一种二酚类与环己醇酮类组合物在制备抗菌药物中的应用
阅读：49发布：2020-05-17
专利汇可以提供一种二酚类与环己醇酮类组合物在制备抗菌药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种二酚类与环己醇 酮 类组合物在制备抗菌药物中的应用，其属于药物制备的技术领域。二酚类化合物单用时具有较好的抑菌效果，如苯二酚的 最低抑菌浓度 为20μM，环己醇酮类化合物单用时抑菌效果一般，其最低抑菌浓度大于200μM。当二酚类化合物与环己醇酮类化合物按 质量 比1:1‑10制备抗菌药物时，其抑菌效果明显强于单独使用二酚类化合物或环己醇酮类化合物的效果。并且二酚类化合物：环己醇酮类化合物的质量比1:10应用于抗菌药物时，抑菌效果最好。二酚类与环己醇酮类化合物的组合物具有疗效可靠，无毒 副作用 、资源丰富、价格低廉等优点。，下面是一种二酚类与环己醇酮类组合物在制备抗菌药物中的应用专利的具体信息内容。
一种二酚类与环己醇酮类组合物在制备抗菌药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种二酚类与环己醇酮类组合物在制备抗菌药物中的应用，其属于药物制备的技术领域。
背景技术
[0002] 金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属。有“嗜肉菌"的别称。可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。抗生素是目前治疗金黄色葡萄球菌感染的主要药物，但抗生素滥用是一个世界性的问题，抗生素滥用的结果就是导致大量耐药菌的产生。耐药性金黄色葡萄球菌就是临床耐药菌中常见且意义重大的一类耐药菌。多药耐药的金黄色葡萄球菌感染十分普遍，是院内和社区感染的主要致病菌。
目前多药耐药的MRSA感染的治疗一直是困扰临床的十分棘手的难题之一，对于该菌的临床治疗多选择万古霉素，其被认为是治疗MRSA的最后一道防线。但新发现了中介度耐万古霉素的耐药性金黄色葡萄球菌，目前我国临床分离的金黄色葡萄球菌中约三分之一也都是耐药株。临床上对于新药的需求迫在眉睫。本发明所涉及的三种共两类化合物，化合物1（氢醌）抗菌活性良好，最低抑菌浓度达到20 μM，并且在化合物2（千里光内酯）或化合物3（连翘环己醇酮）和化合物1联用之后，极大地增强了化合物1的抗菌活性。
目前多药耐药的MRSA感染的治疗一直是困扰临床的十分棘手的难题之一，对于该菌的临床治疗多选择万古霉素，其被认为是治疗MRSA的最后一道防线。但新发现了中介度耐万古霉素的耐药性金黄色葡萄球菌，目前我国临床分离的金黄色葡萄球菌中约三分之一也都是耐药株。临床上对于新药的需求迫在眉睫。本发明所涉及的三种共两类化合物，化合物1（氢醌）抗菌活性良好，最低抑菌浓度达到20 μM，并且在化合物2（千里光内酯）或化合物3（连翘环己醇酮）和化合物1联用之后，极大地增强了化合物1的抗菌活性。
[0003] 但目前未见关于上述化合物其抗金黄色葡萄球菌和耐药型金黄色葡萄球菌作用的报道。
发明内容
[0004] 本发明涉及一种二苯酚物质与天然环己醇酮类成分组合在制备药物中的新用途，尤其是在制备抗菌药物中的应用。本发明的技术解决方案是：一种二酚类与环己醇酮类组合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述二酚类化合物的结构通式为： ，其中：R1、R2及R3中的三个取代基中的一个为-OH或-OMe，另外的两个取代基为H；
所述环己醇酮类化合物的结构通式为： ，其中：R4为H或O；
按二酚类化合物：环己醇酮类化合物的质量比1:1-10应用于抗菌药物的制备。
所述环己醇酮类化合物的结构通式为： ，其中：R4为H或O；
按二酚类化合物：环己醇酮类化合物的质量比1:1-10应用于抗菌药物的制备。
[0005] 本发明的有益效果为：二酚类化合物单用时具有较好的抑菌效果，如苯二酚的最低抑菌浓度为20μM，环己醇酮类化合物单用时抑菌效果一般，其最低抑菌浓度大于200μM。当二酚类化合物与环己醇酮类化合物按质量比1:1-10制备抗菌药物时，其抑菌效果明显强于单独使用二酚类化合物或环己醇酮类化合物的效果。并且二酚类化合物：环己醇酮类化合物的质量比1:10应用于抗菌药物时，抑菌效果最好。二酚类与环己醇酮类化合物的组合物具有疗效可靠，无毒副作用、资源丰富、价格低廉等优点。
附图说明
附图说明
[0006] 图1是连翘中活性单体化合物结构式。
[0007] 图2是单体化合物在固体琼脂培养基中抑菌活性图。
[0008] 图3是单体化合物联合用药作用抑菌活性图。图中，化合物2或3与化合物1对金葡菌（标准株、耐药株）联合抗菌活性作用（浓度单位：μM）。
具体实施方式
[0009] 实施例1 单体类成分对苯二酚及其与天然环己醇酮类成分联合应用后的体外抗菌活性1．活性化合物的分离鉴定：
首先利用制备型中压液相对中药连翘的乙酸乙酯提取层进行粗略馏分分段共得到22个馏分；然后进一步的抗菌试验筛选得出4号组分（F4）具有最好的抗菌活性，继续将该组份中单体化合物通过高效液相色谱仪进行详细分离，流动相为乙腈-水（90：10）和乙腈，使用以下分离条件：0.0–30.0 min, 95% A, 30.0 – 40.0 min, 95% –20% A, 40.0 –50.0 min, 20% A, 50 – 55 min, 20% - 95% A。流速为10mL/min，进样量为20 mg/mL的样品100 μl。紫外检测器信号接收在225 nm，最后分离得到了化合物1、2、3并通过质谱和核磁共振色谱进行结构分析后，得到三个单体化合物并确定结构。
首先利用制备型中压液相对中药连翘的乙酸乙酯提取层进行粗略馏分分段共得到22个馏分；然后进一步的抗菌试验筛选得出4号组分（F4）具有最好的抗菌活性，继续将该组份中单体化合物通过高效液相色谱仪进行详细分离，流动相为乙腈-水（90：10）和乙腈，使用以下分离条件：0.0–30.0 min, 95% A, 30.0 – 40.0 min, 95% –20% A, 40.0 –50.0 min, 20% A, 50 – 55 min, 20% - 95% A。流速为10mL/min，进样量为20 mg/mL的样品100 μl。紫外检测器信号接收在225 nm，最后分离得到了化合物1、2、3并通过质谱和核磁共振色谱进行结构分析后，得到三个单体化合物并确定结构。
[0010] 所得上述化合物1，化合物2，化合物3的1H-NMR和13C-NMR谱，通过同已知成分NMR数据的比较，分别确定为氢醌，千里光内酯，连翘环己醇酮。
[0011] 2. 药品与试剂：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（标准株）、大肠杆菌（标准株）、绿脓杆菌（209）、乙性溶血性链菌（10）均购自中国药品生物制品检定所菌种室和中国中医科学院中药研究所新药研发中心，肺炎克雷伯菌（标准株）购自中国典型培养物保藏中心，金黄色葡萄球菌（耐药株）由吉林大学中日联谊医院提供。营养肉汤、牛肉粉、蛋白胨，均为北京奥博星生物技术有限责任公司产品。酵母提取物、胰化蛋白胨，均为英国OXOID公司产品。
[0012] 实施例2 抗菌活性测定：化合物最低抑菌浓度（MIC）的测定
对单体化合物进行最低抑菌浓度的测定，参照CLSI（美国临床标准协会）M07-A9微量肉汤稀释法。600 nm OD值为1的菌液用麦氏比浊管稀释至0.5麦氏比浊度，继续稀释1000倍得到实验用菌液，备用。继续进行抗菌活性分析，利用96孔板，第2-11列加入单体化合物，化合物终浓度依次为200 μM, 100 μM, 50 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM,
0.2 μM，同时设置空白对照（第1列）和阴性对照组（第12列），37℃培养24 h，菌液完全澄清的最低单体化合物浓度可认为是最低抑菌浓度。
对单体化合物进行最低抑菌浓度的测定，参照CLSI（美国临床标准协会）M07-A9微量肉汤稀释法。600 nm OD值为1的菌液用麦氏比浊管稀释至0.5麦氏比浊度，继续稀释1000倍得到实验用菌液，备用。继续进行抗菌活性分析，利用96孔板，第2-11列加入单体化合物，化合物终浓度依次为200 μM, 100 μM, 50 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM,
0.2 μM，同时设置空白对照（第1列）和阴性对照组（第12列），37℃培养24 h，菌液完全澄清的最低单体化合物浓度可认为是最低抑菌浓度。
[0013] 表1. 化合物1、2、3的最小抑菌浓度（MIC）固体培养基平板抑菌实验
在37℃细菌震荡箱内分别培养各受试细菌至600 nm OD值为1后，将原菌液10倍梯度稀释10-11倍，铺制96孔板，每孔200 μl，在96孔板中第12列加入空白培养基，1-11列依次加入稀释后10-1-10-11浓度的菌液，37℃培养18-24 h，观察。细菌可以正常生长的最小浓度为药物筛选实验菌液浓度。配制营养肉汤固体培养基，将实验菌液浓度的菌液，取100 μl分别加入终浓度为50 μg/ml的乙酸乙酯层萃取物、5 μg/ml的4号组分、2 μg/ml（MIC）的化合物
1，混匀后均匀涂布到琼脂平板培养基上，37℃培养24h后观察细菌生长状况。
在37℃细菌震荡箱内分别培养各受试细菌至600 nm OD值为1后，将原菌液10倍梯度稀释10-11倍，铺制96孔板，每孔200 μl，在96孔板中第12列加入空白培养基，1-11列依次加入稀释后10-1-10-11浓度的菌液，37℃培养18-24 h，观察。细菌可以正常生长的最小浓度为药物筛选实验菌液浓度。配制营养肉汤固体培养基，将实验菌液浓度的菌液，取100 μl分别加入终浓度为50 μg/ml的乙酸乙酯层萃取物、5 μg/ml的4号组分、2 μg/ml（MIC）的化合物
1，混匀后均匀涂布到琼脂平板培养基上，37℃培养24h后观察细菌生长状况。
[0014] 实施例3 化合物1与化合物2的联合抗菌作用通过最低抑菌浓度的测定，化合物1抗菌活性最好，最低抑菌浓度为20 μM。进行化合物
2与化合物1混合后的抗菌活性分析，固定化合物1终浓度为4 μM，其他单体化合物终浓度从
20 μM-0 μM梯度变化，两两混合为第一组实验组。将其他单体化合物按照终浓度20 μM-0 μM加入96孔板为第二组实验组。设置空白对照和阴性对照，实验用菌液浓度参照最低抑菌浓度的测定，37℃培养24 h，测定600 nm OD值。
2与化合物1混合后的抗菌活性分析，固定化合物1终浓度为4 μM，其他单体化合物终浓度从
20 μM-0 μM梯度变化，两两混合为第一组实验组。将其他单体化合物按照终浓度20 μM-0 μM加入96孔板为第二组实验组。设置空白对照和阴性对照，实验用菌液浓度参照最低抑菌浓度的测定，37℃培养24 h，测定600 nm OD值。
[0015] 实施例4化合物1与化合物3的联合抗菌作用通过最低抑菌浓度的测定，化合物1抗菌活性最好，最低抑菌浓度为20 μM。进行化合物
3与化合物1混合后的抗菌活性分析，固定化合物1终浓度为4 μM，其他单体化合物终浓度从
20 μM-0 μM梯度变化，两两混合为第一组实验组。将其他单体化合物按照终浓度20 μM-0 μM加入96孔板为第二组实验组。设置空白对照和阴性对照，实验用菌液浓度参照最低抑菌浓度的测定，37℃培养24 h，测定600 nm OD值。
3与化合物1混合后的抗菌活性分析，固定化合物1终浓度为4 μM，其他单体化合物终浓度从
20 μM-0 μM梯度变化，两两混合为第一组实验组。将其他单体化合物按照终浓度20 μM-0 μM加入96孔板为第二组实验组。设置空白对照和阴性对照，实验用菌液浓度参照最低抑菌浓度的测定，37℃培养24 h，测定600 nm OD值。
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