素瘤皮肤癌，以及血液系统肿瘤和/或恶性病变，如儿童白血病和淋巴瘤，多发性骨髓瘤
Hodgkin′s病，源于淋巴细胞和皮肤的淋巴瘤，急性和慢性白血病如极性成淋巴细胞白血
病，急性粒细胞样或慢性粒细胞样白血病，浆细胞瘤，淋巴性肿瘤及与AIDS相关的癌症。典
型的肿瘤包括如胰腺肿瘤，卵巢肿瘤，肺肿瘤，结肠肿瘤，前列腺肿瘤，子宫颈肿瘤及乳腺肿
瘤。在一个实例中，所述肿瘤是癌瘤，如卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
肿瘤可以是实体肿瘤，如肺癌和支气管癌，乳腺癌，结肠癌和直肠癌，肾癌，胃癌，食管癌，
肝癌和肝内胆管癌，膀胱癌，脑癌及其它神经系统癌症，头颈癌，口腔癌和咽癌，子宫颈癌，
子宫体癌，甲状腺癌，卵巢癌，睾丸癌，前列腺癌，恶性黑素瘤，肝胆管型肝癌，胸腺瘤，非黑素瘤皮肤癌，以及血液系统肿瘤和/或恶性病变，如儿童白血病和淋巴瘤，多发性骨髓瘤
Hodgkin′s病，源于淋巴细胞和皮肤的淋巴瘤，急性和慢性白血病如极性成淋巴细胞白血
病，急性粒细胞样或慢性粒细胞样白血病，浆细胞瘤，淋巴性肿瘤及与AIDS相关的癌症。典
型的肿瘤包括如胰腺肿瘤，卵巢肿瘤，肺肿瘤，结肠肿瘤，前列腺肿瘤，子宫颈肿瘤及乳腺肿
瘤。在一个实例中，所述肿瘤是癌瘤，如卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
[0462] 在其它实例中，提供方法对对象进行免疫，所述方法包括给对象施用表达一或多种抗原的病毒，所述对象对抗该抗原发生免疫应答。免疫抗原对于所述病毒可以是内源的，
如痘苗病毒上的痘苗病毒抗原，用于免于天花、麻疹、腮腺炎，或者免疫抗原可以是由病毒
表达的外源抗原，如在病毒衣壳表面上表达的流感病毒或HIV抗原。在天花病毒的情况中，
例如肿瘤特异性蛋白抗原可以由针对天花疫苗的减毒的痘苗病毒(由病毒基因组编码)携
带。因此，本发明提供的病毒包括修饰的痘苗病毒可以用作疫苗。
如痘苗病毒上的痘苗病毒抗原，用于免于天花、麻疹、腮腺炎，或者免疫抗原可以是由病毒
表达的外源抗原，如在病毒衣壳表面上表达的流感病毒或HIV抗原。在天花病毒的情况中，
例如肿瘤特异性蛋白抗原可以由针对天花疫苗的减毒的痘苗病毒(由病毒基因组编码)携
带。因此，本发明提供的病毒包括修饰的痘苗病毒可以用作疫苗。
[0463] 在一些实例中，本发明提供在对象体内针对选择的抗原或选择的抗原类型激发或增强抗体产生的方法，所述方法包括给对象施用一种病毒，所述病毒可以在肿瘤和/或转
移中积累，及可引起选择的抗原或选择的抗原类型从肿瘤中释放，导致针对选择的抗原或
选择的抗原类型的抗体产生。在本发明提供的方法中任何各种抗原均可被靶向，包括选择
的抗原如由该病毒表达的外源基因产物，或者选择的抗原类型如由于肿瘤的病毒感染而从
肿瘤中释放的一或多种肿瘤抗原(例如通过裂解，细胞凋亡，分泌或者其它导致抗原从肿
瘤中释放的其它机制)。
移中积累，及可引起选择的抗原或选择的抗原类型从肿瘤中释放，导致针对选择的抗原或
选择的抗原类型的抗体产生。在本发明提供的方法中任何各种抗原均可被靶向，包括选择
的抗原如由该病毒表达的外源基因产物，或者选择的抗原类型如由于肿瘤的病毒感染而从
肿瘤中释放的一或多种肿瘤抗原(例如通过裂解，细胞凋亡，分泌或者其它导致抗原从肿
瘤中释放的其它机制)。
[0464] 在一些实例中，可取的是维持选择的抗原或选择的抗原类型在一段时间内释放，如至少1周、至少10天、至少2周或者至少1个月。本发明提供在对象体内持续释放抗原
的方法，所述方法包括给对象施用一种病毒，所述病毒可在肿瘤和/或转移中积累，及可引
起抗原的持续释放，导致针对该抗原的抗体产生。抗原的持续释放导致病毒感染的宿主的
免疫应答，其中所述宿主可产生该抗原的抗体，和/或宿主可产生针对表达该抗原的细胞
的免疫应答，包括对抗肿瘤细胞的免疫应答。因此，抗原的持续释放可导致针对肿瘤细胞的
免疫作用。在一些实例中，病毒介导的持续抗原释放诱导的针对肿瘤细胞的免疫应答可导
致所有肿瘤细胞的完全消除或杀灭。
的方法，所述方法包括给对象施用一种病毒，所述病毒可在肿瘤和/或转移中积累，及可引
起抗原的持续释放，导致针对该抗原的抗体产生。抗原的持续释放导致病毒感染的宿主的
免疫应答，其中所述宿主可产生该抗原的抗体，和/或宿主可产生针对表达该抗原的细胞
的免疫应答，包括对抗肿瘤细胞的免疫应答。因此，抗原的持续释放可导致针对肿瘤细胞的
免疫作用。在一些实例中，病毒介导的持续抗原释放诱导的针对肿瘤细胞的免疫应答可导
致所有肿瘤细胞的完全消除或杀灭。
[0465] 2.诊断和监测方法
[0466] 本发明提供的病毒、包括本发明提供的克隆病毒毒株，可用于诊断方法中以检测和成像癌细胞、肿瘤、癌干细胞和转移监测治疗。如上文论述，本发明提供的病毒可以积累
在肿瘤或转移中。因此，本发明提供通过施用一种病毒毒株检测对象体内肿瘤或转移的方
法，所述病毒毒株编码可检测的蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质，从而检测所述可检
测的蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质以表明肿瘤或转移的存在。可检测的蛋白质或者
诱导可检测信号的蛋白质可以通过本领域技术人员已知的任何成像技术检测。
在肿瘤或转移中。因此，本发明提供通过施用一种病毒毒株检测对象体内肿瘤或转移的方
法，所述病毒毒株编码可检测的蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质，从而检测所述可检
测的蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质以表明肿瘤或转移的存在。可检测的蛋白质或者
诱导可检测信号的蛋白质可以通过本领域技术人员已知的任何成像技术检测。
[0467] 在其它实例中，本发明提供的病毒、包括克隆病毒毒株，可用于诊断或监测方法中。例如，本发明提供的病毒可用于检测宿主中病毒活性如复制活性的方法中。本发明提
供的病毒是溶瘤病毒，因此杀死并裂解肿瘤细胞。在肿瘤细胞内部感染和复制的活性病毒
表达蛋白质(如内源或转基因编码的)，在肿瘤细胞裂解时可从肿瘤细胞中过滤出并在身
体中循环。因此，病毒编码的蛋白质可以在肿瘤或者在其它体液中检测，以测量活性，如复
制活性，这是测量病毒溶瘤活性。此外，所述方法还允许在携带肿瘤的患者体内直接诊断肿
瘤并证实成功的肿瘤定殖，因为活性病毒优先在肿瘤细胞中积累和复制。药动学测定可用
于测量可检测的蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质，以监测病毒随着时间的感染和/或
活性。例如，病毒表达的蛋白质或者可检测的蛋白质可以在施用病毒后从肿瘤或者体液中
检测，及在用病毒处理后几分钟、几小时或几天后监测。例如，可从对象获取样品并评估病
毒表达的蛋白质或者可检测蛋白质，或者可以对对象进行成像以检测可检测的蛋白质的存
在情况，在施用病毒后5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小
时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时或更长时间内检测。在
其它实例中，可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天测定一次病毒表达的蛋白质或者
可检测的蛋白质。在检测病毒活性的方法中，可以通过侵入方法检测，如从对象获得体液，
或者通过非侵入方法检测如成像方法。
供的病毒是溶瘤病毒，因此杀死并裂解肿瘤细胞。在肿瘤细胞内部感染和复制的活性病毒
表达蛋白质(如内源或转基因编码的)，在肿瘤细胞裂解时可从肿瘤细胞中过滤出并在身
体中循环。因此，病毒编码的蛋白质可以在肿瘤或者在其它体液中检测，以测量活性，如复
制活性，这是测量病毒溶瘤活性。此外，所述方法还允许在携带肿瘤的患者体内直接诊断肿
瘤并证实成功的肿瘤定殖，因为活性病毒优先在肿瘤细胞中积累和复制。药动学测定可用
于测量可检测的蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质，以监测病毒随着时间的感染和/或
活性。例如，病毒表达的蛋白质或者可检测的蛋白质可以在施用病毒后从肿瘤或者体液中
检测，及在用病毒处理后几分钟、几小时或几天后监测。例如，可从对象获取样品并评估病
毒表达的蛋白质或者可检测蛋白质，或者可以对对象进行成像以检测可检测的蛋白质的存
在情况，在施用病毒后5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小
时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时或更长时间内检测。在
其它实例中，可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天测定一次病毒表达的蛋白质或者
可检测的蛋白质。在检测病毒活性的方法中，可以通过侵入方法检测，如从对象获得体液，
或者通过非侵入方法检测如成像方法。
[0468] 在诊断、检测或监测方法中，可检测的蛋白质或可检测的信号可以是由在上述章节D中本发明提供的基因编码的任何蛋白质，所述病毒已经被修饰以表达蛋白质。例如，
可检测蛋白质或诱导可检测信号的蛋白质包括但不限于萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋
白、结合和/或转运造影剂的受体或转运蛋白、细胞色素、可被检测的化合物或配体，或者
由黑色素合成基因编码的黑色素。在一些实例中，可检测的蛋白质或者诱导可检测信号的
蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、铁受体、铁转运蛋白、人肾上腺素受体
(hNET)和碘化钠同向转移蛋白(NIS)。
可检测蛋白质或诱导可检测信号的蛋白质包括但不限于萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋
白、结合和/或转运造影剂的受体或转运蛋白、细胞色素、可被检测的化合物或配体，或者
由黑色素合成基因编码的黑色素。在一些实例中，可检测的蛋白质或者诱导可检测信号的
蛋白质是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、铁受体、铁转运蛋白、人肾上腺素受体
(hNET)和碘化钠同向转移蛋白(NIS)。
[0469] 在任何这些实例中，可检测的蛋白质或者可检测信号可以通过成像方法检测。典型的成像方法包括例如弱光成像、荧光光谱学、X-线照相，磁共振成像(MRI)、磁共振光谱
分析(MRS)、正电子成像术(PET)、单光子发射计算机断层X射线照相术(SPECT)、或者(多
谱)光-/光声X线断层摄影术((MS)OAT)。这些技术在本领域技术人员的技术水平内，技
术人员可以根据待检测的特定的可检测蛋白质或者可检测的信号选择适当的成像技术。
分析(MRS)、正电子成像术(PET)、单光子发射计算机断层X射线照相术(SPECT)、或者(多
谱)光-/光声X线断层摄影术((MS)OAT)。这些技术在本领域技术人员的技术水平内，技
术人员可以根据待检测的特定的可检测蛋白质或者可检测的信号选择适当的成像技术。
[0470] 在通过侵入方法如从收集的对象或患者的体液中检测病毒活性的实例中，可以收集任何体液并测定可检测的蛋白质或者诱导可检测信号的蛋白质的存在或水平。体液的
非限制性实例包括但不限于尿液、血液、泪液或脑脊髓液(CSF)。可以使用任何荧光或发光
检测方法，例如使用荧光光谱仪或者显微镜，荧光-发光微平板分析仪，或者荧光激活的细
胞分选。在检测活性病毒或病毒肿瘤定居的这种方法的一个实例中，可以在取自预先施用
GusA-编码病毒的对象的体液样品如血清中加入可由β-葡糖苷酸酶激活的探针。这种探
针的实例是GusA-可激活的化合物，如FDGlcU和4-MUG。所述体液可以是在用病毒注射对
象后某一时间后收集的样品。可以分析样品的激活的荧光化合物情况。
非限制性实例包括但不限于尿液、血液、泪液或脑脊髓液(CSF)。可以使用任何荧光或发光
检测方法，例如使用荧光光谱仪或者显微镜，荧光-发光微平板分析仪，或者荧光激活的细
胞分选。在检测活性病毒或病毒肿瘤定居的这种方法的一个实例中，可以在取自预先施用
GusA-编码病毒的对象的体液样品如血清中加入可由β-葡糖苷酸酶激活的探针。这种探
针的实例是GusA-可激活的化合物，如FDGlcU和4-MUG。所述体液可以是在用病毒注射对
象后某一时间后收集的样品。可以分析样品的激活的荧光化合物情况。
[0471] 3.施用
[0472] 本发明提供的病毒可以给对象施用，包括具有肿瘤或者具有致瘤性细胞的对象或者被免疫的对象。施用的病毒可以是本发明提供的病毒或者使用本发明的方法产生的任何
其它病毒。在一些实例中，施用的病毒是这样的病毒，其具有如减毒的致病性、较低毒性、预
先在肿瘤中积累、激活针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、高免疫原性、复制能力和表达外源
蛋白质的能力以及这些性质的组合。
其它病毒。在一些实例中，施用的病毒是这样的病毒，其具有如减毒的致病性、较低毒性、预
先在肿瘤中积累、激活针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、高免疫原性、复制能力和表达外源
蛋白质的能力以及这些性质的组合。
[0473] a.施用病毒前的步骤
[0474] 在一些实例中，在施用所述对象所述病毒之前可进行一或多个步骤。可以进行任何前期步骤，包括但不限于诊断具有适于病毒施用的条件的对象，确定对象的免疫活性，使
所述对象免疫，用化疗剂处理所述对象，用放射线处理所述对象或者对对象进行手术。
所述对象免疫，用化疗剂处理所述对象，用放射线处理所述对象或者对对象进行手术。
[0475] 对于包括将病毒施用至携带肿瘤的对象以进行治疗的实例而言，所述对象典型先前已经诊断为患有致瘤性病变(neoplastic condition)。诊断方法也可包括确定致瘤性
病变的类型，确定致瘤性病变的阶段，确定所述对象中一或多个肿瘤的大小，确定所述对象
淋巴结中转移的或致瘤性细胞的存在与否，或者确定所述对象中转移的存在与否。给对象
施用病毒的治疗方法的一些实例可包括确定原发肿瘤的大小或肿瘤疾病的阶段的步骤，并
且如果原发肿瘤的大小等于或超过阈体积或者如果肿瘤疾病的阶段处于或超过阈阶段之
上，则将所述病毒施用所述对象。在一个相似的实例中，如果原发肿瘤的大小低于阈体积
或者如果肿瘤疾病的阶段处于或低于阈阶段，则还不用将所述病毒施用所述对象；这些方
法可包括监测所述对象直至肿瘤大小或肿瘤疾病阶段达到阈值，然后施用所述对象所述病
毒。大小阈值可以根据一些因素而变化，包括肿瘤的生长速度，病毒感染肿瘤的能力及所述
对象的免疫活性。通常大小阈值是这样的大小，其足以使得病毒在肿瘤内或附近积累及复
制并且不被宿主的免疫系统完全除去，而且典型地还是足以维持病毒感染足够长的时间以
使得宿主激发针对所述肿瘤细胞的免疫应答，典型为大约1周或更长时间，大约10天或更
长时间，或者大约两周或更长时间。对于病毒如痘苗病毒而言肿瘤大小的阈值例如至少大
3 3 3 3 3
约100mm、至少大约200mm、至少大约300mm、至少大约400mm、至少大约500mm、至少大约
3 3 3
750mm、至少大约1000mm 或者至少大约1500mm。肿瘤疾病的阈阶段也可以根据一些因素
变化，包括对特定肿瘤疾病分阶段的特殊需要，肿瘤疾病生长的迅速蔓延，所述病毒感染肿
瘤或转移的能力，及对象的免疫活性。通常地，所述阈值阶段是这样的阶段，其足以使得病
毒在肿瘤或转移中积累并复制，而不被宿主的免疫系统完全除去，并且典型地还足以维持
病毒感染足够长的时间以使得宿主激发针对致瘤性细胞的免疫应答，典型地为大约1周或
更长时间，大约10天或更长时间，或者大约2周或更长时间。阈阶段例如是超过最低阶段
的任何阶段(例如阶段I或等同阶段)，或者是其中原发肿瘤大于阈值大小的任何阶段，或
者其中检测到转移细胞的任何阶段。
病变的类型，确定致瘤性病变的阶段，确定所述对象中一或多个肿瘤的大小，确定所述对象
淋巴结中转移的或致瘤性细胞的存在与否，或者确定所述对象中转移的存在与否。给对象
施用病毒的治疗方法的一些实例可包括确定原发肿瘤的大小或肿瘤疾病的阶段的步骤，并
且如果原发肿瘤的大小等于或超过阈体积或者如果肿瘤疾病的阶段处于或超过阈阶段之
上，则将所述病毒施用所述对象。在一个相似的实例中，如果原发肿瘤的大小低于阈体积
或者如果肿瘤疾病的阶段处于或低于阈阶段，则还不用将所述病毒施用所述对象；这些方
法可包括监测所述对象直至肿瘤大小或肿瘤疾病阶段达到阈值，然后施用所述对象所述病
毒。大小阈值可以根据一些因素而变化，包括肿瘤的生长速度，病毒感染肿瘤的能力及所述
对象的免疫活性。通常大小阈值是这样的大小，其足以使得病毒在肿瘤内或附近积累及复
制并且不被宿主的免疫系统完全除去，而且典型地还是足以维持病毒感染足够长的时间以
使得宿主激发针对所述肿瘤细胞的免疫应答，典型为大约1周或更长时间，大约10天或更
长时间，或者大约两周或更长时间。对于病毒如痘苗病毒而言肿瘤大小的阈值例如至少大
3 3 3 3 3
约100mm、至少大约200mm、至少大约300mm、至少大约400mm、至少大约500mm、至少大约
3 3 3
750mm、至少大约1000mm 或者至少大约1500mm。肿瘤疾病的阈阶段也可以根据一些因素
变化，包括对特定肿瘤疾病分阶段的特殊需要，肿瘤疾病生长的迅速蔓延，所述病毒感染肿
瘤或转移的能力，及对象的免疫活性。通常地，所述阈值阶段是这样的阶段，其足以使得病
毒在肿瘤或转移中积累并复制，而不被宿主的免疫系统完全除去，并且典型地还足以维持
病毒感染足够长的时间以使得宿主激发针对致瘤性细胞的免疫应答，典型地为大约1周或
更长时间，大约10天或更长时间，或者大约2周或更长时间。阈阶段例如是超过最低阶段
的任何阶段(例如阶段I或等同阶段)，或者是其中原发肿瘤大于阈值大小的任何阶段，或
者其中检测到转移细胞的任何阶段。
[0476] 在其它实例中，在给对象施用微生物之前，可以确定所述对象的免疫活性。本发明提供的给对象施用病毒的方法可包括引起或增强对象的免疫应答。因此，在给对象施用病
毒之前，可以确定对象激发免疫应答的能力。在本发明提供的方法中可进行任何本领域已
知的免疫活性测试。免疫活性测试例如可检测ABO血细胞凝集效价(IgM)，白细胞粘着缺陷
(LAD)，粒细胞功能(NBT)，T和B细胞定量，破伤风抗体效价，唾液IgA，皮肤测试，扁桃体测
试，补体C3水平，B因子水平，及淋巴细胞计数。本领域技术人员可以确定给对象施用病毒
的需要性，根据所述对象的免疫活性水平、根据所述病毒的免疫原性、及任选地根据待治疗
的肿瘤疾病的免疫原性而确定。典型地，如果技术人员可以确定对象具有足够的激发针对
所述病毒的免疫应答能力，则可以认为所述对象是免疫活性的。
毒之前，可以确定对象激发免疫应答的能力。在本发明提供的方法中可进行任何本领域已
知的免疫活性测试。免疫活性测试例如可检测ABO血细胞凝集效价(IgM)，白细胞粘着缺陷
(LAD)，粒细胞功能(NBT)，T和B细胞定量，破伤风抗体效价，唾液IgA，皮肤测试，扁桃体测
试，补体C3水平，B因子水平，及淋巴细胞计数。本领域技术人员可以确定给对象施用病毒
的需要性，根据所述对象的免疫活性水平、根据所述病毒的免疫原性、及任选地根据待治疗
的肿瘤疾病的免疫原性而确定。典型地，如果技术人员可以确定对象具有足够的激发针对
所述病毒的免疫应答能力，则可以认为所述对象是免疫活性的。
[0477] 在一些实例中，所述对象可以在根据本发明提供的方法施用病毒之前进行免疫。免疫可以增加对象激发针对所述病毒的免疫应答的能力，或者增加所述对象激发针对病毒
的免疫应答的速度。免疫还可以降低所述病毒的致病性对所述对象的危险。在一些实例中，
可以使用与待施用的治疗性病毒相似的免疫病毒进行免疫。例如，所述免疫病毒可以是所
述治疗性病毒的无复制能力的变体。在其他实例中，所述免疫物可以是所述待施用的治疗
性病毒的消化物。本领域已知用已知病毒免疫对象的任何方法并可以用于本发明中。在一
个实例中，用例如1μg补骨脂素处理的及用紫外线在365nm处理4分钟的痘苗病毒可以导
致不能复制。在另一个实例中，可以选择应用与已经先前用于免疫对象的病毒(例如在儿
童疫苗接种中)相同或相似的病毒。
的免疫应答的速度。免疫还可以降低所述病毒的致病性对所述对象的危险。在一些实例中，
可以使用与待施用的治疗性病毒相似的免疫病毒进行免疫。例如，所述免疫病毒可以是所
述治疗性病毒的无复制能力的变体。在其他实例中，所述免疫物可以是所述待施用的治疗
性病毒的消化物。本领域已知用已知病毒免疫对象的任何方法并可以用于本发明中。在一
个实例中，用例如1μg补骨脂素处理的及用紫外线在365nm处理4分钟的痘苗病毒可以导
致不能复制。在另一个实例中，可以选择应用与已经先前用于免疫对象的病毒(例如在儿
童疫苗接种中)相同或相似的病毒。
[0478] 在另一实例中，所述对象可以施用病毒而无先前的癌症治疗步骤，如化疗、放疗或手术切除肿瘤和/或转移。本发明提供的方法利用所述病毒进入或局限于肿瘤附近的能
力，其中所述肿瘤细胞可以被保护免于所述对象的免疫系统攻击；然后所述病毒在这个免
疫保护区域内繁殖，并且也可以导致肿瘤抗原从所述肿瘤中释放(典型持续释放)进所述
对象的免疫系统可以识别所述肿瘤抗原并激发免疫应答的部位。在这种方法中，存在足够
大小的肿瘤或者充分发生的免疫保护阶段对于成功施用所述肿瘤所述病毒及充分的肿瘤
抗原产生是有利的。如果肿瘤经手术切除，则所述病毒也许不能定位于其他致瘤性细胞
(例如小的转移)，因为这种细胞也许还未足够成熟以产生所述病毒可以存活并繁殖的免
疫保护性环境，或者即使所述病毒可以定位于致瘤性细胞，细胞的数目或者体积的大小太
小以致于所述病毒不能持续释放肿瘤抗原以使得宿主激发抗肿瘤免疫应答。因此，例如，本
发明提供的是治疗肿瘤或肿瘤疾病的方法，其中施用具有肿瘤或肿瘤疾病的对象以病毒而
不除去原发瘤，或者施用具有肿瘤或肿瘤疾病的对象以病毒，其中至少一些肿瘤或致瘤性
细胞有意保留在所述对象中。在其他典型的癌症治疗方法如化疗或放疗中，这些方法典型
地具有削弱患者免疫系统的副作用。通过化疗或放疗对对象进行的治疗可以降低对象激发
抗肿瘤免疫应答的能力。因此，例如，本发明提供的是治疗肿瘤或肿瘤疾病的方法，其中病
毒施用具有肿瘤或肿瘤疾病的对象，而对所述对象不进行削弱免疫系统的治疗如化疗或放
疗。
力，其中所述肿瘤细胞可以被保护免于所述对象的免疫系统攻击；然后所述病毒在这个免
疫保护区域内繁殖，并且也可以导致肿瘤抗原从所述肿瘤中释放(典型持续释放)进所述
对象的免疫系统可以识别所述肿瘤抗原并激发免疫应答的部位。在这种方法中，存在足够
大小的肿瘤或者充分发生的免疫保护阶段对于成功施用所述肿瘤所述病毒及充分的肿瘤
抗原产生是有利的。如果肿瘤经手术切除，则所述病毒也许不能定位于其他致瘤性细胞
(例如小的转移)，因为这种细胞也许还未足够成熟以产生所述病毒可以存活并繁殖的免
疫保护性环境，或者即使所述病毒可以定位于致瘤性细胞，细胞的数目或者体积的大小太
小以致于所述病毒不能持续释放肿瘤抗原以使得宿主激发抗肿瘤免疫应答。因此，例如，本
发明提供的是治疗肿瘤或肿瘤疾病的方法，其中施用具有肿瘤或肿瘤疾病的对象以病毒而
不除去原发瘤，或者施用具有肿瘤或肿瘤疾病的对象以病毒，其中至少一些肿瘤或致瘤性
细胞有意保留在所述对象中。在其他典型的癌症治疗方法如化疗或放疗中，这些方法典型
地具有削弱患者免疫系统的副作用。通过化疗或放疗对对象进行的治疗可以降低对象激发
抗肿瘤免疫应答的能力。因此，例如，本发明提供的是治疗肿瘤或肿瘤疾病的方法，其中病
毒施用具有肿瘤或肿瘤疾病的对象，而对所述对象不进行削弱免疫系统的治疗如化疗或放
疗。
[0479] 在另一个实例中，在施用所述对象病毒之前，所述对象可以进行不除去原发肿瘤或者不削弱免疫系统的一或多个癌症治疗步骤。各种更成熟的癌症治疗方法正不断开发出
来，其中可以不经手术切除肿瘤或削弱免疫系统而治疗肿瘤。所述方法例如包括施用降低
肿瘤或致瘤性细胞增殖速度而不削弱免疫系统的一种化合物(例如通过施用肿瘤抑制化
合物或者通过施用肿瘤细胞特异性化合物)或者施用一种抑制血管发生的化合物。因此，
包括给对象施用病毒的组合方法可进一步改善癌症治疗。因此，本发明提供的是给对象施
用病毒的方法，伴随之前或之后例如施用一种减缓肿瘤生长而不削弱所述对象免疫系统的
化合物或者一种抑制所述肿瘤血管形成的化合物。
来，其中可以不经手术切除肿瘤或削弱免疫系统而治疗肿瘤。所述方法例如包括施用降低
肿瘤或致瘤性细胞增殖速度而不削弱免疫系统的一种化合物(例如通过施用肿瘤抑制化
合物或者通过施用肿瘤细胞特异性化合物)或者施用一种抑制血管发生的化合物。因此，
包括给对象施用病毒的组合方法可进一步改善癌症治疗。因此，本发明提供的是给对象施
用病毒的方法，伴随之前或之后例如施用一种减缓肿瘤生长而不削弱所述对象免疫系统的
化合物或者一种抑制所述肿瘤血管形成的化合物。
[0480] b.施用模式
[0481] 可以使用给对象施用病毒的任何模式，条件是施用模式使得所述病毒进入肿瘤或转移中。施用模式可包括但不限于全身性、肠道外、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经皮、皮内、动脉内(如肝动脉灌注)、囊内(intravesicular)灌注、胸膜内、关节内、局部、肿瘤内、损伤
内、内窥镜、多穿刺(例如针对天花疫苗使用的)、吸入、经皮、皮下、鼻内、气管内、口服、腔内(例如通过导管施用膀胱，通过栓剂或灌肠剂施用肠道)、经阴道、直肠、颅内、前列腺内、
玻璃体内、耳或眼睛施用。在一些实例中，如本文别处描述的诊断或治疗剂也可以相似地施
用。
内、内窥镜、多穿刺(例如针对天花疫苗使用的)、吸入、经皮、皮下、鼻内、气管内、口服、腔内(例如通过导管施用膀胱，通过栓剂或灌肠剂施用肠道)、经阴道、直肠、颅内、前列腺内、
玻璃体内、耳或眼睛施用。在一些实例中，如本文别处描述的诊断或治疗剂也可以相似地施
用。
[0482] 本领域技术人员可以选择与所述对象和所述病毒相容，并且很可能导致病毒到达肿瘤和/或转移的任何施用模式。本领域技术人员可根据任何因素选择施用途径，所述因
素包括疾病的性质、肿瘤的种类、及药物组合物中包含的特定病毒。可以例如作为胶状分散
系统通过弹道输送(ballistic delivery)进行靶部位施用，或者可以通过注入动脉内而进
行全身性施用。
素包括疾病的性质、肿瘤的种类、及药物组合物中包含的特定病毒。可以例如作为胶状分散
系统通过弹道输送(ballistic delivery)进行靶部位施用，或者可以通过注入动脉内而进
行全身性施用。
[0483] c.剂量和剂量方案
[0484] 剂量方案可以是任何方法和数量，并且可以通过本领域技术人员根据已知临床因素确定。如医学领域所已知，对于任一患者的剂量可以依赖于许多因素，包括所述对象的物
种、大小、体表面积、年龄、性别、免疫活性及一般健康状况、待施用的特殊病毒、施用的持续时间和途径、疾病的种类和阶段，例如肿瘤大小、及同时施用的其他化合物如药物。除了上
述因素之外，这些水平也可以受到病毒的感染性及病毒的性质影响，这可以由本领域技术
人员确定。
种、大小、体表面积、年龄、性别、免疫活性及一般健康状况、待施用的特殊病毒、施用的持续时间和途径、疾病的种类和阶段，例如肿瘤大小、及同时施用的其他化合物如药物。除了上
述因素之外，这些水平也可以受到病毒的感染性及病毒的性质影响，这可以由本领域技术
人员确定。
[0485] 在本发明的方法中，病毒的合适的最小剂量水平和剂量方案可以是足以使得所述病毒在肿瘤或转移中存活、生长和复制的水平。通常地，病毒的施用量是在一个施用周期施
5
用至少一次至少或大约或者是1×10pfu。施用体重为65kg的人体的病毒的最小水平例
5 5 6
如可包括至少大约1×10 噬斑形成单位(pfu)、至少大约5×10pfu、至少大约1×10pfu、
6 7 8 9
至少大约5×10pfu、至少大约1×10pfu、至少大约1×10pfu、至少大约1×10pfu，或者
10
至少大约1×10 pfu。例如施用的病毒的量为在一个施用周期施用至少一次至少或者大约
5 6 7 8 9 10 11
或者施用1×10pfu、1×10pfu、1×10pfu、1×10pfu、1×10pfu、1×10 pfu、1×10 pfu、
12 13 14
1×10 pfu、1×10 pfu或者1×10 pfu。
5
用至少一次至少或大约或者是1×10pfu。施用体重为65kg的人体的病毒的最小水平例
5 5 6
如可包括至少大约1×10 噬斑形成单位(pfu)、至少大约5×10pfu、至少大约1×10pfu、
6 7 8 9
至少大约5×10pfu、至少大约1×10pfu、至少大约1×10pfu、至少大约1×10pfu，或者
10
至少大约1×10 pfu。例如施用的病毒的量为在一个施用周期施用至少一次至少或者大约
5 6 7 8 9 10 11
或者施用1×10pfu、1×10pfu、1×10pfu、1×10pfu、1×10pfu、1×10 pfu、1×10 pfu、
12 13 14
1×10 pfu、1×10 pfu或者1×10 pfu。
[0486] 在所述剂量方案中，所述病毒的量在施用周期期间可以单一施用或者多次施用。因此，本发明提供的方法可包括将病毒单一给对象施用或者将病毒多次给对象施用。在一
些实施方案中，单一施用足以使得病毒在肿瘤内定居，其中所述病毒可以繁殖并可以引起
或增强所述对象的抗肿瘤免疫应答；这些方法不需要另外施用病毒以引起或增强对象抗肿
瘤免疫应答，抗肿瘤免疫应答可例如导致肿瘤生长抑制、转移生长或形成抑制、肿瘤或转移
大小降低、肿瘤或转移消除、抑制或防止肿瘤疾病的复发或新肿瘤形成、或者其他的癌症治
疗作用。
些实施方案中，单一施用足以使得病毒在肿瘤内定居，其中所述病毒可以繁殖并可以引起
或增强所述对象的抗肿瘤免疫应答；这些方法不需要另外施用病毒以引起或增强对象抗肿
瘤免疫应答，抗肿瘤免疫应答可例如导致肿瘤生长抑制、转移生长或形成抑制、肿瘤或转移
大小降低、肿瘤或转移消除、抑制或防止肿瘤疾病的复发或新肿瘤形成、或者其他的癌症治
疗作用。
[0487] 在其它实例中，病毒可以在不同的时机施用，典型地至少间隔1天施用。例如，病毒可以施用两次、三次、四次、五次或六次或更多次，两次施用期间间隔在一天或更多天、两
天或更多天、一周或更多周或者一个月或更多时间。间隔施用可增加病毒输送至肿瘤或转
移的可能性，其中先前的施用在病毒输送至肿瘤或转移中是无效的。间隔施用可增加肿瘤
或转移上病毒繁殖可以发生的位置，或者可以另外增加积累在肿瘤中的病毒的效价，这可
以增加抗原或其它化合物从肿瘤中释放的比例，激发或增强宿主的抗肿瘤免疫应答，并且
也可以任选地增加基于病毒的肿瘤溶解或肿瘤细胞死亡的水平。间隔施用病毒可进一步扩
充对象针对病毒抗原的免疫应答，这可以扩充宿主对其中积累了所述病毒的肿瘤或转移的
免疫应答，并且可以增加宿主激发抗肿瘤免疫应答的可能性。
天或更多天、一周或更多周或者一个月或更多时间。间隔施用可增加病毒输送至肿瘤或转
移的可能性，其中先前的施用在病毒输送至肿瘤或转移中是无效的。间隔施用可增加肿瘤
或转移上病毒繁殖可以发生的位置，或者可以另外增加积累在肿瘤中的病毒的效价，这可
以增加抗原或其它化合物从肿瘤中释放的比例，激发或增强宿主的抗肿瘤免疫应答，并且
也可以任选地增加基于病毒的肿瘤溶解或肿瘤细胞死亡的水平。间隔施用病毒可进一步扩
充对象针对病毒抗原的免疫应答，这可以扩充宿主对其中积累了所述病毒的肿瘤或转移的
免疫应答，并且可以增加宿主激发抗肿瘤免疫应答的可能性。
[0488] 当进行间隔施用时，每次施用可以是与其它施用剂量相同或不同的剂量。在一个实施方案中，所有的施用剂量均是相同的。在其它实施方案中，首次剂量与一或多次随后剂
量相比可以较高，例如至少高出10倍、至少高出100倍、或者至少高出1000倍。在间隔施
用方法的一个实例中，其中首次剂量高于一或多次随后的剂量，所有随后的剂量与首次施
用剂量相比可以相同、较小。
量相比可以较高，例如至少高出10倍、至少高出100倍、或者至少高出1000倍。在间隔施
用方法的一个实例中，其中首次剂量高于一或多次随后的剂量，所有随后的剂量与首次施
用剂量相比可以相同、较小。
[0489] 间隔施用可包括两或多次施用的任何次数，包括施用2、3、4、5、或6次施用。本领域技术人员可根据已知的监测治疗方法及本发明提供的其它监测方法而易于确定进行施
用的次数或进行一或多次额外的施用的需要性。因此，本发明提供的方法包括施用所述对
象一或多次病毒，其中施用的次数可以通过监测所述对象而确定，并且基于监测的结果确
定是否提供一或多次额外的施用。决定是否提供一或多次额外的施用可以基于各种监测结
果，包括但不限于肿瘤生长或肿瘤生长抑制的指征、新转移出现或者转移受抑制、对象抗病
毒抗体效价、对象抗肿瘤抗体效价、对象的整体健康状况、对象的体重、只在肿瘤和/或转
移中病毒的存在、正常组织或器官中病毒的存在。
用的次数或进行一或多次额外的施用的需要性。因此，本发明提供的方法包括施用所述对
象一或多次病毒，其中施用的次数可以通过监测所述对象而确定，并且基于监测的结果确
定是否提供一或多次额外的施用。决定是否提供一或多次额外的施用可以基于各种监测结
果，包括但不限于肿瘤生长或肿瘤生长抑制的指征、新转移出现或者转移受抑制、对象抗病
毒抗体效价、对象抗肿瘤抗体效价、对象的整体健康状况、对象的体重、只在肿瘤和/或转
移中病毒的存在、正常组织或器官中病毒的存在。
[0490] 两次施用之间的时间可以是任何时间。两次施用之间的时间可以是任何因素的函数，包括如关于施用次数所描述的监测步骤，对象激发免疫应答的时间、对象从正常组织中
清除病毒的时间、或者病毒在肿瘤或转移中的增殖时间。在一个实例中，所述时间可以是对
象激发免疫应答的时间的函数；例如，所述时间可以多于对象激发免疫应答的时间，如多于
大约1周、多于大约10天、多于大约2周、或者多于大约1个月；在另一实例中，所述时间可
以少于对象激发免疫应答的时间，如少于大约1周、少于大约10天、少于大约2周、或者少
于大约1个月。在另一个实例中，所述时间可以是对象从正常组织中清除病毒的时间的函
数；例如所述时间可以多于对象从正常组织中清除病毒的时间，如多于大约1天、多于大约
2天、多于大约3天、多于大约5天、或者多于大约1周。在另一个实例中，所述时间可以是
病毒在肿瘤或转移中繁殖的时间的函数；例如所述时间可以多于施用表达可检测的标记的
病毒后在肿瘤或转移中产生可检测信号的时间，如大约3天、大约5天、大约1周、大约10
天、大约2周、或者大约1个月。
清除病毒的时间、或者病毒在肿瘤或转移中的增殖时间。在一个实例中，所述时间可以是对
象激发免疫应答的时间的函数；例如，所述时间可以多于对象激发免疫应答的时间，如多于
大约1周、多于大约10天、多于大约2周、或者多于大约1个月；在另一实例中，所述时间可
以少于对象激发免疫应答的时间，如少于大约1周、少于大约10天、少于大约2周、或者少
于大约1个月。在另一个实例中，所述时间可以是对象从正常组织中清除病毒的时间的函
数；例如所述时间可以多于对象从正常组织中清除病毒的时间，如多于大约1天、多于大约
2天、多于大约3天、多于大约5天、或者多于大约1周。在另一个实例中，所述时间可以是
病毒在肿瘤或转移中繁殖的时间的函数；例如所述时间可以多于施用表达可检测的标记的
病毒后在肿瘤或转移中产生可检测信号的时间，如大约3天、大约5天、大约1周、大约10
天、大约2周、或者大约1个月。
[0491] 例如，病毒的施用量是在一次施用周期中施用两次、三次、四次、五次、六次或七次。病毒的量可以在施用周期的第一天、第一天和第二天、前三天、前四天、前五天、前六天
或者前七天施用。通常地，施用周期是7天，14天，21天或者28天。根据患者的应答或预
后，将施用周期在几个月或几年内重复施用。
或者前七天施用。通常地，施用周期是7天，14天，21天或者28天。根据患者的应答或预
后，将施用周期在几个月或几年内重复施用。
[0492] 通常地，合适的微生物的最大剂量水平或剂量方案是对宿主无毒性的水平，不引起脾肿大3倍或更多的水平，在大约1天或3天或7天后在正常组织或器官中不产生集落
或噬斑的水平。
或噬斑的水平。
[0493] d.共同施用
[0494] 本发明还提供施用额外的治疗物质如不同的治疗性病毒或治疗性化合物的方法。这些可以与第一种病毒同时、相继或间歇施用。所述额外的治疗性物质可以与所述病毒或
其基因产物相互作用，或者所述额外的治疗性物质可以不依赖于所述病毒而起作用。
其基因产物相互作用，或者所述额外的治疗性物质可以不依赖于所述病毒而起作用。
[0495] 组合治疗具有如下优势：1)避免单一药物抗性；2)在异质肿瘤群中，可通过不同机制杀死细胞；3)通过选择具有非重叠毒性的药物，每种药物可以全量使用以激发最大效
力和协同作用。组合治疗可以通过组合诊断性/治疗性病毒与一或多种如下抗癌剂进行：
化疗剂，治疗性抗体，siRNA，毒素，酶-前药对或放射。
力和协同作用。组合治疗可以通过组合诊断性/治疗性病毒与一或多种如下抗癌剂进行：
化疗剂，治疗性抗体，siRNA，毒素，酶-前药对或放射。
[0496] i.施用多种病毒
[0497] 本发明提供给对象施用两或多种病毒的方法。施用可以是同时、相继或间歇完成的。所述多种病毒可以作为单一的组合物或者作为两或多种组合物而施用。所述两或多种
病毒可包括至少两种病毒。在特别的实例中，在存在两种病毒的情况中，这两种病毒均是痘
苗病毒。在另一实例中，一种病毒是痘苗病毒，另一种病毒是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病
毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒、泡沫病毒、流感病毒、粘液瘤病毒、水泡性口炎病毒、或者本文所述或本领域已知的任何其它病毒中的任一种病毒。可以基于其作用途径
选择病毒。例如，靶向激活的Ras途径的病毒可以与靶向p53表达缺陷的肿瘤细胞的病毒
组合。
病毒可包括至少两种病毒。在特别的实例中，在存在两种病毒的情况中，这两种病毒均是痘
苗病毒。在另一实例中，一种病毒是痘苗病毒，另一种病毒是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病
毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒、泡沫病毒、流感病毒、粘液瘤病毒、水泡性口炎病毒、或者本文所述或本领域已知的任何其它病毒中的任一种病毒。可以基于其作用途径
选择病毒。例如，靶向激活的Ras途径的病毒可以与靶向p53表达缺陷的肿瘤细胞的病毒
组合。
[0498] 所述多种病毒可以包含组合物的组合和/或试剂盒形式提供，所述试剂盒包括包装的用于施用的病毒及任选包括其说明书。所述组合物可含有配制的以单一剂量施用(即
直接施用)的病毒，可需要稀释剂或其他添加剂。
直接施用)的病毒，可需要稀释剂或其他添加剂。
[0499] 在一个实例中，至少一种病毒是修饰的病毒，如本发明提供的那些病毒，具有特性如低致病性、低毒性、优先积累在肿瘤中、激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、免疫原性、复
制能力、表达外源蛋白质的能力，及这些特性的组合。所述病毒可以大约同时施用或者在不
同时间施用。所述病毒可以在同一组合物中施用，或者以相同的施用方法施用，或者可以在
单独的组合物中或者通过不同的施用方法施用。
制能力、表达外源蛋白质的能力，及这些特性的组合。所述病毒可以大约同时施用或者在不
同时间施用。所述病毒可以在同一组合物中施用，或者以相同的施用方法施用，或者可以在
单独的组合物中或者通过不同的施用方法施用。
[0500] 两次施用之间的时间可以是达到所希望效果的任何时间，这可以通过本领域技术人员确定。施用不同的病毒之间的时间的选择可以根据与选择施用相同病毒之间的相似的
时间参数进行，包括得自监测步骤的结果、对象激发免疫应答的时间、对象从正常组织中清
除病毒的时间、或者肿瘤或转移中病毒繁殖的时间。在一个实例中，所述时间可以是对象激
发免疫应答的时间的函数，例如所述时间可以多于对象激发免疫应答的时间，如多于大约1
周、多于大约10天、多于大约2周或多于大约1个月；在另一实例中，所述时间可少于对象
激发免疫应答的时间，如少于大约1周、少于大约10天、少于大约2周或少于大约1个月。
在另一实例中，所述时间可以是对象从正常组织中清除病毒的时间的函数，例如所述时间
可以多于对象从正常组织中清除病毒的时间，如多于大约1天、多于大约2天、多于大约3
天、多于大约5天或多于大约1周。在另一个实例中，所述时间可以是病毒在肿瘤或转移中
繁殖的时间，例如所述时间可以多于在施用表达可检测的标记的病毒后在肿瘤或转移中产
生可检测信号的时间量，如大约3天、大约5天、大约1周、大约10天、大约2周或大约1个
月。
时间参数进行，包括得自监测步骤的结果、对象激发免疫应答的时间、对象从正常组织中清
除病毒的时间、或者肿瘤或转移中病毒繁殖的时间。在一个实例中，所述时间可以是对象激
发免疫应答的时间的函数，例如所述时间可以多于对象激发免疫应答的时间，如多于大约1
周、多于大约10天、多于大约2周或多于大约1个月；在另一实例中，所述时间可少于对象
激发免疫应答的时间，如少于大约1周、少于大约10天、少于大约2周或少于大约1个月。
在另一实例中，所述时间可以是对象从正常组织中清除病毒的时间的函数，例如所述时间
可以多于对象从正常组织中清除病毒的时间，如多于大约1天、多于大约2天、多于大约3
天、多于大约5天或多于大约1周。在另一个实例中，所述时间可以是病毒在肿瘤或转移中
繁殖的时间，例如所述时间可以多于在施用表达可检测的标记的病毒后在肿瘤或转移中产
生可检测信号的时间量，如大约3天、大约5天、大约1周、大约10天、大约2周或大约1个
月。
[0501] ii.治疗性化合物
[0502] 任何治疗剂或抗癌剂均可用作第二种治疗剂或抗癌剂以与本发明提供的癌症治疗方法组合。所述方法包括除了给对象施用一种或多种病毒之外，还给对象施用一或多种
治疗性化合物。治疗性化合物可单独或者与病毒联合发挥肿瘤治疗作用。
治疗性化合物。治疗性化合物可单独或者与病毒联合发挥肿瘤治疗作用。
[0503] 可单独起作用的治疗性化合物包括任何已知化疗性化合物，其可已知肿瘤生长，抑制转移生长和/或形成，降低肿瘤或转移的大小，消除肿瘤或转移，而不降低病毒在肿瘤
中积累，在肿瘤中复制的能力，及引起或增强对象体内抗肿瘤免疫应答。
中积累，在肿瘤中复制的能力，及引起或增强对象体内抗肿瘤免疫应答。
[0504] 可与所述病毒联合起作用的治疗性化合物包括例如改变所述病毒表达的化合物或者与病毒表达的基因相互作用的化合物，或者可抑制病毒繁殖的化合物，包括对所述病
毒有毒性的化合物。与所述病毒联合起作用的治疗性化合物包括例如增加病毒的繁殖、毒
性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质的治疗性化合物，并且还可包括例如降低病毒的繁
殖、毒性或杀死细胞性质的治疗性化合物。因此，本发明提供给对象施用一或多种治疗性化
合物的方法，所述化合物可与所述微生物联合起作用以增加微生物的增殖、毒性、杀死肿瘤
细胞或免疫应答激发性质。任选地，治疗剂可呈现出或显示出另外的性质，如允许其用作成
像剂的性质，如本文别处所述。
毒有毒性的化合物。与所述病毒联合起作用的治疗性化合物包括例如增加病毒的繁殖、毒
性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质的治疗性化合物，并且还可包括例如降低病毒的繁
殖、毒性或杀死细胞性质的治疗性化合物。因此，本发明提供给对象施用一或多种治疗性化
合物的方法，所述化合物可与所述微生物联合起作用以增加微生物的增殖、毒性、杀死肿瘤
细胞或免疫应答激发性质。任选地，治疗剂可呈现出或显示出另外的性质，如允许其用作成
像剂的性质，如本文别处所述。
[0505] 治疗性化合物还包括但不限于化疗剂、纳米颗粒、放疗、siRNA分子、酶/前药对、光敏剂、毒素、微波、放射性同位素、血管发生抑制剂、有丝分裂抑制剂蛋白(例如cdc6)、抗
肿瘤寡肽(例如抗有丝分裂寡肽、高亲和性肿瘤选择性结合肽)、信号调节物、抗癌抗生素
或者其组合。
肿瘤寡肽(例如抗有丝分裂寡肽、高亲和性肿瘤选择性结合肽)、信号调节物、抗癌抗生素
或者其组合。
[0506] 典型的光敏剂包括但不限于例如吲哚花青绿，甲苯胺蓝，氨基乙酰丙酸，texaphyrins，苯并卟啉，吩噻嗪，酞菁染料(phthalocyanines)，卟啉如卟菲尔钠，绿
素如四(m-羟苯基)二氢卟酚或锡(IV)二氢卟酚e6，羟基茜草素如本紫红素乙酯，
purpurinimides，菌绿素，脱镁叶绿酸，焦脱镁叶绿酸或者阳离子染料。在一个实例中，痘苗
病毒如本发明提供的痘苗病毒，与光敏剂组合施用具有肿瘤、癌症或者转移的对象。
素如四(m-羟苯基)二氢卟酚或锡(IV)二氢卟酚e6，羟基茜草素如本紫红素乙酯，
purpurinimides，菌绿素，脱镁叶绿酸，焦脱镁叶绿酸或者阳离子染料。在一个实例中，痘苗
病毒如本发明提供的痘苗病毒，与光敏剂组合施用具有肿瘤、癌症或者转移的对象。
[0507] 放射性同位素根据放射性同位素的量和应用可用于诊断和/或治疗。其包括但不32 60 90 99 103 106 111 117 125
限于如含有如下元素的化合物或分子：磷，钴，钇，锝， 钯， 钌， 铟， 镥， 碘，
131 137 153 186 188 192 198 211 212 213
碘， 铯， 钐， 铼， 铼， 铱， 金， 砹， 铋或 铋。在一个实例中，痘苗病毒如
本发明提供的痘苗病毒与放射性同位素组合施用具有肿瘤、癌症或者转移的对象。
限于如含有如下元素的化合物或分子：磷，钴，钇，锝， 钯， 钌， 铟， 镥， 碘，
131 137 153 186 188 192 198 211 212 213
碘， 铯， 钐， 铼， 铼， 铱， 金， 砹， 铋或 铋。在一个实例中，痘苗病毒如
本发明提供的痘苗病毒与放射性同位素组合施用具有肿瘤、癌症或者转移的对象。
[0508] 毒素包括但不限于化疗化合物，例如但不限于5-氟尿嘧啶，卡奇霉素(calicheamicin)和美登素(maytansine)。信号调节物包括但不限于例如巨噬细胞抑制性
因子的抑制剂，toll-样受体激动剂，和stat3抑制剂。在一个实例中，痘苗病毒与本发明
提供的痘苗病毒与毒素或信号调节物组合施用具有肿瘤、癌症或转移的对象。
因子的抑制剂，toll-样受体激动剂，和stat3抑制剂。在一个实例中，痘苗病毒与本发明
提供的痘苗病毒与毒素或信号调节物组合施用具有肿瘤、癌症或转移的对象。
[0509] 化疗剂与治疗性病毒之间的组合治疗在单一制剂治疗无效的情况中可以是有效/疗效的。化疗化合物包括但不限于烷化剂如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸
盐类如白消安，英丙舒凡和派泊舒凡；氮丙啶类如苯佐替派，卡波醌，美妥替哌和乌瑞替派；
乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺，曲他胺，三亚乙基磷酰胺和三亚乙基硫代磷酰胺，氮
芥如苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯磷酰胺，雌氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸氧化氮芥，美法仑，新生霉素，苯芥胆甾醇，泼尼氮芥，曲磷胺，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，安曲霉素，重氮丝
氨酸，博来霉素，c放线菌素，卡奇霉素，卡柔比星，洋红霉素，嗜癌霉素，色霉素，更生霉素，道诺霉素，地托比星，6-叠氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊达
比星，麻西罗霉素，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，泊非霉素，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链脲菌素，杀结核菌素，鸟苯美司，净司他丁，佐柔比星；
抗代谢物如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸，氨甲喋呤，蝶罗呤，
三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西
他滨，阿扎胞苷，6-阿扎尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮，丙酸屈他雄酮，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯；抗-肾上腺物如氨鲁
米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充物如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；
安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙酰肼；甲苄肼；多糖-K；雷佐生；
西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡
巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷；环磷酰
胺；噻替派；泰素类，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌
呤；氨甲喋呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂
霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺肖林；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸钠；CPT11；局部异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；
esperamycins；卡培他滨；以及任何上述化合物的药物可接受的盐、酸或衍生物。还包括
抗激素物质，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，如抗雌激素物质如他莫昔芬，雷洛昔
芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，4-羟基三苯氧胺，曲沃昔芬，那洛昔芬(keoxifene)，LY117018，
奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；及抗雄激素物质如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞
林和戈舍瑞林；以及任何上述化合物的药物可接受的盐、酸或衍生物。可用于本发明中的这
种化疗化合物包括其毒性妨碍该化合物用于一般的全身性化疗方法中的化合物。化疗剂也
包括新类别的靶向化疗剂，例如伊马替尼(在美国由Novartis以商品名Gleevec销售)，
吉非替尼(由AstraZeneca以商品名Iressa开发)和厄洛替尼。特殊的化疗剂包括但不
限于顺铂，卡铂，奥沙利铂，DWA2114R，NK121，IS3295和254-S长春新碱，强的松，阿霉素和
L-天冬酰胺酶；氮芥，长春新碱，甲苄肼和强的松(MOPP)，环磷酰胺，长春新碱，甲苄肼和强
的松(C-MOPP)，博来霉素，长春碱，吉西他滨和5-氟尿嘧啶。典型的化疗剂是例如顺铂，卡
铂，奥沙利铂，DWA2114R，NK121，IS3295和254-S。在一个非限制性实例中，痘苗病毒如本
发明提供的痘苗病毒组合铂协同复合物如顺铂、卡铂、奥沙利铂、DWA2114R、NK121、IS3295
和254-S施用具有肿瘤、癌症或转移的对象。肿瘤、癌症和转移可以是本发明提供的任何那
些，特别可以是胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、前列腺肿瘤、子宫颈肿瘤或者乳腺
肿瘤；典型的肿瘤是胰腺和卵巢肿瘤。肿瘤、癌症和转移可以是单一治疗抗性肿瘤，如对单
独用病毒或抗癌剂治疗无反应的肿瘤，但是对病毒与抗癌剂的组合有反应。典型地，病毒的
治疗有效量是全身性给对象施用，病毒定居及积累在肿瘤中。在施用病毒之后，给对象施用
治疗有效量的抗癌剂，如顺铂。在一个实例中，顺铂一天施用一次，连续施用五天。本领域
技术人员使用如体内动物模型可以确定在施用病毒后何时施用抗癌剂。使用本发明提供的
方法，施用病毒与抗癌剂如顺铂可引起肿瘤体积减小，可导致肿瘤生长终止或者延缓，或者
可以导致肿瘤从对象体内消除。肿瘤、癌症和转移在治疗后的状态可以通过使用本发明提
供的及本领域已知的任何方法监测。
盐类如白消安，英丙舒凡和派泊舒凡；氮丙啶类如苯佐替派，卡波醌，美妥替哌和乌瑞替派；
乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺，曲他胺，三亚乙基磷酰胺和三亚乙基硫代磷酰胺，氮
芥如苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯磷酰胺，雌氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸氧化氮芥，美法仑，新生霉素，苯芥胆甾醇，泼尼氮芥，曲磷胺，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，安曲霉素，重氮丝
氨酸，博来霉素，c放线菌素，卡奇霉素，卡柔比星，洋红霉素，嗜癌霉素，色霉素，更生霉素，道诺霉素，地托比星，6-叠氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊达
比星，麻西罗霉素，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，泊非霉素，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链脲菌素，杀结核菌素，鸟苯美司，净司他丁，佐柔比星；
抗代谢物如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸，氨甲喋呤，蝶罗呤，
三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西
他滨，阿扎胞苷，6-阿扎尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮，丙酸屈他雄酮，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯；抗-肾上腺物如氨鲁
米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充物如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；
安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙酰肼；甲苄肼；多糖-K；雷佐生；
西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡
巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷；环磷酰
胺；噻替派；泰素类，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌
呤；氨甲喋呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂
霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺肖林；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸钠；CPT11；局部异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；
esperamycins；卡培他滨；以及任何上述化合物的药物可接受的盐、酸或衍生物。还包括
抗激素物质，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，如抗雌激素物质如他莫昔芬，雷洛昔
芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，4-羟基三苯氧胺，曲沃昔芬，那洛昔芬(keoxifene)，LY117018，
奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；及抗雄激素物质如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞
林和戈舍瑞林；以及任何上述化合物的药物可接受的盐、酸或衍生物。可用于本发明中的这
种化疗化合物包括其毒性妨碍该化合物用于一般的全身性化疗方法中的化合物。化疗剂也
包括新类别的靶向化疗剂，例如伊马替尼(在美国由Novartis以商品名Gleevec销售)，
吉非替尼(由AstraZeneca以商品名Iressa开发)和厄洛替尼。特殊的化疗剂包括但不
限于顺铂，卡铂，奥沙利铂，DWA2114R，NK121，IS3295和254-S长春新碱，强的松，阿霉素和
L-天冬酰胺酶；氮芥，长春新碱，甲苄肼和强的松(MOPP)，环磷酰胺，长春新碱，甲苄肼和强
的松(C-MOPP)，博来霉素，长春碱，吉西他滨和5-氟尿嘧啶。典型的化疗剂是例如顺铂，卡
铂，奥沙利铂，DWA2114R，NK121，IS3295和254-S。在一个非限制性实例中，痘苗病毒如本
发明提供的痘苗病毒组合铂协同复合物如顺铂、卡铂、奥沙利铂、DWA2114R、NK121、IS3295
和254-S施用具有肿瘤、癌症或转移的对象。肿瘤、癌症和转移可以是本发明提供的任何那
些，特别可以是胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、前列腺肿瘤、子宫颈肿瘤或者乳腺
肿瘤；典型的肿瘤是胰腺和卵巢肿瘤。肿瘤、癌症和转移可以是单一治疗抗性肿瘤，如对单
独用病毒或抗癌剂治疗无反应的肿瘤，但是对病毒与抗癌剂的组合有反应。典型地，病毒的
治疗有效量是全身性给对象施用，病毒定居及积累在肿瘤中。在施用病毒之后，给对象施用
治疗有效量的抗癌剂，如顺铂。在一个实例中，顺铂一天施用一次，连续施用五天。本领域
技术人员使用如体内动物模型可以确定在施用病毒后何时施用抗癌剂。使用本发明提供的
方法，施用病毒与抗癌剂如顺铂可引起肿瘤体积减小，可导致肿瘤生长终止或者延缓，或者
可以导致肿瘤从对象体内消除。肿瘤、癌症和转移在治疗后的状态可以通过使用本发明提
供的及本领域已知的任何方法监测。
[0510] 典型的抗癌抗生素包括但不限于蒽环类抗生素如盐酸阿霉素，盐酸伊达比星，盐酸柔红霉素，盐酸阿柔比星，盐酸表柔比星和盐酸吡柔比星，腐草霉素类如腐草霉素和硫酸
腐草霉素，丝裂霉素类如丝裂霉素C，放线菌素类如放线菌素D，净司他丁斯酯和多肽如新
制癌菌素。在一个实例中，痘苗病毒如本发明提供的痘苗病毒与抗癌抗生素组合施用具有
肿瘤、癌症或转移的对象。
腐草霉素，丝裂霉素类如丝裂霉素C，放线菌素类如放线菌素D，净司他丁斯酯和多肽如新
制癌菌素。在一个实例中，痘苗病毒如本发明提供的痘苗病毒与抗癌抗生素组合施用具有
肿瘤、癌症或转移的对象。
[0511] 在一个实例中，可以设计纳米颗粒，由此其携带一或多种本发明提供的治疗剂。此外，纳米颗粒可以设计为携带使纳米颗粒靶向肿瘤细胞的分子。在一个非限制性实例中，纳
米颗粒可以用放射性同位素包被，及任选用与肿瘤相关抗原免疫反应性的抗体包被。在一
个实例中，痘苗病毒如本发明提供的痘苗病毒与携带本发明提供的任何治疗剂的纳米颗粒
组合施用具有肿瘤、癌症或转移的对象。
米颗粒可以用放射性同位素包被，及任选用与肿瘤相关抗原免疫反应性的抗体包被。在一
个实例中，痘苗病毒如本发明提供的痘苗病毒与携带本发明提供的任何治疗剂的纳米颗粒
组合施用具有肿瘤、癌症或转移的对象。
[0512] 放射疗法已经成为大部分癌症患者的首选。放疗的广泛应用出于γ射线诱导靶细胞不可逆的损害，而保持正常组织功能的能力。电离辐射触发细胞凋亡，癌细胞中内在
的细胞死亡机制，以及细胞凋亡的激活似乎是在暴露于电离辐射之后癌细胞死亡的主要模
式。在一个实例中，痘苗病毒如本发明提供的痘苗病毒与放疗组合施用具有肿瘤、癌症或转
移的对象。
的细胞死亡机制，以及细胞凋亡的激活似乎是在暴露于电离辐射之后癌细胞死亡的主要模
式。在一个实例中，痘苗病毒如本发明提供的痘苗病毒与放疗组合施用具有肿瘤、癌症或转
移的对象。
[0513] 因此，本发明还提供给对象施用一或多种治疗性化合物的方法，所述化合物可与所述病毒联合起作用以增加病毒的繁殖、毒性、杀死肿瘤细胞或者免疫应答激发性质。本发
明还提供基于对象一或多种治疗性化合物的方法，所述化合物可以与所述病毒联合起作用
以降低病毒的繁殖、毒性或者杀死细胞的性质。基于的治疗性化合物可以是本发明提供的
或者本领域已知的任何那些化合物。
明还提供基于对象一或多种治疗性化合物的方法，所述化合物可以与所述病毒联合起作用
以降低病毒的繁殖、毒性或者杀死细胞的性质。基于的治疗性化合物可以是本发明提供的
或者本领域已知的任何那些化合物。
[0514] 可与所述病毒联合起作用以增加病毒的繁殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质的治疗性化合物是可改变基因表达的化合物，其中改变的基因表达可引起所述对象
中肿瘤细胞杀死增加或者抗肿瘤免疫应答增加。改变基因表达的化合物可例如导致一或多
种病毒基因包括内源病毒基因和/或外源病毒基因的表达增加或降低。例如，改变基因表
达的化合物可诱导或增加病毒中基因的转录，如可导致细胞溶解或细胞死亡、可激发免疫
应答、可催化前体药物样化合物转变、或者可抑制肿瘤细胞基因表达的外源基因。本领域已
知可改变基因表达的各种化合物，包括IPTG和RU486。其表达可以被正调节的基因例如包
括蛋白质和RNA分子，包括毒素、可将前体药物转变为抗肿瘤药物的酶、细胞因子、转录调
节蛋白、siRNA及核酶。在另一个实例中，改变基因表达的化合物可抑制或降低病毒中基因
的转录，所述基因如可降低病毒毒性或降低病毒繁殖的异源基因。可降低或抑制基因表达
的任何各种化合物均可用于本发明提供的方法中，包括siRNA化合物、转录抑制剂或转录
激活物抑制剂。其表达可以被负调节的基因例如包括蛋白质和RNA分子，包括病毒蛋白或
抑制细胞溶解、核苷酸合成或增殖的RNA，及抑制细胞死亡、免疫反应性、细胞溶解或病毒复
制的细胞蛋白或RNA分子。
中肿瘤细胞杀死增加或者抗肿瘤免疫应答增加。改变基因表达的化合物可例如导致一或多
种病毒基因包括内源病毒基因和/或外源病毒基因的表达增加或降低。例如，改变基因表
达的化合物可诱导或增加病毒中基因的转录，如可导致细胞溶解或细胞死亡、可激发免疫
应答、可催化前体药物样化合物转变、或者可抑制肿瘤细胞基因表达的外源基因。本领域已
知可改变基因表达的各种化合物，包括IPTG和RU486。其表达可以被正调节的基因例如包
括蛋白质和RNA分子，包括毒素、可将前体药物转变为抗肿瘤药物的酶、细胞因子、转录调
节蛋白、siRNA及核酶。在另一个实例中，改变基因表达的化合物可抑制或降低病毒中基因
的转录，所述基因如可降低病毒毒性或降低病毒繁殖的异源基因。可降低或抑制基因表达
的任何各种化合物均可用于本发明提供的方法中，包括siRNA化合物、转录抑制剂或转录
激活物抑制剂。其表达可以被负调节的基因例如包括蛋白质和RNA分子，包括病毒蛋白或
抑制细胞溶解、核苷酸合成或增殖的RNA，及抑制细胞死亡、免疫反应性、细胞溶解或病毒复
制的细胞蛋白或RNA分子。
[0515] 在另一实例中，可以与所述病毒联合起作用以增加病毒的繁殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质的治疗性化合物是可以与病毒表达基因产物相互作用的化合物，而
且这种相互作用可导致所述对象中肿瘤细胞杀死增加或者抗肿瘤免疫应答增加。可以与
病毒表达的基因产物相互作用的治疗性化合物可包括例如前体药物或其他化合物，其在给
对象施用的形式具有较小的毒性或者无毒性或者其他生物学活性，但在与病毒表达的基因
产物相互作用后，所述化合物可产生导致肿瘤细胞死亡的性质，包括但非限于胞毒性、诱导
细胞凋亡的能力、或者触发免疫应答的能力。在一个非限制性实例中，所述病毒携带一种
酶进入癌细胞中。一旦所述酶被导入癌细胞中，则施用了无活性形式的化疗药物(即前
药)。当无活性的前药到达癌细胞时，所述酶将前药转变为活性的化疗药，由此其可杀死癌
细胞。因此，所述治疗仅靶向于癌细胞，不影响正常细胞。所述前药可以与所述病毒同时
或相继施用。本领域已知各种前药样物质，在本文别处揭示了一系列这种化合物，所述化
合物可包括丙氧鸟苷，5-氟尿嘧啶，6-甲基嘌呤脱氧核苷，头孢菌素-阿霉素，4-[(2-氯乙
基)(2-甲磺酰氧乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸，对乙酰氨基酚，吲哚-3-乙酸，CB1954，
7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧基喜树碱，二-(2-氯乙基)氨基-4-羟
苯基-氨基甲酮28，1-氯甲基-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯基吲哚，表柔比星-葡糖苷酸，
5’-脱氧-5-氟尿苷，胞嘧啶阿糖胞苷，亚麻苦苷，及核苷类似物(例如氟尿苷，氟脱氧尿苷，
氟尿苷阿拉伯糖苷，阿糖胞苷，阿糖腺苷，鸟嘌呤阿拉伯糖苷，次黄嘌呤阿拉伯糖苷，6-巯基
嘌呤核苷，theoguanosine核苷，水粉蕈素(nebularine)，5-碘尿苷，5-碘脱氧尿苷，5-溴
脱氧尿苷，5-乙烯基脱氧尿苷，9-[(2-羟基)乙氧基]甲基鸟嘌呤(阿昔洛韦)，9-[(2-羟
基-1-羟甲基)-乙氧基]甲基鸟嘌呤(DHPG)，叠氮尿苷，叠氮胞苷，叠氮胸苷，双脱氧腺
苷，双脱氧胞苷，双脱氧肌苷，双脱氧鸟苷，双脱氧胸苷，3′-脱氧腺苷，3′-脱氧胞苷，
3′-脱氧肌苷，3′-脱氧鸟苷，3′-脱氧胸苷).
且这种相互作用可导致所述对象中肿瘤细胞杀死增加或者抗肿瘤免疫应答增加。可以与
病毒表达的基因产物相互作用的治疗性化合物可包括例如前体药物或其他化合物，其在给
对象施用的形式具有较小的毒性或者无毒性或者其他生物学活性，但在与病毒表达的基因
产物相互作用后，所述化合物可产生导致肿瘤细胞死亡的性质，包括但非限于胞毒性、诱导
细胞凋亡的能力、或者触发免疫应答的能力。在一个非限制性实例中，所述病毒携带一种
酶进入癌细胞中。一旦所述酶被导入癌细胞中，则施用了无活性形式的化疗药物(即前
药)。当无活性的前药到达癌细胞时，所述酶将前药转变为活性的化疗药，由此其可杀死癌
细胞。因此，所述治疗仅靶向于癌细胞，不影响正常细胞。所述前药可以与所述病毒同时
或相继施用。本领域已知各种前药样物质，在本文别处揭示了一系列这种化合物，所述化
合物可包括丙氧鸟苷，5-氟尿嘧啶，6-甲基嘌呤脱氧核苷，头孢菌素-阿霉素，4-[(2-氯乙
基)(2-甲磺酰氧乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸，对乙酰氨基酚，吲哚-3-乙酸，CB1954，
7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧基喜树碱，二-(2-氯乙基)氨基-4-羟
苯基-氨基甲酮28，1-氯甲基-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯基吲哚，表柔比星-葡糖苷酸，
5’-脱氧-5-氟尿苷，胞嘧啶阿糖胞苷，亚麻苦苷，及核苷类似物(例如氟尿苷，氟脱氧尿苷，
氟尿苷阿拉伯糖苷，阿糖胞苷，阿糖腺苷，鸟嘌呤阿拉伯糖苷，次黄嘌呤阿拉伯糖苷，6-巯基
嘌呤核苷，theoguanosine核苷，水粉蕈素(nebularine)，5-碘尿苷，5-碘脱氧尿苷，5-溴
脱氧尿苷，5-乙烯基脱氧尿苷，9-[(2-羟基)乙氧基]甲基鸟嘌呤(阿昔洛韦)，9-[(2-羟
基-1-羟甲基)-乙氧基]甲基鸟嘌呤(DHPG)，叠氮尿苷，叠氮胞苷，叠氮胸苷，双脱氧腺
苷，双脱氧胞苷，双脱氧肌苷，双脱氧鸟苷，双脱氧胸苷，3′-脱氧腺苷，3′-脱氧胞苷，
3′-脱氧肌苷，3′-脱氧鸟苷，3′-脱氧胸苷).
[0516] 在另一个实施方案中，可以与所述病毒联合起作用以降低病毒的繁殖、毒性或杀死细胞性质的治疗性化合物是可抑制病毒复制、抑制病毒毒素或者导致病毒死亡的化合
物。可以抑制病毒复制、抑制病毒毒素或导致病毒死亡的治疗性化合物一般可包括可阻断
病毒生命周期中的一或多个步骤的化合物，包括但非限于可抑制病毒DNA复制、病毒RNA转
录、病毒外壳蛋白装配、外膜或多糖装配的化合物。本领域已知可阻断病毒生命周期中一或
多个步骤的任何化合物，包括任何已知的抗病毒化合物(例如西多福韦)、病毒DNA聚合酶
抑制剂、病毒RNA聚合酶抑制剂、调节病毒DNA复制或RNA转录的蛋白质的抑制剂。在另一
实例中，病毒可含有编码病毒生命周期蛋白如DNA聚合酶或RNA聚合酶的基因，其可以被任
选对宿主生物体无毒性的化合物抑制。
物。可以抑制病毒复制、抑制病毒毒素或导致病毒死亡的治疗性化合物一般可包括可阻断
病毒生命周期中的一或多个步骤的化合物，包括但非限于可抑制病毒DNA复制、病毒RNA转
录、病毒外壳蛋白装配、外膜或多糖装配的化合物。本领域已知可阻断病毒生命周期中一或
多个步骤的任何化合物，包括任何已知的抗病毒化合物(例如西多福韦)、病毒DNA聚合酶
抑制剂、病毒RNA聚合酶抑制剂、调节病毒DNA复制或RNA转录的蛋白质的抑制剂。在另一
实例中，病毒可含有编码病毒生命周期蛋白如DNA聚合酶或RNA聚合酶的基因，其可以被任
选对宿主生物体无毒性的化合物抑制。
[0517] 除了在化疗剂与本发明提供的病毒之间的组合治疗之外，可应用其它更复杂的组合治疗策略。例如，组合治疗可包括化疗剂、治疗性抗体和本发明提供的病毒。或者，另一
组合治疗可以是放疗、治疗性抗体与本发明提供的病毒的组合。因此，组合治疗的观念也可
以基于应用本发明提供的病毒与一或多种如下治疗模式，即化疗剂、放疗、治疗性抗体、高
体温或低体温治疗、siRNA、诊断性/治疗性细菌、诊断性/治疗性哺乳动物细胞、免疫治疗
和/或靶向毒素(由抗体、脂质体和纳米颗粒输送)。
组合治疗可以是放疗、治疗性抗体与本发明提供的病毒的组合。因此，组合治疗的观念也可
以基于应用本发明提供的病毒与一或多种如下治疗模式，即化疗剂、放疗、治疗性抗体、高
体温或低体温治疗、siRNA、诊断性/治疗性细菌、诊断性/治疗性哺乳动物细胞、免疫治疗
和/或靶向毒素(由抗体、脂质体和纳米颗粒输送)。
[0518] 组合治疗的每种成分的有效输送对于本发明提供的方法是重要方面。根据一方面，下文论述的施用模式采用一或多个关键特征：(i)通过有效实现最高效价和最高治疗
作用的施用模式将本发明提供的病毒输送给肿瘤；(ii)通过实现最佳治疗作用的施用模
式将任何其它提及的治疗模式输送给肿瘤。施用的组合治疗的剂量方案是两或多种治疗模
式的组合是治疗有效的。剂量根据如患者的年龄、健康状况、性别、大小和体重、施用途径、
药物毒性、治疗频率及癌症对于每种治疗模式的相对易感性等因素而变化。
作用的施用模式将本发明提供的病毒输送给肿瘤；(ii)通过实现最佳治疗作用的施用模
式将任何其它提及的治疗模式输送给肿瘤。施用的组合治疗的剂量方案是两或多种治疗模
式的组合是治疗有效的。剂量根据如患者的年龄、健康状况、性别、大小和体重、施用途径、
药物毒性、治疗频率及癌症对于每种治疗模式的相对易感性等因素而变化。
[0519] 对于与治疗性化合物的组合治疗，这种化合物的施用剂量为本领域已知，可以由本领域技术人员根据已知临床因素确定(例如对象物种，大小，体表面积，年龄，性别，
免疫活性和一般状况，施用持续时间和途径，疾病的性质和阶段，例如肿瘤大小，及同时
施用的其它病毒、治疗或化合物，如其它化疗药)。除了上述因素之外，这种水平可以由
病毒的感染性、及病毒的性质影响，如可由本领域技术人员确定。例如，顺铂(也称作
cis-platinum，platinol；cis-diamminedichloroplatinum和cDDP)，是光谱的水溶性铂
协同化合物的代表，经常用于治疗睾丸癌、卵巢癌和各种其它癌症(见例如Blumenreich
et al.Cancer55(5)：1118-1122(1985)；Forastiere et al.J.Clin.Oncol.19(4)：
1088-1095(2001))。顺铂的临床应用方法为本领域熟知。例如，顺铂在一天内在6小时期
间施用，一个月施用一次，通过缓慢静脉内注射施用。对于局部损害，可以通过局部注射施
2
用顺铂。也可以使用腹膜内注射。顺铂的施用剂量可以低如每次治疗施用10mg/m，如果是
多重药物方案的一部分或者如果所述患者对高剂量有副作用。通常地，临床剂量为大约每
2
次治疗施用大约30至大约120或150mg/m。
免疫活性和一般状况，施用持续时间和途径，疾病的性质和阶段，例如肿瘤大小，及同时
施用的其它病毒、治疗或化合物，如其它化疗药)。除了上述因素之外，这种水平可以由
病毒的感染性、及病毒的性质影响，如可由本领域技术人员确定。例如，顺铂(也称作
cis-platinum，platinol；cis-diamminedichloroplatinum和cDDP)，是光谱的水溶性铂
协同化合物的代表，经常用于治疗睾丸癌、卵巢癌和各种其它癌症(见例如Blumenreich
et al.Cancer55(5)：1118-1122(1985)；Forastiere et al.J.Clin.Oncol.19(4)：
1088-1095(2001))。顺铂的临床应用方法为本领域熟知。例如，顺铂在一天内在6小时期
间施用，一个月施用一次，通过缓慢静脉内注射施用。对于局部损害，可以通过局部注射施
2
用顺铂。也可以使用腹膜内注射。顺铂的施用剂量可以低如每次治疗施用10mg/m，如果是
多重药物方案的一部分或者如果所述患者对高剂量有副作用。通常地，临床剂量为大约每
2
次治疗施用大约30至大约120或150mg/m。
[0520] 典型地，经肠道外施用含铂化疗剂，例如通过如上述缓慢静脉内注射或者通过局部注射。损害内部(肿瘤内)和IP施用顺铂的作用在(Nagase et al.Cancer Treat.
Rep.71(9)：825-829(1987)和Theon et al.J.Am.Vet.Med.Assoc.202(2)：261-7.(1993))
中描述。
Rep.71(9)：825-829(1987)和Theon et al.J.Am.Vet.Med.Assoc.202(2)：261-7.(1993))
中描述。
[0521] 在一个典型的实例中，施用所述病毒1次，2-6次或者更多次，每次施用间隔0-60天，随后1-30天无抗癌治疗，然后施用顺铂每天一次共1-5天，随后1-30天不施用抗癌治
疗。可以重复所述治疗的每个部分，病毒或顺铂治疗，或者病毒与顺铂组合治疗。在另一典
型的实例中，每天施用一次顺铂共1-5天，随后1-10天不施用抗癌治疗，然后间隔0-60天
施用一次或2-6次病毒。可以重复这种治疗方案。在另一典型的实例中，每天施用一次顺铂
共1-5天，随后1-10天不施用抗癌治疗，然后间隔0-60体内施用一次或2-6次所述病毒。
随后5-60天不施用抗癌治疗，然后再次施用顺铂1-5天。可以重复这种治疗方案。
疗。可以重复所述治疗的每个部分，病毒或顺铂治疗，或者病毒与顺铂组合治疗。在另一典
型的实例中，每天施用一次顺铂共1-5天，随后1-10天不施用抗癌治疗，然后间隔0-60天
施用一次或2-6次病毒。可以重复这种治疗方案。在另一典型的实例中，每天施用一次顺铂
共1-5天，随后1-10天不施用抗癌治疗，然后间隔0-60体内施用一次或2-6次所述病毒。
随后5-60天不施用抗癌治疗，然后再次施用顺铂1-5天。可以重复这种治疗方案。
[0522] 吉西他滨 是用于乳腺癌、非小细胞肺癌和胰腺癌治疗的另一种化合物。吉西他滨是呈现出抗肿瘤活性的一种核苷类似物。临床应用吉西他滨的方法为本领
2
域熟知。例如，已经将吉西他滨通过静脉内注射施用，每剂施用1000mg/m，在30分钟施用，
一周一次直至7周(或者直至毒性需求降低或者保持剂量)，随后休息一周不施用胰腺癌治
疗。随后的循环包括每4周中连续3周每周注射一次。吉西他滨也已经与顺铂组合用于癌
症治疗中。
2
域熟知。例如，已经将吉西他滨通过静脉内注射施用，每剂施用1000mg/m，在30分钟施用，
一周一次直至7周(或者直至毒性需求降低或者保持剂量)，随后休息一周不施用胰腺癌治
疗。随后的循环包括每4周中连续3周每周注射一次。吉西他滨也已经与顺铂组合用于癌
症治疗中。
[0523] 在一个典型的实例中，间隔0-60天施用所述病毒一次或2-6次，随后1-30天不施用抗癌治疗，然后间隔0-30天施用吉西他滨1-7次，随后1-30天不施用抗癌治疗。可以重
复这种治疗方案。在另一典型的实例中，间隔0-30天施用吉西他滨1-7次，随后1-10天不
予以抗癌治疗，然后间隔0-60天施用一次或2-6次所述病毒。随后50-60天不予以抗癌治
疗。可以重复这种治疗方案。在另一典型的实例中，间隔0-30天施用吉西他滨1-7次，随
后1-10天不予以抗癌治疗，然后间隔0-60天施用一次或2-6次病毒。随后5-60天不予以
抗癌治疗，然后间隔0-30天再次施用吉西他滨1-7次。可以重复这种治疗方案。
复这种治疗方案。在另一典型的实例中，间隔0-30天施用吉西他滨1-7次，随后1-10天不
予以抗癌治疗，然后间隔0-60天施用一次或2-6次所述病毒。随后50-60天不予以抗癌治
疗。可以重复这种治疗方案。在另一典型的实例中，间隔0-30天施用吉西他滨1-7次，随
后1-10天不予以抗癌治疗，然后间隔0-60天施用一次或2-6次病毒。随后5-60天不予以
抗癌治疗，然后间隔0-30天再次施用吉西他滨1-7次。可以重复这种治疗方案。
[0524] 如本领域技术人员所理解，最佳的治疗方案是变化的，其在所述治疗方法的范围内，在施用一或多次组合治疗之前及之后评估在治疗下疾病的状态及患者的一般状况，以
确定最佳的治疗组合。
确定最佳的治疗组合。
[0525] iii.免疫治疗和生物治疗
[0526] 治疗性化合物也包括但不限于这样的化合物，其发挥免疫治疗作用、刺激或阻抑免疫系统、携带治疗性化合物，或者这些作用的组合。任选地，所述治疗剂可呈现出或者显
示其它性质，如允许其用作成像剂的性质，如本文别处所述。这种治疗性化合物包括但不限
于抗癌抗体，放疗，siRNA分子及阻抑免疫系统的化合物(即免疫抑制物，免疫抑制制剂)。
在一些情况中，希望在施用所述病毒之前给对象施用以免疫抑制剂阻抑免疫系统，以使得
对于该病毒的任何不利反应最小化。典型的免疫抑制剂包括但不限于糖皮质激素，烷化剂，
抗代谢物，干扰素和免疫抑制抗体(例如抗-CD3和抗-IL2受体抗体)。
示其它性质，如允许其用作成像剂的性质，如本文别处所述。这种治疗性化合物包括但不限
于抗癌抗体，放疗，siRNA分子及阻抑免疫系统的化合物(即免疫抑制物，免疫抑制制剂)。
在一些情况中，希望在施用所述病毒之前给对象施用以免疫抑制剂阻抑免疫系统，以使得
对于该病毒的任何不利反应最小化。典型的免疫抑制剂包括但不限于糖皮质激素，烷化剂，
抗代谢物，干扰素和免疫抑制抗体(例如抗-CD3和抗-IL2受体抗体)。
[0527] 免疫治疗也包括如免疫刺激分子(基于蛋白质或基于非蛋白质)、细胞和抗体。免疫治疗可包括刺激免疫细胞更有效地起作用，或者使肿瘤细胞或肿瘤相关抗原可以被免疫
系统识别(即破坏耐受性)。
系统识别(即破坏耐受性)。
[0528] 细胞因子和生长因子包括但不限于白细胞介素，例如白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-6和白细胞介素-12，肿瘤坏死因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)，干扰素
如干扰素γ(IFN-γ)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，血管生成素，及组织因子。
如干扰素γ(IFN-γ)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，血管生成素，及组织因子。
[0529] 抗癌抗体包括但不限于利妥普单抗，ADEPT，曲妥珠单抗(Herceptin)，托西莫单抗(Bexxar)，西妥普单抗(Erbitux)，Ibritumomab(Zevalin)，阿仑珠单抗(Campath-1H)，依
帕珠单抗(Lymphocide)，吉妥珠单抗奥佐米星(Mylotarg)，Bevacimab(阿伐他汀)，特罗凯
(厄洛替尼)，SUTENT(sunitinib malate)，Panorex(依决洛单抗)，RITUXAN(Rituximab)，
泽娃灵(Zevalin)(90Y-ibritumomab tiuexetan)，Mylotarg(吉妥珠单抗奥佐米星)及
Campath(阿仑珠单抗)。
帕珠单抗(Lymphocide)，吉妥珠单抗奥佐米星(Mylotarg)，Bevacimab(阿伐他汀)，特罗凯
(厄洛替尼)，SUTENT(sunitinib malate)，Panorex(依决洛单抗)，RITUXAN(Rituximab)，
泽娃灵(Zevalin)(90Y-ibritumomab tiuexetan)，Mylotarg(吉妥珠单抗奥佐米星)及
Campath(阿仑珠单抗)。
[0530] 因此，本发明提供给对象施用一或多种治疗性化合物的方法，所述化合物可以联合所述病毒起作用以刺激或增强免疫系统，从而增强病毒的作用。这种免疫治疗可以作为
单独的治疗模式施用，或者可以由施用的病毒编码(如果所述免疫治疗是基于蛋白质的)。
单独的治疗模式施用，或者可以由施用的病毒编码(如果所述免疫治疗是基于蛋白质的)。
[0531] 生物治疗是使用天然身体物质或从天然身体物种中制备的药物进行的治疗。该治疗可帮助治疗癌症并控制由于其它癌症治疗如化疗产生的副作用。生物治疗有时也称作生
物学反应修饰剂(BRM′s)、生物学制剂或简单称作“生物制剂”，因为其刺激身体对癌症产
生生物学(或天然)应答。免疫治疗是使用天然物质进行治疗，身体用其对抗感染和疾病。
由于其使用天然物质，因此免疫治疗也是生物治疗。有一些类型的药物归入在生物学治疗
的术语下：这些药物包括如单克隆抗体(mAb)，癌症疫苗，血细胞生长因子，癌症生长抑制
剂，抗血管发生因子，干扰素α，白细胞介素-2(IL-2)，基因治疗以及膀胱癌的BCG疫苗。
物学反应修饰剂(BRM′s)、生物学制剂或简单称作“生物制剂”，因为其刺激身体对癌症产
生生物学(或天然)应答。免疫治疗是使用天然物质进行治疗，身体用其对抗感染和疾病。
由于其使用天然物质，因此免疫治疗也是生物治疗。有一些类型的药物归入在生物学治疗
的术语下：这些药物包括如单克隆抗体(mAb)，癌症疫苗，血细胞生长因子，癌症生长抑制
剂，抗血管发生因子，干扰素α，白细胞介素-2(IL-2)，基因治疗以及膀胱癌的BCG疫苗。
[0532] 单克隆抗体(mAbs)由于其结合独特抗原的特异性及在实验室中大批生产以大范围分布的能力而是特别感兴趣用于治疗癌症。单克隆抗体可以工程化为以与免疫系统
蛋白相同方式起作用，即在身体内寻找并杀死外来物，如病毒。单克隆抗体可以被设计为
识别癌细胞表面上的表位。所述抗体特异性靶向结合该表位并杀死癌细胞或者输送治疗
剂至癌细胞。本领域熟知治疗剂与抗体的缀合方法。针对不同类型的癌症产生不同的
抗体；例如利妥昔单抗识别非霍奇金淋巴瘤细胞外面的CD20蛋白；ADEPT是使用识别肠
(结肠)癌的抗体治疗；曲妥珠单抗(Herceptin)识别乳腺癌细胞，其产生太多的HER2蛋
白(“HER2阳性的”)。其它抗体包括例如托西莫单抗(Bexxar)，西妥普单抗(Erbitux)，
Ibritumomab(Zevalin)，阿仑珠单抗(Campath-1H)，依帕珠单抗(Lymphocide)，吉妥珠单
抗奥佐米星(Mylotarg)和Bevacimab(Avastin)。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病
毒可以与一或多种单克隆抗体同时或相继施用。在一个实例中，另外的治疗是以本发明提
供的一或多种任何其它治疗模式的形式施用。
蛋白相同方式起作用，即在身体内寻找并杀死外来物，如病毒。单克隆抗体可以被设计为
识别癌细胞表面上的表位。所述抗体特异性靶向结合该表位并杀死癌细胞或者输送治疗
剂至癌细胞。本领域熟知治疗剂与抗体的缀合方法。针对不同类型的癌症产生不同的
抗体；例如利妥昔单抗识别非霍奇金淋巴瘤细胞外面的CD20蛋白；ADEPT是使用识别肠
(结肠)癌的抗体治疗；曲妥珠单抗(Herceptin)识别乳腺癌细胞，其产生太多的HER2蛋
白(“HER2阳性的”)。其它抗体包括例如托西莫单抗(Bexxar)，西妥普单抗(Erbitux)，
Ibritumomab(Zevalin)，阿仑珠单抗(Campath-1H)，依帕珠单抗(Lymphocide)，吉妥珠单
抗奥佐米星(Mylotarg)和Bevacimab(Avastin)。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病
毒可以与一或多种单克隆抗体同时或相继施用。在一个实例中，另外的治疗是以本发明提
供的一或多种任何其它治疗模式的形式施用。
[0533] 与尝试预防感染不同，如在流感病毒的情况中，癌症疫苗是在一旦发生癌症时帮助治疗癌症。癌症疫苗的目的是刺激免疫应答。癌症疫苗包括例如抗原疫苗，全细胞疫苗，
树突状细胞疫苗，DNA疫苗和抗独特型疫苗。抗原疫苗是从肿瘤相关抗原中制备的或者由
癌细胞产生的疫苗。抗原疫苗刺激对象免疫系统攻击癌症。全细胞疫苗是使用完全的癌细
胞而不是仅从中获得的特异性抗原而产生的疫苗。所述疫苗由对象自身的癌细胞、另一对
象的癌细胞或者在实验室中市场的癌细胞制成。所述细胞在实验室中处理，通常用放射处
理，以便其不能生长，将其通过注射或者通过静脉内滴注于血流中而给对象施用，由此其可
刺激免疫系统攻击癌症。一种类型的全细胞疫苗是树突状细胞疫苗，其帮助免疫系统识别
和攻击异常细胞如癌细胞。树突状细胞疫苗是通过在实验室里将树突状细胞在癌细胞侧面
生长而制成的。施用该疫苗以刺激免疫系统攻击癌症。抗独特型疫苗是刺激身体产生抗癌
细胞的抗体的疫苗。癌细胞产生一些肿瘤相关抗原，这些抗原被免疫系统识别为是外来物。
但是由于癌细胞与非癌细胞相似，免疫系统的应答较弱。DNA疫苗加强免疫应答。DNA疫苗
从来自癌细胞的DNA中制备，其携带肿瘤相关抗原的基因。当注射DNA疫苗时，其使得免疫
系统细胞识别肿瘤相关抗原，并激活免疫系统细胞(即破坏耐受性)。使用DNA疫苗在治疗
黑素瘤中获得最佳结果。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病毒可以与全细胞疫苗同时
或相继施用。在一个实例中，另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗模式的
形式施用。
树突状细胞疫苗，DNA疫苗和抗独特型疫苗。抗原疫苗是从肿瘤相关抗原中制备的或者由
癌细胞产生的疫苗。抗原疫苗刺激对象免疫系统攻击癌症。全细胞疫苗是使用完全的癌细
胞而不是仅从中获得的特异性抗原而产生的疫苗。所述疫苗由对象自身的癌细胞、另一对
象的癌细胞或者在实验室中市场的癌细胞制成。所述细胞在实验室中处理，通常用放射处
理，以便其不能生长，将其通过注射或者通过静脉内滴注于血流中而给对象施用，由此其可
刺激免疫系统攻击癌症。一种类型的全细胞疫苗是树突状细胞疫苗，其帮助免疫系统识别
和攻击异常细胞如癌细胞。树突状细胞疫苗是通过在实验室里将树突状细胞在癌细胞侧面
生长而制成的。施用该疫苗以刺激免疫系统攻击癌症。抗独特型疫苗是刺激身体产生抗癌
细胞的抗体的疫苗。癌细胞产生一些肿瘤相关抗原，这些抗原被免疫系统识别为是外来物。
但是由于癌细胞与非癌细胞相似，免疫系统的应答较弱。DNA疫苗加强免疫应答。DNA疫苗
从来自癌细胞的DNA中制备，其携带肿瘤相关抗原的基因。当注射DNA疫苗时，其使得免疫
系统细胞识别肿瘤相关抗原，并激活免疫系统细胞(即破坏耐受性)。使用DNA疫苗在治疗
黑素瘤中获得最佳结果。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病毒可以与全细胞疫苗同时
或相继施用。在一个实例中，另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗模式的
形式施用。
[0534] 生长因子是刺激骨髓产生血细胞的天然物质。重组技术可用于产生生长因子，可将其施用至对象以增加血液中白细胞、红细胞和干细胞的数目。癌症治疗中使用的以增加
白细胞的生长因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，也称作优保沣(Neupogen)或来格拉
诺赛特(Granocyte)，及包括粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称作莫拉司亭。
帮助治疗贫血的生长因子是红细胞生成素(EPO)。EPO促进身体产生更多的红细胞，随之增
加身体组织中血红蛋白水平和氧水平。开发的其它生长因子可以增加血小板。因此，在癌症
的治疗中，本发明提供的病毒可以与生长因子如GM-CSF同时或相继施用。在一个实例中，
另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗模式的形式施用。
白细胞的生长因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，也称作优保沣(Neupogen)或来格拉
诺赛特(Granocyte)，及包括粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称作莫拉司亭。
帮助治疗贫血的生长因子是红细胞生成素(EPO)。EPO促进身体产生更多的红细胞，随之增
加身体组织中血红蛋白水平和氧水平。开发的其它生长因子可以增加血小板。因此，在癌症
的治疗中，本发明提供的病毒可以与生长因子如GM-CSF同时或相继施用。在一个实例中，
另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗模式的形式施用。
[0535] 癌症生长抑制剂使用细胞信号分子，其控制细胞如癌细胞的生长和增殖。阻断这些信号分子的药物可终止肿瘤生长和分化。癌症生长因子包括但不限于酪氨酸激酶。因
此，阻断酪氨酸激酶的药物是酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)。典型的TKIs包括但不限于厄洛替
尼(Tarceva，OSI-774)，Iressa(Gefitinib，ZD1839)和伊马替尼(Glivec，STI571)。另一类
型的生长抑制剂是硼替佐米(Velcade)，用于治疗多发性骨髓瘤和一些其它癌症。Velcade
是一种蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体在细胞中被发现，其帮助在细胞中破坏蛋白质。干扰蛋
白酶体的作用导致细胞中蛋白质建立毒性水平，从而杀死癌细胞。癌细胞与正常细胞相比
对于Velcade更敏感。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病毒可以与癌症生长抑制剂如
Velcade同时或相继施用。在一个实例中，另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它
治疗模式的形式施用。
此，阻断酪氨酸激酶的药物是酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)。典型的TKIs包括但不限于厄洛替
尼(Tarceva，OSI-774)，Iressa(Gefitinib，ZD1839)和伊马替尼(Glivec，STI571)。另一类
型的生长抑制剂是硼替佐米(Velcade)，用于治疗多发性骨髓瘤和一些其它癌症。Velcade
是一种蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体在细胞中被发现，其帮助在细胞中破坏蛋白质。干扰蛋
白酶体的作用导致细胞中蛋白质建立毒性水平，从而杀死癌细胞。癌细胞与正常细胞相比
对于Velcade更敏感。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病毒可以与癌症生长抑制剂如
Velcade同时或相继施用。在一个实例中，另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它
治疗模式的形式施用。
[0536] 癌症需要血液供养以随着其变得更大而扩展和生长其自身血管。没有其自身的血供，癌症由于缺少营养和氧而不能生长。抗血管发生药物终止肿瘤发展其自身血管。典型
的这些类型的药物包括但不限于沙立度胺，主要用于治疗骨髓瘤，但也实验治疗其它类型
癌症，及阿伐他丁(Avastin)，这是一种单克隆抗体，其已经用于治疗肠癌。因此，在癌症的
治疗中，本发明提供的病毒可以与抗血管发生药物同时或相继施用。在一个实例中，另外的
治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗模式的形式施用。
的这些类型的药物包括但不限于沙立度胺，主要用于治疗骨髓瘤，但也实验治疗其它类型
癌症，及阿伐他丁(Avastin)，这是一种单克隆抗体，其已经用于治疗肠癌。因此，在癌症的
治疗中，本发明提供的病毒可以与抗血管发生药物同时或相继施用。在一个实例中，另外的
治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗模式的形式施用。
[0537] 干扰素-α(IFN-α)是一种作为免疫应答的一部分在身体内以极小量产生的一种天然物质。施用IFN-α作为治疗方式以增强免疫系统及帮助对抗癌症如肾细胞(肾)
癌、恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤及一些类型的白血病。IFN-α以如下一些方式起作用：其可
帮助终止癌细胞生长，其也可以增强免疫系统以帮助其攻击癌症，及其可影响供给癌细胞
的血供。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病毒可与IFN-α同时或相继施用。在一个
实例中，另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗模式的形式施用。
癌、恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤及一些类型的白血病。IFN-α以如下一些方式起作用：其可
帮助终止癌细胞生长，其也可以增强免疫系统以帮助其攻击癌症，及其可影响供给癌细胞
的血供。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病毒可与IFN-α同时或相继施用。在一个
实例中，另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗模式的形式施用。
[0538] 施用IL-2是一种生物治疗药物，因为其由免疫系统天然产生。因此，其也是免疫治疗。白细胞介素2用于治疗肾细胞癌症，并且正在临床试验中针对一些其它类型的癌症
进行检测。IL-2通过干扰细胞生长和增殖而直接作用于癌细胞；其通过促进杀伤性T细胞
及攻击癌细胞的其它细胞的生长刺激免疫系统；及其也刺激癌细胞分泌趋化物以引诱免疫
系统细胞。IL-2一般通过就在皮肤之下的皮下注射施用，一天施用一次共五天，随后休息两
天。注射循环重复4周，随后一周不予以治疗。施用的治疗方案和循环次数依赖于癌症的
类型及其对于所述治疗的应答情况。IL-2可以自己施用或者由健康专业人士施用。或者，
IL-2可以通过注射或滴注经静脉内注射。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病毒可以与
IL-2同时或者相继施用。在一个实例中，另外的治疗以本发明提供的一或多种任何其它治
疗模式的形式施用。
进行检测。IL-2通过干扰细胞生长和增殖而直接作用于癌细胞；其通过促进杀伤性T细胞
及攻击癌细胞的其它细胞的生长刺激免疫系统；及其也刺激癌细胞分泌趋化物以引诱免疫
系统细胞。IL-2一般通过就在皮肤之下的皮下注射施用，一天施用一次共五天，随后休息两
天。注射循环重复4周，随后一周不予以治疗。施用的治疗方案和循环次数依赖于癌症的
类型及其对于所述治疗的应答情况。IL-2可以自己施用或者由健康专业人士施用。或者，
IL-2可以通过注射或滴注经静脉内注射。因此，在癌症的治疗中，本发明提供的病毒可以与
IL-2同时或者相继施用。在一个实例中，另外的治疗以本发明提供的一或多种任何其它治
疗模式的形式施用。
[0539] 基因治疗包括通过阻断癌细胞中的异常基因、修复或置换癌细胞中的异常基因、促进甚至更多的基因在癌细胞中成为异常基因，由此其死亡或者变成治疗敏感性的，使用
携带治疗活性酶进入癌细胞或者其组合进行。结果，癌细胞由于细胞中的损害而死亡。癌细
胞是由于其一些基因中的某些类型的突变的结果而发生。靶向的基因包括但不限于促进细
胞倍增的基因(即致癌基因)，终止细胞倍增的基因(即肿瘤阻抑物基因)以及修复其它损
害的基因的基因。基因治疗可包括修复损害的致癌基因或者阻断致癌基因产生的蛋白质。
肿瘤阻抑物基因p53在许多人体癌症中被损害。病毒已经用于输送未损害的p53基因进入
癌细胞，早期临床试验目前在进行审视用修饰的p53-产生病毒治疗癌症。基因治疗可用于
置换损害的DNA修复基因。在另一个实例中，增加肿瘤细胞内DNA损害的方法可促进肿瘤
细胞死亡或者导致肿瘤细胞对于其它癌症治疗方法如放疗或化疗的敏感性增加。因此，在
癌症的治疗中，本发明提供的病毒可以与本发明提供的或本领域已知的任何基因治疗方法
同时或相继施用。在一个实例中，另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗形
式施用的。
携带治疗活性酶进入癌细胞或者其组合进行。结果，癌细胞由于细胞中的损害而死亡。癌细
胞是由于其一些基因中的某些类型的突变的结果而发生。靶向的基因包括但不限于促进细
胞倍增的基因(即致癌基因)，终止细胞倍增的基因(即肿瘤阻抑物基因)以及修复其它损
害的基因的基因。基因治疗可包括修复损害的致癌基因或者阻断致癌基因产生的蛋白质。
肿瘤阻抑物基因p53在许多人体癌症中被损害。病毒已经用于输送未损害的p53基因进入
癌细胞，早期临床试验目前在进行审视用修饰的p53-产生病毒治疗癌症。基因治疗可用于
置换损害的DNA修复基因。在另一个实例中，增加肿瘤细胞内DNA损害的方法可促进肿瘤
细胞死亡或者导致肿瘤细胞对于其它癌症治疗方法如放疗或化疗的敏感性增加。因此，在
癌症的治疗中，本发明提供的病毒可以与本发明提供的或本领域已知的任何基因治疗方法
同时或相继施用。在一个实例中，另外的治疗是以本发明提供的一或多种任何其它治疗形
式施用的。
[0540] 早期膀胱癌的治疗称作膀胱内治疗，这是主要用于治疗高级别(级别3或G3)的T1期膀胱癌或者膀胱的原位癌(也称作Tis或CIS)。BCG是一种肺结核(TB)疫苗，其也已
经被发现在治疗CIS及预防膀胱癌复发中是有效的。在一些情况中，BCG疫苗已经用于治
疗级别2早期膀胱癌。由于膀胱癌可发生在膀胱内壁的任何部位，其不能使用与乳突状早
期膀胱癌相同的方式去除。而是使用膀胱内治疗方法施用BCG疫苗，即首先在膀胱中插入
导管(管)，随后经导管内施用BCG疫苗和/或化疗处理。根据对膀胱癌的作用，BCG治疗
每周一次，施用六周或更长时间。膀胱癌的BCG治疗可以组合其它类型的治疗，如施用化疗
(膀胱内、IL-2、用使细胞对于光敏感的药物治疗、维生素及光动力学治疗。因此，在癌症的
治疗中，本发明提供的病毒可以与BCG疫苗同时或相继施用。在一个实例中，以本发明提供
的一或多种任何其它治疗形式施用其它的治疗。
经被发现在治疗CIS及预防膀胱癌复发中是有效的。在一些情况中，BCG疫苗已经用于治
疗级别2早期膀胱癌。由于膀胱癌可发生在膀胱内壁的任何部位，其不能使用与乳突状早
期膀胱癌相同的方式去除。而是使用膀胱内治疗方法施用BCG疫苗，即首先在膀胱中插入
导管(管)，随后经导管内施用BCG疫苗和/或化疗处理。根据对膀胱癌的作用，BCG治疗
每周一次，施用六周或更长时间。膀胱癌的BCG治疗可以组合其它类型的治疗，如施用化疗
(膀胱内、IL-2、用使细胞对于光敏感的药物治疗、维生素及光动力学治疗。因此，在癌症的
治疗中，本发明提供的病毒可以与BCG疫苗同时或相继施用。在一个实例中，以本发明提供
的一或多种任何其它治疗形式施用其它的治疗。
[0541] e.对象状态
[0542] 在另一个实例中，本发明提供的给对象施用病毒的方法可以对任何状况的对象进行，包括麻醉的对象、警觉的对象、体温升高的对象、体温降低的对象、或者已知影响病毒在
肿瘤中积累的其它状态的对象。如本发明所提供，已经确定麻醉的对象相对于未麻醉的对
象而言，肿瘤中病毒的积累速度降低。如本发明所进一步提供，已经确定体温降低的对象相
对于正常体温的对象而言，肿瘤中病毒的积累速度降低。因此，本发明提供给对象施用病毒
的方法，其中所述方法可包括给对象施用病毒，其中所述对象不是在麻醉如全身麻醉之下；
例如，所述对象可以在局部麻醉之下或者可以是未麻醉的。本发明还提供给对象施用病毒
的方法，其中所述方法可包括给体温改变的对象施用病毒，其中所述体温的改变可影响病
毒在肿瘤中积累的能力；典型地，体温降低可降低病毒在肿瘤内的积累能力。因此，在一个
示例性实例中，本发明提供给所述对象施用病毒的方法，其中所述方法包括使所述对象的
体温升高至正常体温之上，并且给所述对象施用病毒，其中所述病毒相对在正常体温的对
象可更易于积累在较高体温的对象肿瘤中。
肿瘤中积累的其它状态的对象。如本发明所提供，已经确定麻醉的对象相对于未麻醉的对
象而言，肿瘤中病毒的积累速度降低。如本发明所进一步提供，已经确定体温降低的对象相
对于正常体温的对象而言，肿瘤中病毒的积累速度降低。因此，本发明提供给对象施用病毒
的方法，其中所述方法可包括给对象施用病毒，其中所述对象不是在麻醉如全身麻醉之下；
例如，所述对象可以在局部麻醉之下或者可以是未麻醉的。本发明还提供给对象施用病毒
的方法，其中所述方法可包括给体温改变的对象施用病毒，其中所述体温的改变可影响病
毒在肿瘤中积累的能力；典型地，体温降低可降低病毒在肿瘤内的积累能力。因此，在一个
示例性实例中，本发明提供给所述对象施用病毒的方法，其中所述方法包括使所述对象的
体温升高至正常体温之上，并且给所述对象施用病毒，其中所述病毒相对在正常体温的对
象可更易于积累在较高体温的对象肿瘤中。
[0543] 4.监测
[0544] 本发明提供的方法可进一步包括监测所述对象、监测所述肿瘤和/或监测给对象施用的病毒的一或多个步骤。本发明提供的方法可包括任何监测步骤，包括但非限于监测
肿瘤大小、监测抗肿瘤抗原的抗体效价、监测转移的存在和/或大小、监测所述对象的淋巴
结、监测所述对象的体重或者其他健康指征，包括血液或尿液指征，监测抗微生物抗原的抗
体效价，监测可检测基因产物的病毒表达及直接检测对象的肿瘤、组织或器官中病毒效价。
肿瘤大小、监测抗肿瘤抗原的抗体效价、监测转移的存在和/或大小、监测所述对象的淋巴
结、监测所述对象的体重或者其他健康指征，包括血液或尿液指征，监测抗微生物抗原的抗
体效价，监测可检测基因产物的病毒表达及直接检测对象的肿瘤、组织或器官中病毒效价。
[0545] 监测目的可以是简单地评价所述对象的健康状况或者治疗性处理的进展，或者可以是为了确定是否进一步施用相同或不同的病毒，或者确定何时或是否施用所述对象以化
合物，其中所述化合物可以增加治疗方法的效力或者所述化合物可降低给对象施用的病毒
的致病性。
合物，其中所述化合物可以增加治疗方法的效力或者所述化合物可降低给对象施用的病毒
的致病性。
[0546] a.监测基因表达
[0547] 在一些实施方案中，本发明提供的方法可包括监测一或多种病毒表达的基因。病毒可以表达一或多种可检测的基因产物，包括但非限于可检测的蛋白质(例如发光或荧光
蛋白)或者诱导可检测信号的蛋白质(例如结合或者转运可检测化合物或者修饰底物以产
生信号的蛋白质)。感染的细胞/组织因此可通过一或多种光学或非光学成像方法成像。
蛋白)或者诱导可检测信号的蛋白质(例如结合或者转运可检测化合物或者修饰底物以产
生信号的蛋白质)。感染的细胞/组织因此可通过一或多种光学或非光学成像方法成像。
[0548] 如本发明所提供，由病毒表达的可检测的基因产物的测定可以提供对所述对象中存在的病毒水平的精确确定。如本发明进一步所提供，可检测的基因产物位置的测定，例
如通过成像方法包括但不限于磁共振、荧光和X线断层成像方法测定，可确定所述对象中
所述病毒的定位。因此，包括监测可监测的病毒基因产物的本发明提供的方法可用于确定
对象的一或多个器官或组织中所述病毒的存在与否，和/或确定对象的肿瘤或转移中所述
病毒的存在与否。另外，包括监测可检测的病毒基因产物的本发明提供的方法可用于确定
一或多个器官、组织、肿瘤或转移中存在的病毒的效价。包括监测对象中病毒的定位和/
或效价的方法可用于确定病毒的致病性；因为正常组织和器官的病毒感染特别是感染水平
可以表明探针的致病性，监测对象中病毒的定位和/或数量的方法可用于确定病毒的致病
性。因为本发明提供的方法可用于监测对象中任何特定部位的病毒的量，所以包括监测对
象中病毒的定位和/或效价的方法可以在多个时间点进行，并因此可确定病毒在对象中的
复制速度，包括病毒在对象的一或多个器官或组织中的复制速度；因此，监测病毒基因产物
的方法可用于确定病毒的复制能力。本发明提供的方法还可以用于量化各种器官或组织及
肿瘤或转移中存在的病毒的量，并从而可以表明在对象中所述病毒的优先积累程度；因此，
本发明提供的病毒基因产物监测方法可用于确定病毒与积累在正常组织或器官中相比优
先积累在肿瘤或转移中的能力。因为本发明提供的方法中使用的病毒可积累在全部的肿瘤
中或者可以积累在肿瘤的多个部位，并且也可以积累在转移中，因此本发明提供的监测病
毒基因产物的方法可用于确定对象中存在的肿瘤大小或转移数目。在一定时间内这种监测
肿瘤或转移中病毒基因产物的存在可用于估计肿瘤或转移中的改变，包括肿瘤的生长或皱
缩，或者新转移的发展或转移的消失，并且也可以用于确定肿瘤的生长或皱缩的速度，或者
新转移的发展或消失，或者肿瘤的生长或皱缩速度的改变，或者新转移的发展或消失的速
度的改变。因此，监测病毒基因产物的方法可用于监测对象中的肿瘤疾病，或者用于确定肿
瘤疾病的治疗效力，通过确定肿瘤的生长或皱缩速度，或者新转移的发展或消失，或者肿瘤
的生长或皱缩的速度的改变，或者新转移的发展或转移的消失的速度的改变而进行。
如通过成像方法包括但不限于磁共振、荧光和X线断层成像方法测定，可确定所述对象中
所述病毒的定位。因此，包括监测可监测的病毒基因产物的本发明提供的方法可用于确定
对象的一或多个器官或组织中所述病毒的存在与否，和/或确定对象的肿瘤或转移中所述
病毒的存在与否。另外，包括监测可检测的病毒基因产物的本发明提供的方法可用于确定
一或多个器官、组织、肿瘤或转移中存在的病毒的效价。包括监测对象中病毒的定位和/
或效价的方法可用于确定病毒的致病性；因为正常组织和器官的病毒感染特别是感染水平
可以表明探针的致病性，监测对象中病毒的定位和/或数量的方法可用于确定病毒的致病
性。因为本发明提供的方法可用于监测对象中任何特定部位的病毒的量，所以包括监测对
象中病毒的定位和/或效价的方法可以在多个时间点进行，并因此可确定病毒在对象中的
复制速度，包括病毒在对象的一或多个器官或组织中的复制速度；因此，监测病毒基因产物
的方法可用于确定病毒的复制能力。本发明提供的方法还可以用于量化各种器官或组织及
肿瘤或转移中存在的病毒的量，并从而可以表明在对象中所述病毒的优先积累程度；因此，
本发明提供的病毒基因产物监测方法可用于确定病毒与积累在正常组织或器官中相比优
先积累在肿瘤或转移中的能力。因为本发明提供的方法中使用的病毒可积累在全部的肿瘤
中或者可以积累在肿瘤的多个部位，并且也可以积累在转移中，因此本发明提供的监测病
毒基因产物的方法可用于确定对象中存在的肿瘤大小或转移数目。在一定时间内这种监测
肿瘤或转移中病毒基因产物的存在可用于估计肿瘤或转移中的改变，包括肿瘤的生长或皱
缩，或者新转移的发展或转移的消失，并且也可以用于确定肿瘤的生长或皱缩的速度，或者
新转移的发展或消失，或者肿瘤的生长或皱缩速度的改变，或者新转移的发展或消失的速
度的改变。因此，监测病毒基因产物的方法可用于监测对象中的肿瘤疾病，或者用于确定肿
瘤疾病的治疗效力，通过确定肿瘤的生长或皱缩速度，或者新转移的发展或消失，或者肿瘤
的生长或皱缩的速度的改变，或者新转移的发展或转移的消失的速度的改变而进行。
[0549] 在本发明提供的监测方法中可以检测任何可检测的蛋白质；例如这些可检测的蛋白质非限制性例如包括任何荧光蛋白(例如绿色或红色荧光蛋白)，任何萤光素酶、运铁蛋
白或其他铁结合蛋白；或者受体、结合蛋白及抗体，其中特异性结合所述受体的化合物、结
合蛋白或抗体可以是一种可检测的物质或者可以是用可检测的物质(例如放射性同位素
或成像剂)标记；或者转运蛋白(如hNET或hNIS)，其可结合可检测的分子并将其转运进
细胞中。表达可检测蛋白的病毒可以通过组合本发明提供的及本领域已知的方法检测。表
达一种以上可检测蛋白的病毒或者表达不同的可检测蛋白的两或多种病毒可以通过双重
成像方法检测和区分。例如，表达荧光蛋白和铁结合蛋白的病毒可以在体外或者在体内分
别通过弱光荧光成像和磁共振方法检测。在另一实例中，表达两或多种荧光蛋白的病毒可
以通过在不同波长的荧光成像方法检测。可以对已经施用表达两或多种可检测基因产物的
病毒或者均表达一或多种可检测基因产物的两或多种病毒的对象进行体内双重成像。
白或其他铁结合蛋白；或者受体、结合蛋白及抗体，其中特异性结合所述受体的化合物、结
合蛋白或抗体可以是一种可检测的物质或者可以是用可检测的物质(例如放射性同位素
或成像剂)标记；或者转运蛋白(如hNET或hNIS)，其可结合可检测的分子并将其转运进
细胞中。表达可检测蛋白的病毒可以通过组合本发明提供的及本领域已知的方法检测。表
达一种以上可检测蛋白的病毒或者表达不同的可检测蛋白的两或多种病毒可以通过双重
成像方法检测和区分。例如，表达荧光蛋白和铁结合蛋白的病毒可以在体外或者在体内分
别通过弱光荧光成像和磁共振方法检测。在另一实例中，表达两或多种荧光蛋白的病毒可
以通过在不同波长的荧光成像方法检测。可以对已经施用表达两或多种可检测基因产物的
病毒或者均表达一或多种可检测基因产物的两或多种病毒的对象进行体内双重成像。
[0550] b.监测肿瘤大小
[0551] 本发明还提供监测肿瘤和/或转移大小和位置的方法。肿瘤或转移的大小可以通过本领域已知的任何方法监测，包括外部评估方法或断层扫描或磁性成像方法。除了本领
域已知的方法外，本发明提供的方法如监测病毒基因表达可以用于监测肿瘤和/或转移大
小。
域已知的方法外，本发明提供的方法如监测病毒基因表达可以用于监测肿瘤和/或转移大
小。
[0552] 在一些时间点监测大小可提供关于肿瘤或转移大小增加或缩小的信息，并且还可以提供关于对象体内另外的肿瘤和/或转移存在与否的信息。在一些时间点监测肿瘤大小
可提供关于对象体内肿瘤疾病发生的信息，包括对对象肿瘤疾病的治疗效力。
可提供关于对象体内肿瘤疾病发生的信息，包括对对象肿瘤疾病的治疗效力。
[0553] c.监测抗体效价
[0554] 本发明提供的方法还可包括监测对象中抗体效价，包括应答给对象施用一种病毒而产生的抗体。在本发明提供的方法中施用的病毒可激发对内源病毒抗原的免疫应答。本
发明提供的方法中施用的病毒还可激发对病毒表达的外源基因的免疫应答。本发明提供的
方法中施用的病毒也可以激发对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对病毒抗原、病毒表达的外
源基因产物或肿瘤抗原的抗体效价可用于监测病毒毒性、监测治疗方法的效力或者监测生
产和/或收集的基因产物或抗体的水平。
发明提供的方法中施用的病毒还可激发对病毒表达的外源基因的免疫应答。本发明提供的
方法中施用的病毒也可以激发对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对病毒抗原、病毒表达的外
源基因产物或肿瘤抗原的抗体效价可用于监测病毒毒性、监测治疗方法的效力或者监测生
产和/或收集的基因产物或抗体的水平。
[0555] 在一个实例中，监测抗体效价可用于监测病毒的毒性。针对病毒的抗体效价在施用所述对象所述病毒后随着时间而变化，其中在一些特定的时间点，低抗病毒抗原抗体效
价可表示较高的毒性，而在其他时间点高抗病毒抗原抗体效价可表示较高的毒性。本发明
提供的方法中使用的病毒可以是免疫原性的，并因此可以在施用所述对象所述病毒后不久
即激发免疫应答。通常地，对象免疫系统所针对的可迅速激发强的免疫应答的病毒可以是
当所述对象免疫系统可以从所有正常器官或组织中除去所述病毒时低毒性的病毒。因此，
在一些实例中，在给对象施用所述病毒后不久针对病毒抗原的高抗体效价可以提示病毒的
低毒性。相反，非高免疫原性的病毒可感染宿主身体而不激发强的免疫应答，这可导致所述
病毒对宿主的较高毒性。因此，在一些实例中，在给对象施用所述病毒后不久针对病毒抗原
的高抗体效价可表示病毒的低毒性。
价可表示较高的毒性，而在其他时间点高抗病毒抗原抗体效价可表示较高的毒性。本发明
提供的方法中使用的病毒可以是免疫原性的，并因此可以在施用所述对象所述病毒后不久
即激发免疫应答。通常地，对象免疫系统所针对的可迅速激发强的免疫应答的病毒可以是
当所述对象免疫系统可以从所有正常器官或组织中除去所述病毒时低毒性的病毒。因此，
在一些实例中，在给对象施用所述病毒后不久针对病毒抗原的高抗体效价可以提示病毒的
低毒性。相反，非高免疫原性的病毒可感染宿主身体而不激发强的免疫应答，这可导致所述
病毒对宿主的较高毒性。因此，在一些实例中，在给对象施用所述病毒后不久针对病毒抗原
的高抗体效价可表示病毒的低毒性。
[0556] 在其它实例中，监测抗体效价可用于监测治疗方法的效力。在本发明提供的方法中，抗体效价如抗肿瘤抗原抗体效价可提示治疗方法如治疗肿瘤疾病的治疗方法的效力。
本发明提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答。因此，通过监
测抗肿瘤抗原抗体效价，可以监测引起或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答的治疗方法
的效力。本发明提供的治疗方法还可以包括给对象施用一种病毒，所述病毒可积累在肿瘤
中并可引起或增强抗肿瘤免疫应答。因此，可以监测宿主激发针对积累在肿瘤或转移中的
病毒的免疫应答的能力，这可以提示对象也已经激发了抗肿瘤免疫应答，或者可以提示对
象可能激发抗肿瘤免疫应答，或者可以提示对象能激发抗肿瘤免疫应答。
本发明提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答。因此，通过监
测抗肿瘤抗原抗体效价，可以监测引起或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答的治疗方法
的效力。本发明提供的治疗方法还可以包括给对象施用一种病毒，所述病毒可积累在肿瘤
中并可引起或增强抗肿瘤免疫应答。因此，可以监测宿主激发针对积累在肿瘤或转移中的
病毒的免疫应答的能力，这可以提示对象也已经激发了抗肿瘤免疫应答，或者可以提示对
象可能激发抗肿瘤免疫应答，或者可以提示对象能激发抗肿瘤免疫应答。
[0557] 在其它实例中，监测抗体效价可用于监测生产和/或收集的基因产物或抗体的水平。本发明提供的方法可用于通过表达已经积累在肿瘤内的病毒中的外源基因而产生蛋白
质、RNA分子或其他化合物。本发明进一步提供了通过针对已经积累在肿瘤内的病毒中的
外源基因的表达产生的蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗体的生产方法。监测针对所述
蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗体效价可提示由肿瘤积累的病毒产生的蛋白质、RNA分
子或其他化合物的水平，并且也可直接提示特异于这种蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗
体的水平。
质、RNA分子或其他化合物。本发明进一步提供了通过针对已经积累在肿瘤内的病毒中的
外源基因的表达产生的蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗体的生产方法。监测针对所述
蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗体效价可提示由肿瘤积累的病毒产生的蛋白质、RNA分
子或其他化合物的水平，并且也可直接提示特异于这种蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗
体的水平。
[0558] d.监测一般健康诊断
[0559] 本发明提供的方法还可以包括监测对象健康状况的方法。本发明提供的一些方法是治疗性方法，包括肿瘤疾病的治疗方法。监测对象的健康状况如本领域所已知可用于确
定治疗方法的效力。本发明提供的方法还可以包括给对象施用一种病毒的步骤。监测对象
的健康状况可用于确定给对象施用的病毒的致病性。本领域已知的监测疾病如肿瘤疾病、
感染性疾病或免疫相关的疾病的任何健康诊断方法均可以监测。例如，对象的体重、血压、
脉搏、呼吸、面色、体温或其他可观测的状态可表示对象的健康状况。另外，对象的样品中一
或多种成分的存在与否或水平可以表示对象的健康状况。典型的样品可包括血液和尿液样
品，其中一或多种成分的存在与否或水平可以通过进行例如血液或尿液诊断测试而确定。
表示对象健康状况的成分例如包括但非限于白细胞计数、血细胞比容、反应蛋白浓度。
定治疗方法的效力。本发明提供的方法还可以包括给对象施用一种病毒的步骤。监测对象
的健康状况可用于确定给对象施用的病毒的致病性。本领域已知的监测疾病如肿瘤疾病、
感染性疾病或免疫相关的疾病的任何健康诊断方法均可以监测。例如，对象的体重、血压、
脉搏、呼吸、面色、体温或其他可观测的状态可表示对象的健康状况。另外，对象的样品中一
或多种成分的存在与否或水平可以表示对象的健康状况。典型的样品可包括血液和尿液样
品，其中一或多种成分的存在与否或水平可以通过进行例如血液或尿液诊断测试而确定。
表示对象健康状况的成分例如包括但非限于白细胞计数、血细胞比容、反应蛋白浓度。
[0560] e.监测协同治疗
[0561] 本发明提供监测治疗的方法，其中治疗决定可基于监测的结果。本发明提供的治疗方法可包括给对象施用病毒，所述病毒可优先积累在肿瘤和/或转移中，所述病毒可引
起或增强抗肿瘤免疫应答。这些治疗方法可包括多个步骤，包括多次施用一种特定的病毒，
施用第二种病毒，或者施用治疗性化合物。确定施用所述对象的病毒或化合物的数量、时间
或类型可基于监测所述对象的一或多个结果。例如，对象中的抗体效价可用于确定是否需
要施用病毒或化合物，施用的病毒或化合物的数量，施用的病毒或化合物的类型，其中例如
低抗体效价可表示需要施用额外的病毒、不同的病毒或者治疗性化合物如诱导病毒基因表
达的化合物。在另一个实例中，对象的整体健康状况可用于确定是否需要施用病毒或化合
物、施用的病毒或化合物的数量、及施用的病毒或化合物的类型，其中例如确定所述对象是
健康的可表示需要施用额外的病毒、不同的病毒或治疗性化合物如诱导病毒基因表达的化
合物。在另一实例中，监测可检测的病毒表达的基因产物可用于确定是否需要施用病毒或
化合物、施用的病毒或化合物的数量、及施用的病毒或化合物的类型。这些监测方法可用于
确定治疗方法是否是有效的、治疗方法对对象是否是致病性的、所述病毒是否已经积累在
肿瘤或转移中、及所述病毒是否已经积累在正常组织或器官中。基于这些确定，可以推导出
进一步治疗方法的可需性和形式。
起或增强抗肿瘤免疫应答。这些治疗方法可包括多个步骤，包括多次施用一种特定的病毒，
施用第二种病毒，或者施用治疗性化合物。确定施用所述对象的病毒或化合物的数量、时间
或类型可基于监测所述对象的一或多个结果。例如，对象中的抗体效价可用于确定是否需
要施用病毒或化合物，施用的病毒或化合物的数量，施用的病毒或化合物的类型，其中例如
低抗体效价可表示需要施用额外的病毒、不同的病毒或者治疗性化合物如诱导病毒基因表
达的化合物。在另一个实例中，对象的整体健康状况可用于确定是否需要施用病毒或化合
物、施用的病毒或化合物的数量、及施用的病毒或化合物的类型，其中例如确定所述对象是
健康的可表示需要施用额外的病毒、不同的病毒或治疗性化合物如诱导病毒基因表达的化
合物。在另一实例中，监测可检测的病毒表达的基因产物可用于确定是否需要施用病毒或
化合物、施用的病毒或化合物的数量、及施用的病毒或化合物的类型。这些监测方法可用于
确定治疗方法是否是有效的、治疗方法对对象是否是致病性的、所述病毒是否已经积累在
肿瘤或转移中、及所述病毒是否已经积累在正常组织或器官中。基于这些确定，可以推导出
进一步治疗方法的可需性和形式。
[0562] 在一个实例中，确定一种治疗方法是否是有效可用于推导出进一步的治疗方法。任何监测方法均可用于确定如本发明提供的或本领域另外已知的治疗方法是否是有效的。
如果监测方法表示治疗方法是有效的，则可以决定保持目前的治疗进程，这可以包括进一
步施用病毒或化合物，或者可以决定不需要进一步施用。如果监测方法表示治疗方法是无
效的，则所述监测结果可表示是否应停止治疗进程(例如当病毒对所述对象是致病性的时
候)，或者改变治疗进程(例如当病毒积累在肿瘤内而不损害宿主身体，但不激发抗肿瘤免
疫应答的时候)，或者增加施用频率或数量(例如当病毒很少积累或不积累在肿瘤中时)。
如果监测方法表示治疗方法是有效的，则可以决定保持目前的治疗进程，这可以包括进一
步施用病毒或化合物，或者可以决定不需要进一步施用。如果监测方法表示治疗方法是无
效的，则所述监测结果可表示是否应停止治疗进程(例如当病毒对所述对象是致病性的时
候)，或者改变治疗进程(例如当病毒积累在肿瘤内而不损害宿主身体，但不激发抗肿瘤免
疫应答的时候)，或者增加施用频率或数量(例如当病毒很少积累或不积累在肿瘤中时)。
[0563] 在一个实例中，监测可表示病毒对对象是致病性的。在这些情况中，可决定终止施用所述对象以所述病毒、施用所述对象较低水平的所述病毒、给对象施用不同的病毒、或者
给对象施用降低所述病毒致病性的化合物。在一个实例中，可以终止施用确定是致病性的
微生物。在另一个实例中，确定是致病性的病毒的剂量可以在随后的施用中降低，在这种实
例的一种形式中，所述对象可预先用可增加所述致病性病毒在肿瘤内积累的能力的另一种
表达处理，之后再施用所述对象所述致病性病毒。在另一个实例中，对象可以已经施用了对
所述对象是致病性的病毒，施用这种致病性病毒可以伴随施用例如一种抗病毒化合物(例
如西多福韦)、致病性减毒化合物(例如负调节溶解细胞的或引起细胞凋亡的基因产物表
达的化合物)、或者可降低病毒的繁殖、毒性或杀死细胞性质的其他化合物，如本文其他地
方所描述的。在这种实例的另一种变化的形式中，可以监测所述表达的定位，并且基于确定
所述表达积累在肿瘤和/或转移内而不积累在正常组织或器官内，可以终止施用抗病毒化
合物或致病性减毒化合物，并且所述病毒的致病性活性可以激活或增加，但仅限于对肿瘤
和转移。在这种实例的另一种变化的形式中，在终止施用抗病毒化合物或致病性减毒化合
物之后，可以进一步监测所述病毒的存在和/或病毒的致病性，如果确定所述病毒通过例
如波及至正常器官或组织、释放毒素进入脉管系统或者另外对肿瘤或转移之外的区域具有
致病性作用而对宿主造成威胁，则可以再开始施用这种化合物。
给对象施用降低所述病毒致病性的化合物。在一个实例中，可以终止施用确定是致病性的
微生物。在另一个实例中，确定是致病性的病毒的剂量可以在随后的施用中降低，在这种实
例的一种形式中，所述对象可预先用可增加所述致病性病毒在肿瘤内积累的能力的另一种
表达处理，之后再施用所述对象所述致病性病毒。在另一个实例中，对象可以已经施用了对
所述对象是致病性的病毒，施用这种致病性病毒可以伴随施用例如一种抗病毒化合物(例
如西多福韦)、致病性减毒化合物(例如负调节溶解细胞的或引起细胞凋亡的基因产物表
达的化合物)、或者可降低病毒的繁殖、毒性或杀死细胞性质的其他化合物，如本文其他地
方所描述的。在这种实例的另一种变化的形式中，可以监测所述表达的定位，并且基于确定
所述表达积累在肿瘤和/或转移内而不积累在正常组织或器官内，可以终止施用抗病毒化
合物或致病性减毒化合物，并且所述病毒的致病性活性可以激活或增加，但仅限于对肿瘤
和转移。在这种实例的另一种变化的形式中，在终止施用抗病毒化合物或致病性减毒化合
物之后，可以进一步监测所述病毒的存在和/或病毒的致病性，如果确定所述病毒通过例
如波及至正常器官或组织、释放毒素进入脉管系统或者另外对肿瘤或转移之外的区域具有
致病性作用而对宿主造成威胁，则可以再开始施用这种化合物。
[0564] 在另一实例中，监测可以确定微生物是否积累在对象的肿瘤或转移内。基于这种确定，可以决定进一步给对象施用额外的病毒、一种不同的病毒或一种化合物。在另一个实
例中，检测肿瘤内病毒的存在可用于决定施用所述对象一种化合物，其中所述化合物可增
加病毒的致病性、繁殖或免疫原性，或者所述化合物可另外与所述病毒联合起作用以增加
病毒的繁殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质；在这种实例的一种变化的形式中，
所述病毒可例如在没有这种化合物的情况中具有很小的或不具有杀死细胞的能力；在这种
实例的另一种变化的形式中，监测肿瘤或转移中所述病毒的存在可以与监测正常组织或器
官中不存在所述病毒联合，其中如果所述病毒存在于肿瘤或转移内而在正常器官或组织中
一点也不存在，则施用所述化合物；在这种实例的另一种变化的形式中，可以监测肿瘤或转
移内病毒的量，如果所述病毒以足够的水平存在于肿瘤或转移内，则施用所述化合物。
例中，检测肿瘤内病毒的存在可用于决定施用所述对象一种化合物，其中所述化合物可增
加病毒的致病性、繁殖或免疫原性，或者所述化合物可另外与所述病毒联合起作用以增加
病毒的繁殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质；在这种实例的一种变化的形式中，
所述病毒可例如在没有这种化合物的情况中具有很小的或不具有杀死细胞的能力；在这种
实例的另一种变化的形式中，监测肿瘤或转移中所述病毒的存在可以与监测正常组织或器
官中不存在所述病毒联合，其中如果所述病毒存在于肿瘤或转移内而在正常器官或组织中
一点也不存在，则施用所述化合物；在这种实例的另一种变化的形式中，可以监测肿瘤或转
移内病毒的量，如果所述病毒以足够的水平存在于肿瘤或转移内，则施用所述化合物。
[0565] H.实施例
[0566] 如下实施例只是例证本发明，无限制本发明范围之意。
[0567] 实施例1：LIVP克隆分离株的分离
[0568] 将非洲绿猴肾成纤维细胞CV-1细胞(ATCC No.CCL-70；American Type Culture5
Collection(Manassas，VA))铺板于6孔平板中，密度为5×10 个细胞/孔，在添加1％抗生
素-抗真菌溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％胎牛血清(FBS，Mediatech，Inc.，
Herndon，VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，Mediatech，Inc.，Herndon，
VA)中于37℃通5％CO2增湿温箱中生长过夜。当细胞达到90％铺满时，将CV-1细胞用
10倍稀释的痘苗病毒LIVP(痘苗病毒毒株，最初通过在小牛皮肤上适应Lister毒株(ATCC
Catalog No.VR-1549)而产生(俄罗斯莫斯科病毒制备物研究所，Al’tshtein et al.，
(1983)Dokl.Akad.Nauk USSR285：696-699))感染。采用系列稀释液感染以保证分离到充
分分开的噬斑。在感染两天后，挑取相对于平板上其它噬斑呈现出更大噬斑表型的8个充
分分离的噬斑。对这些噬斑在CV-1细胞中进行两次或多次噬斑纯化，分别称作LIVP克隆
分离株1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1。LIVP1.1.1和4.1.1较
其它分离株在CV-1细胞中形成更大噬斑。
Collection(Manassas，VA))铺板于6孔平板中，密度为5×10 个细胞/孔，在添加1％抗生
素-抗真菌溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％胎牛血清(FBS，Mediatech，Inc.，
Herndon，VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，Mediatech，Inc.，Herndon，
VA)中于37℃通5％CO2增湿温箱中生长过夜。当细胞达到90％铺满时，将CV-1细胞用
10倍稀释的痘苗病毒LIVP(痘苗病毒毒株，最初通过在小牛皮肤上适应Lister毒株(ATCC
Catalog No.VR-1549)而产生(俄罗斯莫斯科病毒制备物研究所，Al’tshtein et al.，
(1983)Dokl.Akad.Nauk USSR285：696-699))感染。采用系列稀释液感染以保证分离到充
分分开的噬斑。在感染两天后，挑取相对于平板上其它噬斑呈现出更大噬斑表型的8个充
分分离的噬斑。对这些噬斑在CV-1细胞中进行两次或多次噬斑纯化，分别称作LIVP克隆
分离株1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1。LIVP1.1.1和4.1.1较
其它分离株在CV-1细胞中形成更大噬斑。
[0569] 实施例2：各种正常和癌细胞系的体外感染
[0570] 分析LIVP克隆分离株在各种正常和癌细胞类型中的生长，并与亲代LIVP毒株、两个LIVP衍生毒株GLV-1h68(见美国专利号7,588,767)和GLV-1h74(见美国专利申请公开
号2009-0098529和2009-0053244)及痘苗病毒WR(ATCC Catalog No.VR-1354)的生长进
行对比。GLV-1h68含有在LIVP毒株的基因座中的DNA插入(SEQ ID NO：9)。GLV-1h68在
F14.5L(在LIVP中也称作F3)、胸苷激酶(rK)和血凝素(HA)基因座含有编码可检测标记蛋
白的表达盒。含有受痘苗病毒合成的早期/晚期启动子PSEL((PSEL)Ruc-GFP)控制的Ruc-GFP
cDNA分子(编码Renilla萤光素酶的DNA与编码GFP的DNA的融合体)的表达盒插入到
F14.5L基因座中；含有受痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5k((P7.5k)LacZ)控制的编码β-半
乳糖苷酶的DNA分子及位于相对于痘苗病毒合成的早期/晚期启动子PSEL((PSEL)rTrfR)转
录相反方向的编码大鼠运铁蛋白受体的DNA的表达盒插入到TK基因座中(所得病毒不表
达运铁蛋白受体，因为编码所述蛋白质的DNA分子位于相对于表达盒中启动子的转录相反
方向)；及含有受痘苗病毒晚期启动子P11k((P11k)gusA)控制的编码β-葡糖苷酸酶的DNA
分子的表达盒插入到HA基因座中。GLV-1h74通过删除在F14.5L、J2R和A56R基因座的所有
三个插入体而衍生自GLV-1h68。GLV-1h74含有插入到F14.5L基因座中代替(PSEL)Ruc-GFP
的非编码DNA分子、插入到TK基因座中代替(PSEL)rTrfR和(P7.5k)LacZ的非编码DNA分子
以及插入到HA基因座中代替(P11k)gusA的非编码DNA分子。
号2009-0098529和2009-0053244)及痘苗病毒WR(ATCC Catalog No.VR-1354)的生长进
行对比。GLV-1h68含有在LIVP毒株的基因座中的DNA插入(SEQ ID NO：9)。GLV-1h68在
F14.5L(在LIVP中也称作F3)、胸苷激酶(rK)和血凝素(HA)基因座含有编码可检测标记蛋
白的表达盒。含有受痘苗病毒合成的早期/晚期启动子PSEL((PSEL)Ruc-GFP)控制的Ruc-GFP
cDNA分子(编码Renilla萤光素酶的DNA与编码GFP的DNA的融合体)的表达盒插入到
F14.5L基因座中；含有受痘苗病毒早期/晚期启动子P7.5k((P7.5k)LacZ)控制的编码β-半
乳糖苷酶的DNA分子及位于相对于痘苗病毒合成的早期/晚期启动子PSEL((PSEL)rTrfR)转
录相反方向的编码大鼠运铁蛋白受体的DNA的表达盒插入到TK基因座中(所得病毒不表
达运铁蛋白受体，因为编码所述蛋白质的DNA分子位于相对于表达盒中启动子的转录相反
方向)；及含有受痘苗病毒晚期启动子P11k((P11k)gusA)控制的编码β-葡糖苷酸酶的DNA
分子的表达盒插入到HA基因座中。GLV-1h74通过删除在F14.5L、J2R和A56R基因座的所有
三个插入体而衍生自GLV-1h68。GLV-1h74含有插入到F14.5L基因座中代替(PSEL)Ruc-GFP
的非编码DNA分子、插入到TK基因座中代替(PSEL)rTrfR和(P7.5k)LacZ的非编码DNA分子
以及插入到HA基因座中代替(P11k)gusA的非编码DNA分子。
[0571] 将细胞系用下文所示病毒感染，病毒得率通过在CV-1细胞(ATCC No.CCL-70；美国菌种保藏中心(Manassas，VA))上滴定确定，所述细胞在添加1％抗生素-抗真菌溶液
(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％胎牛血清(FBS，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的
Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)上生长。
(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％胎牛血清(FBS，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的
Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)上生长。
[0572] A.正常细胞系
[0573] 1.MEF小鼠胚胎成纤维细胞
[0574] 将MEF细胞(StemCell Technologies，Vancouver，Canada；Catalog#00321)在添加1％青霉素/链霉素/两性霉素抗生素-抗真菌溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，
VA)、3.5μL/Lβ-巯基乙醇(Sigma#M3148-25ml)和10％胎牛血清(FBS，Mediatech，Inc.，
Herndon，VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，含有4.5g/L葡萄糖和L-谷
氨酰胺，无丙酮酸钠(Cellgro#10-017-CV))上生长。将细胞维持在37℃通5％CO2的增湿
温箱中。
VA)、3.5μL/Lβ-巯基乙醇(Sigma#M3148-25ml)和10％胎牛血清(FBS，Mediatech，Inc.，
Herndon，VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，含有4.5g/L葡萄糖和L-谷
氨酰胺，无丙酮酸钠(Cellgro#10-017-CV))上生长。将细胞维持在37℃通5％CO2的增湿
温箱中。
[0575] 将MEF细胞铺于12孔平板(以1.5x105个细胞/孔的密度铺板)，在含有10％FBS的DMEM培养基中生长以备感染。当达到80-90％铺满率时，用在含有2％FBS的DMEM培养
基中的痘苗病毒WR、LIVP、GLV-1h68、GLV-1h74或者LIVP克隆毒株(1.1.1、2.1.1、3.1.1、
4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时。吸去接种物，将细
胞单层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个孔中加入2mL
细胞培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在感染后(hpi)1、
24、48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循环，最大功率超
声处理三次，每次1分钟，之后进行滴定。所述病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标准方法
滴定。
基中的痘苗病毒WR、LIVP、GLV-1h68、GLV-1h74或者LIVP克隆毒株(1.1.1、2.1.1、3.1.1、
4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时。吸去接种物，将细
胞单层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个孔中加入2mL
细胞培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在感染后(hpi)1、
24、48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循环，最大功率超
声处理三次，每次1分钟，之后进行滴定。所述病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标准方法
滴定。
[0576] 结果如下表7中所示，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，以及标准误差。LIVP7.1.1复制优于所有其它分离株和检测的毒株，WR的复制效率仅
略微较低。GLV-1h68、GLV-1h74和LIVP2.1.1在MEF细胞中不复制。LIVP4.1.1复制优于
亲代LIVP，LIVP1.1.1、3.1.1、5.1.1和8.1.1复制慢于亲代LIVP。
略微较低。GLV-1h68、GLV-1h74和LIVP2.1.1在MEF细胞中不复制。LIVP4.1.1复制优于
亲代LIVP，LIVP1.1.1、3.1.1、5.1.1和8.1.1复制慢于亲代LIVP。
[0577]
[0578] B.癌细胞系
[0579] 1.B16-F10小鼠黑素瘤细胞
[0580] 将小鼠黑 素瘤B16-F10细胞(ATCC No.CRL-6475；American Type CultureCollection(Manassas，VA))置于添加1％抗生素-抗真菌剂溶液(Mediatech，Inc.，
Herndon，VA)和10％胎牛血清(FBS，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中生长。将细胞培养在37℃通5％
CO2的增湿温箱中。
Herndon，VA)和10％胎牛血清(FBS，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中生长。将细胞培养在37℃通5％
CO2的增湿温箱中。
[0581] B16-F10细胞生长于6孔平板中(在添加2％FBS的DMEM培养基中)以备感染。用痘苗病毒WR、LIVP、GLV-1h68、GLV-1h74或者LIVP克隆毒株(1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、
5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时。吸去接种物，将细胞单
层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个孔中加入2mL细胞
培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在感染后(hpi)1、24、
48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循环，最大功率超声
处理三次，每次1分钟，之后进行滴定。所述病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标准方法滴
定。
5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时。吸去接种物，将细胞单
层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个孔中加入2mL细胞
培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在感染后(hpi)1、24、
48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循环，最大功率超声
处理三次，每次1分钟，之后进行滴定。所述病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标准方法滴
定。
[0582] 结果如下表8中所示，其列出了复制效率，以噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差。GLV-1h68的复制在B16-F10细胞中最低。GLV-1h74的复制在所有检测的时间
点均显著优于(P<0.05)GLV-1h68，表明在GLV-1h68中插入的异源基因减慢这个病毒在这
些细胞中的的复制。LIVP分离株2.1.1、3.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1与GLV-1h74的复制
相似或略低。在24和48hpi，LIVP5.1.1的复制显著优于(P<0.01)GLV-1h74。LIVP1.1.1和
亲代病毒LIVP的复制相似，但是在24和48hpi显著优于(P<0.05)LIVP5.1.1。LIVP4.1.1
与亲代病毒LIVP在24hpi的复制相似，但是在48(P＝0.057)和72(P＝0.003)hpi优于
LIVP。痘苗病毒WR的复制优于所有其它检测的病毒。在B16-F10细胞中LIVP分离株的复
制能力的差异表示亲代LIVP病毒群中遗传的多样性。
点均显著优于(P<0.05)GLV-1h68，表明在GLV-1h68中插入的异源基因减慢这个病毒在这
些细胞中的的复制。LIVP分离株2.1.1、3.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1与GLV-1h74的复制
相似或略低。在24和48hpi，LIVP5.1.1的复制显著优于(P<0.01)GLV-1h74。LIVP1.1.1和
亲代病毒LIVP的复制相似，但是在24和48hpi显著优于(P<0.05)LIVP5.1.1。LIVP4.1.1
与亲代病毒LIVP在24hpi的复制相似，但是在48(P＝0.057)和72(P＝0.003)hpi优于
LIVP。痘苗病毒WR的复制优于所有其它检测的病毒。在B16-F10细胞中LIVP分离株的复
制能力的差异表示亲代LIVP病毒群中遗传的多样性。
[0583]
[0584] 2.DU145人前列腺癌细胞
[0585] 将人前列腺癌细胞DU145细胞(ATCC No.HTB-81；American Type CultureCollection(Manassas，VA))在含有1％丙酮酸钠(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％抗生
素-抗真菌剂溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％非必需氨基酸(Mediatech，Inc.，
Herndon，VA)和10％FBS的EMEM(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中生长。将细胞维持在
37℃添加5％CO2的增湿温箱中。
素-抗真菌剂溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％非必需氨基酸(Mediatech，Inc.，
Herndon，VA)和10％FBS的EMEM(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中生长。将细胞维持在
37℃添加5％CO2的增湿温箱中。
[0586] DU145细胞生长于6孔平板中(在添加2％FBS的DMEM培养基中)以备感染，用痘苗病毒WR、LIVP、GLV-1h68、GLV-1h74或者LIVP克隆毒株(1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、
5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时。吸去接种物，将细胞单
层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个孔中加入2mL细胞
培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在感染后(hpi)1、24、
48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循环，最大功率超声处
理三次，每次1分钟，之后进行滴定。一式两份使用标准方法将所述病毒在CV-1细胞中滴
定。
5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时。吸去接种物，将细胞单
层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个孔中加入2mL细胞
培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在感染后(hpi)1、24、
48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循环，最大功率超声处
理三次，每次1分钟，之后进行滴定。一式两份使用标准方法将所述病毒在CV-1细胞中滴
定。
[0587] 结果如下表9中所示，其列出了复制效率，以噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差。GLV-1h68在DU145细胞中复制得相当好。GLV-1h74的复制在所有检测的时间
点均显著优于(P<0.01)GLV-1h68，表明GLV-1h68中的外源插入减慢了这个病毒在DU145细
胞中的复制。野生型痘苗病毒毒株WR与GLV-1h68在DU145细胞中的复制相似。LIVP3.1.1
和GLV-1h74在感染后前24小时的复制相似。GLV-1h74在48和72hpi的病毒产量显著高
于(P<0.01)LIVP3.1.1。LIVP和LIVP分离株1.1.1、2.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1，和
8.1.1复制相似，但是在感染后前24小时显著优于(P<0.01)GLV-1h74。
点均显著优于(P<0.01)GLV-1h68，表明GLV-1h68中的外源插入减慢了这个病毒在DU145细
胞中的复制。野生型痘苗病毒毒株WR与GLV-1h68在DU145细胞中的复制相似。LIVP3.1.1
和GLV-1h74在感染后前24小时的复制相似。GLV-1h74在48和72hpi的病毒产量显著高
于(P<0.01)LIVP3.1.1。LIVP和LIVP分离株1.1.1、2.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1，和
8.1.1复制相似，但是在感染后前24小时显著优于(P<0.01)GLV-1h74。
[0588]
[0589] 3.CT26.WT小鼠结肠癌细胞
[0590] 小鼠CT26.WT结肠癌细胞生长于(ATCC CRL-2638；American Type CultureCollection(Manassas，VA))在含有1％丙酮酸钠(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％链霉
素/两性霉素抗生素/抗真菌溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％HEPES(Mediatech，
Inc.，Herndon，VA)、5.6mL/L45％葡萄糖溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％FBS
的RPMI中。将细胞培养在37℃通5％CO2的增湿温箱中。
素/两性霉素抗生素/抗真菌溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％HEPES(Mediatech，
Inc.，Herndon，VA)、5.6mL/L45％葡萄糖溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％FBS
的RPMI中。将细胞培养在37℃通5％CO2的增湿温箱中。
[0591] 将CT26.WT细胞置于6孔平板(以5x105个细胞/孔密度铺板)，在含有10％FBS的RPMI培养基中生长以备感染，当铺满率在80-90％时，用含有2％FBS的RPMI培养基中的
痘苗病毒WR、LIVP、GLV-1h68、GLV-1h74或者LIVP克隆毒株(1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、
5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时，每20分钟旋动一次。吸
去接种物，将细胞单层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个
孔中加入2mL细胞培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在
感染后(hpi)1、24、48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循
环，最大功率超声处理三次，每次1分钟，之后进行滴定。所述病毒一式两份，在CV-1细胞
中使用标准方法将滴定。
痘苗病毒WR、LIVP、GLV-1h68、GLV-1h74或者LIVP克隆毒株(1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、
5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时，每20分钟旋动一次。吸
去接种物，将细胞单层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个
孔中加入2mL细胞培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在
感染后(hpi)1、24、48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循
环，最大功率超声处理三次，每次1分钟，之后进行滴定。所述病毒一式两份，在CV-1细胞
中使用标准方法将滴定。
[0592] 结果示于下表10，其列出复制效率，以噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差。GLV-1h68的复制在CT26.WT细胞中最低。GLV-1h74在所有检测时间点的复制均
优于GLV-1h68。痘苗病毒WR的复制优于所有其它检测的病毒。LIVP1.1.1、LIVP5.1.1、
LIVP4.1.1和亲代病毒LIVP的复制相似，其复制均优于GLV-1h74。LIVP分离株2.1.1、
6.1.1和7.1.1与GLV-1h74的复制相似或略低。
优于GLV-1h68。痘苗病毒WR的复制优于所有其它检测的病毒。LIVP1.1.1、LIVP5.1.1、
LIVP4.1.1和亲代病毒LIVP的复制相似，其复制均优于GLV-1h74。LIVP分离株2.1.1、
6.1.1和7.1.1与GLV-1h74的复制相似或略低。
[0593]
[0594]
[0595] 4.MC-38小鼠腺癌细胞
[0596] 将小鼠MC-38腺癌细胞(Jochen Stritzker，University of Wuerzburg)生长于含有1％丙酮酸钠(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％链霉素/两性霉素抗生素/抗真菌
剂溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％HEPES(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、5.6mL/L45％葡萄糖溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％FBS的RPMI中。将细胞维持在
37℃通5％CO2的湿化的温箱中。
剂溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、1％HEPES(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)、5.6mL/L45％葡萄糖溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％FBS的RPMI中。将细胞维持在
37℃通5％CO2的湿化的温箱中。
[0597] 将MC-38细胞置于6孔平板(以5x105个细胞/孔密度铺板)中，在含有10％FBS的RPMI培养基中生长以备感染，当铺满率在80-90％时，用在含有2％FBS的RPMI培养基中
痘苗病毒WR、LIVP、GLV-1h68、GLV-1h74或者LIVP克隆毒株(1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、
5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时，每20分钟旋动一次。吸
去接种物，将细胞单层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个
孔中加入2mL细胞培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在
感染后(hpi)1、24、48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循
环，最大功率超声处理三次，每次1分钟，之后进行滴定。所述病毒一式两份，在CV-1细胞
中使用标准方法将滴定。
痘苗病毒WR、LIVP、GLV-1h68、GLV-1h74或者LIVP克隆毒株(1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、
5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1)在37℃以MOI为0.01感染1小时，每20分钟旋动一次。吸
去接种物，将细胞单层用2mL的DPBS(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)洗涤两次，随后在每个
孔中加入2mL细胞培养基。感染当天在CV-1细胞中确认每种病毒接种物的病毒效价。在
感染后(hpi)1、24、48和72小时各收获三个孔的每种病毒。对收获的细胞进行三次冻融循
环，最大功率超声处理三次，每次1分钟，之后进行滴定。所述病毒一式两份，在CV-1细胞
中使用标准方法将滴定。
[0598] 结果示于下表11，其列出复制效率，以噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差。GLV-1h6在MC-38细胞中复制最低。在1、24和48小时时间点，LIVP5.1.1复制
最佳，仅WR的复制在72小时时间点更好。LIVP复制略优于GV-1h74。LIVP分离株2.1.1、
6.1.1和8.1.1与GLV-1h74复制相似或比其略低。
最佳，仅WR的复制在72小时时间点更好。LIVP复制略优于GV-1h74。LIVP分离株2.1.1、
6.1.1和8.1.1与GLV-1h74复制相似或比其略低。
[0599]
[0600]
[0601] 实施例3：编码抗-VEGF单链抗体的病毒的构建
[0602] 1.GLV-1h164
[0603] 在这个实施例中，通过双相互交换(double reciprocal crossover)从GLV-1h100中产生GLV-1h164，GLV-1h164含有包括单链抗-VEGF抗体基因(G6；SEQ ID NO：73)的基
因(GLAF-2)，GLAF-2插入于A56R基因座且受VACV合成的晚期启动子控制。GLV-1h100衍
生自GLV-1h68，通过体内同源重组技术用hNET表达盒置换在J2R基因座的β-半乳糖苷酶
表达盒而产生(见美国专利号7,588,767和U.S.Pat.Pub.No.2009-0117034)。
因(GLAF-2)，GLAF-2插入于A56R基因座且受VACV合成的晚期启动子控制。GLV-1h100衍
生自GLV-1h68，通过体内同源重组技术用hNET表达盒置换在J2R基因座的β-半乳糖苷酶
表达盒而产生(见美国专利号7,588,767和U.S.Pat.Pub.No.2009-0117034)。
[0604]
[0605] 由GeneArt AG(Germany)合成质粒0608997-pGA4，其含有编码单链抗-VEGF抗体GLAF-1的DNA(SEQ ID NO：12和21)，含有Ig kappa轻链序列，G6Fab的VH链序列，(G4S)3
接头序列，G6Fab的VL链序列，及C末端DDDDK序列(SEQ ID NO：18)。使用这个载体作为
模板，使用引物进行PCR以扩增无DDDDK序列(GLAF-2，SEQ ID NO：22)的GLAF-1(SEQ ID
NO：12和21)基因序列，所述引物为P-G6-for-b(5’-gtcgacccaccatggagac-3’，SEQ ID NO：
19)和P-G6-rev-b(5’-ttaattaattatcgcttaatctcaaccttggtccc-3’，SEQ ID NO：20)。为
了构建最终质粒，使用VACV DNA的同源穿梭质粒pHA-PSL-hNET-1(SEQ ID NO：23)，其预先
构建为通过双互反交叉将外源基因同源重组入VACV基因组的A56R基因座中。将GLAF-2
片段通过SalI和PacI位点克隆进构架质粒中，从而用GLAF-2cDNA置换hNet-1cDNA序列，
获得质粒pHA-PSL-GLAF-2。
接头序列，G6Fab的VL链序列，及C末端DDDDK序列(SEQ ID NO：18)。使用这个载体作为
模板，使用引物进行PCR以扩增无DDDDK序列(GLAF-2，SEQ ID NO：22)的GLAF-1(SEQ ID
NO：12和21)基因序列，所述引物为P-G6-for-b(5’-gtcgacccaccatggagac-3’，SEQ ID NO：
19)和P-G6-rev-b(5’-ttaattaattatcgcttaatctcaaccttggtccc-3’，SEQ ID NO：20)。为
了构建最终质粒，使用VACV DNA的同源穿梭质粒pHA-PSL-hNET-1(SEQ ID NO：23)，其预先
构建为通过双互反交叉将外源基因同源重组入VACV基因组的A56R基因座中。将GLAF-2
片段通过SalI和PacI位点克隆进构架质粒中，从而用GLAF-2cDNA置换hNet-1cDNA序列，
获得质粒pHA-PSL-GLAF-2。
[0606] 用非洲绿猴肾成纤维细胞CV-1细胞(American Type Culture Collection(Manassas，VA)；CCL-70)进行病毒产生和生产。该细胞在添加1％抗生素-抗真菌溶液
(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％胎牛血清(FBS；Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的
Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)中在37℃，5％CO2条件下生长。用GLV-1h164
以MOI为0.1感染CV-1细胞1小时。然后以pHA-PSL-GLAF-2转移载体用Fugene(Roche，
Indianapolis，IN)转染感染的细胞及。在感染之后两天，收获感染/转染的细胞，使用如
前述标准方法(Falkner and Moss(1990)J.Virol.64：3108-3111)选择重组病毒并进行噬
斑纯化。
(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和10％胎牛血清(FBS；Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的
Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)中在37℃，5％CO2条件下生长。用GLV-1h164
以MOI为0.1感染CV-1细胞1小时。然后以pHA-PSL-GLAF-2转移载体用Fugene(Roche，
Indianapolis，IN)转染感染的细胞及。在感染之后两天，收获感染/转染的细胞，使用如
前述标准方法(Falkner and Moss(1990)J.Virol.64：3108-3111)选择重组病毒并进行噬
斑纯化。
[0607] 每种病毒以MOI为0.1感染10个T225瓶融合的CV-1细胞(在感染前一天以7
2×10 个细胞/瓶的密度种植)。感染之后两天收获感染的细胞，使用玻璃Dounce匀浆器裂
解。将细胞裂解物以1,800g离心5分钟使之澄清，然后铺在36％蔗糖上成层，以13,000rpm
在HB-6转子Sorvall RC-5B冷冻超速离心机中离心2小时。将病毒沉淀重悬浮于1ml的
1mM Tris，pH9.0中，加样于无菌24％-40％连续蔗糖梯度，在26,000g离心50分钟。收集
病毒带，使用2体积的1mM Tris pH9.0稀释，然后在HB-6转子中以13,000rpm离心60分
钟。将最终的病毒沉淀重悬浮于1ml的1mM Tris，pH9.0中，在CV-1细胞中确定效价(ATCC
No.CCL-70)。
2×10 个细胞/瓶的密度种植)。感染之后两天收获感染的细胞，使用玻璃Dounce匀浆器裂
解。将细胞裂解物以1,800g离心5分钟使之澄清，然后铺在36％蔗糖上成层，以13,000rpm
在HB-6转子Sorvall RC-5B冷冻超速离心机中离心2小时。将病毒沉淀重悬浮于1ml的
1mM Tris，pH9.0中，加样于无菌24％-40％连续蔗糖梯度，在26,000g离心50分钟。收集
病毒带，使用2体积的1mM Tris pH9.0稀释，然后在HB-6转子中以13,000rpm离心60分
钟。将最终的病毒沉淀重悬浮于1ml的1mM Tris，pH9.0中，在CV-1细胞中确定效价(ATCC
No.CCL-70)。
[0608] 2.GLV-1h109
[0609] 在美国专利号8,052,968中描述了GLV-1h109的产生。GLV-1h109衍生自GLV-1h68毒株(SEQ ID NO：9)，通过在A56R基因座中用编码GLAF-1(SEQ ID NO：12和21)
的基因置换LacZ基因(β-半乳糖苷酶)而产生。GLAF-1基因编码抗-VEGF单链抗体G6，
其受VACV合成的晚期(SL)启动子控制。
的基因置换LacZ基因(β-半乳糖苷酶)而产生。GLAF-1基因编码抗-VEGF单链抗体G6，
其受VACV合成的晚期(SL)启动子控制。
[0610] 3.GLV-1h158
[0611] GLV-1h158衍生自GLV-1h68毒株(SEQ ID NO：9)，通过在J2R基因座中用编码GLAF-2(SEQ ID NO：22)的基因置换gusA基因(β-葡糖苷酸酶)而产生。GLAF-2基因编
码抗-VEGFR单链抗体G6，其受VACV合成的早期/晚期(SEL)启动子控制。
码抗-VEGFR单链抗体G6，其受VACV合成的早期/晚期(SEL)启动子控制。
[0612] 4.GLV-1h163
[0613] GLV-1h163衍生自GLV-1h100毒株(在实施例3.1中描述)，通过在A56R基因座中用编码GLAF-2(SEQ ID NO：22)的基因置换gusA基因(β-葡糖苷酸酶)而产生。GLAF-2
基因受VACV合成的早期/晚期(SEL)启动子控制。此外，GLV-1h163携带插入J2R基因座
的受VACV合成的早期(SE)启动子控制的人去甲肾上腺素转运蛋白(NET)。
基因受VACV合成的早期/晚期(SEL)启动子控制。此外，GLV-1h163携带插入J2R基因座
的受VACV合成的早期(SE)启动子控制的人去甲肾上腺素转运蛋白(NET)。
[0614] 实施例4：用LIVP分离株1.1.1进行的体外病毒复制研究
[0615] 在这个实施例中，检测了在一些癌细胞系中LIVP分离株1.1.1的体外病毒复制情况，并与痘苗病毒GLV-1h68(在实施例1和美国专利号7,588,767中描述)和
GLV-1h164(在实施例3描述)的复制情况进行了对比。此外，在经放射预处理后评估每个
病毒，如下文所述。
GLV-1h164(在实施例3描述)的复制情况进行了对比。此外，在经放射预处理后评估每个
病毒，如下文所述。
[0616] 1.B16-F10小鼠黑素瘤细胞
[0617] 小 鼠 黑 素 瘤 B16-F10细 胞 (ATCC No.CRL-6475；American Type CultureCollection(Manassas，VA))生长在DMEM培养基中，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或者
LIVP克隆分离株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24、48或72小时。
LIVP克隆分离株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24、48或72小时。
[0618] 放射处理：在病毒感染前一天将细胞以6Gy/天的剂量放射处理或者不予以放射处理。放射作为single fraction施用，该施用使用RS2000X-线生物辐照器(Rad Source
Technologies Inc.)进行。放射的施用速度是1Gy/分钟。
Technologies Inc.)进行。放射的施用速度是1Gy/分钟。
[0619] 病毒一式两份，使用标准方法在CV-1细胞中进行滴定。结果示于下表13，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差值。列出如表中所示，
LIVP1.1.1在B16-F10细胞中呈现出比GLV-1h68和GLV-1h164显著增强的病毒复制。
LIVP1.1.1在B16-F10细胞中呈现出比GLV-1h68和GLV-1h164显著增强的病毒复制。
[0620]
[0621] 2.A549人肺癌细胞
[0622] 人A549肺癌细胞(ATCC)在F-12K培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或者LIVP克隆分离株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24、48或72小时。将
细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标
准方法进行滴定。
细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标
准方法进行滴定。
[0623] 结果示于下表14，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差值。列出如表中所示，LIVP1.1.1在A549细胞中呈现出比GLV-1h68和
GLV-1h164显著增强的病毒复制。
GLV-1h164显著增强的病毒复制。
[0624]
[0625] 3.MDA-MB-231人乳腺癌细胞
[0626] 人MDA-MB-231乳腺癌细胞(ATCC)在Leibovitz′s L-15培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或者LIVP克隆分离株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24、48
或72小时。将细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1
细胞中使用标准方法进行滴定。。
或72小时。将细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1
细胞中使用标准方法进行滴定。。
[0627] 结果示于下表15，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差值。列出如表中所示，LIVP1.1.1在MDA-MB-231细胞中呈现出比GLV-1h68和
GLV-1h164显著增强的病毒复制。
GLV-1h164显著增强的病毒复制。
[0628]
[0629] 4.MIA PaCa-2人胰腺癌细胞
[0630] 人MIA PaCa-2胰腺癌细胞(ATCC)在DMEM培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或者LIVP克隆分离株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24、48或72小时。将
细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标
准方法进行滴定。
细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标
准方法进行滴定。
[0631] 结果示于下表16，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差值。列出如表中所示，LIVP1.1.1在MIAPaCa-2细胞中呈现出比GLV-1h68和
GLV-1h164显著增强的病毒复制。
GLV-1h164显著增强的病毒复制。
[0632]
[0633] 5.PC-3人前列腺癌细胞
[0634] 人PC-3前列腺癌细胞(ATCC)在F-12K培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或者LIVP克隆分离株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24、48或72小时。将
细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标
准方法进行滴定。
细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标
准方法进行滴定。
[0635] 结果示于下表17，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差值。列出如表中所示，LIVP1.1.1在PC-3细胞中呈现出比GLV-1h68和
GLV-1h164显著增强的病毒复制。
GLV-1h164显著增强的病毒复制。
[0636]
[0637] 6.U-87MG人成胶质细胞瘤-星形细胞瘤细胞
[0638] 人U-87MG成胶质细胞瘤-星形细胞瘤细胞(ATCC)在DMEM中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或者LIVP克隆分离株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24小时。将
细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标
准方法进行滴定。结果示于下表18，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/
mL)表示，及标准误差值。列出如表中所示，LIVP1.1.1在U-87细胞中呈现出比GLV-1h68
和GLV-1h164显著增强的病毒复制。
细胞如上述用6Gyγ射线放射或者不予以放射处理。病毒一式两份，在CV-1细胞中使用标
准方法进行滴定。结果示于下表18，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/
mL)表示，及标准误差值。列出如表中所示，LIVP1.1.1在U-87细胞中呈现出比GLV-1h68
和GLV-1h164显著增强的病毒复制。
[0639]
[0640] 实施例5：用LIVP分离株5.1.1进行的体外病毒复制研究
[0641] 在这个实施例中，检测在A549人肺癌细胞和4T1鼠乳腺癌细胞中LIVP分离株5.1.1的体外病毒复制情况，并与痘苗病毒GLV-1h68(在实施例1和美国专利号7,588,767
中描述)的复制情况相对比。在上清和细胞裂解物中评估病毒生长情况。
中描述)的复制情况相对比。在上清和细胞裂解物中评估病毒生长情况。
[0642] 1.A549人肺癌细胞
[0643] 人A549肺癌细胞(ATCC)在F-12K培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68或者LIVP克隆分离株5.1.1以MOI为0.1在37℃感染。在感染后1、6、12、24、48、72和96小时收集
病毒上清和细胞裂解物，将其一式三份，在CV-1细胞中使用标准方法滴定。
病毒上清和细胞裂解物，将其一式三份，在CV-1细胞中使用标准方法滴定。
[0644] 结果示于下表19，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差值。列出数据显示LIVP5.1.1在A549细胞中比GLV-1h68更有效地复制。
[0645]
[0646] 2.4T1鼠乳腺癌细胞
[0647] 将小鼠4T1乳腺癌细胞(ATCC)在24孔平板中在RPMI-1640培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68或者LIVP克隆分离株5.1.1以MOI为0.01在37℃感染。在感染后1、6、
12、24、48、72和96小时收集病毒上清和细胞裂解物，将其一式三份，在CV-1细胞中使用标
准方法滴定。
12、24、48、72和96小时收集病毒上清和细胞裂解物，将其一式三份，在CV-1细胞中使用标
准方法滴定。
[0648] 结果示于下表20，其列出了复制效率，以平均噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)表示，及标准误差值。列出数据显示LIVP5.1.1在4T1细胞中比GLV-1h68更有效地复制。
[0649]
[0650]
[0651] 实施例6：LIVP克隆毒株的体外细胞毒性
[0652] 在这个实施例中，使用XTT细胞增殖实验，在各种癌细胞系中体外测量LIVP分离株1.1.1和5.1.1的病毒细胞毒性。使用或不使用预先放射处理测量毒性。
[0653] A.LIVP克隆分离株1.1.1的体外细胞毒性
[0654] 1.B16-F10小鼠黑素瘤细胞
[0655] 小 鼠 黑 素 瘤 B16-F10细 胞 (ATCC No.CRL-6475；American Type CultureCollection(Manassas，VA))在DMEM培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或
LIVP克隆毒株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24小时。
LIVP克隆毒株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24小时。
[0656] 放射处理(XRT)：在病毒感染前一天将细胞用6Gy剂量放射并与未接受放射的细胞对比。放射作为single fraction施用，该施用使用RS2000X-线生物辐照器(Rad Source
Technologies Inc.)进行。放射的施用速度是1Gy/分钟。
Technologies Inc.)进行。放射的施用速度是1Gy/分钟。
[0657] 细胞毒性在感染后1、3、5和7天用细胞增殖试剂盒II(XTT)(Roche)测量。在病毒感染后的每个时间点，在每个孔中加入50μL XTT标记的混合物，在37℃及6.5％CO2条
件下孵育4小时。使用微平板(ELISA)读取器(reader)测量样品的分光光度吸光率。根
据使用的ELISA读取器的可用滤波器，测量甲瓒产物吸光率的波长在450-500nm之间。参
照波长大于650nm。
件下孵育4小时。使用微平板(ELISA)读取器(reader)测量样品的分光光度吸光率。根
据使用的ELISA读取器的可用滤波器，测量甲瓒产物吸光率的波长在450-500nm之间。参
照波长大于650nm。
[0658] 结果示于下表21。细胞毒性效率以细胞存活率表示(无细胞死亡＝1)，根据未处理标准化。列出如表中所示，在感染后3-5天，与GLV-1h68和GLV-1h164相比，LIVP1.1.1
诱导对B16-F10小鼠黑素瘤细胞的略高的细胞毒性。放射处理不增强LIVP1.1.1在B16-F10
细胞中的细胞毒性。
诱导对B16-F10小鼠黑素瘤细胞的略高的细胞毒性。放射处理不增强LIVP1.1.1在B16-F10
细胞中的细胞毒性。
[0659]
[0660]
[0661] 2.A549人肺癌细胞
[0662] 人A549肺癌细胞(ATCC)在F-12K培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或LIVP克隆毒株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24小时。将细胞如上述用
6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用细胞增殖试剂
盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用细胞增殖试剂
盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
[0663] 结果示于下表22。细胞毒性效率以细胞存活率表示(无细胞死亡＝1)，根据未处理标准化。列出如表中所示，LIVP1.1.1与用GLV-1h68和GLV-1h164处理相比诱导对A549
肺癌细胞显著更高的细胞毒性。放射处理不增强LIVP1.1.1在A549细胞中的细胞毒性。
肺癌细胞显著更高的细胞毒性。放射处理不增强LIVP1.1.1在A549细胞中的细胞毒性。
[0664]
[0665] 3.MDA-MB-231人乳腺癌细胞
[0666] 人MDA-MB-231乳腺癌细胞(ATCC)在Leibovitz′s L-15培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或LIVP克隆毒株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24小时。将
细胞如上述用6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用
细胞增殖试剂盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
细胞如上述用6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用
细胞增殖试剂盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
[0667] 结果示于下表23。细胞毒性效率以细胞存活率表示(无细胞死亡＝1)，根据未处理标准化。列出如表中所示，LIVP1.1.1与用GLV-1h68和GLV-1h164处理相比诱导对
MDA-MB-231乳腺癌细胞显著更高的细胞毒性。放射处理不增强LIVP1.1.1在MDA-MB-231
细胞中的细胞毒性，但是增强GLV-1h164毒株的细胞毒性。
MDA-MB-231乳腺癌细胞显著更高的细胞毒性。放射处理不增强LIVP1.1.1在MDA-MB-231
细胞中的细胞毒性，但是增强GLV-1h164毒株的细胞毒性。
[0668]
[0669] 4.MIA PaCa-2人胰腺癌细胞s
[0670] 人MIA PaCa-2胰腺癌细胞(ATCC)在DMEM培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或LIVP克隆毒株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24小时。将细胞如上述用
6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用细胞增殖试剂
盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用细胞增殖试剂
盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
[0671] 结果示于下表24。细胞毒性效率以细胞存活率表示(无细胞死亡＝1)，根据未处理标准化。列出如表中所示，LIVP1.1.1与用GLV-1h68和GLV-1h164处理相比诱导对MIA
PaCa-2胰腺癌细胞显著更高的细胞毒性。放射处理略增强LIVP1.1.1在MiaPaCa-2细胞中
的细胞毒性。
PaCa-2胰腺癌细胞显著更高的细胞毒性。放射处理略增强LIVP1.1.1在MiaPaCa-2细胞中
的细胞毒性。
[0672]
[0673]
[0674] 5.PC-3人前列腺癌细胞
[0675] 人PC-3前列腺癌细胞(ATCC)在F-12K培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或LIVP克隆毒株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24小时。将细胞如上述用
6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用细胞增殖试剂
盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用细胞增殖试剂
盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
[0676] 结果示于下表25。细胞毒性效率以细胞存活率表示(无细胞死亡＝1)，根据未处理标准化。列出如表中所示，LIVP1.1.1与用GLV-1h68和GLV-1h164处理相比诱导对PC-3
前列腺癌细胞更高的细胞毒性。放射处理略增强LIVP1.1.1在PC-3细胞中的细胞毒性。
前列腺癌细胞更高的细胞毒性。放射处理略增强LIVP1.1.1在PC-3细胞中的细胞毒性。
[0677]
[0678] 6.U-87MG人成胶质细胞瘤-星形细胞瘤细胞
[0679] 人U-87MG成胶质细胞瘤-星形细胞瘤细胞(ATCC)在培养基中生长，用痘苗病毒GLV-1h68、GLV-1h164或LIVP克隆毒株1.1.1以MOI为0.01在37℃感染24小时。将细胞
如上述用6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用细胞
增殖试剂盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
如上述用6Gy的γ射线放射或者不予以放射处理。如上述，在感染后1、3、5和7天用细胞
增殖试剂盒II(XTT)Roche测量细胞毒性。
[0680] 结果示于下表26。细胞毒性效率以细胞存活率表示(无细胞死亡＝1)，根据未处理标准化。列出如表中所示，LIVP1.1.1与用GLV-1h68和GLV-1h164处理相比诱导对
U-87MG成胶质细胞瘤-星形细胞瘤细胞显著更高的细胞毒性。放射处理不增强LIVP1.1.1
在U-87MG细胞中的细胞毒性，但是略增强GLV-1h164毒株的细胞毒性。
U-87MG成胶质细胞瘤-星形细胞瘤细胞显著更高的细胞毒性。放射处理不增强LIVP1.1.1
在U-87MG细胞中的细胞毒性，但是略增强GLV-1h164毒株的细胞毒性。
[0681]
[0682] B.LIVP克隆毒株5.1.1的体外细胞毒性
[0683] 1.A549人肺癌细胞
[0684] 人A549肺癌细胞(ATCC)在24孔平板中一式四份在F-12K培养基中生长，并用痘苗病毒GLV-1h68、LIVP分离株5.1.1、PBS、GLV-1h68+5μMST-246、LIVP5.1.1+5μM ST-246
或者PBS+5μM ST-246在MOI为0.1在37℃感染24小时。如上述在感染后24、48和72小
时用细胞增殖试剂盒II(XTT)，Roche测量细胞毒性。
或者PBS+5μM ST-246在MOI为0.1在37℃感染24小时。如上述在感染后24、48和72小
时用细胞增殖试剂盒II(XTT)，Roche测量细胞毒性。
[0685] 结果示于下表27，其以平均细胞存活率和标准误差表示。LIVP5.1.1病毒感染与GLV-1h68相比在细胞培养中导致更有效的A549细胞根除。加入5μM ST-246降低
LIVP5.1.1和GLV-1h68对A549细胞的杀伤。
LIVP5.1.1和GLV-1h68对A549细胞的杀伤。
[0686]
[0687] 实施例7：LIVP克隆分离株对存活和体内肿瘤生长的作用
[0688] A.病毒对DU145人前列腺癌异种移植物的作用
[0689] 使用人前列腺癌的小鼠模型评估LIVP克隆分离株1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1的体内作用。为了评估所述病毒的安全性和抗肿瘤效力，为
nu
雄性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，Ind.；4-5周龄)皮下注射
7
(在右后肢s.c.注射于100μL PBS中的1.0×10 个细胞)DU145细胞(ATCC No.HTB-81；
American Type Culture Collection(Manassas，VA))以建立肿瘤。在植入肿瘤细胞之后
5
13天，通过眼窝后(retro orbital)注射，给这些小鼠施用7.0×10pfu LIVP克隆毒株
1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1或8.1.1、GLV-1h68、GLV-1h74或者野生型LIVP(于100μL的PBS中)，或者仅施用PBS。在癌细胞注射后13、20、27、34、41、48、55、62
3
和69天测量肿瘤体积(mm)。
nu
雄性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，Ind.；4-5周龄)皮下注射
7
(在右后肢s.c.注射于100μL PBS中的1.0×10 个细胞)DU145细胞(ATCC No.HTB-81；
American Type Culture Collection(Manassas，VA))以建立肿瘤。在植入肿瘤细胞之后
5
13天，通过眼窝后(retro orbital)注射，给这些小鼠施用7.0×10pfu LIVP克隆毒株
1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1或8.1.1、GLV-1h68、GLV-1h74或者野生型LIVP(于100μL的PBS中)，或者仅施用PBS。在癌细胞注射后13、20、27、34、41、48、55、62
3
和69天测量肿瘤体积(mm)。
[0690] 使用如下公式计算每个病毒的治疗指数：AUC未处理-AUC病毒/AUC未处理×100。使用计算肿瘤体积的变化中值(y轴)与时间(x轴)的曲线图检测的每组的曲线下面积(AUC)。使用梯形积分法计算每组绘制的AUC数据图。简而言之，对于每个时间间隔(7天)，使用公
式[(在时间间隔的最后一天肿瘤体积的变化中值)+(在时间间隔第一天肿瘤体积的变化
中值)/2×(间隔的时间)(7天)]计算该时间间隔的AUC。通过每个时间间隔(直至肿瘤
植入后55天)的AUC相加并乘以7(第一次间隔)计算每条绘制曲线的总AUC。
式[(在时间间隔的最后一天肿瘤体积的变化中值)+(在时间间隔第一天肿瘤体积的变化
中值)/2×(间隔的时间)(7天)]计算该时间间隔的AUC。通过每个时间间隔(直至肿瘤
植入后55天)的AUC相加并乘以7(第一次间隔)计算每条绘制曲线的总AUC。
[0691] 为了测量病毒的毒性，监测在实验过程中小鼠的净体重和存活率。净体重(克)是从动物总重量中减去肿瘤的重量(肿瘤体积/1000)而计算的。所得重量表示动物不包
括肿瘤的重量。
括肿瘤的重量。
[0692] 结果如下表28-31中所列出。表28列出肿瘤体积中值。表29列出每个病毒的所得AUC和治疗指数。表30列出小鼠的净体重。表31列出小鼠的存活百分比。LIVP1.1.1、
5.1.1、6.1.1和GLV-1h68是最低毒性的，所有小鼠在肿瘤细胞植入后57天均存活并保持体
重。所有检测的病毒均导致肿瘤细胞生长降低。所有LIVP克隆分离株均具有高于GLV-1h68
的治疗指数。LIVP克隆分离株1.1.1、5.1.1和6.1.1表现出良好的肿瘤缩小而无任何细胞
毒性副作用。
5.1.1、6.1.1和GLV-1h68是最低毒性的，所有小鼠在肿瘤细胞植入后57天均存活并保持体
重。所有检测的病毒均导致肿瘤细胞生长降低。所有LIVP克隆分离株均具有高于GLV-1h68
的治疗指数。LIVP克隆分离株1.1.1、5.1.1和6.1.1表现出良好的肿瘤缩小而无任何细胞
毒性副作用。
[0693]
[0694]
[0695]
[0696]
[0697]
[0698]
[0699] B.病毒对DU145人前列腺癌异种移植物的作用-剂量研究
[0700] 使用人前列腺癌的小鼠模型评估增加剂量的LIVP1.1.1、5.1.1和6.1.1的体内作用。为了评估不同剂量的病毒的安全性和抗肿瘤效力，为雄性裸鼠(Hsd：Athymic
Nude-Foxnlnu；Harlan，Indianapolis，Ind.；4-5周龄；n＝8只/组)皮下注射(在右后
肢s.c.注射于100μL PBS中6.0×106个细胞)DU145细胞(ATCC no.HTB-81；American
Type Culture Collection(Manassas，VA))以建立肿瘤。在肿瘤细胞植入后13天，通过
眼窝后(retro orbital)注射，给小鼠施用LIVP分离株1.1.1(7.0×105pfu，2.0×106pfu
或1×107pfu)、5.1.1(7.0×105pfu，2.0×106pfu或1×107pfu)或者6.1.1(7.0×105pfu，
2.0×106pfu或1×107pfu)、GLV-1h68(7.0×105pfu，2.0×106pfu或1×107pfu)(于100μL
的PBS中)或者仅施用PBS。在癌细胞注射后13、20、27、34、41、48、55、62和69天测量肿瘤
体积(mm3)。如上文实施例7A所述计算AUC、治疗指数和存活率。
Nude-Foxnlnu；Harlan，Indianapolis，Ind.；4-5周龄；n＝8只/组)皮下注射(在右后
肢s.c.注射于100μL PBS中6.0×106个细胞)DU145细胞(ATCC no.HTB-81；American
Type Culture Collection(Manassas，VA))以建立肿瘤。在肿瘤细胞植入后13天，通过
眼窝后(retro orbital)注射，给小鼠施用LIVP分离株1.1.1(7.0×105pfu，2.0×106pfu
或1×107pfu)、5.1.1(7.0×105pfu，2.0×106pfu或1×107pfu)或者6.1.1(7.0×105pfu，
2.0×106pfu或1×107pfu)、GLV-1h68(7.0×105pfu，2.0×106pfu或1×107pfu)(于100μL
的PBS中)或者仅施用PBS。在癌细胞注射后13、20、27、34、41、48、55、62和69天测量肿瘤
体积(mm3)。如上文实施例7A所述计算AUC、治疗指数和存活率。
[0701] 结果如下表32-35中所示。表32列出肿瘤体积中值。表33列出每个病毒的所得AUC和治疗指数。表34列出小鼠的净体重。表35列出小鼠存活百分比。在用所有剂量的
LIVP分离株1.1.1、5.1.1和6.1.1及GLV-1h68处理后，观测到DU145肿瘤生长降低。对于
所有检测的病毒，施用2.0×106pfu获得最高的治疗指数。GLV-1h68的毒性最高，LIVP5.1.1
的毒性最低，LIVP分离株1.1.1和6.1.1的毒性相似。
LIVP分离株1.1.1、5.1.1和6.1.1及GLV-1h68处理后，观测到DU145肿瘤生长降低。对于
所有检测的病毒，施用2.0×106pfu获得最高的治疗指数。GLV-1h68的毒性最高，LIVP5.1.1
的毒性最低，LIVP分离株1.1.1和6.1.1的毒性相似。
[0702]
[0703]
[0704]
[0705]
[0706]
[0707]
[0708] C.LIVP1.1.1对OE19人食管癌异种移植物的作用
[0709] 使用人食管癌的小鼠模型评估LIVP1.1.1的体内作用。为了评估该病毒的安全性nu
和抗肿瘤效力，为雄性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，Ind.；4-5
6
周龄；n＝5只/组)皮下注射(在右后肢s.c.注射于100μLPBS中的2.0×10 个细胞)
3
OE19细胞(SigmaAldrich)以建立肿瘤。在植入肿瘤细胞后13天(肿瘤大小>300mm)，通
6
过眼窝后注射，给小鼠(n＝5只/组)施用2.0×10pfu的LIVP分离株1.1.1、GLV-1h68
或GLV-1h164(于100μL的PBS中)或者仅施用PBS。在癌细胞注射后13、20、27、34、41、
3
48、55和62天测量肿瘤体积(mm)。
和抗肿瘤效力，为雄性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，Ind.；4-5
6
周龄；n＝5只/组)皮下注射(在右后肢s.c.注射于100μLPBS中的2.0×10 个细胞)
3
OE19细胞(SigmaAldrich)以建立肿瘤。在植入肿瘤细胞后13天(肿瘤大小>300mm)，通
6
过眼窝后注射，给小鼠(n＝5只/组)施用2.0×10pfu的LIVP分离株1.1.1、GLV-1h68
或GLV-1h164(于100μL的PBS中)或者仅施用PBS。在癌细胞注射后13、20、27、34、41、
3
48、55和62天测量肿瘤体积(mm)。
[0710] 为了测量病毒的毒性，监测在实验过程中小鼠的净体重和存活率。净体重(克)是从动物总重中减去肿瘤的重量(肿瘤体积/1000)计算的。所得重量表示动物的不包括
肿瘤的重量。
肿瘤的重量。
[0711] 结果如下表36-38中所示。表36列出肿瘤体积中值。表37列出小鼠的净体重。表38列出小鼠存活百分比。LIVP分离株1.1.1对于降低OE19肿瘤细胞生长最有效。未
处理的小鼠和接受GLV-1h68处理的小鼠由于肿瘤大小和/或健康因素在第35天处死。用
GLV-1h64和LIVP分离株1.1.1处理降低肿瘤大小及总体健康情况，存活率增加。
处理的小鼠和接受GLV-1h68处理的小鼠由于肿瘤大小和/或健康因素在第35天处死。用
GLV-1h64和LIVP分离株1.1.1处理降低肿瘤大小及总体健康情况，存活率增加。
[0712]
[0713]
[0714]
[0715]
[0716] -＝小鼠由于肿瘤大小和/或健康因素被处死。
[0717] D.LIVP1.1.1对U-87MG人成胶质细胞瘤异种移植物的作用
[0718] 使用人神经胶质瘤的小鼠模型评估LIVP1.1.1的体内作用。为了评估该病毒的nu
安全性和抗肿瘤效力，为雄性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，
6
Ind.；4-5周龄)皮下注射(在右后肢s.c.注射于100μLPBS中的5.0×10 个细胞)
U-87MG成胶质细胞瘤-星形细胞瘤细胞(ATCC)以建立肿瘤。在植入肿瘤后14天(肿瘤大
3 6
小>200mm)，通过眼窝后注射施用小鼠(n＝8/组)2.0×10pfu的LIVP分离株1.1.1或者
GLV-1h68(在100μL的PBS中)或者仅施用PBS。在注射癌细胞后-1、2、6、9、13、16、20、
3
23、27、30、34、37、41、44、48、51和55天测量肿瘤体积(mm)。
安全性和抗肿瘤效力，为雄性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，
6
Ind.；4-5周龄)皮下注射(在右后肢s.c.注射于100μLPBS中的5.0×10 个细胞)
U-87MG成胶质细胞瘤-星形细胞瘤细胞(ATCC)以建立肿瘤。在植入肿瘤后14天(肿瘤大
3 6
小>200mm)，通过眼窝后注射施用小鼠(n＝8/组)2.0×10pfu的LIVP分离株1.1.1或者
GLV-1h68(在100μL的PBS中)或者仅施用PBS。在注射癌细胞后-1、2、6、9、13、16、20、
3
23、27、30、34、37、41、44、48、51和55天测量肿瘤体积(mm)。
[0719] 为了测量病毒的毒性，监测在实验过程中小鼠的净体重和存活率。净体重(克)是从动物总重中减去肿瘤的重量(肿瘤体积/1000)计算的。所得重量表示动物的不包括
肿瘤的重量。
肿瘤的重量。
[0720] 肿瘤体积中值的结果如下表39中提供。肿瘤体积以肿瘤体积分数(fractionaltumor volume)(V/Vo)表示，在表40中列出。净体重在表41中列出。所有动物的净体重保
持稳定。LIVP分离株1.1.1在抑制肿瘤生长中比GLV-1h68更有效，后者比对照略好。
持稳定。LIVP分离株1.1.1在抑制肿瘤生长中比GLV-1h68更有效，后者比对照略好。
[0721]
[0722]
[0723]
[0724]
[0725] E.LIVP1.1.1组合预放射和/或后放射对U87人成胶质细胞瘤异种移植物的作用
[0726] 使用人神经胶质瘤的小鼠模型评估LIVP1.1.1的体内作用。实验详情如下表42中所示。通过为雄性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnlnu；Harlan，Indianapolis，Ind.；4-5周
龄)皮下注射(在右后肢s.c.注射于100μLPBS中的5.0×106个细胞)U-87MG成胶质细
胞瘤-星形细胞瘤细胞(ATCC)，在裸鼠中建立肿瘤。在植入肿瘤细胞后13天，给一些组的
小鼠施用6Gy或3.5Gy放射处理或者不予以放射处理。在肿瘤细胞植入后14天(肿瘤大小
>200mm3)，通过眼窝后注射给小鼠施用2.0×106pfu的LIVP分离株1.1.1或GLV-1h68(于
100μL的PBS中)或仅施用PBS。在病毒注射后一天，给一些组小鼠施用6Gy或3.5Gy放
射处理或不予以处理。在癌细胞注射后-1、3、6、9、13、16、20、23、27、30、34、37、41和44天
3
测量肿瘤体积(mm)。通过测量感染后第3和7天的病毒效价(pfu)评估LIVP1.1.1在健
康器官中的病毒分布情况。
龄)皮下注射(在右后肢s.c.注射于100μLPBS中的5.0×106个细胞)U-87MG成胶质细
胞瘤-星形细胞瘤细胞(ATCC)，在裸鼠中建立肿瘤。在植入肿瘤细胞后13天，给一些组的
小鼠施用6Gy或3.5Gy放射处理或者不予以放射处理。在肿瘤细胞植入后14天(肿瘤大小
>200mm3)，通过眼窝后注射给小鼠施用2.0×106pfu的LIVP分离株1.1.1或GLV-1h68(于
100μL的PBS中)或仅施用PBS。在病毒注射后一天，给一些组小鼠施用6Gy或3.5Gy放
射处理或不予以处理。在癌细胞注射后-1、3、6、9、13、16、20、23、27、30、34、37、41和44天
3
测量肿瘤体积(mm)。通过测量感染后第3和7天的病毒效价(pfu)评估LIVP1.1.1在健
康器官中的病毒分布情况。
[0727]
[0728] 数据如下表43-50中所示。表43和44列出LIVP1.1.1和GLV-1h68的肿瘤体积中值和肿瘤生长，通过肿瘤体积分数(V/Vo)表示。表45和46列出LIVP1.1.1和6Gy放射的
肿瘤体积中值和肿瘤生长，以肿瘤体积分数(V/Vo)表示。表47和48列出针对LIVP1.1.1
和3.5Gy放射的肿瘤体积中值和肿瘤生长，以肿瘤体积分数(V/Vo)表示。净体重在表49
中列出。表50列出LIVP1.1.1在健康组织中的病毒分布。
肿瘤体积中值和肿瘤生长，以肿瘤体积分数(V/Vo)表示。表47和48列出针对LIVP1.1.1
和3.5Gy放射的肿瘤体积中值和肿瘤生长，以肿瘤体积分数(V/Vo)表示。净体重在表49
中列出。表50列出LIVP1.1.1在健康组织中的病毒分布。
[0729] LIVP分离株1.1.1和GLV-1h68在注射后20天开始降低肿瘤生长。用6Gy放射处理导致肿瘤生长略延缓。在施用LIVP1.1.1之前或者之后用6Gy放射处理导致肿瘤生长略
降低。用2剂的3.5Gy放射处理延缓3天肿瘤生长，但是不抑制生长。在施用LIVP1.1.1
之前1天或之后1天用3.5放射处理导致肿瘤生长显著降低。所有动物的净体重均保持稳
定。
降低。用2剂的3.5Gy放射处理延缓3天肿瘤生长，但是不抑制生长。在施用LIVP1.1.1
之前1天或之后1天用3.5放射处理导致肿瘤生长显著降低。所有动物的净体重均保持稳
定。
[0730]
[0731]
[0732]
[0733]
[0734]
[0735]
[0736]
[0737]
[0738]
[0739]
[0740] F.LIVP1.1.1组合预放射对小鼠黑素瘤同种移植物的作用
[0741] 使用黑素瘤异种移植物小鼠模型评估LIVP1.1.1的体内作用。实验详情如下表51中所示。在C57BL/6小鼠中通过为雌性小鼠(Harlan)皮下注射(在右后肢s.c.注射
5
于100μL PBS中的2.0×10 个细胞)B16-F10小鼠黑素瘤细胞(ATCC)以建立肿瘤。在植
入肿瘤细胞后13天，一些组的小鼠接受6Gy或4Gy放射或者不接受放射。在植入肿瘤细
3 7
胞后14天(肿瘤大小>200mm)，通过眼窝后注射，给小鼠施用5.0×10pfu的LIVP分离株
1.1.1或GLV-1h68(于100μL的PBS中)或者仅施用PBS。一些组的小鼠在注射病毒之后
1、6和8天接受另外的4Gy剂量放射或者不接受放射处理。在癌细胞注射后-1、2、6、8、13、
3
16和20天测量肿瘤体积(mm)。
5
于100μL PBS中的2.0×10 个细胞)B16-F10小鼠黑素瘤细胞(ATCC)以建立肿瘤。在植
入肿瘤细胞后13天，一些组的小鼠接受6Gy或4Gy放射或者不接受放射。在植入肿瘤细
3 7
胞后14天(肿瘤大小>200mm)，通过眼窝后注射，给小鼠施用5.0×10pfu的LIVP分离株
1.1.1或GLV-1h68(于100μL的PBS中)或者仅施用PBS。一些组的小鼠在注射病毒之后
1、6和8天接受另外的4Gy剂量放射或者不接受放射处理。在癌细胞注射后-1、2、6、8、13、
3
16和20天测量肿瘤体积(mm)。
[0742]
[0743] 在表52中提供了肿瘤平均体积结果。肿瘤体积分数(V/Vo)在表53中列出。表54列出肿瘤达到肿瘤体积分数50(FTV＝50)的平均时间。FTV＝50相应于肿瘤体积
在3750mm3-5000mm3之间，是在此小鼠必须从实验中除去的终点。用LIVP1.1.1处理导致
B16-F10肿瘤细胞中肿瘤体积略微缩小。用6Gy放射和LIVP1.1.1处理与仅用6Gy放射处理
的结果相似，导致达到肿瘤体积分数50的时间延缓大约7天。用4剂4Gy放射和LIVP1.1.1
处理降低肿瘤体积及使达到FTV＝50的平均时间延缓至14天。
在3750mm3-5000mm3之间，是在此小鼠必须从实验中除去的终点。用LIVP1.1.1处理导致
B16-F10肿瘤细胞中肿瘤体积略微缩小。用6Gy放射和LIVP1.1.1处理与仅用6Gy放射处理
的结果相似，导致达到肿瘤体积分数50的时间延缓大约7天。用4剂4Gy放射和LIVP1.1.1
处理降低肿瘤体积及使达到FTV＝50的平均时间延缓至14天。
[0744]
[0745]
[0746]
[0747] G.LIVP5.1.1对A549人肺癌异种移植物的作用
[0748] 使用人肺癌的小鼠模型进一步评估LIVP5.1.1的体内作用。通过将A549细胞6
(ATCC)皮下注射(在右后肢s.c.注射于100μLPBS中的5.0×10 个细胞)进雌性裸
nu
鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，Ind.；6-8周龄)中以在裸鼠中
3
建立肿瘤。在植入肿瘤细胞后17天(肿瘤大小>250mm)，通过眼窝后注射给小鼠施用
6
5.0×10pfu的LIVP5.1.1、GLV-1h68(于100μL的PBS中)、LIVP1.1.1+2.5μM ST-246、
3
GLV-1h68+2.5μM ST-246或者仅施用PBS。在癌细胞注射后每周测量两次肿瘤体积(mm)。
在植入后42天处死小鼠，使用标准技术确定在肿瘤和器官中的病毒效价。
(ATCC)皮下注射(在右后肢s.c.注射于100μLPBS中的5.0×10 个细胞)进雌性裸
nu
鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，Ind.；6-8周龄)中以在裸鼠中
3
建立肿瘤。在植入肿瘤细胞后17天(肿瘤大小>250mm)，通过眼窝后注射给小鼠施用
6
5.0×10pfu的LIVP5.1.1、GLV-1h68(于100μL的PBS中)、LIVP1.1.1+2.5μM ST-246、
3
GLV-1h68+2.5μM ST-246或者仅施用PBS。在癌细胞注射后每周测量两次肿瘤体积(mm)。
在植入后42天处死小鼠，使用标准技术确定在肿瘤和器官中的病毒效价。
[0749] 在表55中提供了肿瘤体积中值的结果。平均体重在表56中列出。肿瘤和器官中的病毒效价在表57中列出，其列出了在肿瘤、肝、脾、肾、心脏、肺、血清和脑中的病毒效价，以pfu/g组织的单位表示。所有经病毒治疗的小鼠与PBS对照组相比均显示显著的肿瘤
缩小。LIVP5.1.1注射的动物的肿瘤衰退与GLV-1h68相比略微增加。除了LIVP5.1.1或
GLV-1h68之外，加入2.5μM抗病毒剂ST-246，使每种病毒缩小肿瘤大小的能力降低，但是
肿瘤缩小高于仅用PBS处理组。GLV-1h68对于小鼠具有略微毒性，通过平均体重降低证明。
加入ST-246降低了用GLV-1h68处理的小鼠中的毒性。主要在肿瘤组织中鉴别到GLV-1h68
和LIVP分离株5.1.1，脑和肝中也含有病毒颗粒。
缩小。LIVP5.1.1注射的动物的肿瘤衰退与GLV-1h68相比略微增加。除了LIVP5.1.1或
GLV-1h68之外，加入2.5μM抗病毒剂ST-246，使每种病毒缩小肿瘤大小的能力降低，但是
肿瘤缩小高于仅用PBS处理组。GLV-1h68对于小鼠具有略微毒性，通过平均体重降低证明。
加入ST-246降低了用GLV-1h68处理的小鼠中的毒性。主要在肿瘤组织中鉴别到GLV-1h68
和LIVP分离株5.1.1，脑和肝中也含有病毒颗粒。
[0750]
[0751]
[0752]
[0753]
[0754] 实施例8：LIVP5.1.1和GLV-1H68在A549细胞和肿瘤中成像
[0755] A.在A549肺癌细胞中的噬斑形态学
[0756] 通过用抗痘苗病毒(vaccinia)的抗体及Hoechst染色确定在A549肺癌细胞中的噬斑形态学。人A549肺癌细胞在含有10％FCS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培
养基中培养。A549细胞接种在24孔平板中的盖玻片上。在100％铺满时，细胞用50pfu/
孔GLV-1h68或LIVP分离株5.1.1感染。感染后3天(dpi)，细胞用500μL4％PFA固定
10分钟并用1xPBS洗涤3次。为了封闭及透化，细胞与每孔500μL封闭溶液(1x PBS/5％
FCS/0.1％Triton-X100)孵育15分钟。加入痘苗病毒的兔多克隆抗体(在封闭溶液中
1：500稀释，(ab35219，abcam))，细胞在摇床上于4℃孵育过夜。随后，平板用1xPBS洗
涤3次。为了封闭及透化，细胞与每孔500μL 1x PBS/5％FCS/0.1％Triton-X100孵
育15分钟。加入二抗(Cy2缀合的AffiniPure驴抗兔IgG，在封闭溶液中1：200稀释
(711-225-152，Jackson ImmunoResearch)和Hoechst(Hoechst33258，1：400稀释(861405，
Sigma Aldrich))并孵育45分钟。最后，细胞用1xPBS洗涤3次，盖玻片包埋在平板上。结
果显示与GLV-1h68感染细胞相比LIVP5.1.1感染细胞中的噬斑更大。
养基中培养。A549细胞接种在24孔平板中的盖玻片上。在100％铺满时，细胞用50pfu/
孔GLV-1h68或LIVP分离株5.1.1感染。感染后3天(dpi)，细胞用500μL4％PFA固定
10分钟并用1xPBS洗涤3次。为了封闭及透化，细胞与每孔500μL封闭溶液(1x PBS/5％
FCS/0.1％Triton-X100)孵育15分钟。加入痘苗病毒的兔多克隆抗体(在封闭溶液中
1：500稀释，(ab35219，abcam))，细胞在摇床上于4℃孵育过夜。随后，平板用1xPBS洗
涤3次。为了封闭及透化，细胞与每孔500μL 1x PBS/5％FCS/0.1％Triton-X100孵
育15分钟。加入二抗(Cy2缀合的AffiniPure驴抗兔IgG，在封闭溶液中1：200稀释
(711-225-152，Jackson ImmunoResearch)和Hoechst(Hoechst33258，1：400稀释(861405，
Sigma Aldrich))并孵育45分钟。最后，细胞用1xPBS洗涤3次，盖玻片包埋在平板上。结
果显示与GLV-1h68感染细胞相比LIVP5.1.1感染细胞中的噬斑更大。
[0757] B.A549肿瘤的免疫荧光染色
[0758] 通过将A549细胞(ATCC)皮下注射(右侧大腿上皮下注射在100μL PBS中的6 nu
5.0×10 个细胞)进雌性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，Ind.；
3
6-8周龄)而在裸鼠中建立肿瘤。肿瘤细胞移植后17天(肿瘤大小>250mm)，小鼠经尾
6
静脉注射施用5.0×10pfu LIVP5.1.1，GLV-1h68(于100μl PBS中)或者单独PBS。在
移植后42天处死小鼠，收集肿瘤并冷冻。冷冻肿瘤在摇床上于4℃在4％PFA中固定过
夜。然后肿瘤用1xPBS洗涤5次，每次30分钟。肿瘤切成两半，用在1xPBS中的5％低熔
点琼脂糖包埋在6孔平板中。用振动切片机制备琼脂糖切片(100μm)并直接转移进具有
1xPBS的48孔平板中。用每孔500μL封闭溶液(1xPBS/0.2％Triton-X100/5％FCS)封
闭及透化切片1小时以备染色。一抗在摇床上于室温孵育过夜。一抗包括抗痘苗病毒的
兔多克隆抗体(在封闭溶液中1：100稀释，(ab35219，abcam))和大鼠抗小鼠MHC II类抗
体(在封闭溶液中1：200稀释，(14-5321-85，eBioscience))。在用1xPBS洗涤3次后，
加入二抗及Hoechst33258(在封闭溶液中1：400稀释)，并在摇床上于室温孵育4小时。
二抗包括Cy2缀合的AffiniPure驴抗兔IgG(在封闭溶液中1：200稀释(711-225-152，
Jackson ImmunoResearch))，Cy3缀合的AffiniPure驴抗大鼠IgG(在封闭溶液中1：200稀
释(712-165-153，Jackson ImmunoResearch))。肿瘤用1xPBS洗涤3次并包埋在Moviol
中。结果显示在GLV-1h68及LIVP5.1.1感染细胞之间在病毒传播或者免疫细胞吸引或定
位方面无显著差异。
5.0×10 个细胞)进雌性裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，Ind.；
3
6-8周龄)而在裸鼠中建立肿瘤。肿瘤细胞移植后17天(肿瘤大小>250mm)，小鼠经尾
6
静脉注射施用5.0×10pfu LIVP5.1.1，GLV-1h68(于100μl PBS中)或者单独PBS。在
移植后42天处死小鼠，收集肿瘤并冷冻。冷冻肿瘤在摇床上于4℃在4％PFA中固定过
夜。然后肿瘤用1xPBS洗涤5次，每次30分钟。肿瘤切成两半，用在1xPBS中的5％低熔
点琼脂糖包埋在6孔平板中。用振动切片机制备琼脂糖切片(100μm)并直接转移进具有
1xPBS的48孔平板中。用每孔500μL封闭溶液(1xPBS/0.2％Triton-X100/5％FCS)封
闭及透化切片1小时以备染色。一抗在摇床上于室温孵育过夜。一抗包括抗痘苗病毒的
兔多克隆抗体(在封闭溶液中1：100稀释，(ab35219，abcam))和大鼠抗小鼠MHC II类抗
体(在封闭溶液中1：200稀释，(14-5321-85，eBioscience))。在用1xPBS洗涤3次后，
加入二抗及Hoechst33258(在封闭溶液中1：400稀释)，并在摇床上于室温孵育4小时。
二抗包括Cy2缀合的AffiniPure驴抗兔IgG(在封闭溶液中1：200稀释(711-225-152，
Jackson ImmunoResearch))，Cy3缀合的AffiniPure驴抗大鼠IgG(在封闭溶液中1：200稀
释(712-165-153，Jackson ImmunoResearch))。肿瘤用1xPBS洗涤3次并包埋在Moviol
中。结果显示在GLV-1h68及LIVP5.1.1感染细胞之间在病毒传播或者免疫细胞吸引或定
位方面无显著差异。
[0759] 实施例9：在异种移植小鼠模型中Effects of LIVP1.1.1对犬软组织肉瘤的作用
[0760] 在这个实施例中，在异种移植小鼠模型中检测了LIVP1.1.1及GLV-1h68在犬软组织肉瘤中的治疗作用。
[0761] A.材料及方法
[0762] 1.细胞培养
[0763] 非洲绿猴肾成纤维细胞(CV-1)得自美国菌种保藏中心(ATCC)。Morris(MTH52c)得自软组织肉瘤[Any MacNeill，未公布数据]。对于CV-1，细胞在添加抗生素溶液(100U/
ml青霉素G，100单位/ml链霉素)和10％胎牛血清(FBS；Invitrogen GmbH，Karlsruhe，
Germany)的DMEM中在5％CO2下于37℃培养，而对于MTH52c，FBS为20％。
ml青霉素G，100单位/ml链霉素)和10％胎牛血清(FBS；Invitrogen GmbH，Karlsruhe，
Germany)的DMEM中在5％CO2下于37℃培养，而对于MTH52c，FBS为20％。
[0764] 2.病毒毒株
[0765] 本研究中采用实施例1所描述的GLV-1h68和LIVP1.1.1痘苗病毒株。
[0766] 3.细胞存活性测定
[0767] 细胞培养在24孔平板中(Nunc，Wiesbaden，Germany)。培养24小时后，用LIVP1.1.1和GLV-1h68感染细胞，感染复数(MOI)为0.1和1.0。细胞于37℃孵育1小时，
除去感染培养基，随后细胞在新鲜生长培养基中孵育。感染后的活细胞数量用3-(4，5-二
甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测量(Sigma，Taufkirchen，Germany)。在
感染后24、48、72或96小时，培养基用0.5ml MTT溶液置换，在5％CO2气氛中于37℃孵育
2小时，MTT溶液为MTT以2.5mg/ml的浓度溶解在不含酚红的RPMI1640中孵育。除去MTT
溶液后，通过加入在异丙醇中稀释的1N HCl而终止颜色反应。在570nm波长测量光密度。
未感染细胞用作参照并被认为是100％活的。
除去感染培养基，随后细胞在新鲜生长培养基中孵育。感染后的活细胞数量用3-(4，5-二
甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测量(Sigma，Taufkirchen，Germany)。在
感染后24、48、72或96小时，培养基用0.5ml MTT溶液置换，在5％CO2气氛中于37℃孵育
2小时，MTT溶液为MTT以2.5mg/ml的浓度溶解在不含酚红的RPMI1640中孵育。除去MTT
溶液后，通过加入在异丙醇中稀释的1N HCl而终止颜色反应。在570nm波长测量光密度。
未感染细胞用作参照并被认为是100％活的。
[0768] 4.体外病毒复制
[0769] 为了测定病毒复制，用LIVP1.1.1和GLV-1h68在MOI为0.1感染生长在24孔平板中的细胞。在37℃孵育1小时，其中每20分钟温和振荡孵育后，除去感染培养基并用新
鲜生长培养基置换。在1、6、12、24、48、72和96小时后，收集细胞和上清。3次冻融循环后，在CV-1细胞上经标准噬斑测定滴定裂解物的系列稀释液。所有样品一式三份测量。
鲜生长培养基置换。在1、6、12、24、48、72和96小时后，收集细胞和上清。3次冻融循环后，在CV-1细胞上经标准噬斑测定滴定裂解物的系列稀释液。所有样品一式三份测量。
[0770] 5.Western印迹分析
[0771] 感染之前3天，Morris细胞接种在24孔平板中(Nunc，Wiesbaden，Germany)。如果不另外指出，90％铺满细胞层模拟感染或者用LIVP1.1.1或GLV-1h68以MOI为1.0在
37℃感染1小时。吸取含有病毒的培养基并用含有20％FBS的新鲜培养基置换。在感染后
1、12、24、48、72和96小时(hpi)收获细胞并重悬于十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中以
备蛋白质分离和检测。蛋白质样品经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离并随后印
迹到硝基纤维素膜上(Whatman GmbH，Dassel，Germany)。膜然后与抗β-肌动蛋白小鼠单
克隆抗体(ab6276，Abcam，Cambridge，UK)或多克隆兔抗痘苗病毒(抗VACV)抗体(Abcam，
Cambridge，UK)孵育，用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗(ab6728，Abcam，Cambridge，
UK)或抗兔二抗(ab6721，Abcam，Cambridge，UK)及随后用增强的化学发光获得检测结果。
37℃感染1小时。吸取含有病毒的培养基并用含有20％FBS的新鲜培养基置换。在感染后
1、12、24、48、72和96小时(hpi)收获细胞并重悬于十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中以
备蛋白质分离和检测。蛋白质样品经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离并随后印
迹到硝基纤维素膜上(Whatman GmbH，Dassel，Germany)。膜然后与抗β-肌动蛋白小鼠单
克隆抗体(ab6276，Abcam，Cambridge，UK)或多克隆兔抗痘苗病毒(抗VACV)抗体(Abcam，
Cambridge，UK)孵育，用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗(ab6728，Abcam，Cambridge，
UK)或抗兔二抗(ab6721，Abcam，Cambridge，UK)及随后用增强的化学发光获得检测结果。
[0772] 6.荧光成像
[0773] 分别用荧光显微镜(Leica DM IRB；Wetzlar，Germany)和荧光立体显微镜(LeicaMZ16FA；Wetzlar，Germany)分析病毒感染的细胞和动物的GFP信号。用电子相机捕获图
像并用META-MORPH(Universal Imaging；Downingtown，PA，USA)和Photoshop7.0(Adobe
Systems，Mountain View，CA，USA)加工图像。
像并用META-MORPH(Universal Imaging；Downingtown，PA，USA)和Photoshop7.0(Adobe
Systems，Mountain View，CA，USA)加工图像。
[0774] 7.Morris异种移植物的痘苗病毒介导的治疗
[0775] 通过将在100μl PBS中的1x106个细胞皮下植入6-8周龄雌性裸鼠(NCI/Hsd/Athymic Nude-Foxnlnu，Harlan Winkelmann GmbH，Borchen，Germany)的右后腿中而产生
2
肿瘤。用数字测径器每周在二维监测肿瘤生长。肿瘤体积计算为[(长度x宽度 )/2]。在
7
第28天，将单剂LIVP1.1.1或者GLV-1h68病毒(1x10 噬斑形成单位[pfu]于100μl PBS
中)注射进尾静脉(i.v.)。对照动物静脉内注射仅PBS。
2
肿瘤。用数字测径器每周在二维监测肿瘤生长。肿瘤体积计算为[(长度x宽度 )/2]。在
7
第28天，将单剂LIVP1.1.1或者GLV-1h68病毒(1x10 噬斑形成单位[pfu]于100μl PBS
中)注射进尾静脉(i.v.)。对照动物静脉内注射仅PBS。
[0776] 通过使用GraphPad Prism软件(San Diego，USA)的双向方差分析(ANOVA)计算结果的显著性。结果显示为平均值±s.d.(标准误差)。P值<0.05被认为是显著的。
[0777] 动物通过颈部脱位而安乐死。所有动物实验均由Unterfranken政府批准并且根据德国动物保护指南而进行。
[0778] B.结果
[0779] 1.LIVP1.1.1和GLV-1h68对培养的犬肉瘤细胞的细胞毒性
[0780] Morris细胞在感染之前3天接种在24孔平板中。细胞然后用分别为1.0和0.1的MOI的LIVP1.1.1或者GLV-1h68感染。在感染后24、48、72和96小时(hpi)用A部分
描述的MTT测定分析细胞存活性。结果如表58所示。数值以各自未感染对照的百分比表
示。
描述的MTT测定分析细胞存活性。结果如表58所示。数值以各自未感染对照的百分比表
示。
[0781] 在MOI为0.1和1.0的病毒GLV-1h68感染后96小时，仅19.1％及13.13％的Morris细胞在处理后存活。在LIVP1.1.1感染后，仅10.1％及5.1％的活Morris细胞存在
于一些时间点和MOI。这些结果显示LIVP1.1.1病毒感染与GLV-1h68相比导致对培养的犬
肉瘤细胞略有效的杀伤。
于一些时间点和MOI。这些结果显示LIVP1.1.1病毒感染与GLV-1h68相比导致对培养的犬
肉瘤细胞略有效的杀伤。
[0782]
[0783] 2.LIVP1.1.1或GLV-1h68在Morris细胞中的复制效率
[0784] “Morris”细胞如上所述在MOI为0.1用LIVP1.1.1或GLV-1h68感染。在感染期间不同时间点在CV-1细胞单层中通过标准噬斑测定一式三份确定病毒效价，表示为pfu/
孔。结果如表59所示。
孔。结果如表59所示。
[0785] LIVP1.1.1(2.14x107+/-5.3x106pfu/孔 ) 和 GLV-1h68(2.39x106+/-7.4x105pfu/孔)在96hpi观测到最大病毒效价。这些数据与细胞死亡相关性非常好并且证实在这些实
验条件下在Morris细胞中LIVP1.1.1比GLV-1h68复制得更有效率。
验条件下在Morris细胞中LIVP1.1.1比GLV-1h68复制得更有效率。
[0786]
[0787] 3.通过显微镜分析LIVP1.1.1或GLV-1h68感染对Morris细胞的作用
[0788] LIVP1.1.1或GLV-1h68感染对Morris细胞的作用也通过荧光显微镜分别在MOI为0.1和1.0进行了分析。为此目的，在感染期间，病毒处理的Morris细胞通过
Hoechst-12222染色(蓝色，核染色)或碘化丙锭(红色，死细胞染色)染色，并在不同时间
点(1、24、48、72和96hpi)用荧光显微镜Leica DM IRB分析。然后合并图像以指示细胞感
染及裂解的程度。在GLV-1h68感染情况中，还分析了重组病毒标记基因GFP(绿色荧光蛋
白)的表达。
Hoechst-12222染色(蓝色，核染色)或碘化丙锭(红色，死细胞染色)染色，并在不同时间
点(1、24、48、72和96hpi)用荧光显微镜Leica DM IRB分析。然后合并图像以指示细胞感
染及裂解的程度。在GLV-1h68感染情况中，还分析了重组病毒标记基因GFP(绿色荧光蛋
白)的表达。
[0789] 在这些实验设置中，在MOI0.1和1.0用GLV-1h68感染的Morris细胞在48和72小时显示最强的GFP表达。另外，使用死细胞特异性碘化丙锭(PI)染色，也发现大多数感
染细胞在96hpi是PI阳性的。这些数据与我们的细胞存活性测定相关性非常好。在感染后
不同时间点用Leica DM IRB荧光显微镜的数码相机拍照并且合并以显示死细胞相对于全
部细胞的量。在Morris细胞上的LIVP1.1.1感染的分析证实与未感染细胞相比LIVP1.1.1
处理导致Morris细胞的死亡率显著升高。
染细胞在96hpi是PI阳性的。这些数据与我们的细胞存活性测定相关性非常好。在感染后
不同时间点用Leica DM IRB荧光显微镜的数码相机拍照并且合并以显示死细胞相对于全
部细胞的量。在Morris细胞上的LIVP1.1.1感染的分析证实与未感染细胞相比LIVP1.1.1
处理导致Morris细胞的死亡率显著升高。
[0790] 4.LIVP1.1.1或者GLV-1h68感染后，Morris细胞中病毒介导的蛋白质表达的Western印迹分析
[0791] 细胞接种在24孔平板中并且生长至它们达到90％铺满。然后用LIVP1.1.1或者GLV-1h68以MOI1.0在37℃感染细胞1小时。吸掉上清并用Morris细胞的新鲜生长培养
基置换。在不同时间点(1、24、48、72和96hpi)收获细胞并且重悬于十二烷基硫酸钠(SDS)
缓冲液中以备蛋白质分离及检测。样品用核酸酶在37℃处理30分钟。蛋白质样品用10％
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，随后印迹在硝基纤维素膜上。然后，膜与抗β-肌动
蛋白小鼠单克隆抗体(1：10,000)或者抗痘苗病毒兔多克隆抗体(1：1000)孵育，用辣根过
氧化物酶标记的抗小鼠二抗(1：2,000)或抗兔二抗(1：10,000)及随后用增强的化学发光
进行检测。Western印迹分析也证实与GLV-1h68相比LIVP1.1.1在Morris细胞中更有效
地复制，如在LIVP1.1.1感染样品中痘苗病毒抗体信号更强。
基置换。在不同时间点(1、24、48、72和96hpi)收获细胞并且重悬于十二烷基硫酸钠(SDS)
缓冲液中以备蛋白质分离及检测。样品用核酸酶在37℃处理30分钟。蛋白质样品用10％
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，随后印迹在硝基纤维素膜上。然后，膜与抗β-肌动
蛋白小鼠单克隆抗体(1：10,000)或者抗痘苗病毒兔多克隆抗体(1：1000)孵育，用辣根过
氧化物酶标记的抗小鼠二抗(1：2,000)或抗兔二抗(1：10,000)及随后用增强的化学发光
进行检测。Western印迹分析也证实与GLV-1h68相比LIVP1.1.1在Morris细胞中更有效
地复制，如在LIVP1.1.1感染样品中痘苗病毒抗体信号更强。
[0792] 5.用GLV-1h68和LIVP1.1.1全身性治疗Morris异种移植物
[0793] 12只6-8周龄雌性无胸腺裸鼠FoxN1小鼠被植入1x106个Morris细胞。植入3
后4周，所有裸鼠均产生肿瘤，体积大约为700-1100mm。动物分成3组(n＝4)并分别用
GLV-1h68、LIVP1.1.1或PBS(对照)注射。每周测量肿瘤大小。
后4周，所有裸鼠均产生肿瘤，体积大约为700-1100mm。动物分成3组(n＝4)并分别用
GLV-1h68、LIVP1.1.1或PBS(对照)注射。每周测量肿瘤大小。
[0794] 直至感染后21天，对照组所有小鼠均产生体积大于3000mm3的肿瘤，因此这组研究终止。相反，所有病毒治疗小鼠与这个时间点的对照相比均显示显著的肿瘤减小。结果
如表60所示。
如表60所示。
[0795] 病毒注射导致所有LIVP1.1.1治疗小鼠中显著的肿瘤消退。GLV-1h68治疗组不是3
这样，其中4个小鼠中有2个产生肿瘤，在35dpi体积大于3000mm。这个数据提示在Morris
异种移植物中LIVP1.1.1比GLV-1h68具有更高的溶瘤潜力。
这样，其中4个小鼠中有2个产生肿瘤，在35dpi体积大于3000mm。这个数据提示在Morris
异种移植物中LIVP1.1.1比GLV-1h68具有更高的溶瘤潜力。
[0796]
[0797] -＝小鼠由于肿瘤大小大于3000mm3而被杀死。
[0798]
[0799] 已发现与对照组小鼠相比LIVP1.1.1注射小鼠的存活率显著改善。直至第39天在LIVP1.1.1注射小鼠中未观测到死亡，并且最后一只小鼠在第105天死亡。相比之下，未
3
接受LIVP1.1.1治疗的对照小鼠在第17天和24天由于肿瘤大小大于3000mm 而安乐死，
这严重影响了小鼠的总体健康。这些结果见表62。
3
接受LIVP1.1.1治疗的对照小鼠在第17天和24天由于肿瘤大小大于3000mm 而安乐死，
这严重影响了小鼠的总体健康。这些结果见表62。
[0800]
[0801]
[0802] *＝小鼠由于肿瘤大小大于3000mm3而被是杀死。
[0803] 实施例10：LIVP分离株的序列数据分析
[0804] 在这个实施例中，对LIVP克隆分离株1.1.1、2.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1进行了测序和分析，结果与痘苗病毒株GLV-1h68、Western Reserve和Copenhagen的
已知序列进行了比较。
已知序列进行了比较。
[0805] LIVP克隆分离株1.1.1、2.1.1、3.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1在CV-1细胞单层中繁殖及测定效价。离心收获由LIVP克隆分离株1.1.1、2.1.1、3.1.1、
4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1或8.1.1感染的CV-1细胞并经过3轮冻融而破坏。低速离心
从细胞裂解物中除去细胞碎片及细胞核。使用标准方案通过蔗糖垫和蔗糖梯度(20-40％)
离心纯化回收的病毒颗粒。在用蛋白酶K处理后从纯化病毒粒提取基因组病毒DNA，随后
酚-氯仿提取(参见，Earl et al.，in Ausubel et al.，(eds)Current protocols in
molecular biology，vol.3，pages16.17.1-16.19-7(1998))。
4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1或8.1.1感染的CV-1细胞并经过3轮冻融而破坏。低速离心
从细胞裂解物中除去细胞碎片及细胞核。使用标准方案通过蔗糖垫和蔗糖梯度(20-40％)
离心纯化回收的病毒颗粒。在用蛋白酶K处理后从纯化病毒粒提取基因组病毒DNA，随后
酚-氯仿提取(参见，Earl et al.，in Ausubel et al.，(eds)Current protocols in
molecular biology，vol.3，pages16.17.1-16.19-7(1998))。
[0806] 基因组DNA通过鸟枪法测序并由AGOWA GmbH组装。通过在鸟枪法克隆上的额外测序或者通过用病毒基因组DNA进行PCR而进行缺口闭合。通过将反向互补序列与序
列进行比较、鉴别相同序列及延伸侧翼序列而重新构建反向末端重复。ORF与已知痘苗病
毒株GLV-1h68(SEQ ID NO：9，GenBank Accession No.EU410304)、Western Reserve(SEQ
ID NO：191，GenBank Accession No.AY243312)和Copenhagen(SEQ ID NO：192，GenBank
Accession No.M35027)的ORF进行比较。比较这些毒株中的主要和次要ORF的表可
见于Zhang et al.，Mol Genet Genomics282：417-438(2009)。使用得自Iowa State
University的两两序列比对程序(deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html；
Huang，X.(1994)Computer Applications in the Biosciences10：227-235)将每个单独
LIVP克隆分离株的序列与GL-ONC-1亲代LIVP分离株(SEQ ID NO：10)进行比对。所述比
对计算为“Global Alignment with GAP”。GAP程序计算两个序列的最佳全局比对，对末
端缺口不罚分。较短序列中的长缺口给予恒定罚分。两个序列必须是相同类型，即两个都
是DNA序列或者两个都是蛋白质序列。GAP在线性空间中输送比对，因此可以比对长序列。
默认参数设定为“Max Match”10分，“Min Mismatch，”-15分，“Gap-Open penalty”30分，“Gap-Extension penalty”3分。
列进行比较、鉴别相同序列及延伸侧翼序列而重新构建反向末端重复。ORF与已知痘苗病
毒株GLV-1h68(SEQ ID NO：9，GenBank Accession No.EU410304)、Western Reserve(SEQ
ID NO：191，GenBank Accession No.AY243312)和Copenhagen(SEQ ID NO：192，GenBank
Accession No.M35027)的ORF进行比较。比较这些毒株中的主要和次要ORF的表可
见于Zhang et al.，Mol Genet Genomics282：417-438(2009)。使用得自Iowa State
University的两两序列比对程序(deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html；
Huang，X.(1994)Computer Applications in the Biosciences10：227-235)将每个单独
LIVP克隆分离株的序列与GL-ONC-1亲代LIVP分离株(SEQ ID NO：10)进行比对。所述比
对计算为“Global Alignment with GAP”。GAP程序计算两个序列的最佳全局比对，对末
端缺口不罚分。较短序列中的长缺口给予恒定罚分。两个序列必须是相同类型，即两个都
是DNA序列或者两个都是蛋白质序列。GAP在线性空间中输送比对，因此可以比对长序列。
默认参数设定为“Max Match”10分，“Min Mismatch，”-15分，“Gap-Open penalty”30分，“Gap-Extension penalty”3分。
[0807] 表63描述了克隆分离株，包括SEQ ID NO、基因组大小、相应于反向末端重复的核苷酸及与GL-ONC-1亲代LIVP分离株(SEQ ID NO：10)的百分比(％)相同性。测序揭示
LIVP1分离株3.1.1是至少两个序列的混合物。
LIVP1分离株3.1.1是至少两个序列的混合物。
[0808]
[0809] 表64列出预测的ORF，包括名称/功能，分离株及GLV-1h68的核苷酸长度，在GLV-1h68、WR和/或Copenhagen(COP)中鉴别的相应的ORF。片段化的ORF用星号(*)指
示。表65列出假设的负责溶瘤能力和毒性中的差异的ORF。
示。表65列出假设的负责溶瘤能力和毒性中的差异的ORF。
[0810] 如表64所示，一些分离株在各种ORF中含有截短。例如，分泌的趋化因子结合蛋白(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的g1001/290、WR001/218和C23L/B29R)在LIVP分
离株1.1.1中由于缺失而截短。分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的g1093，WR071和I2L
的假设蛋白在GLV-1h68和LIVP分离株2.1.1中被截短。抑制蛋白样蛋白(分别相应于
GLV-1h68、WR和Cop中的g1225、WR167和A42R)在LIVP分离株5.1.1中被截短。锚蛋白
样蛋白(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl257、WR188和B6R)在LIVP分离株4.1.1
中被截短。
离株1.1.1中由于缺失而截短。分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的g1093，WR071和I2L
的假设蛋白在GLV-1h68和LIVP分离株2.1.1中被截短。抑制蛋白样蛋白(分别相应于
GLV-1h68、WR和Cop中的g1225、WR167和A42R)在LIVP分离株5.1.1中被截短。锚蛋白
样蛋白(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl257、WR188和B6R)在LIVP分离株4.1.1
中被截短。
[0811] 各种相应的开放读框的长度可变性先前已在不同痘苗病毒毒株中观测到。例如，白介素-18(IL-18)结合蛋白(分别相应于GLV-1h68和WR中的gl015/277和WR013)在痘
苗病毒株WR、Lister和VACV-3737(GenBank Acc.No.DQ377945)中是381bp，在痘苗病毒株
DUKE(GenBank Acc.No.DQ439815)、LC16(GenBank Acc.No.AY678277)、Acam3(GenBank Acc.
No.AY313848)和Acam2000(GenBank Acc.No.AY313847)中是375bp。在表64的LIVP分离
株中，在C末端的小的长度差异导致IL-18结合蛋白ORF在分离株1.1.1、2.1.1、4.1.1和
8.1.1中是381bp，在分离株5.1.1、6.1.1和7.1.1中是375bp。α-鹅膏蕈碱敏感性蛋白
(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl034、WR029和N2L)在毒株WR、GLV-1h68和LIVP
分离株5.1.1中是528bp，但是在LIVP分离株1.1.1、2.1.1、4.1.1、6.1.1、7.1.1、8.1.1和
毒株Acam3000(GenBank Acc.No.AY603355)中仅513bp(相应于5个氨基酸缺失)。锚蛋
白样蛋白(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl035、WR030和M1L)在各种痘苗病毒毒
株中已被确定为1419bp、1413bp或1410bp。如表64所示，在LIVP分离株5.1.1中，这个
ORF是1419bp，而其余LIVP分离株中这个ORF含有1413bp。Toll/IL1-受体(分别相应于
GLV-1h68、WR和Cop中的g1230、WR172和A46R)在痘苗病毒株WR和LIVP分离株1.1.1、
5.1.1和7.1.1中是723bp，在LIVP分离株2.1.1、4.1.1、6.1.1和8.1.1中是711bp，在痘
苗病毒株Cop中仅645bp。在病毒体ORFS丰富组件(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的
gl077、WR061和E5R)和DNA聚合酶(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl084、WR065
和E9L)中观测到相似的可变性。
苗病毒株WR、Lister和VACV-3737(GenBank Acc.No.DQ377945)中是381bp，在痘苗病毒株
DUKE(GenBank Acc.No.DQ439815)、LC16(GenBank Acc.No.AY678277)、Acam3(GenBank Acc.
No.AY313848)和Acam2000(GenBank Acc.No.AY313847)中是375bp。在表64的LIVP分离
株中，在C末端的小的长度差异导致IL-18结合蛋白ORF在分离株1.1.1、2.1.1、4.1.1和
8.1.1中是381bp，在分离株5.1.1、6.1.1和7.1.1中是375bp。α-鹅膏蕈碱敏感性蛋白
(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl034、WR029和N2L)在毒株WR、GLV-1h68和LIVP
分离株5.1.1中是528bp，但是在LIVP分离株1.1.1、2.1.1、4.1.1、6.1.1、7.1.1、8.1.1和
毒株Acam3000(GenBank Acc.No.AY603355)中仅513bp(相应于5个氨基酸缺失)。锚蛋
白样蛋白(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl035、WR030和M1L)在各种痘苗病毒毒
株中已被确定为1419bp、1413bp或1410bp。如表64所示，在LIVP分离株5.1.1中，这个
ORF是1419bp，而其余LIVP分离株中这个ORF含有1413bp。Toll/IL1-受体(分别相应于
GLV-1h68、WR和Cop中的g1230、WR172和A46R)在痘苗病毒株WR和LIVP分离株1.1.1、
5.1.1和7.1.1中是723bp，在LIVP分离株2.1.1、4.1.1、6.1.1和8.1.1中是711bp，在痘
苗病毒株Cop中仅645bp。在病毒体ORFS丰富组件(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的
gl077、WR061和E5R)和DNA聚合酶(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl084、WR065
和E9L)中观测到相似的可变性。
[0812] LIVP分离株6.1.1和8.1.1在未知蛋白中具有DT重复延伸(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl264、WR193和B11R)，其为255bp，而在其余分离株和GLV-1h68
中是219bp。锚蛋白样蛋白(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl273、WR199和B18R)
在痘苗病毒株WR、Cop、DUKE、Acam3、Acam2000和Acam3000中是1725bp，但是在LIVP分离
株1.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1中被大缺失截短。IL-1-beta抑制剂(分别
相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl270、WR197和B16R)通常是981bp，但是在痘苗病毒株
Cop中被片段化(873bp)，在LIVP分离株1.1.1、2.1.1、5.1.1和7.1.1中含有缺失。
中是219bp。锚蛋白样蛋白(分别相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl273、WR199和B18R)
在痘苗病毒株WR、Cop、DUKE、Acam3、Acam2000和Acam3000中是1725bp，但是在LIVP分离
株1.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1和8.1.1中被大缺失截短。IL-1-beta抑制剂(分别
相应于GLV-1h68、WR和Cop中的gl270、WR197和B16R)通常是981bp，但是在痘苗病毒株
Cop中被片段化(873bp)，在LIVP分离株1.1.1、2.1.1、5.1.1和7.1.1中含有缺失。
[0813] 除了ORF中的变异之外，测序揭示了一些ORF的启动子区的差异，包括插入和缺失。例如，LIVP分离株1.1.1在丝氨酸蛋白酶抑制剂样SPI-1ORF(gl009/283)的启动子区
有6个核苷酸的插入。LIVP分离株8.1.1在分泌的表皮生长因子样蛋白(gl010/282)的
启动子区有缺失。LIVP分离株5.1.1在锚蛋白样蛋白ORF(gl037)的启动子区有8个核苷
酸的缺失。LIVP分离株6.1.1在编码未知蛋白的ORF(相应于gl079)的启动子区有缺失。
LIVP分离株1.1.1、4.1.1、6.1.1和7.1.1在编码未知蛋白的ORF(相应于gl088)的启动子
区有19个核苷酸的缺失。LIVP分离株4.1.1在抑制蛋白样蛋白(gl225)的启动子区有2
个缺失，分离株5.1.1有一个缺失。
有6个核苷酸的插入。LIVP分离株8.1.1在分泌的表皮生长因子样蛋白(gl010/282)的
启动子区有缺失。LIVP分离株5.1.1在锚蛋白样蛋白ORF(gl037)的启动子区有8个核苷
酸的缺失。LIVP分离株6.1.1在编码未知蛋白的ORF(相应于gl079)的启动子区有缺失。
LIVP分离株1.1.1、4.1.1、6.1.1和7.1.1在编码未知蛋白的ORF(相应于gl088)的启动子
区有19个核苷酸的缺失。LIVP分离株4.1.1在抑制蛋白样蛋白(gl225)的启动子区有2
个缺失，分离株5.1.1有一个缺失。
[0814]
[0815]
[0816]
[0817]
[0818]
[0819]
[0820]
[0821]
[0822]
[0823]
[0824]
[0825]
[0826]
[0827]
[0828] 实施例11：将编码异源蛋白质的基因导入LIVP克隆分离株中
[0829] 在这个实施例中，编码异源蛋白质的基因通过1)直接克隆或2)同源重组而插入LIVP克隆分离株中。
[0830] A.直接克隆
[0831] 在这个实施例中，编码异源蛋白质的LIVP病毒根据Scheifiinger et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：9977-9981和U.S.Pat.No.6,265,183所述方法通过直接
克隆而构建。在这个方法中，编码异源蛋白质的核酸被插入到位于病毒基因组中非关键
区域的独特限制性内切酶切点中。例如，编码异源蛋白质的基因被插入到LIVP1.1.1、
LIVP2.1.1、LIVP3.1.1、LIVP4.1.1、LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1、LIVP8.1.1 和
GLV-1h68(GL-ONC1)的NotI位点。典型的编码的异源蛋白质及编码核酸序列(SEQ ID NO)
列表见下表66。
克隆而构建。在这个方法中，编码异源蛋白质的核酸被插入到位于病毒基因组中非关键
区域的独特限制性内切酶切点中。例如，编码异源蛋白质的基因被插入到LIVP1.1.1、
LIVP2.1.1、LIVP3.1.1、LIVP4.1.1、LIVP5.1.1、LIVP6.1.1、LIVP7.1.1、LIVP8.1.1 和
GLV-1h68(GL-ONC1)的NotI位点。典型的编码的异源蛋白质及编码核酸序列(SEQ ID NO)
列表见下表66。
[0832]
[0833]
[0834]
[0835]
[0836]
[0837]
[0838] 简而言之，首先用标准重组DNA技术构建基因盒，其含有可操纵连接于痘苗病毒启动子的编码异源基因的核酸。所述盒还含有可操纵连接于痘苗病毒启动子的编码标记蛋
白的核酸，该标记蛋白以用于重组病毒的选择。在这个实施例中，盒中包括可操纵连接于痘
苗病毒P7.5启动子的大肠杆菌黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶(gpt)基因。所述基因
盒侧翼是特异性限制性内切酶切点的核酸。在这个实施例中，盒的侧翼是NotI切点序列
GCGGCCGC(SEQ ID NO：193)。所述基因盒被连接进克隆载体以用于在细菌中繁殖。
白的核酸，该标记蛋白以用于重组病毒的选择。在这个实施例中，盒中包括可操纵连接于痘
苗病毒P7.5启动子的大肠杆菌黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶(gpt)基因。所述基因
盒侧翼是特异性限制性内切酶切点的核酸。在这个实施例中，盒的侧翼是NotI切点序列
GCGGCCGC(SEQ ID NO：193)。所述基因盒被连接进克隆载体以用于在细菌中繁殖。
[0839] 根据标准方法制备及纯化LIVP病毒DNA(参见例如Gross-Bellard et al.(1973)Eur.J.Biochem.36：32-38)。病毒DNA用特异的限制性内切酶裂解，在本实施例中是NotI，
并根据标准方法如酚/氯仿提取法纯化。LIVP病毒载体臂的完整性通过反转电场凝胶电
泳(例如1％琼脂糖凝胶于20mM Tris/10mM冰醋酸/0.5mM EDTA，pH8.0；7V/cm交替正向
和反向脉冲，之后1秒钟停顿-1)F6R3(4hr)；2)F4R2(4hr)；3)F2R1(4hr)；4)F8R4(8hr))控
制。通过用NotI消化从克隆载体中切下编码异源蛋白质和标记蛋白的基因盒，并用T4DNA
连接酶连接到NotI裂解的病毒DNA制备物中。
并根据标准方法如酚/氯仿提取法纯化。LIVP病毒载体臂的完整性通过反转电场凝胶电
泳(例如1％琼脂糖凝胶于20mM Tris/10mM冰醋酸/0.5mM EDTA，pH8.0；7V/cm交替正向
和反向脉冲，之后1秒钟停顿-1)F6R3(4hr)；2)F4R2(4hr)；3)F2R1(4hr)；4)F8R4(8hr))控
制。通过用NotI消化从克隆载体中切下编码异源蛋白质和标记蛋白的基因盒，并用T4DNA
连接酶连接到NotI裂解的病毒DNA制备物中。
[0840] 用辅助病毒禽痘HP1.441以M.O.I为0.5感染非洲绿猴肾细胞系CV-1的铺满单层1小时以包装病毒。连接的病毒DNA用标准磷酸钙转染方法转染进感染的细胞。孵育
3天后，收获细胞并制备粗病毒原液。然后，病毒原液用于感染在gpt选择下的单层CV-1
细胞(参见Issacs，Vaccinia virus and poxvirology：methods and protocols，Humana
Press(2004))。掺入并表达大肠杆菌gpt基因的病毒重组体在含有霉酚酸(MPA，嘌呤代谢
抑制剂)和核苷酸前体黄嘌呤和次黄嘌呤的培养基中可以形成噬斑(参见Falkner and
Moss(1988)J.Virol.62(6)：1849-1854)。
3天后，收获细胞并制备粗病毒原液。然后，病毒原液用于感染在gpt选择下的单层CV-1
细胞(参见Issacs，Vaccinia virus and poxvirology：methods and protocols，Humana
Press(2004))。掺入并表达大肠杆菌gpt基因的病毒重组体在含有霉酚酸(MPA，嘌呤代谢
抑制剂)和核苷酸前体黄嘌呤和次黄嘌呤的培养基中可以形成噬斑(参见Falkner and
Moss(1988)J.Virol.62(6)：1849-1854)。
[0841] B.同源重组
[0842] 在这个实施例中，根据类似于U.S.Patent No.7,588,767，U.S.Pat.Pub.No.2009-0117034以及Falkner and Moss(1990)J.Virol.3108-3111描述的方法，编码异源
蛋白质的基因(如表66所述)通过体内同源重组插入LIVP病毒，例如LIVP1.1.1、2.1.1、
4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、8.1.1和GLV-1h68(GL-ONC1)。在这个方法中，编码异源蛋白质
的基因被克隆到穿梭质粒中，该穿梭质粒靶向LIVP克隆分离株中的特定基因座。然后，所
述基因通过双相互交换(double reciprocal crossover)被插入克隆分离株的基因组中。
蛋白质的基因(如表66所述)通过体内同源重组插入LIVP病毒，例如LIVP1.1.1、2.1.1、
4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、8.1.1和GLV-1h68(GL-ONC1)。在这个方法中，编码异源蛋白质
的基因被克隆到穿梭质粒中，该穿梭质粒靶向LIVP克隆分离株中的特定基因座。然后，所
述基因通过双相互交换(double reciprocal crossover)被插入克隆分离株的基因组中。
[0843] 简而言之，构建了穿梭转移载体，其含有编码异源基因的核酸，所述核酸用标准重组DNA技术插入到含有希望的痘苗病毒DNA片段的质粒中。典型地，DNA被插入到非关键
基因中，例如F14.5、A56R或HA基因，并且与痘苗病毒启动子连接。典型的异源蛋白质的列
表见表66。所述质粒还可以包括可操纵连接于痘苗病毒启动子的显性选择标记蛋白，用于
选择重组病毒。穿梭转移载体连接到克隆载体中以在细菌中繁殖。
基因中，例如F14.5、A56R或HA基因，并且与痘苗病毒启动子连接。典型的异源蛋白质的列
表见表66。所述质粒还可以包括可操纵连接于痘苗病毒启动子的显性选择标记蛋白，用于
选择重组病毒。穿梭转移载体连接到克隆载体中以在细菌中繁殖。
[0844] 用非洲绿猴肾成纤维细胞CV-1细胞(美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)；CCL-70)产生病毒。细胞在添加1％抗生素-抗真菌溶液(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)
和10％胎牛血清(FBS；Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s
medium(DMEM)中在5％CO2下于37℃生长。CV-1细胞用LIVP克隆分离株以MOI0.1感染1
小时。然后，感染的细胞用Fugene(Roche，Indianapolis，IN)转染穿梭转移载体。在感染
后两天，收获感染/转染的细胞，选择重组病毒，用先前所述的标准方法纯化噬斑(Falkner
and Moss(1990)J.Virol.64：3108-3111)。例如，掺入及表达大肠杆菌gpt基因的病毒重组
体在含有霉酚酸(MPA，嘌呤代谢抑制剂)和核苷酸前体黄嘌呤和次黄嘌呤的培养基中可以
形成噬斑(参见Falkner and Moss(1988)J.Virol.62(6)：1849-1854)。
和10％胎牛血清(FBS；Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s
medium(DMEM)中在5％CO2下于37℃生长。CV-1细胞用LIVP克隆分离株以MOI0.1感染1
小时。然后，感染的细胞用Fugene(Roche，Indianapolis，IN)转染穿梭转移载体。在感染
后两天，收获感染/转染的细胞，选择重组病毒，用先前所述的标准方法纯化噬斑(Falkner
and Moss(1990)J.Virol.64：3108-3111)。例如，掺入及表达大肠杆菌gpt基因的病毒重组
体在含有霉酚酸(MPA，嘌呤代谢抑制剂)和核苷酸前体黄嘌呤和次黄嘌呤的培养基中可以
形成噬斑(参见Falkner and Moss(1988)J.Virol.62(6)：1849-1854)。
[0845] 实施例12：将病毒静脉内施用于具有晚期癌症的人类患者
[0846] 在这个实施例中，LIVP病毒1.1.1、2.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、8.1.1或GLV-1h68的每一种以静脉输液施用于具有晚期癌症的患者。每种病毒用8个剂量方案或
组(cohort)在28天周期中施用，确定毒性作用和应答并在组中比较。在每个组中有3个
患者。
组(cohort)在28天周期中施用，确定毒性作用和应答并在组中比较。在每个组中有3个
患者。
[0847] 对 于 第1-5组，LIVP病 毒1.1.1、2.1.1、4.1.1、5.1.1、6.1.1、7.1.1、8.1.1 或5 6
GLV-1h68在28天周期的第1天以静脉输液施用，剂量逐步升高(分别为1x10，1x10，
7 8 9 7 8
1x10，1x10，1x10pfu)。第6-7组在28天周期第1-3天分别接受1.667x10 或1.667x10pfu
9
病毒。第8组在28天周期的前5天连续接受1x10pfu病毒。在基线及每个周期期间对具
有表面或粘膜损伤的患者照相。每天进行端点评估，包括安全性、耐受性、病毒复制、肿瘤输
送、中和抗体产生及抗肿瘤活性。评估毒性作用如疲劳、发热、僵直肌痛、流感样症状、痘苗
病毒皮疹、贫血、油状皮肤/毛发及白细胞增多。例如，在周期的每天在血液、尿液、粪便和
痰液上进行病毒噬斑测定(VPA)分析病毒排出。
GLV-1h68在28天周期的第1天以静脉输液施用，剂量逐步升高(分别为1x10，1x10，
7 8 9 7 8
1x10，1x10，1x10pfu)。第6-7组在28天周期第1-3天分别接受1.667x10 或1.667x10pfu
9
病毒。第8组在28天周期的前5天连续接受1x10pfu病毒。在基线及每个周期期间对具
有表面或粘膜损伤的患者照相。每天进行端点评估，包括安全性、耐受性、病毒复制、肿瘤输
送、中和抗体产生及抗肿瘤活性。评估毒性作用如疲劳、发热、僵直肌痛、流感样症状、痘苗
病毒皮疹、贫血、油状皮肤/毛发及白细胞增多。例如，在周期的每天在血液、尿液、粪便和
痰液上进行病毒噬斑测定(VPA)分析病毒排出。
[0848] 还使用RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors；RECIST 1.1，published in January2009)评估患者对治疗的应答以确定治疗期间患者是否改善(“应
答”)、保持相同(“稳定”)或恶化(“进展”)。具有稳定疾病或部分应答的患者继续接受
后续治疗周期。具有进展疾病的患者取消试验。如果患者具有补体应答，治疗也终止，跟踪
患者并且监测症状。
答”)、保持相同(“稳定”)或恶化(“进展”)。具有稳定疾病或部分应答的患者继续接受
后续治疗周期。具有进展疾病的患者取消试验。如果患者具有补体应答，治疗也终止，跟踪
患者并且监测症状。
[0849] 实施例13：黑素瘤宿主细胞因子转录谱及溶瘤痘苗病毒的早期基因表达-病毒感染及复制
[0851] 用痘苗病毒分离株GLV-1h68、LIVP1.1.1、LIVP5.1.1或LIVP6.1.1以感染复数(MOI)为0.01感染黑素瘤细胞系888-MEL和1936-MEL(来自时间独特皮下转移
(temporally distinct cutaneous metastases)的公知黑素瘤细胞系，如Sabatino et
al.(2008)Cancer Res.，68：122-131 和 Monsurro et al.(2010)J.Transl.Med.，8：10
所述衍生；也参见例如，Robbins et al.(2002)J.Immunol.，169：6036-47；and Wang et
al.(2006)J.Invest.Dermatol.，126：1372-7)。作为阴性对照，细胞系也用无病毒感染培养
基处理。在感染后，细胞在细胞培养基中于37℃孵育规定时间直至收获。细胞在感染后2、
6、10、24和48小时(hpi)收获。在CV-1细胞单层上经标准噬斑测定确定病毒效价以确定
复制效率。用标准程序分离、扩增、纯化并标记总RNA。
(temporally distinct cutaneous metastases)的公知黑素瘤细胞系，如Sabatino et
al.(2008)Cancer Res.，68：122-131 和 Monsurro et al.(2010)J.Transl.Med.，8：10
所述衍生；也参见例如，Robbins et al.(2002)J.Immunol.，169：6036-47；and Wang et
al.(2006)J.Invest.Dermatol.，126：1372-7)。作为阴性对照，细胞系也用无病毒感染培养
基处理。在感染后，细胞在细胞培养基中于37℃孵育规定时间直至收获。细胞在感染后2、
6、10、24和48小时(hpi)收获。在CV-1细胞单层上经标准噬斑测定确定病毒效价以确定
复制效率。用标准程序分离、扩增、纯化并标记总RNA。
[0852] 转录谱经36,000(36k)人(Wang et al.(2005)J.transl.Med.，3：28)或订制痘苗病毒(VACV)阵列平台(VACGLa520445F，Affymetrix，CA；see Worschech et al.(2009)
BMC Genomics，10：301)产生。36k人阵列杂交使用二颜色系统；参照及测试aRNA均用ULS
aRNA荧光标记试剂盒(Kreatech Diagnostics，Amsterdam，The Netherlands)直接标记，
用Cy3标记参照，Cy5标记测试样品，并共杂交至玻片。在42℃孵育20小时后，洗涤、干燥
并用Agilent扫描仪扫描阵列。用订制VACV阵列平台(VACGla520445F；Affymetrix，CA)
评估痘苗病毒(VACV)的基因表达，该平台包括代表219个基因覆盖几种VACV毒株的合并
基因组的308个探针，Renilla萤光素酶-Aequorea绿色荧光融合基因及337种人或小鼠
“管家”基因(393个探针)(参见例如Worschech et al.(2009)BMC Genomics，10：301)。阵
列质量如先前描述记录(Wang E(2005)J.Transl.Med.，3：28)。
BMC Genomics，10：301)产生。36k人阵列杂交使用二颜色系统；参照及测试aRNA均用ULS
aRNA荧光标记试剂盒(Kreatech Diagnostics，Amsterdam，The Netherlands)直接标记，
用Cy3标记参照，Cy5标记测试样品，并共杂交至玻片。在42℃孵育20小时后，洗涤、干燥
并用Agilent扫描仪扫描阵列。用订制VACV阵列平台(VACGla520445F；Affymetrix，CA)
评估痘苗病毒(VACV)的基因表达，该平台包括代表219个基因覆盖几种VACV毒株的合并
基因组的308个探针，Renilla萤光素酶-Aequorea绿色荧光融合基因及337种人或小鼠
“管家”基因(393个探针)(参见例如Worschech et al.(2009)BMC Genomics，10：301)。阵
列质量如先前描述记录(Wang E(2005)J.Transl.Med.，3：28)。
[0853] 用 3’IVT表达试剂盒(Affymetrix，Santa Clara，CA)根据厂商说明从总RNA扩增6.5μgaRNA，并杂交至芯片。在杂交炉中于45℃孵育16小时后，在
Fluidics工作站用 杂交、洗涤及染色试剂盒(Affymetrix)洗涤并染色阵列。
用 Scanner30007G(Affymetrix)扫描阵列。
Fluidics工作站用 杂交、洗涤及染色试剂盒(Affymetrix)洗涤并染色阵列。
用 Scanner30007G(Affymetrix)扫描阵列。
[0854] 转录数据上载到MicroArray数据库(mAdb；available at madb.nci.nih.govor nciarray.nci.nih.gov)并酌情使用Biometric Research Branch，National Cancer
Institute开发的BRBArrayTools (linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html；参见例
TM
如，Jin et al.(2004)BMC Genomics，5：55)或者Partek Genomics Suite software(St.
Louis，MO)做进一步分析。基因比率在实验样品间平均校正并且根据uncentered
correlation algorithm展示。为统计学分析，感染后的完整数据集表达谱被过滤至包括仅
95％基因存在和全部实验中的2倍变化(过滤器95％，2倍)以富集有信息的转录物。用
parametric unpaired Student’s t检验或3-way ANOVA.进行类比(Class comparison)。
独立地，因为标准统计学不分离对照样品和感染样品，还对原始基因列表(不是滤波前的
列表)应用标准差(STDEV)排除/包括(exclusion/inclusion)。为此，第一次过滤排除
对照间STDEV>0.25的基因，以消除由非特异于病毒感染的细胞培养效应不同表达的基因，
第二次过滤包括具有STDEV>0.7(888-MEL)或>0.4(1936-MEL)的基因以在由第一个滤波步
骤选择的基因中包括仅在感染样品中具有高STDEV的那些基因。基于Ingenuity Pathway
Analysis(IPA，Ingenuity Systems)解释基因功能。用Robust Multichip Average(RMA)
方法标准化获取自Affymetrix平台的数据。
Institute开发的BRBArrayTools (linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html；参见例
TM
如，Jin et al.(2004)BMC Genomics，5：55)或者Partek Genomics Suite software(St.
Louis，MO)做进一步分析。基因比率在实验样品间平均校正并且根据uncentered
correlation algorithm展示。为统计学分析，感染后的完整数据集表达谱被过滤至包括仅
95％基因存在和全部实验中的2倍变化(过滤器95％，2倍)以富集有信息的转录物。用
parametric unpaired Student’s t检验或3-way ANOVA.进行类比(Class comparison)。
独立地，因为标准统计学不分离对照样品和感染样品，还对原始基因列表(不是滤波前的
列表)应用标准差(STDEV)排除/包括(exclusion/inclusion)。为此，第一次过滤排除
对照间STDEV>0.25的基因，以消除由非特异于病毒感染的细胞培养效应不同表达的基因，
第二次过滤包括具有STDEV>0.7(888-MEL)或>0.4(1936-MEL)的基因以在由第一个滤波步
骤选择的基因中包括仅在感染样品中具有高STDEV的那些基因。基于Ingenuity Pathway
Analysis(IPA，Ingenuity Systems)解释基因功能。用Robust Multichip Average(RMA)
方法标准化获取自Affymetrix平台的数据。
[0855] 2.结果
[0856] a.人类基因转录变化
[0857] 取自不同时间点的未感染样品根据培养时间与感染样品一起分离(细胞培养效应)，甚至是在施用标准统计学(ANOVA)之后。使用STDEV包括/排除标准，获得了由痘苗
病毒感染特异性影响的基因列表(见表67和68)。具体地，从设计的顺序统计学方法，在
888和1936细胞系中分别有507和480个基因被影响。在施加90％过滤后，鉴定了400个
在888-MEL细胞系中变化的基因和370个在1936-MEL细胞系中变化的基因，总共鉴定了
703个由于病毒感染而特异性变化的人类基因。病毒影响的基因涉及广泛细胞功能，如细胞
死亡、细胞生长及增殖、蛋白质合成和折叠以及DNA复制、重组及修复。
病毒感染特异性影响的基因列表(见表67和68)。具体地，从设计的顺序统计学方法，在
888和1936细胞系中分别有507和480个基因被影响。在施加90％过滤后，鉴定了400个
在888-MEL细胞系中变化的基因和370个在1936-MEL细胞系中变化的基因，总共鉴定了
703个由于病毒感染而特异性变化的人类基因。病毒影响的基因涉及广泛细胞功能，如细胞
死亡、细胞生长及增殖、蛋白质合成和折叠以及DNA复制、重组及修复。
[0858]
[0859]
[0860]
[0861]
[0862]
[0863]
[0864]
[0865]
[0866]
[0867]
[0868]
[0869]
[0870]
[0871]
[0872]
[0873]
[0874]
[0875]
[0876]
[0877]
[0878]
[0879]
[0880] b.痘苗病毒基因转录变化
[0881] 分析了3个阵列簇(对照，2hpi；早期基因以及10hpi；晚期基因)。另外，也分析了4个主要基因簇(C1，C2，C3a/3B和C4)。阵列簇显示时间点和感染最影响基因表达模式，
如基于对照、2hpi和10hpi之间的分离所示。基因簇显示特异性模式，由此反映了不同时间
表达类别和功能类别如：VACV的进入及传播，VACV的结构及组装，VACV的DNA复制及RNA
转录，宿主相互作用及免疫调节，以及其它/未知功能。结果显示在2和10hpi有相似的早
期/晚期基因表达并且所述基因散布在所有类别中。由于基因富集在结构及聚集类别，在
10hpi有晚期基因的增加表达，。在10hpi，富集在DNA复制/RNA转录类别的早期及早期/
晚期基因的表达降低。在2和10hpi富集在DNA复制/RNA转录及宿主相互作用/免疫调
节物中的早期及早期/晚期基因也有相似的高表达。因此，结果显示在感染后痘苗病毒基
因转录随时间的变化涉及参与痘苗病毒进入及传播、结构及组装、DNA复制/RNA转录、宿主
相互作用/免疫调节的基因。其它未知功能的基因也与转录变化相关。
如基于对照、2hpi和10hpi之间的分离所示。基因簇显示特异性模式，由此反映了不同时间
表达类别和功能类别如：VACV的进入及传播，VACV的结构及组装，VACV的DNA复制及RNA
转录，宿主相互作用及免疫调节，以及其它/未知功能。结果显示在2和10hpi有相似的早
期/晚期基因表达并且所述基因散布在所有类别中。由于基因富集在结构及聚集类别，在
10hpi有晚期基因的增加表达，。在10hpi，富集在DNA复制/RNA转录类别的早期及早期/
晚期基因的表达降低。在2和10hpi富集在DNA复制/RNA转录及宿主相互作用/免疫调
节物中的早期及早期/晚期基因也有相似的高表达。因此，结果显示在感染后痘苗病毒基
因转录随时间的变化涉及参与痘苗病毒进入及传播、结构及组装、DNA复制/RNA转录、宿主
相互作用/免疫调节的基因。其它未知功能的基因也与转录变化相关。
[0882] c.复制效率
[0883] 从0-10hpi时间点获得的病毒效价的生长曲线确定复制效率。效价以每106细胞的噬斑形成单位表示。对于所有测试的病毒，复制效率在最初2hpi降低，但是然后在10hpi
以时间相关方式稳步增加。GLV-1h68展示最低复制效率。尽管LIVP6.1.1显示最高效价，
LIVP1.1.1，LIVP5.1.1和LIVP6.1.1展示相似复制效率。LIVP5.1.1和LIVP1.1.1显示相
当的复制效率。
以时间相关方式稳步增加。GLV-1h68展示最低复制效率。尽管LIVP6.1.1显示最高效价，
LIVP1.1.1，LIVP5.1.1和LIVP6.1.1展示相似复制效率。LIVP5.1.1和LIVP1.1.1显示相
当的复制效率。
[0884] 复制效率与痘苗病毒基因转录水平相比较。用7个痘苗病毒早期基因(V149，V194，V189，V104，V069，V167和V106)通过表达水平的等级 聚类(hierarchical
clustering)进行相关性分析。在一组7个病毒早期基因中的基因表达水平的等级与
在2hpi的各自复制效率匹配(见表69和70，其描述了在2hpi的基因表达水平)。与复
制效率结果相似，GLV-1h68显示最低平均基因转录水平，而LIVP6.1.1显示最高表达值。
LIVP1.1.1和LIVP5.1.1在2hpi显示相当的转录水平。这些数据表明痘苗病毒早期基因转
录和痘苗病毒早期基因组复制之间的相关性。
clustering)进行相关性分析。在一组7个病毒早期基因中的基因表达水平的等级与
在2hpi的各自复制效率匹配(见表69和70，其描述了在2hpi的基因表达水平)。与复
制效率结果相似，GLV-1h68显示最低平均基因转录水平，而LIVP6.1.1显示最高表达值。
LIVP1.1.1和LIVP5.1.1在2hpi显示相当的转录水平。这些数据表明痘苗病毒早期基因转
录和痘苗病毒早期基因组复制之间的相关性。
[0885]
[0886]
[0887] 另外，复制效率还与人类基因转录水平进行了比较。结果显示114个人类基因显2
示与平均痘苗病毒早期基因转录强相关(R ≥0.6)。这些基因整理在如下网络中：翻译后
修饰、基因表达、细胞死亡及细胞生长和增殖。顶级分子功能是细胞周期、细胞运动、生长
和繁殖及细胞与细胞信号传导。用通过转录行为鉴定病毒候选基因观察是否有人类基因
可以影响这些病毒基因并因此影响复制效率，所述病毒候选基因是病毒复制的特征。具有
2
与病毒转录的最强阳性相关性的人类基因(Pearson相关性，R ＝0.8)是MLL5，LRRFIP2，
CSRNP2，EFHD1，TXNRD3，ARFIP2，ENTPD6，ITPKA，YTHDF2，MRSPS11和PREP，所述相关性是通过表达水平的等级聚类进行的相关性分析确定的。宿主基因表达与病毒候选基因之间的相
关性分析揭示了与一组人类基因的强阴性或阳性相关性。
示与平均痘苗病毒早期基因转录强相关(R ≥0.6)。这些基因整理在如下网络中：翻译后
修饰、基因表达、细胞死亡及细胞生长和增殖。顶级分子功能是细胞周期、细胞运动、生长
和繁殖及细胞与细胞信号传导。用通过转录行为鉴定病毒候选基因观察是否有人类基因
可以影响这些病毒基因并因此影响复制效率，所述病毒候选基因是病毒复制的特征。具有
2
与病毒转录的最强阳性相关性的人类基因(Pearson相关性，R ＝0.8)是MLL5，LRRFIP2，
CSRNP2，EFHD1，TXNRD3，ARFIP2，ENTPD6，ITPKA，YTHDF2，MRSPS11和PREP，所述相关性是通过表达水平的等级聚类进行的相关性分析确定的。宿主基因表达与病毒候选基因之间的相
关性分析揭示了与一组人类基因的强阴性或阳性相关性。
[0888] 3.总结
[0889] 结果显示病毒复制、早期基因表达盒各自宿主应答之间的直接相关性。
[0890] 实施例14：命名为STSA-1的犬软组织肉瘤(CSTS)细胞系的产生
[0891] 细胞系STSA-1来源于自7岁雄性阉割的金毛猎犬的肿瘤，其在左前肢有结实、疼痛性红斑肿物。肿物经手术切下(surgically debulked)，并切下深屈肌和屈腕肌，因为它
们已被肿瘤广泛浸润。对象经历全程放疗。在3个月复查时，胸X光照片和腹部超声显示
无转移迹象，但是左前肢X光照片揭示una末端、桡骨尾末端和腕骨严重溶解。肿大的左肩
胛骨前淋巴结(enlarged left prescapular lymph node)的细针抽吸物通过细胞学诊断
为转移性间质肿瘤。在这时，对该肢进行截肢并取出肿大淋巴结。对该肢和axiallary也
许是腋生的(axillary)及肩胛骨前淋巴结的福尔马林固定样品的组织学证实，其损伤与
中间级软组织肉瘤一致，伴有血管侵袭、肿瘤细胞浸润至骨髓腔及转移至引流淋巴结。
们已被肿瘤广泛浸润。对象经历全程放疗。在3个月复查时，胸X光照片和腹部超声显示
无转移迹象，但是左前肢X光照片揭示una末端、桡骨尾末端和腕骨严重溶解。肿大的左肩
胛骨前淋巴结(enlarged left prescapular lymph node)的细针抽吸物通过细胞学诊断
为转移性间质肿瘤。在这时，对该肢进行截肢并取出肿大淋巴结。对该肢和axiallary也
许是腋生的(axillary)及肩胛骨前淋巴结的福尔马林固定样品的组织学证实，其损伤与
中间级软组织肉瘤一致，伴有血管侵袭、肿瘤细胞浸润至骨髓腔及转移至引流淋巴结。
[0892] 从肿瘤无菌分离细胞用于培养。简而言之，手术切下肿瘤，将脂肪和坏死组织从2
未固定肿瘤部分除去。然后将肿物切碎成1mm正方体块，置于25cm 细胞培养瓶(Nunc，
Wiesbaden，Germany)，在室温贴壁10分钟，随后加入具有Earle盐并添加2mM谷氨酰胺、
50U/mL青霉素G、50μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和10％FBS的最低
基本培养基(MEM-C)，然后在37℃，5％CO2和100％湿度下孵育。当细胞覆盖大约80％培
养瓶表面进行胰蛋白酶化和培养细胞传代，或者如果组织移植物变坏则更早进行。一旦建
立原代培养物，则在具有10％FBS的MEM-C中培养，并如上孵育。
未固定肿瘤部分除去。然后将肿物切碎成1mm正方体块，置于25cm 细胞培养瓶(Nunc，
Wiesbaden，Germany)，在室温贴壁10分钟，随后加入具有Earle盐并添加2mM谷氨酰胺、
50U/mL青霉素G、50μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和10％FBS的最低
基本培养基(MEM-C)，然后在37℃，5％CO2和100％湿度下孵育。当细胞覆盖大约80％培
养瓶表面进行胰蛋白酶化和培养细胞传代，或者如果组织移植物变坏则更早进行。一旦建
立原代培养物，则在具有10％FBS的MEM-C中培养，并如上孵育。
[0893] 经细胞化学及免疫细胞化学染色分析细胞类型。简而言之，原代细胞在35mm直径平板(Nunc)中如上所述生长。然后以胰蛋白酶消化细胞，并将其收集在含有10％FBS的
MEM-C中，在400xg离心5分钟使其沉淀。细胞沉淀悬浮于1mL磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)
中，从中取100μL小份在1000rpm冷冻离心3分钟至带电玻璃滑块上。随后，贴壁细胞
与BCIP/NBT磷酸酶底物(KPL，Inc.，Gaithersburg，Maryland，USA)孵育10分钟以检测
碱性磷酸酶(ALP)活性，该活性可在衍生自骨骼、肝、肾和小肠的细胞中检测到。贴壁细
胞还直接用小鼠抗犬CD18单克隆抗体(CA16.3C10，from Dr.Peter Moore，University
of California，Davis，CA)进行免疫染色，CD18是组织细胞的细胞标记。另外的玻片在
decloacking chamber(Biocare Medical，Concord，CA)中进行抗原获取，并与小鼠单克隆
抗AEL和抗AE3抗体的混合物(Biogenex，San Ramon，CA)孵育以检测细胞角蛋白(在表皮
来源的细胞中发现)，或者与小鼠单克隆抗波形蛋白抗体(V-9，Biogenex)(存在于间充质
细胞中)孵育。结果显示细胞对于波形蛋白呈阳性，但是对其它蛋白质呈阴性，这支持了软
组织肉瘤诊断。
MEM-C中，在400xg离心5分钟使其沉淀。细胞沉淀悬浮于1mL磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)
中，从中取100μL小份在1000rpm冷冻离心3分钟至带电玻璃滑块上。随后，贴壁细胞
与BCIP/NBT磷酸酶底物(KPL，Inc.，Gaithersburg，Maryland，USA)孵育10分钟以检测
碱性磷酸酶(ALP)活性，该活性可在衍生自骨骼、肝、肾和小肠的细胞中检测到。贴壁细
胞还直接用小鼠抗犬CD18单克隆抗体(CA16.3C10，from Dr.Peter Moore，University
of California，Davis，CA)进行免疫染色，CD18是组织细胞的细胞标记。另外的玻片在
decloacking chamber(Biocare Medical，Concord，CA)中进行抗原获取，并与小鼠单克隆
抗AEL和抗AE3抗体的混合物(Biogenex，San Ramon，CA)孵育以检测细胞角蛋白(在表皮
来源的细胞中发现)，或者与小鼠单克隆抗波形蛋白抗体(V-9，Biogenex)(存在于间充质
细胞中)孵育。结果显示细胞对于波形蛋白呈阳性，但是对其它蛋白质呈阴性，这支持了软
组织肉瘤诊断。
[0894] 多重物种特异性PCR及短串联重复分析也证实该细胞是犬来源的(O’Donoghue etal.(2011)J.Vet.Diagn.Invest.，23：780-785)。
[0895] 实施例15：LIVP1.1.1、LIVP5.1.1和LIVP6.1.1在各种犬癌细胞系及犬异种移植小鼠模型中的作用
[0896] 1.LIVP1.1.1，LIVP5.1.1和LIVP6.1.1抗一组犬癌细胞系的体外治疗作用
[0897] 独立地用痘苗病毒GLV-1h68，GLV-1h109，GLV-1h163，LIVP1.1.1.，LIVP5.1.1和/或LIVP6.1.1中的一种以感染复数(MOI)为0.1或1.0感染生长在24孔平板中的各种犬
癌细胞系，如表70所示。测试的犬癌细胞系是：STSA-1(如实施例14所述)，DT08/40(由
Dr.Nolte提供，Small Animal Clinic，University of Veterinary Medicine Hannover，
Germany)，D17(ATCC#CCL-183)或CHAS(由Dr.Greg Ogilvie提供，Angel Care Center，
Carlsbad，CA)。细胞在37℃孵育1小时，每20分钟温和振荡。然后，除去感染培养基并用
新鲜生长培养基置换。在感染后1、6、24、48、72和96小时收集病毒上清和细胞裂解物，评
估与治疗作用相关的各种参数，包括病毒复制和细胞毒性。
癌细胞系，如表70所示。测试的犬癌细胞系是：STSA-1(如实施例14所述)，DT08/40(由
Dr.Nolte提供，Small Animal Clinic，University of Veterinary Medicine Hannover，
Germany)，D17(ATCC#CCL-183)或CHAS(由Dr.Greg Ogilvie提供，Angel Care Center，
Carlsbad，CA)。细胞在37℃孵育1小时，每20分钟温和振荡。然后，除去感染培养基并用
新鲜生长培养基置换。在感染后1、6、24、48、72和96小时收集病毒上清和细胞裂解物，评
估与治疗作用相关的各种参数，包括病毒复制和细胞毒性。
[0898]
[0899] a.病毒复制
[0900] 在收集的细胞裂解物的3次冻融循环后，裂解物的系列稀释液如上所述在CV-1细胞上经标准噬斑测定进行滴定。所有样品一式三份进行测量。结果显示在所有细胞系中均
观测到由所有测试的病毒株的有效病毒复制。效价通常在48或72小时增加超过100倍。
观测到由所有测试的病毒株的有效病毒复制。效价通常在48或72小时增加超过100倍。
[0901] b.细胞毒性
[0902] 通过用MTT实验(Sigman，Taufkirchen，Germany)测量感染细胞的存活性，由此评估细胞毒性。在细胞感染后24、48、72或96小时，用0.5mL MTT溶液置换培养基，所述MTT
溶液为MTT以2.5mg/mL的浓度溶解在不含酚红的RPMI1640中，在5％CO2气氛中于37℃
孵育2小时。除去MTT溶液后，通过加入在异丙醇中稀释的1N HCl而终止颜色反应。在
570nm波长测量光密度。未感染细胞用作参照并认为其是100％活的。结果示于表71，并描
述了在感染后72小时的被杀伤细胞的百分比(hpi；LIVP6.1.1在DT08/40上的细胞毒性是
在96hpi评估)。
溶液为MTT以2.5mg/mL的浓度溶解在不含酚红的RPMI1640中，在5％CO2气氛中于37℃
孵育2小时。除去MTT溶液后，通过加入在异丙醇中稀释的1N HCl而终止颜色反应。在
570nm波长测量光密度。未感染细胞用作参照并认为其是100％活的。结果示于表71，并描
述了在感染后72小时的被杀伤细胞的百分比(hpi；LIVP6.1.1在DT08/40上的细胞毒性是
在96hpi评估)。
[0903]
[0904] *在感染后96小时(hpi)的细胞毒性活性
[0905] 2.LIVP1.1.1、LIVP5.1.1和LIVP6.1.1对犬生长及治疗的作用
[0906] 产生了软组织肉瘤异种移植模型(STSA-1)、犬黑素瘤异种移植模型(CHAS)、犬骨肉瘤异种移植模型(D17)及犬前列腺癌异种移植物生长模型(DT08/40)以测试病毒株的体
内作用。
内作用。
[0907] a.犬软组织肉瘤
[0908] 通过一周两次共八周(病毒感染后42天)测量用病毒治疗的荷瘤小鼠中的肿瘤体积，对GLV-1h68、GLV-1h109、LIVP1.1.1、LIVP5.1.1和LIVP6.1.1治疗软组织肉瘤肿瘤
6
皮下异种移植物的进展的作用进行体内评估。通过将1x10STSA-1犬软组织肉瘤细胞皮下
nu
植入到6-8周龄雌性裸鼠(NCI/Hsd/Athymic Nude-Foxnl )的右后腿而产生肿瘤。植入后
3
4周，所有小鼠均产生体积为400-500mm 的肿瘤。
6
皮下异种移植物的进展的作用进行体内评估。通过将1x10STSA-1犬软组织肉瘤细胞皮下
nu
植入到6-8周龄雌性裸鼠(NCI/Hsd/Athymic Nude-Foxnl )的右后腿而产生肿瘤。植入后
3
4周，所有小鼠均产生体积为400-500mm 的肿瘤。
[0909] 1)GLV-1h68、LIVP1.1.1、LIVP5.1.17
[0910] 在第28天，静脉内注射单剂(1x10pfu)GLV-1h68、LIVP1.1.1或LIVP5.1.1进侧尾静脉中(i.v.)。对照动物i.v.仅注射PBS(n＝6/组)。每周测量肿瘤体积2次。由
3
于过量肿瘤负荷(>3000mm)，在病毒感染后21天杀死对照组的所有动物。结果显示全身
性施用GLV-1h68、LIVP1.1.1或LIVP5.1.1导致与对照小鼠相比肿瘤生长显著抑制。尽管
LIVP5.1.1和GLV-1h68与对照动物相比均降低肿瘤生长，但是这些治疗组的6个小鼠中有
3
2个至病毒感染后35天产生体积大于3000mm 的肿瘤。这些结果表明LIVP1.1.1相比于
GLV-1h68或者LIVP5.1.1具有更高的抗软组织肉瘤异种异种物的溶瘤潜力。
3
于过量肿瘤负荷(>3000mm)，在病毒感染后21天杀死对照组的所有动物。结果显示全身
性施用GLV-1h68、LIVP1.1.1或LIVP5.1.1导致与对照小鼠相比肿瘤生长显著抑制。尽管
LIVP5.1.1和GLV-1h68与对照动物相比均降低肿瘤生长，但是这些治疗组的6个小鼠中有
3
2个至病毒感染后35天产生体积大于3000mm 的肿瘤。这些结果表明LIVP1.1.1相比于
GLV-1h68或者LIVP5.1.1具有更高的抗软组织肉瘤异种异种物的溶瘤潜力。
[0911] 在第二组实验中(n＝4)，单次i.v.注射LIVP1.1.1进入犬软组织肉瘤STSA-1异种移植物中在42天期间导致近乎完全的肿瘤消退，并且未观测到毒性。
[0912] 另外，在长期存活实验中，与PBS处理的对照小鼠相比，注射LIVP1.1.1导致携带肉瘤小鼠的存活的显著改善(P＝0.0039，双向方差分析(ANOVA)及Bonferroni
post-test)。
post-test)。
[0913] 2)GLV-1h109和LIVP6.1.1
[0914] GLV-1h109和LIVP6.1.1的治疗作用在上述相同模型中进行了评估。在此情况中，在注射病毒之前的中间(medial)起始肿瘤体积是植入后5周测量的，其时所有小鼠均产生
3
体积为600-1000mm 的肿瘤，代表肿瘤发生的晚期。将动物分成4组(n＝6/组)并静脉内
7 7 6
注射单剂GLV-1h68(1x10pfu)、LIVP6.1.1(1x10pfu)、LIVP6.1.1(5x10pfu)或PBS到侧尾
3
静脉。每周测量肿瘤体积2次。由于过量肿瘤负荷(>3000mm)，对照PBS组的所有动物在
感染后14天均安乐死。与对照动物相比，肿瘤生长的抑制通常在所有测试时间点对于所有
病毒治疗组都是相同的，并且导致与对照相比显著的肿瘤生长差异。例如，在感染后第21、
3 3
28和35天，所有病毒治疗组的肿瘤体积是在大约500mm 至大约1000mm，表明与对照动物
7 6
相比肿瘤负荷的实质降低。在用1x10pfu或5x10pfu LIVP6.1.1治疗的动物之间，结果是
相似的。
3
体积为600-1000mm 的肿瘤，代表肿瘤发生的晚期。将动物分成4组(n＝6/组)并静脉内
7 7 6
注射单剂GLV-1h68(1x10pfu)、LIVP6.1.1(1x10pfu)、LIVP6.1.1(5x10pfu)或PBS到侧尾
3
静脉。每周测量肿瘤体积2次。由于过量肿瘤负荷(>3000mm)，对照PBS组的所有动物在
感染后14天均安乐死。与对照动物相比，肿瘤生长的抑制通常在所有测试时间点对于所有
病毒治疗组都是相同的，并且导致与对照相比显著的肿瘤生长差异。例如，在感染后第21、
3 3
28和35天，所有病毒治疗组的肿瘤体积是在大约500mm 至大约1000mm，表明与对照动物
7 6
相比肿瘤负荷的实质降低。在用1x10pfu或5x10pfu LIVP6.1.1治疗的动物之间，结果是
相似的。
[0915] b.犬黑素瘤异种移植物生长
[0916] 通过一周一次共八周，测量用病毒治疗的荷瘤小鼠中的肿瘤体积，对GLV-1h1636
和LIVP6.1.1治疗犬黑素瘤异种移植物的进展的作用进行体内评估。通过将5x10CHAS细
nu；
胞皮下注射到雄性裸鼠(Hsd/Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，IN)的右侧
3
大腿而产生肿瘤。植入后3周，所有小鼠均产生体积为400-500mm 的肿瘤。植入后3周，
6
各组小鼠(n＝5-6)眼窝后注射2x10pfu的LIVP6.1.1或GLV-1h163或PBS。每周测量一
次肿瘤体积。结果显示GLV-1h163在感染后42天导致肿瘤生长显著延迟，但是LIVP6.1.1
3
不导致。在感染后42天，GLV-1h63治疗小鼠的肿瘤体积为大约2000mm，而对照小鼠或者
3
LIVP6.1.1治疗小鼠的肿瘤体积为大约4000mm。来自对照和LIVP6.1.1治疗组的小鼠在
第42天安乐死。
和LIVP6.1.1治疗犬黑素瘤异种移植物的进展的作用进行体内评估。通过将5x10CHAS细
nu；
胞皮下注射到雄性裸鼠(Hsd/Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，IN)的右侧
3
大腿而产生肿瘤。植入后3周，所有小鼠均产生体积为400-500mm 的肿瘤。植入后3周，
6
各组小鼠(n＝5-6)眼窝后注射2x10pfu的LIVP6.1.1或GLV-1h163或PBS。每周测量一
次肿瘤体积。结果显示GLV-1h163在感染后42天导致肿瘤生长显著延迟，但是LIVP6.1.1
3
不导致。在感染后42天，GLV-1h63治疗小鼠的肿瘤体积为大约2000mm，而对照小鼠或者
3
LIVP6.1.1治疗小鼠的肿瘤体积为大约4000mm。来自对照和LIVP6.1.1治疗组的小鼠在
第42天安乐死。
[0917] c.犬骨肉瘤异种移植物生长
[0918] 通过一周一次共八周，测量用病毒治疗的荷瘤小鼠中的肿瘤体积，对GLV-1h1636
和LIVP6.1.1治疗犬骨肉瘤异种移植物的进展的作用进行体内评估。通过将5x10D17细胞
nu；
皮下注射到雄性裸鼠(Hsd/Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，IN)的右侧大
6
腿而产生肿瘤。植入后44天，各组小鼠(n＝5-6/组)眼窝后注射2x10pfu的LIVP6.1.1
或GLV-1h163病毒。对照组小鼠施用PBS。结果显示，在感染后第21天开始，用LIVP6.1.1
和GLV-1h163治疗均延迟骨肉瘤生长。例如，在第28-42天(在第28、35和42天测量)，
3 3
LIVP6.1.1或GLV-1h163治疗的动物的肿瘤体积是大约1200mm 至2500mm，而在这些时间
3 3 3
点的对照动物显示肿瘤生长稳步增加，肿瘤体积分别为大约2800mm、3800mm 和7800mm。
和LIVP6.1.1治疗犬骨肉瘤异种移植物的进展的作用进行体内评估。通过将5x10D17细胞
nu；
皮下注射到雄性裸鼠(Hsd/Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Indianapolis，IN)的右侧大
6
腿而产生肿瘤。植入后44天，各组小鼠(n＝5-6/组)眼窝后注射2x10pfu的LIVP6.1.1
或GLV-1h163病毒。对照组小鼠施用PBS。结果显示，在感染后第21天开始，用LIVP6.1.1
和GLV-1h163治疗均延迟骨肉瘤生长。例如，在第28-42天(在第28、35和42天测量)，
3 3
LIVP6.1.1或GLV-1h163治疗的动物的肿瘤体积是大约1200mm 至2500mm，而在这些时间
3 3 3
点的对照动物显示肿瘤生长稳步增加，肿瘤体积分别为大约2800mm、3800mm 和7800mm。
[0919] d.犬前列腺癌异种移植物生长
[0920] 通过一周一次共七周，测量用病毒治疗的荷瘤小鼠中的肿瘤体积，对GLV-1h1096
和LIVP6.1.1治疗犬前列腺癌进展的作用进行体内评估。通过将5x10DT08/40细胞皮下
nu；
植入6-8周龄裸鼠(NCI/Hsd/Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Winkelmann GmbH，Borchen，
和LIVP6.1.1治疗犬前列腺癌进展的作用进行体内评估。通过将5x10DT08/40细胞皮下
nu；
植入6-8周龄裸鼠(NCI/Hsd/Athymic Nude-Foxnl ；Harlan，Winkelmann GmbH，Borchen，
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 三维计算机断层扫描量规 | 2020-05-14 | 716 |
| 一种计算机断层扫描系统 | 2020-05-14 | 948 |
| 谱计算机断层扫描指纹识别 | 2020-05-13 | 549 |
| 计算机断层扫描系统和进行计算机断层扫描的方法 | 2020-05-12 | 351 |
| 标记方法和计算机化断层扫描设备 | 2020-05-14 | 123 |
| 计算机断层扫描设备、计算单元和计算机断层扫描系统 | 2020-05-12 | 771 |
| 用于计算机断层扫描仪的方法和计算机断层扫描仪 | 2020-05-12 | 796 |
| 电子计算机X射线断层扫描仪 | 2020-05-13 | 865 |
| 计算机断层扫描设备 | 2020-05-11 | 352 |
| 计算机断层扫描系统 | 2020-05-11 | 875 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈