编码新RG1多肽的DNA
阅读：2发布：2022-01-14
专利汇可以提供编码新RG1多肽的DNA专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及新的人胞外基质多肽，称为RG1，编码所述多肽的多核苷酸，生产所述多肽的方法，用于表达所述多肽的表达载体和基因工程化宿主细胞。本发明还涉及使用所述多核苷酸和多肽用于研究、诊断和 治疗 应用的方法。，下面是编码新RG1多肽的DNA专利的具体信息内容。
1.一种分离的抗体或抗体片段，其特异性结合选自以下一组的多 肽：
(a)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列28-46位氨基酸的 多肽；
(b)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列77-91位氨基酸的 多肽；
(c)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列188-210位氨基酸 的多肽；
(d)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列263-274位氨基酸 的多肽；
(e)与(a)，(b)，(c)或(d)的多肽具有至少70％相同性的 多肽。
2.权利要求1的抗体，其中抗体特异性结合氨基酸序列 PLGGESICSAGAPAKYSIT(SEQ ID NO：8)。
3.权利要求1的抗体，其中抗体特异性结合氨基酸序列 HSSDYSMWRKNQYVS(SEQ ID NO：10)。
4.权利要求1的抗体，其中抗体特异性结合氨基酸序列 DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(SEQ ID NO：11)。
5.权利要求1的抗体，其中抗体特异性结合氨基酸序列 NEIVDASAVPET(SEQ ID NO：12)。
6.权利要求1的抗体，其中抗体是多克隆抗体。
7.权利要求1的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
8.一种免疫缀合物，其包含缀合于一治疗剂的分离的抗体或抗体 片段，所述抗体或抗体片段特异性结合选自以下一组的多肽：
(a)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列28-46位氨基酸的 多肽；
(b)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列77-91位氨基酸的 多肽；
(c)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列188-210位氨基酸 的多肽；
(d)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列263-274位氨基酸 的多肽；
(e)与(a)，(b)，(c)或(d)的多肽具有至少70％相同性的 多肽。
9.权利要求8的免疫缀合物，其中治疗剂是胞毒剂。
10.权利要求9的免疫缀合物，其中胞毒剂选自蓖麻毒蛋白， 阿霉素，道诺红霉素，紫杉醇，溴化乙锭，丝裂霉素，表鬼臼毒吡喃 葡糖苷，tenoposide，长春花新碱，长春花碱，秋水仙素，二羟炭疽 菌素，放线霉素D，白喉毒素，假单胞杆菌外毒素(PE)A，PE40， 相思豆毒蛋白，糖皮质激素和放射性同位素。
11.权利要求8的免疫缀合物，其中抗体片段选自Fv，F(ab’) 和F(ab’)2片段。
12.权利要求8的免疫缀合物在制备用于选择性破坏表达图 2(SEQ ID NO：2)所示多肽的细胞的治疗剂中的应用。
13.权利要求8的免疫缀合物在制备用于治疗与RG1表达相关 的人体疾病的治疗剂中的应用。
14.特异性裂解编码多肽的RNA的核酶在制备用于治疗与 RG1表达相关的人体疾病的治疗剂中的应用，所述多肽包含选自以下 的成员：
(a)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列28-46位氨基酸序 列的多肽，或其生物活性或免疫活性片段；
(b)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列77-91位氨基酸序 列的多肽，或其生物活性或免疫活性片段；
(c)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列188-210位氨基酸 序列的多肽，或其生物活性或免疫活性片段；
(d)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列263-274位氨基酸 序列的多肽，或其生物活性或免疫活性片段；
(e)一种与(a)，(b)，(c)或(d)多肽有至少70％相同性的 多肽。
15.互补于编码具有如下氨基酸序列的多肽或其一部分的多核 苷酸在制备用于治疗人体中与RG1非适当表达相关的疾病的治疗剂 中的应用：
(a)图2(SEQ ID NO：2)所示序列28-46位氨基酸序列；
(b)图2(SEQ ID NO：2)所示序列77-91位氨基酸序列；
(c)图2(SEQ ID NO：2)所示序列188-210位氨基酸序列；
(d)图2(SEQ ID NO：2)所示序列263-274位氨基酸序列；
(e)与(a)，(b)，(c)或(d)的序列有至少70％相同性的氨 基酸序列。
16.权利要求1的抗体或抗体片段在制备用于通过检测多肽而 诊断与RG1非适当表达相关的疾病的诊断剂中的应用，所述多肽包 含选自以下一组的成员：
(a)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列的第28-46位氨基 酸的多肽；
(b)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列的第77-91位氨基 酸的多肽；
(c)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列的第188-210位氨 基酸的多肽；
(d)一种包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列的第263-274位氨 基酸的多肽；
(e)一种与(a)，(b)，(c)或(d)的多肽由至少70％相同性 的多肽。
17.选自以下一组的多核苷酸或与选自以下一组的成员有至少 70％相同性的多核苷酸在制备用于诊断与RG1非适当表达相关的疾 病的诊断剂中的应用：
(a)一种编码多肽，或其生物活性或免疫活性片段的多核苷 酸，所述多肽包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列28-46位氨基酸序 列；
(b)一种编码多肽，或其生物活性或免疫活性片段的多核苷 酸，所述多肽包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列77-91位氨基酸序 列；
(c)一种编码多肽，或其生物活性或免疫活性片段的多核苷 酸，所述多肽包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列188-210位氨基酸 序列；
(d)一种编码多肽，或其生物活性或免疫活性片段的多核苷 酸，所述多肽包含图2(SEQ ID NO：2)所示序列263-274位氨基酸 序列；
(e)与(a)，(b)，(c)或(d)的多核苷酸互补的多核苷酸。
18.权利要求1的抗体在制备用于诊断与图2(SEQ ID NO：2)所 示多肽相关的转移瘤的诊断剂中的应用。
19.权利要求18的应用，其中抗体是标记的，以直接或间接产 生可以用放射标记的化合物，酶，生色化合物和荧光物可检测的信号。
本发明涉及新鉴别的多核苷酸和多肽；这种多核苷酸和 多肽的变体和衍生物；产生这种多核苷酸，多肽，其变体 和衍生物的方法；直接抗这种多肽，其变体和衍生物的抗 体；及这种多核苷酸，多肽，变体，衍生物和抗体的应用。 本发明尤其涉及新的人体胞外基质多肽(称为RG1)，编码 这些多肽的多核苷酸，直接抗这些多肽的抗体，和封阻RG1 表达的反义多核苷酸。
发明背景
前列腺癌是男性经常发生的疾病，在45岁以上的男性 中有大约1/3发现患有此病。主要有遗传和环境两方面的因 素，大多数情况是这两种因素组合所致的。关于家族性癌 症的研究提示遗传因素在所有前列腺癌的大约5-10％中起作 用，大约45％的情况中男性年龄小于55岁。
有这样的迹象即前列腺癌是以多级疾病发生的，一种先 期损害是前列腺上皮内瘤形成(PIN)。这种疾病早期是雄 激素依赖性的，而后期是非激素依赖性的。临床经常检测 到一种已知是良性前列腺增生的增殖性前列腺疾病，但也 许不是癌症发生的一个时期。然而，其通常与前列腺癌相 关。前列腺的癌症通常是多病灶的，一般是缓慢生长的， 及是异质的。晚期癌症通常转移至淋巴结和骨。
前列腺癌通常是通过物理检查和通过前列腺特异性抗原 (PSA)的血清水平加以诊断的。前列腺根除术是治疗局部疾 病的一种选择。进展的转移疾病目前是通过睾丸切除术导致 的雄激素消融，或用GnRH(促性腺激素释放激素)处理，及 通过抗雄激素疗法进行治疗的。然而，进展性疾病几乎总是 成为对激素有抗性，而且不能治愈进行性疾病。另外，基本 前列腺切除术和雄激素消融疗法均具有严重的副作用。包括 与前列腺根除术相关的尿失禁和阳痿，与雄激素消融疗法相 关的骨折和骨质疏松症。
因此，需要一种新的治疗早期和晚期前列腺癌的方法。 还明显需要新的诊断制剂，尤其能区别疾病进程的制剂，因 为这能明显影响治疗方案。例如，如果疾病已经进展超过了 前列腺并已经转移至淋巴结，就不能进行前列腺根除术，因 为这对进展已经没有作用，但却具有明显不期望的副作用。 可以检测体内转移的制剂具有重要意义。
已经证明在前列腺癌中特异性蛋白表达发生变化，包括 在晚期前列腺癌中p53表达异常，TGF-β受体水平降低，E- 钙粘着蛋白，C-Cam(一种细胞粘着分子)，和一些整联蛋白 水平降低。在晚期雄激素非依赖性肿瘤中，癌基因bcl-2的表 达明显提高，而且bcl-2高水平表达的患者预后相对不好。前 面提及的基因表达中的变化是经充分论证的；表达中无变化 已经鉴别，这已经证明是致病原因。因此，这可用于鉴别新 的蛋白质，其表达与前列腺肿瘤的存在和发生相关，可以用 作诊断和治疗前列腺癌的分子标记。
本发明揭示了胞外基质蛋白的超家族的一种新的同源 物。这种称为RG1的同源物是在前列腺组织中表达的，并可 以在前列腺肿瘤中过表达。
胞外基质是胶原蛋白和弹性蛋白的复合网眼，包埋于由 蛋白聚糖和糖蛋白组成的粘弹性基质中。基质存在一个三 维支架，分离组织区室，介导细胞吸附和确定组织结构(Bissel 等，生物治疗杂志99：31-68，1982；Carlson等，美国科学 院院报78：2403-2406，1981)。基质发挥大分子滤膜的作用 (Hay，E.D.，胞外基质的细胞生物学，纽约，Plenum出版 社，1982)，并还影响细胞分化，细胞有丝分裂和形态发生 (Gospodarowiczs，D.癌症研究38：4155-171，1978)。正常 细胞和基质之间的生物化学作用可以在瘤形成中改变，这 可以影响肿瘤增殖。肿瘤细胞可以不同方式与基质相互作 用。首先，肿瘤细胞可以通过特异性血浆膜受体附着于基 质(Terranova等，癌症研究42：2265-2269，1982)。其次， 基质的降解是通过由肿瘤细胞和宿主提供的酶级联介导的 (Eisen等，生物化学生物生理学学报151：637-645，1968)。 再者，在肿瘤的分化区域内，肿瘤细胞可以合成并积累基 质，或诱导宿主细胞积累过量的基质(Brownstein等，癌症 40：2979-2986，1977)。
RG1示出与由Mindin/F-spondin基因编码的胞外基质蛋 白的超家族同源。此基因家族由在氨基末端附近的两个保 守的spondin结构域FS1和FS2，和在羧基末端的至少一个 血小板spondin 1型重复(TSR1)联合的(Shimeld，S.M.， Mol.Bio.Evol.15(9)：1218-1223，1998)。TSR基序最初是在脊 椎动物胞外基质蛋白中发现的(Bornstein，P.，细胞生物学 杂志130：503-506，1995)，并接着在一些其它胞外基质蛋白 中也已经发现。有一些迹象表明TSR’s介导细胞粘附，并 在肿瘤发生中起关键作用。例如，已经证实TSR’s中包含 的血小板spondin的蛋白酶解片段，及具有相当于血小板 spondin的TSR区域的序列的合成肽，促进肿瘤细胞附着和 转移(Prater等，细胞生物学杂志112：1031-1040，1991； Tuszynski和Nicosia，BioEssays18：71-76，1996)，具有抗血 管生成活性(Tolsma等，细胞生物学杂志122：497-511， 1993)，并抑制血小板聚集和黑素瘤转移(Tuszynski等，细 胞生物学杂志116：209-217，1992)。
目前这个超家族的成员包括Caenorhabditis elegans中 的一个具有，Drosophila中的一个单一基因和脊椎动物中的 多个基因。在C.elegans中，基因F10E7.4编码除了FS1和 FS2结构域之外的5个TSR’s(Higashijiima等，生物学进 展192：211-227，1997)。在Drosopnila中，称为M-spondin (mspo)的家族成员含有FS1和FS2结构域和一个单一的 TSR(Umemiya等，生物学进展186：165-176，1997)。M- spondin基因编码一种分泌的蛋白，其位于肌附着位点并似 乎具有胞外基质蛋白的功能，支持肌一内突附着。脊椎动 物中的家族成员包括分离自zebrafish(Mindin 1和Mindin 2， F-spondin 1和F-spondin2)，大鼠F-spondin，Xenopus F- spondin和大鼠Mindin的基因。Mindin 1和Mindin 2彼此 密切相关，并具有类似于Drosophila M-spondin的基因结构。 Mindin 1和Mindin2基因均编码除了FS1和FS2之外的一 个单一TSR(Higashijima等，生物学进展192：211-227， 1997)。Zebrafish F-spondin和F-spondin2，大鼠F-spondin (Klar等，细胞69：95-110，1992)和Xenopus F-spondin(Altaba 等，美国科学院院报90：8268-8272)基因均具有相似结构， 编码除了FS1和FS2结构域之外的6个拷贝的TSR。在脊 椎动物中，Mindin/F-spondin超家族可以分为两类：与原始 的大鼠F-spondin和Mindin基因密切相关那些基因，和与 Drosophila M-spondin基因密切相关的那些基因。脊椎动物 的Mindin和F-spondin基因均编码蛋白质，所述蛋白质最 初是在胚胎发育期间由神经管的底板表达的。
近来从文昌鱼中已经分离了一个单一的F-spondin相关 的基因，AmphiF-spondin(Shimeld，S.M.， Mol.Biol.Evol.15(9)：1218-1223，1998)。基于分子系统发生， AmphiF-spondin是编码6个TSR’s的脊椎动物F-spondin 基因的特殊亚组密切相关的。AmphiF-spondin编码3个 TSR’s和两个纤连蛋白III型重复，其中一个与来自结肠癌 缺失(DCC)的纤连蛋白III型重复非常相同。这个蛋白质 的表达在大多数中枢神经系统中发现，并非限于所述脊椎 动物Mindin和F-spondin蛋白的中线。
这些数据提示胞外基质蛋白如新的RG1蛋白，是用于 癌症诊断和治疗的良好候选物，这种新的RG1蛋白是 Mindin/F-spondin超家族的同源物。
发明概要
本发明提供了一种多核苷酸序列，其特异地编码称为 RG1的一种新蛋白质。RG1多肽示出与大鼠Mindin胞外基 质蛋白同源。其含有在N末端的一个疏水性序列，在C末 端的两个spondin结构域(FS1和FS2)，和血小板spondin 1 型重复。RG1与大鼠Mindin有89.7％的相似性。在此称为 rg1并如图1所示的多核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，编码图 2所示的RG1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
本发明的一方面提供了多肽，其已经修饰为与胞外基质 蛋白的Mindin家族同源的新的蛋白质，同源性是通过将图 2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和其它胞外基质蛋白已 知氨基酸序列进行对比示出的。
本发明的另一方面提供了编码这种多肽的多核苷酸，尤 其编码在此称为RG1的多肽的多核苷酸。
根据本发明的一方面，提供了编码RG1的分离的多核 苷酸，包括mRNAs，cDNAs，及在本发明的另外的实施方 案中提供了它们的有生物学，诊断，临床或治疗用途的变 体，类似物或衍生物，或其片段，包括变体，类似物和衍 生物的片段。
本发明这个方面的实施方案中尤为优选的是多核苷酸的 天然发生的等位基因，其编码称为RG1的多肽的变体。
根据本发明的这个方面，提供了人源的称为RG1的新 多肽，以及其有生物学，诊断或治疗用途的片段，变体和 衍生物，前述片段和类似物的变体和衍生物。
本发明这个方面的实施方案中尤为优选的是由rg1多核 苷酸的天然发生的等位基因变体编码的RG1的变体。
本发明的另一方面提供了一种产生前述多肽，多肽片 段，变体和衍生物，前述变体和衍生物和类似物的片段的 方法。在本发明的一个优选的实施方案中，提供了产生前 述RG1多肽的方法，包括在宿主中表达人RG1的条件下， 培养可表达掺入其中的外源性编码RG1的多核苷酸的宿主 细胞，然后回收表达的多肽。
本发明的另一方面提供了利用前述多肽和多核苷酸，进 行生物学，临床和治疗研究的产物，组合物，程序和方法。
根据本发明此方面的一些优选实施方案中，提供了通过 测定RG1多肽或编码RG1的mRNA评估细胞中RG1表达 的产物，组合物和方法；及分析rg1基因中遗传变异和畸变 如缺陷的产物，组合物和方法。
根据本发明的这个及其它方面的一些优选实施方案中， 提供了与rg1序列杂交的探针。
本发明的另一方面提供了对RG1多肽或其片段具有高 度选择性的抗体，其可用于诊断和/或检测RG1表达的方法 中，RG1表达与前列腺癌相关。在根据本发明此方面的一 些优选实施方案中，抗体是标记的，由此产生可检测的信 号。尤为优选的是用放射标记，酶，生色团或荧光素标记 的抗体。
本发明的另一方面提供了与治疗剂缀合的抗体，以施用 于在体外的细胞，源于体内的细胞和体内细胞，或多细胞 机体。尤为优选的是胞毒性治疗剂。在一些优选的实施方 案中，将这种缀合的抗体施用于病人，以治疗特征在于RG1 活性或表达的疾病，如前列腺癌。
本发明的另一方面提供了可用于刺激免疫应答的肽和抗 独特型抗体。
本发明的另一方面提供了核酶和互补于rg1多核苷酸和 多核苷酸(即反义多核苷酸)，以施用于在体外的细胞，源 于体内的细胞和体内细胞，或多细胞机体。尤为优选的是 将此反义分子施用于病人，以治疗如前列腺癌或早期前列 腺增生等疾病，通过降低RG1活性水平而减轻症状。
本领域技术人员通过以下详细论述可以理解本发明的其 它方面，特点，优点和目的。然而应知道以下阐述和特异 的实施例，及所述的优选实施方案，只是举例说明本发明。 通过阅读以下论述和本发明的其它部分，本领域技术人员 在本发明精神和所示范围内，可以对本发明加以各种变化 和修改。
附图简述
图1：编码生物活性或免疫活性形式RG1的rg1的多核 苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2：RG1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，单 下划线处为F-spondin结构域，双下划线处为血小板spondin 结构域。
图3：RG1与大鼠Mindin序列的氨基酸序列对比。RG1 序列在上部。
图4：RG1的多核苷酸和推导的氨基酸序列。
图5：通过基于Taqman的PCR分析rg1 mRNA在人体 组织中表达。来自人体肿瘤和正常组织的RNA是通过标准 方法分离的。检测rg1 mRNA表达的引物和探针是用Perkin Elmer’s引物表达软件设计的，并通过合成遗传学合成。 在人前列腺组织中检测Rg1 mRNA。在其它组织中可以检 测到较低水平表达的rg1 mRNA，例如在肝脏中。
图6：纯化由LNCaP细胞分泌的天然RG1蛋白。使用 抗合成的RG1肽序列(3C，SEQ ID NO：10；见实施例4) 产生的抗血清进行Western印迹分析，以检测LNCaP细胞 分泌的天然RG1蛋白。浓缩的LNCaP细胞条件培养基的Q- 琼脂糖凝胶层析的洗脱级分：(L)层析柱充填物，(F)层 析柱流量，(1-12)经过盐梯度的洗脱级分。预测的RG1分 子量为大约36kD，然而观测到细菌表达的RG1，BHK表达 的RG1和LNCaP表达的RG1在PAGE上均在大约45kD 迁移(L，级分6-9)。
图7：在人体前列腺组织中RG1表达的免疫组织化学 染色。前列腺组织得自Stanford大学医学院的泌尿系。用载 体ABC-AP试剂盒(AK5002)进行染色。用载体红色底物 试剂盒(SK-5100)观测染色，并用苏木精对染。结果示出 在腺体结构中外周网眼膜明显染色。
发明详述
词解
本发明的说明书，实施例和所附权利要求中所使用的术 语，除非特别说明均具有以下含义。
“RG1”是指具有图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2) 的多肽；其变体，类似物，衍生物和片段，及变体，类似 物和衍生物的片段。术语“片段”，“衍生物”和“类似物” 当是指图2的多肽(SEQ ID NO：2)时，是指基本保留与图 2的多肽(SEQ ID NO：2)相同的生物和/或免疫学活性的多 肽。
“rg1”是指具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列 的多核苷酸，和编码具有图2(SEQ IN NO：2)所示RG1的 氨基酸序列的多肽的多核苷酸；及指编码RG1变体，类似 物，衍生物和片段，和变体，类似物和衍生物的片段的多 核苷酸。Rg1还指由RNA组成的这种多核苷酸，以及是编 码图2(SEQ ID NO：2)所示多肽序列的多核苷酸的补体的多 核苷酸。
“多核苷酸”一般是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖 核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或 DNA。因此，例如本发明使用的多核苷酸是指单链和双链 DNA，单链和双链区混合的DNA，单链和双链的RNA，和 单链和双链区混合的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子， 其可以是单链的，或更典型是双链的或单链和双链区的混 合物。另外，本发明使用的多核苷酸是指包含RNA或DNA 或RNA和DNA的三链区域。这种区域中的链可以来自相 同分子或来自不同分子。这个区域可以包括所有一或多个 分子，但更典型地只包含一些分子的一个区域。三螺旋区 域的分子之一通常是寡核苷酸。
本发明所用术语“多核苷酸”包括含有一或多个修饰的 碱基的上述DNAs或RNAs。因此，“多核苷酸”在此是指 由于稳定性或其它原因骨架经修饰的DNAs或RNAs。另外， 本发明多核苷酸也指包含不同寻常的碱基如肌苷，或修饰 的碱基如氚标记的碱基的DNAs或RNAs，所述碱基只是举 例而非全部。
应意识到本领域技术人员可以根据多种使用目的，对 DNA和RNA加以多种修饰。本发明所用术语“多核苷酸” 包含这种经化学，酶学或代谢修饰形式的多核苷酸，以及 病毒和细胞特有的化学形式的DNA和RNA，所述细胞包 括简单和复杂的细胞。
本发明所用的“多肽”包括以下所述的所有多肽。多肽 的结构已经熟知，并可见于本领域无数的教材和其它出版 物所述。文中此术语是指任何肽或蛋白质，其包含在一个 线性链中通过肽键彼此连接的两或多个氨基酸。如本发明 所使用，此术语指本领域通常也例如称为肽，寡肽和寡聚 物的短链，及指本领域通常称为蛋白质的较长的链，其中 它们具有许多类型。
应意识到多肽通常含有除了通常称为天然发生的20个 氨基酸之外的氨基酸，而且许多氨基酸包括末端氨基酸在 给定的多肽中可以是修饰的，通过自然程序如糖基化和其 它翻译后修饰，或通过本领域熟知的化学修饰方法进行修 饰。甚至多肽中天然发生的常见修饰也太多，以至于在此 不能一一列举，但在基本的教材和更详细的专论以及长篇 研究文献中有充分阐述，而且这些内容为本领域技术人员 所熟知。在已知的修饰中，可以存在于本发明多肽中的是 乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价附着， 血红素部分共价附着，多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价 附着，脂质或脂质衍生物的共价附着，phosphotidylinositol 的共价附着，交联，环化，二硫键形成，脱甲基化，共价 交联形成，胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化， 糖化，糖基化，GP1锚形成，羟基化，碘化，甲基化，十 四烷酰化，氧化，蛋白酶解，磷酸化，异戊二烯化，外消 旋化，硒化，硫酸化，将氨基酸通过转移RNA介导加入蛋 白质如精氨酰化，和遍在蛋白化。
这些修饰是本领域技术人员熟知的，并见于科学文献中 的详细阐述。一些特别普通的修饰例如糖基化，脂质附着， 硫酸化，谷氨酸刺激的γ-羧化，羟基化，和ADP-核糖基化 在最基本的教材中加以论述，如I.E.Creighton，蛋白质结构 和分子学性质，第二版，W.H.Freeman和Company，纽约， 1993。关于这方面的一些详细论述例如见于Wold，F.，蛋 白质的翻译后共价修饰，B.C.Johnson编辑，科学出版社， 纽约，pp1-12，1983；Seifter等，酶学方法182：626-646，1990， 和Rattan等，蛋白质分析：翻译后修饰和老化， Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992。
如所熟知的及如上所述，应意识到多肽并不总是完全线 性的。例如多肽可以是由于遍在化结果而分支的，及可以 有或无分支的环形，通常是由于翻译后的结果，包括天然 形成的和不是天然发生的人为操纵所致。环形的，分支的 和分支环形的多肽，可以是通过非翻译天然程序及通过完 全合成方法合成的。
修饰可以在多肽中的任何部位发生，包括肽骨架，氨基 酸侧链和氨基或羧基末端。事实上，通过共价修饰封阻多 肽中的氨基团或羧基团或这二者，在天然发生的和合成的 多肽中是常见的，，而且这种修饰可以存在于本发明的多肽 中。例如，在蛋白酶解之前在大肠杆菌中产生的多肽的氨 基末端残基，几乎总是N-甲酰甲硫氨酸。
多肽中发生的修饰通常是其产生方式的作用。例如，通 过在宿主中表达克隆的基因产生的多肽，修饰的性质和程 度大部分是通过宿主细胞翻译后修饰的能力和多肽氨基酸 序列中存在的修饰信号确定的。例如熟知的糖基化通常不 在细菌宿主如大肠杆菌中发生。因此，当需要糖基化时， 多肽应在糖基化宿主中表达，一般为真核细胞。昆虫细胞 通常完成与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化，为此已经 产生了昆虫细胞表达系统，以有效表达具有天然糖基化模 式的哺乳动物蛋白质。对其它修饰也需要考虑相似的问题。
应意识到相同类型修饰在给定的多肽中的一些位点可以 相同或不同程度存在。同样，给定的多肽可以含有许多类 型的修饰。
如本文使用，术语多核苷酸涵盖了所有这种修饰，尤其 在通过在宿主细胞中表达多核苷酸而合成的多肽中存在的 那些修饰。
本文所用的术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖了这样的 多核苷酸，其包括编码本发明多肽，尤其具有图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的RG1多肽的序列。该术语涵盖了这 样的多核苷酸，其包括一个编码多肽的连续区域或不连续 区域(例如由内含子中断)，及附加的区域。
“生物学活性”是指天然发生的RG1多肽的结构性， 调节性或生物化学功能。
“免疫学活性”是指天然的，重组的或合成的RG1或 其片段，在适当的动物或细胞中诱导特异性免疫应答，及 与特异性抗体结合的能力。
“寡核苷酸”是指相对短的多核苷酸。该术语通常是指 单链的脱氧核糖核苷酸，但也可以指单链或双链的核糖核 苷酸，RNA:DNA杂交体和双链的DNAs。寡核苷酸，如单 链的DNA探针寡核苷酸，通常是通过化学方法合成，如在 自动寡核苷酸合成仪上合成。然而，可以通过各种其它方 法产生寡核苷酸，包括体外重组DNA方法和通过在细胞和 有机体中表达DNA的方法。“寡核苷酸”或“寡聚物”或 多核苷酸“片段”，“部分”或“节段”是指具有至少大约10 个核苷酸，及多如大约60个核苷酸，优选大约15-30个 核苷酸，更优选大约20-25个核苷酸的多核苷酸序列。
“天然发生的RG1”是指由未进行遗传工程化的人体 细胞产生的RG1，特别是期望是产生自多肽翻译后修饰的 各种RG1形式，所述修饰包括但非限于乙酰化，羧基化， 糖基化，磷酸化，脂质化，酰化和裂解。
多核苷酸或多肽的“变体”是指分别与参比多核苷酸或 多肽不同的多核苷酸或多肽。这种含义的变体如以下和在 本发明揭示的其它章节所述。
(1)与另一个参比多核苷酸的多核苷酸序列不同的多核 苷酸。通常不同之处是限定的，以便参比的多核苷酸序列 和变体是非常相似的，并在许多区域是相同的。
如下所述，变体的多核苷酸序列中的变化可以是沉默 的。即它们可以不改变由多核苷酸编码的氨基酸。在改变 是限于这种类型的沉默改变之处，变体将编码与参比序列 具有相同氨基酸序列的多肽。如下所述，变体的多核苷酸 序列中的变化可以改变由参比多核苷酸编码的多肽的氨基 酸序列。这种多核苷酸变化可以使由参比序列编码的多肽 中产生氨基酸取代，添加，缺失，融合和截短，如下所述。
(2)与另外的参比多肽氨基酸序列不同的多肽。通常不 同之处是限定的，以便参比多肽和变体的序列是非常相似 的，并在许多区域是相同的。变体和参比多肽的氨基酸序 列可以由于一或多个取代，添加，缺失，融合和截短而不 同，它们可以以任何组合存在。编码这些相同或相似多肽 的重组变体可以是合成的，或通过利用“遗传密码”丰余 性而选择的。可以进行各种密码子取代如产生各种限制位 点的沉默变化，以最佳化克隆入质粒或病毒载体中或在特 殊的原核或真核系统中表达。也可以进行诱变以修饰多肽 的性质，改变配体结合亲和性，链间亲和性，或多肽降解 或周转率。
“等位基因变体”是指rg1多核苷酸的另一种形式。等 位基因得自突变即多核苷酸序列发生变化，并通常产生其 结构或功能可以或不改变的变化的mRNAs或多肽。任何给 定的基因可以没有，或有一或多种等位基因形式。产生等 位基因的突变一般是由于核苷酸的天然缺失，添加或取代 产生的。这些类型的变化均可以单独或组合发生，或在给 定的序列中发生一或多次。
“衍生物”是指分别衍生自天然发生的rg1或RG1的 多核苷酸或多肽，通过在人体蛋白内不正常发生的化学修 饰如遍在化，标记(例如用放射性核素，各种酶促修饰标 记)，pegylation(用聚乙二醇衍生)，或通过氨基酸如鸟氨 酸插入或取代(或取代编码这种氨基酸的核苷酸)而衍生。
“缺失”是指多核苷酸或氨基酸序列中分别缺少一或多 个多核苷酸或氨基酸残基的变化。
“插入”或“添加”是指多核苷酸或氨基酸序列中的变 化，与天然发生的多核苷酸或氨基酸序列相比，分别添加 了一或多个多核苷酸或氨基酸残基。
“取代”是指分别用不同的多核苷酸或氨基酸置换一或 多个多核苷酸或氨基酸。
优选地，氨基酸取代是将一个氨基酸用具有相似结构和 /或化学性质的另一种氨基酸置换，如用异亮氨酸或缬氨酸 置换亮氨酸，用谷氨酸置换天冬氨酸，或用丝氨酸置换苏 氨酸，即保守氨基酸置换。插入或缺失典型地在大约1-5 个氨基酸范围内。可以通过在多肽中用重组DNA方法系统 地产生氨基酸插入，缺失或取代，并分析所得重组变体的 活性，对发生的变化加以实验性测定。
“片段”是指一种多肽，其氨基酸序列与前述RG1多 肽及其变体或衍生物的氨基酸序列部分而非全部相同。
多肽的“片段”“部分”或“节段”是指至少大约5个 氨基酸，通常至少大约7个氨基酸，典型地至少大约9-13 个氨基酸，及在各种实施方案中至少大约17或更多个氨基 酸的一段氨基酸序列。
“重组体”或“重组的DNA分子”是指不是天然发生 的，或是通过人为组合序列的两个其它分离的节段而产生 的多核苷酸序列。“重组产生的”是指通常通过化学合成方 法，或通过人为操纵分离的多核苷酸节段，例如通过基因 工程技术所达到的人为组合。这种操纵通常是将一个密码 子用编码相同或保守氨基酸的丰余密码子置换，同时典型 地导入或除去一个序列识别位点。或者，与具有所需功能 的多核苷酸节段连接在一起，以产生一个遗传本体，其包 含在通常的天然形式中未发现的所需功能组合。限制酶识 别位点，调节序列，控制序列，或其它有益的特点可以通 过设计掺入其中。“重组的DNA分子”包括克隆和表达载 体。“重组体”还可以指编码多肽的多核苷酸，是用重组DNA 技术制备的。
“分离的”是指“通过人为”从其天然环境中改变，即 如果是天然发生的，将其从原始环境中改变或分离。例如， 以其天然状态天然存在于生活动物中的天然发生的多核苷 酸或多肽，不是“分离的”，但从其天然状态的共存物中分 离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。例如，关于多核苷 酸，术语分离是指从在其中其天然发生的染色体和细胞中 分离的。
多核苷酸和多肽可以存在于组合物中，如将多核苷酸或 多肽例如导入细胞中的培养基配方或溶液中，及存在于进 行化学或酶促反应的组合物或溶液中，例如其不是天然发 生的组合物，其中保留本文所用的此术语含义范围内的分 离的多核苷酸或多肽。
“基本纯化”和“基本同源”是交替用于阐述RG1多 肽，或其片段，或编码其的多核苷酸节段，其中这种多肽 或多核苷酸分离自天然涵盖其的组分中。当从涵盖其天然 状态的天然污染物中分离时，RG1多肽或其片段，或编码 其的DNA节段是基本没有天然相关的组分。因此，化学合 成的或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多 肽，基本没有其天然相关的组分。
“同源”这一术语当用于阐述多核苷酸时，是指两个多 核苷酸或其指定的序列，当进行最佳序列对比时具有适当 的核苷酸插入或缺失，至少70％核苷酸，通常为大约75％ -99％，优选至少大约98-99％的核苷酸是相同的。
“相似性”这一术语当用于阐述多肽时，是通过将一个 多肽的氨基酸序列和保守的氨基酸取代与另一个多肽的序 列进行对比而测定的。
“聚合酶链反应”或“PCR”是指一种方法，其中如1987 年7月28日发布的美国专利No.4683195所述扩增特异的 DNA。通常地，需要获得相应的或远处多肽片段末端的序 列信息，这样可以设计寡核苷酸引物；这些引物指向一定 方向，并与扩增模板的相反链的序列相同或相似。两种引 物的5’末端核苷酸与扩增物的末端一致。PCR可用于扩增 来自总基因组DNA的特异的DNA序列，转录自总细胞RNA 的cDNA，质粒序列等(见Mullis等，冷泉港 Symp.Quant.Biol.，51：263，1987；Erlich编辑，PCR技术， Stockton出版社，NY，1989)。
“严格性”典型是指在大约Tm(解链温度)-5℃(低 于探针Tm5℃)至大约20-25℃Tm范围内。正如本领域 技术人员所意识到，严格杂交可用于鉴别或检测相同的多 核苷酸序列，或鉴别或检测相似的或相关的多核苷酸序列。 本文所用术语“严格条件”是指杂交只在序列之间存在至 少95％优选至少97％相同性的情况下发生。
本文所用术语“杂交”应包括“将多核苷酸链与其互补 链通过碱基配对连接的任何方法”(Coombs，J.，生物技术 词典，Stockton出版社，纽约，N.Y.，1994)。
“治疗有效量“是指减轻疾病症状或状况的多肽或其抗 体，拮抗剂，或抑制剂，包括反义分子和核酶的数量。这 种化合物的治疗效力和毒性，可以在细胞培养物或实验动 物中通过标准药学方法确定，例如ED50(半数治疗有效量) 和LD50(半数致死量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比 是治疗指数，并可以ED50/LD50表示。
“治疗”是指治疗患者所患疾病，这种疾病与前列腺肿 瘤生长相关，并包括这样的疾病，其中需要降低患者的RG1 水平。
发明详述
本发明涉及新的RG1多肽，rg1多核苷酸，和直接抗RG1 多肽的抗体及其它物质，如以下更详细的论述。本发明尤 其涉及新的RG1多肽和编码这些RG1多肽的多核苷酸，并 特别涉及具有图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的RG1， 和具有图1(SEQ ID NO：1)所示多核苷酸序列的rg1。本发明 还涵盖了RG1变体。一种优选的RG1变体与图2(SEQ ID NO：2)所示多肽序列有至少70％相似性(优选至少70％相同 性)，优选具有至少90％相似性(优选至少90％相同性)， 更优选具有至少95％相似性(优选至少95％相同性)，并也 包括这种多肽的一部分，多肽的这部分一般含有至少30个 氨基酸及优选至少50个氨基酸。
预测的RG1多肽的编码序列起自图1(SEQ ID NO：1) 所示核苷酸序列的5’末端的296个碱基对。RG1含有胞外 基质蛋白的Mindin/F-spondin超家族的3个特征结构域：两 个spondin结构域(FS1和FS2)，分别包含31-103和138 -221位氨基酸，和一个血小板spondin结构域，包含278 -330位氨基酸。
本发明部分基于图3所示的RG1和大鼠Mindin之间的 结构同源性，大鼠Mindin是胞外基质蛋白家族的另一个成 员。RG1的氨基酸序列与大鼠Mindin具有接近89.7％的相 似性。
本发明还部分基于RG1的表达分布图，通过其在前列 腺组织文库中表达及在前列腺肿瘤文库中过表达证实。通 过基于PCR的Taqman分析，在来自正常和肿瘤组织的组 织样品中分析mRNA表达，可以见到这种组织分布图。这 种分析方法表明编码RG1的mRNA与其它组织相比，在前 列腺组织中是过表达的。
多核苷酸
根据本发明的一方面，提供了编码RG1多肽的分离的 多核苷酸，所述多肽具有图2(SEQ ID NO：2)所示推导的氨 基酸序列。
使用所提供的信息，如图1(SEQ ID NO：1)所示的多 核苷酸序列，本发明编码RG1多肽的多核苷酸可以使用标 准克隆和筛选方法获得，如使用来自人体组织细胞的mRNA 作为起始物克隆cDNA的那些方法。本发明举例说明了图 1(SEQ ID NO：1)所示多核苷酸序列是在得自人体前列腺组织 的cDNA克隆中发现的。通过mining lncyte’s LifeSeq数据 库，鉴别rg1是在前列腺组织中表达的基因。核苷酸序列是 使用lncyte为研究数据库而提供的“蛋白质功能”工具，通 过对数据库进行解读研究而鉴别的。核苷酸序列是在解读 的数据库中细胞粘着分子类别中发现的，并描述为是f- spondin的同源物。对rg1多核苷酸序列在数据库的一系列 文库中的分布进行的电子Northern分析表明，rg1在前列腺 组织中高水平表达，在一些其它组织文库中以较低水平表 达。
在将数据库中rg1克隆系列装配成连续的多核苷酸序 列，并对连续的序列进行编辑后，在预装配的多核苷酸中 鉴别全长编码序列。这个编码蛋白质的序列预大鼠mindin 同源。
Lncyte克隆1640796，1712252和1880265得自lncyte 以进行实验研究，克隆3360733经鉴别含有大多数5’核苷 酸序列。这个克隆是经过充分测序的，并含有预测的RG1 蛋白的全部编码序列。这个序列适于图1(SEQ ID NO：1)。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式如mRNA，或DNA 形式，例如包括cDNA和基因组DNA，通过克隆获得或通 过化学合成方法或通过组合方法或本发明所述方法产生。 DNA可以是双链或单链的。单链的DNA可以是编码链(也 称为有义链)，或者可以是非编码链(也称为反义链)。
编码多肽的序列可以与图1(SEQ ID NO：1)所示多核 苷酸的编码序列相同。其也可以是由于遗传密码的丰余(简 并)而具有不同序列的编码图2(SEQ ID NO：2)的多核苷酸。
本发明编码图2(SEQ ID NO：2)所示多肽的的多核苷酸， 可以包括但非限于多肽自身的编码序列；多肽的编码序列， 及另外的非编码序列，包括例如但非限于内含子和非编码 5’和3’序列，如在转录，mRNA加工(例如剪接和聚腺 苷酸化信号)起作用的转录的，未翻译序列，或编码如提 供其它功能的其它氨基酸的另外的编码序列。因此，多肽 例如可以融合于标记序列，如易于纯化融合多肽的肽。在 本发明的一些优选的实施方案中，标记序列是一种6-组氨 酸肽，如pTrcHisB载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供 的标签，其中许多是可以商购的。如Gentz等(美国科学院 院报86：821-824，1989)所述，6-组氨酸可以常规纯化融合 蛋白。
多核苷酸可以编码一种多肽，这种多肽是加上另外的氨 基或羧基末端氨基酸，或多肽内部的氨基酸(例如当活性 形式具有一个以上多肽链时)的多肽。这种序列可以在将 多肽从前体加工为最终形式中起作用，可以易于多肽运输， 可以延长或缩短多肽半衰期，或可以易于操纵多肽进行分 析或产生等等。由于一般是在原位的情况下，另外的氨基 酸可以通过蛋白酶从多肽中除去。
本发明还涉及所述多核苷酸的变体，其编码具有图 2(SEQ ID NO：2)所示推导的氨基酸序列的多肽的配对，类似 物和衍生物。多核苷酸的变体可以是天然发生的变体如天 然发生的等位基因变体，或者可以是未知是天然发生的变 体。多核苷酸的这种非天然发生的变体可以通过诱变方法 产生，包括用于多核苷酸，细胞或有机体的那些方法。
变体中在这点上是由于多核苷酸取代，缺失或添加而不 同于前述多核苷酸的变体。取代，缺失或添加可以包含一 或多个多核苷酸。变体可以是在编码区或非编码区或二者 中改变的。编码区中的变化可以产生保守的或非保守的氨 基酸取代，缺失或添加。
在本发明特别优选的实施方案中，在这点上是编码具有 图2(SEQ ID NO：2)所示RG1的氨基酸序列的多肽的多核苷 酸；其变体，类似物，衍生物和片段，及变体，类似物和 衍生物的片段。
特别优选的是编码RG1变体，类似物，衍生物和片段， 及片段的变体，类似物和衍生物的多核苷酸，其具有图2(SEQ ID NO：2)所示RG1多肽的氨基酸序列，其中一些，少量， 5-10，1-5，1-3，2，1个或没有氨基酸残基是任何组合的取 代，缺失或添加的。尤为优选的是不改变RG1多肽的性质 和活性的沉默取代，添加和缺失。同样尤为优选的是保守 取代。最优选的是编码具有图2(SEQ ID NO：2)所示没有取 代的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
本发明另外优选的实施方案是这样的多核苷酸，其与编 码具有图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的的RG1多肽的 多核苷酸具有至少70％相同性，及与这种多核苷酸互补的 多核苷酸。或者，最优选的是包含与编码RG1多肽的多核 苷酸有至少80％相同性的区域的多核苷酸，及其互补多核 苷酸。在这点上，尤为优选的是具有至少90％相同性的多 核苷酸，特别优选的是具有至少95％相同性的多核苷酸。 另外，更为优选的是具有至少97％，98％和99％相同性的 多核苷酸。
此外，特别优选的是编码基本保留与图1(SEQ ID NO：1)所示多核苷酸序列编码的多肽相同生物活性的多肽 的多核苷酸。
本发明还涉及与上述序列杂交的多核苷酸。在这点上， 本发明特别涉及在严格杂交条件下，与上述多核苷酸杂交 的多核苷酸。
如关于本发明多核苷酸的其它分析所揭示，例如上述的 本发明多核苷酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探 针，以分离编码RG1的全长cDNAs和基因组克隆，及分离 与rg1基因具有高度序列相似性的其它基因的cDNA和基因 组克隆。这种探针通常包含至少15个碱基。优选地，这种 探针具有至少30个碱基，并可以具有至少50个碱基。
例如，可以使用合成的寡核苷酸探针筛选文库分离rg1 基因的编码区，所述探针是用已知DNA序列设计的。例如， 具有与本发明多核苷酸的序列互补的序列的标记的寡核苷 酸，可以用于筛选cDNA或基因组DNA的文库，以鉴别与 探针杂交的克隆。
总而言之，本发明的多核苷酸可以编码一种多肽，一种 加上引导序列的多肽(可以称为前多肽)。
应意识到本发明还涉及编码多肽片段的多核苷酸，与编 码多肽片段的多核苷酸杂交尤其在严格条件下杂交的多核 苷酸，及多核苷酸如PCR引物，以扩增编码多肽片段的多 核苷酸。优选的是相当于优选的多肽片段的那些多核苷酸， 如下述。
多肽
本发明还涉及具有图2(SEQ ID NO：2)所示推导的氨基 酸序列的RG1多肽。
本发明还涉及这些多肽的片段，类似物和衍生物。术语 片段，衍生物和类似物当指图2(SEQ ID NO：2)所示多肽时， 是指基本保留与这种多肽相同生物活性的多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成的多 肽。在一些一些的实施方案中，是重组的多肽。
图2(SEQ ID NO：2)所示多肽的片段，衍生物或类似物 可以是(i)其中一或多个氨基酸残基用保守或非保守的氨 基酸残基取代(一些保守的氨基酸残基)，而且这种取代的 氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的，或(ii)其中 一或多个氨基酸残基包括一个取代基，或(iii)其中多肽与 另一种化合物融合，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚 乙二醇)，或(iv)其中另外的氨基酸与多肽融合，如引导 序列或分泌序列或用于纯化多肽的序列。通过本文教导， 认为这种片段，衍生物和类似物在本领域技术范围内。
在这点上本发明特别一些的实施方案是具有图2(SEQ ID NO：2)所示RG1的氨基酸序列的多肽，其变体，类似物， 衍生物和片段，及片段的变体，类似物和衍生物。
优选的变体是由于保守氨基酸取代而不同于参照物的那 些变体。这种取代是用另一种相似特性的氨基酸取代多肽 中给定的氨基酸。典型可见的保守取代是脂肪族氨基酸 Ala，Val，Leu，和Ile的彼此置换，羟基Ser和Thr的互换， 酸性Asp和Glu的交换，酰胺基Asn和Gln之间的取代， 碱性Lys和Arg的交换及芳香族Phe和Tyr之间的置换。
在这点上尤为优选的是具有图2(SEQ ID NO：2)所示RG1 多肽的氨基酸序列的变体，类似物，衍生物和片段，及片 段的变体，类似物和衍生物，其中一些，少量，5-10，1-5， 1-3，2，1个氨基酸残基或没有氨基酸残基是任何组合的取 代，缺失或添加的。尤为优选的是不改变RG1多肽性质和 活性的沉默取代，添加和缺失。同样尤为优选的是保守取 代。最优选的是具有图2(SEQ ID NO：2)所示没有取代的氨 基酸序列的多肽。
本发明的多肽和多核苷酸优选是以分离形式提供的，优 选纯化至同质性。
本发明的多肽还包括图2(SEQ ID NO：2)所示多肽，以 及与图2(SEQ ID NO：2)所示多肽具有至少70％相似性(优 选70％相同性)，优选具有至少90％相似性(优选90％相同 性)，更优选具有至少95％相似性(优选95％相同性)的多 肽，并还包括这种多肽的一部分，多肽的这部分一般含有 至少30个氨基酸，优选至少50个氨基酸。
如本领域已知两个多肽之间的“相似性”，是将一个多 肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代与另一个多肽的序 列相对比而测定的。
通过肽合成方法，本发明多肽的片段或一部分可以用于 产生相应的全长多肽；因此，片段可以用作产生全长多肽 的中间物。
片段
本发明在这个方面优选的实施方案是这样的多肽，其包 含RG1的片段，尤其图2(SEQ ID NO：2)所示RG1的片段， 及图2(SEQ ID NO：2)所示RG1的变体和衍生物的片段。
在这点上，片段是具有一种氨基酸序列的多肽，所述氨 基酸序列与前述RG1多肽及其变体或衍生物的氨基酸序列 部分而非全部相同。
在这点上，片段是一种多肽，其具有的氨基酸序列与 前述RG1多肽及其变体或衍生物的氨基酸序列部分而非全 部相同。
这种片段可以是“无标准”的，即不是其它氨基酸或 多肽的一部分或与其融合，或者可以包含于较大的多肽中， 形成较大多肽的一部分或一个区域。当包含于较大的多肽 中时，所述片段优选形成一个连续的区域。然而，一些片 段可以包含于一个较大的多肽中。例如，一些优选的实施 方案涉及包含于一种前体多肽中的本发明RG1多肽的一个 片段，所述前体多肽是设计的以在宿主中表达，并具有融 合于RG1片段氨基末端的异源的前多肽和多肽原区域，及 融合于此片段羧基末端的另外的一个区域。因此，所述片 段是指衍生自RG1的融合多肽或融合蛋白的一部分。
本发明多肽片段的代表性实施例可以具有大约25-331 个氨基酸。
文中“大约”是指在一个末端或两个末端具有比所述 范围多或少一些，少量，5，4，3，2，和1个氨基酸。例 如，文中大约331个氨基酸是指一种多肽片段，其具有25 个加上或减去一些，少量，5，4，3，2，和1个氨基酸至331 个氨基酸加上或减去一些，少量5，4，3，2，和1个氨基 酸残基，即在大如25个减去一些氨基酸至331个加上一些 氨基酸的范围，及小如25个加上一些氨基酸至331个减去 一些氨基酸的范围内。
在这方面优选的是在一或两个末端在所述范围内加上 或减去如5个氨基酸。尤为优选的是在一或两个末端在所 述范围内加上或减去如3个氨基酸。更优选的是在一或两 个末端在所述范围内加上或减去如1个氨基酸，或不添加 或缺失氨基酸。最优选的是大约25-331个氨基酸的片段。
本发明优选的片段是RG1的截短的突变体。RG1的截 短突变体包括图2(SEQ ID NO：2)所示序列的变体或衍生 物，除了缺失一个连续系列的残基(即一个连续区域，部 分或一部分)，包括图2(SEQ ID NO：2)所示序列的氨基末 端，或者一个连续系列的残基，包括羧基端残基，或在双 截短体中是缺失两个连续系列的残基，一个包括氨基端， 一个包括羧基端。优选的截短片段是具有上述大小的片段。
尤为优选的是具有RG1生物学和/或免疫学活性的片 段。这种片段包括那些含有RG1预知结构性结构域的片段， 其涵盖了至少31-103，138-221和278-330个氨基酸的 片段，或那些用于产生抗体的片段，如实施例4所述。
在这方面一些优选的区域示于图2(SEQ ID NO：2)，并 包括但非限于通过分析图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序 列鉴别的上述类型的区域。
在这方面尤为优选的是那些包含RG1区域的片段，所 述区域组合了一些如上述的结构特点。尤为优选的是两个 spondin和一个thrombospondin区域，它们分别含有大约31 -103，138-221和278-330个氨基酸，具有胞外基质蛋 白的Mindin/spondin超家族的特点。这种区域可以包含在较 大的多肽内，或者其自身就是本发明优选的片段。应意识 到文中术语“大约”一般是指关于上述片段所作的解释。
另外优选的区域是那些介导RG1活性的区域。最优选 的是具有RG1的化学，生物学或其它活性的片段，包括那 些具有相似或改良活性，或具有降低的非所需活性的片段。 在这方面特别优选的是这样的片段，其含有的区域在序列， 位置或序列和位置是同源的，以激活相关多肽的区域，如 Mindin家族的其它蛋白质，包括RG1。
载体，宿主细胞和表达系统
本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体，用本发明 载体遗传工程化的宿主细胞，和通过重组方法产生本发明 多肽。这种方法见于Sambrook等，分子克隆实验手册，冷 泉港实验室出版社，Plainview，N.Y.，1989和Ausubel，F.M. 等，分子生物学通用方法，John Wiley&Sons，纽约，N.Y.， 1989。
可以对宿主细胞进行遗传工程化，以掺入多核苷酸并 表达本发明的多核苷酸。例如，可以通过熟知的感染，转 导，转染，转介和转化方法，将多核苷酸导入宿主细胞中。 可以将多核苷酸单独或与其它多核苷酸一起导入。这种其 它的多核苷酸可以单独导入，与本发明的多核苷酸一起导 入，或与本发明的多核苷酸结合导入。
因此，例如可以使用标准的在哺乳动物中进行共同转 染和选择的方法，将本发明的多核苷酸转染入具有另一种 单独的编码可选择标记的多核苷酸中。在这种情况中，多 核苷酸通常是稳定地掺入宿主细胞基因组中。
或者，多核苷酸可以与含有可选择标记的载体结合以 在宿主中增殖。可以通过前述方法将载体构建体导入宿主 细胞中。通常地，质粒载体在沉淀物如磷酸钙沉淀，或在 与荷电脂质的复合物中作为DNA导入。也可以使用电穿孔 方法将多核苷酸导入宿主。如果载体是病毒，可以在体外 将其包装或导入包装细胞中，包装的病毒可以转导入细胞 中。本领域技术人员熟知许多适于产生多核苷酸和将多核 苷酸导入细胞的方法。这种方法参见上述Sambrook等所述， 这只是详细阐述这些方法的许多实验手册中的一个实例。 根据本发明的这个方面，载体例如可以是质粒载体，单链 或双链的噬菌体载体，单链或双链的RNA或DNA病毒载 体。通过熟知的将DNA或RNA导入细胞中的方法，可以 将这种载体作为多核苷酸优选DNA导入细胞中。在噬菌体 和病毒载体的情况下，通过熟知的感染和转导的方法也可 以并优选将载体作为包装的或衣壳化病毒导入细胞中。病 毒载体可以有复制能力或复制缺陷的。在后一情况中，病 毒增殖通常只在互补的宿主细胞中发生。
优选的载体是那些表达本发明多核苷酸和多肽的载 体。这种载体通常包含可操纵地连于被表达的多核苷酸的 顺式作用控制区，以在宿主中有效地表达。适当的反式作 用因子是由宿主，互补载体提供的，或由导入宿主的载体 自身提供的。
在这方面的一些优选的实施方案中，载体提供特异性 表达。这种特异性表达可以是可诱导表达或只在特定类型 的细胞中表达，或者是可诱导和细胞特异性的。特别优选 的可诱导载体是可以诱导的以通过环境因子表达的载体， 所述环境因子是易于操纵的如温度和营养添加剂。本领域 技术人员熟知适于本发明这方面的一些载体，包括用于原 核细胞和真核细胞宿主的组成型和可诱导表达载体，并可 以常规应用。
遗传工程化的宿主细胞可以在常规营养培养基中培 养，所述培养基可以适当修饰，例如激活启动子，选择转 化体或扩增基因。本领域技术人员意识到预先选择的用于 宿主细胞以进行表达的培养条件如温度，pH等，应适于表 达本发明的多肽。
可以使用许多表达载体表达本发明的多肽。这种载体 包括染色体型，附加型和病毒衍生的载体，例如衍生自细 菌质粒，噬菌体，酵母染色体因子，病毒如杆状病毒，乳 多空病毒，如SV40，痘苗病毒，腺病毒，牛痘病毒， pseudorabies病毒，逆转录病毒和甲病毒属如Sindbis病毒， 和衍生自上述组合的载体，如那些衍生自质粒和噬菌体遗 传因子如粘粒和噬菌粒的载体，所有这些载体根据本发明 均可用于进行表达。通常地，任何适于保持，增殖或表达 多核苷酸以在宿主中表达多肽的载体均可以用于表达。
通过任何熟知和常规的方法，均可以将适当的DNA序 列掺入载体中。通常将表达的DNA序列与表达载体连接是 通过用一或多种限制性内切酶切割DNA序列和表达载体， 然后用T4DNA连接酶将限制性片段连接而进行的。本领 域技术人员熟知并可以常规使用进行限制和连接的方法。 在这方面和使用另一种方法构建表达载体的的适当方法也 为本领域技术人员所熟知，并详见于Sambrook等所述。
表达载体中的DNA序列可操纵地连于适当的表达控制 序列，包括例如指导mRNA转录的启动子，这种启动子代 表性包括噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac，trp，tac和trc 启动子，SV40早期和晚期启动子及逆转录病毒LTRs等， 这里只列举了熟知的启动子的一少部分。应意识到适用于 本发明这个方面的许多未提及的启动子也是本领域技术人 员熟知的，并可以通过所例举的方式应用。
通常地，表达构建体含有转录起始和终止位点，并在 转录区域含有进行翻译的核糖体结合位点。由构建体表达 转录物的编码部分，在起始处包括一个翻译起始AUG，终 止密码子几乎位于翻译的多肽的末端。
另外，构建体可以含有调节以及增强表达的控制区域。 通常地，根据许多目前通用的方法，这种区域可以通过控 制转录操纵，如阻抑物结合位点和增强子等。
进行增殖和表达的载体一般包括可选择标记。这种标 记也可以是适于扩增的，或者载体可以含有另外的标记。 在这方面，表达载体优选含有一或多个可选择标记基因， 以提供表型性状选择转化的宿主细胞。优选的标记对真核 细胞培养物而言，包括二氢叶酸还原酶，新霉素，嘌呤霉 素或潮霉素抗性基因，对大肠杆菌和其它细菌培养物而言， 包括四环素，theomycin，卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。
含有适当所述DNA序列以及适当启动子，及其它适当 控制序列的载体，可以使用熟知的适于表达所需多肽的方 法导入适当的宿主中。适当的宿主代表性例如包括细菌细 胞，如大肠杆菌细胞，链霉菌细胞和鼠伤寒杆菌细胞；真 菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9细 胞；动物细胞如CHO，COS和Bowes黑素瘤细胞；和植物 细胞优选昆虫细胞BT1-TN-5B1-4。本领域技术人员熟知大 量表达构建体的宿主，并可以根据本发明的揭示选择表达 本发明多肽的宿主。
可以使用各种哺乳动物细胞培养系统进行表达。哺乳 动物表达系统例如包括猴肾成纤维细胞COS-7系(Gluzman 等，细胞23：175，1991)。其它能表达可相容载体的细胞系 例如包括C127，3T3，CHO，HeLa，人肾293和BHK细胞 系。在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表 达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况中，编码RG1的 多核苷酸序列可以连接入腺病毒转录/翻译复合物中，所述 复合物由晚期启动子和三联前导序列组成。在病毒基因组 的一个非必需E1或E3区域中插入，产生一个能在感染的 宿主细胞中表达RG1的活性病毒(Logan和Shenk，美国科 学院院报81：3655-59，1984)。另外，转录增强子如Rous肉 瘤病毒(RSV)增强子，可以用于提高在哺乳动物宿主细胞 中的表达。
更特别地，本发明还包括重组的构建体，如表达构建 体，其包含上述一或多个序列。此构建体包含一个载体， 如质粒或病毒载体，其中已经插入本发明的序列。序列可 以正向或反向插入。在这方面的一些优选的实施方案中， 构建体还包含调节序列，例如包括可操纵地与序列连接的 启动子。本领域技术人员已知大量适当的载体和启动子， 而且有许多可商购的载体适用于本发明。
以下举例提及了一些可商购的载体。优选在细菌中使 用的载体是购自美国Qiagen公司的pQE7O，pQE6O和 pQE-9；购自Stratagene公司(LaJolla，CA)的pBS载体， Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A，Pnh16a， pNH18A，pNH46A；和购自Pharmacia Biotech公司 (Piscataway，N.J.)的ptrca，pK223-3，pKK233-3，Pdr54O， pRIT5。最优选的是购自Invitrogen的pTrcHisB载体。优选 的真核细胞载体是购自Stratagene的pWLNEO，pSV2CAT， Pog44，PXTI和pSG；和购自Pharmacia Biotech PSVK3， pBPV，pMSG和pSVL。最优选的是购自Promega的pClneo 载体。这些载体只是例举了许多可商购载体的一少部分， 而且是本领域技术人员熟知的可用于本发明的载体。应意 识到根据本发明可以使用适于例如在宿主中导入，维持， 增殖或表达本发明多核苷酸或多肽的任何其它质粒或载 体。
启动子区域可以使用载体选自任何所需的基因，所述 载体含有一个缺失启动子区域的报道转录单位，如氯霉素 乙酰转移酶(cat)转录单位，下游的导入候选启动子片段 的限制位点；即可包含一个启动子的片段。正如所熟知的， 在cat基因上游的限制位点将含有启动子的片段导入载体中 可以激活CAT，这可以通过标准的CAT分析检测。两个这 种载体是pKK232-B和pCM7。因此，表达本发明多核苷酸 的启动子不仅包括熟知的和易于获得的启动子，还包括通 过上述方法使用报道基因易于获得的那些启动子。
已知的适于表达本发明多核苷酸和多肽的细菌启动子 是大肠杆菌lac1和lacZ启动子，T3和T7启动子，T5tac 启动子，λPR，PL启动子，trp启动子和衍生自trp和lac启 动子的trc杂合启动子。已知的适于这方面的真核启动子是 CMV立即早期启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期 SV40启动子，逆转录病毒LTRs启动子，如Rous肉瘤病毒 (RSV)启动子和金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-1 启动子。
在宿主细胞中表达的适当载体和启动子的选择是本领 域技术人员所熟知的，而且表达载体的构建，将载体导入 宿主中并在宿主中表达的必需方法也是本领域技术人员所 常规使用的。
通常地，重组载体包括复制起点，一个衍生自高度表 达的基因的启动子，以指导下游结构序列转录，和一个可 选择的标记，以在暴露于载体后分离含有载体的细胞。
本发明还涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞 可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞 如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。 宿主细胞中的构建体可以以常规方式使用，以产生由重组 序列编码的基因产物。
多肽可以在适当启动子控制下，在哺乳动物细胞，酵 母，细菌或其它细胞中表达。没有细胞的翻译系统也可用 于产生这种蛋白质，通过使用衍生自本发明的DNA构建体 的RNAs进行。用于原核和真核细胞宿主的适当克隆和表 达载体如Sambrook等所述。
通过高等真核细胞转录编码本发明多肽的DNA，可以 通过将一个增强子序列插入载体中而增强。增强子是DNA 的顺式作用因子，通常大约10-300个bp，在给定类型的 宿主细胞中提高启动子的转录活性。增强子例如包括SV40 启动子，其位于在100-270bp的复制起点的后侧，巨细胞 病毒早期启动子增强子，位于复制起点后侧的多形瘤增强 子，和腺病毒增强子。
使用标准方法，将编码本发明的异源结构序列的本发 明的多核苷酸插入载体中，使其可操纵地连于启动子以进 行表达。多核苷酸是定位的，以使转录起始位点接近位于5’ 端至核糖体结合位点。核糖体结合位点在5’端至AUG之 间，启动表达的多肽翻译。通常地，在起始密码子通常为AUG 起始处，及核糖体结合位点与起始AUG之间没有其它的开 放读框。同样，在多肽的末端有一个翻译终止密码子，而 且有一个聚腺苷酸化信号，和接近在转录区3’末端的一个 转录终止信号。
为将翻译的蛋白质分泌入内质网腔，壁膜间隙或胞外 环境中，可以将适当的分泌信号掺入表达的多肽中。这个 信号可以是多肽内源性的，或者可以是异源信号。多肽可 以以修饰的形式表达，如以融合蛋白的形式，而且不仅可 以包括分泌信号，也可以包括其它的异源功能区。因此， 例可以在多肽的N末端加入如一个另外氨基酸区域尤其荷 电的氨基酸，以在纯化期间或在随后的运用和贮存期间改 良在宿主细胞中的稳定性和持续性。同样，也可以在多肽 中加入特殊的区域以易于纯化。这种区域在最后制备多肽 之前可以除去。在多肽中加入肽部分以产生分泌或排泄， 改良稳定性或易于纯化等方法是本领域技术人员熟知并常 规使用的。例如，当需要将大量的RG1导入抗体中时，需 要直接高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体。这种载体 包括但非限于多功能的大肠杆菌克隆和表达载体，如 Bluescript(Stratagene)，其中rg1编码序列可以在框架中 以氨基端Met和随后的7个β-半乳糖苷酶残基的序列连接 于载体中，以便产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heede和 Shuster，生物化学杂志264：5503-5509，1989)等。PtrcHis 载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)可以用于表达外源多肽 作为含有多组氨酸(6×His)标记的融合蛋白以迅速纯化。 在这种系统中产生的蛋白质设计为包括切割位点如肠激酶 裂解位点，以便相应的克隆的多肽可以从融合肽组分中随 意释放。
在转化适当的宿主菌株及宿主菌株生长至适当的细胞 密度后，可诱导启动子如果存在则可以通过适当的方法(例 如温度变换或暴露于化学诱导剂)诱导，并将细胞另外培 养一段时间。
然后通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破坏， 将所得粗提物保留以进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞，可以通过任何常规方 法破坏，包括冷冻-融化循环，超声，机械破坏，或使用细 胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员所熟知的。
RG1多肽可以通过熟知的方法从重组细胞培养物中回 收和纯化，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸性提取， 阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层 析，亲和层析，羟磷灰石层析和凝集素层析。优选使用高 效液相层析(HPLC)进行纯化。当多肽在分离和或纯化期 间变性时，可以应用熟知的重折叠蛋白质的方法以再生活 性的构象。本领域熟知的各种纯化蛋白质的其它方法包括 那些Deutscher，M.，酶学方法，第182卷，科学出版社， San Diego，1982；和Scopes，R.，蛋白质纯化原理和实践， Springer-Verlag，纽约，1982。
或者，本发明的多肽可以使用固相方法通过直接合成 肽而产生(Stewart等，固相肽合成，W.H.Freeman Co.，San Francisco，1969；Merrifield，J.，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154， 1963)。可以使用人工或自动方法进行体外蛋白质合成。自 动合成例如可以通过使用Applied Biosystems 431A肽合成 仪(Perkin Elmer，Foster City，Calf)，根据生产者的指导 进行。RG1的各种片段可以是单独或组合使用化学方法化 学合成的，以产生全长的分子。
本发明的多肽包括自然纯化的产物，化学合成的产物， 及通过重组方法从真核或原核宿主中产生的产物，所述宿 主例如包括细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞。 依赖于重组产生方法中的宿主，本发明的多肽可以是糖基 化的或可以是非糖基化的。另外，本发明的多肽也可以包 括一个初始形式的甲硫氨酸残基，在一些情况中是宿主介 导的结果。
RG1多肽及编码其的多核苷酸的使用
Rg1多核苷酸和RG1多肽根据本发明可以有许多用途， 尤其使用RG1的化学和生物学性质的那些用途。另外可以 用于诊断和治疗细胞增殖性疾病，如前列腺癌。本发明的 这些方面通过以下揭示得以进一步例证，并在说明书的主 要部分内进一步阐述。
使用本发明多核苷酸和多肽序列的基本原理，部分基于 RG 1和其它胞外基质分子之间的化学和结构同源性，及基 于RG1在前列腺组织中比在其它组织中优先表达。RG1可 以用于诊断和治疗与前列腺组织异常生长相关的病理状 态，功能失调或疾病。这些包括但非限于癌症和转移性肿 瘤生长。
Rg1序列可以用作DNA探针，及用作反义和核酶疗法 的靶位，或作为产生反义多核苷酸的模板。
RG1多肽可以用于产生RG1的抗体，以用于检测细胞 和组织中多肽的水平，及将药物定向于原发和转移瘤。
RG1多肽可用于刺激对含有RG1细胞的免疫应答。
编码RG1的多核苷酸可用于检测细胞和组织中编码 RG1的多核苷酸水平的诊断分析中。
在与RG1表达相关的病变中，如前列腺癌，抑制RG1 的表达和活性是有益的。RG1表达可以通过施用反义寡核 苷酸或核酶而抑制。或者，可以施用特异识别RG1多肽活 性相关区域的抗体，以治疗与RG1活性相关的疾病或病理 状态。
多核苷酸分析
本发明还涉及使用rg1-相关的多核苷酸以检测互补多核 苷酸，例如作为诊断试剂。与疾病相关的rg1多核苷酸的检 测，提供了一种体外或体内诊断工具，可以补充或限于诊 断由于RG1组织特异性表达所致的疾病或对这种疾病的易 感性。
编码RG1的基因中有突变的个体，可以在DNA水平 通过各种方法检测。进行诊断的多核苷酸样品可以得自病 人的细胞，如取自血液，尿液，唾液，组织活检和尸检物。 基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析之前通过使用 PCR进行酶促扩增(Saiki等，自然324：163-166，1986)。RNA 或cDNA也可以以相同方式使用。例如，互补于编码RG1 的多核苷酸序列的PCR引物，可以用于鉴别和分析rg1的 表达和突变。例如，缺失和插入可以通过扩增产物的大小 与正常基因型不同而检测。点突变可以通过将扩增的DNA 与放射标记的rg1 RNA或者放射标记的rg1反义DNA序列 杂交而鉴别。通过RNase A消化或通过解链温度不同，可 以将完全匹配的序列从错配的双链体中区分出。
参照基因和具有突变的基因之间的序列差异还可以通过 直接DNA测序证明。另外，克隆的DNA节段可以用作探 针，以检测特异性DNA节段。这种方法的敏感性可以通过 适当使用PCR或其它的扩增方法而明显增强。例如，测序 引物与双链的PCR产物或通过修改的PCR产生的单链的模 板分子一起使用。序列测定是使用放射标记的多核苷酸通 过常规方法，或使用荧光标记通过自动测序方法进行的。
基于DNA序列差异的遗传学试验，可以通过检测有或 无变性剂的凝胶中DNA片段的电泳迁移率的变化进行。通 过高解离凝胶电泳可以观测到少量序列缺失和插入。不同 序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上区分，其中 不同DNA片段的迁移率根据其特异性解链或部分解链温 度，在凝胶中在不同位置减速(见例如Myers等，科学 230：1242，1985)。
在特异位置的序列变化也可以通过核酸酶保护分析证 实，如RNase和S1保护或者通过化学裂解方法证实(例如 Catton等，美国科学院院报85：4397-4401，1985)。
因此，检测特异性DNA序列可以通过以下方法进行， 如杂交，RNase保护，化学裂解，直接DNA测序或使用限 制酶(例如限制片段长度多态性(RFLP)和基因组DNA 的Southern印迹分析)。
除了更常规的凝胶电泳和DNA测序之外，突变也可以 通过原位分析进行检测。
多肽分析
本发明还涉及诊断分析如定量分析和检测细胞和组织和 体液中RG1多肽水平的诊断分析，包括测定正常和异常水 平。因此例如根据本发明的检测与在正常对照组织样品中 相比RG1多肽过表达的诊断分析，可以用于检测瘤形成， 例如前列腺癌。这种诊断试验可用于检测转移瘤生长。可 用于测定来自宿主的样品中多肽如本发明的RG1多肽的水 平的分析方法，是本领域技术人员所熟知的。这种分析方 法包括放射性免疫分析(RIA)，竞争性结合分析，Western 印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)，及荧光激活的细 胞分选(FACS)。这些方法当中优选ELISA。ELISA分析 开始包括制备一种RG1的特异性抗体，优选单克隆抗体。 另外，通常要制备一种结合单克隆抗体的报道抗体。将报 道抗体粘附于一种可检测试剂，如放射性，荧光或酶促试 剂，在这个实施例中是辣根过氧化物酶。
为进行ELISA，从宿主中取样品，并在结合样品中多 肽的固体支持物上温育，如在聚苯乙烯培养皿上。然后将 培养皿上的任何游离多肽结合位点，通过用非特异性蛋白 质如牛血清白蛋白温育而覆盖。接着，将单克隆抗体在培 养皿中，在单克隆抗体与附着于聚苯乙烯培养皿的任何RG1 多肽附着的期间温育。用合成仪将未结合的单克隆抗体洗 去。将连接于辣根过氧化物酶的报道抗体置于培养皿中， 导致报道抗体与结合RG1的任何单克隆抗体结合。然后洗 去未附着的报道抗体。然后在培养皿中加入过氧化物酶活 性试剂，包括比色底物。通过原始和二级抗体连接于RG1 的固定的过氧化物酶，产生有色的反应产物。在给定的时 间内产生的颜色数量，表明样品中存在的RG1多肽数量。 定量结果典型地是通过参考标准曲线获得的。
可以使用竞争性分析，其中将特异于RG1的抗体附着 于固相支持物，并将标记的RG1和取自宿主的样品穿经此 固相支持物，检测到的附着于固相支持物的标记数量与样 品中RG1的数量相关。
这些及其它方法见于Hampton等(血清学方法实验手 册，APS出版社，St Paul，Minn，1990)和Maddox等(实 验方法杂志158：12111，1983)所述。
抗体
本发明还涉及特异结合RG1的抗体，在此称为RG1抗 体。RG1在前列腺组织中的过表达及其细胞表面位置，代 表了进行筛选，诊断，预后，追踪分析和显影方法的理想 标记的特性。另外，这些特性表明RG1可以是一些疗法的 理想靶位，如定向抗体疗法，免疫疗法和基因疗法。如本 文所用术语“特异结合”是指抗体与多肽之间的相互作用， 其中这种相互作用依赖于多肽上存在特殊的结构(即抗原 性决定簇或表位)；换而言之，抗体识别并结合特异性多肽 结构而不是一般的蛋白质。
RG1多肽，其片段或其它衍生物，或其类似物，或表 达它们的细胞，可以用作免疫原以产生抗体(Harlow，抗 体，冷泉港出版社，NY(1989))。这些抗体例如可以是多 克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合的，单链的，人化 的和人抗体，以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。可 以使用本领域已知的各种方法产生这种抗体和片段。
抗相当于本发明序列的多肽产生的抗体，可以通过将多 肽直接注射入动物体内，或通过将多肽施用于动物优选非 人动物而获得。这样获得的抗体然后结合其自身多肽。以 这种方式，甚至只编码多肽片段的序列也可用于产生结合 整个天然多肽的抗体。这种抗体然后可用于从表达那种多 肽的组织中分离多肽。
为制备单克隆抗体，可以使用任何通过连续细胞系培养 产生抗体的方法。例如包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein， 自然256：495-497，1975)，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor 等，现代免疫学4：72，1983)和产生人单克隆抗体的EBV- 杂交瘤技术(Cole等，单克隆抗体和癌症，Alan R.Liss，Inc.， 77-96，1985)。
另外，可以使用产生“嵌合”抗体的技术，将小鼠抗体 基因与人抗体基因相剪接，获得具有适当抗原特异性和生 物学活性的分子(Morrison等，美国科学院院报81：6851- 6855，1984；Neuberger等，自然312：604-608，1984；Takeda 等，自然314：452-454，1985)。或者，生产单链抗体的技术 (美国专利No.4946778)可以适于生产RG1特异性单链抗 体。
另外，“人”抗体可以使用美国专利No.5877397和 5569825所述的方法生产，所述专利在此并入参考。
抗体还可以通过在淋巴细胞群中体内诱导产生，或通过 筛选重组的免疫球蛋白文库或高特异性结合剂而产生，如 Orlandi等(美国科学院院报86：3833-3837，1989)和Winter 和Milstein(自然349：293-299，1991)所述。
也可以产生含有RG1特异性结合位点的抗体片段。例 如，这种片段包括但非限于F(ab’)2片段，其可以通过胃 蛋白酶消化抗体分子而产生，和Fab片段，其可以通过还 原F(ab’)2片段的二硫键而产生。或者，可以构建Fab表 达文库以迅速和简便地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab 片段(Huse等，科学256：1270-1281，1989)。
在此所述RG1的氨基酸序列可以用于选择RG1多肽特 异性区域，以产生抗体。本领域技术人员应意识到抗体定 向的RG1多肽的区域和表位可以随着具体应用而变化。例 如，用于免疫分析中以检测前列腺细胞上膜结合的RG1的 抗体，应定向于RG1多肽上的可及表位。表现免疫原性记 过的RG1多肽的区域，以及其它区域和结构域，可以使用 本领域已知的各种其它方法轻易鉴别，如Chou-Fasman， Gamier-Robson，或Jameson-Wolf分析。含有这些残基的片 段特别适于产生抗RG1抗体。特别有用的片段包括但非限 于序列PLGGESICSAGAPAKYSIT(SEQ ID NO：8)； HSSDYSMWRKNQYVS(SEQ ID NO：10)； DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(SEQ ID NO：11)，和 NEIVDSASVPET(SEQ ID NO：12)。这些区域产生的单克 隆抗体见于实施例4所述。
本发明的RG1抗体可以特别用于前列腺癌的诊断分 析，显影方法学，和治疗方法中。本发明提供了用于检测RG1 多肽和诊断前列腺癌的各种免疫学分析。这种分析通常包 括一或多个能识别和结合RG1多肽的RG1抗体。最优选的 抗体将选择性结合RG1并不结合(或微弱结合)非RG1多 肽。这些分析包括本领域熟知的各种免疫学分析，包括但 非限于各种类型的免疫学分析，酶联免疫吸附测定等。另 外，本发明还提供了能检测前列腺癌的免疫学显影方法， 包括但分析适用于标记的RG1抗体的放射闪烁照相显影方 法。这种分析可以临床用于检测，监测和预后前列腺癌。
上述抗体可以用于分离或鉴别表达多肽的克隆，或纯化 本发明的多肽，通过将抗体附着于固体支持物以通过亲和 层析分离和/或纯化。
另外，可以使用细胞分选和纯化方法，将RG1抗体用 于分离RG1阳性细胞。特别地，RG1抗体可以用于从异种 移植的肿瘤组织中，从培养的细胞中等，使用基于抗体的 细胞分选或嵌合纯化方法，分离前列腺癌细胞。本发明RG1 抗体的其它应用包括产生模拟RG1多肽的抗独特型抗体。
RG1多肽可以用于监测前列腺癌或肿瘤转移的存在与 否。各种生物学样品中，包括血清，前列腺和其它组织活 检样品，是否存在这种含有RG1的细胞，可以用RG1抗体 检测。另外，RG1抗体可以用于各种显影方法学中，如用 Tc-99m(或其它同位素)缀合的抗体进行免疫闪烁照相。 例如，可以使用一种类似于最近阐述的使用In-111缀合的 抗PSMA抗体的显影方法，以检测复发的和转移的前列腺 癌(Sodee等，临床核酸方法21：756-766，1997)。
本发明的RG1抗体可以用可检测的标志标记或缀合于 另一种分子，如胞毒剂，及用于将另一种分子定向于RG1 阳性细胞(Vitetta，E.S.等，免疫毒素疗法，DeVita，Jr.，V.T. 等编辑，癌症：肿瘤学原理和实践，第4版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，2624-2636，1993)。胞毒剂例如包括但 非限于蓖麻毒蛋白，阿霉素，道诺红霉素，紫杉醇，溴化 乙锭，丝裂霉素，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，tenoposide，长春 花新碱，长春花碱，秋水仙素，二羟炭疽菌素dione，放线 菌素D，diptheria毒素，假单胞杆菌外毒素(PE)A，PE40， 相思豆毒蛋白和糖皮质激素及其它化疗剂，以及放射性同 位素。适当的可检测标记包括但非限于放射性同位素，荧 光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物，金属螯合 剂或酶。适当的放射性同位素包括以下物质：锑-124，锑 -125，砷-74，钡-103，钡-140，铍-7，铋-206，铋 -207，镉-109，镉-115m，钙-45，铈-139，铈-141， 铯-144，铯-137，铬-51，钴-56，钴-57，钴-58， 钴-60，钴-64，铒-169，铕-152，Gadolinium-153， 金-195，金-199，Hafnium-175，Hafnium-181，铟-11， 碘-123，碘-131，铱-192，铁-55，铁-59，氪-85， 铅-210，镁-54，汞-197，汞-203，钼-99，钕-147， 镎-237，镍-63，铌-95，锇-185+191，钯-103，铂 -195m，镨-143，钜-147，镤-233，镭-2226，铼-186， 铷-86，钌-103，钌-106，钪-44，钪-46，硒-75， 银-110m，银-11，钠-22，锶-85，锶-89，锶-90， 硫-35，Tantalum-182，锝-99m，碲-125，碲-132， 铊-170，铊-204，钍-228，钍-232，锡-113，钛-44， 钨-185，钒-48，钒-49，镱-169，钇-88，钇-90， 钇-91，锌-65和锆-95。
前列腺癌的免疫治疗
本发明提供了多种治疗前列腺癌的免疫治疗方法，包括 抗体疗法，体内接种，和源于体内免疫治疗方法。在一个 方法中，本发明提供了RG1抗体，其可以系统施用以治疗 前列腺癌。例如，可以将未缀合的RG1抗体导入患者体内， 这样抗体与前列腺癌细胞上，内或与之缔合的RG1结合， 并引起细胞和肿瘤的破坏，这是通过可包括以下机制引起 的：补体引起的细胞溶解，抗体依赖性细胞胞毒性，改变RG1 的生理功能，和/或抑制配体结合或信号转导途径。缀合于 毒性剂如蓖麻毒蛋白或放射性同位素的RG1抗体，也可以 治疗性用于将毒性剂定向送递于携带RG1的前列腺肿瘤细 胞，并从而破坏肿瘤细胞。
施用RG1抗体进行的前列腺癌免疫治疗，可以遵循已 经成功用于其它类型癌症的多种方法的教导，包括但非限 于结肠癌(Arlen等，Crit.Rev.Immunol.18：133-138，1998)， 多发性肌瘤(Ozaki等，血液90：3179-3186，1997；Tsunenari 等，血液90：2437-2444，1997)，胃癌(Kasprzyk等，癌 症研究52：2771-2776，1996)，白血病(Zhong等，白血 病研究20：581-589，1996)，结肠直肠癌(Moun等，癌 症研究54：6160-6166，1994；Velders等，癌症研究55： 4398-4403，1995)和乳腺癌(Shepard等，临床免疫学杂 志11：117-127，1991)。
本发明还提供了含有RG1多肽或其片段的疫苗。本领 域熟知在疫苗中使用肿瘤抗原以产生肿瘤或细胞介导的免 疫性，以用于抗肿瘤治疗中，而且已经使用人PSMA和啮 齿动物PAP免疫原用于前列腺癌中(Houdge等，癌症研究 杂志63：231-237，1995；Fong等，免疫学杂志159：3113-3117， 1997)。这种方法可通过应用RG1多肽，或其片段，或编码 RG1的核酸分子，和能表达和适当呈递RG1免疫原的重组 载体而易于实践。
例如，可以使用病毒基因输送系统以输送编码RG1的 核酸分子。根据本发明的此方面可以使用的各种病毒基因 输送系统包括但非限于牛痘，禽痘，金丝雀痘，腺病毒， 流感病毒，脊髓灰质炎病毒，腺伴随病毒，慢病毒和新培 斯病毒(Restifo，现代免疫学见解8：658-663，1996)。也可 以通过将编码RG1或其片段的裸DNA导入患者(即通过 肌内注射)中诱导抗肿瘤应答，而应用非病毒输送系统。 在-个实施方案中，可以应用全长的人rg1 cDNA。在另一 个实施方案中，可以应用人rg1 cDNA片段。在另一个实施 方案中，可以应用编码特异性T淋巴细胞(CTL)表位的rg1 核酸分子。CTL表位可以使用特异程序确定(例如Epimer， Brown大学)，以鉴别RG1多肽中能与特异的HLA等位基 因最佳结合的肽。
也可以使用各种源于体内的方案。一种方法包括使用树 突细胞，将RG1多肽作为抗原呈递给患者免疫系统。树突 细胞表达MHC的I和II型分子，B7共同刺激因子，和IL- 12，并因此特别专用于抗原呈递细胞。在前列腺癌中，将 用前列腺特异性膜抗原(PSMA)肽脉冲的自身树突细胞用 于I期临床试验中，以刺激前列腺癌患者的免疫系统(Tioa 等，前列腺28：65-69，1996；Murphy等，前列腺29：371-380， 1996)。可以使用树突细胞将RG1多肽呈递给MHC的I和 II型分子邻近的T细胞。在一个实施方案中，自身树突细 胞是用能结合MHC分子的RG1多肽脉冲的。在另一个实 施方案中，树突细胞是用完整的RG1多肽脉冲的。然而另 一个实施方案包括使用本领域已知的各种载体，对树突细 胞中rg1基因的过表达加以遗传工程化，所述载体例如是腺 病毒(Arthur等，癌症基因治疗4：17-25，1997)，逆转录病 毒(Henderson等，癌症研究56：3763-3770，1996)，慢病毒， 腺伴随病毒，DNA转染(Ribas等，癌症研究57：2865-2869， 1997)，和肿瘤衍生的RNA转染(Ashley等， J.Exp.Med.186：1177-1182，1997)。
抗独特型抗RG1抗体也可用于抗癌治疗中，作为疫苗 诱导对表达RG1多肽的细胞的免疫应答。特别是本领域熟 知产生抗独特型抗体的方法，并可方便地适于产生抗独特 型抗RG1抗体，其模拟RG1多肽上的一个表位(见例如 Wagner等，杂交瘤16：33-40，1997；Foon等，临床研究杂 志96：334-342，1995；Herlyn等，癌症免疫学免疫治疗 43：65-76，1996)。这种抗独特型抗体可以用于抗独特型治 疗中，与现有的直接抗肿瘤抗原的其它抗独特型抗体一样 使用。
遗传免疫接种方法可以用于产生对表达RG1的癌细胞 的预防性或治疗性激素和细胞免疫应答。使用本文所述的 编码RG1的DNA分子，可以将包含编码RG1多肽/免疫原 的DNA和适当调节序列的构建体，直接注射至个体的肌肉 或皮肤中，这样肌或皮肤的细胞吸收构建体并表达编码的 RG1多肽/免疫原。RG1多肽/免疫原可以表达为细胞表面多 肽或是分泌的。RG1多肽/免疫原的表达地址抗前列腺癌的 预防性或治疗性激素和细胞免疫应答产生。可以使用本领 域已知的各种预防性和治疗性遗传免疫接种方法(参见 www.genweb.com网站上公布的信息和参考资料)。
反义寡核苷酸，反义载体和核酶
互补于rg1的反义多核苷酸可以是合成制备的。这种寡 核苷酸可以用或不用脂质体输送至细胞中，脂质体可以有 助于反义寡核苷酸摄取入细胞中。
或者，可以使用衍生自逆转录病毒，腺病毒，疱疹病毒 或痘苗病毒，或各种细菌质粒的表达载体，构建和输送表 达反义rg1的重组载体。见例如Sambrook(如前)和Ausubel (如前)所述的方法。
包含全长cDNA序列和/或其调节因子的多核苷酸，使 研究人员可以使用rg1多核苷酸在有义链(Youssoufian和 Lodish，分子细胞生物学13：98-104，1993)或反义链(Eguchi 等，Annu.Rev.Biochem.60：613-652，1991)中作为研究工具 以调节基因功能。目前本领域熟知这种技术，而且有义或 反义寡聚物，或较大片段可以从沿着编码或控制区的各种 位置中设计。
编码RG1的基因可以通过用表达载体转染细胞或组织 而关闭，所述表达载体高水平表达所需的rg1多核苷酸片 段。这种构建体用不可翻译的有义或反义链充填细胞。即 使在没有整合入DNA的情况下，这种载体也可以持续转录 RNA分子，直至所有拷贝均由内源核酸酶破坏。瞬时表达 用一个非复制载体可以持续一个月或更长时间，而且如果 适当的复制因子是载体系统的一部分可以持续更长时间。
如上所述，对基因表达的修饰可以通过设计反义分子， DNA或RNA控制rg1的区域，即启动子，增强子和内含子。 优选衍生自转录起始位点的寡核苷酸，例如在引导序列-10 和+10区域之间的寡核苷酸。反义分子也可以设计为通过 阻止转录物结合核糖体而阻断mRNA的翻译。相似地，抑 制可以通过使用“三螺旋”碱基配对方法达到。三螺旋配 对包含双螺旋充分打开以结合聚合酶，转录因子或调节分 子的努力。新近的使用3螺旋DNA的治疗进展参见Gee，J.E. 等揭示(Huber和Car，分子和免疫学方法，Futura出版公 司，Mt.Kisco，N.Y.，1994)。
核酶是能催化RNA特异性裂解的酶性RNA分子(美 国专利No.4987071；WO93/23057)。核酶的作用机制包括 核酶分子与互补的靶RNA序列特异性杂交，随后内切核酸 酶性裂解。在本发明范围内的是遗传工程化的锤头基序核 酶分子，其能特异及有效地催化编码RG1的RNA内切核 酸酶性裂解。在任何潜在的RNA靶内的特异性核酶裂解位 点，最初是通过扫描靶分子的包括以下序列GUA，GUU和 GUC的核酶裂解位点而鉴别的。一旦鉴别，可以对相当于 含有靶基因裂解位点的区域的在15-20个核糖核苷酸之间 的短RNA序列，评价其使寡核苷酸不可操纵的二级结构特 点。候选靶分子是否适当也可以使用核糖核酸酶保护分析， 通过测试与互补寡核苷酸杂交的能力而加以评价(Irie等， 药物学进展40：207-257，1997)。
本发明的反义分子和核酶可以通过本领域已知的任何合 成RNA分子的方法制备。这些包括化学合成寡核苷酸方法， 如固相亚磷酰胺化学合成方法。或者，RNA分子可以通过 体外和体内转录产生，或通过编码RG1的DNA序列产生。 这种DNA序列可以掺入各种具有适当RNA聚合酶启动子 如T7或SP6的载体中。或者，可以将组成型或可诱导地合 成反义RNA的反义cDNA构建体导入细胞系，细胞或组织 中。
可以对RNA分子加以修饰以提高胞内稳定性和半衰 期。可能的修饰包括但非限于在该分子的5’和/或3’末端 添加侧翼序列，或在分子的骨架内使用硫代磷酸酯或2’O- 甲基而不是磷酸二酯酶键合。通过包含非常规的碱基如肌 苷和queosine以及乙酰基-，甲基一，硫代-及相似修饰 形式的腺嘌呤，胞苷，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，和尿嘧啶，也 可以提高稳定性，这些碱基一般不易被内源性内切核酸酶 识别。
将反义载体导入细胞或组织的方法包括前述的那些方 法，这些方法均等地适用于体内，体外和源于体内的治疗 中。就源于体内的治疗而言，是将反义载体导入取自患者 的细胞中并克隆繁殖，以自体移植入同一患者中，如在此 并入参考的美国专利No.5399493和5437994所述。本领域 熟知通过转染和通过基于脂质体或其它脂质或基于非脂质 的制剂进行输送的方法。
鉴别结合RG1的制剂的试验
本发明还涉及可以用于鉴别结合RG1的制剂的试验和 方法。特别地，鉴别结合RG1的制剂，可以通过RG1配体 或其它制剂或组分结合RG1的能力和/或抑制/刺激RG1活 性的能力进行。
或者，结合RG1多肽的制剂可以使用酵母双杂交系统 或结合捕获试验加以鉴别。在酵母双杂交系统中，将一个 编码融合蛋白的表达单位导入酵母细胞中并表达，所述融 合蛋白是由两个亚单位转录因子的一个亚单位和RG1多肽 组成。将此细胞进一步修饰以含有(1)一个编码可检测标 记的表达单位，所述标记的表达需要两个亚单位转录因子， 和(2)一个编码融合蛋白的表达单位，所述融合蛋白由转 录因子的另一个亚单位和克隆的DNA节段组成。如果克隆 的DNA节段编码一种结合RG1多肽的蛋白质，则表达导 致RG1和编码的蛋白之间的相互作用。这使转录因子的两 个亚单位密切结合，重组为转录因子。这使可检测标记表 达。酵母双杂交系统特别用于筛选cDNA文库，所述cDNA 编码RG1的细胞结合配体的节段。
可用于上述试验的RG1多肽包括但非限于一种分离的 RG1多肽，RGl多肽的片段，一个已经改变而表达RG1多 肽的细胞，或已经改变而表达RG1多肽的细胞的组分。另 外，RG1多肽可以是完整的多肽或是RG1多肽的指定片段。 本领域技术人员将意识到只要可以测定RG1多肽的结合 剂，例如通过改变分子量或活性进行测定，就可以使用本 试验。
用于鉴别一种制剂/细胞区室是否结合RG1多肽的方 法，主要基于使用的RG1多肽的性质。例如，可使用凝胶 阻滞试验测定一种制剂是否结合RG1或其片段。或者，可 采用免疫检测和生物芯片技术与RG1一起使用。技术人员 可方便地应用本领域熟知方法测定一种特殊制剂是否与 RG1多肽结合。
可以对制剂和细胞区室进一步测试其调节RG1活性的 能力，使用无细胞测定系统或细胞测定系统。由于RG1多 肽的活性是更加限定的，可以应用基于鉴别活性的功能测 定。
如本文所用，当制剂降低RG1活性时，称之为拮抗RG1 活性。优选的拮抗剂将选择性拮抗RG1，而不影响任何其 它细胞蛋白。另外，优选的拮抗剂将RG1活性降低50％以 上，更优选降低90％以上，最优选消除所用RG1活性。
在上述方法中测定的制剂可以上随机选择的或理性选择 或设计的。如本文所用，当制剂是随机的而不考虑RG1多 肽的特异性序列而选择的时候，将此制剂称为随机选择的。 随机选择的制剂例如是使用化学文库或肽组合文库，或有 机物或植物提取物的生长肉汤。
如本文所用，当制剂是在考虑靶位点的序列和/或其与 制剂功能相关的构象的非随机基础上选择的，则称此制剂 为理性选择或设计的。制剂可以利用由组成RG1多肽的肽 序列加以理性选择或理性设计。例如，一个理性选择的肽 制剂可以是这样的一种肽，其氨基酸序列等同于RG1多肽 的片段。
本发明方法中测试的制剂可以是例如肽，抗体，寡核苷 酸，小分子和维生素衍生物，以及碳水化合物。技术人员 可易于意识到对所述筛选方法中使用的制剂的结构性质没 有限制。本发明的一类的制剂是肽制剂，其氨基酸序列是 基于RG1多肽的氨基酸序列选择的。
肽制剂可以使用标准固相(或溶液相)肽合成方法制备 的，如本领域已知的方法。另外，编码这些肽的DNA可以 是使用可商购的寡核苷酸合成仪器合成的，及使用标准的 重组生产系统重组生产的。如果包括无基因编码的氨基酸， 使用固相肽合成生产是必要的。
本发明的另一类制剂是与RG1的关键位置免疫反应的 抗体。如上所述，抗体是通过用肽免疫接种适当的哺乳动 物对象而获得的，所述肽含有作为抗原性区域的抗体定向 的RG1多肽的那些部分。这种制剂可以用于竞争性结合研 究，以鉴别第二代抑制剂以及封阻RG1活性。
本发明方法中细胞提取物试验可以是例如细胞或组织的 水相提取物，细胞或组织或部分纯化的细胞组分的有机提 取物。技术人员可易于意识到对本发明的筛选方法中使用 的细胞提取物的来源没有限制。
结合RG1多肽的制剂，如RG1抗体，可以用于调节RG1 的活性，将抗癌剂定向于适当的哺乳动物细胞，或鉴别封 阻与RG1相互作用的制剂。表达RG1的细胞可以使用结合 RG1的制剂定向或鉴别。
RG1结合剂怎样使用依赖于RG1结合剂的性质。例如， RG1结合剂可以用于：将缀合的毒素，如白喉毒素，霍乱 毒素，蓖麻毒蛋白或假单胞杆菌外毒素，输送至RG1表达 细胞；调节RG1活性；直接杀死RG1表达细胞；或筛选鉴 别竞争性结合剂。例如，RG1抑制剂可以用于直接已知RG1 表达细胞的生长，而RG1结合剂可以用作诊断剂。
药物组合物及施用
本发明还涉及药物组合物，其可以包含rg1多核苷酸， RG1多肽，抗体，兴奋剂，拮抗剂，或抑制剂，单独或与 至少一种其它制剂如稳定化合物组合，其可以在任何无菌 的，生物相容的药物载体中施用，所述载体包括但非限于 盐水，缓冲盐水，葡萄糖和水。任何这些分子均可以单独 施用于患者，或与其它制剂，药物或激素组合在药物组合 物中施用，其中其与赋形剂或药物适当载体混合。在本发 明的一个实施方案中，药物适当的载体是药物学惰性的。
本发明还涉及药物组合物的施用。这种施用是经口服或 非肠道施用的。非肠道施用的方法包括局部施用，动脉内 (直接施用于肿瘤)，肌内，皮下，髓内，鞘内，心室内， 静脉内，腹膜内或鼻内施用。除了活性配料之外，这些药 物组合物可以含有适当的药物适当的载体，包括赋形剂和 辅助剂，其促进将活性化合物加工为可作为药物施用的制 品。关于配方和施用技术的进一步阐述见于最近版本的 Remington’s药物学(Ed.Maack出版公司，Easton，Pa.)。
口服施用的药物组合物，可以使用本领域熟知的药物适 当的载体，以适于口服的剂量配制。这种载体可以使药物 组合物配制为片剂，药丸，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶， 糖浆，悬浮液等，由患者摄取。
口服的药物制品可以通过将活性化合物与固体赋形剂组 合，随意地研磨为混合物，及如果需要，加入适当的辅助 剂之后，将此混合物加工为细粒以获得片剂或糖衣丸。适 当的赋形剂是碳水化合物或蛋白质充填剂如糖，包括乳糖， 蔗糖，甘露醇或山梨糖醇；来自谷物，小麦，水稻，马铃 薯或其它植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素，羟丙甲基纤 维素，或羧甲基纤维素钠；和树脂包括阿拉伯树胶和西黄 蓍胶；和蛋白质如明胶和胶原蛋白。如果需要，可以加入 分解剂或增溶剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，藻酸 或藻酸盐，如藻酸钠。
糖衣丸是用适当的包衣如浓缩的糖溶液包被的，其还可 以含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚羰乙烯凝 胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，紫胶漆溶液，和适当的有机 溶剂或溶剂混合物。可以在片剂或糖衣丸中加入染料或色 素，以鉴别产物或确定活性化合物的数量，即剂量。
可以口服的药物制品包括由明胶组成的推入契合的胶 囊，以及由明胶和包衣如甘露醇或山梨糖醇组成的柔软的 密封的胶囊。推入契合的胶囊可以含有活性配料，混合充 填剂或结合剂如乳糖或淀粉，润滑剂如滑石或硬脂酸镁， 及任选的稳定剂。在柔软的胶囊中，活性化合物可以溶解 或悬浮于适当的液体中，如脂肪油，液体石腊或液态聚乙 二醇中，有或没有稳定剂。
非肠道施用的药物配方包括活性化合物的水溶液。就注 射而言，本发明的药物组合物可以在水溶液中配制，优选 在生理适当的缓冲液如Hank’s溶液，Ringer’s溶液或生 理缓冲盐水中配制。水相注射悬浮液可含有提高悬浮液粘 度的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇或右旋糖苷。另 外，活性化合物的悬浮液可以制备为适当的油性注射悬浮 液。适当的脂质溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油，或合 成的脂肪酸酯，如乙基油酸酯或甘油三酯，或脂质体。任 选地，悬浮液还可以含有适当的稳定剂或提高化合物溶解 性的制剂，以可以制备高度浓缩的溶液。
就局部或鼻腔施用而言，在配方中使用可以透过特殊屏 障的适当渗透剂。这种渗透剂是本领域已知的。
试剂盒
本发明还涉及药物包装和试剂盒，其包含一或多个充填 了一或多种前述本发明组合物的配料的容器。所使用的容 器应参照负责药品或生物制品生产，应用或销售的政府部 门的建议，所提的建议必需被用于临床的生产，应用或销 售部门接受。另外，药物成分可以与其他有治疗作用的化 合物联合使用。
生产和贮存
本发明的药物组合物可以透过本领域已知的方式生产， 例如透过常规的混合，消散，成粒，包衣，研磨，乳化， 胶囊化，截留或冻干程序。
药物组合物可以以盐的形式提供，并可以用许多酸形 成，包括但非限于盐酸，硫酸，乙酸，乳酸，酒石酸，马 来酸，琥珀酸等。盐在水性或其它质子溶剂中往往是更可 溶的，相当于游离碱基形式。在其它情况中，优选的制品 可以是冻干的粉末，1mM-50mM组氨酸，0.1％-2％蔗糖， 2％-7％甘露醇，pH4.5-5.5，在使用之前用缓冲液将它们 组合。
在已经制备药物组合物之后，所述组合物包含在适当载 体中配制的本发明的化合物，将它们置于适当的容器中， 并标示，以在指定条件下处理。就施用RG1而言，这种标 示包括施用数量，频率和方法。
治疗有效量
适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中活 性配料是有效量的，以达到想要的目的，即特征在于通过 RG1表达治疗特殊的疾病。本领域技术人员熟知确定有效 量的方法。
就任何化合物而言，治疗有效量可以在细胞培养试验如 肿瘤形成细胞中，或在动物模型中初步评估，一般使用小 鼠，兔，狗或猪。动物模型还用于达到所需的浓度范围和 施用途径。这样的信息然后可以用于确定在人体内的有效 剂量和施用途径。
治疗有效量是指改善症状或状态的蛋白质或其抗体，拮 抗剂或抑制剂的数量。这种化合物的治疗效力和毒性可以 通过标准药物学程序在细胞培养物或试验动物中确定，例 如ED50(半数治疗有效量)和LD50(半数致死量)。治疗效 力和毒性之间的剂量比是治疗指数，并可以以ED50/LD50表 示。优选呈现高治疗指数的药物组合物。得自细胞培养试 验和动物研究的数据用于明确阐述用于人体的剂量范围。 这种化合物的剂量优选在流通浓度范围内，包括ED50及很 小的或没有毒性。根据应用的剂型，患者的敏感性及施用 途径，剂量可以在此范围内变化。
精确的剂量是根据治疗的患者的个体差异选择的。调节 剂量和施用方法以提供足够水平的活性组分，或保持所需 效力。需加以考虑的其它因素包括病情程度，例如肿瘤大 小和位置；患者的年龄，体重和性别；饮食，施用时间和 频率，药物组合，反应敏感性，和对治疗的耐受性/应答。 根据特殊配方的半衰期和清除率，长效药物组合物可以每3 -4天，每周，或每两周施用一次。
根据施用途径，标准剂量可以在0.1-100000ug之间变 化，最多总剂量为大约1g。文献中提供了关于特殊剂量和 施用方法的指导。见美国专利No.4657760；5206344；或 5225212。本领域技术人员针对多核苷酸可应用与针对蛋白 质或其抑制剂不同的配方。相似地，根据特殊的性别，条 件，位置等施用特异的多核苷酸或多肽。
本发明还通过以下实施例加以进一步详述。实施例只是 通过参考特异的实施方案例证了本发明。这些实施例例证 了本发明的某些方面，无限制本发明范围之意。
如果没有特别说明，所有的实施例均使用本领域熟知的 标准技术进行。以下实施例的常规分子生物学技术可以如 标准实验手册所述进行，如Sambrook等，分子克隆实验手 册，第2版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989。
实施例1：鉴别人rg1多核苷酸
rg1是作为在前列腺中表达的基因通过淘选Incyte’s LifeSeq数据库鉴别的。核苷酸序列是对数据库的注释研究， 使用Incyte为研究数据库而提供的“蛋白质功能”工具鉴 别的。核苷酸序列是在注释的数据库中的细胞粘着分子中 发现的，并阐述为同源的f-spondin。对数据库中一系列文 库中的rg1多核苷酸序列的分布进行的电子Northern分析表 明，rg1在前列腺文库中高水平表达，在其它许多组织文库 中以较低水平表达，包括正常的组织和肿瘤组织。
在将数据库中rg1克隆系列装配为连续的多核苷酸系 列，并对此连续的系列进行编辑后，在预定装配的多核苷 酸中鉴别一个全长的编码序列。这个序列编码与f-spondin 和Mindin-2同源的蛋白质。
Incyte克隆1640796，1712252和1880265得自Incyte， 以进行试验研究，克隆3360733经鉴别含有最多的5’核苷 酸序列。对这个克隆进行充分测序，含有推定的RG1蛋白 的全部编码序列。这个序列示于图1(SEQ ID NO：1)。
实施例2：rg1mRNA表达
对得自正常组织和肿瘤组织和细胞系的各种样品中rg1 mRNA的表达，使用Taqman分析(Perkin-Elmer)通过半 定量PCR测定。前列腺正常的，良性的和肿瘤组织样品得 自史丹佛医科大学泌尿系，所述样品已经根据修改的Gleason 分级系统分级。通过标准方法从这些样品中分离RNA。来 自其它肿瘤和正常组织的RNA是商购的，包括从Clontech 和Biochain商购的。前列腺肿瘤细胞系(PC-3，LNCaP和 DU145)得自美国典型培养物保藏中心，并通过标准方法使 用含有血清的培养基培养增殖。在裸鼠中建立来自这些细 胞系的异种移植的肿瘤，并在植入后大约4-6周，从这些 小鼠中收集肿瘤。通过标准方法从这些肿瘤中分离RNA。
进行基于Taqman的PCR分析，使用引物CGC GCA TAG CTC CGA CTA C(SEQ ID NO：3)和GCC GCG TCC GCA AAG(SEQ ID NO：4)，和Taqman探针：6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra(SEQ ID NO：5)。
这些引物和探针是用Perkin Elmer的引物表达软件设计 的，并通过合成遗传学合成。PCR反应进行30-40次循环， 并用前列腺RNA量化，以产生相对比的标准曲线。此分析 表明rg1 mRNA在前列腺中最高丰余检测，在一些其它组织 中明显水平较低(见图5)。
实施例3：在BHK细胞中克隆和表达RG1
RG1编码区得自Incyte质粒3360733。将此编码序列在 标准PCR反应中(100ul)，使用1×Pfu Turbo聚合酶缓冲 液(Stratagene，La Jolla，CA)/200uM dNTPs/0.2uM寡核苷 酸引物/2.5U Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，经PCR扩增， 使用引物SST115(5’-TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAA CCCCAGCCCGGC-3’)(SEQ ID NO：6)，和SST113 (5’-AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGAC G-3’)(SEQ ID NO：7)。PCR扩增条件如下：95℃3分 钟，(在95℃15秒，在60℃30秒，在72℃2分钟) ×35次，72℃7分钟。将所得PCR扩增产物用QIAquick PCR层析柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化，并用XbaI和 Pmall限制酶纯化，产生一个1010bp的片段，其是用BIO 101 GeneClean试剂盒(Vista，CA)从1％琼脂糖凝胶中纯化的。 将此纯化的片段连接于(使用Epicientre快速连接试剂盒 (Epicenter，Madison，WI))用XbaI和Pmall消化的非致 细胞病变的Sindbis表达载体pSINrep21(Agapov等，1998， PNAS95：12989-12994)中，并转化入DH5α感受态细胞中 (Life Technologies，Gaithersburg，CA)，及在含有氨苄青 霉素(100ug/ml)的LB琼脂平板上选择。将一个这种氨苄 青霉素抗性集落生长于含有氨苄青霉素的LB培养基中，通 过序列分析示出其含有插入的RG1编码序列。这个质粒称 为pPEG6。
使用Lipofectamine Plus试剂(Life Technologies， Gaithersburg，MD)，根据产生导致指导，将2ug的PEG6 用于转染1-3×105个牛仓鼠肾(BHK)细胞。在转染后， 将细胞在加上胎牛血清的DMEM中温育24-48小时，此 时细胞从1分裂为10，通过加入嘌呤霉素(终浓度为 2.5ug/ml)和含有血清的DMEM，开始选择含有质粒的细胞。 在细胞铺满后(加入嘌呤霉素4-5天后)，将细胞用PBS 冲洗，，分裂1-10，加入具有血清的DMEM和5ug/ml嘌 呤霉素。在另外2-3天后，将培养基用没有血清的DMEM 和5ug/ml嘌呤霉素置换，生长2-3天后，使用RG1抗体 通过Western分析检测培养基中RG1蛋白的存在情况。检 测的RG1蛋白的水平为1ug/ml。
实施例4：抗体产生
兔多克隆抗血清是对抗衍生自RG1蛋白序列的5种合 成的多肽序列而产生的。选择这些序列是因为推定其位于 蛋白质表面，以产生更易于识别表面表位的抗血清。将半 胱氨酸残基用氨基丁酸(Abu)置换以助于合成。所述5种 多肽的特异氨基酸序列，在RG1蛋白上的位置，和名称如 下所示。
名称 位置 氨基酸序列
C 28-46 PLGGESICSAGAPAKYSIT(SEQ ID NO：8)
2C 46-64 TFTGKWSQTAFPKQYPLFR(SEQ ID NO：9)
3C 77-91 HSSDYSMWRKNQYVS(SEQ ID NO：10)
4C 188-210 DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(SEQ ID NO：11)
5C 263-274 NEIVDSASVPET(SEQ ID NO：12)
将肽与匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)通过另外的羧基端半胱 氨酸常规偶联，以用作免疫原。相似地，制备牛血清白蛋 白(BSA)缀合物以通过ELISA分析抗血清滴定。
将两种动物用每种肽免疫接种。初始的免疫接种是在 Freunds完全佐剂中(0.5mg肽/动物)进行的，随后间隔3 周肌内注射Freunds不完全佐剂中以0.25mg肽/动物攻击。 定期取从实验动物中取血液，通过ELISA测定抗特异性 BSA-肽缀合物的抗体滴定，并与免疫前血清对比。抗1C和 3C肽的抗血清示出是活性的。抗2C肽的抗血清不识别RG1 多肽。抗4C和5C肽的抗血清未测试。
抗RG1的人单克隆抗体是通过免疫接种抗RG1肽和在 大肠杆菌中表达的6-组氨酸标记的RG1融合蛋白的转基因 小鼠产生的。将这些动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以 产生杂交瘤细胞。将所得杂交瘤通过ELISA筛选产生直接 抗RG1多肽和蛋白的抗体的那些杂交瘤。
实施例5：对抗体进行Western印迹分析
通过Western印迹测试抗血清的RG1特异性。RG1特 异性抗血清(上述抗1C和3C序列产生的那些)进行测试 在COS细胞中RG1瞬时表达，从LNCaP细胞中分泌天然 RG1和从转染的幼仓鼠肾细胞(BHK)中产生的RG1情况。 RG1-抗血清还进一步测试制备自以下物质的裂解物：LNCaP 肿瘤，LNCaP细胞，PC3肿瘤，PC3细胞和人前列腺肿瘤 的一些临床样品。将细胞和组织在去污剂缓冲液中裂解。 在沸腾5分钟后，将10ul的每种裂解物加样于12％SDS-聚 丙烯酰胺凝胶上以解离蛋白质。然后将分离的蛋白质移至 硝基纤维素膜上。RG1抗体的结合特异性通过在存在同源 和异源肽的情况下的结合加以验证。RG1特异性抗血清可 以检测除了PC-3细胞和PC-3肿瘤之外的所有样品中的蛋 白质。
实施例6：纯化分泌自LNCaP细胞的天然RG1蛋白
生长于培养物中的LNCaP细胞通过Western印迹分析 示出分泌天然RG1蛋白。为纯化此天然的蛋白质，将细胞 在没有血清的培养基中生长48小时。收集此没有血清的条 件培养基，离心以除去所有细胞，并通过超滤浓缩将近50 倍。然后将浓缩的培养基用20mM乙酸钠(pH6.5)缓冲液 稀释10倍，加样于Q-琼脂糖阴离子交换层析柱上。层析柱 洗脱由NaCl梯度(每分钟5％)组成，同时收集2.0ml级 分。将在大约75mM NaCl洗脱的RG1蛋白质通过Western 印迹和SDS PAGE测定。天然RG1蛋白在略低于在细菌中 表达的6组氨酸-RG1融合蛋白的分子量泳动，推测上因为 其没有融合蛋白。
实施例7：对RG1表达进行免疫组织化学染色
RG1蛋白的表达是由LifeSpan生物科学公司在多种人 体组织中测定的，包括肾，肺，胰腺，肌，脑和前列腺。 另外的前列腺组织得自史丹佛大学泌尿系，并由Berlex测 试。将组织切片用标准方法脱蜡。将多克隆抗体RGl-3C用 作初级抗体，检测系统由载体ABC-AP试剂盒(AK5002) 和载体红色底物试剂盒(Sk5002)组成。作为阴性对照， 在没有初级抗体的情况下进行染色。
在上述说明书中提及的所有出版物和专利在此均并入参 考。本发明结合特异的实施方案已经进行阐述，但本领域 技术人员应意识到在不偏离本发明精神和范围的条件下可 以对本发明加以修改和用等价物代替。另外，对本发明可 进行许多修改以适应特殊情况，材料，组合物，加工，加 工步骤等。所有这些修改应包含在所附权利要求范围内。
本申请要求1999年12月16日提请的美国临时专利申 请No.60/172370的优先权，该申请在此并入参考。
有这样的迹象即前列腺癌是以多级疾病发生的，一种先 期损害是前列腺上皮内瘤形成(PIN)。这种疾病早期是雄 激素依赖性的，而后期是非激素依赖性的。临床经常检测 到一种已知是良性前列腺增生的增殖性前列腺疾病，但也 许不是癌症发生的一个时期。然而，其通常与前列腺癌相 关。前列腺的癌症通常是多病灶的，一般是缓慢生长的， 及是异质的。晚期癌症通常转移至淋巴结和骨。
前列腺癌通常是通过物理检查和通过前列腺特异性抗原 (PSA)的血清水平加以诊断的。前列腺根除术是治疗局部疾 病的一种选择。进展的转移疾病目前是通过睾丸切除术导致 的雄激素消融，或用GnRH(促性腺激素释放激素)处理，及 通过抗雄激素疗法进行治疗的。然而，进展性疾病几乎总是 成为对激素有抗性，而且不能治愈进行性疾病。另外，基本 前列腺切除术和雄激素消融疗法均具有严重的副作用。包括 与前列腺根除术相关的尿失禁和阳痿，与雄激素消融疗法相 关的骨折和骨质疏松症。
因此，需要一种新的治疗早期和晚期前列腺癌的方法。 还明显需要新的诊断制剂，尤其能区别疾病进程的制剂，因 为这能明显影响治疗方案。例如，如果疾病已经进展超过了 前列腺并已经转移至淋巴结，就不能进行前列腺根除术，因 为这对进展已经没有作用，但却具有明显不期望的副作用。 可以检测体内转移的制剂具有重要意义。
已经证明在前列腺癌中特异性蛋白表达发生变化，包括 在晚期前列腺癌中p53表达异常，TGF-β受体水平降低，E- 钙粘着蛋白，C-Cam(一种细胞粘着分子)，和一些整联蛋白 水平降低。在晚期雄激素非依赖性肿瘤中，癌基因bcl-2的表 达明显提高，而且bcl-2高水平表达的患者预后相对不好。前 面提及的基因表达中的变化是经充分论证的；表达中无变化 已经鉴别，这已经证明是致病原因。因此，这可用于鉴别新 的蛋白质，其表达与前列腺肿瘤的存在和发生相关，可以用 作诊断和治疗前列腺癌的分子标记。
本发明揭示了胞外基质蛋白的超家族的一种新的同源 物。这种称为RG1的同源物是在前列腺组织中表达的，并可 以在前列腺肿瘤中过表达。
胞外基质是胶原蛋白和弹性蛋白的复合网眼，包埋于由 蛋白聚糖和糖蛋白组成的粘弹性基质中。基质存在一个三 维支架，分离组织区室，介导细胞吸附和确定组织结构(Bissel 等，生物治疗杂志99：31-68，1982；Carlson等，美国科学 院院报78：2403-2406，1981)。基质发挥大分子滤膜的作用 (Hay，E.D.，胞外基质的细胞生物学，纽约，Plenum出版 社，1982)，并还影响细胞分化，细胞有丝分裂和形态发生 (Gospodarowiczs，D.癌症研究38：4155-171，1978)。正常 细胞和基质之间的生物化学作用可以在瘤形成中改变，这 可以影响肿瘤增殖。肿瘤细胞可以不同方式与基质相互作 用。首先，肿瘤细胞可以通过特异性血浆膜受体附着于基 质(Terranova等，癌症研究42：2265-2269，1982)。其次， 基质的降解是通过由肿瘤细胞和宿主提供的酶级联介导的 (Eisen等，生物化学生物生理学学报151：637-645，1968)。 再者，在肿瘤的分化区域内，肿瘤细胞可以合成并积累基 质，或诱导宿主细胞积累过量的基质(Brownstein等，癌症 40：2979-2986，1977)。
RG1示出与由Mindin/F-spondin基因编码的胞外基质蛋 白的超家族同源。此基因家族由在氨基末端附近的两个保 守的spondin结构域FS1和FS2，和在羧基末端的至少一个 血小板spondin 1型重复(TSR1)联合的(Shimeld，S.M.， Mol.Bio.Evol.15(9)：1218-1223，1998)。TSR基序最初是在脊 椎动物胞外基质蛋白中发现的(Bornstein，P.，细胞生物学 杂志130：503-506，1995)，并接着在一些其它胞外基质蛋白 中也已经发现。有一些迹象表明TSR’s介导细胞粘附，并 在肿瘤发生中起关键作用。例如，已经证实TSR’s中包含 的血小板spondin的蛋白酶解片段，及具有相当于血小板 spondin的TSR区域的序列的合成肽，促进肿瘤细胞附着和 转移(Prater等，细胞生物学杂志112：1031-1040，1991； Tuszynski和Nicosia，BioEssays18：71-76，1996)，具有抗血 管生成活性(Tolsma等，细胞生物学杂志122：497-511， 1993)，并抑制血小板聚集和黑素瘤转移(Tuszynski等，细 胞生物学杂志116：209-217，1992)。
目前这个超家族的成员包括Caenorhabditis elegans中 的一个具有，Drosophila中的一个单一基因和脊椎动物中的 多个基因。在C.elegans中，基因F10E7.4编码除了FS1和 FS2结构域之外的5个TSR’s(Higashijiima等，生物学进 展192：211-227，1997)。在Drosopnila中，称为M-spondin (mspo)的家族成员含有FS1和FS2结构域和一个单一的 TSR(Umemiya等，生物学进展186：165-176，1997)。M- spondin基因编码一种分泌的蛋白，其位于肌附着位点并似 乎具有胞外基质蛋白的功能，支持肌一内突附着。脊椎动 物中的家族成员包括分离自zebrafish(Mindin 1和Mindin 2， F-spondin 1和F-spondin2)，大鼠F-spondin，Xenopus F- spondin和大鼠Mindin的基因。Mindin 1和Mindin 2彼此 密切相关，并具有类似于Drosophila M-spondin的基因结构。 Mindin 1和Mindin2基因均编码除了FS1和FS2之外的一 个单一TSR(Higashijima等，生物学进展192：211-227， 1997)。Zebrafish F-spondin和F-spondin2，大鼠F-spondin (Klar等，细胞69：95-110，1992)和Xenopus F-spondin(Altaba 等，美国科学院院报90：8268-8272)基因均具有相似结构， 编码除了FS1和FS2结构域之外的6个拷贝的TSR。在脊 椎动物中，Mindin/F-spondin超家族可以分为两类：与原始 的大鼠F-spondin和Mindin基因密切相关那些基因，和与 Drosophila M-spondin基因密切相关的那些基因。脊椎动物 的Mindin和F-spondin基因均编码蛋白质，所述蛋白质最 初是在胚胎发育期间由神经管的底板表达的。
近来从文昌鱼中已经分离了一个单一的F-spondin相关 的基因，AmphiF-spondin(Shimeld，S.M.， Mol.Biol.Evol.15(9)：1218-1223，1998)。基于分子系统发生， AmphiF-spondin是编码6个TSR’s的脊椎动物F-spondin 基因的特殊亚组密切相关的。AmphiF-spondin编码3个 TSR’s和两个纤连蛋白III型重复，其中一个与来自结肠癌 缺失(DCC)的纤连蛋白III型重复非常相同。这个蛋白质 的表达在大多数中枢神经系统中发现，并非限于所述脊椎 动物Mindin和F-spondin蛋白的中线。
这些数据提示胞外基质蛋白如新的RG1蛋白，是用于 癌症诊断和治疗的良好候选物，这种新的RG1蛋白是 Mindin/F-spondin超家族的同源物。
发明概要
本发明提供了一种多核苷酸序列，其特异地编码称为 RG1的一种新蛋白质。RG1多肽示出与大鼠Mindin胞外基 质蛋白同源。其含有在N末端的一个疏水性序列，在C末 端的两个spondin结构域(FS1和FS2)，和血小板spondin 1 型重复。RG1与大鼠Mindin有89.7％的相似性。在此称为 rg1并如图1所示的多核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，编码图 2所示的RG1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
本发明的一方面提供了多肽，其已经修饰为与胞外基质 蛋白的Mindin家族同源的新的蛋白质，同源性是通过将图 2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和其它胞外基质蛋白已 知氨基酸序列进行对比示出的。
本发明的另一方面提供了编码这种多肽的多核苷酸，尤 其编码在此称为RG1的多肽的多核苷酸。
根据本发明的一方面，提供了编码RG1的分离的多核 苷酸，包括mRNAs，cDNAs，及在本发明的另外的实施方 案中提供了它们的有生物学，诊断，临床或治疗用途的变 体，类似物或衍生物，或其片段，包括变体，类似物和衍 生物的片段。
本发明这个方面的实施方案中尤为优选的是多核苷酸的 天然发生的等位基因，其编码称为RG1的多肽的变体。
根据本发明的这个方面，提供了人源的称为RG1的新 多肽，以及其有生物学，诊断或治疗用途的片段，变体和 衍生物，前述片段和类似物的变体和衍生物。
本发明这个方面的实施方案中尤为优选的是由rg1多核 苷酸的天然发生的等位基因变体编码的RG1的变体。
本发明的另一方面提供了一种产生前述多肽，多肽片 段，变体和衍生物，前述变体和衍生物和类似物的片段的 方法。在本发明的一个优选的实施方案中，提供了产生前 述RG1多肽的方法，包括在宿主中表达人RG1的条件下， 培养可表达掺入其中的外源性编码RG1的多核苷酸的宿主 细胞，然后回收表达的多肽。
本发明的另一方面提供了利用前述多肽和多核苷酸，进 行生物学，临床和治疗研究的产物，组合物，程序和方法。
根据本发明此方面的一些优选实施方案中，提供了通过 测定RG1多肽或编码RG1的mRNA评估细胞中RG1表达 的产物，组合物和方法；及分析rg1基因中遗传变异和畸变 如缺陷的产物，组合物和方法。
根据本发明的这个及其它方面的一些优选实施方案中， 提供了与rg1序列杂交的探针。
本发明的另一方面提供了对RG1多肽或其片段具有高 度选择性的抗体，其可用于诊断和/或检测RG1表达的方法 中，RG1表达与前列腺癌相关。在根据本发明此方面的一 些优选实施方案中，抗体是标记的，由此产生可检测的信 号。尤为优选的是用放射标记，酶，生色团或荧光素标记 的抗体。
本发明的另一方面提供了与治疗剂缀合的抗体，以施用 于在体外的细胞，源于体内的细胞和体内细胞，或多细胞 机体。尤为优选的是胞毒性治疗剂。在一些优选的实施方 案中，将这种缀合的抗体施用于病人，以治疗特征在于RG1 活性或表达的疾病，如前列腺癌。
本发明的另一方面提供了可用于刺激免疫应答的肽和抗 独特型抗体。
本发明的另一方面提供了核酶和互补于rg1多核苷酸和 多核苷酸(即反义多核苷酸)，以施用于在体外的细胞，源 于体内的细胞和体内细胞，或多细胞机体。尤为优选的是 将此反义分子施用于病人，以治疗如前列腺癌或早期前列 腺增生等疾病，通过降低RG1活性水平而减轻症状。
本领域技术人员通过以下详细论述可以理解本发明的其 它方面，特点，优点和目的。然而应知道以下阐述和特异 的实施例，及所述的优选实施方案，只是举例说明本发明。 通过阅读以下论述和本发明的其它部分，本领域技术人员 在本发明精神和所示范围内，可以对本发明加以各种变化 和修改。
附图简述
图1：编码生物活性或免疫活性形式RG1的rg1的多核 苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2：RG1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，单 下划线处为F-spondin结构域，双下划线处为血小板spondin 结构域。
图3：RG1与大鼠Mindin序列的氨基酸序列对比。RG1 序列在上部。
图4：RG1的多核苷酸和推导的氨基酸序列。
图5：通过基于Taqman的PCR分析rg1 mRNA在人体 组织中表达。来自人体肿瘤和正常组织的RNA是通过标准 方法分离的。检测rg1 mRNA表达的引物和探针是用Perkin Elmer’s引物表达软件设计的，并通过合成遗传学合成。 在人前列腺组织中检测Rg1 mRNA。在其它组织中可以检 测到较低水平表达的rg1 mRNA，例如在肝脏中。
图6：纯化由LNCaP细胞分泌的天然RG1蛋白。使用 抗合成的RG1肽序列(3C，SEQ ID NO：10；见实施例4) 产生的抗血清进行Western印迹分析，以检测LNCaP细胞 分泌的天然RG1蛋白。浓缩的LNCaP细胞条件培养基的Q- 琼脂糖凝胶层析的洗脱级分：(L)层析柱充填物，(F)层 析柱流量，(1-12)经过盐梯度的洗脱级分。预测的RG1分 子量为大约36kD，然而观测到细菌表达的RG1，BHK表达 的RG1和LNCaP表达的RG1在PAGE上均在大约45kD 迁移(L，级分6-9)。
图7：在人体前列腺组织中RG1表达的免疫组织化学 染色。前列腺组织得自Stanford大学医学院的泌尿系。用载 体ABC-AP试剂盒(AK5002)进行染色。用载体红色底物 试剂盒(SK-5100)观测染色，并用苏木精对染。结果示出 在腺体结构中外周网眼膜明显染色。
发明详述
词解
本发明的说明书，实施例和所附权利要求中所使用的术 语，除非特别说明均具有以下含义。
“RG1”是指具有图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2) 的多肽；其变体，类似物，衍生物和片段，及变体，类似 物和衍生物的片段。术语“片段”，“衍生物”和“类似物” 当是指图2的多肽(SEQ ID NO：2)时，是指基本保留与图 2的多肽(SEQ ID NO：2)相同的生物和/或免疫学活性的多 肽。
“rg1”是指具有图1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列 的多核苷酸，和编码具有图2(SEQ IN NO：2)所示RG1的 氨基酸序列的多肽的多核苷酸；及指编码RG1变体，类似 物，衍生物和片段，和变体，类似物和衍生物的片段的多 核苷酸。Rg1还指由RNA组成的这种多核苷酸，以及是编 码图2(SEQ ID NO：2)所示多肽序列的多核苷酸的补体的多 核苷酸。
“多核苷酸”一般是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖 核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或 DNA。因此，例如本发明使用的多核苷酸是指单链和双链 DNA，单链和双链区混合的DNA，单链和双链的RNA，和 单链和双链区混合的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子， 其可以是单链的，或更典型是双链的或单链和双链区的混 合物。另外，本发明使用的多核苷酸是指包含RNA或DNA 或RNA和DNA的三链区域。这种区域中的链可以来自相 同分子或来自不同分子。这个区域可以包括所有一或多个 分子，但更典型地只包含一些分子的一个区域。三螺旋区 域的分子之一通常是寡核苷酸。
本发明所用术语“多核苷酸”包括含有一或多个修饰的 碱基的上述DNAs或RNAs。因此，“多核苷酸”在此是指 由于稳定性或其它原因骨架经修饰的DNAs或RNAs。另外， 本发明多核苷酸也指包含不同寻常的碱基如肌苷，或修饰 的碱基如氚标记的碱基的DNAs或RNAs，所述碱基只是举 例而非全部。
应意识到本领域技术人员可以根据多种使用目的，对 DNA和RNA加以多种修饰。本发明所用术语“多核苷酸” 包含这种经化学，酶学或代谢修饰形式的多核苷酸，以及 病毒和细胞特有的化学形式的DNA和RNA，所述细胞包 括简单和复杂的细胞。
本发明所用的“多肽”包括以下所述的所有多肽。多肽 的结构已经熟知，并可见于本领域无数的教材和其它出版 物所述。文中此术语是指任何肽或蛋白质，其包含在一个 线性链中通过肽键彼此连接的两或多个氨基酸。如本发明 所使用，此术语指本领域通常也例如称为肽，寡肽和寡聚 物的短链，及指本领域通常称为蛋白质的较长的链，其中 它们具有许多类型。
应意识到多肽通常含有除了通常称为天然发生的20个 氨基酸之外的氨基酸，而且许多氨基酸包括末端氨基酸在 给定的多肽中可以是修饰的，通过自然程序如糖基化和其 它翻译后修饰，或通过本领域熟知的化学修饰方法进行修 饰。甚至多肽中天然发生的常见修饰也太多，以至于在此 不能一一列举，但在基本的教材和更详细的专论以及长篇 研究文献中有充分阐述，而且这些内容为本领域技术人员 所熟知。在已知的修饰中，可以存在于本发明多肽中的是 乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价附着， 血红素部分共价附着，多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价 附着，脂质或脂质衍生物的共价附着，phosphotidylinositol 的共价附着，交联，环化，二硫键形成，脱甲基化，共价 交联形成，胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化， 糖化，糖基化，GP1锚形成，羟基化，碘化，甲基化，十 四烷酰化，氧化，蛋白酶解，磷酸化，异戊二烯化，外消 旋化，硒化，硫酸化，将氨基酸通过转移RNA介导加入蛋 白质如精氨酰化，和遍在蛋白化。
这些修饰是本领域技术人员熟知的，并见于科学文献中 的详细阐述。一些特别普通的修饰例如糖基化，脂质附着， 硫酸化，谷氨酸刺激的γ-羧化，羟基化，和ADP-核糖基化 在最基本的教材中加以论述，如I.E.Creighton，蛋白质结构 和分子学性质，第二版，W.H.Freeman和Company，纽约， 1993。关于这方面的一些详细论述例如见于Wold，F.，蛋 白质的翻译后共价修饰，B.C.Johnson编辑，科学出版社， 纽约，pp1-12，1983；Seifter等，酶学方法182：626-646，1990， 和Rattan等，蛋白质分析：翻译后修饰和老化， Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992。
如所熟知的及如上所述，应意识到多肽并不总是完全线 性的。例如多肽可以是由于遍在化结果而分支的，及可以 有或无分支的环形，通常是由于翻译后的结果，包括天然 形成的和不是天然发生的人为操纵所致。环形的，分支的 和分支环形的多肽，可以是通过非翻译天然程序及通过完 全合成方法合成的。
修饰可以在多肽中的任何部位发生，包括肽骨架，氨基 酸侧链和氨基或羧基末端。事实上，通过共价修饰封阻多 肽中的氨基团或羧基团或这二者，在天然发生的和合成的 多肽中是常见的，，而且这种修饰可以存在于本发明的多肽 中。例如，在蛋白酶解之前在大肠杆菌中产生的多肽的氨 基末端残基，几乎总是N-甲酰甲硫氨酸。
多肽中发生的修饰通常是其产生方式的作用。例如，通 过在宿主中表达克隆的基因产生的多肽，修饰的性质和程 度大部分是通过宿主细胞翻译后修饰的能力和多肽氨基酸 序列中存在的修饰信号确定的。例如熟知的糖基化通常不 在细菌宿主如大肠杆菌中发生。因此，当需要糖基化时， 多肽应在糖基化宿主中表达，一般为真核细胞。昆虫细胞 通常完成与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化，为此已经 产生了昆虫细胞表达系统，以有效表达具有天然糖基化模 式的哺乳动物蛋白质。对其它修饰也需要考虑相似的问题。
应意识到相同类型修饰在给定的多肽中的一些位点可以 相同或不同程度存在。同样，给定的多肽可以含有许多类 型的修饰。
如本文使用，术语多核苷酸涵盖了所有这种修饰，尤其 在通过在宿主细胞中表达多核苷酸而合成的多肽中存在的 那些修饰。
本文所用的术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖了这样的 多核苷酸，其包括编码本发明多肽，尤其具有图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的RG1多肽的序列。该术语涵盖了这 样的多核苷酸，其包括一个编码多肽的连续区域或不连续 区域(例如由内含子中断)，及附加的区域。
“生物学活性”是指天然发生的RG1多肽的结构性， 调节性或生物化学功能。
“免疫学活性”是指天然的，重组的或合成的RG1或 其片段，在适当的动物或细胞中诱导特异性免疫应答，及 与特异性抗体结合的能力。
“寡核苷酸”是指相对短的多核苷酸。该术语通常是指 单链的脱氧核糖核苷酸，但也可以指单链或双链的核糖核 苷酸，RNA:DNA杂交体和双链的DNAs。寡核苷酸，如单 链的DNA探针寡核苷酸，通常是通过化学方法合成，如在 自动寡核苷酸合成仪上合成。然而，可以通过各种其它方 法产生寡核苷酸，包括体外重组DNA方法和通过在细胞和 有机体中表达DNA的方法。“寡核苷酸”或“寡聚物”或 多核苷酸“片段”，“部分”或“节段”是指具有至少大约10 个核苷酸，及多如大约60个核苷酸，优选大约15-30个 核苷酸，更优选大约20-25个核苷酸的多核苷酸序列。
“天然发生的RG1”是指由未进行遗传工程化的人体 细胞产生的RG1，特别是期望是产生自多肽翻译后修饰的 各种RG1形式，所述修饰包括但非限于乙酰化，羧基化， 糖基化，磷酸化，脂质化，酰化和裂解。
多核苷酸或多肽的“变体”是指分别与参比多核苷酸或 多肽不同的多核苷酸或多肽。这种含义的变体如以下和在 本发明揭示的其它章节所述。
(1)与另一个参比多核苷酸的多核苷酸序列不同的多核 苷酸。通常不同之处是限定的，以便参比的多核苷酸序列 和变体是非常相似的，并在许多区域是相同的。
如下所述，变体的多核苷酸序列中的变化可以是沉默 的。即它们可以不改变由多核苷酸编码的氨基酸。在改变 是限于这种类型的沉默改变之处，变体将编码与参比序列 具有相同氨基酸序列的多肽。如下所述，变体的多核苷酸 序列中的变化可以改变由参比多核苷酸编码的多肽的氨基 酸序列。这种多核苷酸变化可以使由参比序列编码的多肽 中产生氨基酸取代，添加，缺失，融合和截短，如下所述。
(2)与另外的参比多肽氨基酸序列不同的多肽。通常不 同之处是限定的，以便参比多肽和变体的序列是非常相似 的，并在许多区域是相同的。变体和参比多肽的氨基酸序 列可以由于一或多个取代，添加，缺失，融合和截短而不 同，它们可以以任何组合存在。编码这些相同或相似多肽 的重组变体可以是合成的，或通过利用“遗传密码”丰余 性而选择的。可以进行各种密码子取代如产生各种限制位 点的沉默变化，以最佳化克隆入质粒或病毒载体中或在特 殊的原核或真核系统中表达。也可以进行诱变以修饰多肽 的性质，改变配体结合亲和性，链间亲和性，或多肽降解 或周转率。
“等位基因变体”是指rg1多核苷酸的另一种形式。等 位基因得自突变即多核苷酸序列发生变化，并通常产生其 结构或功能可以或不改变的变化的mRNAs或多肽。任何给 定的基因可以没有，或有一或多种等位基因形式。产生等 位基因的突变一般是由于核苷酸的天然缺失，添加或取代 产生的。这些类型的变化均可以单独或组合发生，或在给 定的序列中发生一或多次。
“衍生物”是指分别衍生自天然发生的rg1或RG1的 多核苷酸或多肽，通过在人体蛋白内不正常发生的化学修 饰如遍在化，标记(例如用放射性核素，各种酶促修饰标 记)，pegylation(用聚乙二醇衍生)，或通过氨基酸如鸟氨 酸插入或取代(或取代编码这种氨基酸的核苷酸)而衍生。
“缺失”是指多核苷酸或氨基酸序列中分别缺少一或多 个多核苷酸或氨基酸残基的变化。
“插入”或“添加”是指多核苷酸或氨基酸序列中的变 化，与天然发生的多核苷酸或氨基酸序列相比，分别添加 了一或多个多核苷酸或氨基酸残基。
“取代”是指分别用不同的多核苷酸或氨基酸置换一或 多个多核苷酸或氨基酸。
优选地，氨基酸取代是将一个氨基酸用具有相似结构和 /或化学性质的另一种氨基酸置换，如用异亮氨酸或缬氨酸 置换亮氨酸，用谷氨酸置换天冬氨酸，或用丝氨酸置换苏 氨酸，即保守氨基酸置换。插入或缺失典型地在大约1-5 个氨基酸范围内。可以通过在多肽中用重组DNA方法系统 地产生氨基酸插入，缺失或取代，并分析所得重组变体的 活性，对发生的变化加以实验性测定。
“片段”是指一种多肽，其氨基酸序列与前述RG1多 肽及其变体或衍生物的氨基酸序列部分而非全部相同。
多肽的“片段”“部分”或“节段”是指至少大约5个 氨基酸，通常至少大约7个氨基酸，典型地至少大约9-13 个氨基酸，及在各种实施方案中至少大约17或更多个氨基 酸的一段氨基酸序列。
“重组体”或“重组的DNA分子”是指不是天然发生 的，或是通过人为组合序列的两个其它分离的节段而产生 的多核苷酸序列。“重组产生的”是指通常通过化学合成方 法，或通过人为操纵分离的多核苷酸节段，例如通过基因 工程技术所达到的人为组合。这种操纵通常是将一个密码 子用编码相同或保守氨基酸的丰余密码子置换，同时典型 地导入或除去一个序列识别位点。或者，与具有所需功能 的多核苷酸节段连接在一起，以产生一个遗传本体，其包 含在通常的天然形式中未发现的所需功能组合。限制酶识 别位点，调节序列，控制序列，或其它有益的特点可以通 过设计掺入其中。“重组的DNA分子”包括克隆和表达载 体。“重组体”还可以指编码多肽的多核苷酸，是用重组DNA 技术制备的。
“分离的”是指“通过人为”从其天然环境中改变，即 如果是天然发生的，将其从原始环境中改变或分离。例如， 以其天然状态天然存在于生活动物中的天然发生的多核苷 酸或多肽，不是“分离的”，但从其天然状态的共存物中分 离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。例如，关于多核苷 酸，术语分离是指从在其中其天然发生的染色体和细胞中 分离的。
多核苷酸和多肽可以存在于组合物中，如将多核苷酸或 多肽例如导入细胞中的培养基配方或溶液中，及存在于进 行化学或酶促反应的组合物或溶液中，例如其不是天然发 生的组合物，其中保留本文所用的此术语含义范围内的分 离的多核苷酸或多肽。
“基本纯化”和“基本同源”是交替用于阐述RG1多 肽，或其片段，或编码其的多核苷酸节段，其中这种多肽 或多核苷酸分离自天然涵盖其的组分中。当从涵盖其天然 状态的天然污染物中分离时，RG1多肽或其片段，或编码 其的DNA节段是基本没有天然相关的组分。因此，化学合 成的或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多 肽，基本没有其天然相关的组分。
“同源”这一术语当用于阐述多核苷酸时，是指两个多 核苷酸或其指定的序列，当进行最佳序列对比时具有适当 的核苷酸插入或缺失，至少70％核苷酸，通常为大约75％ -99％，优选至少大约98-99％的核苷酸是相同的。
“相似性”这一术语当用于阐述多肽时，是通过将一个 多肽的氨基酸序列和保守的氨基酸取代与另一个多肽的序 列进行对比而测定的。
“聚合酶链反应”或“PCR”是指一种方法，其中如1987 年7月28日发布的美国专利No.4683195所述扩增特异的 DNA。通常地，需要获得相应的或远处多肽片段末端的序 列信息，这样可以设计寡核苷酸引物；这些引物指向一定 方向，并与扩增模板的相反链的序列相同或相似。两种引 物的5’末端核苷酸与扩增物的末端一致。PCR可用于扩增 来自总基因组DNA的特异的DNA序列，转录自总细胞RNA 的cDNA，质粒序列等(见Mullis等，冷泉港 Symp.Quant.Biol.，51：263，1987；Erlich编辑，PCR技术， Stockton出版社，NY，1989)。
“严格性”典型是指在大约Tm(解链温度)-5℃(低 于探针Tm5℃)至大约20-25℃Tm范围内。正如本领域 技术人员所意识到，严格杂交可用于鉴别或检测相同的多 核苷酸序列，或鉴别或检测相似的或相关的多核苷酸序列。 本文所用术语“严格条件”是指杂交只在序列之间存在至 少95％优选至少97％相同性的情况下发生。
本文所用术语“杂交”应包括“将多核苷酸链与其互补 链通过碱基配对连接的任何方法”(Coombs，J.，生物技术 词典，Stockton出版社，纽约，N.Y.，1994)。
“治疗有效量“是指减轻疾病症状或状况的多肽或其抗 体，拮抗剂，或抑制剂，包括反义分子和核酶的数量。这 种化合物的治疗效力和毒性，可以在细胞培养物或实验动 物中通过标准药学方法确定，例如ED50(半数治疗有效量) 和LD50(半数致死量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比 是治疗指数，并可以ED50/LD50表示。
“治疗”是指治疗患者所患疾病，这种疾病与前列腺肿 瘤生长相关，并包括这样的疾病，其中需要降低患者的RG1 水平。
发明详述
本发明涉及新的RG1多肽，rg1多核苷酸，和直接抗RG1 多肽的抗体及其它物质，如以下更详细的论述。本发明尤 其涉及新的RG1多肽和编码这些RG1多肽的多核苷酸，并 特别涉及具有图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的RG1， 和具有图1(SEQ ID NO：1)所示多核苷酸序列的rg1。本发明 还涵盖了RG1变体。一种优选的RG1变体与图2(SEQ ID NO：2)所示多肽序列有至少70％相似性(优选至少70％相同 性)，优选具有至少90％相似性(优选至少90％相同性)， 更优选具有至少95％相似性(优选至少95％相同性)，并也 包括这种多肽的一部分，多肽的这部分一般含有至少30个 氨基酸及优选至少50个氨基酸。
预测的RG1多肽的编码序列起自图1(SEQ ID NO：1) 所示核苷酸序列的5’末端的296个碱基对。RG1含有胞外 基质蛋白的Mindin/F-spondin超家族的3个特征结构域：两 个spondin结构域(FS1和FS2)，分别包含31-103和138 -221位氨基酸，和一个血小板spondin结构域，包含278 -330位氨基酸。
本发明部分基于图3所示的RG1和大鼠Mindin之间的 结构同源性，大鼠Mindin是胞外基质蛋白家族的另一个成 员。RG1的氨基酸序列与大鼠Mindin具有接近89.7％的相 似性。
本发明还部分基于RG1的表达分布图，通过其在前列 腺组织文库中表达及在前列腺肿瘤文库中过表达证实。通 过基于PCR的Taqman分析，在来自正常和肿瘤组织的组 织样品中分析mRNA表达，可以见到这种组织分布图。这 种分析方法表明编码RG1的mRNA与其它组织相比，在前 列腺组织中是过表达的。
多核苷酸
根据本发明的一方面，提供了编码RG1多肽的分离的 多核苷酸，所述多肽具有图2(SEQ ID NO：2)所示推导的氨 基酸序列。
使用所提供的信息，如图1(SEQ ID NO：1)所示的多 核苷酸序列，本发明编码RG1多肽的多核苷酸可以使用标 准克隆和筛选方法获得，如使用来自人体组织细胞的mRNA 作为起始物克隆cDNA的那些方法。本发明举例说明了图 1(SEQ ID NO：1)所示多核苷酸序列是在得自人体前列腺组织 的cDNA克隆中发现的。通过mining lncyte’s LifeSeq数据 库，鉴别rg1是在前列腺组织中表达的基因。核苷酸序列是 使用lncyte为研究数据库而提供的“蛋白质功能”工具，通 过对数据库进行解读研究而鉴别的。核苷酸序列是在解读 的数据库中细胞粘着分子类别中发现的，并描述为是f- spondin的同源物。对rg1多核苷酸序列在数据库的一系列 文库中的分布进行的电子Northern分析表明，rg1在前列腺 组织中高水平表达，在一些其它组织文库中以较低水平表 达。
在将数据库中rg1克隆系列装配成连续的多核苷酸序 列，并对连续的序列进行编辑后，在预装配的多核苷酸中 鉴别全长编码序列。这个编码蛋白质的序列预大鼠mindin 同源。
Lncyte克隆1640796，1712252和1880265得自lncyte 以进行实验研究，克隆3360733经鉴别含有大多数5’核苷 酸序列。这个克隆是经过充分测序的，并含有预测的RG1 蛋白的全部编码序列。这个序列适于图1(SEQ ID NO：1)。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式如mRNA，或DNA 形式，例如包括cDNA和基因组DNA，通过克隆获得或通 过化学合成方法或通过组合方法或本发明所述方法产生。 DNA可以是双链或单链的。单链的DNA可以是编码链(也 称为有义链)，或者可以是非编码链(也称为反义链)。
编码多肽的序列可以与图1(SEQ ID NO：1)所示多核 苷酸的编码序列相同。其也可以是由于遗传密码的丰余(简 并)而具有不同序列的编码图2(SEQ ID NO：2)的多核苷酸。
本发明编码图2(SEQ ID NO：2)所示多肽的的多核苷酸， 可以包括但非限于多肽自身的编码序列；多肽的编码序列， 及另外的非编码序列，包括例如但非限于内含子和非编码 5’和3’序列，如在转录，mRNA加工(例如剪接和聚腺 苷酸化信号)起作用的转录的，未翻译序列，或编码如提 供其它功能的其它氨基酸的另外的编码序列。因此，多肽 例如可以融合于标记序列，如易于纯化融合多肽的肽。在 本发明的一些优选的实施方案中，标记序列是一种6-组氨 酸肽，如pTrcHisB载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供 的标签，其中许多是可以商购的。如Gentz等(美国科学院 院报86：821-824，1989)所述，6-组氨酸可以常规纯化融合 蛋白。
多核苷酸可以编码一种多肽，这种多肽是加上另外的氨 基或羧基末端氨基酸，或多肽内部的氨基酸(例如当活性 形式具有一个以上多肽链时)的多肽。这种序列可以在将 多肽从前体加工为最终形式中起作用，可以易于多肽运输， 可以延长或缩短多肽半衰期，或可以易于操纵多肽进行分 析或产生等等。由于一般是在原位的情况下，另外的氨基 酸可以通过蛋白酶从多肽中除去。
本发明还涉及所述多核苷酸的变体，其编码具有图 2(SEQ ID NO：2)所示推导的氨基酸序列的多肽的配对，类似 物和衍生物。多核苷酸的变体可以是天然发生的变体如天 然发生的等位基因变体，或者可以是未知是天然发生的变 体。多核苷酸的这种非天然发生的变体可以通过诱变方法 产生，包括用于多核苷酸，细胞或有机体的那些方法。
变体中在这点上是由于多核苷酸取代，缺失或添加而不 同于前述多核苷酸的变体。取代，缺失或添加可以包含一 或多个多核苷酸。变体可以是在编码区或非编码区或二者 中改变的。编码区中的变化可以产生保守的或非保守的氨 基酸取代，缺失或添加。
在本发明特别优选的实施方案中，在这点上是编码具有 图2(SEQ ID NO：2)所示RG1的氨基酸序列的多肽的多核苷 酸；其变体，类似物，衍生物和片段，及变体，类似物和 衍生物的片段。
特别优选的是编码RG1变体，类似物，衍生物和片段， 及片段的变体，类似物和衍生物的多核苷酸，其具有图2(SEQ ID NO：2)所示RG1多肽的氨基酸序列，其中一些，少量， 5-10，1-5，1-3，2，1个或没有氨基酸残基是任何组合的取 代，缺失或添加的。尤为优选的是不改变RG1多肽的性质 和活性的沉默取代，添加和缺失。同样尤为优选的是保守 取代。最优选的是编码具有图2(SEQ ID NO：2)所示没有取 代的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
本发明另外优选的实施方案是这样的多核苷酸，其与编 码具有图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的的RG1多肽的 多核苷酸具有至少70％相同性，及与这种多核苷酸互补的 多核苷酸。或者，最优选的是包含与编码RG1多肽的多核 苷酸有至少80％相同性的区域的多核苷酸，及其互补多核 苷酸。在这点上，尤为优选的是具有至少90％相同性的多 核苷酸，特别优选的是具有至少95％相同性的多核苷酸。 另外，更为优选的是具有至少97％，98％和99％相同性的 多核苷酸。
此外，特别优选的是编码基本保留与图1(SEQ ID NO：1)所示多核苷酸序列编码的多肽相同生物活性的多肽 的多核苷酸。
本发明还涉及与上述序列杂交的多核苷酸。在这点上， 本发明特别涉及在严格杂交条件下，与上述多核苷酸杂交 的多核苷酸。
如关于本发明多核苷酸的其它分析所揭示，例如上述的 本发明多核苷酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探 针，以分离编码RG1的全长cDNAs和基因组克隆，及分离 与rg1基因具有高度序列相似性的其它基因的cDNA和基因 组克隆。这种探针通常包含至少15个碱基。优选地，这种 探针具有至少30个碱基，并可以具有至少50个碱基。
例如，可以使用合成的寡核苷酸探针筛选文库分离rg1 基因的编码区，所述探针是用已知DNA序列设计的。例如， 具有与本发明多核苷酸的序列互补的序列的标记的寡核苷 酸，可以用于筛选cDNA或基因组DNA的文库，以鉴别与 探针杂交的克隆。
总而言之，本发明的多核苷酸可以编码一种多肽，一种 加上引导序列的多肽(可以称为前多肽)。
应意识到本发明还涉及编码多肽片段的多核苷酸，与编 码多肽片段的多核苷酸杂交尤其在严格条件下杂交的多核 苷酸，及多核苷酸如PCR引物，以扩增编码多肽片段的多 核苷酸。优选的是相当于优选的多肽片段的那些多核苷酸， 如下述。
多肽
本发明还涉及具有图2(SEQ ID NO：2)所示推导的氨基 酸序列的RG1多肽。
本发明还涉及这些多肽的片段，类似物和衍生物。术语 片段，衍生物和类似物当指图2(SEQ ID NO：2)所示多肽时， 是指基本保留与这种多肽相同生物活性的多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成的多 肽。在一些一些的实施方案中，是重组的多肽。
图2(SEQ ID NO：2)所示多肽的片段，衍生物或类似物 可以是(i)其中一或多个氨基酸残基用保守或非保守的氨 基酸残基取代(一些保守的氨基酸残基)，而且这种取代的 氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的，或(ii)其中 一或多个氨基酸残基包括一个取代基，或(iii)其中多肽与 另一种化合物融合，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚 乙二醇)，或(iv)其中另外的氨基酸与多肽融合，如引导 序列或分泌序列或用于纯化多肽的序列。通过本文教导， 认为这种片段，衍生物和类似物在本领域技术范围内。
在这点上本发明特别一些的实施方案是具有图2(SEQ ID NO：2)所示RG1的氨基酸序列的多肽，其变体，类似物， 衍生物和片段，及片段的变体，类似物和衍生物。
优选的变体是由于保守氨基酸取代而不同于参照物的那 些变体。这种取代是用另一种相似特性的氨基酸取代多肽 中给定的氨基酸。典型可见的保守取代是脂肪族氨基酸 Ala，Val，Leu，和Ile的彼此置换，羟基Ser和Thr的互换， 酸性Asp和Glu的交换，酰胺基Asn和Gln之间的取代， 碱性Lys和Arg的交换及芳香族Phe和Tyr之间的置换。
在这点上尤为优选的是具有图2(SEQ ID NO：2)所示RG1 多肽的氨基酸序列的变体，类似物，衍生物和片段，及片 段的变体，类似物和衍生物，其中一些，少量，5-10，1-5， 1-3，2，1个氨基酸残基或没有氨基酸残基是任何组合的取 代，缺失或添加的。尤为优选的是不改变RG1多肽性质和 活性的沉默取代，添加和缺失。同样尤为优选的是保守取 代。最优选的是具有图2(SEQ ID NO：2)所示没有取代的氨 基酸序列的多肽。
本发明的多肽和多核苷酸优选是以分离形式提供的，优 选纯化至同质性。
本发明的多肽还包括图2(SEQ ID NO：2)所示多肽，以 及与图2(SEQ ID NO：2)所示多肽具有至少70％相似性(优 选70％相同性)，优选具有至少90％相似性(优选90％相同 性)，更优选具有至少95％相似性(优选95％相同性)的多 肽，并还包括这种多肽的一部分，多肽的这部分一般含有 至少30个氨基酸，优选至少50个氨基酸。
如本领域已知两个多肽之间的“相似性”，是将一个多 肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代与另一个多肽的序 列相对比而测定的。
通过肽合成方法，本发明多肽的片段或一部分可以用于 产生相应的全长多肽；因此，片段可以用作产生全长多肽 的中间物。
片段
本发明在这个方面优选的实施方案是这样的多肽，其包 含RG1的片段，尤其图2(SEQ ID NO：2)所示RG1的片段， 及图2(SEQ ID NO：2)所示RG1的变体和衍生物的片段。
在这点上，片段是具有一种氨基酸序列的多肽，所述氨 基酸序列与前述RG1多肽及其变体或衍生物的氨基酸序列 部分而非全部相同。
在这点上，片段是一种多肽，其具有的氨基酸序列与 前述RG1多肽及其变体或衍生物的氨基酸序列部分而非全 部相同。
这种片段可以是“无标准”的，即不是其它氨基酸或 多肽的一部分或与其融合，或者可以包含于较大的多肽中， 形成较大多肽的一部分或一个区域。当包含于较大的多肽 中时，所述片段优选形成一个连续的区域。然而，一些片 段可以包含于一个较大的多肽中。例如，一些优选的实施 方案涉及包含于一种前体多肽中的本发明RG1多肽的一个 片段，所述前体多肽是设计的以在宿主中表达，并具有融 合于RG1片段氨基末端的异源的前多肽和多肽原区域，及 融合于此片段羧基末端的另外的一个区域。因此，所述片 段是指衍生自RG1的融合多肽或融合蛋白的一部分。
本发明多肽片段的代表性实施例可以具有大约25-331 个氨基酸。
文中“大约”是指在一个末端或两个末端具有比所述 范围多或少一些，少量，5，4，3，2，和1个氨基酸。例 如，文中大约331个氨基酸是指一种多肽片段，其具有25 个加上或减去一些，少量，5，4，3，2，和1个氨基酸至331 个氨基酸加上或减去一些，少量5，4，3，2，和1个氨基 酸残基，即在大如25个减去一些氨基酸至331个加上一些 氨基酸的范围，及小如25个加上一些氨基酸至331个减去 一些氨基酸的范围内。
在这方面优选的是在一或两个末端在所述范围内加上 或减去如5个氨基酸。尤为优选的是在一或两个末端在所 述范围内加上或减去如3个氨基酸。更优选的是在一或两 个末端在所述范围内加上或减去如1个氨基酸，或不添加 或缺失氨基酸。最优选的是大约25-331个氨基酸的片段。
本发明优选的片段是RG1的截短的突变体。RG1的截 短突变体包括图2(SEQ ID NO：2)所示序列的变体或衍生 物，除了缺失一个连续系列的残基(即一个连续区域，部 分或一部分)，包括图2(SEQ ID NO：2)所示序列的氨基末 端，或者一个连续系列的残基，包括羧基端残基，或在双 截短体中是缺失两个连续系列的残基，一个包括氨基端， 一个包括羧基端。优选的截短片段是具有上述大小的片段。
尤为优选的是具有RG1生物学和/或免疫学活性的片 段。这种片段包括那些含有RG1预知结构性结构域的片段， 其涵盖了至少31-103，138-221和278-330个氨基酸的 片段，或那些用于产生抗体的片段，如实施例4所述。
在这方面一些优选的区域示于图2(SEQ ID NO：2)，并 包括但非限于通过分析图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序 列鉴别的上述类型的区域。
在这方面尤为优选的是那些包含RG1区域的片段，所 述区域组合了一些如上述的结构特点。尤为优选的是两个 spondin和一个thrombospondin区域，它们分别含有大约31 -103，138-221和278-330个氨基酸，具有胞外基质蛋 白的Mindin/spondin超家族的特点。这种区域可以包含在较 大的多肽内，或者其自身就是本发明优选的片段。应意识 到文中术语“大约”一般是指关于上述片段所作的解释。
另外优选的区域是那些介导RG1活性的区域。最优选 的是具有RG1的化学，生物学或其它活性的片段，包括那 些具有相似或改良活性，或具有降低的非所需活性的片段。 在这方面特别优选的是这样的片段，其含有的区域在序列， 位置或序列和位置是同源的，以激活相关多肽的区域，如 Mindin家族的其它蛋白质，包括RG1。
载体，宿主细胞和表达系统
本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体，用本发明 载体遗传工程化的宿主细胞，和通过重组方法产生本发明 多肽。这种方法见于Sambrook等，分子克隆实验手册，冷 泉港实验室出版社，Plainview，N.Y.，1989和Ausubel，F.M. 等，分子生物学通用方法，John Wiley&Sons，纽约，N.Y.， 1989。
可以对宿主细胞进行遗传工程化，以掺入多核苷酸并 表达本发明的多核苷酸。例如，可以通过熟知的感染，转 导，转染，转介和转化方法，将多核苷酸导入宿主细胞中。 可以将多核苷酸单独或与其它多核苷酸一起导入。这种其 它的多核苷酸可以单独导入，与本发明的多核苷酸一起导 入，或与本发明的多核苷酸结合导入。
因此，例如可以使用标准的在哺乳动物中进行共同转 染和选择的方法，将本发明的多核苷酸转染入具有另一种 单独的编码可选择标记的多核苷酸中。在这种情况中，多 核苷酸通常是稳定地掺入宿主细胞基因组中。
或者，多核苷酸可以与含有可选择标记的载体结合以 在宿主中增殖。可以通过前述方法将载体构建体导入宿主 细胞中。通常地，质粒载体在沉淀物如磷酸钙沉淀，或在 与荷电脂质的复合物中作为DNA导入。也可以使用电穿孔 方法将多核苷酸导入宿主。如果载体是病毒，可以在体外 将其包装或导入包装细胞中，包装的病毒可以转导入细胞 中。本领域技术人员熟知许多适于产生多核苷酸和将多核 苷酸导入细胞的方法。这种方法参见上述Sambrook等所述， 这只是详细阐述这些方法的许多实验手册中的一个实例。 根据本发明的这个方面，载体例如可以是质粒载体，单链 或双链的噬菌体载体，单链或双链的RNA或DNA病毒载 体。通过熟知的将DNA或RNA导入细胞中的方法，可以 将这种载体作为多核苷酸优选DNA导入细胞中。在噬菌体 和病毒载体的情况下，通过熟知的感染和转导的方法也可 以并优选将载体作为包装的或衣壳化病毒导入细胞中。病 毒载体可以有复制能力或复制缺陷的。在后一情况中，病 毒增殖通常只在互补的宿主细胞中发生。
优选的载体是那些表达本发明多核苷酸和多肽的载 体。这种载体通常包含可操纵地连于被表达的多核苷酸的 顺式作用控制区，以在宿主中有效地表达。适当的反式作 用因子是由宿主，互补载体提供的，或由导入宿主的载体 自身提供的。
在这方面的一些优选的实施方案中，载体提供特异性 表达。这种特异性表达可以是可诱导表达或只在特定类型 的细胞中表达，或者是可诱导和细胞特异性的。特别优选 的可诱导载体是可以诱导的以通过环境因子表达的载体， 所述环境因子是易于操纵的如温度和营养添加剂。本领域 技术人员熟知适于本发明这方面的一些载体，包括用于原 核细胞和真核细胞宿主的组成型和可诱导表达载体，并可 以常规应用。
遗传工程化的宿主细胞可以在常规营养培养基中培 养，所述培养基可以适当修饰，例如激活启动子，选择转 化体或扩增基因。本领域技术人员意识到预先选择的用于 宿主细胞以进行表达的培养条件如温度，pH等，应适于表 达本发明的多肽。
可以使用许多表达载体表达本发明的多肽。这种载体 包括染色体型，附加型和病毒衍生的载体，例如衍生自细 菌质粒，噬菌体，酵母染色体因子，病毒如杆状病毒，乳 多空病毒，如SV40，痘苗病毒，腺病毒，牛痘病毒， pseudorabies病毒，逆转录病毒和甲病毒属如Sindbis病毒， 和衍生自上述组合的载体，如那些衍生自质粒和噬菌体遗 传因子如粘粒和噬菌粒的载体，所有这些载体根据本发明 均可用于进行表达。通常地，任何适于保持，增殖或表达 多核苷酸以在宿主中表达多肽的载体均可以用于表达。
通过任何熟知和常规的方法，均可以将适当的DNA序 列掺入载体中。通常将表达的DNA序列与表达载体连接是 通过用一或多种限制性内切酶切割DNA序列和表达载体， 然后用T4DNA连接酶将限制性片段连接而进行的。本领 域技术人员熟知并可以常规使用进行限制和连接的方法。 在这方面和使用另一种方法构建表达载体的的适当方法也 为本领域技术人员所熟知，并详见于Sambrook等所述。
表达载体中的DNA序列可操纵地连于适当的表达控制 序列，包括例如指导mRNA转录的启动子，这种启动子代 表性包括噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac，trp，tac和trc 启动子，SV40早期和晚期启动子及逆转录病毒LTRs等， 这里只列举了熟知的启动子的一少部分。应意识到适用于 本发明这个方面的许多未提及的启动子也是本领域技术人 员熟知的，并可以通过所例举的方式应用。
通常地，表达构建体含有转录起始和终止位点，并在 转录区域含有进行翻译的核糖体结合位点。由构建体表达 转录物的编码部分，在起始处包括一个翻译起始AUG，终 止密码子几乎位于翻译的多肽的末端。
另外，构建体可以含有调节以及增强表达的控制区域。 通常地，根据许多目前通用的方法，这种区域可以通过控 制转录操纵，如阻抑物结合位点和增强子等。
进行增殖和表达的载体一般包括可选择标记。这种标 记也可以是适于扩增的，或者载体可以含有另外的标记。 在这方面，表达载体优选含有一或多个可选择标记基因， 以提供表型性状选择转化的宿主细胞。优选的标记对真核 细胞培养物而言，包括二氢叶酸还原酶，新霉素，嘌呤霉 素或潮霉素抗性基因，对大肠杆菌和其它细菌培养物而言， 包括四环素，theomycin，卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。
含有适当所述DNA序列以及适当启动子，及其它适当 控制序列的载体，可以使用熟知的适于表达所需多肽的方 法导入适当的宿主中。适当的宿主代表性例如包括细菌细 胞，如大肠杆菌细胞，链霉菌细胞和鼠伤寒杆菌细胞；真 菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9细 胞；动物细胞如CHO，COS和Bowes黑素瘤细胞；和植物 细胞优选昆虫细胞BT1-TN-5B1-4。本领域技术人员熟知大 量表达构建体的宿主，并可以根据本发明的揭示选择表达 本发明多肽的宿主。
可以使用各种哺乳动物细胞培养系统进行表达。哺乳 动物表达系统例如包括猴肾成纤维细胞COS-7系(Gluzman 等，细胞23：175，1991)。其它能表达可相容载体的细胞系 例如包括C127，3T3，CHO，HeLa，人肾293和BHK细胞 系。在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表 达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况中，编码RG1的 多核苷酸序列可以连接入腺病毒转录/翻译复合物中，所述 复合物由晚期启动子和三联前导序列组成。在病毒基因组 的一个非必需E1或E3区域中插入，产生一个能在感染的 宿主细胞中表达RG1的活性病毒(Logan和Shenk，美国科 学院院报81：3655-59，1984)。另外，转录增强子如Rous肉 瘤病毒(RSV)增强子，可以用于提高在哺乳动物宿主细胞 中的表达。
更特别地，本发明还包括重组的构建体，如表达构建 体，其包含上述一或多个序列。此构建体包含一个载体， 如质粒或病毒载体，其中已经插入本发明的序列。序列可 以正向或反向插入。在这方面的一些优选的实施方案中， 构建体还包含调节序列，例如包括可操纵地与序列连接的 启动子。本领域技术人员已知大量适当的载体和启动子， 而且有许多可商购的载体适用于本发明。
以下举例提及了一些可商购的载体。优选在细菌中使 用的载体是购自美国Qiagen公司的pQE7O，pQE6O和 pQE-9；购自Stratagene公司(LaJolla，CA)的pBS载体， Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A，Pnh16a， pNH18A，pNH46A；和购自Pharmacia Biotech公司 (Piscataway，N.J.)的ptrca，pK223-3，pKK233-3，Pdr54O， pRIT5。最优选的是购自Invitrogen的pTrcHisB载体。优选 的真核细胞载体是购自Stratagene的pWLNEO，pSV2CAT， Pog44，PXTI和pSG；和购自Pharmacia Biotech PSVK3， pBPV，pMSG和pSVL。最优选的是购自Promega的pClneo 载体。这些载体只是例举了许多可商购载体的一少部分， 而且是本领域技术人员熟知的可用于本发明的载体。应意 识到根据本发明可以使用适于例如在宿主中导入，维持， 增殖或表达本发明多核苷酸或多肽的任何其它质粒或载 体。
启动子区域可以使用载体选自任何所需的基因，所述 载体含有一个缺失启动子区域的报道转录单位，如氯霉素 乙酰转移酶(cat)转录单位，下游的导入候选启动子片段 的限制位点；即可包含一个启动子的片段。正如所熟知的， 在cat基因上游的限制位点将含有启动子的片段导入载体中 可以激活CAT，这可以通过标准的CAT分析检测。两个这 种载体是pKK232-B和pCM7。因此，表达本发明多核苷酸 的启动子不仅包括熟知的和易于获得的启动子，还包括通 过上述方法使用报道基因易于获得的那些启动子。
已知的适于表达本发明多核苷酸和多肽的细菌启动子 是大肠杆菌lac1和lacZ启动子，T3和T7启动子，T5tac 启动子，λPR，PL启动子，trp启动子和衍生自trp和lac启 动子的trc杂合启动子。已知的适于这方面的真核启动子是 CMV立即早期启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期 SV40启动子，逆转录病毒LTRs启动子，如Rous肉瘤病毒 (RSV)启动子和金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-1 启动子。
在宿主细胞中表达的适当载体和启动子的选择是本领 域技术人员所熟知的，而且表达载体的构建，将载体导入 宿主中并在宿主中表达的必需方法也是本领域技术人员所 常规使用的。
通常地，重组载体包括复制起点，一个衍生自高度表 达的基因的启动子，以指导下游结构序列转录，和一个可 选择的标记，以在暴露于载体后分离含有载体的细胞。
本发明还涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞 可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞 如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。 宿主细胞中的构建体可以以常规方式使用，以产生由重组 序列编码的基因产物。
多肽可以在适当启动子控制下，在哺乳动物细胞，酵 母，细菌或其它细胞中表达。没有细胞的翻译系统也可用 于产生这种蛋白质，通过使用衍生自本发明的DNA构建体 的RNAs进行。用于原核和真核细胞宿主的适当克隆和表 达载体如Sambrook等所述。
通过高等真核细胞转录编码本发明多肽的DNA，可以 通过将一个增强子序列插入载体中而增强。增强子是DNA 的顺式作用因子，通常大约10-300个bp，在给定类型的 宿主细胞中提高启动子的转录活性。增强子例如包括SV40 启动子，其位于在100-270bp的复制起点的后侧，巨细胞 病毒早期启动子增强子，位于复制起点后侧的多形瘤增强 子，和腺病毒增强子。
使用标准方法，将编码本发明的异源结构序列的本发 明的多核苷酸插入载体中，使其可操纵地连于启动子以进 行表达。多核苷酸是定位的，以使转录起始位点接近位于5’ 端至核糖体结合位点。核糖体结合位点在5’端至AUG之 间，启动表达的多肽翻译。通常地，在起始密码子通常为AUG 起始处，及核糖体结合位点与起始AUG之间没有其它的开 放读框。同样，在多肽的末端有一个翻译终止密码子，而 且有一个聚腺苷酸化信号，和接近在转录区3’末端的一个 转录终止信号。
为将翻译的蛋白质分泌入内质网腔，壁膜间隙或胞外 环境中，可以将适当的分泌信号掺入表达的多肽中。这个 信号可以是多肽内源性的，或者可以是异源信号。多肽可 以以修饰的形式表达，如以融合蛋白的形式，而且不仅可 以包括分泌信号，也可以包括其它的异源功能区。因此， 例可以在多肽的N末端加入如一个另外氨基酸区域尤其荷 电的氨基酸，以在纯化期间或在随后的运用和贮存期间改 良在宿主细胞中的稳定性和持续性。同样，也可以在多肽 中加入特殊的区域以易于纯化。这种区域在最后制备多肽 之前可以除去。在多肽中加入肽部分以产生分泌或排泄， 改良稳定性或易于纯化等方法是本领域技术人员熟知并常 规使用的。例如，当需要将大量的RG1导入抗体中时，需 要直接高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体。这种载体 包括但非限于多功能的大肠杆菌克隆和表达载体，如 Bluescript(Stratagene)，其中rg1编码序列可以在框架中 以氨基端Met和随后的7个β-半乳糖苷酶残基的序列连接 于载体中，以便产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heede和 Shuster，生物化学杂志264：5503-5509，1989)等。PtrcHis 载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)可以用于表达外源多肽 作为含有多组氨酸(6×His)标记的融合蛋白以迅速纯化。 在这种系统中产生的蛋白质设计为包括切割位点如肠激酶 裂解位点，以便相应的克隆的多肽可以从融合肽组分中随 意释放。
在转化适当的宿主菌株及宿主菌株生长至适当的细胞 密度后，可诱导启动子如果存在则可以通过适当的方法(例 如温度变换或暴露于化学诱导剂)诱导，并将细胞另外培 养一段时间。
然后通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破坏， 将所得粗提物保留以进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞，可以通过任何常规方 法破坏，包括冷冻-融化循环，超声，机械破坏，或使用细 胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员所熟知的。
RG1多肽可以通过熟知的方法从重组细胞培养物中回 收和纯化，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸性提取， 阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层 析，亲和层析，羟磷灰石层析和凝集素层析。优选使用高 效液相层析(HPLC)进行纯化。当多肽在分离和或纯化期 间变性时，可以应用熟知的重折叠蛋白质的方法以再生活 性的构象。本领域熟知的各种纯化蛋白质的其它方法包括 那些Deutscher，M.，酶学方法，第182卷，科学出版社， San Diego，1982；和Scopes，R.，蛋白质纯化原理和实践， Springer-Verlag，纽约，1982。
或者，本发明的多肽可以使用固相方法通过直接合成 肽而产生(Stewart等，固相肽合成，W.H.Freeman Co.，San Francisco，1969；Merrifield，J.，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154， 1963)。可以使用人工或自动方法进行体外蛋白质合成。自 动合成例如可以通过使用Applied Biosystems 431A肽合成 仪(Perkin Elmer，Foster City，Calf)，根据生产者的指导 进行。RG1的各种片段可以是单独或组合使用化学方法化 学合成的，以产生全长的分子。
本发明的多肽包括自然纯化的产物，化学合成的产物， 及通过重组方法从真核或原核宿主中产生的产物，所述宿 主例如包括细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞。 依赖于重组产生方法中的宿主，本发明的多肽可以是糖基 化的或可以是非糖基化的。另外，本发明的多肽也可以包 括一个初始形式的甲硫氨酸残基，在一些情况中是宿主介 导的结果。
RG1多肽及编码其的多核苷酸的使用
Rg1多核苷酸和RG1多肽根据本发明可以有许多用途， 尤其使用RG1的化学和生物学性质的那些用途。另外可以 用于诊断和治疗细胞增殖性疾病，如前列腺癌。本发明的 这些方面通过以下揭示得以进一步例证，并在说明书的主 要部分内进一步阐述。
使用本发明多核苷酸和多肽序列的基本原理，部分基于 RG 1和其它胞外基质分子之间的化学和结构同源性，及基 于RG1在前列腺组织中比在其它组织中优先表达。RG1可 以用于诊断和治疗与前列腺组织异常生长相关的病理状 态，功能失调或疾病。这些包括但非限于癌症和转移性肿 瘤生长。
Rg1序列可以用作DNA探针，及用作反义和核酶疗法 的靶位，或作为产生反义多核苷酸的模板。
RG1多肽可以用于产生RG1的抗体，以用于检测细胞 和组织中多肽的水平，及将药物定向于原发和转移瘤。
RG1多肽可用于刺激对含有RG1细胞的免疫应答。
编码RG1的多核苷酸可用于检测细胞和组织中编码 RG1的多核苷酸水平的诊断分析中。
在与RG1表达相关的病变中，如前列腺癌，抑制RG1 的表达和活性是有益的。RG1表达可以通过施用反义寡核 苷酸或核酶而抑制。或者，可以施用特异识别RG1多肽活 性相关区域的抗体，以治疗与RG1活性相关的疾病或病理 状态。
多核苷酸分析
本发明还涉及使用rg1-相关的多核苷酸以检测互补多核 苷酸，例如作为诊断试剂。与疾病相关的rg1多核苷酸的检 测，提供了一种体外或体内诊断工具，可以补充或限于诊 断由于RG1组织特异性表达所致的疾病或对这种疾病的易 感性。
编码RG1的基因中有突变的个体，可以在DNA水平 通过各种方法检测。进行诊断的多核苷酸样品可以得自病 人的细胞，如取自血液，尿液，唾液，组织活检和尸检物。 基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析之前通过使用 PCR进行酶促扩增(Saiki等，自然324：163-166，1986)。RNA 或cDNA也可以以相同方式使用。例如，互补于编码RG1 的多核苷酸序列的PCR引物，可以用于鉴别和分析rg1的 表达和突变。例如，缺失和插入可以通过扩增产物的大小 与正常基因型不同而检测。点突变可以通过将扩增的DNA 与放射标记的rg1 RNA或者放射标记的rg1反义DNA序列 杂交而鉴别。通过RNase A消化或通过解链温度不同，可 以将完全匹配的序列从错配的双链体中区分出。
参照基因和具有突变的基因之间的序列差异还可以通过 直接DNA测序证明。另外，克隆的DNA节段可以用作探 针，以检测特异性DNA节段。这种方法的敏感性可以通过 适当使用PCR或其它的扩增方法而明显增强。例如，测序 引物与双链的PCR产物或通过修改的PCR产生的单链的模 板分子一起使用。序列测定是使用放射标记的多核苷酸通 过常规方法，或使用荧光标记通过自动测序方法进行的。
基于DNA序列差异的遗传学试验，可以通过检测有或 无变性剂的凝胶中DNA片段的电泳迁移率的变化进行。通 过高解离凝胶电泳可以观测到少量序列缺失和插入。不同 序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上区分，其中 不同DNA片段的迁移率根据其特异性解链或部分解链温 度，在凝胶中在不同位置减速(见例如Myers等，科学 230：1242，1985)。
在特异位置的序列变化也可以通过核酸酶保护分析证 实，如RNase和S1保护或者通过化学裂解方法证实(例如 Catton等，美国科学院院报85：4397-4401，1985)。
因此，检测特异性DNA序列可以通过以下方法进行， 如杂交，RNase保护，化学裂解，直接DNA测序或使用限 制酶(例如限制片段长度多态性(RFLP)和基因组DNA 的Southern印迹分析)。
除了更常规的凝胶电泳和DNA测序之外，突变也可以 通过原位分析进行检测。
多肽分析
本发明还涉及诊断分析如定量分析和检测细胞和组织和 体液中RG1多肽水平的诊断分析，包括测定正常和异常水 平。因此例如根据本发明的检测与在正常对照组织样品中 相比RG1多肽过表达的诊断分析，可以用于检测瘤形成， 例如前列腺癌。这种诊断试验可用于检测转移瘤生长。可 用于测定来自宿主的样品中多肽如本发明的RG1多肽的水 平的分析方法，是本领域技术人员所熟知的。这种分析方 法包括放射性免疫分析(RIA)，竞争性结合分析，Western 印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)，及荧光激活的细 胞分选(FACS)。这些方法当中优选ELISA。ELISA分析 开始包括制备一种RG1的特异性抗体，优选单克隆抗体。 另外，通常要制备一种结合单克隆抗体的报道抗体。将报 道抗体粘附于一种可检测试剂，如放射性，荧光或酶促试 剂，在这个实施例中是辣根过氧化物酶。
为进行ELISA，从宿主中取样品，并在结合样品中多 肽的固体支持物上温育，如在聚苯乙烯培养皿上。然后将 培养皿上的任何游离多肽结合位点，通过用非特异性蛋白 质如牛血清白蛋白温育而覆盖。接着，将单克隆抗体在培 养皿中，在单克隆抗体与附着于聚苯乙烯培养皿的任何RG1 多肽附着的期间温育。用合成仪将未结合的单克隆抗体洗 去。将连接于辣根过氧化物酶的报道抗体置于培养皿中， 导致报道抗体与结合RG1的任何单克隆抗体结合。然后洗 去未附着的报道抗体。然后在培养皿中加入过氧化物酶活 性试剂，包括比色底物。通过原始和二级抗体连接于RG1 的固定的过氧化物酶，产生有色的反应产物。在给定的时 间内产生的颜色数量，表明样品中存在的RG1多肽数量。 定量结果典型地是通过参考标准曲线获得的。
可以使用竞争性分析，其中将特异于RG1的抗体附着 于固相支持物，并将标记的RG1和取自宿主的样品穿经此 固相支持物，检测到的附着于固相支持物的标记数量与样 品中RG1的数量相关。
这些及其它方法见于Hampton等(血清学方法实验手 册，APS出版社，St Paul，Minn，1990)和Maddox等(实 验方法杂志158：12111，1983)所述。
抗体
本发明还涉及特异结合RG1的抗体，在此称为RG1抗 体。RG1在前列腺组织中的过表达及其细胞表面位置，代 表了进行筛选，诊断，预后，追踪分析和显影方法的理想 标记的特性。另外，这些特性表明RG1可以是一些疗法的 理想靶位，如定向抗体疗法，免疫疗法和基因疗法。如本 文所用术语“特异结合”是指抗体与多肽之间的相互作用， 其中这种相互作用依赖于多肽上存在特殊的结构(即抗原 性决定簇或表位)；换而言之，抗体识别并结合特异性多肽 结构而不是一般的蛋白质。
RG1多肽，其片段或其它衍生物，或其类似物，或表 达它们的细胞，可以用作免疫原以产生抗体(Harlow，抗 体，冷泉港出版社，NY(1989))。这些抗体例如可以是多 克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合的，单链的，人化 的和人抗体，以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。可 以使用本领域已知的各种方法产生这种抗体和片段。
抗相当于本发明序列的多肽产生的抗体，可以通过将多 肽直接注射入动物体内，或通过将多肽施用于动物优选非 人动物而获得。这样获得的抗体然后结合其自身多肽。以 这种方式，甚至只编码多肽片段的序列也可用于产生结合 整个天然多肽的抗体。这种抗体然后可用于从表达那种多 肽的组织中分离多肽。
为制备单克隆抗体，可以使用任何通过连续细胞系培养 产生抗体的方法。例如包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein， 自然256：495-497，1975)，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor 等，现代免疫学4：72，1983)和产生人单克隆抗体的EBV- 杂交瘤技术(Cole等，单克隆抗体和癌症，Alan R.Liss，Inc.， 77-96，1985)。
另外，可以使用产生“嵌合”抗体的技术，将小鼠抗体 基因与人抗体基因相剪接，获得具有适当抗原特异性和生 物学活性的分子(Morrison等，美国科学院院报81：6851- 6855，1984；Neuberger等，自然312：604-608，1984；Takeda 等，自然314：452-454，1985)。或者，生产单链抗体的技术 (美国专利No.4946778)可以适于生产RG1特异性单链抗 体。
另外，“人”抗体可以使用美国专利No.5877397和 5569825所述的方法生产，所述专利在此并入参考。
抗体还可以通过在淋巴细胞群中体内诱导产生，或通过 筛选重组的免疫球蛋白文库或高特异性结合剂而产生，如 Orlandi等(美国科学院院报86：3833-3837，1989)和Winter 和Milstein(自然349：293-299，1991)所述。
也可以产生含有RG1特异性结合位点的抗体片段。例 如，这种片段包括但非限于F(ab’)2片段，其可以通过胃 蛋白酶消化抗体分子而产生，和Fab片段，其可以通过还 原F(ab’)2片段的二硫键而产生。或者，可以构建Fab表 达文库以迅速和简便地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab 片段(Huse等，科学256：1270-1281，1989)。
在此所述RG1的氨基酸序列可以用于选择RG1多肽特 异性区域，以产生抗体。本领域技术人员应意识到抗体定 向的RG1多肽的区域和表位可以随着具体应用而变化。例 如，用于免疫分析中以检测前列腺细胞上膜结合的RG1的 抗体，应定向于RG1多肽上的可及表位。表现免疫原性记 过的RG1多肽的区域，以及其它区域和结构域，可以使用 本领域已知的各种其它方法轻易鉴别，如Chou-Fasman， Gamier-Robson，或Jameson-Wolf分析。含有这些残基的片 段特别适于产生抗RG1抗体。特别有用的片段包括但非限 于序列PLGGESICSAGAPAKYSIT(SEQ ID NO：8)； HSSDYSMWRKNQYVS(SEQ ID NO：10)； DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(SEQ ID NO：11)，和 NEIVDSASVPET(SEQ ID NO：12)。这些区域产生的单克 隆抗体见于实施例4所述。
本发明的RG1抗体可以特别用于前列腺癌的诊断分 析，显影方法学，和治疗方法中。本发明提供了用于检测RG1 多肽和诊断前列腺癌的各种免疫学分析。这种分析通常包 括一或多个能识别和结合RG1多肽的RG1抗体。最优选的 抗体将选择性结合RG1并不结合(或微弱结合)非RG1多 肽。这些分析包括本领域熟知的各种免疫学分析，包括但 非限于各种类型的免疫学分析，酶联免疫吸附测定等。另 外，本发明还提供了能检测前列腺癌的免疫学显影方法， 包括但分析适用于标记的RG1抗体的放射闪烁照相显影方 法。这种分析可以临床用于检测，监测和预后前列腺癌。
上述抗体可以用于分离或鉴别表达多肽的克隆，或纯化 本发明的多肽，通过将抗体附着于固体支持物以通过亲和 层析分离和/或纯化。
另外，可以使用细胞分选和纯化方法，将RG1抗体用 于分离RG1阳性细胞。特别地，RG1抗体可以用于从异种 移植的肿瘤组织中，从培养的细胞中等，使用基于抗体的 细胞分选或嵌合纯化方法，分离前列腺癌细胞。本发明RG1 抗体的其它应用包括产生模拟RG1多肽的抗独特型抗体。
RG1多肽可以用于监测前列腺癌或肿瘤转移的存在与 否。各种生物学样品中，包括血清，前列腺和其它组织活 检样品，是否存在这种含有RG1的细胞，可以用RG1抗体 检测。另外，RG1抗体可以用于各种显影方法学中，如用 Tc-99m(或其它同位素)缀合的抗体进行免疫闪烁照相。 例如，可以使用一种类似于最近阐述的使用In-111缀合的 抗PSMA抗体的显影方法，以检测复发的和转移的前列腺 癌(Sodee等，临床核酸方法21：756-766，1997)。
本发明的RG1抗体可以用可检测的标志标记或缀合于 另一种分子，如胞毒剂，及用于将另一种分子定向于RG1 阳性细胞(Vitetta，E.S.等，免疫毒素疗法，DeVita，Jr.，V.T. 等编辑，癌症：肿瘤学原理和实践，第4版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，2624-2636，1993)。胞毒剂例如包括但 非限于蓖麻毒蛋白，阿霉素，道诺红霉素，紫杉醇，溴化 乙锭，丝裂霉素，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，tenoposide，长春 花新碱，长春花碱，秋水仙素，二羟炭疽菌素dione，放线 菌素D，diptheria毒素，假单胞杆菌外毒素(PE)A，PE40， 相思豆毒蛋白和糖皮质激素及其它化疗剂，以及放射性同 位素。适当的可检测标记包括但非限于放射性同位素，荧 光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物，金属螯合 剂或酶。适当的放射性同位素包括以下物质：锑-124，锑 -125，砷-74，钡-103，钡-140，铍-7，铋-206，铋 -207，镉-109，镉-115m，钙-45，铈-139，铈-141， 铯-144，铯-137，铬-51，钴-56，钴-57，钴-58， 钴-60，钴-64，铒-169，铕-152，Gadolinium-153， 金-195，金-199，Hafnium-175，Hafnium-181，铟-11， 碘-123，碘-131，铱-192，铁-55，铁-59，氪-85， 铅-210，镁-54，汞-197，汞-203，钼-99，钕-147， 镎-237，镍-63，铌-95，锇-185+191，钯-103，铂 -195m，镨-143，钜-147，镤-233，镭-2226，铼-186， 铷-86，钌-103，钌-106，钪-44，钪-46，硒-75， 银-110m，银-11，钠-22，锶-85，锶-89，锶-90， 硫-35，Tantalum-182，锝-99m，碲-125，碲-132， 铊-170，铊-204，钍-228，钍-232，锡-113，钛-44， 钨-185，钒-48，钒-49，镱-169，钇-88，钇-90， 钇-91，锌-65和锆-95。
前列腺癌的免疫治疗
本发明提供了多种治疗前列腺癌的免疫治疗方法，包括 抗体疗法，体内接种，和源于体内免疫治疗方法。在一个 方法中，本发明提供了RG1抗体，其可以系统施用以治疗 前列腺癌。例如，可以将未缀合的RG1抗体导入患者体内， 这样抗体与前列腺癌细胞上，内或与之缔合的RG1结合， 并引起细胞和肿瘤的破坏，这是通过可包括以下机制引起 的：补体引起的细胞溶解，抗体依赖性细胞胞毒性，改变RG1 的生理功能，和/或抑制配体结合或信号转导途径。缀合于 毒性剂如蓖麻毒蛋白或放射性同位素的RG1抗体，也可以 治疗性用于将毒性剂定向送递于携带RG1的前列腺肿瘤细 胞，并从而破坏肿瘤细胞。
施用RG1抗体进行的前列腺癌免疫治疗，可以遵循已 经成功用于其它类型癌症的多种方法的教导，包括但非限 于结肠癌(Arlen等，Crit.Rev.Immunol.18：133-138，1998)， 多发性肌瘤(Ozaki等，血液90：3179-3186，1997；Tsunenari 等，血液90：2437-2444，1997)，胃癌(Kasprzyk等，癌 症研究52：2771-2776，1996)，白血病(Zhong等，白血 病研究20：581-589，1996)，结肠直肠癌(Moun等，癌 症研究54：6160-6166，1994；Velders等，癌症研究55： 4398-4403，1995)和乳腺癌(Shepard等，临床免疫学杂 志11：117-127，1991)。
本发明还提供了含有RG1多肽或其片段的疫苗。本领 域熟知在疫苗中使用肿瘤抗原以产生肿瘤或细胞介导的免 疫性，以用于抗肿瘤治疗中，而且已经使用人PSMA和啮 齿动物PAP免疫原用于前列腺癌中(Houdge等，癌症研究 杂志63：231-237，1995；Fong等，免疫学杂志159：3113-3117， 1997)。这种方法可通过应用RG1多肽，或其片段，或编码 RG1的核酸分子，和能表达和适当呈递RG1免疫原的重组 载体而易于实践。
例如，可以使用病毒基因输送系统以输送编码RG1的 核酸分子。根据本发明的此方面可以使用的各种病毒基因 输送系统包括但非限于牛痘，禽痘，金丝雀痘，腺病毒， 流感病毒，脊髓灰质炎病毒，腺伴随病毒，慢病毒和新培 斯病毒(Restifo，现代免疫学见解8：658-663，1996)。也可 以通过将编码RG1或其片段的裸DNA导入患者(即通过 肌内注射)中诱导抗肿瘤应答，而应用非病毒输送系统。 在-个实施方案中，可以应用全长的人rg1 cDNA。在另一 个实施方案中，可以应用人rg1 cDNA片段。在另一个实施 方案中，可以应用编码特异性T淋巴细胞(CTL)表位的rg1 核酸分子。CTL表位可以使用特异程序确定(例如Epimer， Brown大学)，以鉴别RG1多肽中能与特异的HLA等位基 因最佳结合的肽。
也可以使用各种源于体内的方案。一种方法包括使用树 突细胞，将RG1多肽作为抗原呈递给患者免疫系统。树突 细胞表达MHC的I和II型分子，B7共同刺激因子，和IL- 12，并因此特别专用于抗原呈递细胞。在前列腺癌中，将 用前列腺特异性膜抗原(PSMA)肽脉冲的自身树突细胞用 于I期临床试验中，以刺激前列腺癌患者的免疫系统(Tioa 等，前列腺28：65-69，1996；Murphy等，前列腺29：371-380， 1996)。可以使用树突细胞将RG1多肽呈递给MHC的I和 II型分子邻近的T细胞。在一个实施方案中，自身树突细 胞是用能结合MHC分子的RG1多肽脉冲的。在另一个实 施方案中，树突细胞是用完整的RG1多肽脉冲的。然而另 一个实施方案包括使用本领域已知的各种载体，对树突细 胞中rg1基因的过表达加以遗传工程化，所述载体例如是腺 病毒(Arthur等，癌症基因治疗4：17-25，1997)，逆转录病 毒(Henderson等，癌症研究56：3763-3770，1996)，慢病毒， 腺伴随病毒，DNA转染(Ribas等，癌症研究57：2865-2869， 1997)，和肿瘤衍生的RNA转染(Ashley等， J.Exp.Med.186：1177-1182，1997)。
抗独特型抗RG1抗体也可用于抗癌治疗中，作为疫苗 诱导对表达RG1多肽的细胞的免疫应答。特别是本领域熟 知产生抗独特型抗体的方法，并可方便地适于产生抗独特 型抗RG1抗体，其模拟RG1多肽上的一个表位(见例如 Wagner等，杂交瘤16：33-40，1997；Foon等，临床研究杂 志96：334-342，1995；Herlyn等，癌症免疫学免疫治疗 43：65-76，1996)。这种抗独特型抗体可以用于抗独特型治 疗中，与现有的直接抗肿瘤抗原的其它抗独特型抗体一样 使用。
遗传免疫接种方法可以用于产生对表达RG1的癌细胞 的预防性或治疗性激素和细胞免疫应答。使用本文所述的 编码RG1的DNA分子，可以将包含编码RG1多肽/免疫原 的DNA和适当调节序列的构建体，直接注射至个体的肌肉 或皮肤中，这样肌或皮肤的细胞吸收构建体并表达编码的 RG1多肽/免疫原。RG1多肽/免疫原可以表达为细胞表面多 肽或是分泌的。RG1多肽/免疫原的表达地址抗前列腺癌的 预防性或治疗性激素和细胞免疫应答产生。可以使用本领 域已知的各种预防性和治疗性遗传免疫接种方法(参见 www.genweb.com网站上公布的信息和参考资料)。
反义寡核苷酸，反义载体和核酶
互补于rg1的反义多核苷酸可以是合成制备的。这种寡 核苷酸可以用或不用脂质体输送至细胞中，脂质体可以有 助于反义寡核苷酸摄取入细胞中。
或者，可以使用衍生自逆转录病毒，腺病毒，疱疹病毒 或痘苗病毒，或各种细菌质粒的表达载体，构建和输送表 达反义rg1的重组载体。见例如Sambrook(如前)和Ausubel (如前)所述的方法。
包含全长cDNA序列和/或其调节因子的多核苷酸，使 研究人员可以使用rg1多核苷酸在有义链(Youssoufian和 Lodish，分子细胞生物学13：98-104，1993)或反义链(Eguchi 等，Annu.Rev.Biochem.60：613-652，1991)中作为研究工具 以调节基因功能。目前本领域熟知这种技术，而且有义或 反义寡聚物，或较大片段可以从沿着编码或控制区的各种 位置中设计。
编码RG1的基因可以通过用表达载体转染细胞或组织 而关闭，所述表达载体高水平表达所需的rg1多核苷酸片 段。这种构建体用不可翻译的有义或反义链充填细胞。即 使在没有整合入DNA的情况下，这种载体也可以持续转录 RNA分子，直至所有拷贝均由内源核酸酶破坏。瞬时表达 用一个非复制载体可以持续一个月或更长时间，而且如果 适当的复制因子是载体系统的一部分可以持续更长时间。
如上所述，对基因表达的修饰可以通过设计反义分子， DNA或RNA控制rg1的区域，即启动子，增强子和内含子。 优选衍生自转录起始位点的寡核苷酸，例如在引导序列-10 和+10区域之间的寡核苷酸。反义分子也可以设计为通过 阻止转录物结合核糖体而阻断mRNA的翻译。相似地，抑 制可以通过使用“三螺旋”碱基配对方法达到。三螺旋配 对包含双螺旋充分打开以结合聚合酶，转录因子或调节分 子的努力。新近的使用3螺旋DNA的治疗进展参见Gee，J.E. 等揭示(Huber和Car，分子和免疫学方法，Futura出版公 司，Mt.Kisco，N.Y.，1994)。
核酶是能催化RNA特异性裂解的酶性RNA分子(美 国专利No.4987071；WO93/23057)。核酶的作用机制包括 核酶分子与互补的靶RNA序列特异性杂交，随后内切核酸 酶性裂解。在本发明范围内的是遗传工程化的锤头基序核 酶分子，其能特异及有效地催化编码RG1的RNA内切核 酸酶性裂解。在任何潜在的RNA靶内的特异性核酶裂解位 点，最初是通过扫描靶分子的包括以下序列GUA，GUU和 GUC的核酶裂解位点而鉴别的。一旦鉴别，可以对相当于 含有靶基因裂解位点的区域的在15-20个核糖核苷酸之间 的短RNA序列，评价其使寡核苷酸不可操纵的二级结构特 点。候选靶分子是否适当也可以使用核糖核酸酶保护分析， 通过测试与互补寡核苷酸杂交的能力而加以评价(Irie等， 药物学进展40：207-257，1997)。
本发明的反义分子和核酶可以通过本领域已知的任何合 成RNA分子的方法制备。这些包括化学合成寡核苷酸方法， 如固相亚磷酰胺化学合成方法。或者，RNA分子可以通过 体外和体内转录产生，或通过编码RG1的DNA序列产生。 这种DNA序列可以掺入各种具有适当RNA聚合酶启动子 如T7或SP6的载体中。或者，可以将组成型或可诱导地合 成反义RNA的反义cDNA构建体导入细胞系，细胞或组织 中。
可以对RNA分子加以修饰以提高胞内稳定性和半衰 期。可能的修饰包括但非限于在该分子的5’和/或3’末端 添加侧翼序列，或在分子的骨架内使用硫代磷酸酯或2’O- 甲基而不是磷酸二酯酶键合。通过包含非常规的碱基如肌 苷和queosine以及乙酰基-，甲基一，硫代-及相似修饰 形式的腺嘌呤，胞苷，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，和尿嘧啶，也 可以提高稳定性，这些碱基一般不易被内源性内切核酸酶 识别。
将反义载体导入细胞或组织的方法包括前述的那些方 法，这些方法均等地适用于体内，体外和源于体内的治疗 中。就源于体内的治疗而言，是将反义载体导入取自患者 的细胞中并克隆繁殖，以自体移植入同一患者中，如在此 并入参考的美国专利No.5399493和5437994所述。本领域 熟知通过转染和通过基于脂质体或其它脂质或基于非脂质 的制剂进行输送的方法。
鉴别结合RG1的制剂的试验
本发明还涉及可以用于鉴别结合RG1的制剂的试验和 方法。特别地，鉴别结合RG1的制剂，可以通过RG1配体 或其它制剂或组分结合RG1的能力和/或抑制/刺激RG1活 性的能力进行。
或者，结合RG1多肽的制剂可以使用酵母双杂交系统 或结合捕获试验加以鉴别。在酵母双杂交系统中，将一个 编码融合蛋白的表达单位导入酵母细胞中并表达，所述融 合蛋白是由两个亚单位转录因子的一个亚单位和RG1多肽 组成。将此细胞进一步修饰以含有(1)一个编码可检测标 记的表达单位，所述标记的表达需要两个亚单位转录因子， 和(2)一个编码融合蛋白的表达单位，所述融合蛋白由转 录因子的另一个亚单位和克隆的DNA节段组成。如果克隆 的DNA节段编码一种结合RG1多肽的蛋白质，则表达导 致RG1和编码的蛋白之间的相互作用。这使转录因子的两 个亚单位密切结合，重组为转录因子。这使可检测标记表 达。酵母双杂交系统特别用于筛选cDNA文库，所述cDNA 编码RG1的细胞结合配体的节段。
可用于上述试验的RG1多肽包括但非限于一种分离的 RG1多肽，RGl多肽的片段，一个已经改变而表达RG1多 肽的细胞，或已经改变而表达RG1多肽的细胞的组分。另 外，RG1多肽可以是完整的多肽或是RG1多肽的指定片段。 本领域技术人员将意识到只要可以测定RG1多肽的结合 剂，例如通过改变分子量或活性进行测定，就可以使用本 试验。
用于鉴别一种制剂/细胞区室是否结合RG1多肽的方 法，主要基于使用的RG1多肽的性质。例如，可使用凝胶 阻滞试验测定一种制剂是否结合RG1或其片段。或者，可 采用免疫检测和生物芯片技术与RG1一起使用。技术人员 可方便地应用本领域熟知方法测定一种特殊制剂是否与 RG1多肽结合。
可以对制剂和细胞区室进一步测试其调节RG1活性的 能力，使用无细胞测定系统或细胞测定系统。由于RG1多 肽的活性是更加限定的，可以应用基于鉴别活性的功能测 定。
如本文所用，当制剂降低RG1活性时，称之为拮抗RG1 活性。优选的拮抗剂将选择性拮抗RG1，而不影响任何其 它细胞蛋白。另外，优选的拮抗剂将RG1活性降低50％以 上，更优选降低90％以上，最优选消除所用RG1活性。
在上述方法中测定的制剂可以上随机选择的或理性选择 或设计的。如本文所用，当制剂是随机的而不考虑RG1多 肽的特异性序列而选择的时候，将此制剂称为随机选择的。 随机选择的制剂例如是使用化学文库或肽组合文库，或有 机物或植物提取物的生长肉汤。
如本文所用，当制剂是在考虑靶位点的序列和/或其与 制剂功能相关的构象的非随机基础上选择的，则称此制剂 为理性选择或设计的。制剂可以利用由组成RG1多肽的肽 序列加以理性选择或理性设计。例如，一个理性选择的肽 制剂可以是这样的一种肽，其氨基酸序列等同于RG1多肽 的片段。
本发明方法中测试的制剂可以是例如肽，抗体，寡核苷 酸，小分子和维生素衍生物，以及碳水化合物。技术人员 可易于意识到对所述筛选方法中使用的制剂的结构性质没 有限制。本发明的一类的制剂是肽制剂，其氨基酸序列是 基于RG1多肽的氨基酸序列选择的。
肽制剂可以使用标准固相(或溶液相)肽合成方法制备 的，如本领域已知的方法。另外，编码这些肽的DNA可以 是使用可商购的寡核苷酸合成仪器合成的，及使用标准的 重组生产系统重组生产的。如果包括无基因编码的氨基酸， 使用固相肽合成生产是必要的。
本发明的另一类制剂是与RG1的关键位置免疫反应的 抗体。如上所述，抗体是通过用肽免疫接种适当的哺乳动 物对象而获得的，所述肽含有作为抗原性区域的抗体定向 的RG1多肽的那些部分。这种制剂可以用于竞争性结合研 究，以鉴别第二代抑制剂以及封阻RG1活性。
本发明方法中细胞提取物试验可以是例如细胞或组织的 水相提取物，细胞或组织或部分纯化的细胞组分的有机提 取物。技术人员可易于意识到对本发明的筛选方法中使用 的细胞提取物的来源没有限制。
结合RG1多肽的制剂，如RG1抗体，可以用于调节RG1 的活性，将抗癌剂定向于适当的哺乳动物细胞，或鉴别封 阻与RG1相互作用的制剂。表达RG1的细胞可以使用结合 RG1的制剂定向或鉴别。
RG1结合剂怎样使用依赖于RG1结合剂的性质。例如， RG1结合剂可以用于：将缀合的毒素，如白喉毒素，霍乱 毒素，蓖麻毒蛋白或假单胞杆菌外毒素，输送至RG1表达 细胞；调节RG1活性；直接杀死RG1表达细胞；或筛选鉴 别竞争性结合剂。例如，RG1抑制剂可以用于直接已知RG1 表达细胞的生长，而RG1结合剂可以用作诊断剂。
药物组合物及施用
本发明还涉及药物组合物，其可以包含rg1多核苷酸， RG1多肽，抗体，兴奋剂，拮抗剂，或抑制剂，单独或与 至少一种其它制剂如稳定化合物组合，其可以在任何无菌 的，生物相容的药物载体中施用，所述载体包括但非限于 盐水，缓冲盐水，葡萄糖和水。任何这些分子均可以单独 施用于患者，或与其它制剂，药物或激素组合在药物组合 物中施用，其中其与赋形剂或药物适当载体混合。在本发 明的一个实施方案中，药物适当的载体是药物学惰性的。
本发明还涉及药物组合物的施用。这种施用是经口服或 非肠道施用的。非肠道施用的方法包括局部施用，动脉内 (直接施用于肿瘤)，肌内，皮下，髓内，鞘内，心室内， 静脉内，腹膜内或鼻内施用。除了活性配料之外，这些药 物组合物可以含有适当的药物适当的载体，包括赋形剂和 辅助剂，其促进将活性化合物加工为可作为药物施用的制 品。关于配方和施用技术的进一步阐述见于最近版本的 Remington’s药物学(Ed.Maack出版公司，Easton，Pa.)。
口服施用的药物组合物，可以使用本领域熟知的药物适 当的载体，以适于口服的剂量配制。这种载体可以使药物 组合物配制为片剂，药丸，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶， 糖浆，悬浮液等，由患者摄取。
口服的药物制品可以通过将活性化合物与固体赋形剂组 合，随意地研磨为混合物，及如果需要，加入适当的辅助 剂之后，将此混合物加工为细粒以获得片剂或糖衣丸。适 当的赋形剂是碳水化合物或蛋白质充填剂如糖，包括乳糖， 蔗糖，甘露醇或山梨糖醇；来自谷物，小麦，水稻，马铃 薯或其它植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素，羟丙甲基纤 维素，或羧甲基纤维素钠；和树脂包括阿拉伯树胶和西黄 蓍胶；和蛋白质如明胶和胶原蛋白。如果需要，可以加入 分解剂或增溶剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，藻酸 或藻酸盐，如藻酸钠。
糖衣丸是用适当的包衣如浓缩的糖溶液包被的，其还可 以含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚羰乙烯凝 胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，紫胶漆溶液，和适当的有机 溶剂或溶剂混合物。可以在片剂或糖衣丸中加入染料或色 素，以鉴别产物或确定活性化合物的数量，即剂量。
可以口服的药物制品包括由明胶组成的推入契合的胶 囊，以及由明胶和包衣如甘露醇或山梨糖醇组成的柔软的 密封的胶囊。推入契合的胶囊可以含有活性配料，混合充 填剂或结合剂如乳糖或淀粉，润滑剂如滑石或硬脂酸镁， 及任选的稳定剂。在柔软的胶囊中，活性化合物可以溶解 或悬浮于适当的液体中，如脂肪油，液体石腊或液态聚乙 二醇中，有或没有稳定剂。
非肠道施用的药物配方包括活性化合物的水溶液。就注 射而言，本发明的药物组合物可以在水溶液中配制，优选 在生理适当的缓冲液如Hank’s溶液，Ringer’s溶液或生 理缓冲盐水中配制。水相注射悬浮液可含有提高悬浮液粘 度的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇或右旋糖苷。另 外，活性化合物的悬浮液可以制备为适当的油性注射悬浮 液。适当的脂质溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油，或合 成的脂肪酸酯，如乙基油酸酯或甘油三酯，或脂质体。任 选地，悬浮液还可以含有适当的稳定剂或提高化合物溶解 性的制剂，以可以制备高度浓缩的溶液。
就局部或鼻腔施用而言，在配方中使用可以透过特殊屏 障的适当渗透剂。这种渗透剂是本领域已知的。
试剂盒
本发明还涉及药物包装和试剂盒，其包含一或多个充填 了一或多种前述本发明组合物的配料的容器。所使用的容 器应参照负责药品或生物制品生产，应用或销售的政府部 门的建议，所提的建议必需被用于临床的生产，应用或销 售部门接受。另外，药物成分可以与其他有治疗作用的化 合物联合使用。
生产和贮存
本发明的药物组合物可以透过本领域已知的方式生产， 例如透过常规的混合，消散，成粒，包衣，研磨，乳化， 胶囊化，截留或冻干程序。
药物组合物可以以盐的形式提供，并可以用许多酸形 成，包括但非限于盐酸，硫酸，乙酸，乳酸，酒石酸，马 来酸，琥珀酸等。盐在水性或其它质子溶剂中往往是更可 溶的，相当于游离碱基形式。在其它情况中，优选的制品 可以是冻干的粉末，1mM-50mM组氨酸，0.1％-2％蔗糖， 2％-7％甘露醇，pH4.5-5.5，在使用之前用缓冲液将它们 组合。
在已经制备药物组合物之后，所述组合物包含在适当载 体中配制的本发明的化合物，将它们置于适当的容器中， 并标示，以在指定条件下处理。就施用RG1而言，这种标 示包括施用数量，频率和方法。
治疗有效量
适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中活 性配料是有效量的，以达到想要的目的，即特征在于通过 RG1表达治疗特殊的疾病。本领域技术人员熟知确定有效 量的方法。
就任何化合物而言，治疗有效量可以在细胞培养试验如 肿瘤形成细胞中，或在动物模型中初步评估，一般使用小 鼠，兔，狗或猪。动物模型还用于达到所需的浓度范围和 施用途径。这样的信息然后可以用于确定在人体内的有效 剂量和施用途径。
治疗有效量是指改善症状或状态的蛋白质或其抗体，拮 抗剂或抑制剂的数量。这种化合物的治疗效力和毒性可以 通过标准药物学程序在细胞培养物或试验动物中确定，例 如ED50(半数治疗有效量)和LD50(半数致死量)。治疗效 力和毒性之间的剂量比是治疗指数，并可以以ED50/LD50表 示。优选呈现高治疗指数的药物组合物。得自细胞培养试 验和动物研究的数据用于明确阐述用于人体的剂量范围。 这种化合物的剂量优选在流通浓度范围内，包括ED50及很 小的或没有毒性。根据应用的剂型，患者的敏感性及施用 途径，剂量可以在此范围内变化。
精确的剂量是根据治疗的患者的个体差异选择的。调节 剂量和施用方法以提供足够水平的活性组分，或保持所需 效力。需加以考虑的其它因素包括病情程度，例如肿瘤大 小和位置；患者的年龄，体重和性别；饮食，施用时间和 频率，药物组合，反应敏感性，和对治疗的耐受性/应答。 根据特殊配方的半衰期和清除率，长效药物组合物可以每3 -4天，每周，或每两周施用一次。
根据施用途径，标准剂量可以在0.1-100000ug之间变 化，最多总剂量为大约1g。文献中提供了关于特殊剂量和 施用方法的指导。见美国专利No.4657760；5206344；或 5225212。本领域技术人员针对多核苷酸可应用与针对蛋白 质或其抑制剂不同的配方。相似地，根据特殊的性别，条 件，位置等施用特异的多核苷酸或多肽。
本发明还通过以下实施例加以进一步详述。实施例只是 通过参考特异的实施方案例证了本发明。这些实施例例证 了本发明的某些方面，无限制本发明范围之意。
如果没有特别说明，所有的实施例均使用本领域熟知的 标准技术进行。以下实施例的常规分子生物学技术可以如 标准实验手册所述进行，如Sambrook等，分子克隆实验手 册，第2版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989。
实施例1：鉴别人rg1多核苷酸
rg1是作为在前列腺中表达的基因通过淘选Incyte’s LifeSeq数据库鉴别的。核苷酸序列是对数据库的注释研究， 使用Incyte为研究数据库而提供的“蛋白质功能”工具鉴 别的。核苷酸序列是在注释的数据库中的细胞粘着分子中 发现的，并阐述为同源的f-spondin。对数据库中一系列文 库中的rg1多核苷酸序列的分布进行的电子Northern分析表 明，rg1在前列腺文库中高水平表达，在其它许多组织文库 中以较低水平表达，包括正常的组织和肿瘤组织。
在将数据库中rg1克隆系列装配为连续的多核苷酸系 列，并对此连续的系列进行编辑后，在预定装配的多核苷 酸中鉴别一个全长的编码序列。这个序列编码与f-spondin 和Mindin-2同源的蛋白质。
Incyte克隆1640796，1712252和1880265得自Incyte， 以进行试验研究，克隆3360733经鉴别含有最多的5’核苷 酸序列。对这个克隆进行充分测序，含有推定的RG1蛋白 的全部编码序列。这个序列示于图1(SEQ ID NO：1)。
实施例2：rg1mRNA表达
对得自正常组织和肿瘤组织和细胞系的各种样品中rg1 mRNA的表达，使用Taqman分析(Perkin-Elmer)通过半 定量PCR测定。前列腺正常的，良性的和肿瘤组织样品得 自史丹佛医科大学泌尿系，所述样品已经根据修改的Gleason 分级系统分级。通过标准方法从这些样品中分离RNA。来 自其它肿瘤和正常组织的RNA是商购的，包括从Clontech 和Biochain商购的。前列腺肿瘤细胞系(PC-3，LNCaP和 DU145)得自美国典型培养物保藏中心，并通过标准方法使 用含有血清的培养基培养增殖。在裸鼠中建立来自这些细 胞系的异种移植的肿瘤，并在植入后大约4-6周，从这些 小鼠中收集肿瘤。通过标准方法从这些肿瘤中分离RNA。
进行基于Taqman的PCR分析，使用引物CGC GCA TAG CTC CGA CTA C(SEQ ID NO：3)和GCC GCG TCC GCA AAG(SEQ ID NO：4)，和Taqman探针：6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra(SEQ ID NO：5)。
这些引物和探针是用Perkin Elmer的引物表达软件设计 的，并通过合成遗传学合成。PCR反应进行30-40次循环， 并用前列腺RNA量化，以产生相对比的标准曲线。此分析 表明rg1 mRNA在前列腺中最高丰余检测，在一些其它组织 中明显水平较低(见图5)。
实施例3：在BHK细胞中克隆和表达RG1
RG1编码区得自Incyte质粒3360733。将此编码序列在 标准PCR反应中(100ul)，使用1×Pfu Turbo聚合酶缓冲 液(Stratagene，La Jolla，CA)/200uM dNTPs/0.2uM寡核苷 酸引物/2.5U Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，经PCR扩增， 使用引物SST115(5’-TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAA CCCCAGCCCGGC-3’)(SEQ ID NO：6)，和SST113 (5’-AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGAC G-3’)(SEQ ID NO：7)。PCR扩增条件如下：95℃3分 钟，(在95℃15秒，在60℃30秒，在72℃2分钟) ×35次，72℃7分钟。将所得PCR扩增产物用QIAquick PCR层析柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化，并用XbaI和 Pmall限制酶纯化，产生一个1010bp的片段，其是用BIO 101 GeneClean试剂盒(Vista，CA)从1％琼脂糖凝胶中纯化的。 将此纯化的片段连接于(使用Epicientre快速连接试剂盒 (Epicenter，Madison，WI))用XbaI和Pmall消化的非致 细胞病变的Sindbis表达载体pSINrep21(Agapov等，1998， PNAS95：12989-12994)中，并转化入DH5α感受态细胞中 (Life Technologies，Gaithersburg，CA)，及在含有氨苄青 霉素(100ug/ml)的LB琼脂平板上选择。将一个这种氨苄 青霉素抗性集落生长于含有氨苄青霉素的LB培养基中，通 过序列分析示出其含有插入的RG1编码序列。这个质粒称 为pPEG6。
使用Lipofectamine Plus试剂(Life Technologies， Gaithersburg，MD)，根据产生导致指导，将2ug的PEG6 用于转染1-3×105个牛仓鼠肾(BHK)细胞。在转染后， 将细胞在加上胎牛血清的DMEM中温育24-48小时，此 时细胞从1分裂为10，通过加入嘌呤霉素(终浓度为 2.5ug/ml)和含有血清的DMEM，开始选择含有质粒的细胞。 在细胞铺满后(加入嘌呤霉素4-5天后)，将细胞用PBS 冲洗，，分裂1-10，加入具有血清的DMEM和5ug/ml嘌 呤霉素。在另外2-3天后，将培养基用没有血清的DMEM 和5ug/ml嘌呤霉素置换，生长2-3天后，使用RG1抗体 通过Western分析检测培养基中RG1蛋白的存在情况。检 测的RG1蛋白的水平为1ug/ml。
实施例4：抗体产生
兔多克隆抗血清是对抗衍生自RG1蛋白序列的5种合 成的多肽序列而产生的。选择这些序列是因为推定其位于 蛋白质表面，以产生更易于识别表面表位的抗血清。将半 胱氨酸残基用氨基丁酸(Abu)置换以助于合成。所述5种 多肽的特异氨基酸序列，在RG1蛋白上的位置，和名称如 下所示。
名称 位置 氨基酸序列
C 28-46 PLGGESICSAGAPAKYSIT(SEQ ID NO：8)
2C 46-64 TFTGKWSQTAFPKQYPLFR(SEQ ID NO：9)
3C 77-91 HSSDYSMWRKNQYVS(SEQ ID NO：10)
4C 188-210 DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(SEQ ID NO：11)
5C 263-274 NEIVDSASVPET(SEQ ID NO：12)
将肽与匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)通过另外的羧基端半胱 氨酸常规偶联，以用作免疫原。相似地，制备牛血清白蛋 白(BSA)缀合物以通过ELISA分析抗血清滴定。
将两种动物用每种肽免疫接种。初始的免疫接种是在 Freunds完全佐剂中(0.5mg肽/动物)进行的，随后间隔3 周肌内注射Freunds不完全佐剂中以0.25mg肽/动物攻击。 定期取从实验动物中取血液，通过ELISA测定抗特异性 BSA-肽缀合物的抗体滴定，并与免疫前血清对比。抗1C和 3C肽的抗血清示出是活性的。抗2C肽的抗血清不识别RG1 多肽。抗4C和5C肽的抗血清未测试。
抗RG1的人单克隆抗体是通过免疫接种抗RG1肽和在 大肠杆菌中表达的6-组氨酸标记的RG1融合蛋白的转基因 小鼠产生的。将这些动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以 产生杂交瘤细胞。将所得杂交瘤通过ELISA筛选产生直接 抗RG1多肽和蛋白的抗体的那些杂交瘤。
实施例5：对抗体进行Western印迹分析
通过Western印迹测试抗血清的RG1特异性。RG1特 异性抗血清(上述抗1C和3C序列产生的那些)进行测试 在COS细胞中RG1瞬时表达，从LNCaP细胞中分泌天然 RG1和从转染的幼仓鼠肾细胞(BHK)中产生的RG1情况。 RG1-抗血清还进一步测试制备自以下物质的裂解物：LNCaP 肿瘤，LNCaP细胞，PC3肿瘤，PC3细胞和人前列腺肿瘤 的一些临床样品。将细胞和组织在去污剂缓冲液中裂解。 在沸腾5分钟后，将10ul的每种裂解物加样于12％SDS-聚 丙烯酰胺凝胶上以解离蛋白质。然后将分离的蛋白质移至 硝基纤维素膜上。RG1抗体的结合特异性通过在存在同源 和异源肽的情况下的结合加以验证。RG1特异性抗血清可 以检测除了PC-3细胞和PC-3肿瘤之外的所有样品中的蛋 白质。
实施例6：纯化分泌自LNCaP细胞的天然RG1蛋白
生长于培养物中的LNCaP细胞通过Western印迹分析 示出分泌天然RG1蛋白。为纯化此天然的蛋白质，将细胞 在没有血清的培养基中生长48小时。收集此没有血清的条 件培养基，离心以除去所有细胞，并通过超滤浓缩将近50 倍。然后将浓缩的培养基用20mM乙酸钠(pH6.5)缓冲液 稀释10倍，加样于Q-琼脂糖阴离子交换层析柱上。层析柱 洗脱由NaCl梯度(每分钟5％)组成，同时收集2.0ml级 分。将在大约75mM NaCl洗脱的RG1蛋白质通过Western 印迹和SDS PAGE测定。天然RG1蛋白在略低于在细菌中 表达的6组氨酸-RG1融合蛋白的分子量泳动，推测上因为 其没有融合蛋白。
实施例7：对RG1表达进行免疫组织化学染色
RG1蛋白的表达是由LifeSpan生物科学公司在多种人 体组织中测定的，包括肾，肺，胰腺，肌，脑和前列腺。 另外的前列腺组织得自史丹佛大学泌尿系，并由Berlex测 试。将组织切片用标准方法脱蜡。将多克隆抗体RGl-3C用 作初级抗体，检测系统由载体ABC-AP试剂盒(AK5002) 和载体红色底物试剂盒(Sk5002)组成。作为阴性对照， 在没有初级抗体的情况下进行染色。
在上述说明书中提及的所有出版物和专利在此均并入参 考。本发明结合特异的实施方案已经进行阐述，但本领域 技术人员应意识到在不偏离本发明精神和范围的条件下可 以对本发明加以修改和用等价物代替。另外，对本发明可 进行许多修改以适应特殊情况，材料，组合物，加工，加 工步骤等。所有这些修改应包含在所附权利要求范围内。
本申请要求1999年12月16日提请的美国临时专利申 请No.60/172370的优先权，该申请在此并入参考。
发明背景
序列表
<110>Harkins，Richard
Parkes，Deborah
Parry，Gordon
Schneider，Douglas
Steinbrecher，Renate
<120>编码新RG1多肽的DNA
<130>51791AUSM1
<140>
<141>
<150>60/172,370
<151>1999-12-l6
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>1785
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(296)..(1291)
<400>1
agaaaggggt gcggcagcac tgccagggga agagggtgat ccgacccggg gaaggtcgct 60
gggcagggcg agttgggaaa gcggcagccc ccgccgcccc cgcagcccct tctcctcctt 120
tctcccacgt cctatctgcc tctcgctgga ggccaggccg tgcagcatcg aagacaggag 180
gaactggagc ctcattggcc ggcccggggc gccggcctcg ggcttaaata ggagctccgg 240
gctctggctg ggacccgacc gctgccggcc gcgctcccgc tgctcctgcc gggtg atg 298
Met
1
gaa aac ccc agc ccg gcc gcc gcc ctg ggc aag gcc ctc tgc gct ctc 346
Glu Asn Pro Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Lys Ala Leu Cys Ala Leu
5 10 15
ctc ctg gcc act ctc ggc gcc gcc ggc cag cct ctt ggg gga gag tcc 394
Leu Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ala Gly Gln Pro Leu Gly Gly Glu Ser
20 25 30
atc tgt tcc gcc gga gcc ccg gcc aaa tac agc atc acc ttc acg ggc 442
Ile Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr Ser Ile Thr Phe Thr Gly
35 40 45
aag tgg agc cag acg gcc ttc ccc aag cag tac ccc ctg ttc cgc ccc 490
Lys Trp Ser Gln Thr Ala Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Leu Phe Arg Pro
50 55 60 65
cct gcg cag tgg tct tcg ctg ctg ggg gcc gcg cat agc tcc gac tac 538
Pro Ala Gln Trp Ser Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp Tyr
70 75 80
agc atg tgg agg aag aac cag tac gtc agt aac ggg ctg cgc gac ttt 586
Ser Met Trp Arg Lys Asn Gln Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp Phe
85 90 95
gcg gag cgc ggc gag gcc tgg gcg ctg atg aag gag atc gag gcg gcg 634
Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu Ile Glu Ala Ala
100 105 110
ggg gag gcg ctg cag agc gtg cac gcg gtg ttt tcg gcg ccc gcc gtc 682
Gly Glu Ala Leu Gln Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala Val
115 120 125
ccc agc ggc acc ggg cag acg tcg gcg gag ctg gag gtg cag cgc agg 730
Pro Ser Gly Thr Gly Gln Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val Gln Arg Arg
130 135 140 145
cac tcg ctg gtc tcg ttt gtg gtg cgc atc gtg ccc agc ccc gac tgg 778
His Ser Leu Val Ser Phe Val Val Arg Ile Val Pro Ser Pro Asp Trp
150 155 160
ttc gtg ggc gtg gac agc ctg gac ctg tgc gac ggg gac cgt tgg cgg 826
Phe Val Gly Val Asp Ser Leu Asp Leu Cys Asp Gly Asp Arg Trp Arg
165 170 175
gaa cag gcg gcg ctg gac ctg tac ccc tac gac gcc ggg acg gac agc 874
Glu Gln Ala Ala Leu Asp Leu Tyr Pro Tyr Asp Ala Gly Thr Asp Ser
180 185 190
ggc ttc acc ttc tcc tcc ccc aac ttc gcc acc atc ccg cag gac acg 922
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala Thr Ile Pro Gln Asp Thr
195 200 205
gtg acc gag ata acg tcc tcc tct ccc agc cac ccg gcc aac tcc ttc 970
Val Thr Glu Ile Thr Ser Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser Phe
210 215 220 225
tac tac cca cgg ctg aag gcc ctg cct ccc atc gcc agg gtg aca ctg 1018
Tyr Tyr Pro Arg Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ile Ala Arg Val Thr Leu
230 235 240
gtg cgg ctg cga cag agc ccc agg gcc ttc atc cct ccc gcc cca gtc 1066
Val Arg Leu Arg Gln Ser Pro Arg Ala Phe Ile Pro Pro Ala Pro Val
245 250 255
ctg ccc agc agg gac aat gag att gta gac agc gcc tca gtt cca gaa 1114
Leu Pro Ser Arg Asp Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu
260 265 270
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Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu Cys
275 280 285
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Gly Gly His Cys Gly Arg Leu Gly Thr Lys Ser Arg Thr Arg Tyr Val
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Arg Val Gln Pro Ala Asn Asn Gly Ser Pro Cys Pro Glu Leu Glu Glu
310 315 320
gag gct gag tgc gtc cct gat aac tgc gtc taa gaccagagcc ccgcagcccc 1311
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325 330
tggggccccc cggagccatg gggtgtcggg ggctcctgtg caggctcatg ctgcaggcgg 1371
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taaagtcatc cccaaggctc cagctactct aaattatgtc tccttataag ttattgctgc 1611
tccaggagat tgtccttcat cgtccagggg cctggctccc acgtggttgc agatacctca 1671
gacctggtgc tctaggctgt gctgagccca ctctcccgag ggcgcatcca agcgggggcc 1731
acttgagaag tgaataaatg gggcggtttc ggaagcgtca aaaaaaaaaa aaaa 1785
<210>2
<211>331
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
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260 265 270
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Glu Glu Ala Glu Cys Val Pro Asp Asn Cys Val
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<210>3
<211>19
<212>CNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>3
cgcgcatagc tccgactac 19
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>
gccgcgtccg caaag 15
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：探针
<400>5
aggaagaacc agtacgtcag taacgggctg 30
<210>6
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
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<212>DNA
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<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>7
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<210>8
<211>19
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<220>
<223>人工序列描述：肽
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1 5 10 15
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<210>9
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Leu Phe Arg
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20
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<110>Harkins，Richard
Parkes，Deborah
Parry，Gordon
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<120>编码新RG1多肽的DNA
<130>51791AUSM1
<140>
<141>
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<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
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1
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Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu Thr
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