评估结肠直肠癌
阅读：889发布：2020-05-11
专利汇可以提供评估结肠直肠癌专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且通过分析一组基因的表达对相信患有结肠直肠癌的患者的结肠直肠癌存在与否或其可能状态进行评估的方法。本 发明 还涉及多种媒介物，如微阵列中基因表达分布图，也包括含有基因表达分布图的 试剂 盒 。，下面是评估结肠直肠癌专利的具体信息内容。
1.包括Seq.ID.No.46-49的基因组合在制备用于评估结肠直肠癌状况方法的试剂中的应用，所述方法包括鉴定每个基因相对于正常种群的相同基因的表达的差异调节。
2.权利要求1的应用，其中被调节的基因表达存在至少2倍差异。
3.权利要求1的应用，其中表示差异调节的p值低于0.05。
4.权利要求1的应用，进一步包括使用非遗传基础的结肠直肠癌诊断方法。
5.权利要求4的应用，其中在非遗传基础的结肠直肠癌诊断方法中使用的非遗传基础的癌症标记选自癌胚性抗原、CA19-9、CA125、CK-BB和鸟苷酸环化酶C。
6.一种诊断框架，包括Seq.ID.No.46-49的基因组合的分离的核酸序列或其互补序列。
7.权利要求6的诊断框架，其位于适合鉴定包含于其上的基因的差异表达的基片上。
8.权利要求7的诊断框架，其中所述的基片用于微阵列。
9.权利要求8的诊断框架，其中所述的微阵列是cDNA微阵列。
10.权利要求8的诊断框架，其中所述的微阵列是寡核苷酸微阵列。
11.一种用于诊断结肠直肠癌的试剂盒，其包含包括Seq.ID.No.46-49的基因组合的分离的核酸序列或其互补序列。
12.权利要求11的试剂盒，进一步包括进行微阵列分析的试剂。
13.权利要求11的试剂盒，进一步包括媒介物，所述的核酸序列或其互补序列通过该媒介物进行检测。
14.包括Seq.ID.No.46-49的基因组合在制备用于评估结肠直肠癌疗效方法的试剂中的应用，所述方法包括鉴定每个基因相对于正常种群的相同基因的表达的差异调节。
15.权利要求14的应用，其中对疗效的评估包括确定患者是否好转，非好转，复发，可能好转或可能复发。
16.评估结肠直肠癌状况的制品，其包含包括Seq.ID.No.46-49的基因组合中的分离的核酸序列或其互补序列。
17.评估结肠直肠癌状况的制品，其包含包括Seq.ID.No.46-49的基因组合的分离的核酸序列或其互补序列的表示物。
评估结肠直肠癌
[0002] 背景
[0003] 本申请要求2002年3月29日申请的序列号为60/368,798的美国临时申请的利益。
[0004] 本发明涉及基于生物样本基因表达分布图的结肠直肠癌的诊断和预测。
[0005] 结肠直肠癌是一种异源疾病，由据认为是通过三种主要分子机制形成的肿瘤组成：1)与染色体不稳定性相结合的多发性结肠腺癌(APC)基因，或β-连环蛋白基因的突变，2)与微卫星序列不稳定性相关的DNA错配修复基因如MLH1，MSH2，PMS2和MSH6的突变，和包含短重复序列基因的突变，以及3)由肿瘤抑制基因启动子区的过甲基化诱导的基因沉默。结肠直肠癌个体的遗传互补可能包括遗传不稳定性、特异突变和基因沉默的不同结合。染色体不稳定性(CIN)一般是癌症的普遍特征。它意味着其中所有的或大部分的染色体丢失或增加了的非整倍体表型。伴随短重复序列突变率的增加，在二倍体肿瘤中发现了微粒体不稳定性(MIN)。这两种遗传不稳定性的形式在结肠直肠癌中很普遍。
[0006] 因此结肠直肠癌具有复杂的起源并且包括不同生物通路间大量的相互作用。用于协助提供诊断、预测或治疗监测结果的血清标记、组织学和细胞学检查通常不具有所期望的可信度。同时，使用单独的遗传标记(例如一特殊基因的表达增加)可能是有益的，癌症的多样性使遗传标记的组合可能成为最好的途径。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明是评估结肠直肠癌存在或不存在，或者被认为患有结肠直肠癌的患者其可能状态的方法。在本方法中，通过分析患者样本的基因表达分布图确定患者是否得了结肠直肠癌，患者是否未得结肠直肠癌，患者是否可能要得结肠直肠癌，或正在接受治疗的结肠直肠癌患者对治疗的反应。
[0009] 本发明的一个方面涉及用于实施该方法的制品。这样的制品包括基因表达分布图或固定于机器可读媒介如计算机可读媒介的基因表达分布图的表现物。
[0010] 用来鉴别基因表达分布图的制品也可以包括用于捕捉和/或显示基因表达存在与否，或表达程度的基片或平面，如微阵列。
[0011] 发明详述
[0012] 很少发现组织样本中单纯的特定核苷酸序列的存在或缺失具有诊断或预测价值。另一方面，关于多种蛋白、肽或mRNA表达的信息正越来越受到重视。具有表达蛋白、肽或mRNA的潜在可能的特定核苷酸序列(这样的序列称为“基因”)仅在给定细胞的基因组中存在这一事实本身，并不能确定该蛋白、肽或mRNA是否会在给定的细胞中表达。能表达蛋白、肽或mRNA的给定基因是否表达以及表达到何种程度取决于多种复合因子。不考虑理解和评估这些因子的困难程度，检测基因表达可以为如肿瘤发生、转移、细胞凋亡以及其他临床有关现象等重要事件的发生提供有用的信息。通过基因表达分布图可以发现基因激活或失活程度的相对指标。本发明的基因表达分布图可用于结肠直肠癌患者的诊断和治疗。
[0013] 样品制备需要收集患者样本。本发明使用的病例样本是那些疑为含有患病细胞的样本，如取自结肠样本或外科切除样本的上皮细胞。获得可疑样本的一种有用技术是激光捕捉微切片技术(LCM)。激光捕捉微切片技术提供了一种选择需研究细胞的方法，并最小化由细胞种类的不均一性造成的易变性。因此，正常细胞和癌细胞之间的基因表达中度或细小的变化都可以被轻易检测到。在优选的方法中，样本包括从外周血中提取的循环上皮细胞。这可以按照多种方法获得，但最优选的方法是Immunivest公司的美国专利6,136,182所描述的磁性分离技术，该专利在此引入作为参考。一旦得到含有所关注细胞的样本，就提取其RNA，扩增，并获得基因表达分布图，优选的通过微阵列获得合适框架(portfolio)中基因的表达分布图。
[0014] 确立基因表达分布图的优选方法包括，确定一个能够编码蛋白质或肽的基因所产生的RNA的量。这可通过逆转录酶PCR(RT-PCR)，竞争性RT-PCR，实时RT-PCR，差异显示RT-PCR，Northern杂交分析和其他相关实验实现。尽管可能用单个PCR反应实施这些技术，但最好扩增来自mRNA的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)并用微阵列对其分析。对本领域的技术人员来说大量不同的阵列构型及其生产方法是已知的，并且也在如下的美国专利中有描述：5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；
5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；
5,658,734；和5,700,637；这些专利披露的技术在此引入作为参考。
5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；
5,658,734；和5,700,637；这些专利披露的技术在此引入作为参考。
[0015] 微阵列技术允许同时检测数千基因的稳定状态的mRNA水平，因此它为检测非控制的细胞增殖效果，如启动、抑制或调节等提供了一个强有力的工具。现在两种微阵列技术正被广泛使用。第一种是cDNA阵列，第二种是寡核苷酸阵列。尽管这些芯片在构造上存在差异，但其下游数据的分析和输出实质上是相同的。这些分析的结果典型地是对由标记探针获得的信号强度的测定，所述的探针用于检测与阵列上已知位点的核酸序列杂交的、来自样品的cDNA序列。典型地，所述的信号强度与cDNA的含量，或者说样本细胞中所表达的mRNA的量成比例。有许多这样的技术可以获得并且是有用的。优选的检测基因表达的方法可以在美国专利中找到，如Linsley等人的专利6,271002；Friend等人的专利6,218,122；Peck等人的专利6,218,114；Wang等人的专利6,004,755，其所公开的内容均在此引入作为参考。
[0016] 基因表达水平的分析通过比较强度进行。最好是通过制备一种待测样品中基因表达强度相对于对照样品中基因表达强度的比值矩阵进行。例如，可以将疾病组织中基因表达的强度与相同类型正常组织中的表达强度进行比较(例如患病的结肠组织样本对正常的结肠组织样本)。这个表达强度的比值显示出被测样本和对照样本中基因表达的倍数变化。
[0017] 基因表达分布图也可以通过很多方法显示。最普遍的方法是将原始的荧光强度或矩阵系数处理成树状图，其中列表示被测样品，行表示基因。数据经这样的处理后那些具有相似表达分布的基因就会相互邻近。每个基因的表达比率可用一种颜色显示。例如，小于一的比率(表示下调)可以出现在图谱的蓝色部分，而大于一的比率(表示上调)可以出现在图谱的红色部分。商业上可购买到的计算机软件程序很适合显示这样的数据，包括Silicon Genetics有限公司的“GENESPRING”，Partek有限公司的“DISCOVERY”和“INFER”软件。
[0018] 用于本发明的方法的受调节基因如表1所示。差异表达的基因表现为在患病细胞中上调或下调。上调和下调是相对的术语，表示可检测到的相对于某种基线的基因表达的量的差异(超出检测系统的噪音影响)。在这种情况中，基线是正常细胞测得的基因表达。再使用同样的测量方法确定患病细胞中所关注的基因相对于基线水平是上调或下调。上下文中，患病的，是指伴随细胞非控制增殖而出现的机体状态的改变，此种改变中断、扰乱或潜在的打乱机体功能的适当表现。当某人基因型或表型的一些方面一致表现出存在特定疾病时，他就被诊断为患有该种疾病。然而，作出诊断或预测的行为包括确定疾病表象/状态的情况，如治疗监测。在治疗监测中，比较经过一段时间治疗后的基因表达确定基因表达分布图是否有变化，或其变化与正常组织的模式更为一致来考虑疗程的效果从而作出临床判定。
[0019] 优选的，上升或下降调节的水平是以杂交的微阵列探针测量强度的成倍变化来区别的。2倍差异或p值小于0.5对于作出这样的辨别是优选的。即当认为与在正常细胞中相比一个基因在患病细胞中差异表达时，患病细胞中的强度至少是正常细胞的2倍或1/2。倍数差异越大，该基因就越优选用作诊断。本发明选择用作分析表达分布图的基因具有产生使该基因区别于正常基因或非调节基因的信号的表达水平，该信号量超出使用临床实验室检测设备的背景量。
[0020] 利用统计值可用于确定地使调节基因与非调节基因和噪音区别开。通过统计检验发现在不同样本组之间有最显著差异的基因。Student’s T检验就是一个发现两组之间显著差异的有力的统计检验的例子。p值越小，不同组之间基因显示差异的证据就越有说服力。然而既然微阵列可以同时检测多个基因，那么就需要同时进行万次的统计检验。因此，就存在偶尔看到极小p值的可能，可以利用Sidak校正以及随机化/排列实验进行调整。T检验中p值小于.05就证明基因是差异显著的。更有说服力的证据是加入Sidak校正因子后p值小于.05。对于每组中的大量样品，经过随机化/排列检验后p值小于.05是差异显著的最有说服力的证据。
[0021] 另一个可用来选择产生强于非调节基因和噪音信号的基因的参数是绝对信号差异测量值。优选的，调节基因的表达形成的信号与正常基因或非调节基因(以绝对值为基础)至少有20％的差异。更优选的，调节基因形成的表达模式与正常基因或非调节基因至少有30％的差异。
[0022] 将基因分组以便于通过获得一组基因中一套基因的信息为诊断、预测或治疗选择等相关临床判断提供可靠的基础。这些套基因构成了本发明的框架(portfolios)。此例中，由该框架支持的判断包括结肠直肠癌。基因表达分布图的框架包含实施例3中描述的基因联合组合。对于大多数诊断标记物来说，最好使用尽量少的标记物就足以充分作出一个正确的医学判断。这就避免了使用那些悬而未决需作进一步分析的治疗措施带来的延误，同时又避免了时间和资源的不合理使用。此例中，这样的最小量的框架包含实施例4中的基因组合。
[0023] 优选的，构建这样的框架以保证该框架中的基因组合相对于单个基因或随机选择的基因组合显示出更好的灵敏度和特异性。在本发明中，框架的灵敏度反映在一个基因在疾病状态下相对于其在正常状态下所表现出的基因表达的成倍差异中。特异性可以反映在基因表达信号与所关注疾病相关性的统计测量中。例如，标准差就是这样一个有用的度量。当考虑将一组基因掺入到某一框架中时，表达测量值的标准差越小其特异性越大。其他检测变量，如相关系数也包括在使用范围内。
[0024] 最优选地，建立基因表达框架的方法是运用优化算法，如在确定股票投资中广泛使用的平均方差算法的。这一方法在同日期的Tim Jatkoe等人标题为“投资组合选择(Portfolio Selection)”的同时待审的专利申请中有详细表述。该方法实质上要求一套输入值(金融应用中的股票，这里指通过强度测定的表达)，其可优化收到的回报率(例如形成的信号)以进行应用，同时最小化回报率的可变性。许多商业软件程序适合进行这样的操作。在整个说明书中称为“Wagner软件”的“Wagner联合均值-方差优化应用程序”是优选的。这个软件使用“Wagner联合均值-方差优化库”中的功能，来确定有效边界，优选Markowitz意义上的优化框架。
[0025] 由于该软件用于金融分析目的，因此使用这种类型的软件需要将微阵列数据进行转换，使数据以股票回报值和风险测量值的方式输入处理。例如，当Wagner软件与微阵列强度测定协同应用时，要运用以下的数据转换方法。
[0026] 首先通过确定那些其表达至少显示出某种微小差异水平的基因，对基因进行预选择。优选的预选择过程如下所述。选择一个基线组。典型的基线组包含来自未患有所述疾病的群体的基因。例如，在选择所用于诊断乳腺癌的基因框架时，可以将未患乳腺癌患者的样本用作制备基线组。一旦选择了基线组，就可以计算出基线组样本中每个基因的表达指标的算术平均值和标准差。典型的，这个指标是微阵列记录的荧光强度。随后将通过计算得到的统计学数据用于计算每个基因的基线值(X*标准差+均值)。这就是基因的基线记录，其它所有样本都要与其相比较。X是由制定框架的人选择出来的严格变量。X的数值越大就越严格。优选的X数值范围是0.5-3，更优选的是2-3，最优选的是3。
[0027] 随后计算每个实验样本(那些表现出所关注疾病的样本)与基线记录的比值。再将这些比值转换成易于软件进行数据处理的底数为10的对数值。该方法使下调基因显示为负值，这是使用Wagner软件并按照Markman均值-方差算法进行优化所必需的。
[0028] 将包含这些转换比值的预处理数据作为输入，替代用于金融分析目的的Wagner软件中通常使用的资产回报值。
[0029] 一旦制定出有效边界，对于一个给定的输入水平值(回报率)或对应于边界上的一个点的方差，就可以选择出一个优化框架。这些输入值或方差是制定框架的人预先确定的标准数集。换句话说，寻求最适框架的人决定一个可接受的输入水平(表明灵敏度)或者一个给定的方差水平(表明特异性)，选择位于该输入水平或方差相应的有效边界的基因。当选定了输入水平或方差，Wagner软件就能够选择出这样的基因。Wagner软件可以像对股票投资组合中每支股票所做的那样，分配所述框架中每个基因一个权重。
[0030] 将患者样本框架中的基因的表达，与用于构建所述框架的差异表达基因的计算值相比较，就可以确定该样本是否患有该框架所诊断的疾病。优选的，首先通过将在选择框架的过程中给每个基因分配的权重乘以框架中每个基因的强度值，加和得到框架值。然后用(基线组中框架的Y*标准差+均值)计算边界值，其中Y是一个严格数值，具有与上述X相同的含义。一个样本具有的框架值大于基线组的框架值，则此样本就被归为患有该病。需要时，可以根据提高可信度水平的已知统计学方法重复上述过程。
[0031] 任选的，可以重复进行上述过程直到获得预期的最高准确度。
[0032] 框架选择的过程和未知量的表征过程概括如下：
[0033] 1.选择基线组
[0034] 2.计算基线组样本中每个基因的均值和标准差
[0035] 3.计算每个基因的(X*标准差+均值)。这就是基线记录，其它所有的样本都要与这个基线记录相比较。X是一严格变量，X数值越大就越严格。
[0036] 4.计算每个实验样本对根据步骤3得到的基线记录的比值。
[0037] 5.转换比值，使值小于1的比值成为负数(例如使用底数为10的对数)。(现在下调的基因有正确的负值以符合MV优化的需要)。
[0038] 6.将这些转换的比值作为输入值，替换软件应用中通常使用的资产回报值。
[0039] 7.该软件将标绘出有效的边界线，并且返回一组沿此有效边界线上任意一点的优化框架。
[0040] 8.在此有效边界线上选择一个所需的回报率或者方差。
[0041] 9.通过将在选择框架的算法中所给定的权重乘以每个基因的强度值，加和计算每个样本的框架值。
[0042] 10.将基线组的框架值的均值加上Y与基线组的框架值的标准差的乘积，计算出边界值。大于该边界值的数值应被归为实验组。
[0043] 11.任选的，可以重复进行上述过程，直到获得预期的最佳准确度。
[0044] 可选择的，首先通过确定那些其表达显示出某种微小差异水平的基因，对基因进行预选择。在这个可选择的方法中，预选择优选的以 给出的阈值为基础，其中μt是已知患有该疾病或病症的样本子集的均值，μn是正常样本子集的均值，σt+σn表示联合标准差。通过根据如 的关系式对数据的预选择，也可在其中使用信噪比截止值。这就确保基于差异调节进行预选择的基因具有临床上的显著差异。即超过了适于测定各种临床参数的仪器产生的噪音水平。对于根据这些标准预选的每个标记物建立一个矩阵，其中列表示样本，行表示标记物，并且每个元件都是根据 对该标记物的表达进行标准化后所得到的强度测量值，其中I代表强度测量值。
[0045] 也可以通过设置附加的边界条件来定义优化框架。例如，框架的大小可限定为固定的值域或标记物的数目。这或者可以通过制定更为严格的预选标准(例如以代替 )或通过使用程序特征如限制组合大小来实现。例如可以设置边界条件使
有效边界线从最优化的10个基因中选出。也可以使用所有的预选基因确定有效边界线后再限定所选择基因的数目(例如不超过10个)。
有效边界线从最优化的10个基因中选出。也可以使用所有的预选基因确定有效边界线后再限定所选择基因的数目(例如不超过10个)。
[0046] 选择框架的过程也包括应用探索式的规则。优选的，这样的规则是基于生物学和对用于产生临床结果的技术理解的基础上制定的。更优选的是，它们应用到优化方法的输出数据中。例如，选择框架的均方差法可以应用于乳腺癌样本中大量差异表达基因的微阵列数据。这种方法得到的输出数据将会是一套优化的基因，包括既在外周血中表达也在患病乳腺组织中表达的一些基因。如果这种检测方法用到的样本来自外周血，并且某些基因既在乳腺癌个例也在外周血中差异表达，那么就可以应用探索式的规则，从排除了那些在外周血中差异表达的基因而得到的有效边界线上选择框架。当然，这个规则可以在形成有效边界线前应用，例如，将该规则应用到数据的预先选择中。
[0047] 可以应用其他与所考虑的生物学问题无必然联系的探索式规则。例如，可以应用只有给定百分比的框架可用特定的基因表示的规则。商业上可购买的软件如Wagner软件就提供了这类型的探索式规则。这是非常有用的，例如，除了正确度和精密度等，其他因素(例如，预期许可费)也会影响包括一个或多个基因的可用性。
[0048] 本发明的一个方法包括如上所述比较多种基因(或框架)的基因表达分布图以进行诊断。将构成框架的每个基因的基因表达分布图固定于如计算机可读的媒介物上。这可以采取很多形式。例如，可以建立一个输入表示疾病的信号范围(例如强度测定值)的表格。可以将患者的实际数据与表格中的值进行比较以确定该患者的样品属于是正常的或患病的。在一个改进的具体实例中，表达信号的模式(例如荧光强度)以数字或图形方式记录。再将与患者样本相结合使用的基因框架中的基因表达模式与上述表达模式比较。然后利用模式比较软件确定该患者本是否具有表示所讨论的疾病的模式。当然这些比较也可用于确定该患者的结果是否正常。再将样本的表达分布图与正常或对照细胞的框架相比较。如果样本表达模式与结肠直肠癌的表达模式一致，那么(无抵消性的医学理由)该患者就被诊断为结肠直肠癌阳性。如果样本表达模式与正常或对照细胞的表达模式一致，那么该患者就被诊断为结肠直肠癌阴性。
[0049] 许多公知的识别模式的方法是适用的。下列参考提供了一些例子：
[0050] 加权阈值Weighted Voting：
[0051] Golub，TR.，Sclonim，DK.，Tamaya，P.，Huard，C.，Gaasenbeek，M.，Mesirov，JP.，Coller，H.，Loh，L.，Downing，JR.，Caligiuri，MA.，Bloomfield，CD.，Lander，ES.癌症的分子分类：利用基因表达检测的分类发现和分类预测。科学Science 286：531-537，1999[0052] 支持矢量机器Support Vector Machine：
[0053] Su，AI.，Welsh，JB.，Sapinoso，LM.，Kern，SG.，Dimitrov，P.，Lapp，H.，Schultz，PG.，Powell，SM.，Moskaluk，CA.，Frierson，HF.Jr.，Hampton，GM.利用基因表达信号的人类癌症的分子分类。癌症研究Cancer Research 61：7388-93，2001
[0054] Ramaswamy，S.，Tamayo，P.，Rifkin，R.，Mukherjee，S.，Yeang，GH.，Angelo，M.，Ladd，C.，Reich，M.，Latulippe，E.，Mesirov，JP.，Poggio，T.，Gerald，W.，Loda，M.，Lander，ES.，Gould，TR.利用肿瘤基因表达信号的多种类癌症诊断。美国国家科学院院刊Proceedingsof the National Academy of Sciences of the USA 98：15149-15154，2001[0055] K-最邻近值K-nearest Neighbors：
[0056] Ramaswamy，S.，Tamayo，P.，Rifkin，R.，Mukherjee，S.，Yeang，GH.，Angelo，M.，Ladd，C.，Reich，M.，Latulippe，E.，Mesirov，JP.，Poggio，T.，Gerald，W.，Loda，M.，Lander，ES.，Gould，TR.利用肿瘤基因表达信号的多种类癌症诊断。美国国家科学院院刊Proceedingsof the National Academy of Sciences of the USA 98：15149-15154，2001[0057] 相关系数Correlation Coefficients：
[0058] van’t Veer LJ，Dai H，van de Vijver MJ，He YD，Hart AA，Mao M，Peterse HL，vander Kooy K，Marton MJ，Witteveen AT，Schreiber GJ，Kerkhoven RM，Roberts C，LinsleyPS，Bernards R，Friend SH.基因表达分布图预测乳腺癌的临床结果。自然Nature.2002 Jan 31：415(6871)：530-6
[0059] 本发明的基因表达分布图也可以与其他在癌症诊断、预测、或治疗监测中所使用的非遗传的诊断方法联合使用。例如，在一些情况中，将如上所述的基于基因表达诊断能力的方法与从如血清蛋白标记(例如癌胚性抗原)的传统标记物中得到的数据结合使用是很有益的。存在许多这样的标记物，包括如CA19-9，CA125，CK-BB和鸟苷酸环化酶C的分析物。在这样的一个方法中，对治疗患者周期性采血，然后将血样作上述血清标记之一的酶联免疫检测。当标记的浓度暗示了肿瘤复发或治疗失败时，可以随后对样本源作基因表达分析。如果存在所怀疑的肿块，取细针吸取物并如上所述对取自肿块的细胞进行基因表达分布图分析。可选择的，组织样本可以取自先前摘取了肿瘤的组织的邻近区域。当其他检测结果不确定时，这种方式特别有用。
[0060] 当其它诊断的可靠性值得怀疑时，联合使用遗传标记和其他诊断是最优选的。例如，众所周知CEA血清水平在相当程度上受到与患者癌症状态毫无关系的因子的影响。当一个患者被监测到在接受结肠癌治疗后显示常规CEA检测高水平时，那联合进行基因表达/CEA检测是有益的。
[0061] 本发明的制品包括用于治疗、诊断、预测和其它疾病评估的基因表达分布图的表示物。这些分布图表示物简化为可被机器自动可读的媒介物，如计算机可读媒介(磁性的，光学的及类似的)。制品也包括在这种媒介中评估基因表达分布图的指令说明。例如，制品可能包括具有用于比较上述基因框架的基因表达分布图的计算机指令的CD ROM。制品可能也含有基因表达分布图的数字记录以用于与患者样本的基因表达数据进行比较。可选择的，所述的分布图可以不同的表现格式记录。图形记录就是这样的一种格式。上文提到的“GENESPRING”和“DISCOVER”计算机程序中整合的聚类算法就可很好的协助这些数据形象化。
[0062] 根据本发明生产制造的不同类型的物品是指用于揭示基因表达分布图的媒介物或格式化检测。这些可以包括，例如微阵列，其中将序列互补物或探针固定于基片上，它与表示所关注基因的序列联合建立一个有关其存在的易读行列式。可选择的，根据本发明的制品可以被制作成用于进行杂交、扩增，以及形成表示所关注的基因表达水平的信号以用来检测结肠直肠癌的试剂盒。
[0063] 根据本发明制备的试剂盒包括确定基因表达分布图的格式化检测。这就包括了进行检测所需的如试剂和说明指令等所有或部分材料。
[0064] 本发明进一步用下列非限定性的实施例说明。
[0065] 实施例：根据本发明分析的基因是通过参考GenBank数据库中的基因ID号鉴定的。它们通常与编码产生蛋白质或肽的全长核苷酸序列相关。本领域的技术人员公认全长核苷酸序列的鉴定不是一个分析观点所必需的。即可以根据公知的为评估相关基因的基因表达设计探针的原理进行部分序列或ESTs选择。
[0066] 实施例1-样品处理和LCM
[0067] 收集接受结肠直肠肿瘤外科手术患者的27个新鲜冷冻组织样本。19个样本是结肠直肠恶性肿瘤样本，8个样本是正常的结肠粘膜。组织在获得后的20-30分钟内快速液氮冷冻，并随后贮存于-80℃。为了激光捕捉，将样本切片(6μm)，一切片封固于玻璃载片上，另一切片封固于已被固定于玻璃载片(Micro SlidesColorfrost，VWR Scientific，Media，PA)上的膜(P.A.L.M.)上.封固于玻璃载片上的切片在冷的丙酮中固定，并用Mayer’s苏木精(Sigma，St.Louis，MO)染色.病理学家为诊断和定级分析样本。使用Dukes分级，由附带的外科病理学和临床报告进行临床阶段评估。封固于膜上的切片在100％乙醇中固定5分钟，在曙红/100％乙醇(100μg曙红溶于100ml脱水乙醇)中复染1分钟，快速在100％乙醇中浸泡一次以除去未结合染料，空气中干燥10分钟。
[0068] 结肠直肠腺癌中的两个为等级1，10个为等级2，5个为等级3。一个恶性肿瘤样本是盲肠的类癌瘤，另一个是转移的黑色素瘤病变。两个腺癌样本表现为粘蛋白状亚型，一个为章形细胞亚型。腺癌样本按Dukes分级划分如下：DukesA：2，Dukes B：5，Dukes C：7，Dukes D：3。六个腺癌样本在手术前放疗过。
[0069] 在LCM中使用前，膜(LPC-MEMBERANE PEN FOIL 1.35μmNo.8100，P.A.L.M.GmbH Mikrolaser Technologie，Bernried，Germany)和载片经过预处理以除去RNA酶，并且增强组织样品在膜上的吸附。简要的，载片用DEPH2O洗涤，膜用RNase AWAY(Molecular Bioproducts，Inc.，San Diego，CA)洗涤并用DEP H2O冲洗。膜粘附到玻璃载片上后，载片于120℃烘烤8小时，用TI-SAD处理(Diagnostic Products Corporation，Los Angeles，CA，以1∶50溶于DEPH2O，用脱脂棉过滤)，+37℃孵育30分钟。临使用前，将10μl小份的RNA酶抑制剂溶液(RNA酶蛋白质抑制剂2500U＝33U/μl N211A，Promega GmbH，Mannheim，Germany，0.5μl溶于400μl冷的含有0.15mol NaCl，10mmol TrispH8.0，0.25mmol二硫苏糖醇的溶液)铺展到待封固组织样本的膜上。
[0070] 封 固 于 膜 上 的 组 织 切 片 用 于 LCM。 利 用PALM 自 动 微 光 束 技 术(P.A.L.M.Microlaser Technologie，Carl Zeiss，Inc.，Thomwood，NY)捕捉约2000个上皮细胞样品，并连接到Zeiss Axiovert 135显微镜中(Carl Zeiss Jena GmbH，Jena，Germany)。正常粘膜的外周基质和癌症样本中偶然的干扰基质成分都包括在内。捕捉到的细胞置于100％乙醇的小管中于-80℃保存。
[0071] 实施例2-RNA提取和扩增
[0072] 利用Zymo-Spin柱(Zymo Research，Orange，CA92867)提取通过LCM捕捉的细胞的总RNA。将约2ng总RNA重悬于10μl水并且利用T7 RNA聚合酶进行两轮扩增，扩增的RNA产量约为50μg。
[0073] 实施例3-cDNA微阵列杂交和定量
[0074] 利用一套由约20,000个人cDNA克隆组成的cDNA微阵列检测样本。将约30个植物基因印迹到微阵列上作为非特异杂交对照。利用LCM捕捉细胞的5μg aRNA合成Cy3标记的cDNA探针。探针用Qiagen’s核苷酸去除柱(Nucleotide Removal Columns)纯化然后经14-16小时杂交到微阵列上。载片在扫描前经过洗涤并于空中干燥。扫描微阵列的Cy3荧光并用ImaGene软件(Biodiscovery，Los Angeles，CA)定量。对于每个cDNA克隆，进行重复点和重复阵列的四次测量并将所得强度值平均。
[0075] 利用第三代微阵列点样仪(Molecular Dynamics)将cDNAs印迹到氨基硅烷涂层的载片上(Corning)。cDNAs经PCR扩增，纯化(Qiagen PCR纯化试剂盒)，并与10M NaSCN印迹缓冲液1∶1混合。杂交前微阵列在异丙醇中室温孵育10分钟。探针于95℃孵育2分钟，室温孵育5分钟，然后加到三个平行测定的载片上。用DPX(Fluka)将盖片密封到载片上并于42℃孵育过夜。然后将载片在1×SSC/0.2％SDS和0.1×SSC/0.2％SDS中于55℃洗涤5分钟，0.1×SSC中浸润并干燥后用第三代微阵列扫描仪(Molecular Dynamics)扫描。用AUTOGENE软件(Biodiscovery，Los Angeles)分析每个点的荧光强度。
[0076] 对芯片强度进行线性标准化使得每个芯片的强度记录75th个百分点相当于值100。芯片上的每个基因通过将该基因的强度记录除以所有样本的基因表达值记录的中间值标准化。在聚类前，那些至少在一个样本中不具有100或更大的强度记录的基因被滤掉了以限制对相似性量度的背景影响。选择一套6255个基因作聚类分析。利用作为相似性测量的相关度进行分级聚类，使具有表现正变化同时不考虑其负变化的基因的样品聚类到一起(Silicon Genetic，Sunnyville，CA)。系统图的每一个主要节点可被认为是样本的一个亚组。通过将每个肿瘤亚组与正常组进行比较鉴定差异表达的基因。筛选是基于给出的信噪比测量阈值，其中μt是肿瘤子集的平均数，μn是正常样本子集的平均数，σt+σn表示结合标准差。组内一个基因的强度记录的变异系数必须低于0.33，才可将基因包括在成对方式比较之中。肿瘤组的中间值与正常组的中间值相比大于2或等于2时为上调，小于或等于0.5倍时为下调。如果一个基因符合所有标准则被选择出来。在所有的比较中均被筛选出来的基因即被认为是在结肠直肠癌中稳定调节异常的。利用T检验假定不等方差计算统计学显著性p值。用于聚类的一套基因也用软件包(Partek，St Louis，MO)进行主成分分析(PCA)。然后将数据投射到简化的三维空间。正常的和结肠直肠肿瘤的样本以映射表达水平表现出来。
[0077] 建立有很大上调差异的基因列表以用来区别肿瘤和正常样本。利用 作为信噪比中止点先挑选出123个基因。以等于或大于1.5的比率作为上调的最低标准。也包括 的基因。已经建立了一个四基因的框架，每个基因在肿瘤和正常细胞间都有至少3倍的表达差异。
[0078] 结肠直肠癌中差异表达的基因。与正常结肠粘膜相比，39个基因在所有的肿瘤样本中差异表达。除了一个异常值，37个基因在所有的肿瘤中显著下调。2个上调。基因的身份通过微阵列上cDNA克隆的测序验证。结果如表1所示。
[0079] 表1调节基因
[0080]登记号 基因描述 平均信号强度 平均信号强度 P值
(正常) (肿瘤)
AF071569 钙调蛋白激酶II基因 93 39 4.64E-09 Seq.ID No.1
亚型delta2
AB014530 KIAA0630蛋白质的 108 50 4.83E-07 Seq.ID No.2
人类mRNA
AK000319 人KIAA0630cDNA 236 69 7.84E-06 Seq.ID No.3
U81504 AP-3复合物的 241 75 3.52E-05 Seq.ID No.4
Beta-3A-衔接蛋白亚
基mRNA
AB011166 人KIAA0594cDNA 116 55 3.53E-05 Seq.ID No.5
AB040914 人KIAA1481cDNA 187 59 8.85E-05 Seq.ID No.6
AK025205 人FLJ21552cDNA 322 97 0.00013 Seq.ID No.7
AJ278219 脂肪酸羟化酶 143 53 0.00011 Seq.ID No.8
AB046854 人KIAA1634cDNA 142 59 0.00020 Seq.ID No.9
R00585 未知 149 57 1.28E-09 Seq.ID No.10
S45844 Spi-B转录因子 140 43 0.00043 Seq.ID No.11
X98311 癌胚性抗原家族成员 6137 223 0.00044 Seq.ID No.12
2(CGM2)
BAA78050 NADPH氧化还原酶 153 84 0.00048 Seq.ID No.40
同源物
N72128 未知 164 77 0.00068 Seq.ID No.13
AB040955 人KIAA1552cDNA 334 120 0.00067 Seq.ID No.14
AF125101 HSPC040蛋白质 363 115 0.0011 Seq.ID No.15
AB023229 人KIAA1012cDNA 263 88 0.00099 Seq.ID No.16
N95761 a-L-岩藻糖苷酶基因 429 104 0.00047 Seq.ID No.17
AK025033 人FLJ21380cDNA 180 85 0.0010 Seq.ID No.18
L10844 人细胞生长调节蛋白 206 101 0.0013 Seq.ID No.19
(正常) (肿瘤)
AF071569 钙调蛋白激酶II基因 93 39 4.64E-09 Seq.ID No.1
亚型delta2
AB014530 KIAA0630蛋白质的 108 50 4.83E-07 Seq.ID No.2
人类mRNA
AK000319 人KIAA0630cDNA 236 69 7.84E-06 Seq.ID No.3
U81504 AP-3复合物的 241 75 3.52E-05 Seq.ID No.4
Beta-3A-衔接蛋白亚
基mRNA
AB011166 人KIAA0594cDNA 116 55 3.53E-05 Seq.ID No.5
AB040914 人KIAA1481cDNA 187 59 8.85E-05 Seq.ID No.6
AK025205 人FLJ21552cDNA 322 97 0.00013 Seq.ID No.7
AJ278219 脂肪酸羟化酶 143 53 0.00011 Seq.ID No.8
AB046854 人KIAA1634cDNA 142 59 0.00020 Seq.ID No.9
R00585 未知 149 57 1.28E-09 Seq.ID No.10
S45844 Spi-B转录因子 140 43 0.00043 Seq.ID No.11
X98311 癌胚性抗原家族成员 6137 223 0.00044 Seq.ID No.12
2(CGM2)
BAA78050 NADPH氧化还原酶 153 84 0.00048 Seq.ID No.40
同源物
N72128 未知 164 77 0.00068 Seq.ID No.13
AB040955 人KIAA1552cDNA 334 120 0.00067 Seq.ID No.14
AF125101 HSPC040蛋白质 363 115 0.0011 Seq.ID No.15
AB023229 人KIAA1012cDNA 263 88 0.00099 Seq.ID No.16
N95761 a-L-岩藻糖苷酶基因 429 104 0.00047 Seq.ID No.17
AK025033 人FLJ21380cDNA 180 85 0.0010 Seq.ID No.18
L10844 人细胞生长调节蛋白 206 101 0.0013 Seq.ID No.19
[0081]H96534 Gp25L2蛋白质的人 147 58 0.0015 Seq.ID No.20
类mRNA
AK001521 人FLJ10659cDNA 157 60 0.0019 Seq.ID No.21
AF151039 HSPC205蛋白质 117 60 0.0017 Seq.ID No.22
AF052059 SEL 1L蛋白质 168 53 0.0016 Seq.ID No.23
N24597 未知 166 62 0.0016 Seq.ID No.24
AK001950 内着丝粒蛋白 148 64 0.0029 Seq.ID No.25
BAA02649 巨噬细胞消除受体I 118 44 0.0031 Seq.ID No.41
型
N75004 未知 98 48 0.0031 Seq.ID No.26
W16916 人KIAA0260cDNA 162 61 0.0037 Seq.ID No.27
X52001 人类内皮素3mRNA 89 33 0.0042 Seq.ID No.28
T50788 未知 364 102 0.0059 Seq.ID No.38
AJ005866 推定的Sqv-7样蛋白 381 163 0.0049 Seq.ID No.29
AF113535 MAID蛋白质 218 100 0.0053 Seq.ID No.39
AB037789 人KIAA1368cDNA 164 62 0.0068 Seq.ID No.30
M33987 碳酸酐酶 652 46 0.0074 Seq.ID No.31
M77830 桥粒斑蛋白1(DP1) 184 81 0.0092 Seq.ID No.32
H81220 EST功能域转录因子 113 55 0.017 Seq.ID No.33
ELF1
AF000592 人染色体21q11-q21 33 69 1.16E-05 Seq.ID No.35
基因组克隆
AK021701 人FLJ11639cDNA 31 63 0.00070 Seq.ID No.36
类mRNA
AK001521 人FLJ10659cDNA 157 60 0.0019 Seq.ID No.21
AF151039 HSPC205蛋白质 117 60 0.0017 Seq.ID No.22
AF052059 SEL 1L蛋白质 168 53 0.0016 Seq.ID No.23
N24597 未知 166 62 0.0016 Seq.ID No.24
AK001950 内着丝粒蛋白 148 64 0.0029 Seq.ID No.25
BAA02649 巨噬细胞消除受体I 118 44 0.0031 Seq.ID No.41
型
N75004 未知 98 48 0.0031 Seq.ID No.26
W16916 人KIAA0260cDNA 162 61 0.0037 Seq.ID No.27
X52001 人类内皮素3mRNA 89 33 0.0042 Seq.ID No.28
T50788 未知 364 102 0.0059 Seq.ID No.38
AJ005866 推定的Sqv-7样蛋白 381 163 0.0049 Seq.ID No.29
AF113535 MAID蛋白质 218 100 0.0053 Seq.ID No.39
AB037789 人KIAA1368cDNA 164 62 0.0068 Seq.ID No.30
M33987 碳酸酐酶 652 46 0.0074 Seq.ID No.31
M77830 桥粒斑蛋白1(DP1) 184 81 0.0092 Seq.ID No.32
H81220 EST功能域转录因子 113 55 0.017 Seq.ID No.33
ELF1
AF000592 人染色体21q11-q21 33 69 1.16E-05 Seq.ID No.35
基因组克隆
AK021701 人FLJ11639cDNA 31 63 0.00070 Seq.ID No.36
[0082] 实施例4结肠直肠肿瘤的优化框架
[0083] 利用方差优化算法生成多重基因基础的标记，其中所包括的基因可结合使用以区别正常和肿瘤样本。利用样本和如实施例1-3所描述的微阵列进行强度检测。首先，基于肿瘤和正常样本间的预定5倍差异，对待分析的数据进行预选。根据这个标准预选出来的基因的表达数据随后作如下使用。以非转移性样本作为基线，计算出每个基因的强度测量*值的平均数和标准差。然后对于每个基线基因计算鉴别值X(标准差+平均值)(X值指定为3)。这个值用来确保结果框架是有说服力的。再计算每个转移性样本的鉴别值与基线值的比率。这个比率随后被转换成常用对数。然后这个数据被输入Wagner软件，产生一个有效边界，从中选择出一个4基因框架。这套基因包括一未知序列，前胶原I型，核糖体蛋白L21的大亚基，和纤连蛋白。这些基因确定为Seq.ID.No.42，Seq.ID.No.43，Seq.ID.No.44和Seq.ID.No.45的序列。换句话说，形成框架的基因组合可以为关于结肠直肠癌的临床判定提供有用的诊断信息。这在将选自该框架的基因组合与附加标记(遗传或非遗传的)相结合时特别有益。
[0084] 优化的基因框架：
[0085] ＞ gi|1264443|gb|N92134.1|N92134 za23f09.r1 Soares fetalliver spleenINFLS Homo sapiens cDNA clone IMAGE：293417 5’similar to gb|M87908|HUMALNE32 Human carcinoma cell-derived Alu RNA transcript，(rRNA)；
gbX57025_rnal INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR IA PRECURSOR(HUMAN)
gbX57025_rnal INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR IA PRECURSOR(HUMAN)
[0086] ＞gi|2221047|gb|AA490172.1|AA490172 ab06b08.s1 Stratagene fetalretina937202 Homo sapiens cDNA clone IMAGE：8399913’similar to gb：J03464PROCOLLAGEN ALPHA 2(I)CHAIN PRECURSOR(HUMAN)
[0087] ＞ gi|2188912|gb|AA464034.1|AA464034 zx86b09.r1 Soares ovarytumor NbHOT Homo sapiens cDNA clone IMAGE：8106175’similar toSW：RL21_HUMAN P4677860S RIBOSOMAL PROTEIN L21
[0088] ＞ gi|834491|gb|R62612.1|R62612 yi12d01.s1 Soares placenta Nb2HPHomo sapiens cDNA clone IMAGE：1390093’similar to gb：X02761-cds1FIBRONECTIN PRECURSOR(HUMAN)；
[0089] 使用不同的标准但相同的方法，通过软件选出了又一个四基因框架。这些是Seq.ID.No.46，Seq.ID.No.47，Seq.ID.No.48和Seq.ID.No.49的序列。两个基因与第一个四基因框架重叠。两个优化框架也可以结合形成一个六基因框架。
[0090] 优化的基因框架：
[0091] ＞ gi|2114953|gb|AA431245.1|AA431245.1 zw78d06.r1Soares_testis_NHT Homo sapiens cDNA clone IMAGE：7823155’similar towp：F36H1.2CE05814 ANKYRIN LIKE[0092] ＞gi|2156172|gb|AA443497.1|AA443497 zw34d03.r1 Soares ovarytumor NbHOT Homo sapiens cDNA clone IMAGE：771173
[0093] ＞ gi|2221047|gb|2|AA490172 ab06b08.s1 Stratagene fetal retina937202Homo sapiens cDNA clone IMAGE：8399913’similar to gb：J03464PROCOLLAGEN ALPHA 2(I) CHAIN PRECURSOR(HUMAN)
[0094] ＞ gi|1264443|gb|N92134.1|N92134 za23f09.r1 Soares fetalliver spleenINFLS Homo sapiens cDNA clone IMAGE：2934175’similar to gb|M87908|HUMALNE32 Human carcinoma cell-derived Alu RNA transcript，(rRNA)；
gbX57025_rnal INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR IA PRECURSOR(HUMAN)；
gbX57025_rnal INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR IA PRECURSOR(HUMAN)；
[0096] <110>WANG，YIXIN
[0097] <120>评估结肠直肠癌
[0098] <130>CDS 267 US NP
[0099] <140>TBD
[0100] <141>2003-03-21
[0101] <150>60/368,798
[0102] <151>2002-03-29
[0103] <160>49
[0104] <170>PatentIn version 3.1
[0105] <210>1
[0106] <211>1500
[0107] <212>DNA
[0108] <213>人
[0109] <400>1
[0110] atggcttcga ccaccacctg caccaggttc acggacgagt atcagctttt cgaggagctt 60[0111] ggaaaggggg cattctcagt ggtgagaaga tgtatgaaaa ttcctactgg acaaggatat 120[0112] gctgccaaaa ttatcaacac caaaaagctt tctgctaggg atcatcagaa actagaaaga 180[0113] gaagctagaa tctgccgtct tttgaagcac cctaatattg tgcgacttca tgatagcata 240[0114] tcagaagagg gctttcacta cttggtgttt gatttagtta ctggaggtga actgtttgaa 300[0115] gacatagtgg caagagaata ctacagtgaa gctgatgcca gtcattgtat acagcagatt 360[0116] ctagaaagtg ttaatcattg tcacctaaat ggcatagttc acagggacct gaagcctgag 420[0117] aatttgcttt tagctagcaa atccaaggga gcagctgtga aattggcaga ctttggctta 480[0118] gccatagaag ttcaagggga ccagcaggcg tggtttggtt ttgctggcac acctggatat 540[0119] ctttctccag aagttttacg taaagatcct tatggaaagc cagtggatat gtgggcatgt 600[0120] ggtgtcattc tctatattct acttgtgggg tatccaccct tctgggatga agaccaacac 660[0121] agactctatc agcagatcaa ggctggagct tatgattttc catcaccaga atgggacacg 720[0122] gtgactcctg aagccaaaga cctcatcaat aaaatgctta ctatcaaccc tgccaaacgc 780[0123] atcacagcct cagaggcact gaagcaccca tggatctgtc aacgttctac tgttgcttcc 840[0124] atgatgcaca gacaggagac tgtagactgc ttgaagaaat ttaatgctag aagaaaacta 900[0125] aagggtgcca tcttgacaac tatgctggct acaaggaatt tctcagcagc caagagtttg 960[0126] ttgaagaaac cagatggagt aaaggagtca actgagagtt caaatacaac aattgaggat 1020[0127] gaagatgtga aagcacgaaa gcaagagatt atcaaagtca ctgaacaact gatcgaagct 1080[0128] atcaacaatg gggactttga agcctacaca aaaatctgtg acccaggcct tactgctttt 1140[0129] gaacctgaag ctttgggtaa tttagtggaa gggatggatt ttcaccgatt ctactttgaa 1200[0130] aatgctttgt ccaaaagcaa taaaccaatc cacactatta ttctaaaccc tcatgtacat 1260[0131] ctggtagggg atgatgccgc ctgcatagca tatattaggc tcacacagta catggatggc 1320[0132] agtggaatgc caaagacaat gcagtcagaa gagactcgtg tgtggcaccg ccgggatgga 1380[0133] aagtggcaga atgttcattt tcatcgctcg gggtcaccaa cagtacccat caagccaccc 1440[0134] tgtattccaa atgggaaaga aaacttctca ggaggcacct ctttgtggca aaacatctga 1500[0135] <210>2
[0136] <211>5761
[0137] <212>DNA
[0138] <213>人
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[2288] ttcttttgga aaaccaaaca tgctttattt catttttttc acaatttatt taaacatctc 60[2289] acatatacaa aataggtaca atttaatttt tctgcttgcc caagaaacaa agcttctgtg 120[2290] gaaccatgga agaagatgaa aatgagactg gcaaagaaca aatgctgaat ctgaagaaga 180[2291] ggacaacttt gggcaaataa tctgcatact tttaattggg aataagatgg aaaatatgaa 240[2292] tgctaaatca aattttttaa aaaatacacc acacgataca actcaataca ggagtatttc 300[2293] ttctcaaatt cttctagcac catcaacatt cttcaagtat ctgaaatact attaattagc 360[2294] acctttgtat tatgaacaaa acaaaacaag gacctcagtt catctctgtc taggtcagca 420[2295] cctaacaatg tggatcacac tcatgggaaa gtgttttgag gtagtttaaa cctttggaag 480[2296] tttgggtttt aaacttccct ctgtggaaga tattcaaaag ccacaagtgg tgcaaatgtt 540[2297] tatggttttt atttttcaat ttttattttg gttttcttac aaaggttgac atttttcata 600[2298] acaggtgtaa gagtgttgaa aaaaaaattt caatttttgg ngggaacggg ggaaggagtt 660[2299] aatgaaact 669[2300] <210>49
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