用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法
专利汇可以提供用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子 生物 学方法，其中该引物包含扩增引物组和延伸引物组；所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。该引物组合物能够有效用于刀鲚和短颌鲚物种的鉴定。该分子生物学方法步骤包括：构建待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库，并对其进行测序获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列；然后利用Structure2.3.2 软件 ，绘制群体遗传差异的柱形图和个体遗传差异的柱形图，利用该分析判断物种种类。该方法步骤简便、准确、高效且 费用 低廉。，下面是用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法专利的具体信息内容。
1.一种引物组合物，其特征在于，它包含扩增引物组和延伸引物组；所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
2.一种权利要求1所述的引物组合物的应用，其特征在于，所述引物组合物用于鉴定刀鲚和短颌鲚。
3.一种构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，包括以下步骤：
首先利用权利要求1所述的扩增引物组对包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物，分别利用磷酸化酶和外切酶对所述第一扩增产物进行纯化；
然后利用权利要求1所述的延伸引物组对纯化后的所述第一扩增产物进行延伸反应，获得延伸产物，采用磷酸化酶对所述延伸产物进行纯化，纯化后的所述延伸产物构成所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库；
其中，所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16 所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
4.根据权利要求3所述的构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，其特征在于，制得所述包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本步骤包括：首先取包括待测刀鲚和短颌鲚样品的肌肉或活体尾鳍尖部组织；然后采用酚氯仿法、高盐法或层析柱法提取待测刀鲚和短颌鲚样品的DNA。
5.根据权利要求4所述的构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，其特征在于，按照20微升反应体系计算，所述第一PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积（微升）
Primer Mix 4
MgCl 1.6
dNTP Mix 0.4
ExTaq酶 10
待测刀鲚和短颌鲚DNA 2
ddH2O 补至20
所述第一PCR扩增的反应程序为：
。
6.根据权利要求4或5所述的构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，其特征在于，按照10 微升反应体系计算，所述延伸反应的反应体系为：
试剂 体积（微升）
SNaPshot Multiplex Kit 5
多重第一扩增产物 2
延伸引物组 1
ddH 2O 补至10
所述延伸反应的反应程序为：
。
7.一种利用上述引物组合鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，包括以下步骤：
首先取待测刀鲚和短颌鲚样品的肌肉或者活体尾鳍尖部组织，然后采用酚氯仿法、高盐法或层析柱法提取待测刀鲚和短颌鲚样品的DNA；
然后利用权利要求1所述的扩增引物组对包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物；利用磷酸化酶和外切酶对所述第一扩增产物进行纯化；
利用权利要求1所述的延伸引物组对纯化后的所述第一扩增产物进行延伸反应，获得延伸产物；采用磷酸化酶对所述延伸产物进行纯化；
最后对纯化后的延伸产物进行测序，获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列；基于所述刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列，利用Structure软件，绘制群体遗传差异的柱形图和个体遗传差异的柱形图，利用该分析判断所述待测刀鲚和短颌鲚物种种类；
其中，所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16 所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
8.根据权利要求7所述的利用上述引物组合鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，其特征在于，分别采用ABI3730xl及GeneMapper4.0对来所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库进行测序和分析统计。
用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法
技术领域
背景技术
发明内容
利用延伸引物组对纯化后的所述第一扩增产物进行延伸反应，获得延伸产物，采用磷酸化酶对所述延伸产物进行纯化，纯化后的所述延伸产物构成所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库；
其中，所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16 所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
Primer Mix 4
MgCl 1.6
dNTP Mix 0.4
ExTaq酶 10
待测刀鲚和短颌鲚DNA 2
ddH2O 补至20
所述第一PCR 扩增的反应程序为：
SNaPshot Multiplex 5
Kit
多重第一扩增产物 2
延伸引物组 1
ddH 2O 补至10
所述延伸反应的反应程序为：
然后利用扩增引物组对包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物；利用磷酸化酶和外切酶对所述第一扩增产物进行纯化；
利用延伸引物组对纯化后的所述第一扩增产物进行延伸反应，获得延伸产物；采用磷酸化酶对所述延伸产物进行纯化；
最后对纯化后的延伸产物进行测序，获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列；基于所述刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列，利用Structure软件，绘制群体遗传差异的柱形图和个体遗传差异的柱形图，利用该分析判断所述待测刀鲚和短颌鲚物种种类；
其中，所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16 所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
具体实施方式
（1）分别取新鲜或冰冻的不同种群的待测刀鲚和短颌鲚肌肉或者活体的尾鳍尖部组织
0.1g，剪碎并置于玻璃匀浆器中，向其中加入1mL的细胞裂解缓冲液匀浆至组织块消失，然后将玻璃匀浆器中的液体置于1.5mL的离心管中，并向离心管加入蛋白酶，混均。在65ºC恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37ºC水浴12-24小时，间歇振荡离心管数次。然后将离心管置于台式离心机以12000rpm/min离心5分钟，取上清液置于第二离心管中。
基于筛选的刀鲚和短颌鲚8个SNP位点基因设计能与之配对的扩增引物SEQ ID NO：1-
16和延伸引物SEQ ID NO：17-24；
（2）多重PCR扩增反应
首先利用上述扩增引物对DNA提取液进行扩增，获得PCR产物；然后取15微升的PCR产物，并向其中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，并将其置于37ºC水浴条件下1小时，然后在75ºC灭活15分钟，对PCR产物进行纯化处理。
Primer Mix 4
MgCl 1.6
dNTP Mix, 0.4
ExTaq 10
待测刀鲚和短颌鲚DNA 2
ddH 2O 补至20
所述第一PCR 扩增的反应程序为：
SNaPshot Multiplex Kit(ABI) 5
多重第一扩增产物 2
延伸引物组 1
ddH 2O 补至10
所述延伸反应的反应程序为：
利用ABI3730XL测序平台，从选自洞庭湖中39个样本中任选的1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布如图1所示。
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