技术领域
[0001] 本
发明属于
生物工程技术领域，尤其涉及一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法及应用。
背景技术
[0002] 荷叶为睡莲科多年生
水生草本植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn)的
叶片，又名莲叶，藕叶。我国荷叶资源丰富，以长江、黄河和珠江等三大流域分布最广。传统医学认为，荷叶味苦、平，归肝、脾、胃经，具有清暑利湿、升发清阳、清心去热、
止血利水的活性。据《本草纲目》记载“荷叶服之，令人瘦劣”、“生发元气，稗助脾胃，涩精浊，散淤血，消肿痛，发痘疮”。在2003年3月中华人民共和国卫生部的卫监发(2002)第51号文件中，荷叶被列入第2批“既是食品又是药品”的名单之中。目前，荷叶的临床应用较多的是以复方的形式用于减肥降脂。此外，荷叶金
银花口香糖通过在口香糖配料中加入适量对
口腔有保健作用的荷叶抑菌成分，以增加口香糖的保健功能。荷叶化学成分复杂，除含有植物所共有的
碳水化合物、脂质、
蛋白质、无机盐和水等成分外，还含有生物碱、黄
酮等多种
生物活性成分。干荷叶中总生物碱含量约为1.0％，主要为异喹啉类和阿朴啡类，并多以去氢和甲基化两种形态存在。研究发现，荷叶中生物碱类物质能干扰
微生物蛋白质的代谢，抑制纺锤体微管蛋白聚合，同时还能抑制RNA聚合酶的活
力，中断细胞膜脂质的合成和
氨基酸在细胞膜上的转运，使微生物的有丝分裂停止于中期，因此具有良好的抗菌作用。如荷叶总生物碱具有明显抑制细菌生长的作用，其
单体鹅掌楸碱对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为32μg/mL，杏黄罂粟碱对红色毛癣菌和
石膏状小孢子菌的MIC均为16μg/mL，O-去甲基荷叶碱对金黄色葡萄球菌的抑制作用与氯霉素相当。在
农作物侵染性病害中，主要有真菌性病害和细菌性病害两种，其中真菌性病害约占病害的70～80％。一种作物上可发现几种甚至几十种
真菌病害。目前主要采取
农药喷施方法对其进行防治。由于大量农药的使用对环境和人畜造成了深远而惨重的危害。因此，充分挖掘尚未得到合理利用的资源，从植物中发现开发高效低毒的天然有效抗菌活性成分成为一条重要途径，符合绿色思维的发展潮流。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法及应用，旨在解决目前主要采取农药喷施方法对植物病原真菌进行防治，大量农药的使用对环境和人畜造成了深远而惨重危害的问题。
[0004] 本发明是这样实现的，一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法，所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法包括：
[0005] 孢子悬液的制备：将保存菌种接入
马铃薯固体培养基的试管斜面活化，取一支生长4d的试管斜面，用50mL的0.9％的无菌生理盐水倒入试管中，用无菌的玻棒在斜面上搅动，将孢子刮下来，并用两层纱布过滤，装入三
角瓶中，用血球板计数法和平皿计数法测定其生长
浊度，将孢子悬液稀释；
[0006] 经
微波辅助热回流法提取、D－101型大孔
吸附树脂纯化、
冷冻干燥得到，其中荷叶碱含量为1.37％，取荷叶总生物碱固体适量，溶解，配置总生物碱溶液，调节pH，将溶液用微量小滤器过滤除菌后用于体外抑菌试验；
[0007] 采用管碟法。待培养基冷却到50℃时，加入2mL孢子悬液，摇匀，倒入直径为12cm培养皿中，待
凝固后，将
牛津杯放置平皿菌层上，每杯加入荷叶总生物碱，观察抑菌圈的大小；
[0008] 采用试管倍比稀释法，分别用50％
乙醇溶液置备荷叶总生物碱，分别吸取以上浓度的荷叶总生物碱1mL加入到19mL液体培养基中，再加入0.2mL孢子悬液，30℃培养48h，从试管中吸取0.2mL的培养液，加入固体培养基中，涂布均匀，倒置放入30℃的恒温
培养箱中，培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱最低杀菌浓度；
[0009] 采用平皿倍比稀释法，培养皿中加入19.0mL培养基，待培养基还未凝固时，分别在各个培养皿中加入浓度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.312mg/mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱溶液1.0mL，摇匀，同时以50％乙醇为对照，待培养凝固后，向各平皿中加入0.2mL孢子悬液，涂布均匀，30℃倒置培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱的
最低抑菌浓度。
[0010] 进一步，所述用血球板计数法和平皿计数法测定其生长浊度，将孢子悬液稀释到5 6 -1
10～10cuf.·mL 。
[0011] 进一步，所述取荷叶总生物碱固体适量，用50％乙醇溶解，配置成10mg/mL和50mg/mL总生物碱溶液，调节pH为8。
[0012] 进一步，所述每杯分别加入2mg/mL、4mg/mL、10mg/mL荷叶总生物碱0.25mL。30℃恒温培养48h，观察抑菌圈的大小，抑菌圈的评判标准为：d≤8mm为不敏感型，8mm＜d≤13mm为低度敏感型,13mm＜d≤19mm为中度敏感型，d＞19mm为高度敏感型。
[0013] 进一步，所述采用试管倍比稀释法，分别用50％乙醇溶液置备10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.32mg/mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法的稻瘟病菌抑菌活性应用。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法的黄瓜枯萎病菌抑菌活性应用，最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为160μg/mL。
[0016] 本发明的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法的油菜菌核菌抑菌活性应用。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法的红菇根霉菌抑菌活性应用。
[0018] 本发明的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法的小麦赤霉菌抑菌活性应用。
[0019] 本发明提供的荷叶总生物碱对6种植物病原真菌抑制活性方法及应用，其中对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性最强，对油菜菌核菌和红菇根霉菌活性较强，对水稻稻瘟菌、小麦赤霉病菌和辣椒疫病菌有一定抑制作用。该方法的应用为从植物中发现开发高效低毒的天然有效抗菌活性成分，从而降低农药喷施防治植物病原真菌提供一条重要途径。本发明采用本实验室纯化的荷叶总生物碱进行了体外抑制植物病原真菌效果的研究，以期为荷叶中天然活性化合物的有效开发利用提供依据。
附图说明
[0020] 图1是本发明
实施例提供的荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法
流程图。
具体实施方式
[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0022] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0023] 如图1所示，本发明实施例的荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法包括以下步骤：
[0024] S101：孢子悬液的制备：将保存菌种接入马铃薯固体培养基的试管斜面活化，取一支生长4d的试管斜面，用50mL的0.9％的无菌生理盐水分几次倒入试管中，其间用无菌的玻棒在斜面上轻轻搅动，将孢子刮下来，并用两层纱布过滤，装入三角瓶中，用血球板计数法和平皿计数法测定其生长浊度，将孢子悬液稀释到105～106cuf.·mL-1；
[0025] S102：经微波辅助热回流法提取、D－101型大孔吸附树脂纯化、冷冻干燥得到，其中荷叶碱含量为1.37％，取荷叶总生物碱固体适量，用50％乙醇溶解，配置成10mg/mL和50mg/mL总生物碱溶液，调节pH为8.0，将上述溶液用微量小滤器过滤除菌后用于体外抑菌试验；
[0026] S103：采用管碟法。待培养基冷却到50℃左右时，加入2mL孢子悬液，摇匀，倒入直径为12cm培养皿中，待凝固后，将牛津杯放置平皿菌层上，每杯分别加入2mg/mL、4mg/mL、10mg/mL荷叶总生物碱0.25mL。30℃恒温培养48h，观察抑菌圈的大小。抑菌圈(d)的评判标准为：d≤8mm为不敏感型，8mm＜d≤13mm为低度敏感型,13mm＜d≤19mm为中度敏感型，d＞
19mm为高度敏感型；
[0027] S104：采用试管倍比稀释法，分别用50％乙醇溶液置备10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.32mg/mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱。分别吸取以上浓度的荷叶总生物碱1mL加入到19mL液体培养基中，再加入0.2mL孢子悬液。30℃培养48h，从试管中吸取0.2mL的培养液，加入固体培养基中，涂布均匀，倒置放入30℃的恒温培养箱中，培养48h。观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱最低杀菌浓度；
[0028] S105：采用平皿倍比稀释法。培养皿中加入19.0mL培养基，待培养基还未凝固时，分别在各个培养皿中加入浓度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.312mg/mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱溶液1.0mL，摇匀，同时以50％乙醇为对照，待培养凝固后，向各平皿中加入0.2mL孢子悬液，涂布均匀，30℃倒置培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱的最低抑菌浓度。
[0029] 下面结合实验对本发明的应用效果作详细的说明。
[0030] 1 材料与方法
[0031] 1.1 材料
[0032] 1.1.1 试验材料
[0033] 实验菌株
[0034] 稻瘟病菌(Piricularia oryzae Cav.)；黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum Schlecht)；油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)；红菇根霉菌(Fusarium oxysporum schl)；小麦赤霉菌(Wheat phytoalexin)；辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)。分别用代码J1、J2、J3、J4、J5、J6表示。(所有供试植物病原菌均由湖南农业大学
植物保护学院植物病理实验室提供)
[0035] 1.1.2 试验方法
[0036] 1.1.2.1 菌液的制备
[0037] 孢子悬液的制备：将保存菌种接入马铃薯固体培养基的试管斜面活化，取一支生长4d的试管斜面，用50mL的0.9％的无菌生理盐水分几次倒入试管中，其间用无菌的玻棒在斜面上轻轻搅动，将孢子刮下来，并用两层纱布过滤，装入三角瓶中，用血球板计数法和平皿计数法测定其生长浊度，将孢子悬液稀释到105～106cuf.·mL-1。
[0038] 1.1.2.2 荷叶总生物碱的制备
[0039] 经微波辅助热回流法提取、D－101型大孔吸附树脂纯化、冷冻干燥得到，其中荷叶碱含量为1.37％。取荷叶总生物碱固体适量，用50％乙醇溶解，配置成10mg/mL和50mg/mL总生物碱溶液，调节pH为8.0，将上述溶液用微量小滤器过滤除菌后用于体外抑菌试验。
[0040] 1.1.2.3 荷叶总生物碱抑菌效果的测定
[0041] 采用管碟法。待培养基冷却到50℃左右时，加入2mL孢子悬液，摇匀，倒入直径为12cm培养皿中。待凝固后，将牛津杯放置平皿菌层上，每杯分别加入2mg/mL、4mg/mL、10mg/mL荷叶总生物碱0.25mL。30℃恒温培养48h，观察抑菌圈的大小。抑菌圈(d)的评判标准为：d≤8mm为不敏感型，8mm＜d≤13mm为低度敏感型,13mm＜d≤19mm为中度敏感型，d＞19mm为高度敏感型。
[0042] 2.2.7 荷叶总生物碱最低杀菌浓度的测定
[0043] 采用试管倍比稀释法。分别用50％乙醇溶液置备10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.32mg/mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱。分别吸取以上浓度的荷叶总生物碱1mL加入到19mL液体培养基中，再加入0.2mL孢子悬液。30℃培养48h，从试管中吸取
0.2mL的培养液，加入固体培养基中，涂布均匀，倒置放入30℃的恒温培养箱中，培养48h。观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱最低杀菌浓度。
[0044] 2.2.荷叶总生物碱最低抑菌浓度的测定
[0045] 采用平皿倍比稀释法。培养皿中加入19.0mL培养基，待培养基还未凝固时，分别在各个培养皿中加入浓度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.312mg/mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱溶液1.0mL，摇匀，同时以50％乙醇为对照。待培养凝固后，向各平皿中加入0.2mL孢子悬液，涂布均匀，30℃倒置培养48h。观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱的最低抑菌浓度。
[0046] 3.结果与分析
[0047] 3.1 荷叶总生物碱的抑菌效果
[0048] 从表1可知，荷叶总生物碱(10mg/mL)对6种植物病原菌的菌丝生长均具有抑制作用。特别是黄瓜枯萎病菌、油菜菌核菌、红菇根霉菌对总生物碱的敏感性强，为高度敏感菌，荷叶总生物碱的
质量分数越大，其抑菌效果越明显，说明总生物碱浓度是制约抑菌效果的重要因素之一。此外，50％乙醇作为
溶剂对荷叶总生物碱的抑菌作用没有形成干扰。
[0049] 表1 荷叶总生物碱对致病菌的抑菌圈直径比较
[0050]
[0051] 注：数据为3次平行实验的平均值，单位：mm
[0052] 3.2 荷叶总生物碱的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)
[0053] 比较荷叶总生物碱对6种植物病原真菌的MIC和MBC。由表2可见，荷叶总生物碱对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性最强，对油菜菌核菌和红菇根霉菌活性较强，对水稻稻瘟菌、小麦赤霉病菌和辣椒疫病菌有一定抑制作用。
[0054] 表2 荷叶总生物碱的MIC和MBC
[0055]
[0056] 注：表中数据为3次平行实验的平均值，单位：mg·mL-1
[0057] 本发明测定了荷叶总生物碱对稻瘟病菌、黄瓜枯萎病菌、油菜菌核菌、红菇根霉菌、小麦赤霉菌、辣椒疫病菌6种植物病原真菌的抑菌效力(抑菌圈直径)、最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。首次明确荷叶总生物碱对植物病原真菌具有明显的抑制活性。尤其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性最强，最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为160μg/mL。由于我国荷叶资源丰富,从荷叶中提取生物碱类活性物质，成本低廉、无毒无害。荷叶总生物碱用于防治植物病害，可作为一种潜在的
生物农药，具有广阔的开发应用前景。
[0058] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
