本发明涉及作为S1P1/Edg1受体激动剂的化合物，所述化合物通 过调节白细胞运输，螯合次级淋巴组织中的淋巴细胞，以及干扰有效 免疫反应所需的细胞：细胞相互作用而具有免疫抑制活性。本发明还涉 及包含所述化合物的药物组合物以及治疗或预防方法。

据表明，免疫抑制剂可用于多种自身免疫性和慢性炎性疾病，包 括系统性红斑狼疮、慢性类风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病、 胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、多发性硬化以及其它病症例如克罗恩病、 溃疡性结肠炎、大疱性类天疱疮、结节病、牛皮癣、自身免疫性肌炎、 韦格纳肉芽肿病、鱼鳞病、格雷夫斯眼病、特应性皮炎和哮喘。它们 已经被证明可用于治疗癌症、淋巴瘤和白血病的化疗方案的部分。

虽然每一这些病症的发病机理可能非常不同，但是它们通常具有 各种自身抗体和/或自身反应性淋巴细胞的表象。这样的自身反应性可 能部分是由于丧失了对正常免疫系统运行的稳态调节。类似地，在骨 髓或器官移植之后，宿主淋巴细胞识别外来组织抗原，并且开始产生 导致移植物排斥的细胞和体液反应，包括抗体、细胞因子和细胞毒性 淋巴细胞。

自身免疫或排斥过程的一个最终结果是由炎性细胞以及它们释放 的介体所导致的组织破坏。抗炎剂例如NSAID主要通过阻断这些介 体的影响或分泌来起作用，但是不调节这些疾病的免疫学基础。另一 方面，细胞毒性剂例如环磷酰胺以非特异性方式起作用，结果正常和 自身免疫性反应都被切断。实际上，用这样的非特异性免疫抑制剂治 疗的患者死于感染的可能性会与它们死于自身免疫性疾病的可能性一 样大。

环孢素A是用于预防移植的器官排斥的药物。FK-506是另一种 被批准的用于预防移植器官排斥，特别是肝脏移植排斥的药物。环孢 素A和FK-506通过抑制身体的免疫系统来起作用，它们阻止身体免 疫系统调动其巨大的天然保护剂兵工厂来排斥移植物的外来蛋白。环 孢素A被批准用于治疗严重的牛皮癣，并且已经被欧洲管理机构批准 用于治疗特应性皮炎。

虽然它们能有效地延迟或抑制移植物排斥，但是已知环孢素A和 FK-506会引起严重的不利的副作用，包括肾毒性、神经毒性和胃肠 道不适。因此，仍然需要开发出没有这些副作用的免疫抑制剂，并且 高度希望这样的抑制剂。

免疫抑制化合物FTY720是目前正处于临床试验阶段的淋巴细胞 螯合剂。FTY720在哺乳动物体内代谢为是鞘氨醇1-磷酸酯受体的有 效激动剂的化合物。鞘氨醇1-磷酸酯受体的激动作用调节淋巴细胞运 输，包括螯合淋巴结和派尔集合淋巴结中的淋巴细胞(T-细胞和B-细 胞)，并且没有淋巴耗尽，并且破坏脾脏构造，由此干扰T细胞依赖 性和非依赖性抗体反应。对于预防器官移植后的排斥以及治疗自身免 疫性病症，这样的免疫抑制作用是人们所期望的。

鞘氨醇1-磷酸酯受体是生物活性鞘脂代谢物，是由造血细胞分泌 的，并且储存在活化的血小板中以及从中释放。Yatomi，Y.，T.Ohmori， G.Rile，F.Kazama，H.Okamoto，T.Sano，K.Satoh，S.Kume，G. Tigyi，Y.Igarashi，和Y.Ozaki.2000.Blood.96：3431-8。其作为G 蛋白偶联受体家族的激动剂起作用，来调控细胞增殖、分化、死亡和 运动。Fukushima，N.，I.Ishii，J.J.A.Contos，J.A.Weiner，和J.Chun. 2001.溶血磷脂受体.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41：507-34；Hla， T.，M.-J.Lee，N.Ancellin，J.H.Paik，和M.J.Kluk.2001.溶血磷 脂受体启示.Science.294：1875-1878；Spiegel，S.，和S.Milstien.2000. 新的鞘氨醇1-磷酸酯受体家族的功能.Biochim.Biophys.Acta.1484： 107-16；Pyne，S.，和N.Pyne.2000.鞘氨醇1-磷酸酯受体经由G蛋 白偶联受体的内皮分化基因家族的信号传导.Phare.& Therapeutics. 88：115-131。已经鉴定出来了5种鞘氨醇1-磷酸酯受体(S1P1、S1P2、 S1P3、S1P4和S1P5，还称为内皮分化基因Edg1、Edg5、Edg3、Edg6、 Edg8)，它们具有广为分布的细胞和组织分布，并且在人和啮齿动物 物种酯是高度保守的(参见表)。与SIP受体的结合引起经由Gq-、Gi/o、 G12-、G13-和Rho-依赖性途径的信号传导。据表明，配体诱导的S1P1 和S1P3的激活促进了血管生成、趋药性和经由Rac-和Rho-的粘着结 合装配，参见Lee，M.-J.，S.Thangada，K.P.Claffey，N.Ancellin， C.H.Liu，M.Kluk，M.Volpi，R.I.Sha′afi，和T.Hla.1999.Cell. 99：301-12，而S1P2的激动作用促进轴突缩回，参见Van Brocklyn， J.R.，Z.Tu，L.C.Edsall，R.R.Schmidt，和S.Spiegel.1999.J.Biol. Chem.274：4626-4632，并且通过阻断Rac激活来抑制趋药性，参见 Okamoto，H.，N.Takuwa，T.Yokomizo，N.Sugimoto，S.Sakurada， H.Shigematsu，和Y.Takuwa.2000.Mol.Cell.Biol.20：9247-9261。 S1P4位于造血细胞和组织中，参见Graeler，M.H.，G.Bernhardt， 和M.LiPP.1999。Curr.Top.Microbiol.Immunol.246：131-6，而S1P5 主要是神经元受体，其中某些是在淋巴组织中表达的，参见Im，D.S.， C.E.Heise，N.Ancellin，B.F.O’Dowd，G.J.Shei，R.P.Heavens，M.R. Rigby，T.Hla，S.Mandala，G.McAllister，S.R.George，和K.R.Lynch. 2000.J.Biol.Chem.275：14281-6。

对动物给予鞘氨醇1-磷酸酯受体诱导外周血液淋巴细胞被系统螯 合到次级淋巴器官内，由此导致在治疗上有用的免疫抑制，参见 Mandala，S.，R.Hajdu，J.Bergstrom，E.Quackenbush，J.Xie，J. Milligan，R.Thornton，G.-J.Shei，D.Card，C.Keohane，M. Rosenbach，J.Hale，C.L.Lynch，K.Rupprecht，W.Parsons，H.Rosen. 2002.Science.296：346-349。然而，鞘氨醇1-磷酸酯受体还具有心血 管和支气管影响，这限制了其作为治疗剂的用途。静脉内施用鞘氨醇 1-磷酸酯受体降低了大鼠中的心搏率、心室收缩和血液，参见 Sugiyama，A.，N.N.Aye，Y.Yatomi，Y.Ozaki，和K.Hashimoto.2000. Jpn.J.Pharmacol.82：338-342。在人气道平滑肌细胞中，鞘氨醇1-磷 酸酯调节收缩、细胞生长和细胞因子生成，这促进了支气管收缩、气 道研制和哮喘中的重塑，参见Ammit，A.J.，A.T.Hastie，L.C.Edsall， R.K.Hoffman，Y.Amrani，V.P.Krymskaya，S.A.Kane，S.P.Peters， R.B.Penn，S.Spiegel，R.A.Panettieri.Jr.2001，FASEB J.15：1212- 1214。鞘氨醇1-磷酸酯的不利作用与其对于所有S1P受体的非选择 性强效激动剂活性有关。

本发明包括是S1P1/Edg1受体的激动剂的化合物，相对于 S1P3/Edg3受体，所述化合物对S1P1/Edg1受体有选择性。S1P1/Edg1 受体选择性激动剂具有超过现有治疗的优点，并且扩大了淋巴细胞螯 合剂的治疗窗口，对于较高剂量有更好的耐受性，并因此提高了作为 单药治疗的效力。

虽然免疫抑制剂的主要应用是治疗骨髓、器官和移植物排斥，但 是这样的化合物的其它应用包括治疗关节炎，特别是类风湿性关节 炎，胰岛素和非胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化、牛皮癣、炎性肠 病、克罗恩病、红斑狼疮等。

因此，本发明提供了免疫抑制化合物，所述化合物比现有化合物 更安全和更有效。通过阅读说明书，这些和其它目的对于本领域技术 人员来说是显而易见的。

S1P受体概述   名称   同义词   偶联G蛋白   mRNA表达   S1P1   Edg1，LPB1   Gi/o   广泛分布的，   内皮细胞   S1P2   Edg5，LPB2   AGR16，H218   Gi/o，Gq，   G12/13   广泛分布的，   血管平滑肌细胞   S1P3   Edg3，LPB3   Gi/o，Gq，   G12/13   广泛分布的，   内皮细胞   S1P4   Edg6，LPC1   Gi/o   淋巴组织，   淋巴细胞系   S1P5   Edg8，LPB4，NRG1   Gi/o   脑，脾脏

                    发明概述

本发明涉及式I化合物：

及其可药用盐。所述化合物可用于治疗免疫介导的疾病和病症例如骨 髓、器官和组织移植排斥。本发明还包括药物组合物和使用方法。

                          发明详述

本发明涉及式I化合物：

或其可药用盐，其中：

A是C-R3或N，

D是C-R4或N，

E是C-R6或N，且

G是C-R7或N，

条件是A、D、E和G当中至少有一个不是N；

X、Y和Z独立地选自：N和C-R8，条件是X、Y和Z当中至少有一 个不是N；

R1和R2分别独立地选自：

(1)氢和

(2)C1-6烷基，所述烷基任选被1-3个卤素取代，

或者R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成3-6元饱和单环；

R3、R4、R6和R7分别独立地选自：

(1)氢，

(2)卤素，

(3)氰基，和

(4)C1-4烷基或C1-4烷氧基，所述烷基或烷氧基分别任选被1-3个卤 素取代；

R5选自：

(1)C1-6烷基，

(2)C2-6链烯基，

(3)C2-6炔基，

(4)C3-6环烷基，

(5)C1-6烷氧基，

(6)C3-6环烷氧基，

(7)C1-6酰基，

(8)卤素，

(9)芳基和

(10)HET，

其中上述基团(1)-(7)任选被卤素取代，卤素的数目为1至可被取代位 置的最大数目，并且

上述基团(9)和(10)任选被1-3个独立地选自下列的取代基取代：

(a)卤素，和

(b)C1-4烷基或C1-4烷氧基，所述烷基和烷氧基分别任选被氧代基、羟 基或1-3个卤素取代，

或者R4和R5可以与它们所连接的原子一起形成5或6元单环，所述 环任选含有1-3个选自O、S和NR8的杂原子，所述环任选被1-3 个独立地选自下列的取代基取代：卤素，C1-4烷基和C1-4烷氧基，所 述C1-4烷基或C1-4烷氧基任选被1-3个卤素取代；

每个R8独立地选自：氢、卤素和C1-4烷基，其中所述C1-4烷基任选被 1-3个卤素取代；并且

HET选自：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯 并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、 吲哚啉基、吲哚基、吲嗪基(indolazinyl)、吲唑基、异苯并呋喃基、 异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、噁 唑基、吡嗪基、吡唑基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、 吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、 三唑基、氮杂环丁烷基、1，4-二氧杂环己烷基、六氢氮杂基、哌嗪 基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二 氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二 氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑 基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶 基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻 唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苯 甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基。

本发明的一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是N，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7；并且

X、Y和Z是C-R8。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7；并且

R3、R6和R7是氢。在该实施方案内包括其中R4是三氟甲基或氰基的 式I化合物。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7；并且

R1和R2分别独立地选自氢、甲基和乙基。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7；并且

R5选自：

(1)C2-6烷基，

(2)C3-6环烷基，

(3)C2-6烷氧基，

(4)C3-6环烷氧基，和

(5)C3-6酰基，

其中上述基团(1)-(5)任选被1-5个氟取代。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7；并且

R5选自：

(1)苯基，所述苯基任选被1-3个独立地选自卤素、甲基、甲氧基和 羟基甲基的取代基取代，

(2)噁二唑基，

(3)噁唑基，

(4)呋喃基，和

(5)噻吩基。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7；并且

X是N，且Y和Z都是C-R8。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7；并且

其中X和Z都是C-R8，且Y是N。

本发明的另一个实施方案包括定义如下的式I化合物，其中：

A是C-R3，

D是C-R4，

E是C-R6，且

G是C-R7；

R1和R2分别独立地选自：氢和甲基，

R3、R6和R7是氢，

R4是三氟甲基或氰基，并且

R5是C2-6烷氧基，所述烷氧基任选被1-5个氟取代。在该实施方案 内包括其中R5选自2，2，2-三氟乙氧基和2，2，2-三氟-1-甲基乙氧基的化 合物。在该实施方案内还包括定义如下的化合物：其中R5选自2，2，2- 三氟乙氧基和2，2，2-三氟-1-甲基乙氧基，X、Y和Z是C-R8，并且每 个R8独立地选自氢、甲基和卤素。在该实施方案内还包括定义如下 的化合物：其中R5选自2，2，2-三氟乙氧基和2，2，2-三氟-1-甲基乙氧基， X是N，且Y和Z都是C-R8，并且每个R8独立地选自氢、甲基和卤 素。在该实施方案内还包括定义如下的化合物：其中R5选自2，2，2-三 氟乙氧基和2，2，2-三氟-1-甲基乙氧基，X和Z都是C-R8，且Y是N， 并且每个R8独立地选自氢、甲基和卤素。

本发明的示例性说明是下列化合物：

或任何上述化合物的可药用盐。

本发明还包括在需要这种治疗的哺乳动物患者中治疗免疫调节异 常的方法，所述方法包括给所述患者施用能有效治疗所述免疫调节异 常的量的式I化合物。

该实施方案包括上述方法，其中所述免疫调节异常是选自下列的 自身免疫性或慢性炎性疾病：系统性红斑狼疮、慢性类风湿性关节炎、 I型糖尿病、炎性肠病、胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、多发性硬化、克 罗恩病、溃疡性结肠炎、大疱性类天疱疮、结节病、牛皮癣、自身免 疫性肌炎、韦格纳肉芽肿病、鱼鳞病、格雷夫斯眼病和哮喘。

该实施方案包括上述方法，其中所述免疫调节异常是骨髓或器官 移植排斥或移植物抗宿主疾病。

该实施方案包括上述方法，其中所述免疫调节异常选自：器官或 组织移植、由于移植而引起的移植物抗宿主疾病、自动免疫性综合征 包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发性硬化、 重症肌无力、I型糖尿病、葡萄膜炎、后葡萄膜炎、应变性脑脊髓炎、 肾小球肾炎、感染后自身免疫性疾病包括风湿热、感染后肾小球肾炎、 炎性和高增殖性皮肤病、牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹性 皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表 皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜伊红细胞增多、 红斑狼疮、痤疮、局限性脱发、角膜结膜炎、春季结膜炎、与贝赫切 特疾病有关的葡萄膜炎、角膜眼、疱疹性角膜眼、圆锥形角膜、角膜 上皮营养不良、角膜白斑、眼天疱疮、莫伦溃疡、巩膜眼、格雷夫斯 眼病、福-小-原综合征、结节病、花粉过敏、可逆性阻塞性气道疾 病、支气管哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、外源性哮喘、粉尘性哮 喘、慢性或顽固性哮喘、后期哮喘和气道反应过度、支气管炎、胃溃 疡、由缺血性疾病和血栓形成形成的血管损伤、缺血性肠病、炎性肠 病、坏死性小肠结肠炎、与热灼伤有关的肠损伤、腹腔疾病、直肠炎、 嗜伊红细胞性胃肠炎、肥大细胞增多、克罗恩病、溃疡性结肠炎、偏 头痛、鼻炎、湿疹、间质性肾炎、古德帕斯丘综合征、溶血性尿毒症 综合征、糖尿病肾病、多发性肌炎、吉-巴综合征、梅尼埃病、多神经 炎、多发性神经炎、单神经炎、神经根病、甲状腺功能亢进、巴泽多 病、纯红细胞再生障碍、再生障碍性贫血、发育不良性贫血、特发性 凝血细胞减少性紫癜、自身免疫性溶血性疾病、粒细胞缺乏症、恶性 贫血、巨幼细胞贫血、红细胞不发育、骨质疏松、结节病、纤维化费、 特发性间质性肺炎、皮肌炎、寻常白斑病、寻常鱼鳞病、光变应性敏 感性、皮肤T细胞淋巴瘤、动脉硬化、动脉粥样硬化、主动脉炎综合 征、结节性多动脉炎、心肌炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、舍格伦综 合征、肥胖症、嗜伊红细胞性筋膜炎、牙龈损伤、牙周膜、牙槽骨、 牙骨质、肾小球肾炎、通过防止脱毛或提供头发出芽和/或促进头发产 生和头发生长来治疗男性型脱发或老年脱发、肌营养不良、脓皮病和 塞泽里综合征、艾迪生病，在防腐、移植或缺血性疾病之后发生的器 官的缺血-再灌注损伤，内毒素休克、假膜性结肠炎、由药物或辐射引 起的结肠炎、缺血性急性肾功能不全、慢性肾功能不全、由肺氧气或 药物引起的毒素病、肺癌、肺气肿、白内障、铁沉着、视网膜色素变 性、老年性黄斑变性、脉络膜瘢痕形成、角膜碱灼伤、皮炎多形性红 斑、线形IgA皮肤病和牙骨质皮炎、龈炎、牙周炎、脓毒症、胰腺炎、 由环境污染引起的疾病、衰老、致癌作用、癌转移和低气压病、由组 胺或白三烯-C4释放引起的疾病、贝赫切特疾病、自身免疫性肝炎、 原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、部分肝切除、急性肝坏死，由 毒素、病毒性肝炎、休克或缺氧引起的坏死，B病毒肝炎、非-A/非-B 肝炎、肝硬化、酒精性肝炎、肝衰竭、爆发性肝衰竭、迟发性肝衰竭、 “急性-慢性”肝衰竭、增强化疗效果、巨细胞病毒感染、HCMV感 染、AIDS、癌症、老年痴呆、创伤以及慢性细菌感染。

在该实施方案内还包括上述方法，其中所述免疫调节异常选自：

1)多发性硬化，

2)类风湿性关节炎，

3)系统性红斑狼疮，

4)牛皮癣，

5)移植的器官或组织排斥，

6)炎性肠病，

7)淋巴起源的恶性肿瘤，

8)急性和慢性淋巴细胞性白血病和淋巴瘤，和

9)胰岛素和非胰岛素依赖型糖尿病。

本发明还包括在需要免疫抑制的哺乳动物患者中抑制免疫系统的 方法，包括给所述患者施用免疫抑制有效量的式I化合物。

本发明还包括药物组合物，所述组合物包含式I化合物与可药用 载体。

本发明还包括在需要这种治疗的哺乳动物患者中治疗呼吸疾病或 病症的方法，包括给所述患者施用治疗所述呼吸疾病或病症有效量的 式I化合物。在该实施方案内还包括上述方法，其中所述呼吸疾病或 病症选自：哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫综 合征、婴儿呼吸窘迫综合征、咳嗽、嗜伊红细胞性肉芽肿、呼吸道合 胞体病毒细支气管炎、支气管扩张、特发性肺纤维化、急性肺损伤和 闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎。

该实施方案内还包括上述方法，其中所述患者还患有呼吸疾病或 病症。

该实施方案内还包括上述方法，其中所述患者还患有心血管疾病 或病症。

除非另有说明，使用以下定义来描述本发明。

当本发明的结构式中具有氮原子时，应当理解，存在足够的氢原 子或取代基来满足氮原子的化合价。

术语“卤素”或“卤代”包括F、Cl、Br和I。

术语“烷基”是指具有指定数目碳原子的直链或支链结构及其组 合。因此，例如C1-6烷基包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、仲丁基和 叔丁基、丁基、戊基、己基、1，1-二甲基乙基、环丙基、环丁基、环 戊基和环己基。

术语“烷氧基”是指具有指定数目碳原子的直链、支链或环状构 型的烷氧基。C1-6烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧 基等。

术语“烷硫基”是指具有指定数目碳原子的直链、支链或环状构 型的烷硫基。C1-6烷硫基包括例如甲硫基、丙硫基、异丙硫基等。

术语“链烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的指定数目碳原子的 直链或支链结构及其组合，其中氢可以被另外的碳-碳双键代替。C2-6 链烯基包括例如乙烯基、丙烯基、1-甲基乙烯基、丁烯基等。

术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的指定数目碳原子的直 链或支链结构及其组合。C3-6炔基包括例如丙炔基、1-甲基乙炔基、 丁炔基等。

术语“环烷基”是指具有指定数目碳原子的单环、二环或三环结 构，所述结构任选与直链或支链结构组合。环烷基的实例包括环丙基、 环戊基、环庚基、金刚烷基、环十二烷基甲基、2-乙基-1-二环[4.4.0] 癸基、环丁基甲基等。

术语“环烷氧基”是指环烷基-O-，其中环烷基如上所定义。例 如，环烷氧基包括环丁氧基。

术语“酰基”是指在1-位被氧代基取代的如上所定义的烷基。实 例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和己酰基。

术语“芳基”定义为单环或二环芳族环系，并且包括例如苯基、 萘基等。

术语“芳烷基”是指具有如上所定义的芳基来取代一个烷基氢原 子的1-6个碳原子的如上所定义的烷基，例如苄基等。

术语“芳氧基”是指通过氧原子连接在分子上的如上所定义的芳 基(芳基-O)，并包括例如苯氧基、萘氧基等。

术语“芳烷氧基”是指通过氧原子连接在分子上的如上所定义的 芳烷基(芳烷基-O)，并包括例如苄氧基等。

术语“芳硫基”定义为通过硫原子连接在分子上的如上所定义的 芳基(芳基-S)，并且包括例如硫代苯氧基、硫代萘氧基等。

术语“芳酰基”是指通过羰基连接在分子上的如上所定义的芳基(芳 基-C(O)-)，并且包括例如苯甲酰基、萘甲酰基等。

术语“芳酰基氧基”是指通过氧原子连接在分子上的如上所定义 的芳酰基(芳酰基-O)，并且包括例如苯甲酰基氧基或苯甲酰氧基、萘 甲酰基氧基等。

术语“治疗”不仅包括治疗患者来缓减患者的疾病或病症的征兆 和症状，而且还包括预防性地治疗无症状的患者以防止疾病或病症发 作或进展。术语“治疗有效量”是指药物或药理活性剂的量，其能引 起组织、系统、动物或人的生物或医疗反应，该量是由研究人员、兽 医、医师或其它临床工作人员确定的。该术语还包括由研究人员、兽 医、医师或其它临床工作人员确定的，能够预防或减轻生物或医疗事 件发生的危险性的药物或药理活性剂的量。

本发明包括可药用盐和水合物。可药用盐包括金属(无机)盐和有 机盐；Remington′s Plzarmaceutical Sciences，17th Edition，pg.1418 (1985)中给出了可药用盐的一览。本领域技术人员众所周知的是，合 适的盐形式是根据物理和化学稳定性、流动性、润湿性和溶解性来选 择的。本领域技术人员理解，可药用盐包括但不限于无机酸的盐，例 如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐和硝酸盐，或者无 机酸的盐，例如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸 盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐或扑酸盐、水杨酸盐 和硬脂酸盐。类似地，可药用阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、 锂和铵(尤其是与仲胺形成的铵盐)。出于上述原因，优选的本发明盐 包括钾盐、钠盐、钙盐和铵盐。式I化合物的结晶形式、水合物和溶 剂化物也包括在本发明范围内。

对于本说明书的目的，“可药用水合物”是指本发明化合物与一 个或多个水分子结晶以形成水合形式。

本发明还包括一种或多种立体异构体形式的式I化合物，所述立 体异构体形式呈基本上纯形式或立体异构体混合物的形式。所有这样 的异构体都包括在本发明内。

由于其S1P1/Edg1激动剂活性，本发明化合物是可用于治疗或预 防自身免疫性或慢性炎性疾病的免疫调节剂。本发明化合物可用于在 其中免疫抑制对其有利的情况下抑制免疫系统，例如在骨髓、器官或 移植物排斥、自身免疫性和慢性炎性疾病中，所述疾病包括系统性红 斑狼疮、慢性类风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病、胆汁性肝硬 化、葡萄膜炎、多发性硬化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、大疱性类天 疱疮、结节病、牛皮癣、自身免疫性肌炎、韦格纳肉芽肿病、鱼鳞病、 格雷夫斯眼病和哮喘。

更特别地，本发明化合物可用于治疗或预防选自下列的疾病或病 症：器官或组织移植、由于移植而引起的移植物抗宿主疾病、自动免 疫性综合征包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、 多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病、葡萄膜炎、后葡萄膜炎、应 变性脑脊髓炎、肾小球肾炎、感染后自身免疫性疾病包括风湿热、感 染后肾小球肾炎、炎性和高增殖性皮肤病、牛皮癣、特应性皮炎、接 触性皮炎、湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔藓、天疱疮、大疱性类 天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、红斑、皮 肤嗜伊红细胞增多、红斑狼疮、痤疮、局限性脱发、角膜结膜炎、春 季结膜炎、与贝赫切特疾病有关的葡萄膜炎、角膜眼、疱疹性角膜眼、 圆锥形角膜、角膜上皮营养不良、角膜白斑、眼天疱疮、莫伦溃疡、 巩膜眼、格雷夫斯眼病、福-小-原综合征、结节病、花粉过敏、可 逆性阻塞性气道疾病、支气管哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、外源 性哮喘、粉尘性哮喘、慢性或顽固性哮喘、后期哮喘和气道反应过度、 支气管炎、胃溃疡、由缺血性疾病和血栓形成形成的血管损伤、缺血 性肠病、炎性肠病、坏死性小肠结肠炎、与热灼伤有关的肠损伤、腹 腔疾病、直肠炎、嗜伊红细胞性胃肠炎、肥大细胞增多、克罗恩病、 溃疡性结肠炎、偏头痛、鼻炎、湿疹、间质性肾炎、古德帕斯丘综合 征、溶血性尿毒症综合征、糖尿病肾病、多发性肌炎、吉-巴综合征、 梅尼埃病、多神经炎、多发性神经炎、单神经炎、神经根病、甲状腺 功能亢进、巴泽多病、纯红细胞再生障碍、再生障碍性贫血、发育不 良性贫血、特发性凝血细胞减少性紫癜、自身免疫性溶血性疾病、粒 细胞缺乏症、恶性贫血、巨幼细胞贫血、红细胞不发育、骨质疏松、 结节病、纤维化费、特发性间质性肺炎、皮肌炎、寻常白斑病、寻常 鱼鳞病、光变应性敏感性、皮肤T细胞淋巴瘤、动脉硬化、动脉粥样 硬化、主动脉炎综合征、结节性多动脉炎、心肌炎、硬皮病、韦格纳 肉芽肿病、舍格伦综合征、肥胖症、嗜伊红细胞性筋膜炎、牙龈损伤、 牙周膜、牙槽骨、牙骨质、肾小球肾炎、通过防止脱毛或提供头发出 芽和/或促进头发产生和头发生长来治疗男性型脱发或老年脱发、肌营 养不良、脓皮病和塞泽里综合征、艾迪生病，在防腐、移植或缺血性 疾病之后发生的器官的缺血-再灌注损伤，内毒素休克、假膜性结肠炎、 由药物或辐射引起的结肠炎、缺血性急性肾功能不全、慢性肾功能不 全、由肺氧气或药物引起的毒素病、肺癌、肺气肿、白内障、铁沉着、 视网膜色素变性、老年性黄斑变性、脉络膜瘢痕形成、角膜碱灼伤、 皮炎多形性红斑、线形IgA皮肤病和牙骨质皮炎、龈炎、牙周炎、脓 毒症、胰腺炎、由环境污染引起的疾病、衰老、致癌作用、癌转移和 低气压病、由组胺或白三烯-C4释放引起的疾病、贝赫切特疾病、自 身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、部分肝切除、 急性肝坏死，由毒素、病毒性肝炎、休克或缺氧引起的坏死，B病毒 肝炎、非-A/非-B肝炎、肝硬化、酒精性肝炎、肝衰竭、爆发性肝衰 竭、迟发性肝衰竭、“急性-慢性”肝衰竭、增强化疗效果、巨细胞病 毒感染、HCMV感染、AIDS、癌症、老年痴呆、创伤以及慢性细菌 感染。

本发明化合物还可以用于治疗或预防阿尔茨海默氏病。

本发明还包括在有此需要的哺乳动物患者中预防或治疗抗移植或 器官或组织移植排斥的方法，包括施用治疗有效量的式I化合物。

另一个实施方案是在有此需要的哺乳动物患者中抑制免疫系统的 方法，包括给所述患者施用免疫系统抑制有效量的式I化合物。

更特别地，本文描述的方法包括治疗或预防骨髓或器官移植排斥 的方法，包括给需要这种治疗或预防的哺乳动物患者施用治疗或预防 骨髓或器官移植排斥有效量的式I化合物或其可药用盐或水合物。

本发明化合物还可以用于治疗呼吸疾病或病症，包括哮喘、慢性 支气管炎、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫综合征、婴儿呼吸窘迫综 合征、咳嗽、嗜伊红细胞性肉芽肿、呼吸道合胞体病毒细支气管炎、 支气管扩张、特发性肺纤维化、急性肺损伤和闭塞性细支气管炎伴机 化性肺炎。

此外，相对于S1P3/Edg3受体，本发明化合物是S1P1/Edg1受体 的选择性激动剂。Edg1选择性激动剂具有超过现有治疗的优点，并 且扩大了淋巴细胞螯合剂的治疗窗口，对于较高剂量有更好的耐受 性，并因此提高了作为单药治疗的效力。

本发明还包括药物制剂，所述制剂包含可药用载体与式I化合物 或其可药用盐或水合物。优选的制剂的实施方案是其中还包括第二免 疫抑制剂的制剂。这样的第二免疫抑制剂的实例包括但不限于：硫唑 嘌呤、布喹那钠、脱氧精胍菌素、咪唑立宾、麦考酚酸吗啉代酯、环 孢素、FK-506、雷帕霉素、FTY720和ISAtx247(Isotechnika)。将式 I化合物与第二免疫抑制剂，包括一种或多种上述第二免疫抑制剂联 合给药的方法也包括在本发明范围内。

本发明化合物，包括其盐和水合物可用于治疗自身免疫性疾病， 包括预防骨髓移植物、外来器官移植物排斥和/或相关病症、疾病和疾 患。

本发明化合物可通过能够在温血动物体内实现活性组分化合物与 作用位点的接触的任何方法给药。例如，给药可以是口服给药，局部 给药，包括透皮给药，眼给药，颊给药，鼻内给药，吸入给药，阴道 内给药，直肠给药，脑池内给药和胃肠外给药。本文所用术语“胃肠 外给药”是指给药方式，其包括皮下给药、静脉内给药、肌内给药、 关节内注射或输注、胸骨内给药和腹膜内给药。

本发明化合物可通过用于与药物结合使用的任何常规手段，作为 单独的治疗剂给药或者与治疗剂联合给药。它们可单独施用，但是通 常与根据给药途径和标准药物实践而选择的药物载体一起给药。

给药剂量将取决于接收者的年龄、健康状况和体重，疾病程度， 同时进行的治疗的种类，如果有的话，治疗频率和所需效果的性质。 通常，活性组分化合物的日剂量为约0.1-2000毫克/天。通常，1-100 毫克/天，一次或多次施用，能有效获得所需结果。这些剂量是治疗自 身免疫性疾病，预防外来器官移植物排斥和/或相关病症、疾病和疾患 的有效量。

活性组分可以在以下剂型中给药：固体剂型，例如胶囊、片剂、 锭剂、糖锭剂、粒剂和粉剂，或液体剂型例如酏剂、糖浆剂、乳剂、 分散液和悬浮液。活性组分还可以在无菌液体剂型例如分散液、悬浮 液或溶液中胃肠外给药。也可用于施用活性组分的其它剂型有，对于 局部给药，有膏剂、霜剂、滴剂、透皮贴剂或粉剂，对于眼给药，有 眼用溶液或悬浮液形式，对于吸入或鼻内给药，有气雾剂或粉剂组合 物，或者对于直肠或阴道给药，有霜剂、膏剂或栓剂。

明胶胶囊含有活性组分和粉末载体例如乳糖、淀粉、纤维素衍生 物、硬脂酸镁、硬脂酸等。可使用类似的稀释剂来制备压缩片剂。片 剂和胶囊都可以制成缓释产品来提供药物在数小时期间内的持续释 放。可以将压缩片剂进行糖包衣或膜包衣以遮蔽任何不适的味道和保 护片剂防潮，或者包以肠溶衣来在胃肠道内选择性地崩解。

用于口服给药的液体剂型可含有着色剂和矫味剂以提高患者接受 性。

通常，水、合适的油、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液以及二 醇例如丙二醇或聚乙二醇是用于胃肠外给药用溶液的合适载体。胃肠 外给药用溶液优选含有活性组分的水溶性盐、合适的稳定剂以及如果 需要的话缓冲物质。单独或组合的抗氧化剂例如亚硫酸氢钠、亚硫酸 钠或抗坏血酸是合适的稳定剂。还使用的是柠檬酸及其盐和EDTA 钠。此外，胃肠外给药用溶液可以含有防腐剂例如苯扎氯铵、对羟基 苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。

合适的药物载体描述在Remington′s Pharmaceutical Sciences，A. Osol中，这是本领域的标准参考书。

对于通过吸入给药，本发明化合物可以方便地以气雾剂的形式从 加压的包装或喷雾器中递送。化合物还可以作为可配制的粉剂递送， 并且粉剂组合物可以借助于吹入粉剂吸入器装置来吸入。对于吸入给 药，优选的递送系统是计量剂量吸入(MDI)气雾剂，其可配制成式I 化合物在合适的推进剂例如碳氟化合物或烃中的悬浮液或溶液。

对于口服给药，眼用制剂可以使用适当重量百分比的式I化合物 在合适的眼用载体中的溶液或悬浮液来配制，这样将化合物与眼睛表 面接触足够长的时间，从而使得化合物透入角膜和眼睛的内部区域。

用于施用本发明化合物的药物剂型可如下所述举例说明：

                      胶囊

通过给标准两片式硬明胶胶囊填充100毫克活性组分粉末、150 毫克乳糖、50毫克纤维素和6克硬脂酸镁来制备大量单位胶囊。

                    软明胶胶囊

制备活性组分在食用油例如豆油、棉籽油或橄榄油中混合物，并 且通过排代泵注入到明胶内以形成含有100毫克活性组分的软明胶胶 囊。将胶囊洗涤并且干燥。

                       片剂

通过常规方法制备大量片剂，这样剂量单位是100毫克活性组分、 0.2毫克胶态二氧化硅、5毫克硬脂酸镁、275毫克微晶纤维素、11毫 克淀粉和98.8毫克乳糖。可施加合适的包衣来提高适口性或延迟吸 收。

                    注射剂

适于通过注射给药的胃肠外用组合物是通过将1.5％重量的活性 组分在10％体积的丙二醇中搅拌而制得的。用注射用水将溶液补足体 积，并灭菌。

                    悬浮液

制备口服给药用水悬浮液，这样每5毫升含有100毫克细分散的 活性组分、100毫克羧甲基纤维素钠、5毫克苯甲酸钠、1.0克山梨醇 溶液U.S.P.和0.025毫升香草醛。

当把本发明化合物逐步给药或者与另一治疗剂联合给药时，一般 可使用相同剂型。当把药物以物理组合给药时，剂型和给药途径应当 根据组合的药物的相容性来选择。因此，应当理解，术语联合给药包 括同时或顺序给予两种活性剂，或者作为两种活性组分的固定剂量组 合来使用。

合成方法

在以下实施例中举例说明制备本发明化合物的方法。另外的途径 对于本领域技术人员来说是可辨别的。

制备本发明通式i化合物的适宜方法如反应方案1所示。可在合 适的碱(如果需要的话)例如三乙胺、N，N-二异丙基乙基胺或碳酸氢钠 存在下，在溶剂例如1，2-二氯乙烷、甲苯、二甲苯、N，N-二甲基甲酰 胺或N-甲基吡咯烷酮中，使用试剂例如N，N′-二环己基碳二亚胺、1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1，1′-羰基二咪唑或二(2-氧代-3-噁 唑烷基)膦酰氯将羧酸ii活化以进行酰化。然后可加入通式iii所示2-(氨 基)芳基N-羟基脒，导致形成酰基N-羟基脒iv。可使用本领域技术人 员已知的方法(例如结晶、硅胶色谱、HPLC)分离出该中间体，在随 后的步骤中，通过在合适的溶剂(例如1，2-二氯乙烷、甲苯、二甲苯、 N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮)中将iv温热来环合/脱水，以生 成式i所示的1，2，4-噁二唑。将iii转化成iv可能需要碱，在这种情况 下可使用试剂例如吡啶、N，N-二异丙基乙基胺或氟化四丁基铵。不分 离N-羟基脒iv可能是更方便和希望的，在这种情况下可作为连续方 法将ii转化成i。

可以使用除了活化的羧酸ii之外的酰化剂来生成化合物i。具体 而言，使用酰氯、羧酸酐、酰胺或腈代替羧酸ii和酰基活化剂来制备 如上所述的1，2，4-噁二唑化合物i可能是有利或期望的。使用这些其 它酰化剂来制备1，2，4-噁二唑化合物的方法以及与本发明有关的其它 方法是本领域技术人员已知的，并且在文献中综合描述过(参见 Clapp，L.B.，“1，2，3-和1，2，4-噁二唑化合物”，pp.366-91， Comprehensive Heterocyclic Chemistry，Volume 6，Potts，K.T.， Editor，Pergamon Press，1984)。

反应方案1

                        溶剂，碱

         X，Y，Z＝N或C-R8，A＝N或CR3，D＝N或C-R4

         E＝N或C-R6且G＝N或C-R7

可用于制备本发明通式i化合物的另一种方法如反应方案2所示。 将羧酸ii如反应方案1所示活化，并且用于酰化2-(取代的)芳基N-羟 基脒v，其中官能团X是离去基团例如氟、氯、溴、碘、氰基、烷基 磺酰氧基或芳基磺酰氧基。使用上述方法来转化成化合物iv以及闭环 生成i。取代离去基团X是通过在合适的溶剂(例如甲醇、乙醇、N，N- 二甲基甲酰胺、二甲亚砜)中，于室温或室温以上温度用氨、烷基胺或 二烷基胺处理vi来进行的，以生成1，2，4-噁二唑i。或者，按照Park 和Cho在Tetrahedron Letters，1997，38，8331-34中报道的方法， 可在二乙醇胺存在下于高温下将vi用N-甲基甲酰胺处理，以生成其 中-NR1R2是-NHCH3的化合物i。

反应方案2

                                   3)溶剂，加热

应当理解，可在化合物i中修饰基团R3-R8的化学结构。这种修 饰的实例包括(但不限于)：1)如果一个或多个R3-R8是-OH，则在合 适的溶剂(二氯甲烷、乙腈、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺)中，于室温或 室温以上的温度下，在合适的碱(例如N，N-二异丙基乙基胺、三乙胺、 吡啶、碳酸钠)存在下，用烷基卤或烷基磺酸酯处理i，以生成其中一 个或多个R3-R8是烷氧基的化合物i；2)如果一个或多个R3-R8是-Cl、 -Br、-I或-OSO2CF3，则在合适的溶剂(例如乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、 二氧杂环己烷、甲苯)中，于室温或室温以上的温度下，在钯催化剂(例 如四(三苯基膦)钯或二氯化钯二(三苯基膦))存在下，将i用芳基硼酸 和合适的碱(氢氧化钠、碳酸氢钾)处理，以生成其中一个或多个R3-R8 是芳基的化合物i。

反应方案3显示了用于制备本发明化合物的N-羟基脒中间体iii 或v的方便制备方法。对于任一中间体，在合适的溶剂(甲醇、乙醇、 水、N，N-二甲基甲酰胺)中，于室温或室温以上的温度下，将相应的腈 viii或ix用羟基胺(得自羟基胺水溶液或者通过用碱例如三乙胺、N，N- 二异丙基乙基胺或碳酸氢钠处理羟基胺盐酸盐而生成的)处理。很多腈 viii或ix以及羧酸ii可从商业来源获得，或者可由本领域技术人员使 用报道的文献方法制得。

反应方案3

虽然通式i是非手性的，但是应当理解，任何基团R1-R8可能具 有不对称中心，在这种情况下，可通过本领域技术人员已知的方法获 得单独的立体异构体i，所述方法包括(但不限于)：立体有择合成，拆 分i或用于其制备的任何中间体与对映体纯的酸或碱的盐，通过采用 对映体纯的固定相HPLC拆分i或用于其制备的任何中间体。

制备实施例

如下所述举例说明本发明化合物：

                   一般介绍

溶液的浓缩是在旋转蒸发仪上于减压条件下进行的。常规快速色 谱法是在硅胶(230-400目)上进行的。快速色谱法还使用Biotage Flash Chromatography装置(Dyax Corp.)，在硅胶(32-63mM，60孔径) 上，在预先填充的所指示尺寸的筒中进行的。除非另有说明，NMR 光谱是在CDCl3中获得的。偶合常数(J)是以赫兹(Hz)为单位。缩写： 乙醚(乙醚)，三乙胺(TEA)，N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)，饱和水溶 液(sat′d)，室温(rt)，小时(h)，分钟(min)。

                    HPLC方法

HPLC A：YMCODS A，5μ，4.6×50mm柱，梯度10∶90-95∶5v/v CH3CN∶H2O+0.05％ TFA，4.5分钟，然后是95∶5v/v CH3CN∶H2O+ 0.05％TFA，1.5分钟；2.5mL/分钟，二极管阵列检测200-400nM HPLC B：Analytical Sales & Service ARMORC18 5m 2×25cm柱， 梯度10∶90-100∶0v/v CH3CN∶H2O+0.05％TFA，15分钟，然后是 100.0v/v CH3CN∶H2O+0.05％ TFA，10分钟；20mL/分钟，二极管 阵列检测200-400nM。

              制备N-羟基脒中间体

                 N-羟基脒1

              2-氯-N-羟基-烟脒

将2-氯-3-吡啶-甲腈(5.00g，37mmol)、羟基胺盐酸盐(3.73g，54 mmol)和碳酸氢钠(9.10g，108mmol)一起在CH3OH(250ml)中于50 ℃搅拌16小时。将该反应冷却，过滤，用CH2Cl2洗涤，将滤液浓缩， 获得了黄色固体：

1H NMR(500MHz，CD3OD)δ8.43(dd，J＝1.9，7.6，1H)，7.88(dd，J＝1.9，7.6 ，1H)，7.44(dd，J＝4.5，7.5，1H).

                      N-羟基脒2-6

使用类似于上述制备N-羟基脒1的方法，用合适的腈代替2-氯-3- 吡啶-甲腈，制得了下列N-羟基脒中间体。

                       N-羟基脒7

               2-(N-甲基氨基)-N-羟基-烟脒

将10g(72mmol)2-氯-3-吡啶-甲腈、40mL 40％甲基胺在H2O和20mL iPrOH中的混合物于55℃搅拌1.5小时。加入羟基胺水溶液 (6.0mL，50wt.％在H2O中的溶液)，将所得混合物在55℃搅拌1小 时。将该溶液冷却至室温。将沉淀的固体过滤，用50mL冷的(0℃)1∶1 v/v iPrOH/H2O洗涤并干燥，获得了7.52g本标题化合物：

                                                      1H NMR(500MHz，DMSO)δ9.88(br s，1H)，8.11(q，J＝4.5，1H)，8.02(dd，J＝1.5，5.0，1H)，7.75(dd，J＝1.5，7.5，1H)，6.54 (dd，J＝5.0，7.5，1H)，5.90(s，2H)，2.89(d，J＝4.5，3H)；ESI-MS 167(M+H).

                      N-羟基脒8

                 2-(氨基)-N-羟基-烟脒

将2-氨基-3-吡啶-甲腈(0.50g，4.2mmol)和羟基胺(0.42g，50％ inH2O)在10mL MeOH中的溶液于50℃搅拌16小时。将该反应冷却 并浓缩。在Biotage 40S筒上进行色谱纯化，使用EtOAc作为洗脱剂， 获得了0.50g本标题化合物：

                                                                    1H NMR (500MHz，CD3OD)δ7.91(dd，J＝1.8，5.0，1H)，7.76(dd，J＝1.9，7.8，1H)，6.66(dd， J＝5.2，7.7，1H).

                          N-羟基脒9

                 3-(N-甲基氨基)-吡嗪-2-(N-羟基脒)

步骤A：2-(N-甲基氨基)-3-氰基吡嗪

用45分钟将3.0mL 40％甲基胺水溶液和3.8mL(27mmol)TEA 在20mL THF中的溶液滴加到1.35g(10.4mmol)吡嗪-2，3-二甲腈在25 mL THF内的溶液中。将所得混合物搅拌15分钟，然后浓缩。将残 余物在100mL CH2Cl2与50mL 1N HCl之间分配。分离各层，用100mL CH2Cl2萃取水层。将有机萃取液合并，干燥并浓缩。在Biotage 40S 筒上进行色谱纯化，使用9∶1v/v己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了446 mg本标题化合物：ESI-MS 135(M+H)；HPLC A：3.03min。

步骤B：3-(N-甲基氨基)-吡嗪-2-(N-羟基脒)

将446mg(3.3mmol)3-(N-甲基氨基)-吡嗪-2-(N-羟基脒)(得自步 骤A)、486mg(7mmol)羟基胺盐酸盐和1.2mL(7mmol)DIEA在15 mL EtOH中的混合物加热回流30分钟。将该混合物冷却至0℃。将 沉淀的固体过滤，用冷的EtOH洗涤并干燥，获得了340mg本标题 化合物：

                                                                1H NMR(500MHz， DMSO)δ10.2(s，1H)，8.36(q，J＝4.5，1H)，8.07(d，J＝2.5，1H)，7.77(d，J＝2.5，1H)， 5.97(s，2H)，2.93(d，J＝4.5，3H)；ESI-MS 135(M+H).

                          N-羟基脒10

                2-(N-甲基氨基)-5-氟-N-羟基烟脒

步骤A：2，6-二氯-5-氟烟酰胺

向2，6-二氯-5-氟烟酰胺(5.50g，26.2mmol)在二氯甲烷(50mL)和 二甲基甲酰胺(2滴)内的冷却至0℃的混合物中滴加草酰氯(6.72mL， 78.6mmol)，移去冷却浴。2小时后，将该反应混合物真空浓缩，将 残余物与甲苯(1×10mL)共沸。将所得棕色残余物溶解在二氧杂环己 烷(50mL)中，滴加浓NH4OH。将该混合物在室温搅拌16小时，真 空浓缩，在0℃从50％ Et2O/i-PrOH(30mL)中研制，获得了5.48g 本标题化合物，为米色固体：

1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.27(br，1H)，6.78(br，1H)，8.11(d，1H，J＝ 7.3Hz).

步骤B：2-氯-5-氟烟酰胺

在氮气氛下，将2，6-二氯-5-氟烟酰胺(500mg，2.39mmol)、乙酸 钾(258mg，2.63mmol)和PtO2(25mg)合并。然后加入EtOAc(2.5mL) 和CH3OH(2.5mL)，之后通过气囊通过一个大气压的氢气。2小时后， 经由硅藻土将该反应混合物过滤，并真空浓缩。把残余物用EtOAc(10 mL)处理，过滤，将滤液真空浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残余物(1、 2％CH3OH/CH2Cl2)，获得了130mg本标题化合物，为白色固体：

                      1H NMR(500MHz，CD3OD)δ7.79(dd，1H，J＝2.8，7.7 Hz)，8.37(d，1H，J＝2.8Hz).

步骤C：2-氯-5-氟吡啶-3-甲腈

向2-氯-5-氟烟酰胺(880mg，5.04mmol)、三乙胺(1.55mL，11.1 mmol)和二氯甲烷(15mL)内的冷却至0℃的混合物中滴加三氟乙酸酐 (783μL，5.55mmol)。将所得黄色溶液在0℃搅拌1小时，用二氯甲 烷(5mL)稀释，用饱和NaHCO3(2×10mL)、盐水(1×10mL)洗涤，用 MgSO4干燥。将该混合物过滤，真空浓缩，通过快速硅胶色谱纯化(5、 10％EtOAc/己烷)，获得了770mg本标题化合物为白色固体：

                        1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.77(dd，1H J＝3.0，6.9 Hz)，8.49(d，1H J＝3.0Hz)；13C NMR(500MHz，CDCl3)δ111.3，113.3，129.4(J＝ 21.1Hz)，141.5，(J＝26.9Hz)，147.6，157.2(J＝260Hz).

步骤D：5-氟-2-甲基氨基吡啶-3-甲腈

在密封的管中，将2-氯-5-氟吡啶-3-甲腈(59mg，0.377mmol)溶 解在二氧杂环己烷(1.5mL)中。加入2.0M甲基胺在THF中的溶液(283 μL，0.565mmol)，将该管密封，加热至60℃。3小时后，再加入甲 基胺在THF中的溶液(283μL，0.565mmol)，将该反应混合物加热16 小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩，通过快速硅胶色谱纯 化(5、7、10％EtOAc/己烷)，获得了21mg本标题化合物，为白色膜 状物：

                                                                  1H NMR(500MHz，CD3OD)δ2.93，(s，3H)，7.68(dd，1H J＝3.0，7.9Hz)，8.19(d，1 H J＝3.0，Hz)；HPLC/MS(HPLC A)：152(M+H)+，1.97min.

步骤E：2-(N-甲基氨基)-5-氟-N-羟基烟脒

向5-氟-2-甲基氨基吡啶-3-甲腈在无水乙醇(1mL)和三乙胺(28 μL，0.198mmol)内的溶液中加入羟基胺盐酸盐(12mg，0.172mmol)， 将该混合物加热回流。6小时后，将该反应混合物冷却至室温，真空 浓缩，通过快速硅胶色谱纯化(10、20、40％EtOAc/己烷)，获得了8.0 mg本标题化合物为白色膜状物：HPLC/MS(HPLC A)：152(M+H)+， 0.33min。

                        N-羟基脒11

                2-氨基-5-氟-N-羟基烟脒

步骤A：2-氨基-5-氟吡啶-3-甲腈

在密封的管中，将浓氨水(0.6mL)加到2-氯-5-氟吡啶-3-甲腈(100 mg，0.639mmol，得自N-羟基脒10，步骤C)在二氧杂环己烷(1mL) 内的溶液中，将该反应混合物加热至110℃。5小时后，将该反应混 合物冷却至室温，真空浓缩，并通过快速色谱法纯化残余物(10、20、 30、50％ EtOAc/己烷)，获得了31mg本标题化合物，为白色膜状物 (35％)：

1H NMR(500MHz，CDCl3)δ5.16(br，2H)，7.45(dd，1H，J＝2.4，7.6Hz)，8.15(d， 1H，J＝2.1Hz).

步骤B：2-氨基-5-氟-N-羟基烟脒

向2-氨基-5-氟吡啶-3-甲腈(38mg，0.277mmol)在乙醇(2mL)和 三乙胺(58μL，0.416mmol)内的溶液中加入羟基胺盐酸盐(23mg，0.333 mmol)，将该混合物加热回流。6小时后，将该反应混合物冷却至室 温，真空浓缩，通过快速硅胶色谱纯化(30、50％EtOAc/己烷)，获得 了35mg本标题化合物，为白色膜状物(74％)：HPLC/MS(HPLC A)： 171(M+H)+。

                   制备羧酸中间体

                      羧酸1

                3-氟-4-环戊基-苯甲酸

将0.45g(1.45mmol)3-氟-4-溴-苯甲酸苄酯(0.45g，1.45mmol) 在4.4mL 0.5M溴化环戊基锌的THF溶液中的溶液用约5mg双(三 叔丁基膦)钯(0)处理，将所得混合物在室温搅拌24小时。将该反应混 合物直接在Biotage 40S筒上纯化，使用1∶1己烷/EtOAc作为洗脱剂。 将所得固体(0.27g，0.91mmol)和10％Pd/C在5mL MeOH中的混 合物于1大气压的氢气下搅拌3小时。将该反应过滤并浓缩。通过HPLC B纯化，获得了本标题化合物：

                                                  1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.83(dd， J＝1.6，8.0，1H)，7.72(dd，J＝1.6，10.5，1H)，7.36(t，J＝7.7，1H)，3.30(m，1H)，2.05- 2.14(m，2H)，1.58-1.90(m，6H).

                       羧酸2

           (+/-)-4-(1-氧代-2-甲基丁基)苯甲酸

步骤A：(+/-)-4-(1-氧代-2-甲基丁基)苯甲酸乙酯

将0.58g(4.5mmol)(+/-)-2-甲基丁酰氯在10mL 0.5M 4-(乙氧基 羰基)苯基碘化锌的THF溶液中的溶液用约5mg双(三叔丁基膦)钯(0) 处理，将所得混合物在室温搅拌1小时。将该反应混合物在50mL EtOAc(乙酸乙酯)与25mL 2N HCl之间分配，分离各层。将有机层 用25mL饱和NaCl水溶液洗涤，干燥并浓缩。通过硅胶色谱纯化， 使用15∶1v/v己烷/乙酸乙酯(15∶1)作为洗脱剂，获得了本标题化合 物：

1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.12(d，J＝8.4，2H)，7.98(d，J＝8.5，2H)，4.40(q，J＝ 7.2，2H)，3.40(m，1H)，1.83(m，1H)，1.51(m，1H)，1.41(t，J＝7.2，3H)，1.20(d，J＝ 6.83H)，0.91(t，J＝7.53H).

步骤B：(+/-)-4-(1-氧代-2-甲基丁基)苯甲酸

将0.57g(2.4mmol)(+/-)-4-(1-氧代-2-甲基丁基)苯甲酸乙酯(得自 步骤A)在10mL MeOH、3mL THF和2.4mL 5N NaOH中的溶液于 室温搅拌16小时。将该混合物用20mL H2O稀释，用25mL CH2Cl2萃取。将水层酸化(pH 1)，用50mL EtOAc萃取。将有机层用25mL 饱和NaCl水溶液洗涤，干燥并浓缩，获得了0.41g本标题化合物：

                                                           1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ8.21(d，J＝8.4，2H)，8.03(d，J＝8.5，2H)，3.41(m，1H)，1.85(m， 1H)，1.52(m，1H)，1.21(d，J＝6.9，3H)，0.93(t，J＝7.5，3H).

                         羧酸3

             4-(1-氧代-2-甲基丙基)苯甲酸

使用类似于上述制备羧酸2的方法，在步骤A中用异丁酰氯代替 (+/-)-2-甲基丁酰氯，制得了本标题化合物：

                               1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ8.21(d，J＝8.5， 2H)，8.03(d，J＝8.5，2H)，3.57(m，1H)，1.24(d，J＝6.9，6H).

                          羧酸4

                 4-(环丁基二氟甲基)苯甲酸

步骤A：4-(环丁基羰基)苯甲酸乙酯

使用类似于上述制备羧酸2的方法，在步骤A中用环丁烷羰基氯 代替(+/-)-2-甲基丁酰氯，制得了本标题化合物：

                                           1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.10(d，J＝ 8.2，2H)，7.93(d，J＝8.5，2H)，4.40(q，J＝7.2，2H)，4.01(m，1H)，2.37-2.46(m，2H)， 2.28-2.36(m，2H)，2.04-2.15(m，1H)，1.88-1.97(m，1H)，1.41(t，J＝7.1，3H).

步骤B：4-(环丁基二氟甲基)苯甲酸乙酯

将810mg(3.5mmol)4-(环丁基羰基)苯甲酸乙酯(得自步骤A)在5 mL甲苯中的溶液用1.30g(5.9mmol)[双(2-甲氧基乙基)氨基]三氟化 硫和0.41mL(0.7mmol)EtOH处理，将所得混合物在80℃加热18 小时。将该反应浓缩。通过硅胶色谱纯化，使用20∶1 v/v己烷/EtOAc洗脱，获得了本标题化合物：

                   1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.07(d，J＝8.2，2H)，7.51(d，J＝ 8.5，2H)，4.39(q，J＝7.2，2H)，2.96(m，1H)，2.15-2.27(m，2H)，1.80-1.99(m，4H)， 1.40(t，J＝7.1，3H).

步骤C：4-(环丁基二氟甲基)苯甲酸

将360mg(1.4mmol)4-(环丁基二氟甲基)苯甲酸乙酯(得自步骤B) 在4mL 1∶1v/v MeOH/THF中的溶液用2.1mL 1.0N NaOH处理。将 所得混合物在50℃搅拌3小时，然后冷却并浓缩。将残余物在EtOAc与2N HCl之间分配。将有机层用2N HCl(25ml)、25mL饱和NaCl水溶液洗涤，干燥并浓缩，获得了280mg本标题化合物：

                                                               1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ8.15(d，J＝8.5，2H)，7.56(d，J＝8.4，2H)，2.97(m，1H)，2.17-2.27 (m，2H)，1.80-2.02(m，4H).

                         羧酸5

               4-(1，1-二氟-2-甲基丙基)苯甲酸

使用类似于上述制备羧酸4的方法，在步骤B中用4-(异丙基羰 基)苯甲酸乙酯代替4-(环丁基羰基)苯甲酸乙酯，制得了本标题化合 物：

                                                                   1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.17(d，J＝8.3，2H)，7.56(d，J＝8.4，2H)，2.34(m，1H)， 1.00(d，J＝6.8，6H).

                         羧酸6

               3-氟-4-(2-甲基丙酰基)苯甲酸

步骤A：1-溴-3-氟-4-(2’-甲基)苯基乙基甲酮

在-78℃，将1.00g(3.8mmol)N-甲氧基-N-甲基(4-溴-2-氟)苯甲酰 胺在10mL THF中的溶液用2.3mL 2.0M氯化异丙基镁在THF中的 溶液处理。让该反应温热至室温，搅拌3小时。将该反应用50mL乙 醚稀释，用25mL 2N HCl、25mL饱和NaCl水溶液洗涤，干燥并浓 缩。通过硅胶色谱纯化，使用50∶1 己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了 143mg本标题化合物：

         1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.67(t，J＝8.2，1H)，7.38(dd，J＝1.8，8.4 ，1H)，7.33(dd，J＝1.6，10.3，1H)，3.35(m，1H)，1.19(d，J＝6.9，6H).

步骤B：3-氟-4-异丁酰基苯甲酸

将143mg(0.58mmol)1-溴-3-氟-4-(2’-甲基)苯基乙基甲酮(得自步 骤A)、41mg(0.35mmol)氰化锌、11mg(0.011mmol)三(二亚苄基丙 酮)-二钯(0)和15mg(0.026mmol)1，1-双(二苯基膦基)-二茂铁(15mg， 0.026mmol)在2mL DMF和0.030mL水中的溶液在85℃加热3小时。 将该反应冷却，负载到硅胶上，用己烷/乙酸乙酯(20∶1)洗脱，获得了 产物，为黄色固体(36mg)。将该固体在甲醇(2mL)中的溶液用5N NaOH处理，在60℃加热3小时。将该反应冷却，用50mL EtOAc稀释，用25mL 2N HCl洗涤，干燥并浓缩，获得了本标题化合物。

                        羧酸7

            3-三氟甲基-4-(2-(S-丁氧基)苯甲酸

步骤A：3-三氟甲基-4-(2-(S)-丁氧基)苄腈

在-10℃，将1.1g(5.9mmol)4-氟-3-三氟甲基苄腈和485mg(6.5 mmol)(S)-(+)-2-丁醇在10mL THF中的溶液用235mg(5.9mmol)氢 化钠处理。将所得混合物冷搅拌2小时，然后用10mL H2O处理。将 处理的溶液用30mL Et2O萃取，用MgSO4干燥并且浓缩。在Biotage 40M柱上进行色谱纯化，使用4∶1 v/v己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，获 得了550mg本标题化合物：

                                                 1H NMR(500 MHz)δ0.99(t，J＝ 7.6，3H)，1.35(d，J＝6.2，3H)，1.58-1.83(m，2H)，4.51(七重峰，1H)，7.04(d，J＝8.7， 1H)，7.75(d，J＝8.7，1H)，7.85(s，1H).

步骤B：3-三氟甲基-4-(2-(S)-丁氧基)苯甲酸

将550mg(2.2mmol)3-三氟甲基-4-(2-(S)-甲基丙氧基)苄腈(得自 步骤A)在5mL乙醇中的溶液用1.5mL 5.0N NaOH处理，在80℃加 热3小时。然后将该反应浓缩，用2NHCl处理，用30mL EtOAc萃 取，干燥并浓缩，获得了600mg本标题化合物：

                                                         1H NMR(500 Mhz)δ0.99(t， J＝7.3，3H)，1.43(d，J＝5.9，3H)，1.73-1.83(m，2H)，4.54(七重峰，1H)，7.02(d，J＝8.9， 1H)，8.21(d，J＝8.9，1H)，8.32(s，1H).

                        羧酸8-14

下列中间体是按照类似于上述制备羧酸7的方法，在步骤A中用 合适的醇代替(S)-2-丁醇而制得的。

                     羧酸15

    3-三氟甲基-4-(1-(S)-甲基-2，2，2-三氟乙氧基)苯甲酸

步骤A：1-(S)-甲基-2，2，2-三氟乙醇

本标题化合物是使用Ramachandran，P.V.，等人在Tetrahedron， 1993，49(9)，1725-38中描述的方法制得的。

步骤B：3-三氟甲基-4-(1-(S)-甲基-2，2，2-三氟乙氧基)苯甲酸

本标题化合物是按照类似于上述制备羧酸7的方法，在羧酸7步 骤A中用1-(S)-甲基-2，2，2-三氟乙醇(得自步骤A)代表(S)-2-丁醇而制 得的。本标题化合物的对映体纯度是通过将其转化成相应的甲酯(过量 2.0M三甲基甲硅烷基重氮甲烷在环己烷中的溶液，THF/MeOH，5 分钟)，并且通过HPLC测定。条件：Chiralcel OD 4.6×250mm柱， 98∶2 v/v庚烷/iPrOH，1.0mL/min，λ＝254nM.(R)对映体＝8.5min， (S)-对映体＝10.4min。

                     羧酸16

            3-氟-4-(2-(S)-丁氧基)苯甲酸

步骤A：3-氟-4-(2-(S)-丁氧基)苯甲醛

将750mg(5.4mmol)3-氟-4-羟基苯甲醛、403mg(5.4mmol) (R)-(-)-2-丁醇和2g(7.5mmol)三苯基膦在10mL THF中的溶液用1.5 mL偶氮二甲酸二异丙酯处理。

步骤C：3，5-二氟-4-(2-(S)-丁氧基)苯甲酸

本标题化合物是按照类似于在羧酸7步骤B中描述的方法，使用 3，5-二氟-4-(2-(S)-丁氧基)苄腈(得自步骤B)代替3-三氟甲基-4-(2-(S)- 甲基丙氧基)苄腈而制得的：

         1H NMR(500Mhz)δ1.0(t，J＝7.3，3H)，1.32(d，J＝5.9，3H)，1.68(m， 1H)，1.79(m，1H)，4.45(m，1H)，7.65(d，J＝8.3，2H).

                       羧酸18

               4-(2-(S)-丁氧基)苯甲酸

步骤A：4-(2-(S)-丁氧基)苯甲酸甲酯

本标题化合物是按照类似于在羧酸16步骤A中描述的方法，使 用4-羟基苯甲酸甲酯代替3-氟-4-羟基苯甲醛而制得的。

步骤B：4-(2-(S)-丁氧基)苯甲酸

将1.0g(4.8mmol)4-(2-(S)-丁氧基)苯甲酸甲酯在15mL MeOH中的溶液用1mL 5.0N NaOH在室温处理1小时。将该溶液浓缩，用 6mL 2N HCl酸化，用EtOAc萃取，干燥并浓缩，获得了800mg(86％) 本标题化合物。

                         羧酸19

                4-(2-(S)-丁氧基-2-氟-苯甲酸

步骤A：4-(2-(S)-丁氧基-2-氟-苄腈

本标题化合物是按照类似于在羧酸16步骤A中描述的方法，使 用2-氟-4-羟基苄腈代替3-氟-4-羟基苯甲醛而制得的。

步骤B：4-(2-(S)-丁氧基-2-氟-苯甲酸

将770mg(4.0mmol)4-(2-(S)-丁氧基-2-氟-苄腈(得自步骤A)在20 mL EtOH和8mL 5N NaOH(8ml)中的混合物于80℃搅拌20小时。 将该溶液浓缩，用2N HCl酸化，用EtOAc萃取，干燥并浓缩，获得 了0.57g本标题化合物：

1H NMR(500Mhz)δ7.99(t，J＝8.8，1H)，6.75(dd，J＝2.0，6.9，1H)，6.66(dd，J＝ 2.1，11.0，1H)，4.38-4.44(m，2H)，1.75-1.85(m，1H)，1.65-1.75(m，1H)，1.37(d，J＝ 6.0，3H)，1.02(t，J＝7.4，3H).

                            羧酸20

                3，5-二氟-4-(2，2，2-三氟乙氧基)苯甲酸

步骤A：5-溴-1，3-二氟-2-(2，2，2-三氟乙氧基)苯

将1.25g(6mmol)4-溴-2，6-二氟苯酚与3.93g(12mmol)碳酸铯在 10mL乙腈中的混合物用1.4g(6mmol)三氟甲磺酸2，2，2-三氟乙基酯 搅拌，在室温搅拌2小时。将该反应混合物用EtOAc稀释，用2N HCl洗涤。将有机层干燥并浓缩。通过硅胶色谱纯化，使用9∶1己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了230mg本标题化合物：

                                                  1H NMR(500 Mhz)δ7.16(d，J＝7.3，2H)，4.41-4.50(m，2H).

步骤B：3，5-二氟-4-(2，2，2-三氟乙氧基)苄腈

将230mg(1.8mmol)5-溴-1，3-二氟-2-(2，2，2-三氟乙氧基)苯(得自 步骤A)、63mg(1.1mmol)氰化锌、41mg(0.09mmol)三(二亚苄基丙 酮)-二钯(0)和60mg(0.21mmol)1，1-双(二苯基膦基)-二茂铁在1.5mL DMF和15μL水中的混合物于95℃加热2小时。将该反应混合物冷 却并浓缩。通过硅胶色谱纯化，使用9∶1己烷/EtOAc作为洗脱剂，获 得了50mg本标题化合物。

步骤C：3，5-二氟-4-(2，2，2-三氟乙氧基)苯甲酸

本标题化合物是按照类似于在羧酸7步骤B中描述的方法，使用 3，5-二氟-4-(2，2，2-三氟乙氧基)苄腈代替3-三氟甲基-4-(2-(S)-甲基丙氧 基)苄腈而制得的：1H NMR(500Mhz)δ7.71(d，J＝8.1，2H)，4.58-4.64(m，2H).

                      羧酸21

          5-(2-甲基-1-氧代丙基)吡啶-2-甲酸

步骤A：(+/-)-5-(2-甲基-1-羟基丙基)-2-溴吡啶

在0℃，将1.00g(4.4mmol)2，5-二溴吡啶在10mL THF中的溶 液用2.5mL 2M氯化异丙基镁在THF中的溶液处理，将所得混合物 冷搅拌1小时。将该混合物用0.46mL(5.1mmol)异丁醛处理，温热至 室温并搅拌16小时。将该混合物在50mL EtOAc与50mL水之间分 配，并分离各层。将有机层用25mL饱和NaCl水溶液洗涤，干燥并 浓缩。通过硅胶色谱纯化，使用3∶1 v/v己烷/EtOAc作为洗脱剂，获 得了290mg本标题化合物：

                                     1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.29(d，J＝2.3，， 1H)，7.55(dd，J＝2.3，8.0，1H)，7.47(d，J＝8.3，1H)，4.45(d，J＝6.7，1H)，1.94(m， 1H)，0.97(d，J＝6.6，3H)，0.85(d，J＝6.9，3H).

步骤B：5-(2-甲基-1-氧代丙基)-2-溴吡啶

将290mg(1.25mmol)5-(2-甲基-1-羟基丙基)-2-溴吡啶(得自步骤 A)和220mg(1.9mmol)N-甲基吗啉-N-氧化物在5mL CH2Cl2中的混 合物用20mg高铼酸四丙基铵处理。将该混合物在室温搅拌3小时。 通过硅胶色谱纯化该反应混合物，使用10∶1 v/v己烷/EtOAc作为洗脱 剂，获得了230mg本标题化合物：

              1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.29(d，J＝2.5，，1H)，8.07(dd， J＝2.6，8.3，1H)，7.61(d，J＝8.5，1H)，3.45(m，1H)，1.23(d，J＝6.8，6H).

步骤C：5-(2-甲基-1-氧代丙基)吡啶-2-甲腈

将300mg(1.3mmol)5-(2-甲基-1-氧代丙基)-2-溴吡啶(得自步骤 B)、氰化锌(0.093g，0.789mmol)、三(二亚苄基丙酮)-二钯(0)(24mg， 0.026mmol)和1，1-双(二苯基膦基)-二茂铁(33mg，0.059mmol)在2mL DMF和0.03mL水中的溶液于80℃加热2.5小时。将该反应冷却，负 载到硅胶上，使用5∶1 v/v己烷/EtOAc洗脱，获得了224mg产物：

                                                                       1H NMR (500MHz，CDCl3)δ9.21(d，J＝1.8，，1H)，8.34(dd，J＝2.3，8.0，1H)，7.83(d，J＝8.0 ，1H)，3.50(m，1H)，1.25(d，J＝6.8，6H).

步骤D：5-(2-甲基-1-氧代丙基)吡啶-2-甲酸

将125mg(0.7mmol)5-(2-甲基-1-氧代丙基)吡啶-2-甲腈(得自步 骤C)和0.7mL 5.0N NaOH在2.5mL EtOH中的溶液于75℃搅拌1小 时。将该反应冷却，用50mL EtOAc稀释，用20mL 2N HCl、25mL 饱和NaCl水溶液洗涤，干燥并浓缩，获得了108mg本标题化合物。

                        羧酸22

               5-(1，1-二氟-2-甲基丙基)吡啶-2-甲酸

本标题化合物是由5-(2-甲基-1-氧代丙基)吡啶-2-甲腈(得自羧酸 21，步骤C)，使用类似于在羧酸4步骤B和C中描述的方法制得的。

1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.71(s，1H)，8.30(d，J＝8.0，1H)，8.01(dd，J＝ 2.1，8.3，1H)，2.37(m，1H)，1.04(d，J＝6.9，6H)；ESI-MS 216.7(M+H).

                       羧酸23

              (S)-4-(3，3-二氟环戊基)苯甲酸

步骤A：(S)-3-(4-溴苯基)环戊酮

在氮气氛下，向7.2g(35.8mmol)4-溴苯基硼酸、186mg(0.72 mmol)乙酰丙酮化双(亚乙基)铑(I)和446mg(0.71mmol)(S)-2，2′-双(二 苯基膦基)-1，1′联萘(BINAP)在60mL二氧杂环己烷和6mL H2O内的 混合物中加入1.0mL(11.9mmol)2-环戊烯-1-酮。回流5.5小时后，将 该反应浓缩。把残余物在300mL EtOAc与300mL 1N NaHCO3之间 分配。分离各相之后，将有机层用300mL盐水洗涤，用Na2SO4干燥 并浓缩。将残余物在40M Biotage柱上纯化，使用9∶1 v/v己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了1.90g本标题化合物，为白色固体：

1H-NMR(500MHz)δ1.97(m，1H)，2.29-2.37(m，2H)，2.43-2.52(m，2H)，2.69(m， 1H)，3.40(m，1H)，7.16(d，J＝8.5，2H)，7.49(d，J＝8.5，2H).

步骤B：(S)-3-(4-溴苯基)-1，1-二氟环戊烷

将2.1mL(11.4mmol)[双(2-甲氧基乙基)氨基]三氟化硫和0.10mL (0.7mmol)三氟化硼合乙醚在7mL甲苯中的混合物于0℃静置，1.3小 时，期间偶尔搅拌。加入1.9g(7.9mmol)(S)-3-(4-溴苯基)环戊酮(得 自步骤A)在13mL甲苯中的溶液。将该反应在55℃搅拌2天。冷却 后，在0℃将该混合物加到250mL 2N NaOH和250mL Et2O中。搅 拌30分钟之后，分离各相。将有机层用250mL 1N NaOH和250mL H2O洗涤，用MgSO4干燥并浓缩。在40M Biotage柱上纯化残余物， 使用49∶1 v/v己烷/Et2O作为洗脱剂，获得了1.47g本标题化合物：

                                   1H-NMR(500MHz)δ1.85(m，1H)，2.09-2.26(m， 3H)，2.35(m，1H)，2.56(m，1H)，3.30(m，1H)，7.13(d，J＝8.3，2H)，7.46(d，J＝8.3， 2H).

步骤C：(S)-4-(3，3-二氟环戊基)苯甲酸

在-78℃，将1.0g(3.8mmol)(S)-3-(4-溴苯基)-1，1-二氟环戊烷(得 自步骤B)在15mL THF中的溶液用1.6mL(4.0mmol)2.5M BuLi在 己烷中的溶液处理。搅拌15分钟之后，将该反应加到干冰在200mL Et2O内的悬浮液中。让该混合物温热至室温。将该反应混合物用100 mL 1N NaOH萃取。分离各相之后，用浓盐酸将水层酸化至pH 1-2。 将水相用3×100mL CH2Cl2萃取。将合并的有机相干燥并浓缩，获得 了0.67g本标题化合物：

                                                                1H- NMR(500MHz，CD3OD)δ1.87(m，1H)，2.13-2.37(m，4H)，2.54(m，1H)，3.41(m， 1H)，7.39(d，J＝8.2，2H)，7.97(d，J＝8.2，2H).

                            羧酸24

                  (R)-4-(3，3-二氟环戊基)苯甲酸

本标题化合物是按照类似于制备羧酸23的方法，但是在步骤A 中用(R)-2，2′-双(二苯基膦基)-1，1′联萘(BINAP)代替(S)-2，2′-双(二苯基 膦基)-1，1′联萘(BINAP)而制得的。

                  实施例化合物的制备

                        实施例1

3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-((2-甲基丙基)苯基)-1，2，4-噁二唑

步骤A：3-(2-(氯)吡啶-3-基)-5-(4-(2-甲基丙基)苯基)-1，2，4-噁二唑

将500mg(2.8mmol)4-(2-甲基丙基)苯甲酸、600mg(3.1mmol) 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和420mg(3.1mmol)1- 羟基苯并三唑(0.42g，3.09mmol)在10mL DMF中的混合物于室温搅 拌10分钟。加入N-羟基脒1(620mg，3.6mmol)，将所得混合物在20 ℃加热3小时。将该反应冷却并浓缩。通过硅胶色谱纯化，使用3∶1 v/v 己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了103mg本标题化合物：

                                                                   1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ8.56(dd，J＝2.0，4.8，1H)，8.38(dd，J＝2.1，7.6，1H)，8.12(d，J＝8.2 ，2H)，7.42(dd，J＝4.8，7.6，1H)，7.35(d，J＝8.2，2H)，2.59(d，J＝7.1，2H)，1.94(m， 1H)，0.94(d，J＝6.7，6H)；ESI-MS 314.1(M+H).

步骤B：3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-(2-甲基丙基)苯基)-1，2，4-噁 二唑

将50mg(0.12mmol)3-(2-(氯)吡啶-3-基)-5-(4-(2-甲基丙基)苯基)- 1，2，4-噁二唑(得自步骤A)和0.05mL二乙醇胺在0.5mL N-甲基甲酰胺 中的溶液于120℃搅拌16小时。将该反应冷却并浓缩。通过硅胶色谱 纯化，使用5∶1 v/v己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了20mg本标题化 合物为白色固体：

1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.43(dd，J＝2.1，7.8，1H)，8.33(dd，J＝1.8，8.3，1H)， 8.12(d，J＝8.3，2H)，7.33(d，J＝8.2，2H)，7.14-7.20(bs，1H)，6.70(dd，J＝5.0，7.5， 1H)，3.18(d，J＝4.6，3H)，2.58(d，J＝7.1，2H)，1.94(m，1H)，0.94(d，J＝6.6，6H； ESI-MS 309.1(M+H).

                     实施例2-9

下列化合物是按照类似于实施例1中描述的方法，但是在步骤A 中使用4-(环己基)苯甲酸代替4-(2-甲基丙基)苯甲酸，用合适的N-羟 基脒代替N-羟基脒1，在步骤B中用合适的胺代替N-甲基甲酰胺而 制得的。

                  实施例10-13

下列化合物是按照类似于实施例1中描述的方法，但是在步骤A 中使用合适的羧酸代替4-(2-甲基丙基)苯甲酸，使用N-羟基脒3代替 N-羟基脒1而制得的。

                       实施例14-17

下列化合物是按照类似于实施例1中描述的方法，但是在步骤A 中使用合适的羧酸代替4-(2-甲基丙基)苯甲酸，在步骤B中使用合适 的胺代替N-甲基甲酰胺而制得的。

                       实施例19

3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-(2，2-二氟丙基)苯基)-1，2，4-噁二唑

将50mg(0.25mmol)4-(2，2-二氟丙基)苯甲酸、50mg(0.3mmol) N-羟基脒1和72mg(0.37mmol)1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐在1mL 1，2-二氯乙烷中的混合物于室温搅拌6小时，然后 在80℃搅拌16小时。将该反应冷却并浓缩。通过硅胶色谱纯化，使 用10∶1 v/v己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了19mg本标题化合物：

                                                         1H NMR(500MHz，CDCl3)δ 8.45(d，J＝6.7，1H)，8.34(dd，J＝1.9，4.8，1H)，8.18(d，J＝8.2，2H)，7.48(d，J＝8.3， 2H)，6.72(dd，J＝4.8，7.6，1H)，3.20-3.30(m，5H)，1.60(d，J＝18.3，3H)；ESI-MS 331.3(M+H).

                     实施例20-46

下列化合物是按照类似于实施例19中描述的方法，但是使用合 适的羧酸代替4-(2，2-二氟丙基)苯甲酸，并且用合适的N-羟基脒代替 N-羟基脒1而制得的。

                 实施例47-56

下列化合物是按照类似于实施例19中描述的方法，但是使用合 适的羧酸代替4-(2，2-二氟丙基)苯甲酸，并且用N-羟基脒7代替N-羟 基脒1而制得的。

  实施例   Ri   HPLCA   (min)   ESI-MS   (M+H)

                      实施例58

3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(5-(2-甲基丙基)吡啶-2-基)-1，2，4-噁二唑

步骤A：3-(2-(苯并三唑-1-基氧基)吡啶-3-基)-5-(5-溴吡啶-2-基)-1，2，4- 噁二唑

将300mg(1.45mmol)5-溴吡啶-2-甲酸、310mg(1.6mmol)1-[3- (二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和220mg(1.6mmol)1-羟 基苯并三唑(0.22g，1.64mmol)在2mL DMF中的溶液于室温搅拌2 小时。将该混合物用30mg(1.8mmol)N-羟基脒1处理，然后在室温 搅拌1小时，自尊80℃搅拌16小时。将该反应冷却并浓缩。通过硅 胶色谱纯化，使用1∶1 v/v己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了190mg 本标题化合物：ESI-MS 437.9(M+H)。

步骤B：3-(2-(苯并三唑-1-基氧基)吡啶-3-基)-5-(5-(2-甲基丙基)吡啶-2- 基)-1，2，4-噁二唑

将190mg(0.43mmol)3-(2-(苯并三唑-1-基氧基)吡啶-3-基)-5-(5- 溴吡啶-2-基)-1，2，4-噁二唑(得自步骤A)在1.0mL 0.M溴化异丁基锌的 THF溶液中的溶液用约2mg双(三叔丁基膦)钯(0)处理，将所得混合 物在室温搅拌2小时。通过硅胶色谱纯化，使用3∶2v/v己烷/EtOAc洗脱，获得了本标题化合物：ESI-MS 414.1(M+H)。

步骤C：3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(5-(2-甲基丙基)吡啶-2-基)- 1，2，4-噁二唑

将100mg(0.24mmol)3-(2-(苯并三唑-1-基氧基)吡啶-3-基)-5-(5- (2-甲基丙基)吡啶-2-基)-1，2，4-噁二唑(得自步骤B)、100mg二乙醇胺 在0.5mL N-甲基甲酰胺(0.5ml)中的混合物于130℃搅拌16小时。将 该反应冷却并浓缩。通过HPLC B纯化本标题化合物：

                                         1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.91(dd，J＝1.3， 7.5，1H)，8.70(bs，1H)，8.48(d，J＝6.2，1H)，8.43(bs，1H)，8.25(d，J＝8.0，1H)，7.77 (dd，J＝1.6，8.1，1H)，7.02(t，J＝6.2，1H)，3.44(s，3H)，2.65(d，J＝7.1，2H)，1.97 (m，1H)，0.98(d，J＝6.6，6H)；ESI-MS 310.2(M+H).

                        实施例59

  3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-溴苯基)-1，2，4-噁二唑

在0℃，将5.0g(31.6mmol)N-羟基脒7和4.6mL(33.1mmol)三 乙胺在50mL DMF中的溶液用6.9g(31.6mmol)4-溴苯甲酰氯处理。 将该反应在0℃搅拌1小时，然后在120℃加热2小时。将该反应冷 却，用甲醇(50ml)稀释，通过过滤收集产物(3.1g)：

                                                           1H NMR(500MHz，CDCl3) δ8.41(dd，J＝1.8，7.6，1H)，8.34(dd，J＝1.9，4.8，1H)，8.08(d，J＝8.5，2H)，7.71(d， J＝8.7，2H)，7.08-7.14(bs，1H)，6.70(dd，J＝4.8，7.5，1H)，3.18(d，J＝4.8，3H)；ESI- MS 333.1(M+H).

                          实施例60

3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-(2，2，2-三氟乙氧基)苯基)-1，2，4-噁二唑

步骤A：3-(2-(氯)吡啶-3-基)-5-(4-羟基苯基)-1，2，4-噁二唑

本标题化合物是按照类似于实施例1步骤A中描述的方法，但是 使用4-羟基苯甲酸代替4-(2-甲基丙基)苯甲酸而制得的。

步骤B：3-(2-(氯)吡啶-3-基)-5-(4-(2，2，2-三氟乙氧基)苯基)-1，2，4-噁二 唑

将35mg 3-(2-(氯)吡啶-3-基)-5-(4-羟基苯基)-1，2，4-噁二唑(得自步 骤A)和210mg(0.38mmol)碳酸铯在0.7mL乙腈和0.3mL THF中 的混合物用90mg(0.38mmol)2，2，2-三氟乙氧基三氟甲磺酸酯处理。 将所得混合物在室温搅拌2小时。通过硅胶色谱纯化，使用3∶1 v/v己 烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了15mg本标题化合物：ESI-MS 356.1 (M+H)。

步骤C：3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-(2，2，2-三氟乙氧基)苯基)- 1，2，4-噁二唑

将15mg 3-(2-(氯)吡啶-3-基)-5-(4-(2，2，2-三氟乙氧基)苯基)-1，2，4- 噁二唑(得自步骤B)、0.11mL 2M甲基胺的THF溶液和甲基胺(2.0M 在THF中的溶液)(0.11mL，0.21mmol)和0.037mL(0.21mmol)的混 合物于65℃搅拌48小时。将该反应冷却并浓缩。通过硅胶色谱纯化， 使用8∶1己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了6.2mg本标题化合物：

                                           1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.55(s，1H)， 8.39(d，J＝4.1，1H)，8.24(d，J＝8.5，2H)，7.16(d，J＝8.5，2H)，6.82(s，1H)，4.46- 4.54(m，2H)，3.33(s，3H)；ESI-MS 351.1(M+H)

                        实施例60a

3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-(2-氟-1-氟甲基)乙氧基-3-三氟甲基

                     苯基)-1，2，4-噁二唑

步骤A：3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-氟-3-三氟甲基苯基)-1，2，4- 噁二唑

在0℃，将200mg N-羟基脒7和0.44mL(3.1mmol)TEA在0.4mL 甲苯和1.4mL DMF中的混合物用360mg(1.6mmol)3-三氟甲基-4-氟 苯甲酰氯处理。将所得混合物在120℃搅拌2.5小时。将该混合物冷 却，然后在CH2Cl2与水之间分配。分离出有机层，干燥并浓缩。通 过硅胶色谱纯化，使用4∶1 v/v己烷/EtOAc洗脱，获得了150mg本 标题化合物：ESI-MS 340.2(M+H)。

步骤B：3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-(2-氟-1-氟甲基)乙氧基-3- 三氟甲基苯基)-1，2，4-噁二唑

本标题化合物是由3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-氟-3-三氟甲 基苯基)-1，2，4-噁二唑(得自步骤A)，使用在羧酸7步骤A中描述的方 法，用1，3-二氟-2-丙醇代替代替2-(S)-丁醇而制得的：

                                                         1H NMR(500MHz，CDCl3) δ8.51(s，1H)，8.41(d，J＝7.1，3H)，7.37(d，J＝8.7，2H)，6.80(s，1H)，4.95-5.09(m， 1H)，4.84(s，2H)，4.75(s，2H)，3.21-3.30(m，3H)；ESI-MS 415.2(M+H).

                         实施例61

3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-(3-噻吩基)苯基)-1，2，4-噁二唑

将50mg(0.15mmol)3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-溴苯基)- 1，2，4-噁二唑(得自实施例61)、29mg(0.23mmol)3-噻吩硼酸和26mg (0.45mmol)氟化钾在1mL THF中的溶液用7mg(0.003mmol)乙酸钯 (II)和2.1mg(0.006mmol)2-(二环己基膦基)联苯处理。将所得混合物 在50℃搅拌2小时，然后冷却和浓缩。通过硅胶色谱纯化，使用7∶1 v/v 己烷/EtOAc作为洗脱剂，获得了30mg本标题化合物：

                                                                   1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ8.44(dd，J＝1.9，7.8，1H)，8.34(dd，J＝1.8，4.8，1H)，8.23(d，J＝8.5 ，2H)，7.78(d，J＝8.5，2H)，7.63(dd，J＝1.4，2.7，1H)，7.45-7.48(m，2H)，7.16-7.20 (bs，1H)，6.71(dd，J＝5.0，7.8，1H)，3.20(d，J＝4.8，3H)；ESI-MS 335.2(M+H).

                   实施例62-71

下列化合物是按照类似于实施例61中描述的方法，但是使用合 适的芳基硼酸代替噻吩-3-硼酸而制得的。

                       实施例72

3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-(2-甲基丙基)-3-(三氟甲基)苯基)-

                    1，2，4-噁二唑

将30mg(0.085mmol)3-(2-(N-甲基氨基)吡啶-3-基)-5-(4-氯-3-(三 氟甲基)苯基)-1，2，4-噁二唑(得自实施例24)在1.0mL 0.5M溴化异丁 基锌的THF溶液中的混合物用2mg双(三叔丁基膦)钯(0)(2个晶粒) 处理。将所得混合物在室温搅拌20小时，然后浓缩。通过硅胶色谱 纯化，使用9∶1己烷/EtOAc洗脱，获得了2.5mg本标题化合物：

                                        1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.51(s，1H)，8.47 (d，J＝6.4，1H)，8.38(s，1H)，8.31(d，J＝7.3，1H)，7.57(d，J＝7.8，1H)，7.14(s，1H)， 3.23(s，3H)，2.80(d，J＝6.6，2H)，2.00-2.10(m，1H)，1.01(d，J＝6.2，6H)；ESI-MS 377.3(M+H).

                    实施例73-80

下列化合物是按照类似于实施例19中描述的方法，使用合适的 N-羟基脒代替N-羟基脒1，并且用合适的羧酸代替4-(2，2-二氟丙基) 苯甲酸而制得的。

                     实施例81-87

下列化合物是按照类似于实施例19中描述的方法，使用合适的 N-羟基脒代替N-羟基脒1，并且用合适的羧酸代替4-(2，2-二氟丙基) 苯甲酸而制得的。

                      实施例88-90

下列化合物是按照类似于实施例19中描述的方法，使用合适的 N-羟基脒代替N-羟基脒1，并且用合适的羧酸代替4-(2，2-二氟丙基) 苯甲酸而制得的。

  实施例   Rs   HPLCA   (min)   ESI-MS   (M+H)   88   (CH3)2CHO-   3.12   345.2   1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.45(d，J＝6.2，1H)，8.36(d，J＝3.9，1H)，8.26(s，   1H)，8.08(d，J＝7.5，1H)，7.09(d，J＝8.7，2H)，6.72-6.78(m，1H)，4.71-4.80(m，   1H)，3.23(s，3H)，1.48(d，J＝5.9，6H)   89   CF3O-   3.9   371.7   1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.45(d，J＝6.7，1H)，8.39(s，2H)，8.19(d，J＝8.3，   1H)，7.56(d，J＝8.1，1H)，7.14(s，1H)，6.72-6.79(m，1H)，3.24(s，3H)   90   CF3(CH3)CHO-   3.9   399.3   1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.53(s，1H)，8.40(s，1H)，8.32(s，1H)，8.14(d，   J＝8.3Hz，1H)，7.21(d，J＝8.5Hz，1H)，6.81(s，1H)，4.80-4.90(m，1H)，3.31(s，   3H)，1.67(d，J＝5.9Hz，3H)

                        实施例91

     3-(4-氨基嘧啶-5-基)-5-(4-环己基苯基)-1，2，4-噁二唑

本标题化合物是按照类似于实施例19中描述的方法，使用N-羟 基(4-氨基嘧啶-5-基)脒代替N-羟基脒1，并且使用合适的4-环己基苯 甲酸代替4-(2，2-二氟丙基)苯甲酸而制得的：

                                   1H NMR(CD3OD)δ1.31-1.56，(m，5H)，1.77- 1.90(m，5H)，2.66(t，1H，J＝5.8Hz)，7.49(d，2H，J＝8.2Hz)，8.16，(d，2H，J＝8.2 Hz)，8.69，(s，1H)，9.10(s，1H)；ESI-MS 322(M+H).

                   实施例92-102

下列化合物是按照类似于实施例19中描述的方法，使用合适的 N-羟基脒代替N-羟基脒1，并且用合适的羧酸代替4-(2，2-二氟丙基) 苯甲酸而制得的。

                        实施例103-106

下列化合物是按照类似于实施例19中描述的方法，使用合适的 N-羟基脒代替N-羟基脒1，并且用合适的羧酸代替4-(2，2-二氟丙基) 苯甲酸而制得的。

                        实施例107

3-(2-氨基-5-氟吡啶-3-基)-5-(3-三氟甲基-4-(1，1，1-三氟-2-(S)-丙氧基))苯

                     基)-1，2，4-噁二唑

向羧酸15(53mg，0.176mmol)在乙腈(1.0mL)内的混合物中加入 EDC-HCl(34mg，0.176mmol)。30分钟后，将所得溶液加到在密封 的管内的N-羟基脒11与乙腈(1.0mL)的混合物中，并加热至40℃。4 小时后，将该反应混合物在120℃加热20小时。将该反应混合物冷却 至室温，真空浓缩，并通过快速硅胶色谱纯化(10、15％EtOAc/己烷)， 获得了40mg本标题化合物，为白色膜状物。通过HPLC进一步纯化 该产物。条件：Chiralcel OD 4.6×250mm柱，60∶40 v/v庚烷/iPrOH， 1.0mL/min，λ＝210nM.(R)-对映体＝12.6min，(S)-对映体＝13.7 min：

                                    1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.61(d，3H，J＝6.4 Hz)，4.91(七重峰，1H，J＝6.1Hz)，6.06(br，2H)，7.22(d，1H，J＝8.9Hz)，8.13，(d，1 H，J＝3.0Hz)，8.20(dd，1H，J＝3.0，8.7Hz)，8.37(d，1H，J＝2.0，8.7Hz)，8.48(d，1 H，J＝2.0Hz)；HPLC/MS(HPLC A)：437(M+H)+，3.89min.

                     实施例108

3-(2-(N-甲基氨基)-5-氟吡啶-3-基)-5-(3-三氟甲基-4-(1，1，1-三氟-2-(S)-

              丙氧基))苯基)-1，2，4-噁二唑

本标题化合物是按照类似于实施例107中描述的方法，使用N-羟 基脒10代替N-羟基脒11而制得的：

                        1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.62(d，3H，J＝6.6Hz)， 3.15(d，3H，J＝4.8Hz)，4.91(七重峰，1H，J＝6.0Hz)，6.95(d，1H，J＝4.1Hz)， 7.21，(d，1H，J＝8.9Hz)，8.19(dd，J＝3.0，8.7Hz)，8.22(d，1H，J＝2.9Hz)，8.36 (dd，1H，J＝2.1，8.7Hz)，8.47(d，1H，J＝2.1Hz)；HPLC/MS(HPLC A)：451 (M+H)+，4.18min.

生物活性

本发明化合物的S1P1/Edg1、S1P3/Edg3、S1P2/Edg5、S1P4/Edg6 或S1P5/Edg8活性可使用下列测定来评估：

配体结合Edg/S1P受体测定

33P-鞘氨醇-1-磷酸酯是采用酶方法由γ33P-ATP和鞘氨醇合成的， 其中在含有50mM KH2PO4、1mM巯基乙醇、1mM Na3VO4、25mM KF、2mM氨基脲、1mM Na2EDTA、5mM MgCl2、50mM鞘氨醇、 0.1％ TritonX-114和1mCiγ33P-ATP(NEN；比活度为3000Ci/mmol) 的反应混合物中，使用具有鞘氨醇激酶活性的粗酵母提取物。使用丁 醇萃取反应产物，并通过HPLC纯化33P-鞘氨醇-1-磷酸酯。

使用不含酶的解离溶液(Specialty Media，Lavallette，NJ)来收获 表达EDG/S1P受体的细胞。将细胞用冷的PBS洗涤一次，悬浮在由 50mM HEPES-Na，pH 7.5，5mM MgCl2，1mM CaCl2和0.5％不含 脂肪酸的BSA组成的结合测定缓冲液中。将33P-鞘氨醇-1-磷酸酯与0.1 nM鞘氨醇-1-磷酸酯在结合测定缓冲液中超声处理；将100μl配体混 合物加到在96孔微量滴定板内的100μl细胞(1×106个细胞/ml)中。 在轻微搅拌下于室温进行60分钟的结合。使用Packard Filtermate Universal Harvester将细胞收集到GF/B滤板上。将滤板干燥30分钟 之后，把40μl Microscint 20加到各个孔中，在Wallac Microbeta闪 烁计数器上测定结合。非特异性结合定义为在0.5μM冷的鞘氨醇-1- 磷酸酯存在下所保留的放射性的量。

或者，在由表达Edg/S1P受体的细胞制备的膜上进行配体结合测 定。使用不含酶的解离溶液收获细胞，在冷的PBS中洗涤一次。通过 在冰冷的20mM HEPES pH 7.4，10mM EDTA中使用Kinematica polytron(设定为5，10秒)匀化来将细胞破裂。将匀化物在4℃以48,000 ×g离心15分钟，将沉淀团悬浮在20mM HEPES pH 7.4，0.1mM EDTA中。再进行一次离心，将最终的沉淀团悬浮在20mM HEPES pH 7.4，100mM NaCl，10mM MgCl2中。使用0.5-2μg膜蛋白，如上 所述进行配体结合测定。

Edg/S1P受体的激动剂和拮抗剂可在33P-鞘氨醇-1-磷酸酯结合缓 冲液中鉴定。将在DMSO、甲醇或其它溶剂中稀释的化合物与含有33P- 鞘氨醇-1-磷酸酯的探针以及结合测定缓冲液在微量滴定板中混合。加 入由表达Edg/S1P受体的细胞制备的膜，如上所述进行与33P-鞘氨醇- 1-磷酸酯的结合。测定在不同浓度的化合物存在下所结合的量，并且 通过非线性回归软件例如MRLCalc(Merck Research Laboratories)或 PRISM(GraphPad Software)来分析数据，以测定化合物对受体的亲 和力。使用由分别用各自受体(S1P1/Edg1、S1P3/Edg3、S1P2/Edg5、 S1P4/Edg6、S1P5/Edg8)转染的细胞制备的膜，测定在化合物存在下33P- 鞘氨醇-1-磷酸酯结合的水平，来确定化合物对Edg/S1P受体的选择 性。

35S-GTPγS结合测定

在35S-GTPγS结合测定中测定S1P/Edg受体与G蛋白的功能偶 联。按照在 Ligand Binding to Edg/S1P Receptors Assay中描述的方 法制备的膜(1-10μg膜蛋白)在96孔微量滴定板内在200μl含有20mM HEPES pH 7.4、100mM NaCl、10mM MgCl2、5μM GDP、0.1％不 含脂肪酸的BSA(Sigma，catalog A8806)、不同浓度的鞘氨醇-1-磷酸 酯和125μM 35S-GTPγS(NEN；比活度1250Ci/mmol)的混合物中培 养。在轻微混合下于室温进行1小时的结合，通过使用Packard Filtermate Universal Harvester把膜收集到GF/B滤板上来终止。将 滤板干燥30分钟之后，向每个孔中加入40μl Microscint 20，在Wallac Microbeta闪烁计数器上测定结合。

S1P/Edg受体的激动剂和拮抗剂可以在35S-GTPγS结合测定中鉴 别。将在DMSO、甲醇或其它溶剂中稀释的化合物加到微量滴定板中 以提供0.01nM-10μM的最终测定浓度。加入由表达S1P/Edg的细 胞制备的膜，如上所述进行与35S-GTPγS的结合。当测定是在没有天 然配体或其它已知激动剂存在下进行时，将35S-GTPγS结合刺激至内 源水平以上的化合物被视为激动剂，而抑制35S-GTPγS的内源性水平 的化合物被视为反向激动剂。在亚最大水平的配体或已知S1P/Edg受 体激动剂存在下，在35S-GTPγS结合测定中检测拮抗剂，其中化合物 降低35S-GTPγS结合水平。确定在不同浓度化合物存在下的结合量， 以测定化合物作为S1P/Edg受体激动剂、反向激动剂或拮抗剂的效 力。为了评估激动剂，通过将在化合物存在下的结合量除以在没有配 体存在下的结合量并乘以100来计算相对于基准的刺激百分比。使用 非线性回归曲线拟合程序MRLCalc(Merck Research Laboratories)来 绘制剂量反应曲线，将EC50值定义为给出其自己最大刺激的50％所 需的激动剂浓度。使用由分别用各自受体转染的细胞制备的膜，测定 在化合物存在下35S-GTPγS结合的水平，来确定化合物对Edg/S1P受 体的选择性。

细胞内钙流量测定

使用FLIPR(Fluorescence Imaging Plate Reader，Molecular Devices)测定与细胞内钙活动有关的S1P/Edg受体对G蛋白的功能性 偶联。收获表达S1P/Edg受体的细胞，用测定缓冲液(Hanks缓冲盐 水溶液(BRL)，含有20mM HEPES、0.1％BSA和710μg/ml丙磺舒 (Sigma))洗涤一次。将细胞在含有500nM钙敏感染料Fluo-4 (Molecular Probes)的相同缓冲液中于37℃和5％CO2下标记4小时。 将细胞用缓冲液洗涤2次，然后以1.5×105/孔(90μl)铺在用聚赖氨酸 包被的96孔黑色微量滴定板中。通过将鞘氨醇-1-磷酸酯或其它激动 剂在200μl测定缓冲液中稀释以给出是最终测试浓度两倍的浓度，来 制备96-孔配体平板。将配体平板和细胞平板负载到FLIPR装置上来 进行分析。将平板平衡到37℃。通过把等体积的配体转移到细胞平板 上来开始测定，以3分钟的间隔记录钙流量。以面积(总和)或最大峰 值高度(max)定量表示细胞反应。在没有天然配体存在下，通过把化 合物在合适的溶剂中稀释，并且转移到Fluo-4标记的细胞中来评估激 动剂。通过以下方法来评估拮抗剂：用不同浓度的化合物将Fluo-4标 记的细胞预先处理15分钟，然后通过加天然配体或其它S1P/Edg受 体激动剂来启动钙流入。

制备表达S1P/Edg受体的细胞

可使用任何多种方法来克隆S1P1/Edg1、S1P3/Edg3、S1P2/Edg5、 S1P4/Edg6或S1P5/Edg8。这些方法包括但不限于(1)RACE PCR克隆 技术(Frohman，等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8998- 9002)。可进行5′和/或3′RACE来生成全长cDNA序列；(2)Edg/SIP cDNA的直接功能表达，然后在合适的表达载体系统中构建含有 S1P/Edg的cDNA库；(3)使用由S1P/Edg蛋白的氨基酸序列设计的 标记的简并寡核苷酸探针来筛选在噬菌体或质粒穿梭载体中构建的含 有S1P/Edg的cDNA库；(4)使用编码S1P/Edg蛋白的部分cDNA来 筛选在噬菌体或质粒穿梭载体中构建的含有S1P/Edg的cDNA库。该 部分cDNA是通过S1P/Edg DNA片段的特异性PCR扩增来获得的， 所述扩增是通过由已知用于涉及S1P/Edg蛋白的其它蛋白的氨基酸序 列来设计简并寡核苷酸引物而进行的；(5)使用与哺乳动物S1P/Edg 蛋白同源的部分cDNA或寡核苷酸来筛选在噬菌体或质粒穿梭载体中 构建的含有S1P/Edg的cDNA库。该方法还可以涉及使用基因特异性 寡核苷酸引物来进行S1P/Edg cDNA的PCR扩增；(6)使用S1P/Edg 核苷酸序列作为模板来设计5′和3′基因特异性寡核苷酸，这样全长 cDNA可以通过已知的RACE技术产生，或者可以通过这些相同的已 知RACE技术来产生一部分编码区域，以生成和分离一部分便秘区 域，用作探针来筛选多种类型cDNA和/或基因组库中之一，从而分离 出编码S1P/Edg的核苷酸序列的全长变型。

对于本领域技术人员来说显而易见的是，其它类型的库以及由其 它细胞类型或物种类型构建的库可用于分离编码S1P/Edg的DNA或 S1P/Edg同源物。其它类型的库包括但不限于衍生自其它细胞的cDNA 库。

对于本领域技术人员来说显而易见的是，合适的DNA库可以由 具有S1P/Edg活性的细胞或细胞系制得。用于制备cDNA库以分离出 编码S1P/Edg的cDNA的细胞或细胞系的选择可以通过首先使用已知 用于这种目的的任何可利用的分析方法测定与细胞有关的S1P/Edg活 性来进行。

cDNA库的制备可以通过本领域已知的标准技术来进行。众所周 知的cDNA库构建技术可参见例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York。互补DNA库也可以由多个商业来源获得， 包括但不限于Clontech Laboratories，Inc.和Stratagene。

含有编码S1P/Edg样蛋白的DNA的表达载体可用于在重组宿主 细胞中表达S1P/Edg。这样的重组宿主细胞可以在合适的条件下培养 以生成S1P/Edg或生物等同形式。表达载体可以包括但不限于克隆载 体、修饰的克隆载体、特异性设计的质粒或病毒。可商购获得的哺乳 动物载体可适于重组S1P/Edg表达。

重组宿主细胞可以是原核生物或真核生物的，包括但不限于细菌 例如大肠杆菌，真菌细胞例如酵母，哺乳动物细胞，包括但不限于牛、 猪、猴子和啮齿动物起源的细胞系；以及昆虫细胞，包括但不限于果 蝇和蚕衍生的细胞系。

各种S1P/Edg受体的核苷酸序列是本领域已知的。参见例如下 列：

S1P1/Edg1人

Hla，T.和T.Maciag 1990在分化的人内皮细胞中诱导的大量转 录物编码在结构上与G蛋白偶联受体类似的多肽.J.Biol Chem.265： 9308-9313，其全文引入本文以供参考。

WO91/15583，1991年10月17日出版，其全文引入本文以供参 考。

WO99/46277，1999年9月16日出版，其全文引入本文以供参考。

S1P1/Edg1小鼠

WO0059529，2000年10月12日出版，其全文引入本文以供参 考。

2001年11月27日授权的U.S.6,323,333，其全文引入本文以供 参考。

S1P1/Edg1大鼠

Lado，D.C.，C.S.Browe，A.A.Gaskin，J.M.Borden，和A.J. MacLennan.1994大鼠edg-1早期基因的克隆：表达模式意味着不同 的功能.Gene 149：331-336，其全文引入本文以供参考。

1996年12月17日授权的U.S.5,585,476，其全文引入本文以供 参考。

1999年1月5日授权的U.S.5,856,443，其全文引入本文以供参 考。

S1P3/Edg3人

An，S.，T.Bleu，W.Huang，O.G.Hallmark，S.R.Coughlin， E.J.Goetzl 1997鉴定编码溶血磷脂的两种G蛋白偶联受体的cDNA FEBS Lett.417：279-282，其全文引入本文以供参考。

WO99/60019，1999年11月25日出版，其全文引入本文以供参 考。

2000年10月10日授权的U.S.6,130,067，其全文引入本文以供 参考。

S1P3/Edg3小鼠

WO01/11022，2001年2月15日出版，其全文引入本文以供参考。

S1P3/Edg3大鼠

WO01/27137，2001年4月19日出版，其全文引入本文以供参考。

S1P2/Edg5人

An，S.，Y.Zheng，T.Bleu 2000鞘氨醇1-磷酸酯诱导的细胞增 殖、死亡以及由G蛋白偶联受体Edg3和Edg5介导的相关信号传导 事件.J.Biol.Chem 275：288-296，其全文引入本文以供参考。

WO99/35259，1999年7月15日出版，其全文引入本文以供参考。

WO99/54351，1999年10月28日出版，其全文引入本文以供参 考。

WO00/56135，2000年9月28日出版，其全文引入本文以供参考。

S1P2/Edg5小鼠

WO00/60056，2000年10月12日出版，其全文引入本文以供参 考。

S1P2/Edg5大鼠

Okazaki，H.，N.Ishizaka，T.Sakurai，K.Kurokawa，K.Goto， M.Kumada，Y.Takuwa 1993在心血管系统中表达的新的推定G蛋 白偶联受体的分子克隆.Biochem.Biophys.Res.Comm.190：1104- 1109，其全文引入本文以供参考。

MacLennan，A.J.，C.S.Browe，A.A.Gaskin，D.C.Lado，G.Shaw 1994可能涉及发育的推定G蛋白偶联受体的克隆和表征.Mol.Cell. Neurosci.5：201-209，其全文引入本文以供参考。

1996年12月17日授权的U.S.5,585,476，其全文引入本文以供 参考。

1999年1月5日授权的U.S.5,856,443，其全文引入本文以供参 考。

S1P4/Edg6人

Graler，M.H.，G.Bernhardt，M.Lipp 1998 EDG6，涉及生物 活性溶血磷脂的受体的一种G蛋白偶联受体是在淋巴组织中特异性地 表达的.Genomics 53：164-169，其全文引入本文以供参考。

WO98/48016，1998年10月29日出版，其全文引入本文以供参 考。

1999年6月15日授权的U.S.5,912,144，其全文引入本文以供参 考。

WO 98/50549，1998年11月12日出版，其全文引入本文以供参 考。

2000年5月9日授权的U.S.6,060,272，其全文引入本文以供参 考。

WO99/35106，1999年7月15日出版，其全文引入本文以供参考。

WO00/15784，2000年3月23日出版，其全文引入本文以供参考。

WO00/14233，2000年3月16日出版，其全文引入本文以供参考。

S1P4/Edg6小鼠

WO 00/15784，2000年3月23日出版，其全文引入本文以供参 考。

S1P5/Edg8人

Im，D.-S.，J.Clemens，T.L.Macdonald，K.R.Lynch 2001人 和小鼠鞘氨醇1-磷酸酯受体S1P5(Edg-8)的表征：鞘氨醇1-磷酸酯受 体的结构-活性关系.Biochemistry 40：14053-14060，其全文引入本文 以供参考。

WO00/11166，2000年3月2日出版，其全文引入本文以供参考。

WO00/31258，2000年6月2日出版，其全文引入本文以供参考。

WO01/04139，2001年1月18日出版，其全文引入本文以供参考。

EP1090925，2001年4月11日出版，其全文引入本文以供参考。

S1P5/Edg8大鼠

Im，D.-S.，C.E.Heise，N.Ancellin，B.E.O’Dowd，G.-J.Shei， R.P.Heavens，M.R.Rigby，T.Hla，S.Mandala，G.McAllister，S.R. George，K.R.Lynch 2000新的鞘氨醇1-磷酸酯受体Edg-8的表征.J. Biol.Chem.275：14281-14286，其全文引入本文以供参考。

WO 01/05829，2001年1月25日出版，其全文引入本文以供参 考。

测定心血管作用

本发明化合物对心血管参数的作用可通过以下方法评估：

给成年雄性大鼠(约350g体重)安置上股动脉和静脉导管来分别 进行动脉血压测定和静脉内化合物给药。将动物用戊巴比妥(55 mg/kg，ip)麻醉。在Gould Po-Ne-Mah数据获得系统上记录血液和心 搏率。从动脉脉波推导出心搏率。一段适应期之后，取基准读数(约20 分钟)，并将数据平均。将化合物静脉内给药(约5秒钟的快速浓注或 15分钟的输注)，化合物给药后，每一分钟记录一次数据，记录60分 钟。数据计算为心搏率中的峰值改变或平均动脉压力，或者计算为关 于心搏率或血压改变对时间的曲线下面积。数据以平均值±SEM表示。 使用单尾学生成对t-检验来与基准值进行统计学比较，在p＜0.05视 为统计学显著。

对大鼠心血管系统的SIP影响描述在Sugiyama，A.，N.N.Aye， Y.Yatomi，Y.Ozaki，K.Hashimoto 2000鞘氨醇-1-磷酸酯一种天然 生物活性溶血磷脂对大鼠心血管系统的影响.Jpn.J.Pharmacol.82： 338-342中，其全文引入本文以供参考。

测定小鼠急性中毒

给一只小鼠静脉内(尾静脉)给予0.1ml溶解在无毒载体中的受试 化合物，观察中毒征兆。严重的征兆可包括死亡、癫痫发作、麻痹或 无意识。还记录轻度征兆，并且可以包括共济失调、用力呼吸、ruffling 或相对于正常水平活动降低。在记录征兆后，将给药溶液在相同载体 中稀释。将稀释的剂量以相同方式对第二只小鼠给药，并且同样观察 征兆。重复该过程直至达到没有征兆的剂量。这被视为估计的无作用 水平。以该水平对另外一只小鼠给药以证实不存在征兆。

评估淋巴细胞减少

按照在测定小鼠急性中毒中描述的方式对化合物进行给药，如下 所述，在给药3小时后，在小鼠中评估淋巴细胞减少。通过施用CO2让小鼠无意识之后，打开胸腔，通过直接心脏穿刺来取出0.5ml血液， 立即用EDTA稳定血液，使用临床血液学自动分析仪来评估血液学， 该自动分析仪已经进行过基准以进行鼠差分计数(H2O00， CARESIDE，Culver City CA)。通过比较三只小鼠的血液学参数与三 只载体治疗的小鼠来确定由受试化合物治疗所引起的淋巴细胞减少。 使用上述稀释法的改变形式，通过耐受力来确定用于该评估的剂量。 对于此目的，没有影响是理想的，轻度影响是可接受的，并且将严重 毒性剂量系列稀释至能仅产生轻度影响的水平。

实施例化合物的体外活性

本文公开的实施例化合物可用作免疫调节剂，这是由于它们具有 作为有效和选择性的S1P1/Edg1受体激动剂—相对于S1PR3/Edg3受 体的活性，上述测定方法中的测定证实了这一点。特别是，相对于 S1PR3/Edg3受体，本文公开的实施例化合物具有对S1P1/Edg1受体的 选择性，如在上述35S-GTPγS结合测定中所评估的对于S1P1/Edg1受 体的EC50与对于S1P3/Edg3受体的EC50的比例所表明的那样，所述 选择性大于100倍，并且如通过上述35S-GTPγS结合测定所评估的那 样，对于结合S1P1/Edg1受体的EC50小于50nM。

                       发明背景