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一种结直肠癌 诊断 试剂盒

阅读：239发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种结直肠癌诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结直肠癌诊断试剂盒。该试剂盒含有检测待测样品中的待测序列甲基化水平的试剂，所述待测序列位于miR-17-92簇转录起始位点上游3.5kb序列到下游2kb序列之间。本发明首次发现原癌非编码RNA miR-17-92簇在结直肠癌中的低甲基化水平，其与结直肠癌的发生发展相关。miR-17-92簇甲基化水平可以作为肿瘤检测的生物指标，辅助诊断结直肠癌，提高检测特异性、敏感度，降低错误率，为了解肿瘤发病机制及诊断具有十分重要的临床指导意义。，下面是一种结直肠癌诊断试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种试剂盒，其特征在于，含有检测待测样品中的待测序列甲基化水平的试剂，所述待测序列位于miR-17-92簇转录起始位点上游3.5kb序列到下游2kb序列之间。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于进行结直肠癌诊断、结直肠癌风险评估和/或结直肠癌治疗效果评估。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述miR-17-92簇位于人类染色体
13q31.3上，GI:387942364。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述待测序列位于miR-17-92簇转录起始位点上游1.5kb序列到下游1.5kb序列之间，优选地，所述待测序列为SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:25的反向互补序列。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述待测样品选自粪便、血液和活检组织中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测所述待测序列甲基化水平的方法选自焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法和质谱中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括选自下组中的至少一组寡核苷酸引物对：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:
17和SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，以及SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括检测miR-
17-92簇表达量的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测miR-17-92簇表达量的试剂包括寡核苷酸引物对，优选地，所述寡核苷酸引物对序列选自下组中的至少一组：SEQ ID NO:
26和SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测miR-17-92簇表达量的试剂包括逆转录引物和Taqman探针，优选地，所述逆转录引物的序列为SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:31，所述Taqman探针的序列为SEQ ID NO:32和/或SEQ ID NO:33。

说明书全文

一种结直肠癌 诊断 试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结直肠癌诊断试剂盒。

背景技术

[0002] 结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是全球高发癌症之一。我国结直肠癌的发病率约为14.2/100,000，近20年呈大幅上升趋势，已经成为发病率上升最快的恶性肿瘤之一。结直肠癌的发生要经过正常黏膜，增生，腺瘤形成，腺瘤癌变直至浸润转移的阶段性演变，其发展过程可长达10余年。其中，腺瘤性息肉是结直肠癌最主要的癌前病变。腺瘤性息肉逐渐增大，到最终发生恶变常常需要数年时间。结直肠癌如果能在早期发现，那么经手术切除后，治愈率非常高，可达90％以上。

[0003] 目前结直肠癌被认为是由环境、遗传等多种因素参与的一个多阶段多步骤累积的致病过程，其发生和致病机制颇为复杂。表观遗传(epigenntics)调控在结直肠癌的发病过程中起到重要的作用，即在基因组DNA中碱基序列未发生变化的情况下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因的表达。

[0004] DNA甲基化与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关。启动子DNA甲基化可导致基因转录沉默，使抑癌基因、细胞周期调节基因、凋亡基因等表达极度降低或不表达。去甲基化则会诱导原癌基因的重新活化和表达，参与肿瘤的发生发展。以往大量研究表明，癌症相关基因DNA的甲基化水平改变要早于细胞恶性增生，故对其进行甲基化水平检测可用于肿瘤的预测、诊断、分级以及预后评估。因此，癌症相关基因DNA启动子的甲基化水平研究，已经成为肿瘤领域中表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。

[0005] 近年来对于微小RNA(miRNA)的研究逐渐被重视，成为肿瘤研究的热点。miRNA是一类长度约为22nt的内源性非蛋白编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，它能够与其相应靶基因的信使RNA(mRNA)的3’端非翻译区(3’-UTR区)结合，从而使mRNA发生降解或抑制其翻译。研究表明miRNA与肿瘤关系密切，充当癌基因或抑癌基因的角色，在肿瘤细胞的生长、增殖、分化、凋亡、恶性间质转化等方面发挥重要作用。

[0006] miR-17-92簇又称为C13orf25，位于人类第13号染色体。大多数研究认为miR-17-92簇是强效的原癌基因，是原癌基因miRNA的典型代表。该簇位于MIR17HG(miR-17-92簇宿主基因)内含子中，初级转录本是一个长约0.8kb的多顺反子，编码为6个独立的成熟miRNA，即miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a-1。它们在胚胎发育、免疫系统、肾脏和心脏发育、衰老以及肿瘤发生中发挥作用。在各种造血系统的恶性肿瘤、肺癌和多种实体肿瘤中发现miR-17-92簇高表达。在结直肠腺瘤向结直肠癌演变中，miR-17-92簇的表达量发生显著变化，并与结直肠腺瘤到腺癌的发生发展有关。然而，目前对于结直肠癌中miRNA甲基化的研究较少。miR-17-92簇甲基化水平在肿瘤中的作用还未有报道。因此，探讨miR-17-92簇甲基化水平与肿瘤的关系，为了解肿瘤发病机制及诊断具有十分重要的临床指导意义。

发明内容

[0007] 本发明旨于提供了一种新的结直肠癌诊断试剂盒。

[0008] 因此，本发明的目的之一在于提供一种试剂盒。

[0009] 本发明所采用的技术方案如下文所述。

[0010] 一种试剂盒，含有检测待测样品中的待测序列甲基化水平的试剂，所述待测序列位于miR-17-92簇转录起始位点上游3.5kb序列到下游2kb序列之间。

[0011] 进一步地，所述甲基化水平采用甲基化率表示；所述甲基化率是指发生甲基化的C在所有CG位点中所占的比例。

[0012] 进一步地，所述试剂盒用于进行结直肠癌诊断、结直肠癌风险评估和/或结直肠癌治疗效果评估。

[0013] 进一步地，所述miR-17-92簇位于人类染色体13q31.3上，GI:387942364，Gene ID为407975 GRCh38。miR-17-92簇位于人类第13号染色体上，目前数据库中记载的miR-17-92簇GI:387942364，Gene ID为407975 GRCh38；本发明的目的是检测miR-17-92簇甲基化即miR-17-92簇转录起始位点上游3.5kb序列到下游2kb序列的甲基化的水平变化从而诊断结直肠癌的发生，因此即使后续数据库升级，miR-17-92簇记录信息发生改变，仍与本发明实质相同，不超出本发明的保护范围。

[0014] 进一步地，所述待测序列位于miR-17-92簇转录起始位点上游1.5kb序列到下游1.5kb序列之间，优选地，所述待测序列为SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:25的反向互补序列。

[0015] 进一步地，所述待测序列还可以位于具有SNP位点的miR-17-92簇转录起始位点上游3.5kb序列到下游2kb序列之间。

[0016] 进一步地，所述待测样品选自粪便、血液和活检组织中的至少一种。优选地，所述待测样品为粪便。

[0017] 进一步地，检测所述待测序列甲基化水平的方法选自焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法和质谱中的至少一种。

[0018] 进一步地，所述试剂包括选自下组中的至少一组寡核苷酸引物对：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，以及SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。

[0019] 进一步地，所述试剂还包括检测miR-17-92簇表达量的试剂。

[0020] 进一步地，所述检测miR-17-92簇表达量的试剂包括寡核苷酸引物对，优选地，所述寡核苷酸引物对序列选自下组中的至少一组：SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。

[0021] 进一步地，所述检测miR-17-92簇表达量的试剂包括逆转录引物和Taqman探针，优选地，所述逆转录引物的序列为SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:31，所述Taqman探针的序列为SEQ ID NO:32和/或SEQ ID NO:33。

[0022] 本发明首次发现原癌基因miR-17-92簇在结直肠癌中的低甲基化水平，其与结直肠癌的发生发展相关。miR-17-92簇的甲基化可以作为肿瘤检测的生物指标，辅助诊断结直肠癌，提高检测特异性、敏感度，降低错误率，为了解肿瘤发病机制及诊断具有十分重要的临床指导意义。

[0023] 本发明采用非侵入式的无创检测方法，实现了对结直肠癌的准确诊断。本发明通过从粪便或活检组织样本中提取DNA，经亚硫酸氢盐处理后，进行亚硫酸氢盐测序法检miR-17-92簇甲基化率，评估miR-17-92簇甲基化位点(CpG位点)的甲基化程度，从而实现结直肠癌的诊断；克服了主流的QPCR检测miRNA的局限性，可以作为肿瘤检测的生物指标，辅助诊断结直肠癌，提高检测特异度、敏感度，降低错误率。
附图说明

[0024] 图1为miR-17-92簇转录起始位点上下游区域的CpG位点；

[0025] 图2为结直肠癌患者粪便样品(T)和正常对照粪便样品(N)的miR-17-92的甲基化率；

[0026] 图3为结直肠癌患者结直肠癌组织样品(T)和癌旁组织样品(N)的miR-17-92的甲基化率；

[0027] 图4为检测结直肠癌患者粪便样品和正常对照粪便样品的ROC曲线；

[0028] 图5为结直肠癌患者粪便样品(T)和正常对照粪便样品(N)的miR-92a的表达量；

[0029] 图6为结直肠癌患者粪便样品(T)和正常对照粪便样品(N)的miR-17的表达量。

具体实施方式

[0030] 本发明首次发现原癌非编码RNA miR-17-92簇即miR-17-92簇转录起始位点附近区域在结直肠癌中的低甲基化水平，且与结直肠癌的发生发展相关，因此可以作为结直肠癌标志物。研究发现miR-17-92簇与肿瘤的发生密切相关。研究人员发现miR-92a在结肠腺瘤和结肠癌中均高表达。而且，miR-92a在结肠癌组织中可以直接抑制抗凋亡因子BCL-2来介导细胞死亡，因此可以推测miR-92a在结直肠癌发生发展中具有重要作用。另外，miR-17的表达与结直肠癌患者的预后相关。miR-17-92簇成员在结直肠癌中表达显著升高，可能作为结直肠癌诊断新的标志物。目前对于结直肠癌中，miRNA甲基化的研究较少。miR-17-92簇甲基化在肿瘤中的作用未有报道。探讨miR-17-92簇甲基化水平与肿瘤的关系，为了解肿瘤发病机制及诊断具有十分重要的临床指导意义。

[0031] 目前越来越多证据显示，miRNA的表达受甲基化修饰调控。而且己有不少研究发现，miRNA与肿瘤的发生发展有关。在结直肠癌细胞系中，miR-137 CpG岛高度甲基化。miR-137甲基化水平在结直肠癌和腺瘤样本分别为31.67％(±17.25)和33.09％(±21.06)，明显高于正常组织7.70％(±4.18)和癌旁组织10.27％(±6.88)。miR-34在食管癌和正常对照组相比，甲基化率增加。结直肠癌癌组织miR34b/c基因的甲基化阳性率为95.2％(120/
126)，对应的癌旁正常组织为11.9％(15/126)，两者比较有显著差异(P<0.01)。miRNA甲基化水平变化是结直肠癌的重要分子特征，检测miRNA甲基化水平有望成为结直肠癌诊断的一个全新的肿瘤标记物。

[0032] 结直肠癌的发病率和死亡率很高，结直肠肿瘤从良性发展到恶性，通常需要15年以上，如果能在早期发现，手术切除后，治愈率非常高，可达90％以上。如何选择一种经济、方便、依从性好的筛查方法提高结直肠癌的检出率，降低死亡率，是医务工作者急需解决的问题。近年来研究者们寻找出一种便捷、无创的检测方法，对粪便中脱落细胞、基因突变、DNA甲基化等进行检测。结肠与外界相通，粪便是唯一能够反映消化道的一个窗口。结直肠癌脱落的癌细胞或分泌的游离DNA通过粪便排出体外，粪便DNA中也存在较高比例的肿瘤DNA。由于肠道为碱性环境，粪便中的DNA不易被核酸核酶所降解。从粪便基因层面上进行结直肠癌诊断，在取材方面具有无创性、随机性、便利性，无需饮食控制，而且粪便DNA甲基化分析技术的建立简化了采样方法，降低研究费用。已有报道，检测粪便miR34b/c基因甲基化，有可能成为结直肠癌诊断或筛查的新方法。结直肠癌粪便miR34b/c甲基化阳性率为90.2％(111/123)，显著高于正常对照7.8％(5/64)，差异有统计学意义。粪便DNA miR34b/c用于结直肠癌早期诊断的敏感性为90.2％，特异性为92.2％，结果与从相同患者中采集的结直肠癌癌组织结果相近，提示检测结直肠癌患者粪便miRNA基因甲基化水平在结直肠癌诊断中有重大应用价值。

[0033] 已经发现，miR-17-92簇成员miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a-1在结直肠癌中显著高表达，可能成为结直肠癌诊断新的标志物，其中miR-17-3p和miR-92诊断结直肠癌的敏感度、特异度分别为64％、70％和89％、70％。通过分析miR-17-92簇序列，发现其上游有一段较长的CpG岛序列(长约2kb)，CG含量约占80％。而且miR-17-
92簇的CpG岛序列在人、小鼠和大鼠等哺乳类动物中高度保守，提示miR-17-92簇有被甲基化调控的可能性以及重要性。已有研究发现miR-17-92簇甲基化水平变化与巨噬细胞分化以及肺支气管发育不良有关，但其与癌症相关性未有报道。因此miR-17-92甲基化水平有可能作为新的肿瘤诊断标志物。

[0034] 本发明中“miR-17-92簇甲基化”是指miR-17-92簇转录起始位点附近区域发生甲基化，也就是本发明miR-17-92簇转录起始位点上游3.5kb序列到下游2kb序列之间的甲基化。

[0035] 以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0036] 实施例1甲基化位点(CpG位点)的筛选

[0037] 用California Santa Cruz(UCSC)大学数据库分析miR-17-92簇，设计亚硫酸氢盐测序(BSP)引物，寻找其CpG位点，即甲基化位点。miR-17-92簇CpG位点集中在miR-17-92簇转录起始位点上游3.5kb序列到下游2kb序列之间。图1示出了转录起始位点上游2kb和下游2kb序列之间的CpG位点，本发明选择miR-17-92簇转录起始位点上游1.5kb序列到下游
1.5kb序列(SED ID NO:25)进行实验。

[0038] 实施例2引物设计

[0039] 设计测序引物即亚硫酸氢盐盐测序(BSP)引物。引物序列见表1。

[0040] 表1甲基化位点引物序列

[0041]

[0042] 实施例3样本收集

[0043] 收集204例结直肠癌患者粪便、结直肠癌组织及癌旁组织，所有病例的手术切除标本都做了常规病理学检查，以确定癌症的诊断，术前取肿瘤患者粪便，样品于半小时之内送实验室提取DNA或RNA，RNA逆转录后的cDNA及DNA于-20℃保存；并同期选择年龄相匹配的164例正常对照者作为粪便检测的对照。所有患者均经手术治疗并且在术前未接受过放疗或化疗。

[0044] 实施例4 DNA提取

[0045] 按照DNA提取试剂盒QIAmp DNA Mini Kit(货号51306)操作。

[0046] 1)在1.5ml离心管中加入20μL蛋白酶K；

[0047] 2)加入100-200mg粪便样品；

[0048] 3)加入400μL Sl Buffer轻摇30秒混匀；

[0049] 4)60℃10min；

[0050] 5)12000rpm离心5min，将上清转移到新离心管中；

[0051] 6)加入400μL Binding Buffer；

[0052] 7)60℃10min；

[0053] 8)加入100μL异丙醇，轻混合5秒，离心10秒降下管壁和盖子上附着的液体；

[0054] 9)将结合柱放入2ml收集管中，转移液体到结合柱中；

[0055] 10)8000rpm离心1min，如果离心后液体还没有完全穿过结合柱，重新离心直到完全穿过；

[0056] 11)将结合柱转移到新的2ml收集管中；

[0057] 12)加入500μL洗脱液1到柱中，8000rpm离心1min；

[0058] 13)转移结合柱到新的2ml收集管中；

[0059] 14)加入500μL洗脱液2到柱中，8000rpm离心1min；

[0060] 15)13000rpm离心1min以完全去除乙醇；

[0061] 16)转移结合柱到1.5ml收集管中，加入200μL E Buffer，静置1分钟，让液体充分扩散；

[0062] 17)8000rpm离心1min以洗脱。

[0063] 实施例5 DNA进行亚硫酸氢盐处理。

[0064] 参照QIAGEN EptiTect Bisulfite Kit(货号59824)说明书，将抽提的DNA进行亚硫酸氢盐处理。

[0065] (1)在0.2ml EP管中配制85ul Bisulfite Mix、35ul DNA Protect Buffer、500ng DNA，补水至140ul体系；

[0066] (2)在PCR仪上采用如下程序反应，99℃变性5min、60℃孵育25min、99℃变性5min、60℃孵育85min、99℃变性5min、60℃孵育175min；

[0067] (3)反应结束取出0.2ml EP管，将反应液转移至1.5ml EP管中；

[0068] (4)加入560μl新鲜配制的BL缓冲液，漩涡振荡；

[0069] (5)将混合液加入离心吸附柱中，套上收集管、最大转速离心1min，弃收集管中液体；

[0070] (6)加入500ul BW洗脱液于离心吸附柱中，最大转速离心1min，弃收集管中液体；

[0071] (7)加入500ul BD缓冲液于离心吸附柱中，室温静置15min；

[0072] (8)重复步骤(6)两次；

[0073] (9)最大转速离心1min，弃收集管中液体；

[0074] (10)将离心吸附柱放置于新收集管内，最大转速1min；

[0075] (11)将离心吸附柱放置于干净1.5ml EP管，加入20ul去离子水至柱基质中，12000rpm/min洗脱DNA，-20℃保存。

[0076] 实施例6 BSP扩增和检测

[0077] (1)BSP反应

[0078] 反应体系为25μl，反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性30s，53.3℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。所得产物采用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行确定。

[0079] (2)T载体连接及转化

[0080] 将PCR产物纯化后，按pMD18-T Vector的说明书进行连接，转化至E.coli DH5α。

[0081] (3)菌液测序

[0082] 分别挑选十个克隆摇菌，测序。

[0083] (4)测序结果

[0084] 原序列中若CpG位点发生甲基化，其经亚硫酸氢盐处理后保持不变，而单独的C均转化为T。甲基化率为发生甲基化的C在所有CG位点中所占的比例。每个样本中每组实际甲基化率相加记作该样本的实际甲基化率。比较结直肠癌患者样品和正常人样品的平均甲基化率，结直肠癌患者样品内部在依据其临床病理分类分别进行比较计量资料结果以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS17.0统计软件，2组均数比较独立样本t检验。测序结果如表2、3和图2、3所示。

[0085] 表2结直肠癌患者粪便样品和正常对照粪便样品的甲基化率

[0086] 正常样品甲基化率％结直肠癌样品甲基化率％
引物对1 67.2±11.8 35.1±12.1
引物对2 68.1±10.8 33.4±8.5
引物对3 62.2±9.4 32.3±9.3
引物对4 72.2±11.3 34.3±10.4
引物对5 66.8±10.7 35.1±7.5
引物对6 70.7±12.3 32.4±10.6
巢式引物对1 64.0±9.4 28.9±10.5
巢式引物对2 64.3±8.5 28.6±8.7
巢式引物对3 66.3±10.8 29.7±7.9

[0087] 表3结直肠癌组织样品和癌旁组织样品的甲基化率

[0088] 癌旁组织样品甲基化率％结直肠癌样品甲基化率％
引物对1 67.7±9.6 22.7±10.1
引物对2 73.8±10.1 21.6±8.1
引物对3 63.0±8.5 23.6±9.6
引物对4 74.7±8.3 21.4±5.4
引物对5 68.8±10.4 24.6±9.1
引物对6 70.4±11.7 20.8±9.3
巢式引物对1 64.1±9.9 24.5±7.5
巢式引物对2 66.5±9.3 21.1±6.7
巢式引物对3 66.7±9.2 20.2±6.9

[0089] 从表2和图2可以看出，粪便样品中，miR-17-92簇甲基化位点在结直肠癌患者样品中低甲基化，在正常对照样品中高甲基化。与正常对照组相比较，miR-17-92簇甲基化水平在结直肠癌患者粪便中显著降低(P＜0.001)。从表3和图3可以看出，结直肠癌组织中miR-17-92簇的甲基化水平明显低于癌旁组织样品。提示miR-17-92簇甲基化水平可以作为结直肠癌肿瘤诊断的标志。

[0090] 构建ROC(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线分析，ROC曲线如图4所示，以测定关于不同成对比较的AUC(曲线下面积)。计算约登指数(Youden index)＝真阳性率-假阳性率＝敏感度-(1-特异性)，取约登指数最高的值为截断值(cut-off值)。因而得出miR-17-92簇甲基化率的截断值。评估结直肠癌的miR-17-92簇甲基化位点的甲基化水平区分正常与结直肠癌患者的粪便样本的诊断能力。在各对引物最佳的cutoff值下，其检测敏感性和特异性如表4所示：

[0091] 表4不同引物对结直肠癌的诊断能力

[0092] 截断值(cutoff值) 敏感性特异性
引物对1 48.10％ 80.27 79.61
引物对2 46.71％ 83.49 77.12
引物对3 45.38％ 84.71 75.16
引物对4 44.91％ 80.49 79.61
引物对5 46.74％ 84.71 75.65
引物对6 43.45％ 83.88 77.61
巢式引物对1 45.55％ 84.1 79.12
巢式引物对2 42.11％ 79.1 76.14
巢式引物对3 47.65％ 84.1 76.63

[0093] 表4结果表明，miR-17-92簇甲基化检测结直肠癌具有比较高的灵敏度和特异性。

[0094] 实施例7miR-17-92表达量在结直肠癌患者中的变化

[0095] RNA抽提

[0096] 将已均质化的冰冻粪便标本用液氮研磨法磨成粉末，取100mg加入1mL Trizol，吹打混匀后旋涡振荡20s。加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。4℃，12,000rpm离心15分钟后小心转移上清液入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解。采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。经琼脂糖胶电泳评价总RNA质量，得到总RNA的28S:18S≥2，可以初步判定总RNA质量较好。

[0097] Q-PCR检测

[0098] miRNA的qPCR检测使用invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取50-100ng总RNA为模板，使用针对特定miRNA的逆转录引物及invitrogen的SuperScript III First-Strand Synthesis System试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用针对miR-17、miR-92a的qPCR引物，利用茎环引物Taqman RT-PCR技术对上述肿瘤特异性miRNAs进行定量检测。实时荧光定量PCR以小核RNAU6作为内参照，来对目标基因进行归一化处理，以确保相等数量的样品中比较目标基因的量。采用定量PCR中的相对定量法，表达量用ΔCt表示，ΔCt＝-ΔΔCtCtmiR-92a-CtU6，表达量倍数的变化用F＝2 法计算。粪便中ΔΔCt＝(CtmiR-92a-CtU6)肿瘤-(CtmiR-92a-CtU6)正常对照均值。F表示肿瘤病人排泄物中目标miRNAs的表达相对于配对的正常对照排泄物的变化，以P＜0.05作为有统计学意义的检验标准。

[0099] QPCR引物：

[0100] miR-92a：

[0101] 上游引物：CCGTATTGCACTTGTCCCG(SEQ ID NO:26)

[0102] 下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:27)

[0103] miR-17:

[0104] 上游引物：CCGTATTGCACTTGTCCCG(SEQ ID NO:28)

[0105] 下游引物：CAGCAAAGTGCTTACAGTGC(SEQ ID NO:29)。

[0106] 逆转录引物：

[0107] 逆转录miR-92a:

[0108] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGC(SEQ ID NO:30)[0109] 逆转录miR-17:

[0110] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT(SEQ ID NO:31)。

[0111] miR-17 Taqman探针：CTACCTGCACTATAAGCACTTTA(SEQ ID NO:32)

[0112] miR-92a Taqman探针：CAGGCCGGGACAAGTGCAATA(SEQ ID NO:33)

[0113] 结果如图5，图6所示。可以看出，对比健康志愿者粪便样本，miR-17、miR-92a的表达量在结直肠癌患者粪便样本中显著提升(P＜0.001)。采用ROC曲线法(受试者工作特征曲线)对研究样本的检测结果进行分析后，确定miR-17、miR-92a截断值。其约登指数最大时所对应的Cut-off值分别为31.25、30.75，在该Ct值下其灵敏度分别为69.84％、71.94％，特异性分别为71.67％、77.25％。联合检测miR-17、miR-92a，在最佳Cut-off值下，灵敏度分别为69.84％、71.94％。因此，在结直肠癌的诊断和风险评估时，可以将miR-17-92簇的甲基化水平和miR-17-92簇表达量同时作为参考，提高检测特异度、敏感度，降低错误率。

[0114] 本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

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