人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物及其应用
阅读：29发布：2020-05-12
专利汇可以提供人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了人 结直肠癌 或人结直肠癌转移的预测性 生物 标志物，它包括Ube2v1蛋白。基于构建的Ube2v1稳定过表达的结直肠细胞株和裸鼠实验结果表明，Ube2v1可促进 肿瘤 的生长和转移。没有功能的Ube2v1通过结合Ube2N降解去乙酰化酶Sirt1，从而削弱Sirt1对组蛋白H4K16位点的去乙酰化作用，促进结直肠癌的转移。在结直肠癌细胞中添加NSC697923化合物，Ube2v1对去乙酰化酶Sirt1的降解作用明显减弱。结果表明Ube2v1能作为结直肠癌发生和转移的标志物，且NSC697923可以应用于制备抗结直肠癌转移药物，具有重要的临床应用价值。，下面是人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物及其应用专利的具体信息内容。
1.人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物，其特征在于，它包括Ube2v1蛋白。
2.一种人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测或筛查的试剂盒，其特征在于，它包括Ube2v1蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测或筛查的试剂盒，其特征在于，所述的Ube2v1蛋白的氨基酸序列为：
Met-Ala-Ala-Thr-Thr-Gly-Ser-Gly-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Asn-Phe-Arg-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Glu-Glu-Gly-Gln-Lys-Gly-Val-Gly-Asp-Gly-Thr-Val-Ser-Trp-Gly-Leu-Glu-Asp-Asp-Glu-AspMet-Thr-Leu-Thr-Arg-Trp-Thr-Gly-Met-Ile-Ile-Gly-Pro-Pro-Arg-Thr-Ile-Tyr-Glu-Asn-Arg-Ile-Tyr-Ser-Leu-Lys-Ile-Glu-Cys-Gly-Pro-Lys-Tyr-Pro-Glu-Ala-Pro-Pro-Phe-Val-Arg-Phe-Val-Thr-Lys-Ile-Asn-Met-Asn-Gly-Val-Asn-Ser-Ser-Asn-Gly-Val-Val-Asp-Pro-Arg-Ala-Ile-Ser-Val-Leu-Ala-Lys-Trp-Gln-Asn-Ser-Tyr-Ser-Ile-Lys-Val-Val-Leu-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Leu-Met-Met-Ser-Lys-Glu-Asn-Met-Lys-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Glu-Gly-Gln-Cys-Tyr-Ser-Asn。
4.自噬诱导剂在制备防治人结直肠癌或人结直肠癌转移药物中的应用。
5.根据权利要求3所述的自噬诱导剂在制备防治人结直肠癌或人结直肠癌转移药物中的应用，其特征在于，所述的自噬诱导剂为雷帕霉素或海藻糖。
6.NSC697923在制备防治人结直肠癌或人结直肠癌转移药物中的应用，NSC697923的CAS编号为343351-67-7，分子式为C11H9NO5S,结构式如下：
人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种泛素结合酶,尤其涉及人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物Ube2v1及其新用途，属于生物医学技术领域。
背景技术
[0002] 泛素-蛋白酶体途径由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating protein，E2)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligase，E3)、26S蛋白酶体和泛素解离酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)等组成，其对靶蛋白的降解是由各个组分承担相应功能的一种级联反应。简而言之，泛素首先在E1催化下获得活性，E1-泛素结合的中间体再将泛素转移给E2，形成E2-泛素中间体；最后，E3s可以直接或间接与底物结合，促使泛素从与E2s转移到靶蛋白上；当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在E3s的催化下相继与底物相连的泛素分子的残基相连，形成一条多聚泛素链；完成泛素化的靶蛋白被展平进入26S蛋白酶体，在蛋白酶体的催化中心中被降解，同时泛素分子可被DUBs从底物上水解下来，重复利用。
[0003] 由泛素系统控制的蛋白质降解，不单可以清除错误折叠的蛋白质，它也是调控细胞信号转导的重要方式。泛素系统控制的蛋白质降解还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。此外，泛素系统异常导致底物蛋白降解或功能的障碍，与许多疾病如炎症性疾病、肿瘤等密切相关。
[0004] 泛素结合酶(E2s)是组成泛素-蛋白酶体途径的重要成分。在泛素化过程中，E2必须在E1和E3之间穿梭往返运行，E1和E3通过相同的基序与E2连接。为了保证在激活的泛素与数量巨大的E3之间得到平衡的分布，需要多个E2异构体。泛素结合酶E2种类很多，分子量在14-35kDa之间，存在于细胞质和细胞核中。哺乳动物中所有的E2都含有一个保守的大约150个氨基酸的核心结构域，在结构域的中央是决定E2活性的半胱氨酸残基，位于蛋白表面浅的裂隙内。
[0005] 结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的消化道肿瘤之一，严重威胁人类健康。迄今，其在全球的发病率和死亡率呈上升趋势。目前泛素结合酶E2s在肿瘤包括结直肠癌中的角色也逐渐被人们重视。
[0006] 泛素结合酶E2变体1(Ube2v1)属于泛素结合酶E2变体家族，它在结直肠癌中的作用尚不清楚。Ube2v1蛋白属于泛素结合酶E2变体蛋白家族，该家族蛋白的序列与其它泛素结合酶相似，但是它们缺少了决定E2活性的半胱氨酸残基，因而不具有泛素结合酶的活性。它的功能意义如何还存在许多的疑问。有研究表明，Ube2v1可通过Lys-63结合Ube2n形成异源二聚体，形成非典型多聚泛素化链，进而通过激活MAP3K7/TAK1复合物活化NF-kappa-B和MAPK通路，从而调控炎症基因的表达。这种类型的多聚泛素化链还能激活IKK，不经过蛋白酶体途径降解蛋白。同时，Ube2v1可以通过IL1B，TNF，TRAF6以及TRAF2分子激活NF-kappa-B通路。此外，它在调控靶基因的转录激活，控制细胞周期和分化，DNA损伤后的细胞修复中均扮演着重要的角色。但是Ube2v1在肿瘤包括结直肠癌中的作用及其作用机制尚不清楚。
发明内容
[0007] 发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中治疗结直肠癌药物的不足，通过对ube2v1深入研究，表明Ube2v1参与调控结直肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)，并且Ube2v1可通过自噬途径调控EMT从而促进结直肠癌转移。本发明通过大量实验筛选和研究，表明Ube2v1可作为人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物，或者人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测或筛查的试剂盒成分。本发明另一个目的是提供Ube2v1在针对性和靶细胞特异性的结直肠癌转移的防治药物。
[0008] 技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
[0009] 人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测性生物标志物，它包括Ube2v1蛋白。
[0010] 一种人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测或筛查的试剂盒，它包括Ube2v1蛋白。
[0011] 本发明提供的一种人结直肠癌或人结直肠癌转移的预测或筛查的试剂盒，所述的Ube2v1蛋白的氨基酸序列为：
[0012] Met-Ala-Ala-Thr-Thr-Gly-Ser-Gly-Val-Lys-Val-Pro-Arg-Asn-Phe-Arg-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Glu-Glu-Gly-Gln-Lys-Gly-Val-Gly-Asp-Gly-Thr-Val-Ser-Trp-Gly-Leu-Glu-Asp-Asp-Glu-AspMet-Thr-Leu-Thr-Arg-Trp-Thr-Gly-Met-Ile-Ile-Gly-Pro-Pro-Arg-Thr-Ile-Tyr-Glu-Asn-Arg-Ile-Tyr-Ser-Leu-Lys-Ile-Glu-Cys-Gly-Pro-Lys-Tyr-Pro-Glu-Ala-Pro-Pro-Phe-Val-Arg-Phe-Val-Thr-Lys-Ile-Asn-Met-Asn-Gly-Val-Asn-Ser-Ser-Asn-Gly-Val-Val-Asp-Pro-Arg-Ala-Ile-Ser-Val-Leu-Ala-Lys-Trp-Gln-Asn-Ser-Tyr-Ser-Ile-Lys-Val-Val-Leu-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Leu-Met-Met-Ser-Lys-Glu-Asn-Met-Lys-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Glu-Gly-Gln-Cys-Tyr-Ser-Asn。序列表如SEQ ID NO 1所示。
[0013] 一、发明提供Ube2v1在结直肠癌转移中作用的实验研究
[0014] 申请人用Ube2v1稳定过表达的结直肠癌细胞株SW480及其对照分别注射入裸鼠尾静脉，制作裸鼠肺转移模型。通过测量结直肠癌细胞转移后两组小鼠的肺重和体重，镜下观察肺组织中转移灶的大小，进一步确认Ube2v1是否促进结直肠癌的转移。
[0015] 该实验的结果图1至图4，RT-PCR的结果显示39对临床结直肠癌标本中Ube2v1的表达明显高于癌旁组织。IHC的结果显示在89对临床结直肠癌标本中Ube2v1的表达明显高于癌旁组织，远端转移的组织中该基因的表达明显高于原位癌，TNM IV的组织中该基因的表达明显高于TNM I的组织。应用PrognoScan(http://www.prognoscan.org/)软件在公共基因表达谱中预测出Ube2v1高表达的结直肠癌病人生存率远低于Ube2v1低表达的病人。
[0016] 另外如图5至图6结果显示，在裸鼠中皮下注射Ube2v1稳定过表达结直肠癌细胞株及其对照株，1个月后摘取裸鼠皮下瘤，比较发现Ube2v1过表达组的瘤较对照组的瘤体积相比明显较大。另外，图5至图6结果显示，在注射了Ube2v1稳定过表达的结直肠癌细胞的裸鼠在2个月后，与对照相比，肉眼观其肺组织上转移灶点明显多于对照组，其肺重比体重的比值显著高于对照组，我们镜下观察HE的切片中两组小鼠肺组织的转移灶点的大小并计数，过表达Ube2v1结直肠癌细胞的小鼠肺部转移灶点数目明显多于对照，且灶点范围更大伴有大面积的坏死。
[0017] 以上结果表明Ube2v1可以做为结直肠癌发生和转移的标志物。
[0018] 二、基于Ube2v1的结直肠癌及其结直肠癌转移防治药物的筛选实验[0019] 申请人用实时荧光定量PCR方法，在敲低Ube2v1的结直肠癌细胞中检测自噬相关的基因Beclin1、LC3等12个自噬相关基因在转录水平变化，进而确定Ube2v1对结直肠癌细胞自噬的影响。
[0020] 申请人在裸鼠尾静脉注射Ube2v1过表达的结直肠癌细胞后一周，又在裸鼠腹腔内注射自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)，通过测量小鼠的肺重和体重，镜下观察肺组织中转移灶的大小，和免疫组化检测EMT的相关蛋白指标，进一步确定自噬诱导物能够削弱Ube2v1促进结直肠癌转移的作用。
[0021] 申请人再次用海藻糖(trehalose)，另一种自噬诱导剂重复该体内实验，最终确定Ube2v1促进结直肠癌转移的效果能通过自噬抑制剂得到缓解。
[0022] 本发明结果图7至图8，尾静脉注射Ube2v1过表达的结直肠癌细胞后一周，我们在裸鼠腹腔注射了自噬诱导剂rapamycin或trehalose，隔一天注射一次，2个月后，观察对照组，Ube2v1过表达组和Ube2v1过表达后腹腔注射rapamycin组或trehalose组，这三组小鼠的肺转移情况。镜下观察三组小鼠肺部的HE切片，观察这三组小鼠肺部灶点的大小并计数。发现Ube2v1过表达组的肺部灶点较其它两组最多，其次是Ube2v1加rapamycin(或trehalose)组，灶点最少的是对照组。同时对这三组小鼠的肺重与体重的比值做了比较，比值最高的是Ube2v1过表达组，Ube2v1加rapamycin组(或trehalose)居中。该结果提示自噬诱导剂能缓解Ube2v1对结直肠癌转移的促进效应。
[0023] 申请人采用IHC的方法观察以上三组小鼠(两种自噬诱导剂)的肺组织中beclin1，E-cadherin的表达情况。图7至图8结果显示Ube2v1组中beclin1的表达最低，Ube2v1加自噬诱导剂组居中，对照组最高。E-cadherin在Ube2v1组中表达最低，Ube2v1加自噬诱导剂组中居中，对照组最高。
[0024] 以上结果表明，Ube2v1可促进结直肠癌的转移，且通过自噬途径调控结直肠癌的转移。在Ube2v1促进转移的加入自噬诱导剂，能明显减缓肿瘤细胞转移的效力，因此自噬诱导剂可用于制备防治人结直肠癌或人结直肠癌转移药物；作为优选方案，自噬诱导剂为雷帕霉素或海藻糖。
[0025] 三、NSC697923在制备治疗结直肠癌及其转移药物的筛选实验
[0026] 申请人在通过实验研究表明：Ube2v1促进结直肠癌转移时，独自没有功能的Ube2v1通过结合Ube2N(Ubc13)降解去乙酰化酶Sirt1，从而削弱Sirt1对组蛋白H4K16位点的去乙酰化作用。图9的结果显示，Ube2v1能减弱Sirt1蛋白水平的表达，增加组蛋白H4K16位点的去乙酰化作用，在此基础上，加入Sirt1，组蛋白H4K16位点的去乙酰化作用会被减弱。
[0027] 申请人通过Co-IP的实验结果(图10)表明，在结直肠癌细胞体系中，Ube2v1不能直接作用于Sirt1，Ube2v1是通过Ube2N(Ubc13)起泛素结合酶的功能，从而降解Sirt1。在结直肠癌细胞中用加入化合物NSC697923(图11)，NSC697923是特异性抑制Ube2v1和Ube2N相互作用的药物，此时Ube2v1对去乙酰化酶Sirt1的降解作用明显减弱。
[0028] 如表1RT-PCR结果显示，这种Sirt1的降解会在转录水平减弱自噬相关基因的表达，最终促进结直肠癌细胞上皮到间质的转化，促进结直肠癌的转移。
[0029] 表1SW480结直肠癌细胞中Ube2V1的低表达对自噬12个相关基因转录水平的影响(p值均小于0.05)
[0030]
[0032] 图1是Ube2v1在结直肠癌和癌旁临床标本中的表达(RT-PCR)结果图。
[0033] 图2是Ube2v1在结直肠癌和癌旁临床标本中的表达(免疫组化)结果图。
[0034] 图3是Ube2v1在有无远端转移的组织中的表达(免疫组化)结果图。
[0035] 图4是Ube2v1在结直肠癌转移的临床四个阶段的表达(免疫组化)结果图。
[0036] 图5是Ube2v1过表达的结直肠癌细胞及其对照在裸鼠皮下成瘤模型中分离出肿瘤的体积和重量的结果图。
[0037] 图6是Ube2v1过表达的结直肠癌细胞在肺转移裸鼠模型中肺重与体重的比值及每个个体肺组织上转移灶点的数目的结果图。
[0038] 图7是对照组、Ube2v1过表达组以及Ube2v1过表达加雷帕霉素组裸鼠肺转移模型中肺重与体重比值，每个个体肺转移灶点的数目的结果图。
[0039] 图8是对照组、Ube2v1过表达组以及Ube2v1过表达加海藻糖组裸鼠肺转移模型中肺重与体重比值，每个个体肺转移灶点的数目的结果图。
[0040] 图9是SW480结直肠癌细胞中Ube2v1通过抑制Sirt1的表达增强H4K16位点的去乙酰化水平的结果图。
[0041] 图10 Ube2N(Ubc13)与Sirt1有直接相互作用，Ube2v1与Sirt1无直接相互作用的结果图。
[0042] 图11 NSC697923通过特异性阻断Ube2v1与Ube2N的直接作用来抑制Ube2v1对Sirt1的泛素化降解的结果图。
具体实施方式
[0043] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0044] 1、构建Ube2v1稳定过表达的结直肠癌细胞株
[0046] 构建Ube2v1稳定过表达结直肠癌细胞株SW480及相应的对照组细胞株。
[0047] 2、裸鼠皮下成瘤和肺转移模型的建立
[0048] SPF级别4-6周的裸鼠(上海斯莱克公司)，放置于SPF房1周后准备注射结直肠癌细胞。
[0049] 将对数期的细胞消化，PBS洗细胞3遍，PBS悬浮细胞，计数，计数细胞为5×105/ml，分别取200μl过表达Ube2v1及其对照组的结直肠癌细胞接种于裸鼠背部左右两侧。观察4周后，拍照，取瘤，测量瘤的体积，部分冻存液氮中，部分-80℃保存。
[0050] 制作肺转移模型时，计数细胞1×106/ml，分别取200μl过表达Ube2v1及其对照组的结直肠癌细胞注射裸鼠尾静脉，观察6-8周后，称小鼠体重，拍照，解剖小鼠取肺组织，拍照，称量肺组织的重量，部分组织液氮冻存，部分组织固定包埋，制作成蜡块。
[0051] 3、HE染色
[0052] 将制作好的石蜡切片经过二甲苯3次各5分钟和由高到低浓度的酒精各1分钟，再浸入水中水化5-10分钟。切片浸入苏木精中3分钟，流水冲去浮色，再至于温水中1分钟返蓝。切片浸入伊红20-30秒，经过95％，100％的酒精脱色，用中性树胶封片。待树脂干后可长期保存，显微镜下拍片。
[0053] 4、应用免疫组化法检测Ube2v1、自噬通路中关键蛋白及EMT关键蛋白的表达[0054] 应用相关抗体免疫组织化学方法检测结直肠癌患者组织标本。首先应用苏州大学附属第一医院提供的组织芯片(具有完整生存情况)进行，重点观察相关蛋白的表达水平及定位；比较癌和癌旁组织中相关蛋白表达水平的差异；观察相关蛋白在转移性结直肠癌患者中的表达。观察蛋白表达与临床病理指标之间的关系。
[0055] 应用相关抗体免疫组织化学方法检测结直肠癌患者组织标本。重点观察相关蛋白的表达水平及定位；比较不同Dukes分期中相关蛋白表达水平及定位的差异。组织芯片常规脱蜡至水：二甲苯I、II、III各5分钟，100％乙醇I、II各5分钟，95％乙醇I、II各5分钟，85％乙醇5分钟，双蒸馏水5分钟。PBS洗3×3分钟；0.3％H2O25分钟阻断内源性过氧化物酶；以PH6.00.01M的柠檬酸缓冲液为抗原修复液，进行高压锅抗原修复，排气2.5分钟，停止加热，移置流水降温降压，开盖自然冷却到室温；滴加正常山羊血清，室温20分钟；去正常山羊血清，滴加抗体，室温2小时，PBS洗3×2分钟；滴加生物素化二抗(羊抗兔)，37℃孵育20分钟，PBS洗3×2分钟；DAB溶液显色，显微镜下控制染色深度8-12分钟，蒸馏水冲洗；苏木素复染，经80％、95％、100％乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜检观察。
[0056] 5、实时定量PCR
[0057] RNA提取
[0058] 在SW480结直肠癌细胞中瞬时敲低Ube2v1，按照Trizol法抽提对照组，瞬时敲低Ube2v1组的总RNA，测定浓度后取500ng总RNA进行反转录，得到的cDNA产物用于RT-PCR的模板。
[0059] 采用实时定量PCR进行自噬相关基因定量分析
[0060] 每个PCR体系加入2μl模板，参考Takara公司的SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real time)的说明进行。
[0061] 6、免疫共沉淀Co-IP
[0062] 转染后48h收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30分钟,细胞裂解液于4℃，最大转速离心30分钟后取上清；取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；取10μl protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm/分钟离心3分钟；将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4小时，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在4℃以3000rpm/分钟速度离心3分钟，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3至4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；westernblotting检测。
[0063] 7、实验结果
[0064] 本发明通过以上实验表明，Ube2v1在人结直肠癌临床标本的癌组织中高表达。基于构建的Ube2v1稳定过表达的结直肠细胞株和裸鼠实验结果表明，Ube2v1可促进肿瘤的生长和转移。独自没有功能的Ube2v1可通过结合Ube2N降解去乙酰化酶Sirt1，从而削弱Sirt1对组蛋白H4K16位点的去乙酰化作用。
[0065] 并且这种组蛋白修饰会在转录水平减弱自噬相关基因的表达，最终促进结直肠癌细胞上皮到间质的转化，促进结直肠癌的转移。本发明在直肠癌细胞中添加化合物NSC697923，它是一种特异性阻断Ube2v1与Ube2N结合的化学药物，此时Ube2v1对去乙酰化酶Sirt1的降解作用明显减弱。以上结果表明Ube2v1能作为结直肠癌发生和转移的标志物，且NSC697923可以应用于制备抗结直肠癌转移的药物。NSC697923的CAS编号为343351-67-7，分子式为C11H9NO5S，结构式如下：
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