一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法
专利汇可以提供一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种从丹凤牡丹籽壳中制备 白藜芦醇 的方法，属于天然产物技术领域。以丹凤牡丹籽壳为原料、经过提取、萃取、大孔 树脂 纯化和 硅 胶柱层析分离得到丹凤牡丹籽壳白藜芦醇。通过本发明的技术条件制备牡丹籽壳白藜芦醇，具有制备过程简单、纯度高和原料价廉等特点。同时通过本发明制备的牡丹籽壳多酚提取物具有良好的抗 氧 化和抑菌活性，可以广泛应用于食品和护肤品领域，具有很好的商业前景。，下面是一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法专利的具体信息内容。
1.一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于由以下步骤组成：
第一步 原料预处理
将丹凤牡丹籽壳干燥至水份8%以内粉碎，用10～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹籽壳细粉；
第二步 白藜芦醇粗提物制备
在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:8～1:
30(g:mL)，然后用超声波或微波辅助提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；
第三步 白藜芦醇粗提物分级萃取
将白藜芦醇粗提物按质量体积比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；
第四步 大孔脂脂选择性吸附筛选
从X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、XDA-4、H103、D101和S-8大孔吸附树脂中筛选得到对白藜芦醇多酚吸附选择性好的X-5、AB-8和D101树脂，其吸附量高于2.5mg/g，吸附率和解附率大于90%；
第五步 大孔树脂吸附分离乙酸乙酯萃取物
将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃取物与水质量体积比为0.8～3.0 mg/mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂与乙酸乙酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物；
第六步 白藜芦醇分离
采用硅胶柱层析分离白藜芦醇，将白藜芦醇多酚提取物溶于少量乙酸乙酯溶液中搅拌成均匀膏状，干燥并用研钵研细为粉末，均匀加入硅胶层析柱中，以乙酸乙酯与石油醚体积比为5:100～40:100为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1～3倍柱体积，收集乙酸乙酯与石油醚体积比=7:3的洗脱液，经减压浓缩后获得95%以上白藜芦醇白色粉末。
2.根据权利要求1所述一一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于第五步中白藜芦醇多酚HPLC分析：HPLC色谱柱为Hypersil GOLD aQ C18Φ250×4.6mm，5μm，流动相：甲醇与0.5%冰醋酸水溶液体积比为4:6；紫外波长306nm；柱温：30℃；流速：1mL/min。
3.根据权利要求1所述一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于第五步得到的白藜芦醇多酚提取物在240℃以下具有良好的热稳定性，在240～378℃之间有10-
20%的质量损失，其分解速率为1.5～2.0%/min，在240～420℃下全程失重总计50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。
4.根据权利要求1所述一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于第五步得到的白藜芦醇多酚提取物具有抗氧化抗菌生物活性，总抗氧化能力为1200mg/g（BHT为
200mg/g）以上，半数抑制浓度为50μg/mL以下，对表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为5.2mg/mL以下，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为20.6mg/mL以下。
一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法
技术领域
背景技术
菌、消炎、镇静、降血糖、抗过敏及免疫调节等作用。白藜芦醇（C14H12O3）结构为3ˊ,4,5ˊ-三羟基-1，2-二苯乙烯（3ˊ,4,5ˊ-tri- hydroxylstillbene），无色针状晶体。白藜芦醇有顺式和反式两种结构，植物中主要以反式结构存在。白藜芦醇是一种天然的植物抗毒素，广泛存在于红葡萄皮、花生、桑葚以及其他一些药用的植物中，其中在种皮中含量极高。紫斑牡丹的叶、侧枝、茎以及根中均不含白藜芦醇，其籽和果荚中含有白藜芦醇，含量约为0.87%和
0.26%。
废为宝，也具有很好的社会和经济效益。
发明内容
第一步 原料预处理
将丹凤牡丹籽壳干燥至水份8%以内粉碎，用10～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹
籽壳细粉；
第二步 白藜芦醇粗提物制备
在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:8～1:
30(g:mL)，然后用超声波或微波辅助提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；
第三步 白藜芦醇粗提物分级萃取
将白藜芦醇粗提物按质量体积比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，
滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；
第四步 大孔脂脂选择性吸附筛选
从X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、XDA-4、H103、D101和S-8大孔吸附树脂中筛选得到对白藜
芦醇多酚吸附选择性好的X-5、AB-8和D101树脂，其吸附量高于2.5mg/g，吸附率和解附率大于90%；
第五步 大孔树脂吸附分离乙酸乙酯萃取物
将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃取物与水质量体积比为0.8～3.0 mg/
mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂与乙酸乙酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～10
（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物；
第六步 白藜芦醇分离
采用硅胶柱层析分离白藜芦醇，将白藜芦醇多酚提取物溶于少量乙酸乙酯溶液中搅拌
成均匀膏状，干燥并用研钵研细为粉末，均匀加入硅胶层析柱中，以乙酸乙酯与石油醚体积比为5:100～40:100为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1～3倍柱体积，收集乙酸乙酯与石油醚体积比=7:3的洗脱液，经减压浓缩后获得95%以上白藜芦醇白色粉末。
（1）本发明采用超声辅助提取方法，可以有效地防止多酚提取物的分解，大大地提高提
取得率；
（2）本发明采用超声波提取、分级萃取和大孔树脂纯化，可以有效地提高白藜芦醇的含
量与纯度；
（3）本发明工艺操作简单，易实施，纯度高。
附图说明
图3 丹凤牡丹籽壳白藜芦醇的红外谱图；
图4 丹凤牡丹籽壳白藜芦醇的1H NMR图；
图5 丹凤牡丹籽壳白藜芦醇的13C NMR图。
具体实施方式
籽壳细粉；在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:
8～1:30(g:mL)，然后用超声波提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；将白藜芦醇粗提物按质量体积比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在
40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；从X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、XDA-4、H103、D101和S-8大孔吸附树脂中筛选得到对白藜芦醇多酚吸附和解吸附性较好的树脂，结果见表1。
牡丹籽壳多酚吸附性能差异不大，应该是因为树脂过量。但是，大孔吸附树脂的解吸量和解吸率有较大差别。其中，X-5和AB-8的解吸性能最好，解析率分别达到94.51%和97.91%。8种树脂中S-8对油牡丹籽壳多酚的解析率最低，可能是因为S-8树脂对油牡丹籽壳中的多酚类
物质有较强的亲和力，因而多酚类物质很难被洗脱，所以S-8大孔吸附树脂不被用来纯化油牡丹籽壳多酚。
mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂X-5与乙酸乙酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～
10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～
90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物。
将丹凤牡丹籽壳干燥至水份8%以内粉碎，用10～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹
籽壳细粉；在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:
8～1:30(g:mL)，然后用微波提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；将白藜芦醇粗提物按质量体积比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶
解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在
40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃
取物与水质量体积比为0.8～3.0 mg/mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂AB-8与乙酸乙
酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为
1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦
醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物。
籽壳细粉；在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:
8～1:30(g:mL)，然后用微波提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；将白藜芦醇粗提物按质量比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～
60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃取物
与水质量体积比为0.8～3.0 mg/mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂D101与乙酸乙酯萃
取物水溶液质量体积比为1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物。
成均匀膏状，干燥并用研钵研细为粉末，均匀加入硅胶层析柱中，以乙酸乙酯与石油醚体积比为5:100～40:100为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1～3倍柱体积，收集乙酸乙酯与石油醚体积比=7:3的洗脱液，经减压浓缩后获得95%以上白藜芦醇白色粉末。
经结构鉴定该化合物为白藜芦醇。其波谱特征如下：
红外光谱：3 300.00，1 609.91和964.55cm-1均为白藜芦醇化学结构的特征吸收峰，并
且具有1 441.84、1 462.83、1 511.84、1 580cm-1等苯环的特征吸收峰。并与相关文献对照，符合白藜芦醇的红外色谱图。油牡丹籽壳白藜芦醇样品的红外谱图见附图3。
以下具有良好的热稳定性，在240～378℃之间有10-20%的质量损失，其分解速率为1.5～
2.0%/min，在240～420℃下全程失重总计50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。
℃，失重为4.63%，这阶段的失重及失重速率都较小。第二阶段173-240℃，失重峰出现在
219.0℃，此时的失重速率为0.98%/min，失重较轻微，损失率为5.86%。表明白藜芦醇多酚提取物在240℃以下具有良好的热稳定性。第三阶段温度为240-378℃，失重峰出现在303.8
℃，此时的失重速率为105-2.0%/min，分解速率达到最高，损失率约为10-20%。在240～420℃下全程失重总计50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。
评价白藜芦醇多酚提取物的抗氧化活性。研究了白藜芦醇多酚提取物抑制大肠杆菌CMCC
44102（Escherichia coli，E. coli）、金黄色葡 萄球菌CMCC 26003（Staphylococcus
aureus，S. aureus）、产气肠杆菌ATCC 13048（Escherichia aerogenes，E. aerogenes）、表皮葡萄球菌CMCC 26069（Staphylococcus epidermidis，S. epidermidis）、肺炎克雷伯氏菌CMCC 46117（Klebsiella pneumoniae，K. pneumoniae）的能力。
值为34.30mg/L。白藜芦醇多酚提取物的半数抑制浓度IC50为45μg/mL。
作用，对表皮葡萄球菌的抑制作用最好，最低抑菌浓度分别为5.2g/L。
肺炎克雷伯氏球菌 17.3 10.38
产气肠杆菌 12.4 20.8
表皮葡萄球菌 36.7 5.15
金黄色葡萄球菌 11.6 19.8
大肠杆菌 12.1 20.8
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