山羊黄体细胞系的建立方法
阅读：230发布：2020-06-10
专利汇可以提供山羊黄体细胞系的建立方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 动物细胞系领域，具体涉及一种妊娠早期萨能奶山羊黄 体细胞 系的建立方法。本发明利用怀孕6-8周的健康萨能奶山羊的黄体组织为细胞来源，用胶原酶消化黄体组织从而得到离散的黄体细胞，并在体外进行扩大培养和纯化。利用脂质体把人端粒酶逆转录酶基因 转染 纯化后的黄体细胞内，并用抗性基因进行筛选，挑取单克隆进行扩大培养。然后通过组织细胞化学 染色 进行鉴定。本发明黄体细胞系细胞呈多 角 型或梭型，3β-羟基类固醇脱氢酶染色呈阳性，此外还保持了原代黄体细胞的一些重要特征。，下面是山羊黄体细胞系的建立方法专利的具体信息内容。
1.一种山羊黄体细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原代培养和纯化：取妊娠6-8周的健康萨能奶山羊黄体，无菌条件下消化黄体组织，并把得到的黄体细胞接种到细胞培养瓶里，用DMEM/F12进行培养，所述DMEM/F12含有
15％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素；并置到37℃、5％CO2培养箱进行培养；等细胞长满培养瓶后进行传代，用柠檬酸-胰蛋白酶差速消化进行纯化；
(2)转染和筛选：对细胞纯度达到95％以上的原代黄体细胞利用脂质体转染人端粒酶逆转录酶基因，并用G418进行筛选2-3周，挑取单克隆并用组织细胞化学染色进行鉴定；
(3)扩大培养：对阳性细胞进行扩大培养，3天传代一次，分种率1∶2，待细胞传到30代时进行鉴定试验，并测定转染前后山羊黄体细胞的生长曲线。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)鉴定黄体细胞的方法：通过对细胞内3β-羟基类固醇脱氢酶活性染色，进行类固醇黄体细胞的鉴定，黄体细胞染色后在细胞核周围层深蓝色。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)用450μg/ml G418进行筛选。
山羊黄体细胞系的建立方法
技术领域
背景技术
[0002] 黄体是哺乳动物排卵后在卵巢中形成的一个暂时性的内分泌组织，对于哺乳动物维持正常的生殖功能具有重要作用，此外它受控于脑垂体促性腺激素的调节，其分泌的类固醇激素主要是孕酮。其主要作用：(1)刺激子宫腺的分泌，子宫充血肿胀和子宫黏膜肥厚，保证受精卵着床；(2)保证妊娠早期胎儿的存活。此外还对下丘脑-脑垂体轴，卵巢，输卵管和乳腺等器官具有调节作用。近年来研究发现如果妊娠黄体功能异常或其他药物影响黄体细胞孕酮的分泌，则会影响妊娠的维持和胎儿的存活。
[0003] 黄体作为成年雌性动物体内具有周期性生长和退化特性的组织之一，其组织结构的规律性变化，调节和分泌的机制一直是许多研究的重点，也是近年来研究最热的内分泌器官之一。此外黄体细胞在体外培养时间有限，不同代数细胞之间在形态，生物特性和基因表达水平上都有很大的差异，这也造成了不同试验室之间的实验结果很难进行比较。
[0004] 因此建立一种能保持原代黄体细胞的生物学特征和长期稳定传代的永生化的黄体细胞系对于阐明黄体细胞的生理调节功能具有重要意义。
[0005] 由于自发永生化的几率非常小，因此目前建立细胞系常用的方法主要有：放射性，癌基因和原癌基因的转染，DNA致瘤病毒。这些方法常常使永生化的细胞核型不稳定，表型改变和具有致瘤性等诸多缺点，限制了其广泛应用。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种能保持原代黄体细胞孕酮分泌等生物学特征的山羊黄体细胞系，为研究黄体细胞的生长，生理生化和孕酮分泌调节的分子机制提高了细胞模型和研究工具。
[0007] 本发明的另一目的是提供分离和纯化原代山羊黄体细胞的方法。
[0008] 本发明通过下述方法和步骤建立山羊黄体细胞系
[0009] 1原代培养和纯化
[0010] 通过检查胎儿大小和观察发育程度来判定妊娠期，胶原酶消化黄体组织使其成单个细胞或者细胞团，并接种细胞瓶进行培养，并柠檬酸-胰酶消化，倒置显微镜下观察，约20％～40％的细胞收缩呈圆形时，加入培养液终止消化，并吹打，移去悬浮的细胞，继续培养剩余，并重复几次。直至纯度达到95％以上。
[0011] 通过组织细胞化学对细胞进行鉴定，阳性细胞的细胞核周围成蓝色。(这样应该是蓝色)
[0012] 2转染和筛选
[0013] 用脂质体2000把人端粒酶逆转录基因导入黄体细胞内，转染后加入(450μg/ml)G418进行筛选2-3周，等单克隆形成后，挑取单克隆并用组织细胞化学法进行鉴定。
[0014] 对阳性细胞进行扩大培养，3天传代一次，传代率1∶2，待细胞传到30代时进行鉴定试验，并测定转染前后山羊黄体细胞的生长曲线。
[0015] RT-PCR检测黄体细胞人端粒酶逆转录酶基因mRNA的表到，ELISA法检查端粒酶活性。
[0016] RT-PCR检测转染后黄体细胞内关键基因的表达，用放射免疫法(RIA)测定转染后黄体细胞分泌孕酮的量。
[0017] 核型分析转染后黄体细胞染色体数量的变化。
[0018] 软琼脂试验和裸鼠致瘤性试验检测转染后黄体细胞是否具有肿瘤转化的特征；如悬浮生长和致瘤性。
[0019] 利用上述方法建立的山羊黄体细胞系，能在体外长期生长和稳定传代，具有下列生物特性：
[0020] (1)与原代细胞形态相似，永生化的细胞呈多角型或梭型；
[0021] (2)外源性人端粒酶逆转录酶基因能在转染的黄体细胞内稳定表达，而且有较高的端粒酶活性，细胞的增殖能力明显增加；
[0022] (3)该细胞系保持了原代黄体细胞的一些重要特征，如分泌孕酮，表达黄体细胞内的关键基因：StAR，P450scc，3β-HSD，LH-R；
[0023] (4)核型分析，该细胞系没有发生染色体的丢失或增加，核型稳定；
[0025] 图1为倒置显微镜下转染前后山羊黄体细胞的形态：A：原代山羊黄体细胞(100×)；B：转染后15代山羊黄体细胞(hTERT-GLCs)(100×)；C：转染后30代山羊黄体细胞(100×)；D：转染后55代山羊黄体细胞(100×)；
[0026] 图2组织细胞化学染色鉴定山羊黄体细胞：类固醇脱氢酶染色鉴定(阳性细胞的细胞核周围显蓝色，100×)；
[0027] 图3转染前后山羊黄体细胞生长曲线：转染后第55代后山羊黄体细胞(hTERT-GLCs)和第2代原代山羊黄体细胞(GLCs)；
[0028] 图4RT-PCR检测转染前后山羊黄体细胞人端粒酶逆转录酶基因mRNA的表达：转染后山羊黄体细胞第30代(泳道2)和第55代(泳道3)，原代山羊黄体细胞第2代(泳道4)和HeLa细胞(泳道1)作为阳性对照；
[0030] 1：子宫颈癌细胞(HeLa)，2：转染后山羊黄体细胞第30代，3：转染后第55代后山羊黄体细胞，4：第2代原代山羊黄体细胞
[0031] 图6RT-PCR检测转染前后山羊黄体细胞关键基因mRNA的表达；
[0032] 图7 放 射 免 疫 测 定 环 化 腺 苷 酸 (8-Br-cAMP)，22(R)-羟 胆 固 醇(22(R)-hydroxycholesterol)和孕烯醇酮(Pregnenolone)对转染后山羊黄体细胞孕酮分泌量的影响；
[0033] 图8转染后山羊黄体细胞核型分析结果；
[0034] 图9软琼脂试验结果A：HeLa细胞在软琼脂上培养3周(阳性对照)，B：转染后山羊黄体细胞在软琼脂上培养3周；
[0035] 图10裸鼠致瘤性试验结果A：裸鼠接种HeLa细胞2月后接种区组织结构(HE，100×)，组织切片检查发现，细胞排列紊乱，极性消失，向深部浸润，可见大量核分裂相，呈现恶性肿瘤的特征。B：裸鼠接种第55代转染后山羊黄体细胞2月后接种区组织结构(HE，
100×)，组织结构良好，和正常组织比未见有明显的区别。
100×)，组织结构良好，和正常组织比未见有明显的区别。
具体实施方式
[0036] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0037] 一.细胞培养
[0038] 1.山羊黄体细胞的分离和纯化
[0039] 在当地屠宰场取妊娠6-8周的健康萨能奶山羊的卵巢(通过检查胎儿大小和观察发育程度来判定妊娠期)，放到4℃加有双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)中，30min内带回实验3
室超净台内，剥离黄体组织并尽可能剪成1mm 组织碎块，加入0.2％(质量体积比)胶原酶II 2ml，置37℃恒温水浴锅中消化黄体组织15min后，加入含15％胎牛血清，100IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM/F12(Dulbecco’s Modified Eagle’s andHAM’S F-12，
1∶1(v/v)with 15mmol/I HEPES)培养基，吹到分散细胞，并用150μm尼龙膜进行过滤，除去未消化完全的组织块，收集过滤液进行离心并重复洗涤3次，然后用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮沉淀，用台盼蓝排斥试验检测细胞的活性，并调整细胞密度使活细
6 2
胞达到1×10 个/ml，接种于25cm 培养瓶内，放置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。3天后进行换液，待细胞长满瓶底时进行传代，用柠檬酸-胰蛋白酶进行差速消化纯化，并根据组织细胞化学染色结果，在显微镜下计算阳性细胞所占细胞总数的比例，待黄体细胞纯度达到95％以上时进行后续转染。
室超净台内，剥离黄体组织并尽可能剪成1mm 组织碎块，加入0.2％(质量体积比)胶原酶II 2ml，置37℃恒温水浴锅中消化黄体组织15min后，加入含15％胎牛血清，100IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM/F12(Dulbecco’s Modified Eagle’s andHAM’S F-12，
1∶1(v/v)with 15mmol/I HEPES)培养基，吹到分散细胞，并用150μm尼龙膜进行过滤，除去未消化完全的组织块，收集过滤液进行离心并重复洗涤3次，然后用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮沉淀，用台盼蓝排斥试验检测细胞的活性，并调整细胞密度使活细
6 2
胞达到1×10 个/ml，接种于25cm 培养瓶内，放置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。3天后进行换液，待细胞长满瓶底时进行传代，用柠檬酸-胰蛋白酶进行差速消化纯化，并根据组织细胞化学染色结果，在显微镜下计算阳性细胞所占细胞总数的比例，待黄体细胞纯度达到95％以上时进行后续转染。
[0040] 2.组织细胞化学染色鉴定黄体细胞
[0041] 通过对细胞内3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)活性染色，进行类固醇黄体细胞的鉴定，黄体细胞染色后在细胞核周围层深蓝色。培养的细胞接种到6孔板里，24h后移去培养基，并用PBS洗两次，用1％的甲醛固定20min，然后加入染液(0.1M的PBS液中含有；0.1％BSA，1.5mM NAD，0.25mM氯化硝基四氮唑和0.2mM脱氢异雄甾酮)，在37℃避光放置
4h，然后用PBS液洗两次，镜下观察拍照(见图2)。
4h，然后用PBS液洗两次，镜下观察拍照(见图2)。
[0042] 3转染和筛选
[0043] 第2代原代黄体细胞用0.25％胰酶消化，用不含双抗的培养基终止消化并接种到六孔板。待细胞达到90％以上汇合时，移去培养基，并用不含血清的基础培养基洗涤两次。根据Invitrogen公司的脂质体2000说明书进行转染，用脂质体2000把人端粒酶逆转录基因导入黄体细胞内，转染后加入(450μg/ml)G418进行筛选2-3周，等单克隆形成后，挑取单克隆，用步骤2组织细胞化学染色鉴定黄体细胞。
[0044] 4阳性细胞扩大培养：组织细胞化学染色鉴定的阳性细胞接种到25cm2细胞培养瓶里，用低浓度G418维持培养，每隔3天传代一次，分种率1∶2，体外传至30代时进行生物学指标的检查和验证。
[0045] 5转染前后山羊黄体细胞的生长曲线的测定
[0046] 将第2代山羊黄体细胞和第55代转染后的山羊黄体细胞按1×104个细胞/孔接种于24孔培养板，3d换液1次，每天用0.25％胰蛋白酶消化细胞，血细胞计数板计数。每个孔计数3次，每次取3个孔，取其平均值绘制细胞的生长曲线，并按以下公式计算群体倍增时间(PDT)：PDT＝[log2/(LogNt-logN0)]×t，其中N0和Nt分别代表接种时和培养t小时后的细胞数(见图3)。
[0047] 6RT-PCR检测转染后山羊黄体细胞端丽酶基因的表达
[0048] 参照Invitrogen公司的Trizol Reagent的操作说明从第30代，55代转染后山羊黄体细胞和第2代山羊黄体细胞中提取总的mRNA，并进行逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增，扩增条件；先在95℃下变性3min，然后95℃，30s，56℃，40s，72℃，60s，35个循环，最后在72℃延伸10min。取上述PCR产物6μL于0.2％的琼脂糖凝胶中电泳，120V，30min电泳完毕后溴化乙锭显色，于紫外凝胶成像系统观察、拍照(见图4)。
[0049] 7端粒酶活性检测
[0050] 按照试剂盒TeloTAGGGTelomerasePCRELISAPLUSkit(Roche)中的操作说明进行：端5
粒酶提取，端粒酶延伸和PCR扩增反应，ELISA测定。收集2×10 个细胞，用Lysis buffer在冰上裂解30min。12000rpm，20min，取上1μl裂解上清液作为端粒酶模板，按照试剂盒的PCR扩增反应条件进行扩增，阴性对照用RNAase处理。扩增结束后，按ELISA要求和加样顺序进行显色和吸光度测定(见图5)。
粒酶提取，端粒酶延伸和PCR扩增反应，ELISA测定。收集2×10 个细胞，用Lysis buffer在冰上裂解30min。12000rpm，20min，取上1μl裂解上清液作为端粒酶模板，按照试剂盒的PCR扩增反应条件进行扩增，阴性对照用RNAase处理。扩增结束后，按ELISA要求和加样顺序进行显色和吸光度测定(见图5)。
[0051] 8RT-PCR检测转染后山羊黄体细胞内关键基因的表达
[0052] 利用步骤6中提取的mRNA转录成的cDNA进行PCR，PCR扩增反应条件同步骤3一样，然后进行凝胶电泳，成像并拍照(见图6)。
[0053] 9放射免疫检测转染山羊黄体细胞的孕酮分泌
[0054] 根据碘【125I】孕酮放射免疫分析药盒(天津九鼎医学生物工程有限公司)的说明书进行：样品准备和处理。将传至第55代山羊黄体细胞接种于12孔培养板，24h移去培养基，并分别加入含有不同浓度的环化腺苷酸类似物，22-羟胆固醇和孕烯醇酮，每个浓度重复3孔，24h收集上清，4℃，3500r/min离心15min取上清，放-20℃保存待测。根据给定的标准曲线，算出待测样品中孕酮的含量(见图7)。
[0055] 10核型分析
[0056] 取对数生长期细胞，加秋水仙素至浓度0.1μg/mL继续培养6h，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，PBS液洗涤细胞1次，800r/min离心5min，弃上清。用75mmol/L KCl重悬细胞，室温放置10min，然后一些甲醇/冰醋酸(v/v 3∶1)固定液，混匀后4℃离心，弃上清，继续加固定液，4℃放置30min，4℃离心，弃上清，根据细胞多少加适量固定液重悬细胞，后滴加在4℃预冷的玻片上，空气快速干燥，用姬姆萨染色10min左右，常规脱水封片，油镜下观察(见图8)。
[0057] 11软琼脂悬浮试验
[0058] 先在12孔培养板底层铺上含0.35％琼脂，取第55代转染后山羊黄体细胞，制备成单细胞悬液，并稀释成2000个细胞/ml，然后和1.2％的琼脂按1∶1(体积)混合，作为上层胶。培养3周后相差显微镜下观察克隆形成情况。HeLa细胞为阳性对照(结果见图9)。
[0059] 12裸鼠致瘤性试验
[0060] 收集第55代转染后上样黄体细胞，用培养基重悬并调整细胞密度为1×106个/ml，于6周龄裸鼠臀部皮下无菌接种细胞悬液0.1mL，定期观察。HeLa细胞为阳性对照。两月后裸鼠脱臼致死，观察肿瘤有无并对接种部位进行组织切片检查(HE染色)(结果见图10)。
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