概要
I.引言
II.心肌肌钙蛋白
III.心肌肌钙蛋白的标记物
 A.肌钙蛋白的结合伴体
  1.抗体
  2.交叉反应性抗体
 B.和结合伴体一起使用的荧光部分
  1.染料
  2.量子点
 C.结合伴体-荧光部分组合物
IV.心肌肌钙蛋白的高灵敏分析
 A.样品
 B.样品制备
 C.肌钙蛋白的检测和浓度的测定
V.适于肌钙蛋白的高灵敏分析的仪器和系统
 A.装置/系统
 B.单一微粒分析器
  1.电磁辐射源
  2.毛细流动池
  3.动力
  4.检测器
 C.采样系统
 D.样品制备系统
 E.样品回收
VI.使用心肌肌钙蛋白的高灵敏分析的方法
 A.样品
 B.诊断、预后或治疗方法的确定
  1.急性心肌梗塞
  2.AMI以外的状态
   a.心脏毒性
 C.商业方法
VII.组合物
VIII.试剂盒
I.引言
本发明提供了用于高灵敏检测肌钙蛋白如心肌肌钙蛋白的组合物 和方法。心肌独有的肌钙蛋白的心肌异型体(心肌肌钙蛋白I和/或T)释 放进入血液表明心肌损伤，并提供了其用作诊断或预后标志物、或者用 于帮助确定治疗的基础。
肌肉中的肌钙蛋白复合物由肌钙蛋白I、C和T组成。肌钙蛋白C以两 种异型体存在，一种来自心肌和慢缩肌，一种来自快缩肌；因为肌钙蛋 白C实际上在所有的横纹肌中发现，其作为特异性标志物的用途是有限 的。相反，肌钙蛋白I和T在慢缩肌、快缩肌和心肌中以不同的异型体表 达。肌钙蛋白I和T的独特心肌异型体使得它们在免疫学上与骨骼肌的其 它肌钙蛋白相区别。因此，心肌肌钙蛋白I和T释放进入血液表明心肌损 伤，并提供了其用作诊断或预后标志物，或者用于帮助确定治疗的基础。
目前使用的心肌损伤的标志物具有限制临床应用的缺点。心肌酶分 析已经形成为确定是否出现损伤心肌的基础。遗憾的是，标准的肌酸激 酶-MB(CK-MB)分析在直至胸痛开始后10-12小时才能可靠地排除梗 塞形成。更早期的诊断对于纤维蛋白溶解治疗和治疗类选方面将具有非 常独特的优势。
因为在健康个体的循环中发现的肌钙蛋白的水平非常低，且心肌特 异性肌钙蛋白不会来自于心脏外的来源，所以肌钙蛋白是非常灵敏且特 异性的心脏损伤的标志物。除了心肌梗塞，许多其它状态也能引起心肌 损伤，而且这样的损伤的早期检测证明对临床医生是有用的。但是，现 有的心肌肌钙蛋白的检测和定量方法没有足够的灵敏度，直至释放进入 血液的心肌肌钙蛋白水平达到异常高的浓度时，如0.1ng/ml或更高时， 才能检测到。
因此，本发明的方法和组合物包括高灵敏检测和定量心肌肌钙蛋白 的方法和组合物，和基于这种高灵敏检测和定量的诊断、预后和/或确定 治疗的组合物和方法。
II.心肌肌钙蛋白
当心肌肌钙蛋白的两种独特形式，心肌肌钙蛋白I(cTnI)和心肌肌 钙蛋白(cTnT)从心肌释放进入血液时，在血液中存在各形式的几个类 型。其中包括由这两种形式彼此形成的和/或与心肌肌钙蛋白C(cTnC) 形成的各种复合物。而且，这两种形式实际上会发生即时的蛋白水解降 解，从而产生多种片段。另外，各种磷酸化和氧化形式的肌钙蛋白也可 能存在于血液中。参见，例如，美国专利6 991 907号，其在本文完整引 入作为参考。除非另有说明，本文使用的“心肌肌钙蛋白”包括所有形式 的心肌肌钙蛋白，包括
在某些实施方式中，发明提供了检测和/或测定总心肌肌钙蛋白(即， 例如血液、血清或血浆样品的样品中的所有或主要部分的心肌肌钙蛋白 的总和，不管它是游离的、复合的、蛋白水解(proteotlytic)片段、磷 酸化的、氧化的还是经其它修饰的)的浓度的方法和组合物。在某些实 施方式中，心肌肌钙蛋白是cTnI，在其它实施方式中，心肌肌钙蛋白是 cTnT，且在另外的其它实施方式中，心肌肌钙蛋白是cTnI和cTnT。可以 理解，不需要获得绝对的总测量值，只要确定与总量一致的比例就可以， 其可以和标准值比较。也可以理解，如果一种形式的肌钙蛋白是总量中 较少的组分，那么该形式检测为不存在或低水平，将不会明显影响肌钙 蛋白总量的测量。因此，本文所用的“总心肌肌钙蛋白”，是指计划测量 样品中的所有或基本上所有形式的特定的心肌肌钙蛋白，例如，所有的 cTnI或所有的cTnT，其中，样品间的一致性使得可以通过样品和标准的 比较，或一个样品和另一个样品的比较来得出临床相关的结论。
在某些实施方式中，本发明提供了检测和/或测定样品中肌钙蛋白各 种形式中的一种或多种作为独立个体的浓度的方法和组合物，例如，复 合的cTnI、游离的cTnI、混杂的cTnI(例如，氧化的或磷酸化的)，或复 合的cTnT、游离的cTnT、混杂的cTnT(例如，氧化的或磷酸化的)，且 通常能够提供样品中该形式的浓度。在后面的实施方式中，可以确定不 同个体的比例或绝对值。因此，在某些实施方式中，本发明提供了检测 和通常测定一种或多种形式的复合肌钙蛋白、或一种或多种肌钙蛋白片 段、或一种或多种氧化或磷酸化形式的肌钙蛋白的浓度的方法。在某些 实施方式中，检测多于一种的形式，且可以测定各种形式的浓度，例如， 通过对单一的样品进行不同个体的多元分析，或对相同样品或类似样品 的等分试样进行单独的分析。可以获得各种形式的浓度的比例。例如， 可以确定特定形式的心肌肌钙蛋白(例如片段、复合物、或修饰形式) 的浓度与总心肌肌钙蛋白浓度的比例。这些比例和/或绝对值能够提供有 意义的临床信息。例如，心肌肌钙蛋白的片段的相对比例能够表明自释 放进入血液以来的时间长度，从而，间接地表明例如自心肌梗塞以来的 时间长度。参见，例如，美国专利6 991 907号，其在本文完整引入作为 参考。
III.心肌肌钙蛋白标记物
在某些实施方式中，本发明提供了包括用于高灵敏检测和定量心肌 肌钙蛋白的标记物的方法和组合物。
本领域的技术人员可以认识到，许多策略可用于标记靶分子，使其 在微粒混合物中能够被检测或区分出来。可以使用任何已知的方法连接 标记物，包括利用标记物和靶标之间的非特异性或特异性相互作用。标 记物可以提供可检测的信号或影响微粒在电场中的迁移率。而且，可以 直接地或通过结合伴体完成标记。
在某些实施方式中，标记物包括连接在荧光部分上的肌钙蛋白的结 合伴体。
A.肌钙蛋白的结合伴体
可以使用任何合适的对于要检测的心肌肌钙蛋白形式具有所需的 特异性的结合伴体。例如，可以使用对于所有或基本上所有cTnI形式特 异性的结合伴体，或可以使用对于所有或基本上所有cTnT形式特异性的 结合伴体；一般地，这样的结合伴体结合到很可能在样品中发现的心肌 肌钙蛋白的所有或大部分不同形式所共有的心肌肌钙蛋白的区域。在某 些实施方式中，可以使用对一种或多种心肌肌钙蛋白的特定形式特异性 的结合伴体，例如，复合的cTnI、游离的cTnI、混杂的cTnI(例如，氧 化的或磷酸化的)的结合伴体，或复合的cTnT、游离的cTnT、混杂的cTnT (例如，氧化的或磷酸化的)的结合伴体。结合伴体为本领域已知，且 包括，例如，适体(aptamer)、凝集素和受体。有用的和通用类型的结 合伴体是抗体。
1.抗体
在某些实施方式中，结合伴体是心肌肌钙蛋白的特异性抗体。本文 使用的术语“抗体”是一个广义的术语且在其一般意义上使用，包括但不 限于，指天然产生的抗体及非天然产生的抗体，包括，例如，单链抗体、 嵌合抗体、双功能抗体和人源化抗体及其抗原结合片段。在某些实施方 式中，抗体是cTnI特异性的。在某些实施方式中，抗体是cTnT特异性的。 在某些实施方式中，标记物包括cTnI和cTnT两者的抗体。抗体可以是对 于所有或基本上所有形式的心肌肌钙蛋白特异性的，例如，对于所有或 基本上所有形式的cTnI或对于所有或基本上所有形式的cTnT特异性的。 在某些实施方式中，可以使用对于一种或多种特定形式的心肌肌钙蛋白 特异性的抗体，例如，复合的cTnI、游离的cTnI、混杂的cTnI(例如， 氧化的或磷酸化的)的结合伴体，或复合的cTnT、游离的cTnT、混杂的 cTnT(例如，氧化的或磷酸化的)的结合伴体。本发明也包括了抗体的 混合物，例如，cTnI和cTnT抗体的混合物，或各种形式肌钙蛋白(游离 的、复合的，等等)的抗体的混合物，或混合物的混合物。
可以理解，对于激起(raise)抗体的肌钙蛋白的表位或区域的选择将 决定其特异性，例如，对于全肌钙蛋白、特定片段、复合的肌钙蛋白、 修饰的肌钙蛋白等等的特异性。在某些实施方式中，抗体对于心肌肌钙 蛋白的特定的氨基酸区域是特异性的。在某些实施方式中，抗体对于人 心肌肌钙蛋白I的氨基酸27-41是特异性的。单克隆抗体和多克隆抗体都 可以作为结合伴体使用。在某些实施方式中，抗体是多克隆抗体。在某 些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，抗体是对于人 心肌肌钙蛋白I的氨基酸27-41特异性的多克隆抗体。在某些实施方式中， 这种抗体不受肝素、磷酸化作用、氧化作用和肌钙蛋白复合物形成的影 响，且不会与骨骼肌的肌钙蛋白I交叉反应。
生产抗体的方法早已建立。在FEBS Lett.270，57-61(1990)和 Genomics 21，311-316(1994)中描述了肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的心肌特异 性序列。本领域的技术人员可以认识到，可使用许多方法生产抗体，例 如，在Antibodies，A Laboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)，Cold Spring Harbor，N.Y.中描述的方法。 本领域的技术人员也可以理解，也可以使用各种方法(Antibody Engineering：A Practical Approach(Borrebaeck，C.等人)，1995，Oxford University Press，Oxford；J.Immunol.149，3914-3920(1992))根据基因信 息制备模拟抗体的结合片段或Fab片段。在美国专利5579687、6 991 907 号及在美国专利申请20050164317号中公开了产生针对肌钙蛋白的各种 复合物、片段、磷酸化形式和氧化形式的抗体的方法，本文将它们完整 引入作为参考。在国际专利申请PCT/US94/05468号中描述了模拟肌钙蛋 白I的心肌特异性序列的包含14个氨基酸的合成肽，和用于制备该肽的抗 体的方法。也可以商购游离和复合的心肌肌钙蛋白的单克隆抗体和多克 隆抗体(HyTest，HyTest Ltd.，Turku Finland；Abcam Inc.，Cambridge，MA， USA，Life Diagnostics，Inc.，West Chester，PA，USA；Fitzgerald Industries International，Inc.，Concord，MA 01742-3049 USA；BiosPacific，Emeryville， CA)。
在某些实施方式中，抗体是哺乳动物的抗体，例如，山羊多克隆抗 cTnI抗体。抗体可以是对于cTnI的特定区域特异性的，例如，对于人心 肌肌钙蛋白I的氨基酸27-41特异性的。捕获结合伴体和检测结合伴体对， 例如，捕获和检测抗体对，可用于本发明的某些实施方式中。因此，在 某些实施方式中，使用异相分析方案，其中通常使用两种结合伴体，例 如，两种抗体。一种结合伴体是捕获伴体，通常固定于固体载体上，另 一种结合伴体是检测结合伴体，一般具有可检测的附加标记物。在某些 实施方式中，一对中的捕获结合伴体成员是对于所有或基本上所有形式 的心肌肌钙蛋白特异性的抗体。举例来说，抗体，例如，对于游离的心 肌肌钙蛋白I(cTnI)的氨基酸41-49和与其它肌钙蛋白成分形成复合物 的cTnI特异性的单克隆抗体。优选地，这种抗体不受肝素、磷酸化作用、 氧化作用和肌钙蛋白复合物形成影响，且不会与骨骼肌的肌钙蛋白I交叉 反应。因此，据认为抗体结合总cTnI。另一例子是对于心肌肌钙蛋白I (cTnI)的氨基酸87-91特异性的且不会与骨骼肌的肌钙蛋白I交叉反应 的单克隆抗体。这样的抗体可从BiosPacific，Emeryville，CA获得，其它的 抗体对是已知的或能够设计的。
交叉反应性抗体  在某些实施方式中，使用与各种物种交叉反应的 抗体作为捕获抗体、检测抗体或作为两者是有利的。这样的实施方式包 括通过测定释放进入血液的例如作为心肌损伤标志物的心肌肌钙蛋白 测量药物毒性。交叉反应性抗体允许在例如非人类的一个物种上进行毒 性研究，并在分析试剂中使用同样的抗体或抗体对将结果直接转到如人 类的另一物种的研究或临床观察上，从而减少分析之间的变易性。因此， 在某些实施方式中，一种或多种作为标志物(例如，如心肌肌钙蛋白I的 心肌肌钙蛋白)的结合伴体使用的抗体可以是交叉反应性抗体。在某些实 施方式中，抗体与来自选自人、猴、狗和小鼠的至少两个物种的标志物 (例如，心肌肌钙蛋白)发生交叉反应。在某些实施方式中，抗体与来自 人、猴、狗和小鼠的所有种类的标志物(例如，心肌肌钙蛋白)发生交叉 反应。
B.和结合伴体一起使用的荧光部分
在某些实施方式中，例如抗体的结合伴体连接在荧光部分上。该部 分的荧光足够允许在单分子检测器(如本文所述的单分子检测器)中检 测。本文使用的术语“荧光部分”包括一种或多种荧光体，其总的荧光使 得该部分可以在本文所述的单分子检测器中检测到。因此，荧光部分可 以包括单一的个体(例如，量子点或荧光分子)或多个个体(例如，多 个荧光分子)。可以理解，本文使用的术语“部分”指一组荧光体，例如， 多个荧光染料分子，各单个个体可以单独地连接在结合伴体上，或多个 个体可以连接在一起，只要作为一组的个体提供足够的检测荧光即可。
一般地，所述部分的荧光包括对量子效率和缺乏光漂白性能进行组 合以使得该部分足以在单分子检测器中在背景水平之上检测到，并具有 达到希望的分析检测水平、准确度及精密度所必需的相容性。例如，在 某些实施方式中，荧光部分的荧光使得其允许在本文所述的装置中以低 于约10、5、4、3、2或1pg/ml的检测水平和低于约20、15、14、13、12、 11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％或更低的变异系数(例如，约10％ 或更低)检测和/或定量肌钙蛋白。在某些实施方式中，荧光部分的荧光 使得其允许在本文所述的装置中以低于约5pg/ml的检测限和低于约10 ％的变异系数检测和/或定量肌钙蛋白。本文所用的术语“检测限”包括可 以确认样品中含有目标物质分子的最低浓度，例如，第一非零值。它可 以通过零点的变异性和标准曲线的斜率确定。例如，分析的检测限可以 通过建立标准曲线、确定标准曲线零位值并向该值加上2个标准差来确 定。产生等于该值的信号的目标物质浓度是“检测下限”的浓度。
更进一步，该部分具有与其在选择的分析中的用途一致的性质。在 某些实施方式中，分析是免疫分析，其中，荧光部分连接在抗体上；该 部分必须具有使得其不与其它抗体或蛋白质聚集，或产生不超过与所需 的分析准确度及精密度相容的聚集的性质。在某些实施方式中，优选的 荧光部分是具有以下特性的组合的荧光部分，例如染料分子：1)高的吸 收系数；2)高的量子产额；3)高的光稳定性(低的光漂白)；和4)与 标记目标生物分子(例如，蛋白质)的相容性，从而其可以使用本发明 的分析器或系统进行分析(例如，不会导致目标蛋白质沉淀，或荧光部 分连接的蛋白质沉淀)。
在本发明的某些实施方式中可用的荧光部分(例如，单个荧光染料分 子或多个荧光染料分子)可以从其被EM辐射激发时光子发射特征方面 进行限定。例如，在某些实施方式中，本发明利用了当受到在荧光染料 部分的激发波长处发射光的激光器激发时能够发射平均至少约10、20、 30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、 350、400、500、600、700、800、900或1000个光子的荧光染料部分(例 如，单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该荧 光染料部分的直径不低于约5微米的点上，而且其中激光指向该点的总 能量不超过约3微焦耳。可以理解，总能量可以通过激光器的功率输出 和染料部分的暴露时间长度的许多不同组合获得。例如，可以使用功率 输出为1mW的激光器3毫秒，可以使用功率输出为3mW的激光1毫秒， 可以使用功率输出为6mW的激光0.5毫秒，可以使用功率输出为12mW 的激光0.25毫秒，等等。
在某些实施方式中，本发明利用了当被在荧光染料部分的激发波长 处发射光的激光器激发时能够发射平均至少约50个光子的荧光染料部 分(例如，单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包 含该荧光染料部分的直径不低于约5微米的点上，而且其中激光指向该 点的总能量不超过约3微焦耳。在某些实施方式中，本发明利用了当被 在荧光染料部分的激发波长处发射光的激光器激发时能够发射平均至 少约100个光子的荧光染料部分(例如，单个荧光染料分子或多个荧光染 料分子)，其中激光聚焦于包含该荧光染料部分的直径不低于约5微米的 点上，而且其中激光指向该点的总能量不超过约3微焦耳。在某些实施 方式中，本发明利用了当被在荧光染料部分的激发波长处发射光的激光 器激发时能够发射平均至少约150个光子的荧光染料部分(例如，单个荧 光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该荧光染料部分 的直径不低于约5微米的点上，而且其中激光指向该点的总能量不超过 约3微焦耳。在某些实施方式中，本发明利用了当被在荧光染料部分的 激发波长处发射光的激光器激发时能够发射平均至少约200个光子的荧 光染料部分(例如，单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光 聚焦于包含该荧光染料部分的直径不低于约5微米的点上，而且其中激 光指向该点的总能量不超过约3微焦耳。在某些实施方式中，本发明利 用了当被在荧光染料部分的激发波长处发射光的激光器激发时能够发 射平均至少约300个光子的荧光染料部分(例如，单个荧光染料分子或多 个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该荧光染料部分的直径不低于约 5微米的点上，而且其中激光指向该点的总能量不超过约3微焦耳。在某 些实施方式中，本发明利用了当被在荧光染料部分的激发波长处发射光 的激光器激发时能够发射平均至少约500个光子的荧光染料部分(例如， 单个荧光染料分子或多个荧光染料分子)，其中激光聚焦于包含该荧光染 料部分的直径不低于约5微米的点上，而且其中激光指向该点的总能量 不超过约3微焦耳。
在某些实施方式中，荧光部分包括平均至少约1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10个荧光体(例如荧光分子)。在某些实施方式中，荧光部分包 括平均不超过约2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个荧光体，例如荧光 分子。在某些实施方式中，荧光部分包括平均约1-11、或约2-10、或约 2-8、或约2-6、或约2-5、或约2-4、或约3-10、或约3-8、或约3-6、或约 3-5、或约4-10、或约4-8、或约4-6、或约2、3、4、5、6或大于约6个荧 光体。在某些实施方式中，荧光部分包括平均约2-8个连接的荧光部分。 在某些实施方式中，平均为约2-6个荧光体。在某些实施方式中，荧光部 分包括平均约2-4个荧光体。在某些实施方式中，荧光部分包括平均约 3-10个荧光体。在某些实施方式中，荧光部分包括平均约3-8个荧光体。 在某些实施方式中，荧光部分包括平均约3-6个荧光体。“平均”意味着在 作为本发明的标记物组的代表性样品的给定样品中(其中，样品包含多个 结合伴体-荧光部分单元)，如通过标准分析方法确定的，组成荧光部分 的特定荧光体与结合伴体的摩尔比对应于所给定的数值或数值范围。例 如，在其中标记物包括作为抗体的结合伴体和包括多个具有特定吸收的 荧光染料分子的荧光部分的实施方式中，可以使用分光光度分析法，其 中，将标记物溶液稀释至合适的水平，并在280nm测定吸光度以测定蛋 白质(抗体)的摩尔浓度，和在例如650nm(对于AlexaFluor 647)测定 吸光度以测定荧光染料分子的摩尔浓度。后者和前者摩尔浓度的比值代 表连接在各个抗体上的荧光部分中荧光体(染料分子)的平均数。
1.染料
在某些实施方式中，本发明利用了包括荧光染料分子的荧光部分。 在某些实施方式中，本发明利用了被在分子的激发波长处发射光的激光 器激发时能够发射至少约50个光子的荧光染料分子，其中激光聚焦于包 含该分子的直径不低于约5微米的点上，而且其中激光指向该点的总能 量不超过约3微焦耳。在某些实施方式中，本发明利用了被在分子的激 发波长处发射光的激光器激发时能够发射至少约75个光子的荧光染料 分子，其中激光聚焦于包含该分子的直径不低于约5微米的点上，而且 其中激光指向该点的总能量不超过约3微焦耳。在某些实施方式中，本 发明利用了被在分子的激发波长处发射光的激光器激发时能够发射至 少约100个光子的荧光染料分子，其中激光聚焦于包含该分子的直径不 低于约5微米的点上，而且其中激光指向该点的总能量不超过约3微焦 耳。在某些实施方式中，本发明利用了被在分子的激发波长处发射光的 激光器激发时能够发射至少约150个光子的荧光染料分子，其中激光聚 焦于包含该分子的直径不低于约5微米的点上，而且其中激光指向该点 的总能量不超过约3微焦耳。在某些实施方式中，本发明利用了被在分 子的激发波长处发射光的激光器激发时能够发射至少约200个光子的荧 光染料分子，其中激光聚焦于包含该分子的直径不低于约5微米的点上， 而且其中激光指向该点的总能量不超过约3微焦耳。
下面的表1给出了可用于本发明的荧光部分的荧光体的非穷尽的列 表。在某些实施方式中，荧光体选自Alexa Flour 488、532、647、700、 750、荧光素、B-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、PBXL-3及Qdot 605。
表1 荧光体






用于本发明的合适的染料包括修饰的羰花青染料。羰花青染料的修 饰包括羰花青染料的吲哚环的修饰，以使得3号位置具有反应性基团 或偶联物质。吲哚环的修饰提供的染料偶联物比用通过1位的氮原子结 合的具有相似结构的羰花青染料标记的偶联物在蛋白质、核酸和其它生 物聚合体上产生均匀的和实质上更高的荧光。除了在实质上相同的波长 处比结构类似的染料具有更强烈的荧光发射和在与生物高聚物偶联后 在吸收光谱上减少假象外，修饰的羰花青染料在吸收峰比结构类似的染 料具有更好的光稳定性和更高的吸收(消光系数)。因此，在使用修饰 的染料及其偶联物的分析中修饰的羰花青染料产生了更高的灵敏性。优 选的修饰的染料包括含有至少一个取代的吲哚环系统的化合物，其 中，在吲哚环3位碳上的取代基包含化学反应性的基团或偶联物质。 其它染料化合物包括含氮杂吲哚(azabenzazolium)环部分和至少一个 磺酸部分的化合物。美国专利6 977 305描述了能够在本发明的各种实施 方式中用来检测单独的微粒的修饰的羰花青染料，其在本文完整引入作 为参考。因此，在某些实施方式中，本发明的标记物利用包括取代的吲 哚环系统的荧光染料，其中，在吲哚环3位碳上的取代基包含化学 反应性的基团或偶联物质基团。
在某些实施方式中，标记物包括荧光部分，荧光部分包含一种或多 种Alexa染料(Molecular Probe，Eugene，OR)。美国专利6977 305、6 974 874、6 130 101和6 974 305公开了Alexa染料，在本文完整引入作为参考。 本发明的某些实施方式利用选自AlexaFluor 647、AlexaFluor 488、 AlexaFluor 532、AlexaFluor 555、AlexaFluor 610、AlexaFluor 680、 AlexaFluor 700和AlexaFluor 750的染料。本发明的某些实施方式利用选 自AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 700和 AlexaFluor 750的染料。本发明的某些实施方式利用AlexaFluor647分子， 其在约650-660nm之间具有最大吸收和在约660-670nm之间具有最大发 射。AlexaFluor 647染料单独使用或与其它AlexaFluor染料组合使用。
另外，目前可得到的有机荧光染料可以通过加入诸如聚乙烯的亲水 基团使其具有较少的疏水性。可替代地，目前的诸如AlexaFluor 647染料 的磺酸化有机荧光染料可以通过变为两性离子而使其具有较少的酸性。 用修饰的荧光染料标记的微粒(如抗体)在免疫分析中可能会较少地与表 面及蛋白质非特异性地结合，从而能够进行具有较高灵敏度和较低背景 的分析。为了提高检测单一微粒的系统的灵敏度而修饰和改进荧光染料 的方法在本领域内是已知的。优选地，修饰在维持高的量子产额的同时， 提高斯托克斯频移。
2 量子点
在某些实施方式中，用于使用本发明的分析器系统检测样品中的分 子的荧光标记部分是量子点。量子点(QDs)，也叫半导体纳米晶体或人 造原子，是在其中任何地方含有100-1000个电子和2-10nm的范围的半导 体晶体。一些量子点的直径为10-20nm。量子点具有高的量子产额，这 使得其在光学应用中尤其有用。量子点是通过形成激子而发荧光的荧光 团，激子被认为是传统荧光团的激发态，但具有高达200纳秒的长得多 的寿命。这种性质为量子点提供了低的光漂白。量子点的能量水平可以 通过改变量子点的大小、形状及量子点电位深度来控制。小的激子量子 点的一个光学特征是显色，其通过点的大小来确定。点越大，就越红， 或越朝向荧光光谱的红端。点越小，就越蓝，或越朝向荧光光谱的蓝端。 决定荧光的能量从而决定荧光的颜色的带隙能量和量子点大小的平方 成反比例。较大的量子点具有更密集地区隔的较多的能量水平，从而允 许量子点吸收含有较低能量的光子，即，那些比较接近光谱红端的光子。 因为点的发射频率取决于带隙，所以可能极为精密地控制点的输出波 长。在某些实施方式中，用单一微粒分析器系统检测的蛋白质用量子点 标记。在某些实施方式中，单一微粒分析器用来检测用一个量子点标记 的蛋白质，并使用滤光器以在不同的波长检测不同的蛋白质。
量子点具有宽激发和窄发射的性质，这使得当使用颜色过滤时，对 于单一样品中的多重目标的多元分析只需要单一的电磁源以解析个别 的信号。因此，在某些实施方式中，分析器系统包括一个连续波激光器 和各使用一个量子点标记的微粒。胶态制备的量子点是自由移动的，且 可以通过金属配位官能团连接在各种分子上。这些官能团包括但不限 于，硫醇、胺、腈、膦、氧化膦、膦酸、羧酸或其它配体。通过将合适 的分子与表面键合，量子点能够分散于或溶于几乎任何溶剂中或合并到 各种无机和有机膜上。量子点(QDs)可以直接通过马来酰亚胺酯偶联 反应结合链霉亲和素或通过马来酰亚胺-硫醇偶联反应结合抗体。这产生 了含有共价连接在表面上的生物分子的材料，其产生具有高特异活性的 偶联物。在某些实施方式中，用单一微粒分析器检测的蛋白质用一个量 子点标记。在某些实施方式中，量子点的直径为10-20nm。在其它实施 方式中，量子点的直径为2-10nm。有用的量子点包括QD 605、QD 610、 QD 655和QD 705。尤其优选的量子点是QD 605。
C.结合伴体-荧光部分组合物(标记物)
本发明的标记物一般包含结合荧光部分以提供在本文所述的仪器 中检测和定量所需的荧光的结合伴体，如抗体。任何适用于在本文所述 的单分子检测器中检测的结合伴体和荧光部分的组合可以作为本发明 的标记物使用。在某些实施方式中，本发明提供了用于心肌肌钙蛋白分 子或其片段、复合物、磷酸化、或氧化形式的标记物，其中，标记物包 括心肌肌钙蛋白的抗体和荧光部分。抗体可以是上述的任何抗体，如 cTnT或cTnI的抗体。在某些实施方式中，抗体是cTnI的抗体。在某些实 施方式中，抗体对于心肌肌钙蛋白的特定区域是特异性的，例如，对于 人cTnI的氨基酸27-41是特异性的。在某些实施方式中，本发明提供了包 括连接在抗cTnI抗体(例如，多克隆抗体，如那些来自BiosPacific， Emeryville的名称为G129C的山羊多克隆抗体)上的荧光部分的组合物。 可以连接荧光部分以使得标记物被在该荧光部分的激发波长处发射光 的激光器激发时，能够发射平均至少约50、75、100、125、150、175、 200、225、250、275、300、350、400、500、600、700、800、900或1000 个光子，其中激光聚焦于包含该荧光部分的直径不低于约5微米的点， 而且其中激光指向该点的总能量不超过约3微焦耳。在某些实施方式中， 荧光部分可以是被在荧光部分的激发波长处发射光的激光器激发时，能 够发射平均至少约50、100、150或200个光子的荧光部分，其中激光聚 焦于包含荧光部分的直径不低于约5微米的点，而且其中激光指向该点 的总能量不超过约3微焦耳。荧光部分可以是包括一个或多个染料分子 的荧光部分，染料分子的结构包括一个取代的吲哚环系统，其中，在 吲哚环3位碳上的取代基包含化学反应性的基团或偶联物质基团。标 记组合物可以包括包含一个或多个选自AlexaFluor 488、532、647、700 或750的染料分子的荧光部分。标记组合物可以包括包含一个或多个选 自AlexaFluor 488、532、700或750的染料分子的荧光部分。标记组合物 可以包括包含一个或多个AlexaFluor 488染料分子的荧光部分。标记组合 物可以包括包含一个或多个AlexaFluor 555染料分子的荧光部分。标记组 合物可以包括包含一个或多个AlexaFluor 610染料分子的荧光部分。标记 组合物可以包括包含一个或多个AlexaFluor 647染料分子的荧光部分。标 记组合物可以包括包含一个或多个AlexaFluor 680染料分子的荧光部分。 标记组合物可以包括包含一个或多个AlexaFluor 700染料分子的荧光部 分。标记组合物可以包括包含一个或多个AlexaFluor 750染料分子的荧光 部分。
在某些实施方式中，本发明提供了用于检测心肌肌钙蛋白I的组合 物，其包括连接在对于人cTnI的氨基酸27-41特异性的抗体(例如，山羊 多克隆抗cTnI抗体)上的AlexFluor分子(例如，选自上述组的AlexFluor分 子，如AlexFluor 647分子)。在某些实施方式中，本发明提供了用于检测 心肌肌钙蛋白I的组合物，其包括平均1-11、或约2-10、或约2-8、或约2-6、 或约2-5、或约2-4、或约3-10、或约3-8、或约3-6、或约3-5、或约4-10、 或约4-8、或约4-6、或约2、3、4、5、6、或大于约6个连接在对于人cTnI 的氨基酸27-41特异性的抗体(例如，山羊多克隆抗cTnI抗体)上的 AlexaFluor 647分子。在某些实施方式中，本发明提供了用于检测心肌肌 钙蛋白I的组合物，其包括平均1-11、或约2-10、或约2-8、或约2-6、或 约2-5、或约2-4、或约3-10、或约3-8、或约3-6、或约3-5、或约4-10、或 约4-8、或约4-6、或约2、3、4、5、6、或大于约6个连接在对于人cTnI 的氨基酸27-41特异性的抗体(例如，山羊多克隆抗cTnI抗体)上的 AlexaFluor 647分子。在某些实施方式中，本发明提供了用于检测心肌肌 钙蛋白I的组合物，其包括平均约2-10个连接在对于人cTnI的氨基酸27-41 特异性的抗体(例如，山羊多克隆抗cTnI抗体)上的AlexaFluor 647分子。 在某些实施方式中，本发明提供了用于检测心肌肌钙蛋白I的组合物，其 包括平均约2-8个连接在对于人cTnI的氨基酸27-41特异性的抗体(例如， 山羊多克隆抗cTnI抗体)上的AlexaFluor 647分子。在某些实施方式中， 本发明提供了用于检测心肌肌钙蛋白I的组合物，其包括平均约2-6个连 接在对于人cTnI的氨基酸27-41特异性的抗体(例如，山羊多克隆抗cTnI 抗体)上的AlexaFluor 647分子。在某些实施方式中，本发明提供了用于 检测心肌肌钙蛋白I的组合物，其包括平均约2-4个连接在对于人cTnI的 氨基酸27-41特异性的抗体(例如，山羊多克隆抗cTnI抗体)上的AlexaFluor 647分子。在某些实施方式中，本发明提供了用于检测心肌肌钙蛋白I的 组合物，其包括平均约3-8个连接在对于人cTnI的氨基酸27-41特异性的 抗体(例如，山羊多克隆抗cTnI抗体)上的AlexaFluor 647分子。在某些实 施方式中，本发明提供了用于检测心肌肌钙蛋白I的组合物，其包括平均 约3-6个连接在对于人cTnI的氨基酸27-41特异性的抗体(例如，山羊多克 隆抗cTnI抗体)上的AlexaFluor 647分子。在某些实施方式中，本发明提 供了用于检测心肌肌钙蛋白I的组合物，其包括平均约4-8个连接在对于 人cTnI的氨基酸27-41特异性的抗体(例如，山羊多克隆抗cTnI抗体)上的 AlexaFluor 647分子。
荧光部分或组成荧光部分的荧光体与如抗体的结合伴体的连接，可 以通过任何合适的方法实现；这类方法是本领域内熟知的，且在实施例 中给出了示例方法。在某些实施方式中，在荧光部分和结合伴体连接以 形成在本发明的方法中使用的标记物之后，及在用标记物标记目标蛋白 质之前，进行过滤步骤是有用的。例如，抗体-染料标记物在使用前可以 例如，通过0.2微米的过滤器或任何合适的过滤器过滤，以除去聚合体。 也可以例如，通过0.2微米的过滤器，或任何合适的过滤器过滤其它用于 本发明的分析的试剂。不受理论的限制，据认为这样的过滤除去了一部 分如抗体-染料标记物的聚合体。由于这样的聚合体作为一个单位与目标 蛋白质结合，但在洗脱缓冲液中进行释放时很可能解聚，因此可能产生 假阳性；即，从仅结合单一目标蛋白质分子的聚合体检测到几个标记物。 与理论无关，已经发现过滤减少了后续分析中的假阳性，并提高了准确 度和精密度。
IV.心肌肌钙蛋白的高灵敏分析
一方面，本发明提供了测定样品中是否存在心肌肌钙蛋白的单一分 子或其片段或复合物的方法，通过i)用标记物标记可能存在的分子、片 段或其复合物；和ii)检测标记物存在与否，其中，发现标记物的存在表 明样品中存在心肌肌钙蛋白的单一分子、片段或复合物。本文使用的“心 肌肌钙蛋白分子”包括包含特定种类的心肌肌钙蛋白的基本上天然产生 的整个氨基酸序列的分子，包括翻译后修饰的形式，例如，磷酸化形式 及氧化形式或其它化学改变形式。本文使用的分子的“片段”，包括含有 少于天然存在的整个氨基酸序列的心肌肌钙蛋白分子，包括对于完整分 子的修饰。本文使用的心肌肌钙蛋白分子的“复合物”，包括与一个或多 个其它分子或物质联合的心肌肌钙蛋白分子或片段，例如，与一个或多 个其它心肌肌钙蛋白分子联合。在某些实施方式中，本方法能够以低于 约100、80、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、 2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1pg/ml的检测限检测 肌钙蛋白。在某些实施方式中，本方法能够以低于约100pg/ml的检测限 检测肌钙蛋白。在某些实施方式中，本方法能够以低于约50pg/ml的检 测限检测肌钙蛋白。在某些实施方式中，本方法能够以低于约20pg/ml 的检测限检测肌钙蛋白。在某些实施方式中，本方法能够以低于约10 pg/ml的检测限检测肌钙蛋白。在某些实施方式中，本方法能够以低于约 5pg/ml的检测限检测肌钙蛋白。在某些实施方式中，本方法能够以低于 约3pg/ml的检测限检测肌钙蛋白。在某些实施方式中，本方法能够以低 于约1pg/ml的检测限检测肌钙蛋白。检测限可以通过使用合适的国家标 准和技术研究所参考标准物质，如标准cTnI来确定。
本方法也提供了通过检测样品中肌钙蛋白单一分子来测定样品中 的心肌肌钙蛋白浓度的方法。肌钙蛋白单一分子的“检测”包括直接或间 接地检测该分子。在间接检测的情况下，可以检测对应于心肌肌钙蛋白 单一分子的标记物，例如，已经连接在心肌肌钙蛋白单一分子上的标记 物。
检测的心肌肌钙蛋白的类型如本文所述，例如，cTnT、cTnI、总心 肌肌钙蛋白(例如，总cTnI或总cTnT)或游离的心肌肌钙蛋白、复合的 心肌肌钙蛋白、或心肌肌钙蛋白片段。在某些实施方式中，检测和/或定 量总心肌肌钙蛋白。在某些实施方式中，检测总cTnT。在某些实施方式 中，检测和/或定量总cTnI。
A.样品
样品可以是任何合适的样品。一般地，样品是生物样品，例如，生 物流体。这样的流体包括，但不限于：呼出气冷凝液(EBC)、支气管肺 泡灌洗液(BAL)、血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、胸膜液、滑 液、腹膜液、羊水、胃液、淋巴液、间隙液、组织匀浆、细胞提取物、 唾液、痰液、粪便、生理分泌液、泪液、粘液、汗液、乳汁、精液、精 液液体、阴道分泌物、来自溃疡和其他表面疹、疱和脓肿的液体、和包 括正常、恶性及可疑组织活组织检查的组织提取物，或其中可能含有感 兴趣的目标微粒的身体的任何其它组分。其它的诸如细胞或组织培养物 或肉汤培养物的类似的样本也受到关注。
在某些实施方式中，样品是血液样品。在某些实施方式中，样品是 血浆样品。在某些实施方式中，样品是血清样品。
B.样品制备
一般地，可以使用产生对应于要测量的心肌肌钙蛋白分子的标记物 的任何样品制备方法，其中，标记物在本文所述的仪器中可检测到。本 领域内已知，在其中将标记物加到一种或多种微粒中的样品制备可以以 均相或异相形式进行。在某些实施方式中，在均相形式下进行样品制备。 在采用均相形式的分析器系统中，未结合的标记物不会从样品中除去。 参见，美国专利申请11/048 660号，在本文完全引入作为参考。在某些实 施方式中，通过加入与一种或多种目标微粒结合的经标记的一种或多种 抗体来标记一种或多种目标微粒。
在某些实施方式中，使用异相的分析形式，其中，一般地，采用去 除未结合标记物的步骤。这样的分析形式在本领域内是熟知的。一种尤 其有用的分析形式是夹心分析，例如夹心免疫分析。在这种形式中，使 用捕获结合伴体在固体载体上捕获如生物学状态的标志物的目标分子。 不想要的分子及其它物质随后可以任选地洗去，接着结合包含检测结合 伴体和如荧光部分的可检测标记的标记物。进一步洗涤除去未结合的标 记物，然后释放可检测的标记，其通常(尽管不是必需的)仍连接在检测 结合伴体上。在可选择的实施方式中，向捕获结合伴体加入样品和标记 物，而不在这其间(例如，同时)进行洗涤。对于本领域的技术人员来说， 其它变化是显而易见的。
在某些实施方式中，检测肌钙蛋白微粒的方法使用以抗体(例如单克 隆抗体)作为捕获结合伴体的夹心分析。该方法包括将样品中的肌钙蛋白 分子结合到固定在结合表面的捕获抗体上，并将检测抗体结合到肌钙蛋 白分子上以形成“夹心”复合物。检测抗体包括可检测的荧光标记，如本 文所述，其可使用例如本发明的单分子检测器检测。捕获抗体和检测抗 体两者都特异性地结合肌钙蛋白。已知许多夹心免疫分析的实例，且其 中一些在美国专利4168146号(Grubb等人)及美国专利4 366 241号(Tom 等人)进行了描述，本文引入这两者作为参考。在实施例部分描述了进 一步的特别用于心肌肌钙蛋白的例子。
捕获结合伴体可以连接在例如微量滴定板或顺磁性珠的固体载体 上。在某些实施方式中，本发明提供了连接在顺磁性珠上的心肌肌钙蛋 白的结合伴体。可以使用任何合适的对于将要捕获的心肌肌钙蛋白的类 型是特异性的结合伴体。结合伴体可以是抗体，例如，单克隆抗体。抗 体可以对于本文所述的游离的心肌肌钙蛋白(cTnI或cTnT)或心肌肌钙 蛋白复合物、修饰的心肌肌钙蛋白或心肌肌钙蛋白片段是特异性的，或 者，对于可能在感兴趣的样品中发现的所有或基本上所有形式的心肌肌 钙蛋白，例如cTnI或cTnT，是特异性的。本文其它地方也描述了心肌肌 钙蛋白的抗体的产生和来源。优选的用于测量总肌钙蛋白的抗体是那些 基本上不被肝素、磷酸化作用、氧化作用及肌钙蛋白复合物形成影响的， 且不会与骨骼肌的肌钙蛋白(例如肌钙蛋白I)交叉反应的抗体。在某些实 施方式中，抗体对于心肌肌钙蛋白的特定区域是特异性的。在某些实施 方式中，所述区域包括人心肌肌钙蛋白I的氨基酸41-49。在某些实施方 式中，所述区域包括人心肌肌钙蛋白I的氨基酸87-91。这样的抗体在本 领域内是熟知的，且可以从例如BiosPacific，Emeryville，CA获得。在本发 明的实施方式中有用的捕获抗体的示例是和游离的心肌肌钙蛋白I (cTnI)的氨基酸41-49及和cTnI与其它肌钙蛋白成分形成的复合物反应 的抗体，例如单克隆抗体。优选地，该抗体不会被肝素、磷酸化作用、 氧化作用及肌钙蛋白复合物形成影响，且不会与骨骼肌的肌钙蛋白I交叉 反应。此类型的一个示例性的抗体是可从BiosPacific，Emeryville，CA获得 的A34650228P号单克隆抗体。在本发明的实施方式中有用的捕获抗体的 另一个示例是与游离的心肌肌钙蛋白I(cTnI)的氨基酸87-91及和cTnI 与其它肌钙蛋白成分形成的复合物反应的抗体，例如单克隆抗体。优选 地，该抗体不会被肝素、磷酸化作用、氧化作用及肌钙蛋白复合物形成 影响，且不会与骨骼肌的肌钙蛋白I交叉反应。此类型的一个示例性的抗 体是可从BiosPacific，Emeryville，CA获得的A34440228P号单克隆抗体。 可以理解，这里确认为可用作捕获抗体的抗体也可以用作检测抗体，反 之亦然。
如抗体的结合伴体与固体载体的连接可以是共价的或非共价的。在 某些实施方式中，连接是非共价的。本领域内熟知的一个非共价连接的 示例是生物素-抗生物素蛋白/链霉亲和素相互作用。因此，在某些实施 方式中，如微量滴定板或顺磁性珠的固体载体通过例如生物素-抗生物素 蛋白/链霉亲和素相互作用的非共价连接与例如抗体的捕获结合伴体连 接。在某些实施方式中，连接是共价的。因此，在某些实施方式中，如 微量滴定板或顺磁性珠的固体载体通过共价连接与例如抗体的捕获结 合蛋白连接。其中捕获抗体的取向使得目标分子的捕获最优化的共价连 接是尤其有用的。例如，在某些实施方式中，可以使用如微量滴定板或 顺磁性珠的固体载体，在使用中，如抗体的结合伴体的连接是定向连接， 如共价定向连接。
抗体和固体载体的定向连接的示例性的方案如下：将IgG溶于pH5.5 的0.1M醋酸钠缓冲液至最终浓度为1mg/ml。加入等体积的冰冷的溶于 pH5.5的0.1M醋酸钠的20mM高碘酸钠。使IgG在冰上氧化0.5小时。通 过加入0.15体积的1M甘油终止过量的高碘酸盐试剂。通过超滤作用去除 氧化反应的低分子量的副产物。将氧化的IgG成分稀释至合适的浓度(一 般为0.5微克IgG/毫升)，并在室温下与酰肼活化的多孔板反应至少2小 时。通过用硼酸盐缓冲盐水或另一种合适的缓冲液洗涤多孔板来除去未 结合的IgG。如果需要，板可以干燥储存。如果微珠材料适于这样的连 接，微珠可以遵循类似的方案。
在某些实施方式中，固体载体是微量滴定板。在某些实施方式中， 固体载体是顺磁性珠。示例性的顺磁性珠是Streptavidin C1(Dynal， 650.01-03)。其它合适的珠对于本领域的技术人员是显而易见的。连接抗 体和顺磁性珠的方法在本领域内是熟知的。实施例部分给出了一个实 例。
目标心肌肌钙蛋白与固定于固体载体上的如捕获抗体的捕获结合 伴体接触。可以使用一些样品制备；例如，在样品与捕获抗体接触之前， 从血液样品制备血清或浓缩过程。在免疫分析中结合蛋白质的方案在本 领域内是公知的，且包括在实施例中。
用于结合的时间随条件而变化；很明显，在一些情况中、尤其是临 床情况中，需要较短的结合时间。如顺磁性珠的使用可以减少结合所需 的时间。在某些实施方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体 结合的时间低于约12、10、8、6、4、3、2或1小时，或低于约60、50、 40、30、25、20、15、10或5分钟。在某些实施方式中，用于目标蛋白 质与如抗体的捕获结合伴体结合的时间低于约60分钟。在某些实施方式 中，用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体结合的时间低于约40分 钟。在某些实施方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体结合 的时间低于约30分钟。在某些实施方式中，用于目标蛋白质与如抗体的 捕获结合伴体结合的时间低于约20分钟。在某些实施方式中，用于目标 蛋白质与如抗体的捕获结合伴体结合的时间低于约15分钟。在某些实施 方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体结合的时间低于约10 分钟。在某些实施方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体结 合的时间低于约5分钟。
在某些实施方式中，在肌钙蛋白微粒与如捕获抗体的捕获结合伴体 结合之后，洗去非特异性地结合的微粒及样品中的其它不想要的物质， 基本上只留下特异性结合的肌钙蛋白微粒。在其它的实施方式中，在加 入样品和加入标记物之间不进行洗涤；可以理解，这更进一步减少了样 品制备时间。因此，在某些实施方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕 获结合伴体结合以及将标记物与目标蛋白质结合的时间低于约12、10、 8、6、4、3、2或1小时，或低于约60、50、40、30、25、20、15、10或 5分钟。在某些实施方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体 结合以及将标记物与目标蛋白质结合的时间低于约60分钟。在某些实施 方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体结合以及将标记物与 目标蛋白质结合的时间低于约40分钟。在某些实施方式中，用于目标蛋 白质与如抗体的捕获结合伴体结合以及将标记物与目标蛋白质结合的 时间低于约30分钟。在某些实施方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕 获结合伴体结合以及将标记物与目标蛋白质结合的时间低于约20分钟。 在某些实施方式中，用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体结合以及 将标记物与目标蛋白质结合的时间低于约15分钟。在某些实施方式中， 用于目标蛋白质与如抗体的捕获结合伴体结合以及将标记物与目标蛋 白质结合的时间低于约10分钟。在某些实施方式中，用于目标蛋白质与 如抗体的捕获结合伴体结合以及将标记物与目标蛋白质结合的时间低 于约5分钟。
用于测量目标分析物的包括捕获和信号抗体的一些免疫分析诊断 试剂可以源自动物血清。具有结合其它种类的免疫球蛋白的能力的内源 性的人类异嗜性抗体或人抗动物抗体存在于超过10％的病人血清或血 浆中。这些循环的异嗜性抗体可能干扰免疫分析测量。在夹心免疫分析 中，这些异嗜性抗体或者桥连捕获抗体和检测(诊断)抗体，从而产生 假阳性信号；或者阻断诊断抗体的结合，从而产生假阴性信号。在竞争 免疫分析中，异嗜性抗体可能结合分析抗体，并抑制其结合肌钙蛋白。 它们也可能阻断或者增强抗体-肌钙蛋白复合物与游离肌钙蛋白的分离， 尤其在分离系统中使用抗种类的抗体时。因此，这些异嗜性抗体的干扰 效应难以预测。所以，阻断任何异嗜性抗体的结合是有利的。在本发明 的某些实施方式中，免疫分析包括使用一种或多种异嗜性抗体阻断剂耗 尽样品中的异嗜性抗体的步骤。从将要在免疫分析中测试的样品中去除 异嗜性抗体的方法是已知的，且包括：在pH5.0的醋酸钠缓冲液中在90℃ 加热样本15分钟，并在1200g下离心10分钟，或者使用聚乙二醇(PEG) 沉淀异嗜性抗体；使用蛋白A或蛋白G从样本中免疫提取干扰性的异嗜性 免疫球蛋白；或者加入非免疫小鼠IgG。本发明方法的实施方式预期在 使用单分子检测器进行分析之前制备样品。可以确定预处理方法的适用 性。用于最小化由异嗜性抗体导致的免疫分析干扰的生化药剂可商购。 例如，称为MAK33的产品，其是一种抗h-CK-MM的IgG1单克隆抗体， 可从Boehringer Mannheim获得。MAK33 plus产品包含IgG1和IgG1-Fab 的组合。聚MAK33含有与IgG1聚合的IgG1-Fab，聚MAC 2b/2a含有与 IgG2b聚合的IgG2a-Fab。用于中和异嗜性抗体的生化药剂的另一种商购 来源是由Bioreclamation Inc，East Meadow，NY销售的免疫球蛋白抑制 剂。该产品是来自多个物种的免疫球蛋白(IgG和IgM)的制品，主要是 来自Balb/c小鼠的鼠IgG2a、IgG2b和IgG3。在某些实施方式中，可以使 用本领域已知的方法从样品中免疫提取异嗜性抗体，例如，通过将干扰 性抗体结合到蛋白A或G上耗尽样品中的异嗜性抗体。在某些实施方式 中，使用一种或多种异嗜性抗体阻断剂中和异嗜性抗体。异嗜性阻断剂 可以选自抗同种型异嗜性抗体阻断剂、抗个体型异嗜性抗体阻断剂和抗 -抗个体型异嗜性抗体阻断剂。在某些实施方式中，可以使用异嗜性抗体 阻断剂的组合。
在加入样品的同时或之后加入标记物并洗涤。将抗体和其它免疫标 记与蛋白质和其它分子结合的方案是本领域内熟知的。如果标记物结合 步骤与捕获结合是分离的，则用于标记物结合的时间在例如临床情况中 是重要的。在某些实施方式中，用于将目标蛋白质与如抗体-染料的标记 物结合的时间低于约12、10、8、6、4、3、2或1小时，或低于约60、50、 40、30、25、20、15、10或5分钟。在某些实施方式中，用于将目标蛋 白质与如抗体-染料的标记物结合的时间低于约60分钟。在某些实施方式 中，用于将目标蛋白质与如抗体-染料的标记物结合的时间低于约40分 钟。在某些实施方式中，用于将目标蛋白质与如抗体-染料的标记物结合 的时间低于约30分钟。在某些实施方式中，用于将目标蛋白质与如抗体 -染料的标记物结合的时间低于约20分钟。在某些实施方式中，用于将目 标蛋白质与如抗体-染料的标记物结合的时间低于约15分钟。在某些实施 方式中，用于将目标蛋白质与如抗体-染料的标记物结合的时间低于约10 分钟。在某些实施方式中，用于将目标蛋白质与如抗体-染料的标记物结 合的时间低于约5分钟。通过洗涤去除过量的标记物。
然后从目标蛋白质上洗脱标记物。优选的洗脱缓冲液对于释放标记 物是有效的而不产生明显的背景。如果洗脱缓冲液是抑菌的，也是有利 的。本发明使用的洗脱缓冲液包括离液剂(chaotrope)，例如，尿素或胍 化合物；缓冲液，例如，硼酸盐缓冲盐水；蛋白质载体，例如，白蛋白， 如人、牛或鱼的白蛋白，或IgG，用来在检测仪器中涂覆毛细管壁；和 表面活性剂，例如，离子或非离子去污剂，挑选产生相对低的背景的， 例如，Tween 20、Triton X-100或SDS。
采集到单分子检测器内的洗脱缓冲液/标记物等分试样被称为“处理 样品”，以将其与从个体获得的初始样品相区别。
在另一实施方式中，固相结合分析可以采用竞争性结合分析形式。 一种这样的方法包括：a)使i)样品中的肌钙蛋白微粒和ii)包含可检测标记 (检测试剂)的肌钙蛋白微粒的经标记类似物竞争性地结合固定于结合 表面的捕获抗体，和b)使用单微粒分析器测定标记物的量。另一种这样 的方法包括：a)使i)样品中的肌钙蛋白微粒和ii)固定于结合表面(捕获 试剂)的肌钙蛋白微粒类似物竞争性地结合具有可检测标记(检测试剂) 的抗体，和b)使用单微粒分析器测定标记物的量。本文的“肌钙蛋白类似 物”指与肌钙蛋白竞争结合捕获抗体的物质。在美国专利4 235 601号 (Deutsch等人)、美国专利4 442 204号(Liotta)和美国专利5 208 535号 (Buechler等人)中公开了竞争性免疫分析的示例，本文完整引入作为 参考。
C.肌钙蛋白的检测和浓度的测定
洗脱之后，通过单分子分析器运行例如洗脱缓冲液中的标记物。处 理样品可能不包含标记物、包含单个或多个标记物。标记物的数目对应 于在捕获步骤中捕获的心肌肌钙蛋白分子的数目或与后者成比例(如果 使用样品的稀释液或部分)。
可以使用任何合适的能够检测与目标蛋白质一起使用的标记物的 单分子检测器。合适的单分子检测器如本文所述。一般地，检测器是系 统的一部分，系统包括用于对制备的样品取样的自动取样器，和任选的 回收样品的回收系统。
在某些实施方式中，处理样品在利用毛细流动系统，并包括毛细流 动池、照射处理样品从其中通过的毛细管中的探询空间的激光器、检测 从探询空间发射的辐射的检测器、和移动处理样品通过探询空间的动力 源的单分子分析器中分析。在某些实施方式中，单分子分析器进一步包 括收集处理样品通过探询空间时的发射光的显微镜物镜，例如，高数值 孔径的显微镜物镜。在某些实施方式中，激光器和检测器是共焦排列。 在某些实施方式中，激光器是连续波激光器。在某些实施方式中，检测 器是雪崩光电二极管检测器。在某些实施方式中，动力源是提供压力的 泵。在某些实施方式中，本发明提供了分析器系统，其包括能够对多个 样品自动取样、在样品容器和探询空间之间提供流体连通的采样系统。 在某些实施方式中，探询空间具有的体积为约0.001-500pL、或约 0.01-100pL、或约0.01-10pL、或约0.01-5pL、或约0.01-0.5pL、或约0.02- 约300pL、或约0.02pL-约50pL、或约0.02-约5pL、或约0.02-约0.5pL、 或约0.02-约2pL、或约0.05-约50pL、或约0.05-约5pL、或约0.05-约0.5 pL、或约0.05-约0.2pL、或约0.1-约25pL。在某些实施方式中，探询空 间具有的体积为约0.004-100pL。在某些实施方式中，探询空间具有的体 积为约0.02-50pL。在某些实施方式中，探询空间具有的体积为约 0.001-10pL。在某些实施方式中，探询空间具有的体积为约0.001-10pL。 在某些实施方式中，探询空间具有的体积为约0.01-5pL。在某些实施方 式中，探询空间具有的体积为约0.02-约5pL。在某些实施方式中，探询 空间具有的体积为约0.05-5pL。在某些实施方式中，探询空间具有的体 积为约0.05-10pL。在某些实施方式中，探询空间具有的体积为约0.5-约 5pL。在某些实施方式中，探询空间具有的体积为约0.02-约0.5pL。
在某些实施方式中，用于本发明方法的单分子检测器利用毛细流动 系统，且包括毛细流动池、照射处理样品从其中通过的毛细管中的探询 空间的连续波激光器、收集处理样品通过探询空间时发射的光的高数值 孔径显微镜物镜、检测从探询空间发射的辐射的雪崩光电二极管检测 器、和为移动处理样品通过探询空间提供压力的泵，其中，探询空间为 约0.02-约50pL。在某些实施方式中，用于本发明方法的单分子检测器利 用毛细流动系统，且包括毛细流动池、照射处理样品从其中通过的毛细 管中的探询空间的连续波激光器、收集处理样品通过探询空间时发射的 光的高数值孔径显微镜物镜(其中，透镜具有至少约0.8的数值孔径)、 检测从探询空间发射的辐射的雪崩光电二极管检测器、和为移动处理样 品通过探询空间提供压力的泵，其中，探询空间为约0.004-约100pL。在 某些实施方式中，用于本发明方法的单分子检测器利用毛细流动系统， 且包括毛细流动池、照射处理样品从其中通过的毛细管中的探询空间的 连续波激光器、收集处理样品通过探询空间时发射的光的高数值孔径显 微镜物镜(其中，透镜具有至少约0.8的数值孔径)、检测从探询空间发 射的辐射的雪崩光电二极管检测器、和为移动处理样品通过探询空间提 供压力的泵，其中，探询空间为约0.05-约10pL。在某些实施方式中，用 于本发明方法的单分子检测器利用毛细流动系统，且包括毛细流动池、 照射处理样品从其中通过的毛细管中的探询空间的连续波激光器、收集 处理样品通过探询空间时发射的光的高数值孔径显微镜物镜(其中，透 镜具有至少约0.8的数值孔径)、检测从探询空间发射的辐射的雪崩光电 二极管检测器、和为移动处理样品通过探询空间提供压力的泵，其中， 探询空间为约0.05-约5pL。在某些实施方式中，用于本发明方法的单分 子检测器利用毛细流动系统，且包括毛细流动池、照射处理样品从其中 通过的毛细管中的探询空间的连续波激光器、收集处理样品通过探询空 间时发射的光的高数值孔径显微镜物镜(其中，透镜具有至少约0.8的数 值孔径)、检测从探询空间发射的辐射的雪崩光电二极管检测器、和为 移动处理样品通过探询空间提供压力的泵，其中，探询空间为约0.5-约5 pL。
在某些实施方式中，单分子检测器能够测定样品浓度可能在至少约 100倍、或1000倍、或10000倍、或100000倍、或30000倍、或1000000 倍、或10000000倍、或30000000倍的范围内的样品中目标分子的浓度。
在某些实施方式中，本发明的方法利用能够检测引入检测器的第一 样品和第二样品之间分析物浓度低于约50％、40％、30％、20％、15％ 或10％的差异的单分子检测器，其中引入分析器的第一样品和所述的第 二样品的体积低于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、 5、4、3、2或1μl，且其中分析物以低于约100、90、80、70、60、50、 40、30、20、15、10、5、4、3、2或1飞摩尔的浓度存在。在某些实施 方式中，本发明的方法使用能够检测引入检测器的第一样品和第二样品 之间分析物浓度低于约50％的差异的单分子检测器，其中引入分析器的 第一样品和所述的第二样品的体积低于约100μl，且其中分析物以低于 约100飞摩尔的浓度存在。在某些实施方式中，本发明的方法使用能够 检测引入检测器的第一样品和第二样品之间分析物浓度低于约40％的 差异的单分子检测器，其中引入分析器的第一样品和所述的第二样品的 体积低于约50μl，且其中分析物以低于约50飞摩尔的浓度存在。在某些 实施方式中，本发明的方法使用能够检测引入检测器的第一样品和第二 样品之间分析物浓度低于约20％的差异的单分子检测器，其中引入分析 器的第一样品和所述的第二样品的体积低于约20μl，且其中分析物以低 于约20飞摩尔的浓度存在。在某些实施方式中，本发明的方法使用能够 检测引入检测器的第一样品和第二样品之间分析物浓度低于约20％的 差别的单分子检测器，其中引入分析器的第一样品和所述的第二样品的 体积低于约10μl，且其中分析物以低于约10飞摩尔的浓度存在。在某些 实施方式中，本发明的方法使用能够检测引入检测器的第一样品和第二 样品之间分析物浓度低于约20％的差别的单分子检测器，其中引入分析 器的第一样品和所述的第二样品的体积低于约5μl，且其中分析物以低 于约5飞摩尔的浓度存在。
下面更详细地描述单分子检测器和系统。在本发明的方法中有用的 单分子分析器的进一步的实施方式，如含有多于一个的探询窗口的检测 器，利用电动流或电泳流的检测器，等等，可以在美国专利申请11/048 660 号中发现，在本文完整引入作为参考。
在多次运行之间，可以洗涤仪器。在某些实施方式中可以使用维持 样品的盐和表面活性剂浓度的洗涤缓冲液以保持毛细管的条件，即，保 持毛细管表面在样品之间的相对恒定以减少变异性。
对于本发明的方法和仪器的极高灵敏度起贡献作用的一个特征是 检测和定量标记物的方法，在某些实施方式中，标记物连接在要检测的 单分子上，或更一般地，对应于要检测的单分子。简单地说，通过使毛 细管的给定的探询空间经受来自以标记物中使用的荧光部分的适当激 发波长发射光的激光器的EM辐射预定的时间，并在那个时间内检测发 射的光子，而将流过毛细管的处理样品有效地分为一系列检测事件。各 个预定的时间段是一个“箱元(bin)”。如果在给定的箱元内检测的光子总 数超过了预设的阈水平，就记录该箱元为检测事件，即，检测到了标记 物。如果光子总数没有达到预设的阈水平，就不记录检测事件。在某些 实施方式中，处理样品的浓度足够稀释，从而对于大百分比的检测事件， 检测事件代表只有一个标记物通过窗口，其对应于原始样品中的单个目 标分子，即，几乎没有检测事件代表在单个箱元中多于一个标记物。在 某些实施方式中，应用进一步的精制以允许处理样品中更大浓度的标记 物被精确地检测到，即，两个或更多个标记物作为单一检测事件被检测 到的可能性不再是无关紧要的浓度。
尽管可以使用其它的箱元时间而不背离本发明的范围，在某些实施 方式中，箱元时间选自约1微秒-约5毫秒的范围。在某些实施方式中，箱 元时间多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、 60、70、80、90、100、200、250、300、400、500、600、700、750、 800、900、1000、2000、3000、4000或5000微秒。在某些实施方式中， 箱元时间低于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、 60、70、80、90、100、200、250、300、400、500、600、700、750、 800、900、1000、2000、3000、4000或5000微秒。在某些实施方式中， 箱元时间为约1-1000微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约1-750微秒。 在某些实施方式中，箱元时间为约1-500微秒。在某些实施方式中，箱元 时间为约1-250微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约1-100微秒。在 某些实施方式中，箱元时间为约1-50微秒。在某些实施方式中，箱元时 间为约1-40微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约1-30微秒。在某些 实施方式中，箱元时间为约1-500微秒。在某些实施方式中，箱元时间为 约1-20微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约1-10微秒。在某些实施 方式中，箱元时间为约1-500微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约1-5 微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约5-500微秒。在某些实施方式中， 箱元时间为约5-250微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约5-100微秒。 在某些实施方式中，箱元时间为约5-50微秒。在某些实施方式中，箱元 时间为约5-20微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约5-10微秒。在某 些实施方式中，箱元时间为约10-500微秒。在某些实施方式中，箱元时 间为约10-250微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约10-100微秒。在 某些实施方式中，箱元时间为约10-50微秒。在某些实施方式中，箱元时 间为约10-30微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约10-20微秒。在某 些实施方式中，箱元时间为约5微秒。在某些实施方式中，箱元时间为 约5微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约6微秒。在某些实施方式中， 箱元时间为约7微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约8微秒。在某些 实施方式中，箱元时间为约9微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约 10微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约11微秒。在某些实施方式中， 箱元时间为约12微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约13微秒。在某 些实施方式中，箱元时间为约14微秒。在某些实施方式中，箱元时间为 约5微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约15微秒。在某些实施方式 中，箱元时间为约16微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约17微秒。 在某些实施方式中，箱元时间为约18微秒。在某些实施方式中，箱元时 间为约19微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约20微秒。在某些实施 方式中，箱元时间为约25微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约30微 秒。在某些实施方式中，箱元时间为约40微秒。在某些实施方式中，箱 元时间为约50微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约100微秒。在某 些实施方式中，箱元时间为约250微秒。在某些实施方式中，箱元时间 为约500微秒。在某些实施方式中，箱元时间为约750微秒。在某些实施 方式中，箱元时间为约1000微秒。
在某些实施方式中，通过平均噪音水平或均方根噪音确定背景噪音 水平。在其它情况中，选择代表性的噪音值或统计值。在大多数情况中， 预期噪音遵循泊松分布。因此，在某些实施方式中，测定样品中的微粒 -标记复合物的浓度包括测定背景噪音水平。
因此，随着标记物流经毛细流动池，它被激光束照射以产生光子脉 冲。通过只考虑具有高于相当于样品中存在的背景噪音量的预设阈能量 水平的光子脉冲，标记物发射的光子区别于背景光或背景噪音发射。背 景噪音一般包括例如由样品、在制备用于分析的样品时使用的缓冲液或 稀释液中存在的非标记微粒的固有荧光所产生的低频发射、拉曼散射和 电子噪音。在某些实施方式中，赋予背景噪音的值以在多个箱元中检测 到的平均背景信号噪音计算，这是在预设长度的时间内在探询空间中检 测到的光子信号的量度。因此，在某些实施方式中，对于每个样品，背 景噪音以该样品特定的数字来计算。
给定背景噪音值，就可以指定阈能量水平。如上讨论，确定阈值以 区分真实信号(由标记物的荧光产生)和背景噪音。在选择阈值时必须 注意使得来自随机噪音的假阳性信号数最小化，而被排除的真实信号数 值也最小化。选择阈值的方法包括确定高于噪音水平的固定值，并基于 噪音信号的分布计算阈值。在一种实施方式中，阈设定为高于背景水平 的标准差的固定数值。假定噪音遵循泊松分布，使用这种方法能够评估 实验过程的时间内的假阳性信号数。在某些实施方式中，阈水平计算为 比背景噪音高4个标准差(sigma)的值。例如，给定200个光子的平均背 景噪音水平，分析器系统确定阈水平比200个光子的平均背景/噪音水平 高4√200，为256光子。因此，在某些实施方式中，确定样品中的标记物 浓度包括建立阈水平，高于阈水平的光子信号代表存在标记物。相反地， 具有不高于阈水平的能量水平的光子信号表明不存在标记物。
采取多个箱元测量以测定样品浓度，且对于每一个箱元测量确定是 否存在标记物。一般地，1分钟内能够进行60000个或更多的测量(例如， 在箱元大小为1毫秒的实施方式中，箱元大小越小，测量的数目相对地 越大，例如，箱元大小为10微秒，则每分钟6000000个测量)。因此， 没有一个测量是关键性的，因而本方法提供了高的误差容限。在测定处 理样品中的标记物的浓度时不考虑确定不含标记物的箱元(“无”箱元)， 只有在确定含有标记物的箱元(“有”箱元)中进行的测量才考虑在内。 不考虑在“无”箱元中或缺乏标记物的箱元中进行的测量提高了信噪比和 测量的准确性。因此，在某些实施方式中，确定样品中的标记物浓度包 括检测反映标记物存在的箱元的测量。
通过使检测微粒-标记复合物的箱元测量过程中检测背景噪音的时 间最小化，可以提高信噪比或分析器系统的灵敏度。例如，在持续1毫 秒的箱元测量中，在这一过程中，一个微粒-标记复合物在250微秒内经 过探询空间而被检测，而1毫秒中的750微秒则花在检测背景噪音发射 上。通过减少箱元时间能够提高信噪比。在某些实施方式中，箱元时间 是1毫秒。在其它实施方式中，箱元时间是750、500、250微秒、100微 秒、50微秒、25微秒或10微秒。其它的箱元时间如本文所述。
影响测量的其它因素是荧光部分的亮度或暗度、流速和激光器的功 率。使得能够检测标记物的相关因素的各种组合对于本领域的技术人员 是显而易见的。在某些实施方式中，不改变流速而调整箱元时间。本领 域的技术人员可以理解，随着箱元时间减少，指向探询空间的激光器的 功率输出必须增加，以维持在箱元时间内应用于探询空间的总能量恒 定。例如，如果箱元时间从1000微秒减少到250微秒，作为第一近似值， 激光器的功率输出必须增加大约4倍。这些设置使得在250μs内检测到的 光子数目与在给定的先前设置下1000μs内检测的光子数目相同，并使得 以较低的背景而因此较高的灵敏度对样品进行较快速的分析。另外，为 了加速样品处理，可以调整流速。这些数字仅仅是示例性的，技术人员 可以根据需要调整参数以获得预期结果。
在某些实施方式中，探询空间涵盖了样品流的整个横截面。当探询 空间涵盖样品流的整个横截面时，为了计算处理样品中的标记物的浓 度，只需要在设定的长度时间内测定的标记物的数目和经过横截面的样 品流的体积。在某些实施方式中，可以例如，通过激光束照射的点的大 小对探询空间进行限定而限定探询空间小于样品流的横截面积。在某些 实施方式中，通过调整分析器的孔306(图1A)或358和359(图1B)及 减小物镜向检测器成像的照射体积来限定探询空间。在某些实施方式 中，当限定探询空间小于样品流的横截面积时，可以通过复合物发射的 信号的内插(interpolation)，由使用一种或多种已知浓度的标准样品产 生的标准曲线确定标记物的浓度。在再另外的实施方式中，可以通过比 较测量的微粒与内标标准来确定标记物的浓度。在分析稀释样品的实施 方式中，在计算起始样品中的目标分子浓度时，要将稀释因素考虑在内。
如上讨论的，当探询空间涵盖样品流的整个横截面时，为了计算样 品的浓度，只需要计算在设定的长度时间(箱元)内经过横截面的计数 标记物的数目和在箱元中探询的样品的体积。确定“有”箱元中含有的标 记物的总数并与由分析中使用的箱元的总数代表的样品体积相关联以 确定处理样品中的标记物浓度。因此，在一个实施方式中，确定处理样 品中的标记物的浓度包括确定检测的“有”箱元的标记物总数，并将检测 的标记物的总数与分析的总样品体积相关联。分析的总样品体积是在指 定的时间间隔内经过毛细流动池且通过探询空间的样品体积。或者，通 过在多个箱元中由标记物发射的信号的内插，由标准曲线来确定样品中 的标记复合物的浓度，该标准曲线通过用含有已知浓度的标记物的标准 样品确定在同样数目的箱元中标记物发射的信号而产生。
在某些实施方式中，箱元中检测的单独的标记物的数目与处理样品 中的微粒的相对浓度相关。在相对低的浓度时，例如，低于约10-16M的 浓度时，标记物的数目与在箱元中检测的光子信号成比例。因此，在标 记物的低浓度时，光子信号提供作为数字信号。在相对较高的浓度时， 例如，高于约10-16M的浓度时，由于两个或多个标记物在大约同样的时 间越过探询空间并被计为一个的可能性变得明显，失去了光子信号与标 记物的比例关系。因此，在某些实施方式中，通过减少箱元测量的时间 长度来解析浓度大于约10-16M的样品中的单独微粒。
或者，在其它实施方式中，可检测由存在于任一个箱元中的多个微 粒发射的总光子信号。这些实施方式使得本发明的单分子检测器动态范 围是至少3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8或大于8个数量级(logs)。
本文所用的术语“动态范围”，指无需稀释或其它处理来改变浓度不 同的连续样品的浓度即可用仪器定量的样品浓度范围，其中，以适于预 期用途的准确度来确定浓度。例如，如果微量滴定板在一个孔中包含1 飞摩尔浓度目标分析物的样品，在另一个孔中包含10000飞摩尔浓度目 标分析物的样品，且在第三个孔中包含100飞摩尔浓度目标分析物的样 品，则具有至少4数量级的动态范围和1飞摩尔的定量下限的仪器能够 准确地定量所有样品的浓度而不需要如稀释的进一步处理以改变浓度。 通过标准方法可以确定准确度，例如，使用浓度跨越动态范围的一系列 标准物并建立标准曲线。可以使用产生的标准曲线拟合标准测量作为准 确度的测量，例如，r2大于约0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.91、0.92、 0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或0.99。
通过改变分析来自检测器的数据的方式，和/或通过在检测器和探询 空间之间使用衰减器来获得增加的动态范围。在范围的低端，其中处理 样品足够稀释而使得每一个检测事件，即，箱元中高于阈水平的每一次 光子脉冲(“事件光子”)，很可能只代表一个标记物，对数据进行分析以 将检测事件计数作为单分子。即，如上文所述，每一个箱元分析为代表 标记物存在的简单的“有”或“无”。对于更浓缩的处理样品，其中，两个 或多个标记物占据单一箱元的可能性变得明显，在相当数目的箱元中的 事件光子的数目实质上大于预期的单一标记物数目，例如，相当数目的 箱元中事件光子的数目相当于预期的单一标记物数目的2倍、3倍或更 多。对于这些样品，仪器将其数据分析方法改变为对于处理样品的箱元 的事件光子总数目进行积分。这一总数目与所有箱元中标记物的总数目 成比例。对于甚至更浓缩的处理样品，其中大部分箱元中出现许多标记 物，背景噪音变为来自每一个箱元中的总信号的无关紧要的一部分，因 而仪器将其数据分析方法改变为计算每一箱元的总的光子(包括背景)。 当浓度使得到达检测器的光的强度另外超过检测器精确计数光子的能 力时，即检测器饱和时，通过在流动池和检测器之间使用衰减器能够获 得动态范围更进一步的增加。
仪器可以包括数据分析系统，其接受来自检测器的输入，并确定对 于运行的样品合适的分析方法，并输出基于这样的分析的值。如果在仪 器中包括衰减器，数据分析系统可以进一步输出使用或不使用衰减器的 指令。
通过利用这样的方法，仪器的动态范围可以急剧增加。因此，在某 些实施方式中，仪器能够在高于约1000(3数量级)、10 000(4数量级)、 100 000(5数量级)、350 000(5.5数量级)、1 000 000(6数量级)、3 500 000 (6.5数量级)、10 000 000(7数量级)、35 000 000(7.5数量级)或1 00 000 000(8数量级)的动态范围上测量样品的浓度。在某些实施方式中，仪器 能够在高于约100 000(5数量级)的动态范围上测量样品的浓度。在某些 实施方式中，仪器能够在高于约1 000 000(6数量级)的动态范围上测量 样品的浓度。在某些实施方式中，仪器能够在高于约100 0000(7数量级) 的动态范围上测量样品的浓度。在某些实施方式中，仪器能够在从约1-10 飞摩尔到至少约1000、10 000、100 000、350 000、1 000 000、3 500 000、 10 000 000或35 000 000飞摩尔的动态范围上测量样品的浓度。在某些 实施方式中，仪器能够在从约1-10飞摩尔到至少约10 000飞摩尔的动 态范围上测量样品的浓度。在某些实施方式中，仪器能够在从约1-10飞 摩尔到至少约100 000飞摩尔的动态范围上测量样品的浓度。在某些实 施方式中，仪器能够在从约1-10飞摩尔到至少约1 000 000飞摩尔的动 态范围上测量样品的浓度。在某些实施方式中，仪器能够在从约1-10飞 摩尔到至少约10 000 000飞摩尔的动态范围上测量样品的浓度。
在某些实施方式中，本发明的分析器或分析器系统能够以低于1纳 摩尔、或1皮摩尔、或1飞摩尔、或1阿托摩尔、或1仄摩尔的检测限 检测例如生物标志物的分析物。在某些实施方式中，当生物标志物以低 于1纳摩尔、或1皮摩尔、或1飞摩尔、或1阿托摩尔、或1仄摩尔的 浓度在样品中存在时，且当各样品的大小为低于约100、50、40、30、 20、10、5、2、1、0.1、0.01、0.001或0.0001μl时，分析器或分析器系 统能够检测从一个样品到另一个样品的一种或多种分析物(例如生物标 志物)的低于约0.1、1、2、5、10、20、30、40、50、60或80％的浓度 改变。在某些实施方式中，当分析物以低于约1皮摩尔的浓度在样品中 存在时，且当各样品的大小为低于约50μl时，分析器或分析器系统能 够检测从第一样品到第二样品的分析物的低于约20％的浓度改变。在某 些实施方式中，当分析物以低于约100飞摩尔的浓度在样品中存在时， 且当各样品的大小为低于约50μl时，分析器或分析器系统能够检测从 第一样品到第二样品的分析物的低于约20％的浓度改变。在某些实施方 式中，当分析物以低于约50飞摩尔的浓度在样品中存在时，且当各样 品的大小为低于约50μl时，分析器或分析器系统能够检测从第一样品 到第二样品的分析物的低于约20％的浓度改变。在某些实施方式中，当 分析物以低于约5飞摩尔的浓度在样品中存在时，且当各样品的大小为 低于约50μl时，分析器或分析器系统能够检测从第一样品到第二样品 的分析物的低于约20％的浓度改变。在某些实施方式中，当分析物以低 于约5飞摩尔的浓度在样品中存在时，且当各样品的大小为低于约5μl 时，分析器或分析器系统能够检测从第一样品到第二样品的分析物的低 于约20％的浓度改变。在某些实施方式中，当分析物以低于约1飞摩尔 的浓度在样品中存在时，且当各样品的大小为低于约5μl时，分析器或 分析器系统能够检测从第一样品到第二样品的分析物的低于约20％的 浓度改变。
V.适于肌钙蛋白的高灵敏分析的仪器和系统
本发明的方法利用高灵敏度的分析仪器，例如，单分子检测器。这 样的单分子检测器包括如下文描述的实施方式。
A.装置/系统
一方面，本文所述的方法利用能够检测样品中的单一微粒的分析器 系统。在一个实施方式中，分析器系统能够进行荧光标记微粒的单一微 粒检测，其中，当单一微粒存在于限定在与分析器系统的采样系统流体 连接的毛细流动池之内的探询空间中时，分析器系统检测激发的荧光标 记物响应电磁辐射源的照射而发射的能量。在分析器系统的进一步的实 施方式中，单一微粒利用动力移动通过毛细流动池的探询空间。在分析 器系统的另一实施方式中，分析器系统中可以包括自动采样系统，用来 将样品引入分析器系统。在分析器系统的另一实施方式中，分析器系统 中可以包括用于制备样品的样品制备系统。在进一步的实施方式中，分 析器系统可以含有样品回收系统，用来在分析完成后回收至少一部分样 品。
一方面，分析器系统包括用来激发用荧光标记物标记的单一微粒的 电磁辐射源。在一个实施方式中，分析器系统的电磁辐射源是激光器。 在进一步的实施方式中，电磁辐射源是连续波激光器。
在一个典型的实施方式中，电磁辐射源在标记物通过毛细流动池的 探询空间时激发连接在标记物上的荧光部分。在某些实施方式中，荧光 标记部分包括一个或多个荧光染料分子。在某些实施方式中，荧光标记 部分是量子点。本文所述的任何荧光部分可用于标记物中。
当标记物通过位于毛细流动池之内的探询空间时，标记物暴露于电 磁辐射中。探询空间一般与采样系统流体连接。在某些实施方式中，标 记物通过毛细流动池的探询空间，是因为动力使得标记物通过分析器系 统。探询空间的位置使其接受来自辐射源发射的电磁辐射。在某些实施 方式中，采样系统是自动采样系统，能够采集多个样品而不需要操作员 的干涉。
标记物通过探询空间，且当被电磁辐射源激发时，发射可检测量的 能量。在一个实施方式中，电磁辐射检测器可操作地与探询空间连接。 电磁辐射检测器能够检测标记物(例如标记物的荧光部分)发射的能量。
在分析器系统的进一步的实施方式中，系统进一步包括样品制备机 构，其中，样品可以部分地或完全地制备而用于分析器系统的分析。在 分析器系统的某些实施方式中，在系统分析样品后可以抛弃样品。在其 它实施方式中，分析器系统进一步包括样品回收机构，其中，在分析之 后，至少一部分、或可选择地全部或基本上全部的样品可以回收。在这 样的一个实施方式中，样品可以返回到样品的来源处。在某些实施方式 中，样品可以返回到样品微量滴定板的微量滴定孔中。分析器系统一般 进一步包括数据获取系统，用来收集并报告检测到的信号。
B.单一微粒分析器
如图1A所示，这里所述的是分析器系统300的一个实施方式。分析 器系统300包括电磁辐射源301、镜子302、透镜303、毛细流动池313、 显微镜物镜305、孔306、检测器透镜307、检测器滤光器308、单一光子 检测器309和可操作地与检测器连接的处理器310。
在运行中，调准电磁辐射源301使得它的输出311可以在镜子302的 前表面312反射出去。透镜303将光束311聚焦于毛细流动池313中的单一 探询空间(图2A显示探询空间314的一个示例)。显微镜物镜305收集来 自样品微粒的光，并在孔306上形成光线的图像。孔306影响毛细流动池 313的探询空间中的样本发射的光的可以收集的部分。检测器透镜307收 集经过孔306的光，并将经过检测器滤光器308之后的光聚焦于检测器 309的活性区。检测器滤光器308在最大化激发的微粒结合荧光部分发射 的信号的同时，将由于光散射或周围光引起的异常的噪音信号最小化。 处理器310根据本文所述的方法处理来自微粒的光信号。
在一个实施方式中，显微镜物镜305是高数值孔径显微镜物镜。本 文所用的“高数值孔径透镜”，包括具有等于或大于0.6的数值孔径的透 镜。数值孔径是物镜捕获的高度衍射成像光线的数值量度。较大的数值 孔径允许逐渐增加的斜射光线进入物镜透镜，从而产生更高分辨率的图 像。另外，图像的亮度随较大的数值孔径而增加。高数值孔径透镜可从 各种厂商购买，且任一种具有等于或大于大约0.6的数值孔径的透镜可以 在分析器系统中使用。在某些实施方式中，透镜具有约0.6-约1.3的数值 孔径。在某些实施方式中，透镜具有约0.6-约1.0的数值孔径。在某些实 施方式中，透镜具有约0.7-约1.2的数值孔径。在某些实施方式中，透镜 具有约0.7-约1.0的数值孔径。在某些实施方式中，透镜具有约0.7-约0.9 的数值孔径。在某些实施方式中，透镜具有约0.8-约1.3的数值孔径。在 某些实施方式中，透镜具有约0.8-约1.2的数值孔径。在某些实施方式中， 透镜具有约0.8-约1.0的数值孔径。在某些实施方式中，透镜具有至少约 0.6的数值孔径。在某些实施方式中，透镜具有至少约0.7的数值孔径。 在某些实施方式中，透镜具有至少约0.8的数值孔径。在某些实施方式中， 透镜具有至少约0.9的数值孔径。在某些实施方式中，透镜具有至少约1.0 的数值孔径。在某些实施方式中，显微镜物镜305的孔径为大约1.25。在 使用0.8的显微镜物镜305的一个实施方式中，可以使用Nikon 60X/0.8 NA Achromat透镜(Nikon，Inc.，USA)。
在某些实施方式中，电磁辐射源301是在可见光谱内发射光的激光 器。在所有的实施方式中，设定电磁辐射源，使得激光器的波长设定为 足以激发连接在微粒上的荧光标记物的波长。在某些实施方式中，激光 器是具有639nm波长的连续波激光器。在其它实施方式中，激光器是具 有532nm波长的连续波激光器。在其它实施方式中，激光器是具有422 nm波长的连续波激光器。在其它实施方式中，激光器是具有405nm波长 的连续波激光器。可以使用任何具有适于激发本发明的方法和组合物中 使用的荧光部分的波长的连续波激光器而不背离本发明的范围。
在单微粒分析器系统300中，随着每一个微粒通过电磁辐射源的光 束311，微粒进入激发态。当微粒从其激发态弛豫时，发射可检测的光的 脉冲。每一个微粒在其通过光束的时间长度中，重复多次激发-发射循环， 从而使得分析器系统300在每个微粒通过探询空间314时对每个颗粒检 测几十到几千个光子。荧光微粒发射的光子被具有时间延迟的检测器 309记录(图1A)，时间延迟表明微粒标记复合物通过探询空间的时间。 检测器309记录光子强度，且采样时间分成箱元，箱元是具有可自由选 择的时间道宽的均匀、任意的时间段。确定在每一个箱元获得的信号的 数目。为了确定微粒出现的时间，采用几种统计分析方法中的一种或其 组合。这样的方法包括确定分析器系统的基线噪音和在基线噪音之上设 定统计水平的荧光标记物的信号强度以消除来自检测器的假阳性信号。
将电磁辐射源301聚焦于分析器系统300的毛细流动池313上，其中， 毛细流动池313与采样系统流体连接。探询空间314如图2A所示。来自图 1A的连续波电磁辐射源301的光束311光学聚焦于毛细流动池313内的特 定深度。光束311以垂直于毛细流动池313的角度指向填充样品的毛细流 动池313。光束311以选择来激发标记目标微粒的特定荧光标记物的预定 波长操作。光束311的直径和光束311聚焦的深度一起确定了探询空间 314的大小或体积。或者，可以通过在分析器系统中运行已知浓度的校 准样品确定探询空间。
当在样品浓度中检测单分子时，设定单分子检测所需的光束大小和 聚焦的深度，从而限定探询空间314的大小。设定探询空间314使得在具 有合适的样品浓度时在进行观察的每个时间间隔中只有一个微粒出现 于探询空间314中。可以理解，由光束限定的检测探询体积不是完美的 球形，一般是“领结(bow-tie)”形状。但是，为了定义的目的，探询空 间的“体积”这里定义为直径等于光束的聚焦点直径的球形包围的体积。 在不背离本发明范围的情况下，光束311的聚焦点可以具有各种直径。 在某些实施方式中，光束聚焦点的直径是约1-约5、10、15或20微米，或 约5-约10、15或20微米，或约10-约20微米，或约10-约15微米。在某些 实施方式中，光束聚焦点的直径是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微米。在某些实施方式中， 光束聚焦点的直径是约5微米。在某些实施方式中，光束聚焦点的直径 是约10微米。在某些实施方式中，光束聚焦点的直径是约12微米。在某 些实施方式中，光束聚焦点的直径是约13微米。在某些实施方式中，光 束聚焦点的直径是约14微米。在某些实施方式中，光束聚焦点的直径是 约15微米。在某些实施方式中，光束聚焦点的直径是约16微米。在某些 实施方式中，光束聚焦点的直径是约17微米。在某些实施方式中，光束 聚焦点的直径是约18微米。在某些实施方式中，光束聚焦点的直径是约 19微米。在某些实施方式中，光束聚焦点的直径是约20微米。
在单一微粒分析器系统的可代替的实施方式中，可以使用多于一个 的电磁辐射源来激发用不同波长的荧光标记物标记的微粒。在另一可代 替的实施方式中，可以使用多于一个的毛细流动池中的探询空间。在另 一可代替的实施方式中，可采用多重检测器来检测来自荧光标记物的不 同的发射波长。图1B显示合并分析器系统的这些可代替实施方式中的每 一个的图解。这些实施方式从以前的美国专利申请11/048 660号中引入本 文作为参考。
在分析器系统300的某些实施方式中，需要动力以移动微粒通过分 析器系统300的毛细流动池313。在一个实施方式中，动力可以是压力的 形式。用来移动微粒通过毛细流动池的压力可由泵产生。在某些实施方 式中，可以使用Scivex，Inc.HPLC泵。在使用泵作为动力的某些实施方 式中，样品可以1微升/分钟-约20微升/分钟，或约5微升/分钟-约20微升/ 分钟的速度通过毛细流动池。在某些实施方式中，样品可以约5微升/分 钟的速度通过毛细流动池。在某些实施方式中，样品可以约10微升/分钟 的速度通过毛细流动池。在某些实施方式中，样品可以约15微升/分钟的 速度通过毛细流动池。在某些实施方式中，样品可以约20微升/分钟的速 度通过毛细流动池。在某些实施方式中，可以使用电动力来移动微粒通 过分析器系统。这类方法以前已经公开，从美国专利申请11/048 660号中 引入本文作为参考。
在分析器系统300的一方面，分析器系统的检测器309检测荧光标记 物发射的光子。在一个实施方式中，光子检测器是光电二极管。在进一 步的实施方式中，检测器是雪崩光电二极管。在某些实施方式中，光电 二极管是具有190nm和1100nm检测波长的硅光电二极管。当使用锗光 电二极管时，检测光的波长是400-1700nm。在其它实施方式中，当使用 铟砷化镓光电二极管时，光电二极管检测的光的波长是800-2600nm。当 使用硫化铅光电二极管作为检测器时，检测的光的波长是1000-3500nm。
在某些实施方式中，按常规光学排列来安排电磁辐射源301的光学 器件和检测器309的光学器件。在这样的安排中，电磁辐射源和检测器 定位在不同的焦平面。如图1A和1B所示的分析器系统的激光器和检测器 光学器件的安排是常规的光学排列。
在某些实施方式中，按共焦光学排列来安排电磁辐射源的光学器件 和检测器的光学器件。在这样的安排中，电磁辐射源301和检测器309定 位在相同的焦平面。共焦安排使得分析器更加耐用，因为如果移动分析 器系统，电磁辐射源301和检测器的光学器件309不需要重新调整。这种 安排也使得分析器的使用更加简化，因为它不需重新调整分析器系统的 组件。分析器300(图1A)和分析器355(图1B)的共焦安排分别如图3A 和3B所示。图3A显示来自电磁辐射源301的光束311被显微镜物镜315聚 焦，以在毛细流动池313之内形成一个探询空间314(图2A)。分色镜316， 其反射激光而让荧光通过，用来分离荧光和激光。位于检测器之前的滤 光器317消除了检测器的任何非荧光光线。在某些实施方式中，以共焦 排列配置的分析器系统可以包括两个或多个探询空间。以前已经公开了 这种方法，从以前的美国专利申请号11/048 660中引入本文引入作为参 考。
激光器可以是可调染料激光器，如氦-氖激光器。可以设置激光器以 发射632.8nm的波长。或者，可以设置激光器的波长来发射543.5nm或 1523nm的波长。或者，电磁激光器可以是氩离子激光器。在这样的实 施方式中，可以操作氩离子激光器作为在可见光谱内的约25种不同的波 长处的连续气体激光器，波长设置为408.9-686.1nm，但其最佳操作性能 设置为488-514.5nm。
1  电磁辐射源
在分析器系统的某些实施方式中，可以使用化学发光标记物。在这 样的实施方式中，不必利用EM源来检测微粒。在另一实施方式中，外 来的标记物或微粒的内在特征是光作用标记或特征，例如，荧光标记物 或光散射标记物。在这样的实施方式中，使用EM辐射源来照射标记物 和/或微粒。优选激发荧光标记物的EM辐射源。
在某些实施方式中，分析器系统包括电磁辐射源301。在不背离本 发明的范围的情况下，在任一种分析器系统300中可以使用任何数目的 辐射源。以前已经公开了多重电磁辐射源，从以前的美国专利申请11/048 660号中引入本文作为参考。在某些实施方式中，所有的连续波电磁 (EM)辐射源在相同的波长处发射电磁辐射。在其它实施方式中，不 同的源发射不同波长的EM辐射。
在一个实施方式中，EM源301、351、352是产生200-1000nm波长的 连续波激光器。这样的EM源优点在于体积小、持久耐用且相对便宜。 另外，它们一般具有比其它光源产生更大的荧光信号的能力。合适的连 续波EM源的具体例子包括但不限于：氩、氪、氦-氖、氦-镉型激光器， 以及可调二极管激光器(红-红外区域)，每个具有频率加倍的可能性。 激光器提供连续照射而不需如光栅的附属的电子或机械装置以干扰其 照射。在使用连续波激光器的一个实施方式中，3mW的电磁辐射源可提 供足够的能量来激发荧光标记。来自具有这样的能量输出的连续波激光 器的光束可以是直径为2-5μm。为了达到3mW的照射，微粒暴露于激光 束的时间可以是约1毫秒。在可替换的实施方式中，暴露于激光束的时 间可以等于或小于约500微秒。在可替换的实施方式中，暴露时间可以 等于或小于约100微秒。在可替换的实施方式中，暴露时间可以等于或 小于约50微秒。在可替换的实施方式中，暴露时间可以等于或小于约10 微秒。
LED是另一类低成本、高可靠性的照射源。在超高亮LED和具有高 吸收截面、量子产额的染料方面的最新进展支持LED在单微粒检测中的 适用性。这样的激光器可以单独使用或联合其它光源使用，如水银弧光 灯、元素弧光灯、卤素灯、弧光放电、等离子体放电、发光二极管或这 些的组合。
在其它实施方式中，EM源可以是脉冲波激光器的形式。在这样的 实施方式中，激光器的脉冲大小是一个重要的因素。在这样的实施方式 中，大小、聚焦点及激光器发射的总能量是重要的，且必须具有足够的 能量以能够激发荧光标记。当使用脉冲激光器时，需要较长持续时间的 脉冲。在某些实施方式中，可以使用2纳秒的激光脉冲。在某些实施方 式中，可以使用5纳秒的激光脉冲。在某些实施方式中，可以使用2-5纳 秒的激光脉冲。
最佳激光强度取决于单染料的光漂白特征和穿过探询空间所需的 时间长度(包括微粒的速度，探询空间之间的距离(如果使用多于一个 探询空间)和探询空间的大小)。为了获得最大信号，需要以不会导致 高百分比的染料产生光漂白的最高强度照射样品。优选的强度是使得不 超过5％的染料在微粒穿过探询空间的时间内被漂白的强度。
根据需要激发的染料分子的类型、染料分子的激发时间和/或染料分 子经过毛细流动池的速度，设置激光器的功率。激光器的功率定义为光 束传递能量的速度，且以焦耳/秒或瓦特的单位测量。可以理解，为了在 微粒经过探询空间时向探询空间提供恒定量的能量，激光器输出功率越 大，激光器照射微粒的时间就可以越短。因此，在某些实施方式中，激 光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能 量大于约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、 30、35、40、45、50、60、70、80、90或100微焦耳。在某些实施方式 中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的 总能量小于约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、 30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或110微焦耳。在某些实施 方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接 收的总能量约0.1-100微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照射 时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约1-100微焦耳。在 某些实施方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射 时间内接收的总能量约1-50微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率 和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约2-50微焦 耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间 在照射时间内接收的总能量约3-60微焦耳。在某些实施方式中，激光器 的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约 3-50微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得 探询空间在照射时间内接收的总能量约3-40微焦耳。在某些实施方式中， 激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总 能量约3-30微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照射时间的组 合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约1微焦耳。在某些实施方 式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接收 的总能量约3微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照射时间的 组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约5微焦耳。在某些实施 方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接 收的总能量约10微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照射时间 的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约15微焦耳。在某些实 施方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间内 接收的总能量约20微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照射时 间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约30微焦耳。在某些 实施方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时间 内接收的总能量约40微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照射 时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约50微焦耳。在某 些实施方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射时 间内接收的总能量约60微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和照 射时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约70微焦耳。在 某些实施方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照射 时间内接收的总能量约80微焦耳。在某些实施方式中，激光器的功率和 照射时间的组合使得探询空间在照射时间内接收的总能量约90微焦耳。 在某些实施方式中，激光器的功率和照射时间的组合使得探询空间在照 射时间内接收的总能量约100微焦耳。
在某些实施方式中，激光器的输出功率设置为至少约1mW、2 mW、3mW、4mW、5mW、6mw、7mW、8mW、9mW、10mW、 13mW、15mW、20mW、25mW、30mW、40mW、50mW、60mW、 70mW、80mW、90mW、100mW或大于100mW。在某些实施方式中， 激光器的输出功率设置为至少约1mW。在某些实施方式中，激光器的输 出功率设置为至少约3mW。在某些实施方式中，激光器的输出功率设置 为至少约5mW。在某些实施方式中，激光器的输出功率设置为至少约10 mW。在某些实施方式中，激光器的输出功率设置为至少约20mW。在 某些实施方式中，激光器的输出功率设置为至少约30mW。在某些实施 方式中，激光器的输出功率设置为至少约40mW。在某些实施方式中， 激光器的输出功率设置为至少约50mW。在某些实施方式中，激光器的 输出功率设置为至少约60mW。在某些实施方式中，激光器的输出功率 设置为至少约90mW。
激光器照射探询空间的时间可以设置为不低于约1、2、3、4、5、 10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、150、300、 350、400、450、500、600、700、800、900或1000微秒。激光器照射探 询空间的时间可以设置为不高于约2、3、4、5、10、15、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、150、300、350、400、450、500、 600、700、800、900、1000、1500或2000微秒。激光器照射探询空间的 时间可以设置为约1-1000微秒。激光器照射探询空间的时间可以设置为 约5-500微秒。激光器照射探询空间的时间可以设置为约5-100微秒。激 光器照射探询空间的时间可以设置为约10-100微秒。激光器照射探询空 间的时间可以设置为约10-50微秒。激光器照射探询空间的时间可以设置 为约10-20微秒。激光器照射探询空间的时间可以设置为约5-50微秒。激 光器照射探询空间的时间可以设置为约1-100微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约1微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约5微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约10微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约25微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约50微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约100微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约250微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约500微秒。在某些实施方式中， 激光器照射探询空间的时间可以设置为约1000微秒。
例如，在激光器提供3mW、4mW、5mW或超过5mW的功率输出 的情况下，激光器照射探询空间的时间可以设置为1毫秒、250微秒、100 微秒、50微秒、25微秒或10微秒。在某些实施方式中，用提供输出功率 为3mW的激光器照射标记物，且照射标记物约1000微秒。在其它实施方 式中，用提供输出功率为不高于约20mW的激光器照射标记物少于1000 毫秒。在其它实施方式中，用提供输出功率为20mW的激光器照射标记 物少于或等于约250微秒。在某些实施方式中，用提供输出功率为约5mW 的激光器照射标记物少于或等于约1000微秒。
2.毛细流动池
毛细流动池流体连接样品系统。在一个实施方式中，通过相应的光 束311的横截面积和检测器309视野内光束之内的片段来确定分析器系统 的探询空间314。在分析器系统的实施方式中，探询空间314具有的如这 里定义的体积为约0.01-500pL、或约0.01-100pL、或约0.01-10pL、或约 0.01-1pL、或约0.01-0.5pL、或约0.02-约300pL、或约0.02pL-约50pL、 或约0.02pL-约5pL、或约0.02-约0.5pL、或约0.02-约2pL、或约0.05- 约50pL、或约0.05-约5pL、或约0.05-约0.5pL、或约0.05pL-约0.2pL、 或约0.1pL-约25pL。在某些实施方式中，探询空间具有的体积为约 0.01-10pL。在某些实施方式中，探询空间314具有的体积为约0.01-1pL。 在某些实施方式中，探询空间314具有的体积为约0.02-约5pL。在某些实 施方式中，探询空间314具有的体积为约0.02-约0.5pL。在某些实施方式 中，探询空间314具有的体积为约0.05-约0.2pL。在某些实施方式中，探 询空间314具有的体积为约0.1pL。其它有用的探询空间体积如本文所 述。本领域的技术人员可以理解，可以为了分析器的最高性能选择探询 空间314。尽管非常小的探询空间显示出最小化的背景噪音，但较大的 探询空间具有以下优点：能够在合理的时间分析低浓度样品。在使用两 个探询空间370和371的实施方式中，可以使用如本文所述的那些单一探 询空间314的体积。
在本发明的一个实施方式中，探询空间足够大以能够进行浓度范围 为约1000飞摩尔(fM)-约1仄摩尔(zM)的微粒的检测。在本发明的一个实 施方式中，探询空间足够大以能够进行浓度范围为约1000fM-约1阿托摩 尔(aM)的微粒的检测。在本发明的一个实施方式中，探询空间足够大以 能够进行浓度范围为约10fM-约1阿托摩尔(aM)的微粒的检测。在许多情 况下，大的探询空间使得能够进行浓度为低于约1fM的微粒的检测而不 需要额外的预浓缩设备或技术。本领域的技术人员公认，最合适的探询 空间的大小取决于待检测微粒的亮度、背景信号的水平和待分析样品的 浓度。
可以通过调整分析器的光学器件来限制探询空间314的大小。在一 个实施方式中，可以调整光束311的直径以改变探询空间314的体积。在 另一实施方式中，检测器309的视野可以改变。因此，可以调整源301和 检测器309使得在探询空间314之内照射并检测单一微粒。在另一实施方 式中，决定检测器309的视野的孔306(图1A)的宽度可以改变。这种构 造使得能够接近实时地改变探询空间，以补偿或多或少地浓缩的样品， 确保两个或多个微粒同时处于探询空间之内的低概率。可以对两个或多 个探询空间370和371进行类似的改变。
在另一实施方式中，可以通过使用已知浓度的校准样品限定探询空 间，校准样品在检测真实样品之前经过毛细流动池。当样品经过毛细流 动池，每次在校准样品中只检测一个单一微粒时，聚焦的深度连同电磁 辐射源的光束的直径决定毛细流动池中的探询空间的大小。
对探询空间的物理约束也可以由固体壁来提供。在一个实施方式 中，当样品流体包含于毛细管内时，壁是流动池313的一个或多个壁(图 2A)。在一个实施方式中，流动池由玻璃制成，但在不背离本发明的范 围的情况下，可以使用其它的可透过约200-约1000nm或更高范围内的 光的物质，如石英、熔融石英及有机材料，如特氟纶、尼龙、塑料如聚 氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯，或其任意组合。尽管在不背离本发明的范 围的情况下，可以使用其它横截面形状(例如，矩形、圆柱形)，但在 一个实施方式中，毛细流动池313具有正方形的横截面。在另一实施方 式中，可以至少部分地由在芯片(未示出)内蚀刻的通道(未示出)限 定探询空间。同样的考虑应用于使用两个探询空间的实施方式中(370 和371，在图2B中)。
探询空间浸浴在流体中。在一个实施方式中，流体是水性的。在其 它实施方式中，流体是非水性的或水性和非水性流体的组合。另外，流 体可以含有调节pH的试剂、离子成分或筛分剂(sieving agents)，例如可 溶性大粒子或聚合物或胶体。可以预期，在探询空间之间可以存在阀或 其它设备，以暂时性地中断流体连接。暂时性地中断的探询空间被认为 是通过流体连接的。
在本发明的另一实施方式中，探询空间是存在于流动池313之内的 单一的探询空间，其被稀释体积之内的样品材料的层流(也称为鞘流) 的大小所限制。在这些和其它实施方式中，探询空间可以由单独的鞘流 限定，也可以由鞘流和照射源尺寸或检测器视野的组合来限定。鞘流可 由许多方式形成，包括：样品材料是同中心层流的内部材料，稀释体积 在外部；稀释体积是在样品体积的一侧；稀释体积是在样品材料的两侧； 稀释体积是在样品材料的多个侧面上，但没有完全围绕样品材料；稀释 体积完全围绕样品材料；稀释体积同心地完全围绕样品材料；样品材料 是不连续液滴系列中的内部材料，稀释体积完全围绕每一滴样品材料。
在某些实施方式中，本发明的单分子检测器包括不超过一个探询空 间。在某些实施方式中，使用多个探询空间。多个探询空间已经在以前 公开，且从美国专利申请11/048 660号中引入本文作为参考。本领域的技 术人员可以认识到，在一些情况下，分析器含有2、3、4、5、6或更多个 独立的探询空间。
3.动力
在分析器系统的一个实施方式中，使用动力移动微粒穿过探询空 间。在某些实施方式中，移动微粒的动力是压力。在某些实施方式中， 由泵和空气压力源、真空源、离心机或其组合供应压力。在某些实施方 式中，移动微粒的动力是电动力。以前已经在在先申请中公开了作为动 力的电动力的使用，从美国专利申请11/048 660号中引入本文作为参考。
在一个实施方式中，使用压力作为动力移动微粒通过毛细流动池的 探询空间。在进一步的实施方式中，通过泵施加压力来移动样品。合适 的泵是本领域内已知的。在一个实施方式中，使用那些由Scivax，Inc.为 HPLC应用而制造的泵来作为动力。在其它实施方式中，当用泵抽取较 小体积的样品时，可以使用为微流体应用而制造的泵。在美国专利5 094 594、5 730 187、6 033 628和6 533 553号中描述了这样的泵，其公开了 能够用泵抽取纳升或皮升范围的体积的流体的设备。与样品接触的泵内 的所有材料优选地由高度惰性的材料制成，例如，聚醚醚酮(PEEK)、 熔融石英或蓝宝石。
有必要使用动力以移动样品通过毛细流动池来推动样品通过探询 空间从而进行分析。也需要动力以在样品通过之后推动冲洗样品通过毛 细流动池。当进行样品回收时，也需要动力以推动样品返回样品回收管。 标准泵有各种大小，可以选择合适的大小以适应预期的样品大小和流动 需求。在某些实施方式中，使用单独的泵来进行样品分析和系统的洗脱。 分析泵可以具有大约0.000001-大约10mL、或大约0.001-大约1mL、或大 约0.01-大约0.2mL、或大约0.005、0.01、0.05、0.1或0.5mL的容积。洗 脱泵可以比分析泵具有更大的容积。洗脱泵可以具有约0.01-约20mL、 或约0.1-约10mL、或约0.1-约2mL、或约0.05、0.1、0.5、1、5或10mL 的体积。这些泵的大小仅是示例性的，本领域的技术人员可以理解，泵 的大小可以根据应用、样品的大小、用泵抽取的样品的粘性、管的尺寸、 流速、温度及其它本领域内熟知的因素来选择。在某些实施方式中，通 过步进电机来驱动系统的泵，其易于通过微处理器非常精确地控制。
在优选的实施方式中，串联使用洗脱泵和分析泵，具有特定的止回 阀以控制流动方向。管件设计为当分析泵抽取最大量的样品时，样品不 会到达泵本身。这一点通过选择分析泵和分析毛细管之间的管道的内径 和长度，使得管道的体积大于分析泵的行程排量来实现。
4.检测器
在一个实施方式中，检测在荧光标记暴露于电磁辐射后发射的光 (例如，紫外、可见或红外范围的光)。检测器309(图1A)、或检测器 (364、365，图1B)能够捕捉来自荧光标记-部分复合物的光子脉冲的 幅度和持续时间，并进一步将光子脉冲的幅度和持续时间转化为电信 号。使用诸如CCD照相机、视频输入模块照相机及超高速扫描照相机的 检测设备来产生具有连续信号的图像。在另一实施方式中，可以使用诸 如测辐射热仪、光电二极管、光电二极管阵列、雪崩光电二极管及光电 倍增管的设备，其产生序列信号。也可以使用前述检测器的任意组合。 在一个实施方式中，使用雪崩光电二极管检测光子。
在探询空间314(图2A)和其对应的检测器309(图1A)之间使用特 定的光学器件，可以检测电磁辐射发射的一些独特特征，包括：发射波 长、发射强度、脉冲大小、脉冲持续时间和荧光偏振。在某些实施方式 中，检测器309是在反向偏压中使用的光电二极管。反向偏压中的光电 二极管装置通常具有极高的电阻。当合适频率的光照射P/N结时，这种 电阻减少。因此，通过追踪通过它的电流，可以使用反向偏压二极管作 为检测器。基于这种效应的电路比基于零偏压的电路对于光更灵敏。
在分析器系统的一个实施方式中，光电二极管可以是雪崩光电二极 管，其比起常规的光电二极管，可以以更高的反向偏压操作，因而允许 各个光生载体被雪崩击穿放大，在光电二极管内产生内部的增益，其增 加了设备的有效的响应率(灵敏度)。光电二极管的选择取决于荧光标 记的微粒发射的能量或发射波长。在某些实施方式中，光电二极管是硅 光电二极管，其检测190-1100nm范围的能量；在另一实施方式中，光电 二极管是锗光电二极管，其检测800-1700nm范围的能量；在另一实施方 式中，光电二极管是铟砷化镓光电二极管，其检测800-2600nm范围的能 量；在其它的实施方式中，光电二极管是硫化铅光电二极管，其检测低 于1000-3500nm范围的能量。在某些实施方式中，雪崩光电二极管是单 一光子检测器，设计为检测400-1100nm波长范围的能量。单一光子检测 器可商购(例如，Perkin Elmer，Wellesley，MA)。
在某些实施方式中，检测器是检测300-1700nm的能量的雪崩光电二 极管检测器。在一个实施方式中，可以使用硅雪崩光电二极管检测器来 检测300-1100nm的波长。可以使用铟砷化镓光电二极管检测器来检测 900-1700nm的波长。在某些实施方式中，分析器系统可以包含至少一个 检测器；在其它实施方式中，分析器系统可以包含至少两个检测器，且 每一个检测器选择和配置为检测特定波长范围的光能量。例如，可以使 用两个单独的检测器来检测已经用不同的标记物标记的微粒，其一经 EM源激发，就发射具有不同光谱的能量的光子。在一个实施方式中， 分析器系统可以包括能够检测如绿色染料(例如，Alexa 546)发射的 450-700nm范围的荧光能量的第一检测器，和能够检测如远红外染料(例 如，Alexa 647)发射的620-780nm范围的荧光能量的第二检测器。也可 以使用用来检测如蓝色染料(例如，Hoechst 33342)发射的400-600nm 范围的荧光能量和用来检测如红色染料(Alexa 546和Cy3)发射的 560-700nm范围的荧光能量的检测器。
可以使用包括两个或多个检测器的系统来检测用两个或多个发射 不同光谱的光的标记物标记的单独的微粒。例如，两个不同的检测器能 够检测已经用两个不同的染料标记物标记的抗体。或者，可以使用包括 两个检测器的分析器系统来检测不同类型的微粒，每一类型用不同的染 料分子或用两个或多个染料分子的混合物标记。例如，两个不同的检测 器可以用来检测两个不同类型的识别两种不同的蛋白质的抗体，每一类 型用不同的染料标记或用两种或多种染料标记分子的混合物标记。通过 改变两种或多种染料标记分子的比例，使用两个检测器，可以单独地检 测两个或多个不同的微粒类型。可以理解，在不背离本发明的范围的情 况下，可以使用三个或多个检测器。
本领域的技术人员可以理解，对每一个探询空间可以配置一个或多 个检测器，不论在流动池之内限定一个或多个探询空间，且可以配置每 一个检测器来检测以上所列的发射的电磁辐射的任一特征。例如用于多 探询空间的多检测器的使用，已经在以前的在先申请中公开，且从美国 专利申请11/048 660号引入本文作为参考。一旦微粒经标记而使其可检测 (或者如果微粒拥有使其可检测的内在特征)，在不背离本发明的范围 的情况下，可以使用本领域内已知的任何合适的检测机构，例如，CCD 照相机、视频输入模块照相机、超高速扫描照相机、测辐射热仪、光电 二极管、光电二极管阵列、雪崩光电二极管和产生序列信号的光电倍增 管，及其组合。可以检测电磁辐射的不同特征，包括：发射波长、发射 强度、脉冲大小、脉冲持续时间、荧光偏振及其任何组合。
C.采样系统
在进一步的实施方式中，分析器系统可能包括准备引入分析器系统 的样品的采样系统。包括的采样系统能够自动采集多个样品，并在样品 容器和第一探询空间之间提供流体连接。
在某些实施方式中，本发明的分析器系统包括将样品的等分试样引 入单一微粒分析器进行分析的采样系统。可以使用任何能够引入样品的 机构。可以使用或者由泵产生的真空吸力，或者施加到样品上的将液体 推向管内的压力，或者任何一种其它将样品引入采样管的机构来抽取样 品。一般地，但不是必需地，采样系统将已知样品体积的样品引入单一 微粒分析器；在检测微粒是否存在的某些实施方式中，样品大小的准确 信息不是关键的。在优选的实施方式中，采样系统提供了单个或多个样 品的自动采集。在将已知体积的样品引入系统的实施方式中，采样系统 提供了多于约0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2、5、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000、1500或2000μl的用 于分析的样品。在某些实施方式中，采样系统提供了低于约2000、1000、 500、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.1、 0.01或0.001μl的用于分析的样品。在某些实施方式中，采样系统提供了 约0.01-1500μl、或约0.1-1000μl、或约1-500μl、或约1-100μl、或约1-50 μl、或约1-20μl的用于分析的样品。在某些实施方式中，采样系统提供 了约5-200μl、或约5-100μl、或约5-50μl的用于分析的样品。在某些实 施方式中，采样系统提供了约10-200μl、或约10-100μl、或约10-50μl 的用于分析的样品。在某些实施方式中，采样系统提供了约0.5-约50μl 的用于分析的样品。
在某些实施方式中，采样系统提供了样品之间可以改变的样品大 小。在这些实施方式中，样品大小可以是本文所述的任一个样品大小， 并且如所期望的，可能随着每种样品或样品组而改变。
对于即将进行的分析，需要样品体积的准确度和采样系统的样品体 积之间的精密度。在某些实施方式中，采样体积的精密度由所用的泵决 定，一般地由样品体积的低于约50、40、30、20、10、5、4、3、2、1、 0.5、0.1、0.05或0.01％的变异系数(CV)代表。在某些实施方式中，采 样系统的样品之间的精密度由低于约50、40、30、20、10、5、4、3、2、 1、0.5、0.1、0.05或0.01％的变异系数(CV)代表。在某些实施方式中， 采样系统的批内精密度由低于约10、5、1、0.5或0.1％的变异系数(CV) 代表。在某些实施方式中，采样系统的批内精密度显示低于约5％的变 异系数(CV)。在某些实施方式中，采样系统的批间精密度由低于约10、 5或1％的变异系数(CV)代表。在某些实施方式中，采样系统的批间精 密度显示低于约5％的变异系数(CV)。
在某些实施方式中，采样系统提供了低的样品遗留率，优点在于在 样品之间不需要另外的洗涤步骤。因此，在某些实施方式中，样品遗留 率低于约1、0.5、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005或0.001％。 在某些实施方式中，样品遗留率低于约0.02％。在某些实施方式中，样 品遗留率低于约0.01％。
在某些实施方式中，取样器提供了进样环路。在这些实施方式中， 顺序将多个样品吸入管路，且每一个被缓冲“塞”与其它分开。一般地相 继地读取样品，之间不需要冲洗。在环路末端冲洗一次。在使用缓冲“塞” 的实施方式中，将缓冲塞喷射进入微量滴定板的单独的孔中可以回收塞 子。
采样系统可以适用于标准分析装置，例如，96孔微量滴定板，或优 选384孔板。在某些实施方式中，系统包括96孔板的定位器和用来将样 品管浸到孔内和孔外的机械装置，例如，提供沿X、Y和Z轴移动的机械 装置。在某些实施方式中，采样系统提供了多个采样管，当开始测试时， 样品可以储藏在其中并从其中抽取。在某些实施方式中，用一个检测器 分析所有的来自多个管的样品。在其它实施方式中，多个单一分子检测 器可以连接到样品管上。可以通过包括在使用采样系统采样之前在板孔 内对样品进行操作的步骤制备样品，或在分析器系统内制备样品，或两 者的一些组合。
D.样品制备系统
样品制备包括制备用于分析的原始样品的必需的步骤。这些步骤可 能包括，例如，一种或多种以下步骤：如离心、过滤、蒸馏、层析的分 离步骤，浓缩、细胞裂解、改变pH、加入缓冲液、加入稀释剂、加入试 剂、加热或冷却、加入标记物、结合标记物、通过照射交联、分离未结 合的标记物、灭活和/或除去干扰化合物，及任何其它制备用于通过单一 微粒分析器分析的样品的必需步骤。在某些实施方式中，处理血液以分 离血浆或血清。也可以对血清或血浆样品进行另外的标记、去除未结合 的标记物和/或稀释步骤。
在某些实施方式中，分析器系统包括样品制备系统，该样品制备系 统进行提供单粒子分析器分析用样品所需的某些或全部步骤。这一系统 可以进行任一或全部以上所列的样品制备的步骤。在某些实施方式中， 通过分析器系统的样品制备系统部分地处理样品。因此，在某些实施方 式中，可以首先在分析器系统之外部分地处理样品。例如，可以首先离 心处理样品。然后，可以通过样品制备系统在分析器之内部分地处理样 品。在分析器之内处理样品包括标记样品、将样品和缓冲液混合及其它 本领域的技术人员已知的处理步骤。在某些实施方式中，在分析器系统 以外处理血液样品以提供血清或血浆样品，血清或血浆样品被引入分析 器系统，并被样品制备系统进一步处理以对一种或多种目标微粒标记并 任选地除去未结合的标记物。在其它实施方式中，样品的制备可以包括 样品的免疫耗尽法，以除去非目标微粒或除去干扰样品分析的微粒。在 再另外的实施方式中，可以除去样品中的干扰样品分析的微粒。例如， 样品制备可以包括耗尽异嗜性抗体，已知其干扰使用非人类抗体直接地 或间接地检测目标微粒的免疫分析。类似地，可以使用识别干扰蛋白质 的抗体从样品中除去干扰目标微粒的测量的其它蛋白质。
在某些实施方式中，样品在分析之前可以进行固相萃取，然后再进 行分析。例如，分析cAMP的血清样品可以首先使用与其结合的c18柱进 行固相萃取。其它的如蛋白酶、脂肪酶和磷酸酶的蛋白质从c18柱洗下， 且cAMP可以洗脱而基本上不含能够降解cAMP或干扰cAMP测定的蛋白 质。固相萃取可以用来除去降低分析灵敏度的样品的基质。在再另外的 实施方式中，样品中存在的目标微粒可以通过干燥或冻干样品并将微粒 溶于比初始样品更小的体积来浓缩。例如，呼出气冷凝液(EBC)样品 可以干燥并再悬浮于小体积的合适的缓冲溶液中，以增强目标微粒的检 测。
在某些实施方式中，分析器系统提供了在系统中对待分析的样品进 行完全制备的样品制备系统，例如，对血液样品、唾液样品、尿液样品、 脑脊髓液样品、淋巴样品、BAL样品、呼出气冷凝液(EBC)样品、活 组织检查样品、法医样品、生物恐怖袭击样品等的完全制备。在某些实 施方式中，分析器系统提供进行某些或全部的样品制备的样品制备系 统。在某些实施方式中，初始样品是需要分析器系统进一步处理的血液 样品。在某些实施方式中，初始样品是需要分析器系统进一步处理的血 清或血浆样品。血清或血浆样品可以通过例如与结合一种或多种目标微 粒的标记物接触的方式进一步处理，然后在除去或未除去未结合的标记 物的情况下使用样品。
在某些实施方式中，或者在分析系统之外，或者在分析系统的样品 制备组件中，在一种或多种微量滴定板如96孔板上进行样品制备。试剂 储库、缓冲液，等等，可以与板孔通过本领域内熟知的管件或其它合适 的结构间断地流体连接。可以在96孔板或管件中单独地制备样品。样品 分离、结合标记物和(如果需要的话)分离标记物的步骤可以在一个板 上进行。在某些实施方式中，制备的微粒然后从板中释放，并将样品移 入管中采样到样品分析系统内。在某些实施方式中，样品制备的所有步 骤在一个板上进行，且分析系统直接从板上获得样品。尽管描述了关于 96孔板的实施方式，但是可以理解，可以使用任何一个用于容纳一种或 多种样品和适于制备样品的容器。例如，可以使用384或1536孔的标准 微量滴定板。更一般地，在某些实施方式中，样品制备系统能够容纳并 制备多于约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、 500、1000、5000或10000个样品。在某些实施方式中，可以采集多个样 品用于在多个分析器系统中分析。因此，在某些实施方式中，可以从样 品制备系统采集2个样品、或多于约2、3、4、5、7、10、15、20、50或 100个样品，并在多个样品分析器系统中平行运行。
微流体系统也可以用于样品制备，且作为是分析器系统的一部分的 样品制备系统，尤其是用于怀疑含有足够高的微粒浓度的样品，因而检 测需要较小体积的样品。微流体操作的原理和技术是本领域已知的。见 美国专利4 979 824、5 770 029、5 755 942、5 746 901、5 681 751、5 658 413、5 653 939、5 653 859、5 645 702、5 605 662、5 571 410、5 543 838、 5 480 614、5 716 825、5 603 351、5 858 195、5 863 801、5 955 028、5 989 402、6 041 515、6 071 478、6 355 420、6 495 104、6 386 219、6 606 609、 6 802 342、6 749 734、6 623 613、6 554 744、6 361 671、6 143 152、6 132 580、5 274 240、6 689 323、6 783 992、6 537 437、6 599 436、6 811 668 号和PCT专利申请公开WO9955461(A1)号。可以连续或平行制备样品用 于单一或多个分析器系统。
优选地，样品包括缓冲液。缓冲液可以在分析器系统外与样品混合， 或它可以由样品制备机构提供。尽管能够使用任何合适的缓冲液，但优 选的缓冲液具有低的荧光背景、对于可检测标记过的微粒为惰性、能够 维持工作pH、且在动力是电力的实施方式中具有适于电泳的离子强度。 缓冲液浓度可以是任何合适的浓度，如约1-约200mM的范围。可以使用 任何缓冲液系统，只要它提供了目标分子的溶解性、功能及可检测性 (delectability)。优选地，对于使用泵的应用，缓冲液选自磷酸盐、甘氨 酸、醋酸盐、柠檬酸盐、酸化(acidulate)、碳酸盐/碳酸氢盐、咪唑、三 乙醇胺、甘氨酰胺、硼酸盐、MES、Bis-Tris、ADA、aces、PIPES、MOPSO、 Bis-Tris丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、 氨基丁三醇(Trizma)、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、三(羟甲基)甲基 甘氨酸(Tricine)、Gly-Gly、N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)、HEPBS、 TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS和CABS。 缓冲液也可以选自Gly-Gly、N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘 氨酸、2-吗啉代乙磺酸(MES)、4-吗啉代丙磺酸(MOPS)和2-氨基-2- 甲基-1-丙醇盐酸盐(AMP)缓冲液。有用的缓冲液是pH8.1的2mM Tris/ 硼酸盐，但Tris/甘氨酸和Tris/HCl也是可接受的。其它缓冲液如本文所述。
用于电泳的缓冲液在在先申请中公开，从美国专利申请11/048660 号引入本文作为参考。
E.样品回收
本发明的分析器和分析系统的实施方式的一个非常有用的特征是， 不需要消耗样品即可分析。这在样品材料有限时尤其重要。回收样品也 使人们能够对其进行另外的分析或再分析。对于样品量有限和/或期望能 够再分析样品的应用，例如法医、药物筛选和临床诊断应用，这一特征 的优点对于本领域技术人员来说是显而易见的。
因此，在某些实施方式中，本发明的分析器系统进一步提供了在分 析后用于样品回收的样品回收系统。在这些实施方式中，该系统包括将 样品吸入分析器内、分析然后返回(例如通过同一路径)样品容器(例 如样品管)的机构和方法。因为样品没有破坏，且样品不会进入任何一 个阀或其它管件，样品未被污染。另外，因为样品通路中的所有的材料 是非常惰性的，例如，PEEK、熔融石英、或蓝宝石，所以极少有来自 样品通路的污染。步进电机控制的泵(尤其是分析泵)的使用允许精密 控制抽取和推回的体积。这使得能够完全地或几乎完全地回收样品，而 很少(即便有)被冲洗缓冲液稀释。因此，在某些实施方式中，在分析之 后，回收多于约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.5％或99.9％的样品。在某些实施方式中，回收 的样品未稀释。在某些实施方式中，回收的样品被稀释低于约1.5倍、1.4 倍、1.3倍、1.2倍、1.1倍、1.05倍、1.01倍、1.005倍、或1.001倍。
对于采样和/或样品回收，可以使用任何将液体样品从样品管转移到 分析器的机构。在某些实施方式中，分析毛细管的进口末端连接有一段 短的管件(例如，PEEK管件)，能够浸入样品容器(如测试管或样品孔) 或能够保持在废液容器以上。当通过冲洗来清洗装置中原有的样品时， 该管位于废物容器之上，吸取冲洗废液。当吸取样品时，该管放进样品 孔或测试管中。一般地，快速吸入样品，然后当观察样品中的微粒时缓 慢推出。或者，在某些实施方式中，在至少部分吸入循环中，缓慢吸入 样品；可以在缓慢吸取的同时分析样品。然后样品快速返回和快速冲洗。 在某些实施方式中，可以在内向循环(吸入)和外向循环(抽出)中分 析样品，其改善了例如小稀释样品的计数统计学，并确认结果，等等。 如果需要保留样品，可以将样品推回到其来自的同样的样品孔，或另一 个孔。如果不需要保留样品，将管件安置于废液容器之上。
VI.使用心肌肌钙蛋白的高灵敏分析的方法
本发明的方法使得远低于以前测量的浓度的心肌肌钙蛋白水平的 测量成为可能。尽管心肌肌钙蛋白是公认的心肌损伤标志物，但其实用 性受以下事实限制：使用当前的分析方法，只有在心肌损伤已经相当大 时才能检测到心肌肌钙蛋白，因为当前方法缺乏灵敏度。对于心肌梗塞 重新定义的联合欧洲心脏病协会/美国心脏病学院委员会推荐，心肌肌钙 蛋白浓度升高应被定义为超过参照组中心肌肌钙蛋白浓度分布的第99 百分位数的测量值，一个非常低的阈。推荐在该确定极限下<10％的总 变异系数(CV)。但是，主要在低浓度范围，对于心肌肌钙蛋白的目前 可用的免疫分析获得的分析变异系数不是均匀的。另外，对于检测非临 床(正常)受试者的肌钙蛋白水平，目前可用的分析缺乏足够的灵敏度， 而且正常人群的肌钙蛋白的真实基线或水平并未定义。本发明的检测器 系统显示出能够一贯地以低于10％的总变异系数、在低于10pg/ml的浓度 下检测cTnI的水平(见实施例)。因此，本发明提供了基于个体心肌肌钙 蛋白的高灵敏度检测确定诊断、预后或治疗方法的方法。
在某些实施方式中，本发明提供了确定个体的诊断、预后或治疗方 法的方法，包括：i)测定样品中的心肌肌钙蛋白浓度，或测定个体的系 列样品中的心肌肌钙蛋白浓度，其中，通过对所述样品中的心肌肌钙蛋 白的检测限低于约50、40、30、10、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于 约20pg/ml)的心肌肌钙蛋白分析确定浓度；和ii)根据样品的浓度或系 列样品的浓度，确定所述的个体的诊断、预后或治疗方法。测定心肌肌 钙蛋白浓度的方法包括任何具有必要灵敏度的合适的方法，例如，本文 所述的方法。在某些实施方式中，本方法利用测定样品中心肌肌钙蛋白 浓度的方法，其中，该方法包括检测肌钙蛋白的单一分子或其复合物或 片段。
在某些实施方式中，通过分析来自明显健康的人群的样品，例如， 血液、血清或血浆样品中的心肌肌钙蛋白，例如心肌肌钙蛋白I，并确定 高于80、90、95、96、97、98、99、99.5或99.9％的人群的水平的水平 (浓度)，从而确定肌钙蛋白的阈浓度。该值是阈值。在某些实施方式 中，设定阈值为第99百分位数值。在某些实施方式中，使用对心肌肌钙 蛋白的检测水平低于约50、20、10、5或1pg/ml(例如，低于约5pg/ml) 的方法进行分析。
在某些实施方式中，本发明提供了确定个体的诊断、预后或治疗方 法的方法，包括比较来自个体的样品的心肌肌钙蛋白的浓度值与心肌肌 钙蛋白的正常值或正常值的范围，其中，通过对所述样品中心肌肌钙蛋 白的检测限低于约50、40、30、10、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于 约20pg/ml)的心肌肌钙蛋白分析确定正常值或正常值的范围；和ii)根 据比较，确定所述个体的诊断、预后或治疗方法。
在某些实施方式中，心肌肌钙蛋白是心肌肌钙蛋白I或心肌肌钙蛋白 T。在某些实施方式中，心肌肌钙蛋白是心肌肌钙蛋白T。在某些实施方 式中，心肌肌钙蛋白是心肌肌钙蛋白I。本方法可以在确定诊断、预后或 治疗方法中使用本文所述的总肌钙蛋白，例如，总的cTnI、或cTnT、或 总的cTnI+cTnT。在某些实施方式中，本方法可以使用游离的心肌肌钙 蛋白、复合的心肌肌钙蛋白、或心肌肌钙蛋白片段的浓度，或它们的比 较(例如，比例)，以确定诊断、预后或治疗方法。
A.样品
样品或系列样品可以是任何合适的样品；在某些实施方式中，样品 是血液、血清或血浆。在某些实施方式中，样品或系列样品是血清样品。 个体可以是动物，例如，哺乳动物，例如，人类。
可以采集单一样品或系列样品。如果采集系列样品，可以以任何合 适的间隔来采集，例如，几分钟、几小时、几天、几周、几个月、或几 年的间隔。在急性临床情况中，一般地，在数小时和数天的时间过程中 采集系列样品，样品间隔大约数小时。当对个体进行更长时期的处理时， 样品间隔可以是几个月或几年。可以从单一样品，或系列样品中的一个 或多个，或系列样品的改变来确定诊断、预后或治疗方法，例如，浓度 以一定速度增加可能表明严重的状况，反之，以较慢的速度增加或没有 增加可能表明相对良性或较不严重的状况。改变的速度可以在几小时、 几天、几周、几个月、或几年的过程中测量。在一些情况下，指定的个 体的改变速度比绝对值更有意义。在急性情况中，例如“尖峰”的极其快 的改变速度表明危急的、进行中的或新近的心脏事件。在其它情况中， 个体的值在几天、几周、几个月或几年的时间中提高可能表明心肌损伤 正在进行和恶化，例如，由于心脏状态(例如，心脏肥大或充血性心力 衰竭)引起的心肌损伤，或由于非心脏状态(例如，药物接触引起的毒 性)引起的心肌损伤。
在某些实施方式中，在心脏应力试验过程中或之后，至少采集一个 样品。例如，可以在心脏应力试验之前采集一个样品，并在心脏应力试 验过程中采集一个或多个样品。在试验前或试验过程中采集的样品的肌 钙蛋白水平之间的偏差能够提供诊断或预后的信息，例如，表明存在冠 心病或其它与心肌相关的病理学的可能性。也可以进行其它的比较，例 如，任一个样品与正常水平或阈水平的比较，或样品中的心肌肌钙蛋白 浓度的改变速度的确定，所有这些可以产生关于心脏与心血管健康，以 及本文所述的其它状况的有用信息。
在某些实施方式中，在个体向医疗专业人员呈现一种或多种表明可 能涉及心肌损伤的状态的症状时或在接近该时间的时刻，至少采集一个 样品。个体呈现给医疗专业人员的情况包括，但不限于：流动诊所、紧 急护理、病危护理、重症监护、监护系统、住院病人、门诊病人、医务 所、医疗诊所、包括救护车的急症反应情况和健康普查情况。在某些实 施方式中，从个体采集一个或多个样品，并就地分析心肌肌钙蛋白，即， 在样品采集处或其附近分析心肌肌钙蛋白。例如，可以对出现在医院的 个体采集一个或多个样品，并在医院内分析心肌肌钙蛋白。例如，可以 对出现在医院的个体采集一个或多个样品，并在医院内分析心肌肌钙蛋 白。在某些实施方式中，从个体采集一个或多个样品，并在CLIA实验室 分析心肌肌钙蛋白。在某些实施方式中，所述个体显示一种或多种符合 急性冠状动脉综合征的症状。在某些实施方式中，所述个体显示一种或 多种符合AMI的症状。这类症状包括但不限于：胸痛、胸闷、臂痛、不 正常的EKG、不正常的酶水平和呼吸短促。
B.诊断、预后或治疗方法的确定
在某些实施方式中，步骤ii)包括比较所述浓度或系列浓度与所述 浓度的正常值，比较所述浓度或系列浓度与预设的阈水平，比较所述浓 度或系列浓度与基线值，或对于所述系列浓度确定浓度改变的速度。
在某些实施方式中，步骤ii)包括比较所述样品中的所述肌钙蛋白 的浓度与预设的阈浓度，并且如果样品浓度大于阈水平，则确定诊断、 预后或治疗方法。例如，可以通过确定一组个体中肌钙蛋白的第99百分 位数浓度，并设定所述阈浓度在所述第99百分位数肌钙蛋白浓度来确定 阈浓度。实施例部分给出了这样的一个示例。
可以通过本领域内熟知的方法建立正常值、阈值、改变的速度、值 的比例及其它有用的诊断和预后指标。例如，可以通过比较病例群体与 对照群体的样品来确定这些值，其中，病例群体显示需要诊断、预后或 治疗方法的生物学状态，而对照群体则不显示这样的生物学状态。在某 些实施方式中，可以进行纵向调查，例如，病例群体可以是随着时间的 过去显示生物学状态的对照群体的一部分。可以理解，可以使用来自多 个调查的数据来确定正常、预后或诊断水平公认值或值的范围。
在发展诊断或预后测试中，可以从受试者组获得一种或多种潜在标 志物的数据。受试者组至少分为两小组，且优选第一小组和第二小组的 每一组具有大致相等数目的受试者。第一小组包括证实患有疾病，或更 一般地，处于第一情况状态的受试者。例如，第一小组的病人可以是那 些最近已经发病的受试者，或可以是那些已经具有一类特定的疾病如 AMI的受试者。通过更严格的和/或昂贵的测试如MRI或CT，可以证实情 况状态。在下文中，第一小组的受试者称为“患病者”。第二小组的受试 者只是那些没有进入第一小组的受试者。第二组的受试者可以是“未患病 者”，即，正常受试者。或者，第二小组的受试者可以选自显示一种症状 或类似于“患病的”受试者的多种症状。在另一种可选择的方式中，第二 小组可以代表那些在不同的时间点发病的受试者。优选地，可以获得每 一个病人的同一组标志物的数据。这一组标志物可以包括可能怀疑与特 定的疾病或状态的检测相关的所有候选标志物。不需要实际已知的相关 性。本文所述的组合物、方法和系统的实施方式可用来确定哪些候选标 志物与疾病或状态的诊断最相关。两小组受试者中各标志物的水平可以 在宽范围内分布，例如，高斯分布。但是，不需要分布拟合。
1.急性心肌梗塞
本发明的方法对于怀疑患有急性心肌梗塞(AMI)的病人的诊断、 预后和/或治疗的选择尤其有用。对于怀疑患有急性心肌梗塞(AMI)的 病人，单一或系列心肌肌钙蛋白的测量提供了改善预后并表明合适的和 早期的治疗介入的逐渐增加的预后信息，以最小化不良后果的风险。
因此，本发明通过对来自个体的样品(例如，血液样品、血浆样品 和/或血清样品)分析例如cTnI的心肌肌钙蛋白，并以低于约50、40、30、 20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于约20pg/ml) 的检测限检测样品中的心肌肌钙蛋白浓度，来提供诊断、预测和/或预防 或治疗个体的AMI的方法，其中，样品中的心肌肌钙蛋白浓度表明或预 测AMI。心肌肌钙蛋白可以是cTnI或cTnT，且可以是总肌钙蛋白或特定 形式的测量，例如，游离的、复合的或片段；在某些实施方式中，使用 如本文所述的一种或多种形式的肌钙蛋白的比例。在某些实施方式中， 测量样品或系列样品中的总cTnI。在某些实施方式中，测量样品或系列 样品中的总cTnT。在某些实施方式中，测量样品或系列样品中的总cTnI +cTnT。在某些实施方式中，在个体向医疗专业人员呈现表明AMI的症 状时或在接近该时间的时刻测定心肌肌钙蛋白的水平。这样的症状包括 但不限于：胸痛、胸闷、臂痛、不正常的EKG、不正常的酶水平和呼吸 短促。
在某些实施方式中，进行系列测量，并且样品中的心肌肌钙蛋白浓 度的尖峰信号表明、预测或提供了AMI预后的基础。在某些实施方式中， 超过基线50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％ 的尖峰信号表明、预测或提供了AMI预后的基础。在某些实施方式中， 如果获得单一样品的心肌肌钙蛋白水平，不管基线水平如何，单一样品 中的超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、 40、45或50pg/ml的心肌肌钙蛋白水平表明、预测或提供了AMI预后的 基础。在某些实施方式中，约1-10、或约5-15、或约10-50、或约10-200、 或约10-100、或约10-40、或约15-50、或约15-40、或约20-200、或约20-150、 或约20-100、或约20-50、或约20-40、或约20-30pg/ml的心肌肌钙蛋白水 平表明、预测或提供了AMI预后的基础。
在某些实施方式中，诊断或预后包括根据样品或系列样品中的心肌 肌钙蛋白浓度对个体分级。这样的分级可以基于单个样品中的心肌肌钙 蛋白的浓度、系列样品中的尖峰信号的存在和/或尖峰信号距基线的大 小、不同形式的心肌肌钙蛋白的比例、不同形式的心肌肌钙蛋白的绝对 值、系列样品中心肌肌钙蛋白或一种或多种形式的心肌肌钙蛋白的浓度 改变速度、系列样品中不同形式的心肌肌钙蛋白的比例随时间的改变、 和至少部分基于样品或系列样品中的心肌肌钙蛋白浓度的任何其它信 息。如本文所述，分级可以基于由正常和患病受试者的群体获得的值。 也可以基于个体的分级确定合适的治疗。
在某些实施方式中，结合一种或多种其它标志物，例如，心肌缺血、 心肌梗塞的标志物，或中风的标志物，确定心肌肌钙蛋白的浓度，且在 确定诊断、预后或治疗方法时考虑各标志物的浓度。一般地也考虑其它 临床指标，例如，EKG、症状、病史，等等，这对于本领域的技术人员 是显而易见的。可以依据这样的标志物与临床指标与肌钙蛋白的水平的 结合构建诊断、预后或治疗的合适的规则。
本发明方法中可用于与心肌肌钙蛋白结合的标志物包括但不限于 肌酸激酶(CK)及其心肌部分CK心肌带(MB)、天冬氨酸氨基转移酶、 乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶、肌红蛋白、谷草转氨酶、糖原磷 酸化酶BB、未结合的游离脂肪酸、心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、缺 血修饰白蛋白、肌球蛋白轻链1、肌球蛋白轻链2。本发明的方法中用于 与心肌肌钙蛋白结合的炎症和斑块不稳定性的标志物包括但不限于C反 应性蛋白、白细胞计数、可溶性CD40配体、髓过氧化物酶、单核细胞趋 化蛋白-1、全血胆碱和妊娠相关血浆蛋白A。其它炎症标志物可被检测， 且包括IL-8、IL-1β、IL6、IL10、TNF和IL-12p70的组合，以及其它本领 域技术人员明白的细胞因子或标志物。
在某些实施方式中，例如cTnI的心肌肌钙蛋白在例如同一样品中或 在同时或相同时间点前后采自同一个体的多个样品中与选自肌酸激酶 (CK)及其心肌部分CK心肌带(MB)、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱 氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶、肌红蛋白、谷草转氨酶、糖原磷酸化酶 BB、未结合的游离脂肪酸、心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、缺血修饰 白蛋白、肌球蛋白轻链1和肌球蛋白轻链2的标志物一起测量。在某些实 施方式中，例如cTnI的心肌肌钙蛋白例如在同一样品中或在同时或相同 时间点前后采自同一个体的样品中与CK-MB一起测量。
在某些实施方式中，如本文所述测量的心肌肌钙蛋白单独或与其它 标志物或临床征兆结合用来确定再梗塞。在某些实施方式中，如本文所 述测量的心肌肌钙蛋白单独或与其它标志物或临床征兆结合用来确定 梗塞的特征，例如，大小、或出现梗塞以来的持续时间。在后一情况下， 血液中由蛋白水解产生的肌钙蛋白的片段可以与总肌钙蛋白相比；片段 的比例越大，出现梗塞以来的时间就越长。
2.AMI以外的状态
本发明的方法也包括用于AMI以外的状态的基于样品中的肌钙蛋白 浓度的诊断、预后及治疗方法。
许多状态包括潜在的或实际的心肌损伤，因而在本文所述的各种水 平测量心肌肌钙蛋白的能力使得能够进行这样的损伤的早期检测和早 期介入。通过本发明的方法和组合物测量的心肌肌钙蛋白的浓度的信息 对于这样的状态的诊断、预后和治疗的确定是有用的。状态包括经皮的 冠状介入、心脏手术、心力衰竭、急性风湿热、淀粉样变性、心脏创伤 (包括挫伤、切除、起搏、放电、心脏复律、导管插入和心脏手术)、 再灌注损伤、癌症治疗引起的心脏毒性、充血性心力衰竭、末期肾衰竭、 II型糖原贮积病(庞普病)、心脏移植、具有输血性含铁血黄素沉着症的 血红蛋白病(haeomoglobinopathy)、高血压(包括妊娠期高血压)、低血压 (常伴有心律不齐)、甲状腺功能减退、心肌炎、心包炎、术后非心脏手 术、肺栓塞及败血症。
在这些实施方式中，可以测定肌钙蛋白的水平，同时测定对于所述 非心脏疾病特异性的标志物的水平或疾病的其它症状或临床体征；标志 物的浓度和/或关于其它症状或临床体征的信息与本文所述测定的关于 心肌肌钙蛋白浓度的信息结合用来确定诊断、预后和/或治疗方法。例如， 本发明的实施方式除了测定心肌肌钙蛋白的浓度外，还可以测定一种或 多种上述的多肽的浓度，或在疾病的诊断、预后或区别中有用的其它蛋 白质标志物。在某些实施方式中，提供了疾病的标志物组，其中，该组 包括本文所述的心肌肌钙蛋白的浓度和该疾病的至少一种其它标志物。 该组可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多的个别标志 物，包括一种或多种例如总cTnI的心肌肌钙蛋白。可以由本领域的技术 人员进行单一标志物或标志物的子集的分析，以优化各种临床情况下的 临床灵敏度或特异性。这些包括但不限于：流动诊所、紧急护理、病危 护理、重症监护、监护系统、住院病人、门诊病人、医务室、医疗诊所、 和健康普查情况。进一步，本领域的技术人员能够在前述的各情况中使 用单一标志物或标志物的子集结合诊断阈的调整，以优化临床灵敏度和 特异性。
a.心脏毒性
本发明的组合物和方法在确定和监测由治疗产生的心脏毒性(例 如，药物治疗的心脏毒性)方面尤其有用。因此，例如，本发明提供了 通过测量个体的心肌肌钙蛋白来评价心脏毒性的方法，包括i)测定样 品中的心肌肌钙蛋白浓度，或测定来自个体的系列样品中的心肌肌钙蛋 白浓度，其中，至少一个样品在个体正接受治疗时或治疗之后从个体采 集，其中，通过对所述样品中的心肌肌钙蛋白的检测限低于约50、40、 30、10、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于约20pg/ml)的心肌肌钙蛋 白分析测定一个或多个浓度；和ii)根据所述的一个或多个浓度，评价治 疗的心脏毒性的程度。在某些实施方式中，治疗是药物治疗。在某些实 施方式中，治疗是非药物治疗。测定心肌肌钙蛋白浓度的方法包括任何 具有需要的灵敏度的合适的方法，例如，本文所述的方法。在某些实施 方式中，本方法利用测定样品中的心肌肌钙蛋白浓度的方法，其中该方 法包括检测肌钙蛋白的单一分子或其复合物或片段。
利用本文所述的交叉反应性抗体，即，与来自例如人类和另一种诸 如大鼠、狗、小鼠或猴的物种的至少两个物种的肌钙蛋白作用的抗体， 来确定心脏毒性的方法尤其有用。这样的抗体可用于药物毒性的动物研 究，其中，评价毒性的个体是，例如哺乳动物，如大鼠、小鼠、狗、猴， 或其它用于这样的研究的动物。当用于分析中的抗体是同样的抗体时， 可以直接比较在各种物种中的毒性，从而减少变异性。
可以理解，本发明的组合物和方法可以结合副作用包括心脏毒性的 特定的药物一起使用，以监测心脏毒性。因此，本发明提供了通过测定 一个或多个从接受已知可引起心脏毒性的药物的个体获得的样品中的 心肌肌钙蛋白的浓度，来监测个体中的心脏毒性的方法，其中，通过对 所述样品中的心肌肌钙蛋白的检测限低于约50、40、30、10、5、4、3、 2或1pg/ml(例如，低于约20pg/ml)的心肌肌钙蛋白分析测定一个或多 个浓度；和ii)根据所述的一个或多个浓度分析药物治疗的心脏毒性的程 度。在某些实施方式中，该方法进一步包括步骤iii)根据步骤ii)的评 价，确定是否继续药物治疗。副作用包括心脏毒性的药物是本领域内熟 知的。
C.商业方法
本发明涉及用于建立心肌肌钙蛋白标志物的系统和方法(包括商业 方法)，其可用于生物体的生物学状态或状况的诊断、预后或处理方法 的确定、基于这样的标志物制备诊断剂和使诊断剂和利用这样的诊断剂 的服务商业化/市场化。生物学状态可以是急性心肌梗塞或由于本文所述 的药物毒性或非AMI状态引起的心肌损伤。
在一个实施方式中，本文的商业方法包括：使用包括以下步骤的方 法建立一种或多种心肌肌钙蛋白标志物：通过在低于约50、20、10、5 或1pg/ml的检测水平检测一种或多种标志物的单一分子，测量从第一群 体获得的生物学样品中的所述一种或多种标志物的浓度从而建立生物 学样品中的一种或多种标志物的浓度范围；并将在上述步骤建立的一种 或多种标志物商业化，例如制成诊断产品。本文的诊断产品包括一种或 多种特异性结合心肌肌钙蛋白标志物的抗体，和能够在被以其激发波长 发射光的激光器激发时发射至少约200个光子的荧光部分，其中激光聚 焦于包含荧光部分的直径不小于约5微米的点，而且其中激光指向该点 的总能量不超过约3微焦耳。
在一个实施方式中，本文的商业方法包括：使用一种系统建立心肌 肌钙蛋白标志物的正常值的范围，该步骤包括：通过在低于约50、20、 10、5或1pg/ml的检测水平下检测标志物的单一分子测量从第一群体获 得的生物学样品中的所述心肌肌钙蛋白标志物的浓度，从而建立生物学 样品中的所述心肌肌钙蛋白标志物的浓度范围；并提供诊断服务以确定 生物体是否具有感兴趣的状态或情况，例如，AMI、由于药物治疗引起 的心脏毒性或非AMI状态。本文的诊断服务可由经营者许可的CLIA批准 的实验室或经营者本身提供。本文的诊断服务可以直接提供给卫生医疗 提供者、卫生医疗保险公司或病人。因此，本文的商业方法能够从销售 例如诊断服务或诊断产品中获得收益。
本文的商业方法也打算向例如卫生医疗提供者、卫生医疗保险公司 或病人等等提供诊断服务。这里的经营者能够通过或者与服务实验室签 订合约或者设置服务实验室(遵守临床实验室改进修正法案(Clinical Laboratory Improvement Amendments(CLIA))或其它规范)来提供诊断 服务。然后这样的服务实验室执行本文公开的方法以确认心肌肌钙蛋白 标志物是否存在于样品内。
VII.组合物
本发明提供了用于检测和定量心肌肌钙蛋白的组合物。组合物包括 可通过本发明的方法检测的经合适的标记物标记的心肌肌钙蛋白的结 合伴体、其中一个或两个结合伴体经可通过本发明的方法检测的合适的 标记物标记的结合伴体对、连接有捕获结合伴体的固体载体，在某些实 施方式中，也具有检测结合伴体。
示例的实施方式包括用于检测心肌肌钙蛋白的组合物，其包括连接 在荧光部分的心肌肌钙蛋白的结合伴体，其中，荧光部分在被以其激发 波长发射光的激光器激发时，能够发射至少约200个光子，其中，激光 聚焦于包含荧光部分的直径不小于约5微米的点，而且其中，激光指向 该点的总能量不超过约3微焦耳。在某些实施方式中，结合伴体包括心 肌肌钙蛋白的抗体。在某些实施方式中，该抗体是多克隆抗体。在某些 实施方式中，该抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，抗体是交叉反 应性抗体，例如，与来自包括人类、猴、狗和小鼠的至少两个物种的心 肌肌钙蛋白交叉反应的抗体。在某些实施方式中，抗体与来自人类、猴、 狗和小鼠的所有心肌肌钙蛋白交叉反应。在某些实施方式中，心肌肌钙 蛋白选自cTnI和cTnT。在某些实施方式中，心肌肌钙蛋白是cTnI。在某 些实施方式中，心肌肌钙蛋白是cTnT。抗体对于肌钙蛋白分子的特定区 域是特异性的，例如，对于包含心肌肌钙蛋白I的氨基酸27-41的区域是 特异性的。荧光部分可以包含一个或多个含有至少一个取代的吲哚环 系统的分子，其中，在吲哚环3位碳上的取代基包含化学反应性的基 团或偶联物质基团。标记组合物可以包括荧光部分，荧光部分包括一个 或多个选自AlexaFluor 488、532、647、700或750的染料分子。标记组合 物可以包括荧光部分，荧光部分包括一个或多个选自AlexaFluor 488、 532、700或750的染料分子。标记组合物可以包括荧光部分，荧光部分 包括一个或多个AlexaFluor 488染料分子。标记组合物可以包括荧光部 分，荧光部分包括一个或多个AlexaFluor 555染料分子。标记组合物可以 包括荧光部分，荧光部分包括一个或多个AlexaFluor 610染料分子。标记 组合物可以包括荧光部分，荧光部分包括一个或多个AlexaFluor 647染料 分子。标记组合物可以包括荧光部分，荧光部分包括一个或多个 AlexaFluor 680染料分子。标记组合物可以包括荧光部分，荧光部分包括 一个或多个AlexaFluor 700染料分子。标记组合物可以包括荧光部分，荧 光部分包括一个或多个AlexaFluor 750染料分子。
在某些实施方式中，本发明提供了包括用于测定心肌肌钙蛋白浓度 的一组标准物的组合物，其中，至少一个标准物的心肌肌钙蛋白浓度低 于约20、15、10、5、4、3、2或1pg/ml。在某些实施方式中，本发明提 供了包括用于测定心肌肌钙蛋白浓度的一组标准物的组合物，其中，至 少一个标准物的心肌肌钙蛋白浓度低于约20pg/ml。在某些实施方式中， 本发明提供了包括用于测定心肌肌钙蛋白浓度的一组标准物的组合物， 其中，至少一个标准物的心肌肌钙蛋白浓度低于约10pg/ml。在某些实 施方式中，本发明提供了包括用于测定心肌肌钙蛋白浓度的一组标准物 的组合物，其中，至少一个标准物的心肌肌钙蛋白浓度低于约5pg/ml。 在某些实施方式中，本发明提供了包括用于测定心肌肌钙蛋白浓度的一 组标准物的组合物，其中，至少一个标准物的心肌肌钙蛋白浓度低于约 1pg/ml。
本发明的其它组合物如本文所述。
VIII.试剂盒
本发明进一步提供了试剂盒。本发明的试剂盒包括一种或多种在合 适的包装中用于本文所述的心肌肌钙蛋白灵敏检测的组合物。在某些实 施方式中，本发明的试剂盒提供了标记物，例如，诸如心肌肌钙蛋白特 异性抗体的结合伴体，其中，结合伴体连接在荧光部分上。在某些实施 方式中，本发明的试剂盒提供了心肌肌钙蛋白特异性的结合伴体对，例 如，抗体对，其中，至少一个结合伴体是本文所述的心肌肌钙蛋白的标 记物。在某些实施方式中，例如抗体的结合伴体以单独容器提供。在某 些实施方式中，例如抗体的结合伴体以同一容器提供。在某些实施方式 中，一种结合伴体(例如抗体)固定在例如微量滴定板或顺磁性珠的固体 载体上。在某些这样的实施方式中，另一结合伴体(例如抗体)用如本文 所述的荧光部分标记。
例如抗体的结合伴体、固体载体和荧光标记作为试剂盒的组分可以 是任何如本所述的这样的组分。
试剂盒可以额外地包括在本发明的方法中有用的试剂，例如，用于 结合反应的缓冲液和其它试剂、预处理运行分析的仪器的洗液、缓冲液 或其它试剂和洗脱缓冲液或通过仪器运行样品的其它试剂。
试剂盒可以包括一种或多种标准物，例如，用于本发明分析的标准 物(如高度纯化的标准物)，例如，重组的人类cTnI或人类cTnT、或它的 各种片段、复合物，等等。试剂盒可以进一步包括说明书。
实施例
以下的实施例是说明性的，而非限制其余的公开内容。
除非另有说明，在本文所述的单分子检测器(SMD)中分析实施例 的处理样品，使用以下参数：激光器：波长639nm的连续波亚砷酸镓二 极管激光器(Blue Sky Research，Milpitas，CA)，聚焦于大小约为2微米的 点(本文限定的0.004pL的探询空间)；通过正内径(ID)为100微米和正外 径(OD)为300微米的熔融石英毛细管的流速＝5微升/分钟；透镜为非共 焦排列(见，例如，图1A)；0.8数值孔径的聚焦透镜(Olympus)；硅雪 崩光电二极管检测器(Perkin Elmer，Waltham，MA)。
实施例1.生物标志物的夹心分析：心肌肌钙蛋白I(cTnI)
分析：本分析的目的是为了检测人血清中心肌肌钙蛋白I(cTNI)的 存在。分析形式是基于小鼠单克隆捕获抗体和山羊多克隆检测抗体的两 步夹心免疫分析。需要10微升样品。分析的工作范围是0-900pg/ml，典 型的分析检测限是1-3pg/ml。分析需要约4小时的工作台时间来完成。
材料：在下文所述的方法中使用以下材料：分析板：Nunc Maxisorp， 产品464718，384孔，透明，用单克隆抗体BiosPacific A34440228P Lot# A0316被动包被(以5μg/ml溶于pH9.6的0.05M碳酸钠，室温下过夜)；用5 ％蔗糖、溶于PBS的1％BSA封闭，并在4℃下储藏。对于标准曲线，使 用人类心肌肌钙蛋白I(BiosPacific Cat# J34000352)。用于标准浓度的稀 释液是经免疫耗尽内源性cTNI、等分并在-20℃储藏的人类血清。在96 孔、圆锥形、聚丙烯板(Nunc产品#249944)上进行标准物的稀释。使用 下列缓冲液和溶液：(a)分析缓冲液：含有1％ BSA和0.1％ TritonX-100 的BBS；(b)含有2mg/ml小鼠IgG(Equitech Bio)、2mg/ml山羊IgG(Equitech Bio)及2mg/ml MAK33 poly，Roche# 11939661的分析缓冲液中的被动封 闭溶液；(c)检测抗体(Ab)：亲和纯化的山羊抗肽3多克隆抗体， (BiosPacific G129C)，它被荧光染料AlexaFluor 647标记，且在4℃下储 藏；检测抗体稀释液：50％分析缓冲液，50％被动封闭溶液；洗涤缓冲 液：硼酸盐缓冲盐水Triton Buffer(BBST)(1.0M硼酸盐、15.0M氯化 钠、10％Triton X-100，pH8.3)；洗脱缓冲液：含有4M尿素的BBS、0.02％ Triton X-100及0.001％ BSA。
AlexaFluor 647标记抗体的制备：通过以下步骤将检测抗体G-129-C 与AlexaFluor 647偶联：首先将100μg的G-129-C溶解于400μl的偶联缓冲 液(0.1M NaHCO3)。然后通过将溶液转移到YM-30过滤器内，并将溶液 与过滤器进行离心过滤而将抗体溶液浓缩至50μl。然后通过加入400μl 的偶联缓冲液洗涤YM-30过滤器和抗体3次。通过向过滤器加入50μl、倒 置过滤器并以5000xg离心1分钟来回收抗体。产生的抗体溶液为1-2 μg/μl。通过向AlexaFluor 647的一个小瓶中加入20μl DMSO来重配 AlexaFluor 647 NHS酯，该溶液在-20℃下储藏最多达1个月。向抗体溶液 中加入3μl AlexaFluor 647原液，然后混合并在黑暗中温育1小时。1小时 后，向抗体AlexaFluor 647溶液中加入7.5μl的1M tris，并混合。用YM-30 超滤器过滤溶液以去除低分子量成分。含有结合AlexaFluor 647的抗体的 渗余物的体积通过加入PBS而调整为200-400μl。向溶液中加入3μl的10 ％ NaN3，将产生的溶液转移到Ultrafree 0.22离心单元中，并以12000xg 旋转2分钟。收集含有偶联抗体的滤出液，并用于分析。
方法：cTnI标准物和样品的制备和分析：
如下制备标准曲线：通过将cTnI的原液系列稀释成标准稀释液来制 备工作标准物(0-900pg/ml)，以获得cTnI的浓度范围1.2pg/ml-4.3μg/ml。
向每孔中加入10μl的被动封闭溶液和10μl的标准物或样品。标准物 是一式四份的。用Axyseal密封膜封闭板，以3000转/分离心1分钟，并在 25℃下摇动温育2小时。洗涤板5次，在纸巾上以倒置位置进行离心直 至转子达到3000转/分。制备1nM的检测抗体的工作稀释液，并向每孔中 加入20μl的检测抗体。封闭板、离心，并在25℃下摇动温育分析物1小 时。向每孔中加入30μl洗脱缓冲液，封闭板，并在25℃下温育分析物0.5 小时。或者在分析前在4℃下储藏板最多达48小时，或者立即分析样品。
为了分析，在40微升/分下需要20微升/孔，在5微升/分下分析5微升。 基于4个标准差(sigma)的阈分析数据。绘制原始信号相对于标准物浓 度的曲线。在低浓度范围进行线性拟合，并在全部标准曲线进行非线性 拟合。以[LOD＝(3 x 零点的标准偏差)/线性拟合的斜率]来计算检测限 (LoD)。通过适于样品信号的方程(线性或非线性)来确定样品的浓度。
将等分试样用泵吸入分析器。在毛细流动过程中，通过设定探询体 积使得在激光器激发之后的限定的空间内只检测到1个荧光标记的发 射，来测量单独标记的抗体。各信号代表一个数字事件，这种构造使得 实现极高的分析灵敏度。以单独数字事件的总和来确定总的荧光信号。 各计数的分子是具有成百上千个DMC事件/样品的阳性数据点。通过平 均值+3SD方法确定本发明的cTnI分析的检测限。
结果：使用分析方案的一式四份的代表性的cTnI标准曲线的数据如 表2所示。
表2 cTnI标准曲线
  cTnI(pg/ml) 信号 标准差 ％变异系数(CV) 0 233 25 10.8 1.5625 346 31 8.9 3.125 463 35 7.5 6.25 695 39 5.6 12.5 1137 61 5.3 25 1988 139 7.0 50 3654 174 4.8 100 5493 350 6.4 200 8264 267 3.2 400 9702 149 1.5 800 9976 50 0.5
在15次运行中测试分析器系统的灵敏度，发现分析器系统的灵敏度 常规地检测亚飞摩尔/升(fM)水平的校准物，如表3的数据所示。精密 度是10％，在4和12pg/ml cTnI。
表3 仪器的灵敏度
  校准物(fM) 信号计数 ％变异系数(CV) 0 11 12 302 9 60 1341 8 300 4784 7
cTnI的浓度范围的线性标准曲线如图5所示。
通过15个连续分析确定检测的分析限(LoD)。LoD是0标准的平均 值+3SD(n＝4)批内测定。平均LoD是1.7pg/ml(0.4-2.8pg/ml的范围)。
通过分析已经被免疫耗尽cTnI和具有已知量cTnI的尖峰信号的血清 样品确定样品的回收率。表4表明系统分析的超过3天的样品回收率的数 据。
表4 样品回收率
  尖峰信号(pg/ml) 回收率(平均) 标准偏差 ％变异系数(CV) 5 5.7 0.9 16 15 13.7 0.2 2 45 43 0.6 2 135 151 6.2 4
在具有cTnI尖峰信号且被标准稀释液稀释的混合人血清中确定分析 的线性。表6中的结果显示稀释度及对相应的稀释度预期的信号的百分 率。
表5 分析的线性
  血清稀释度 预期的信号的百分率 1:2 79 1:4 87 1:8 96
这些数据表明本发明的分析器系统允许对亚飞摩尔浓度的cTnI进行 高灵敏度的激光诱导的免疫分析。
实施例2.对于TnI的基于珠的夹心分析
上述分析使用同样的微量滴定板形式，其中，使用塑料表面来固定 靶分子。为了实现结合体与未结合体的分离，单一微粒分析器系统也与 在溶液中使用微粒或珠进行的分析相容。
材料：从Dynal(650.01-03，10mg/ml原液)获得MyOne Streptavidin C1 微粒(MP)。在分析中使用的缓冲液包括：10X硼酸盐缓冲盐水Triton缓 冲液(BBST)(1.0M硼酸盐、15.0M氯化钠、10％Triton X-100，pH8.3)； 分析缓冲液(溶于0.1M Tris(pH8.1)、0.025M EDTA、0.15M NaCl、0.1％ BSA、0.1％ Triton X-100和0.1％ NaN3的2mg/ml正常山羊IgG、2mg/ml正 常鼠IgG及0.2mg/ml的MAB-33-IgG-聚合体，在4℃储藏)；和洗脱缓冲 液(含有4M尿素、0.02％ Triton X-100和0.001％ BSA的BBS，在2-8℃ 储藏)。在基于珠的夹心分析中使用的抗体包括：Bio-Ab(每个IgG具有1-2 个生物素的A34650228P(BiosPacific))和Det-Ab(与A647偶联的G-129-C (BiosPacific)，每个IgG具有2-4个荧光染料)。标准物是重组人心肌肌钙 蛋白I(BiosPacific，Cat# J34120352)。校准稀释液是溶于TBS wEDTA的30 mg/ml BSA。
微粒包被：将100μl的MP原液置于eppendorf管中。通过应用磁体、 除去上清液、除去磁体并在洗涤缓冲液中再悬浮，用100μl的BBST洗涤 缓冲液洗涤MP3次。洗涤之后，MP再悬浮于100μl的分析缓冲液中，并 加入15μg的Bio-Ab。然后在持续混合下、室温下温育混合物1小时。如 上所述，用1ml的洗涤缓冲液洗涤MP5次。洗涤之后，MP再悬浮于15ml 的分析缓冲液(或100μl在4℃储藏)中。
标准物和样品的制备：用校准稀释液稀释标准物以制备合适的标准 曲线(通常为200pg/ml，下至0.1pg/ml)。冷冻的血清和血浆需要以13000 转/分在室温下离心10分钟。仔细地除去澄清的血清/血浆以避免带走任 何可能的沉淀物或漂浮物，并放入干净的管中。将每份50μl的标准物或 样品注入合适的孔中。
捕获靶标：向每孔中加入150μl的MP(在再悬浮于15ml的分析缓冲 液+400mM NaCl之后)。在室温下在JitterBug，5上温育混合物1小时。
洗涤和检测：将板置于磁体上，并在确信所有的MP被磁体捕获之后 除去上清液。在从磁体上取下板之后，加入250μl的洗涤缓冲液。然后 将板置于磁体上，并在确信所有的MP被磁体捕获之后除去上清液。每孔 中加入20μl Det-Ab(在分析缓冲液+400mM NaCl中将Det-Ab稀释至500 ng/ml)。在室温下在JitterBug，5上温育混合物30分钟。
洗涤和洗脱：将板置于磁体上，并用洗涤缓冲液洗涤3次。在确信 所有的MP被磁体捕获之后除去上清液，并加入250μl的洗涤缓冲液。在 洗涤之后，将样品转移至新的96孔板中。然后将新板置于磁体上，并在 确信所有的MP被磁体捕获之后除去上清液。在从磁体上取下板之后，再 加入250μl的洗涤缓冲液。然后将板置于磁体上，并在确信所有的MP别 磁体捕获之后除去上清液。然后加入20μl的洗脱缓冲液，并在室温下在 JitterBug，5上温育混合物30分钟。
过滤出MP并转移至384孔板：将标准物和样品转移至置于384孔分析 板顶端的384孔过滤板中。然后在室温下在板式旋转器中以3000转/分离 心板。除去过滤板并加入合适的校准物。覆盖板并准备在SMD上运行。
SMD：将等分试样用泵吸入分析器。在毛细流动过程中，通过设定 探询体积使得在激光器激发之后的限定的空间内只检测到1个荧光分子 的发射，来测量单独标记的抗体。各信号代表一个数字事件，这种构造 使得实现极高的分析灵敏度。以单独数字事件的总和来确定总的荧光信 号。各个计数的分子是具有成百上千个DMC事件/样品的阳性数据点。 通过平均值+3 SD的方法确定本发明的cTnI分析的检测限。
实施例3.在正常非患病受试者群体中的cTnI的浓度范围
使用来自88个明显健康的受试者(非患病者)的血清样品建立人类 血清中的cTnI浓度的参考范围或正常范围。进行如实施例1所述的夹心免 疫分析，并如上所述使用本发明的单微粒分析器系统对信号或事件的数 目进行计数。通过将分析器检测的信号与上述标准曲线相关，确定血清 肌钙蛋白I的浓度。所有的分析一式四份地进行。
按照目前的欧洲与美国心脏病协会(ESC/ACC)的建议，为了可靠 地区分患有ACS的病人与不患有缺血性心脏病的病人，并对不良的心脏 病事件危险分级，肌钙蛋白分析的定量应该在具有低于10％的变异系数 (CV)的情况下精确到正常范围的第99百分位数。分析表明TnI的生物 学阈(临界浓度)是7pg/ml的TnI浓度，其为在具有相应的10％的变异系 数(CV)的情况下建立的第99百分位数(图5)。在10％的变异系数水平 时，精密度分布指向4和12pg/ml的TnI浓度。
另外，该分析良好地与由标准与技术国家研究所(National Institute of Standards and Technology)提供的肌钙蛋白-I标准测量相关(图6)。
本发明的分析足够灵敏与精确以满足ESC/ACC的要求，而且，当与 Koerbin等人(Ann Clin Biochem，42：19-23(2005))描述的分析比较时， 本发明的分析对于心肌肌钙蛋白I的分析最灵敏。本发明的分析比确定生 物阈范围为111-333pg/ml的cTnI的当前可用的分析的灵敏度高出10-20 倍。
实施例4.TnI早期释放进入患有急性心肌梗塞(AMI)的病人循环的检测
研究1：从18个由于胸痛而出现在急诊部门(ED)的病人连续获得 47个样品。这些病人都具有非ST的ECG升高，且被诊断患有AMI。在进 入急诊室时根据商用分析测定来自所有18个病人的初始样品中的cTnI浓 度，测定为<350pg/ml(10％临界点)，其中12个<100pg/ml(第99百分位 数)。后期使用同样的商用分析测试这些样品，且对于cTnI测定为测试阳 性。根据实施例1和实施例3所述的本发明的分析，对同样的血清样品也 进行TnI分析，而且将此结果与使用商用分析获得的结果比较。
当病人出现胸痛时第一次取血(样品1)，并以4-8小时的间隔随后 取血(在12小时，样品2；在16小时，样品3；在24小时，样品4；在30 小时，样品5；在36小时，样品6；在42小时，样品7；和在48小时，样 品8)。通过本发明的方法和当前的商用方法分析血清，获得的结果如 图7所示。本发明的分析器在病人出现胸痛时检测到TnI(样品1)，而商 用分析法在迟很多的时刻(在36小时，样品6)第一次检测到cTnI。样品 3的TnI浓度超过了使用本发明的分析器确定的生物阈水平(7pg/ml，见 图5)，并说明样品3对于TnI是阳性的表明心脏事件的发生。商用分析法 的生物阈是111-333pg/ml的TnI。因而，样品3不会被认为是可能的心脏 事件。
另外，从病人取得的第一个样品的结果表明，本发明的方法和组合 物使得能够基于心肌肌钙蛋白水平(如由从病人取得的第一个样品的结 果证明的水平)进行早许多的诊断和可能的介入。在初始商用分析的cTnI 值为100-350ng/ml的3个例子中，对于本发明的分析方法的cTnI全部为阳 性(即，cTnI超过7pg/ml)。在初始商用分析的cTnI值低于100pg/ml的 12个例子中，根据cTnI的本发明的分析方法，确定5个为心血管事件阳性 (即，cTnI超过7pg/ml)。当测试允许入院的样品时，使用本发明的分 析预期将比目前的商用分析法多检测出53％的AMI案例。
研究2：使用本发明的分析器和分析来测试50个另外的根据商用分 析检测为阴性的血清样品。结果如图8所示。在50个样品中，36个在第 99百分位数内，因而确定为在本发明分析确定的正常范围之内。但是， 确定为在商用分析的“正常”或非疾病范围之内的剩余的14个样品，经测 试超过本发明确定的生物阈。
因此，当cTnI的血清水平低于商用分析技术的阈值时，本发明的cTnI 分析的高灵敏度能够对病人的心肌损伤进行检测。本发明的高灵敏、精 确的cTnI分析的使用，使得AMI的检测早于现有的cTnI分析，从而提供 合适的诊断和早期医学介入的机会以改善结果。
交叉参考
该申请基于35USC§119要求以下申请的优先权：2006年04月04日 提出的美国临时申请60/789304号、2006年04月19日提出的美国临时申请 60/793664号、2006年05月26日提出的美国临时申请60/808662号、2006 年11月28日提出的美国临时申请60/861498号和2006年12月04日提出的 美国临时申请60/872986号，本文完整引入所有以上专利申请作为参考。
参考引用
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都引入本文作为参考，如 同每一单独出版物或专利申请具体且单独地引入作为参考。