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用于处理生物 薄膜的D-氨基酸

阅读：603发布：2021-04-03

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权利要求

1.一种在对其有需求的受试者体内治疗生物薄膜相关失调的方法，所述方法包括对所述受试者施用组合物，所述组合物包含有效量的D-氨基酸或其药学上可接受的盐类、酯类或衍生物，所述组合物实质上不包含所述对应的L-氨基酸，由此治疗所述生物薄膜相关失调，
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-天冬酰胺及其组合所组成的组。
2.一种在对其有需求的受试者体内治疗生物薄膜相关失调的方法，所述方法包括对所述受试者施用组合物，所述组合物包含有效量的两种或更多种D-氨基酸或其药学上可接受的盐类、酯类或衍生物的组合，由此治疗所述生物薄膜相关失调。
3.如权利要求2所述的方法，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由
D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-天冬酰胺和D-酪氨酸所组成的组。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者的表面，所述表面选自由皮肤和粘膜表面及其组合所组成的组。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述表面是口腔表面、皮肤表面、尿道表面、阴道表面或肺脏表面。
6.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中将所述组合物通过皮下、肌内、腹膜内、静脉内、口腔、鼻腔或局部施用及其组合施用于所述受试者。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述生物薄膜的形成被抑制。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中先前形成的生物薄膜被破坏。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中以0.1nM至100μM的浓度施用所述
D-氨基酸。
11.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述生物薄膜相关失调选自由肺炎、囊性纤维化、中耳炎、慢性阻塞性肺病和尿路感染及其组合所组成的组。
12.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述生物薄膜相关失调是医疗器械相关的感染。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述生物薄膜相关失调由细菌所导致。
14.一种在生物相关表面处理、减少或抑制由细菌引起的生物薄膜形成的方法，所述方法包括：
将生物表面与组合物接触，所述组合物包含有效量的D-氨基酸或其药学上可接受的盐类、酯类或衍生物，所述组合物实质上不包含所述对应的L-氨基酸，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-天冬酰胺及其组合所组成的组。
15.一种在生物相关表面处理、减少或抑制由细菌引起的生物薄膜形成的方法，所述方法包括：
将生物表面与组合物接触，所述组合物包含有效量的两种或更多种D-氨基酸或其药学上可接受的盐类、酯类或衍生物的组合，减少或抑制所述生物薄膜的形成。
16.如权利要求15所述的方法，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由
D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-天冬酰胺和D-酪氨酸所组成的组。
17.如权利要求14或15所述的方法，其中所述表面包括医疗器械、伤口敷料、隐形眼镜或口腔器械。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述医疗器械选自由钳、镊、剪刀、皮肤钩、管材、针头、牵引器、刮器、钻头、凿具、锉、锯、导管、整形器械、人造心脏瓣膜、假关节、发声假体、支架、分流器、起搏器、手术用针、呼吸机、通风设备和内窥镜及其组合所组成的组。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述细菌属于放线杆菌属(Actinobacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、包特氏菌属(Bordetella)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、布鲁杆菌属(Brucella)、拟杆菌属(Bacteroides)、伯克氏菌属(Burkholderia)、伯氏菌属(Borelia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲菌属(Campylobacter)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、心杆菌属(Cardiobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、衣原体属(Chlamydia)、艾肯菌属(Eikenella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Entembacter)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、金氏杆菌属(Kingella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、李斯特菌属(Listeria)、钩端螺旋体属(Leptospirae)、莫拉氏菌属(Moraxella)、摩根氏菌属(Morganella)、支原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、变形菌属(Proteus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、普罗威登斯菌属(Providencia)、立克次氏体属(Rickettsia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、螺菌属(Spirillum)、密螺旋体属(Treponema)、韦荣球菌属(Veillonella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)或黄单胞菌属(Xanthomonas)。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含D-酪氨酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述组合物进一步包含D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述组合物进一步包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸中的一种或多种。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种D-氨基酸，其选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-天冬酰胺所组成的组。
25.如权利要求21所述的方法，其中所述组合物包含D-酪氨酸、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸。
26.如权利要求21所述的方法，其中所述组合物包含D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括施用生物杀灭剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述生物杀灭剂是抗生素。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物实质上不包含去污剂。
30.一种组合物，其包含：
有效处理、减少或抑制生物薄膜的形成的量的D-氨基酸，所述组合物实质上不包含所述对应的L-氨基酸，
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-天冬酰胺及其组合所组成的组。
31.一种组合物，其包含：
有效处理、减少或抑制生物薄膜的形成的量的两种或更多种D-氨基酸的组合。
32.如权利要求31所述的组合物，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由
D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-天冬酰胺和D-酪氨酸所组成的组。
33.如权利要求30、31或32所述的组合物，其中所述D-氨基酸是D-酪氨酸。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物进一步包含D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种。
35.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物进一步包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸中的一种或多种。
36.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物进一步包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸和D-色氨酸中的一种或多种。
37.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物包含D-酪氨酸、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸。
38.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物包含D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸。
39.如权利要求30至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含聚六亚甲基双胍、氯己定、木糖醇、三氯生或二氧化氯。
40.如权利要求30至38中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
41.如权利要求30至40中任一项所述的组合物，其中所述有效量是有效治疗或预防生物薄膜相关失调的量。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述生物薄膜相关失调是肺炎、囊性纤维化、中耳炎、慢性阻塞性肺病或尿路感染。
43.如权利要求41所述的组合物，其中所述生物薄膜相关失调是医疗器械相关的感染。
44.如权利要求30至40中任一项所述的组合物，其中有效量是有效治疗或预防表面上的生物薄膜的量。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述组合物进一步包含适于施加至所述表面的药剂。
46.如权利要求30至45中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成洗液、敷料、伤口愈合凝胶或人造组织。
47.如权利要求30至45中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、气雾喷剂、溶液、混悬液、凝胶、药膏、药霜或泡沫。
48.如权利要求30至45中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、口腔(如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜、阴道或直肠施用。
49.一种生物薄膜抗性医疗器械，其包括：
有可能接触生物体液的表面；以及
涂布于所述表面上或浸渍于所述表面中的D-氨基酸，其中所述D-氨基酸处于有效处理、减少或抑制生物薄膜形成的量，所述涂层实质上不包含所述对应的L-氨基酸，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-天冬酰胺及其组合所组成的组。
50.一种生物薄膜抗性医疗器械，其包括：
有可能接触生物体液的表面；以及
涂布于所述表面上或浸渍于所述表面中的D-氨基酸组合，其中所述D-氨基酸组合处于有效处理、减少或抑制生物薄膜形成的量。
51.如权利要求50所述的器械，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由
D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-天冬酰胺和D-酪氨酸所组成的组。
52.如权利要求49、50或51中任一项所述的器械，其中所述涂层包含D-酪氨酸。
53.如权利要求52所述的器械，其中所述涂层进一步包含D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种。
54.如权利要求52所述的器械，其中所述涂层进一步包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸中的一种或多种。
55.如权利要求52所述的器械，其中所述涂层进一步包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-天冬酰胺中的一种或多种。
56.如权利要求49至55中任一项所述的器械，其中所述D-氨基酸被配制成为缓释制剂。
57.如权利要求49至56中任一项所述的器械，其中所述表面实质上不包含去污剂。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的器械，其中所述器械选自钳、镊、剪刀、皮肤钩、管材、针头、牵引器、刮器、钻头、凿具、锉、锯、导管、整形器械、人造心脏瓣膜、假关节、发声假体、支架、分流器、起搏器、手术用针、呼吸机、通风设备和内窥镜的一种或多种。
59.一种可饮用液体，其包含浓度处于0.000001％至0.5％的范围内的D-氨基酸，
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-天冬酰胺及其组合所组成的组。
60.一种可饮用液体，其包含浓度处于0.000001％至0.5％的范围内的D-氨基酸组合，其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由
D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-天冬酰胺和D-酪氨酸所组成的组。
61.一种对生物薄膜形成有抗性的组合物，其包含
药学上或美容上适当的基质；以及
分布于所述基质中的有效量的D-氨基酸，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-天冬酰胺和D-酪氨酸及其组合所组成的组，
其中所述基质实质上不包含所述对应的L-氨基酸。
62.一种对生物薄膜形成有抗性的组合物，其包含
药学上或美容上适当的基质；以及
分布于所述基质中的有效量的D-氨基酸组合，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由
D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸所组成的组。
63.如权利要求61或62所述的组合物，其中所述基质选自液体、凝胶、膏体或粉末。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述组合物选自由洗发剂、洗浴添加剂、护发制备物、肥皂、洗剂、乳霜、除臭剂、护肤制备物、美容个人护理制备物、私密部位卫生制备物、足部护理制备物、光照保护制备物、皮肤晒色制备物、驱虫剂、止汗剂、剃须制备物、除毛发制备物、芳香制备物、牙齿护理、假牙护理和口腔护理制备物及其组合所组成的组。
65.一种口腔组合物，其包含：
口腔可接受的载体；以及
有效量的D-氨基酸，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-天冬酰胺和D-酪氨酸及其组合所组成的组，
其中所述组合物实质上不包含所述对应的L-氨基酸。
66.一种口腔组合物，其包含：
口腔可接受的载体；以及
有效量的D-氨基酸组合，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由
D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸所组成的组。
67.如权利要求65或66所述的口腔组合物，其中所述口腔组合物处于牙膏、牙胶或牙粉的形式。
68.如权利要求65或66所述的口腔组合物，其中所述口腔组合物处于漱口液、口腔洗液、口腔喷剂、牙科溶液或灌流液的形式。

说明书全文

用于处理生物 薄膜的D-氨基酸

[0001] 优先权

[0002] 本申请要求针对共同待决的2010年1月8日提交的美国临时申请第61/293,414号和2010年4月30日提交的美国临时申请第61/329,930号的优先权。

[0003] 本申请涉及共同待决的与本案同日提交并且题为“Method and Coating Composition for Treating Biofilms”的国际专利申请。

[0004] 这些申请的内容通过引用结合在此。

[0005] 政府权益声明

[0006] 本发明由美国政府支持通过美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)基金第CA24487号、第GM058213号、第GM082137号、第GM086258号和第GM18568号而完成。美国政府在本发明中具有特定权益。

[0007] 发明背景

[0008] 生物薄膜是在表面定居和增殖，并且被胞外聚合物基质(exopolymer matrix)所覆盖的细胞群落。它们生长缓慢并且许多处于生长停滞期。它们由大多数(即使不是全部)病原体所形成。根据CDC，在美国，全部感染的65％由生物薄膜所导致，所述生物薄膜可以由普通病原体所形成。生物薄膜也见于工业设施中，诸如饮用水分配系统。

[0009] 发明概述

[0010] 本发明的方面的特征在于处理、减少或抑制由细菌引起的生物薄膜形成的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将表面与包含有效量的D-氨基酸的组合物接触，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成。在一些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。在特定的实施方案中，所述细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌。

[0011] 在其它方面，本发明的特征在于包含一种或多种D-氨基酸的组合物，诸如工业、治疗或药物组合物。在特定的实施方案中，所述组合物包含D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-色氨酸或其组合。在一些实施方案中，所述组合物包含D-酪氨酸、D-苯丙氨酸、D-脯氨酸或其组合。在进一步的实施方案中，所述组合物包含D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-甲硫氨酸、D-脯氨酸和D-色氨酸中的两种或更多种，并且在更为进一步的实施方案中后者组合物实质上不包含去污剂和/或L氨基酸。在其它的实施方案中，所述组合物被用于处理本文所述的工业生物薄膜，诸如水处理或管道系统中的生物薄膜。

[0012] 在一些实施方案中，所述组合物实质上不包含L-氨基酸。例如，所述组合物包含低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、低于1％、低于0.5％、低于0.25％、低于0.1％、低于0.05％、低于0.025％、低于0.01％、低于0.005％、低于0.0025％、低于0.001％或更低的L-氨基酸。

[0013] 在一些实施方案中，所述组合物实质上不包含去污剂。例如，所述组合物包含低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、低于1％、低于0.5％、低于0.25％、低于0.1％、低于
0.05％、低于0.025％、低于0.01％、低于0.005％、低于0.0025％、低于0.001％或更低的去污剂。

[0014] 本申请的另一个方面涉及在对其有需求的受试者体内治疗生物薄膜相关失调的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含有效量的D-氨基酸或D-氨基酸组合的组合物，由此治疗所述生物薄膜相关失调，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，或者其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合(synergistic combination)，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸和D-色氨酸组成的组。在一些实施方案中，将所述组合物施用于所述受试者的表面，所述表面选自由皮肤和粘膜表面及其组合所组成的组。在其它实施方案中，所述表面是口腔表面、皮肤表面、尿路表面、阴道表面或肺脏表面。

[0015] 在一些实施方案中，所述组合物相对于所述D-氨基酸或D-氨基酸组合实质上不包含对应的L-氨基酸或L-氨基酸组。

[0016] 在一些实施方案中，通过皮下、肌内、腹膜内、静脉内、口腔、鼻腔或局部施用及其组合将所述组合物施用于所述受试者。

[0017] 在一些实施方案中，所述受试者是人。

[0018] 在一些实施方案中，生物薄膜的形成被抑制。在其它实施方案中，先前形成的生物薄膜被破坏。

[0019] 在一些实施方案中，以约0.1nM至约100μM的浓度施用所述D-氨基酸，例如0.1nM至100μM的浓度。

[0020] 在进一步的实施方案中，所述生物薄膜相关失调选自由肺炎、囊性纤维化、中耳炎、慢性阻塞性肺病和尿路感染及其组合所组成的组。在其它实施方案中，所述生物薄膜相关失调是医疗器械相关的感染。在进一步的实施方案中，所述生物薄膜相关失调是牙周疾病，诸如齿龈炎、牙周炎或口臭(breath malodor)。在更进一步的实施方案中，所述生物薄膜相关失调由细菌所导致。在一些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。在又一些实施方案中，所述细菌是放线杆菌属(Actinobacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、包特氏菌属(Bordetella)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、布鲁杆菌属(Brucella)、拟杆菌属(Bacteroides)、伯克氏菌属(Burkholderia)、伯氏菌属(Borelia)、芽孢杆菌属、弯曲菌属(Campylobacter)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、心杆菌属(Cardiobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、衣原体属(Chlamydia)、艾肯菌属(Eikenella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Entembacter)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、金氏杆菌属(Kingella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、李斯特菌属(Listeria)、钩端螺旋体属(Leptospirae)、莫拉氏菌属(Moraxella)、摩根氏菌属(Morganella)、支原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、变形菌属(Proteus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、假单胞菌属、普罗威登斯菌属(Providencia)、立克次氏体属(Rickettsia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、葡萄球菌属、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、螺菌属(Spirillum)、密螺旋体属(Treponema)、韦荣球菌属(Veillonella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)或黄单胞菌属(Xanthomonas)的细菌。本申请的另一方面涉及在生物相关表面处理、减少或抑制由生物薄膜形成性细菌所导致的生物薄膜形成的方法，所述方法包括将生物表面与包含有效量的D-氨基酸或D-氨基酸组合的组合物接触，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，或者其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸组成的组。

[0021] 在一些实施方案中，所述组合物相对于所述D-氨基酸或D-氨基酸组合实质上不包含对应的L-氨基酸或L-氨基酸组。

[0022] 在一些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，所述细菌是放线杆菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、包特氏菌属、短芽孢杆菌属、布鲁杆菌属、拟杆菌属、伯克氏菌属、伯氏菌属、芽孢杆菌属、弯曲菌属、二氧化碳噬纤维菌属、心杆菌属、柠檬酸杆菌属、梭菌属、衣原体属、艾肯菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、肠杆菌属、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、黄杆菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、金氏杆菌属、克雷伯氏菌属、军团菌属、李斯特菌属、钩端螺旋体属、莫拉氏菌属、摩根氏菌属、支原体属、分枝杆菌属、奈瑟菌属、巴斯德氏菌属、变形菌属、普雷沃氏菌属、邻单胞菌属、假单胞菌属、普罗威登斯菌属、立克次氏体属、寡养单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、螺菌属、密螺旋体属、韦荣球菌属、弧菌属、耶尔森氏菌属或黄单胞菌属的细菌。

[0023] 在一些实施方案中，所述表面包括医疗器械、伤口敷料(wound dressing)、隐形眼镜或口腔器械。在其它实施方案中，所述医疗器械选自由钳、镊、剪刀、皮肤钩、管材、针头、牵引器、刮器、钻头、凿具、锉、锯、导管、整形器械、人造心脏瓣膜、假关节、发声假体、支架、分流器、起搏器、手术用针、呼吸机、通风设备和内窥镜及其组合组成的组。

[0024] 在前述方法的一些实施方案中，所述组合物包含D酪氨酸。除D-酪氨酸外，在一些实施方案中所述组合物还包含D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种。在又一些实施方案中，除D-酪氨酸外，所述组合物还包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸中的一种或多种。在更进一步的实施方案中，除D-酪氨酸外，所述组合物还包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸和D-色氨酸中的一种或多种。

[0025] 在任意前述方法的一些实施方案中，所述方法还包括施用生物杀灭剂。在一些实施方案中，所述生物杀灭剂是抗生素。

[0026] 在又一些实施方案中，所述组合物实质上不包含去污剂。

[0027] 本发明的另一个方面涉及包含有效处理、减少或抑制生物薄膜形成的量的D-氨基酸或D-氨基酸混合物的组合物，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，或者其中所述D-氨基酸组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸组成的组。

[0028] 在一些实施方案中，所述组合物相对于所述D-氨基酸或D-氨基酸组合实质上不包含对应的L-氨基酸或L-氨基酸组。

[0029] 在一些实施方案中，所述D-氨基酸是D-酪氨酸。在其它实施方案中所述组合物还包含D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种。在又一些实施方案中，所述组合物还包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所述组合物还包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸和D-色氨酸中的一种或多种。

[0030] 在一些实施方案中，任意前述组合物还可包含聚六亚甲基双胍、氯己定、木糖醇、三氯生或二氧化氯。在其它实施方案中，任意前述组合物还可包含药学上可接受的载体。在任意前述组合物的又一些实施方案中，所述有效量是有效治疗或预防生物薄膜相关失调的量。在一些实施方案中，有效量包含有效处理或预防表面上的生物薄膜的量。

[0031] 在任意前述组合物的又一些实施方案中，所述生物薄膜相关失调是肺炎、囊性纤维化、中耳炎、慢性阻塞性肺病或尿路感染。在一些实施方案中，所述生物薄膜相关失调是医疗器械相关的感染。

[0032] 在任意前述组合物的一些实施方案中，所述组合物还包含适于对所述表面应用的药剂。在任意前述组合物的其它实施方案中，所述组合物被配制成洗液、敷料、伤口愈合凝胶(wound gel)或人造组织。在进一步的实施方案中，所述组合物被配制成为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、气雾喷剂、溶液、混悬液、凝胶、药膏、药霜或泡沫。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、口腔(如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜、阴道或直肠施用。

[0033] 本申请的另一个方面涉及具生物薄膜抗性的医疗器械，其包含可能接触生物体液的表面和涂布于所述表面上或浸渍于所述表面中的D-氨基酸或D-氨基酸组合，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，或者其中所述D-氨基酸的组合处于有效治疗、减少或抑制生物薄膜形成的量，其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸组成的组。

[0034] 在一些实施方案中，所述D-氨基酸是D-酪氨酸或包含D酪氨酸的D-氨基酸组合。在其它实施方案中，所述组合物还包含D脯氨酸和D苯丙氨酸中的一种或多种。在其它实施方案中，所述组合物还包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸中的一种或多种。在一些实施方案中，所述组合物还包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸和D-色氨酸中的一种或多种。

[0035] 在一些实施方案中，所述D-氨基酸被配制成为缓释制剂。在一些实施方案中，所述表面实质上不包含L-氨基酸。在进一步的实施方案中，所述表面实质上不包含去污剂。

[0036] 在一些实施方案中，所述器械选自钳、镊、剪刀、皮肤钩、管材、针头、牵引器、刮器、钻头、凿具、锉、锯、导管、整形器械、人造心脏瓣膜、假关节、发声假体、支架、分流器、起搏器、手术用针、呼吸机、通风设备和内窥镜的一种或多种。

[0037] 本申请的进一步方面涉及可饮用液体，其包含浓度处于0.000001％至0.1％的范围内的D-氨基酸或D-氨基酸的组合，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，或者其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸组成的组。

[0038] 本申请的另一方面涉及对生物薄膜形成具有抗性的组合物，其包含药学上或美容上适当的基质以及分布于所述基质中的有效量的D-氨基酸或D-氨基酸组合，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，或者其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸组成的组。

[0039] 在一些实施方案中，所述基质相对于所述D-氨基酸或D-氨基酸组合实质上不包含对应的L-氨基酸或L-氨基酸组。

[0040] 在一些实施方案中，所述基质选自液体、凝胶、膏体或粉末。在进一步的实施方案中，所述组合物选自由洗发剂、洗浴添加剂、护发制备物、肥皂、洗剂、乳霜、除臭剂、护肤制备物、美容个人护理制备物、私密部位卫生制备物、足部护理制备物、光照保护制备物、皮肤晒色制备物、驱虫剂、止汗剂、剃须制备物、除毛发制备物、芳香制备物、牙齿护理、假牙护理和口腔护理制备物及其组合组成的组。

[0041] 附图简述

[0042] 下列图仅为说明目的而给出，并且并非意在进行限制。

[0043] 图1A和图1B示出了枯草杆菌(B.subtilis)菌株NCIB3610的细胞，其在22℃下在液体生物薄膜诱导培养基中生长于12孔板内3天(A)或8天(B)。

[0044] 图1C和图1D示出了在培养基中生长了3天的细胞，所述培养基中加入了来自C18 Sep Pak柱的干燥和重悬浮的甲醇洗脱液(1∶100v/v)，所述柱已加载来自6-8天程度的培养物(C)或3天程度培养物(D)的条件化培养基。加入所述孔中的浓缩因子的最终浓度为基于所述原始条件化培养基体积的1∶4稀释。

[0045] 图1E与图1C相同，区别在于所述因子通过使用甲醇进行的逐步洗脱而在所述C-18柱上被进一步纯化。示出的是加入了3μl的所述40％甲醇洗脱液的结果。

[0046] 图1F与图1C相同，区别在于在加入新鲜培养基之前将所述40％甲醇洗脱液与蛋白酶K珠粒进行孵育2小时，随后离心除去所述珠粒。

[0047] 图2A示出了向孵育三天后的处于生物薄膜诱导培养基中的新鲜接种的培养物内加入D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)、L-酪氨酸(7mM)或L-亮氨酸(8.5mM)对薄膜形成的效果。

[0048] 图2B示出了对薄膜形成的完全抑制所需的D-氨基酸的最小生物薄膜抑制浓度(MBIC)。

[0049] 图2C示出了3天程度的培养物，所述培养物中已加入无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸(3μM)或D-酪氨酸、D-色氨酸、D-甲硫氨酸和D-亮氨酸的混合物(各2.5nM)，随后进行8小时的进一步孵育。

[0050] 图2D示出了来自所述野生型或ylmE和racX双突变菌株(IKG55)的8小时程度培养物的条件化培养基的Sep Pak C-18柱浓缩洗脱液的效果。

[0051] 图2E示出了已在37℃下在包含葡萄糖(0.5％)和NaCl(3％)的TSB培养基中生长于12孔聚苯乙烯平板内24小时的金黄色葡萄球菌(S.aureus)(菌株SCO1)。此外向所述孔内加入了无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸(50μM)或D-氨基酸混合物(各15nM)。通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。

[0052] 图3A示出了放射性D-酪氨酸向所述细胞壁中的并入。将细胞生长于生物薄膜诱14 14
导培养基中并将其与 C-D-酪氨酸或 C-L-脯氨酸(10μCi/ml)在37℃下孵育2h。结果以向细胞中的总并入(对于L-脯氨酸为360,000cpm/ml并且对于D-酪氨酸为46,000cpm/ml)的百分比的形式给出。

[0053] 图3B示出了来自包含功能性tasA-mCherry翻译融合蛋白的细胞的总荧光(DR-30(Romero等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2010，出版中))。通过在D-酪氨酸(6μM)存在或不存在的情况下在生物薄膜诱导培养基中伴以振荡而将所述细胞生长至生长停滞期。

[0054] 图3C通过荧光显微法示出了TasA-mCherry的细胞结合。根据说明通过在D-酪氨酸(6μM)存在或不存在(未处理)的情况下在生物薄膜诱导培养基中伴以振荡而将包含所述tasA-mCherry融合蛋白的野生型细胞和yqxM6(IKG51)突变体细胞生长至生长停滞期(OD＝1.5)，在PBS中洗涤并且通过荧光显微法显现。

[0055] 图3D通过电子显微法示出了TasA纤维的细胞结合。不使用(图像1和2)或使用(图像3-6)D-酪氨酸(0.1mM)对24小时程度的培养物进行另外12小时的孵育。通过使用抗TasA抗体进行的免疫金标记对TasA纤维染色，并且根据实施例中所述通过透射电子显微法将其显现。所述细胞是eps操纵子的突变体(Δeps)，因为胞外多糖的缺乏显著地改善了TasA纤维的成像。实箭头标出了纤维簇；空箭头标出了单个纤维。所述尺度条为500nM。在图像2、4和6的放大部分中的尺度条为100nm。图像1和2示出了结合于细胞的纤维簇，图像3、4和6示出了与细胞解离的单个纤维和簇，并且图像3-5示出了几乎没有纤维物质的细胞。

[0056] 图4A示出了在包含或不包含D-酪氨酸的固体(顶部图像)或液体(底部图像)生物薄膜诱导培养基中生长3天的细胞。

[0057] 图4B示出了YqxM的简写氨基酸序列。带下划线的是密码子所指定的残基，其中所述yqxM2和yqxM6移框突变在所述密码子处产生了所标明的序列变化。

[0058] 图5示出了包含补充以D-色氨酸(0.5mM)、D-甲硫氨酸(2mM)、L-色氨酸(5mM)或L-甲硫氨酸(5mM)的MSgg培养基的孔，使用菌株NCIB3610对其进行了接种并孵育了3天。

[0059] 图6示出了包含补充以D-酪氨酸(3μM)或D-亮氨酸(8.5mM)的固体MSgg培养基的平板，使用菌株NCIB3610对其进行了接种并孵育了4天。

[0060] 图7示出了NCIB3610(WT)和ylmE和racX双缺失突变体(IKG155)，其生长于12孔平板内并孵育5天。

[0061] 图8示出了D-氨基酸对细胞生长的效果。在包含D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)或所述4种D-氨基酸混合物(各2.5nM)的MSgg培养基中伴以振荡使细胞生长。

[0062] 图9A示出了菌株FC122(携带PyqxM-lacZ)对PyqxM-lacZ的表达，并且图9B示出了菌株FC5(携带PepsA-lacZ)对PepsA-lacZ的表达，所述菌株在包含D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)或所述4种D-氨基酸混合物(各2.5nM)的MSgg培养基中伴以振荡生长。

[0063] 图10示出了D-氨基酸对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)生物薄膜形成的抑制。在30℃下在12孔聚苯乙烯平板中将绿脓杆菌菌株P014在包含甘油(0.2％)和酪蛋白氨基酸(20μg/ml)的M63培养基中生长48小时。另外向所述孔内加入了无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸或所述D-氨基酸混合物。通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。使用500μl 1.0％的结晶紫染料对孔染色，使用2ml双蒸水清洗两次并彻底干燥。

[0064] 图11示出了对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生物薄膜的结晶紫染色，其在TSB培养基中使用单种D-氨基酸或所述四重混合物生长24小时。

[0065] 图12示出了对绿脓杆菌的结晶紫染色，其在M63培养基中使用单种D-氨基酸或所述四重混合物生长48小时。

[0066] 图13示出了对金黄色葡萄球菌生物薄膜的结晶紫染色，其在TSB培养基中使用单种D-氨基酸或混合物生长24小时。

[0067] 图14示出了对金黄色葡萄球菌生物薄膜的结晶紫染色，其在含L-氨基酸的TSB培养基中生长24小时。

[0068] 图15示出了在除去浮游细菌后在应用了D-氨基酸的TSB培养基中形成的金黄色葡萄球菌生物薄膜的典型图像。

[0069] 图16示出了在除去浮游细菌后在应用了L-氨基酸的TSB培养基中形成的金黄色葡萄球菌生物薄膜的典型图像。

[0070] 图17是在除去浮游细菌后形成于TSB培养基中的金黄色葡萄球菌生物薄膜中的细胞定量。将细胞重悬浮于PBS中。

[0071] 图18示出了D-aa混合物(1mM)对于表面上的金黄色葡萄球菌生物薄膜形成的效果。环氧树脂表面被浸以D/L aa混合物并随后将其与细菌孵育24小时。

[0072] 图19示出了D-aa混合物(1mM)对于表面上的金黄色葡萄球菌生物薄膜形成的效果。环氧树脂表面被浸以D/L aa混合物并随后将其与细菌孵育24小时。

[0073] 图20示出了D-aa对于M63固体培养基上绿脓杆菌中的生物薄膜形成的效果。将菌落在室温下生长4天。

[0074] 图21示出了在生物薄膜诱导条件下在绿脓杆菌的6孔板圆座(button)中对单贴附细胞的Sytox-染色。

[0075] 图22示出了对奇异变形菌(Proteus mirabilis)的结晶紫染色，其在LB培养基中使用D-氨基酸(100μM)或L-氨基酸(100μM)混合物生长了48小时。

[0076] 图23示出了对变异链球菌(Streptococcus mutans)的结晶紫染色，其在应用了蔗糖(0.5％)培养基的BHI培养基中使用D-或L-氨基酸(1mM)生长了72小时。

[0077] 发明详述

[0078] 除非另外进行限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述类似的或等同的方法和材料可被用于本发明的实施或测试，但在下文描述了适当的方法和材料。本文所提及的全部公布、专利申请、专利和其它参考文献全部通过引用结合在此。在不一致的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的，并且并非意在进行限制。

[0079] 本发明的其它特征和优势应通过以下详细描述并通过权利要求进行明确。本领域的技术人员应当明了，本文所述的特定特征和实施方案可与任意其它特征和实施方案进行结合。

[0080] 定义

[0081] 术语“失调”、“疾病”和“病状”在本文中可互换地用于受试者的病状。失调是影响受试者身体的正常功能的紊乱或失序。疾病是器官、身体部分或系统的病理病状，其由多种原因所导致，诸如感染、基因缺陷或环境压力，其特征在于可鉴别的一组症状。失调或疾病可以指生物薄膜相关失调，其特征在于由于生物薄膜的建立而导致的疾病相关的细菌增长。

[0082] 术语“预防”在本文指的是对生物薄膜或生物薄膜相关失调的发展或发作的抑制，或指的是在表面或受试者体内的生物薄膜或生物薄膜相关失调的一种或多种指征或症状的复发、发作或发展的预防，其由本文所述的组合物(例如，预防性或治疗性组合物)的施用或疗法组合(例如，预防性或治疗性组合物的组合)的施用所导致。

[0083] 本文所使用的“治疗”指的是施用本文所述的组合物，其以有效改善失调或其症状或有效预防或减缓疾病或其症状的发展的量、方式(如施用时间安排)和/或模式(如施用途径)进行所述施用。这可通过，例如，与生物薄膜或生物薄膜相关失调或其指征或症状所关联的参数的一定程度的改善而证明，例如统计上显著的程度或本领域的技术人员可检测的程度的改善。有效量、方式或模式可根据所述表面、应用和/或受试者而变化，并且可针对所述表面、应用和/或受试者进行适应调整。通过预防或减缓生物薄膜或生物薄膜相关失调或其指征或症状的发展，治疗可在受作用表面或受侵扰或经诊断的受试者体内预防或减缓由生物薄膜或生物薄膜相关失调或其指征或症状所导致的恶化。

[0084] 本发明至少部分地基于如下发现：存在于来自成熟生物薄膜的条件化培养基中的D-氨基酸预防了生物薄膜形成并且引发了已存在的生物薄膜的解体。标准氨基酸可以互为镜像的称为L-或D-氨基酸的两种光学异构体的任意一种存在。虽然L-氨基酸是见于蛋白质中的最主要氨基酸，但是D-氨基酸是细菌的肽聚糖细胞壁的组分。

[0085] 本文所述的D-氨基酸能够穿透活体或非活体表面上的生物薄膜，能够预防细菌对表面的附着和所述生物薄膜的任何进一步构建，能够解离这些生物薄膜和/或抑制所述生物薄膜形成微生物在所述生物基质上的进一步生长，或能够杀灭这些微生物。D-氨基酸在本领域中是已知的并且可使用已知技术制备。示例性的方法包括，例如，描述于美国专利公开号第20090203091号中的方法。D-氨基酸也可商购(例如，来自Sigma Chemicals，St.Louis，Mo.)。

[0086] 本文所述的方法中可使用任意D-氨基酸，其包括但不限于D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸或D-酪氨酸。D-氨基酸可单独使用或与其它D-氨基酸组合使用。在示例性的方法中，可将2种、3种、4种、5种、6种或更多种D-氨基酸组合使用。优选的情况下，在本文所述的方法中单独使用或组合使用D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸或D-色氨酸。在其它优选的实施方案中，在本文所述的方法中单独使用或组合使用D-酪氨酸、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸。

[0087] 可以以0.1nM至100μM的浓度施用D-氨基酸，如1nM至10μM、5nM至5μM或10nM至1μM。在其它实施方案中，可以以约0.1nM至约100μM的浓度施用D-氨基酸，如约1nM至约10μM、约5nM至约5μM或约10nM至约1μM。

[0088] 在抑制或治疗生物薄膜形成中所发现的特别有效的示例性D-氨基酸组合物包含D-酪氨酸。在一些实施方案中，D-酪氨酸被单独使用并且可以例如低于1mM的浓度使用，或低于100μM或低于10μM的浓度，或0.1nM至100μM的浓度，例如1nM至10μM、5nM至5μM或10nM至1μM。

[0089] 在其它实施方案中，将D-酪氨酸与D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种组合使用。在一些实施方案中，将D-酪氨酸与D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸中的一种或多种组合使用。D-酪氨酸与D-脯氨酸、D-苯丙氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸中的一种或多种的组合可以是协同促进的并且可在10μM或更低的总D-氨基酸浓度下有效抑制或处理生物薄膜形成，例如约1nM至约10μM、约5nM至约5μM或约10nM至约1μM的浓度，或0.1nM至100μM的浓度，例如1nM至10μM、5nM至5μM或10nM至1μM。

[0090] 在一些实施方案中，D-氨基酸的组合是等摩尔量的。在其它实施方案中，D-氨基酸的组合并非是等摩尔量的。

[0091] 在一些实施方案中，本发明实质上不包含L-氨基酸。例如，所述组合物包含低于约30％、低于约20％、低于约10％、低于约5％、低于约1％、低于约0.5％、低于约0.25％、低于约0.1％、低于约0.05％、低于约0.025％、低于约0.01％、低于约0.005％、低于约0.0025％、低于约0.001％或更低的L-氨基酸。在其它实施方案中，所述组合物包含低于
30％、低于20％、低于10％、低于5％、低于1％、低于0.5％、低于0.25％、低于0.1％、低于
0.05％、低于0.025％、低于0.01％、低于0.005％、低于0.0025％、低于0.001％的L-氨基酸。在优选的实施方案中，L-氨基酸的百分比是相对于对应的D-氨基酸的百分比。以实例的方式，L-氨基酸和D-氨基酸的外消旋混合物包含50％的L-氨基酸。

[0092] 在一些实施方案中，所述组合物实质上不包含去污剂。例如，所述组合物包含低于约30wt％、低于约20wt％、低于约10wt％、低于约5wt％、低于约1wt％、低于约0.5wt％、低于约0.25wt％、低于约0.1wt％、低于约0.05wt％、低于约0.025wt％、低于约0.01wt％、低于约0.005wt％、低于约0.0025wt％、低于约0.001wt％或更低的去污剂。在其它实施方案中，所述组合物相对于所述总体组合物包含低于约30wt％、低于20wt％、低于10wt％、低于5wt％、低于1wt％、低于0.5wt％、低于0.25wt％、低于0.1wt％、低于0.05wt％、低于0.025wt％、低于0.01wt％、低于0.005wt％、低于0.0025wt％或低于0.001wt％的去污剂。
在包含去污剂如表面活性剂的制剂中，很多情况下所述表面活性剂将与所述活性剂，此前的所述D-氨基酸，进行相互作用，其可极大地影响所述药剂的效力。在一些实施方案中，可能必须筛选相对于阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂的药剂效能，所述筛选是测定所述表面活性剂类型的存在是否改变了所述效力的筛选。减少或消除去污剂可提高所述组合物的效力和/或降低制剂复杂性。

[0093] 在一些实施方案中，所述组合物实质上均不包含去污剂和L-氨基酸。

[0094] 生物薄膜

[0095] 大多数细菌可形成复合的包含基质的多细胞群落，其被称为生物薄膜(O’Toole等，Annu.Rev.Microbiol.54：49(2000)；López 等，FEMS Microbiol.Rev.33：152(2009)；Karatan等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.73：310(2009))。生物薄膜相关细菌受到保护以免受环境侵害，诸如抗生素的侵害(Bryers，Biotechnol.Bioeng.100：1(2008))。但是，随着生物薄膜老化，营养物变得具限制性，废料进行了积累，并且返回浮游态生存对于生物薄膜结合细菌是有利的(Karatan等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.73：310(2009))，因此，生物薄膜具有有限的寿命，其特征在于最终的解体。

[0096] 除其它单细胞生物外，革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌也可产生生物薄膜。细菌生物薄膜是附着于表面的细胞群落，其封闭于所述移生细胞所产生的细胞外多糖基质中。生物薄膜发展通过一系列的程序化步骤而进行，其包括对表面的初始附着、三维微菌落的形成以及成熟生物薄膜的随后发展。细胞在生物薄膜的定位越深(例如，所述细胞进入所述生物薄膜所附着的固体表面越深，由此更为受到所述生物薄膜基质主体的遮蔽和保护)，则所述细胞在代谢上更不活跃。该生理变化和梯度的结果产生了一系列细菌群落，其中存在有效的系统，微生物通过所述系统而具有多样化的功能特征。生物薄膜还由多种并且多样化的非细胞组分所产生，其可包含但不限于碳水化合物(简单和复杂)、脂类、蛋白质(包括多肽)以及糖和蛋白质的脂类复合体(脂多糖和脂蛋白)。生物薄膜可包含两种或更多种细菌种类的合并群落(多微生物生物薄膜)，或主要包含一种特定的细菌。

[0097] 所述生物薄膜可使细菌以休眠状态存在特定的时间直至适当的生长条件出现，由此为所述微生物提供了选择优势以确保其存活。但是，该选择可对人体健康产生严重威胁，因为已观察到生物薄膜参与了约65％的人类细菌感染(Smith，Adv.Drug Deliv.Rev.57：1539-1550(2005)；Hall-Stoodley等，Nat.Rev.Microbiol.2：95-108(2004))。

[0098] 根据本文所述，生物薄膜可侵扰广泛多种的生物、医学、商业、工业和加工运作。

[0099] 生物薄膜形成细菌

[0100] 本文所述的方法可被用于预防或延迟生物薄膜的形成，和/或处理生物薄膜。在示例性的方法中，所述生物薄膜由生物薄膜形成细菌所形成。所述细菌可以是革兰氏阴性细菌种类或革兰氏阳性细菌种类。这些细菌的非限制性实例包括放线杆菌属(诸如伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)成员、不动杆菌属(诸如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii))成员、气单胞菌属的成员、包特氏菌属的成员(诸如百日咳包特氏菌(Bordetella pertussis)、支气管炎包特氏菌(Bordetella bronchiseptica)或副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis))、短芽孢杆菌属的成员、布鲁杆菌属的成员、拟杆菌属的成员(诸如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、伯克氏菌属的成员(诸如洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)或类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei))、伯氏菌属的成员(诸如伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi))、芽孢杆菌属的成员(诸如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌)、弯曲菌属的成员(诸如空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni))、二氧化碳噬纤维菌属的成员、心杆菌属的成员(诸如人心杆菌(Cardiobacterium hominis))、柠檬酸杆菌属的成员、梭菌属的成员(诸如破伤风梭菌(Clostridium tetani)或艰难梭菌(Clostridium difficile))、衣原体属的成员(诸如砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)或鹦鹉衣原体(Chlamydia psiffaci))、艾肯菌属的成员(诸如啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens))、肠杆菌属的成员、埃希氏菌属的成员(诸如大肠埃希氏菌(Escherichia coli))、弗朗西斯氏菌属的成员(诸如土拉热弗朗西氏菌(Francisella tularensis))、梭杆菌属的成员、黄杆菌属的成员、嗜血杆菌属的成员(诸如杜克嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、螺杆菌属的成员(诸如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、金氏杆菌属的成员(诸如金氏金氏菌(Kingella kingae))、克雷伯氏菌属的成员(诸如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、军团菌属的成员(诸如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila))、李斯特菌属的成员(诸如单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))、钩端螺旋体属的成员、莫拉氏菌属的成员(诸如卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis))、摩根氏菌属的成员、支原体属的成员(诸如人型支原体(Mycoplasma hominis)或肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae))、分枝杆菌属的成员(诸如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))、奈瑟菌属的成员(诸如淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis))、巴斯德氏菌属的成员(诸如多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida))、变形菌属的成员(诸如普通变形菌(Proteus vulgaris)或奇异变形菌(Proteus mirablis))、普雷沃氏菌属的成员、邻单胞菌属的成员(诸如类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides))、假单胞菌属的成员(诸如绿脓假单胞菌)、普罗威登斯菌属的成员、立克次氏体属的成员(诸如立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)或斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi))、寡养单胞菌属的成员(诸如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila))、葡萄球菌属的成员(诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))、链球菌属的成员(诸如草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、产脓链球菌(A型)(Streptococcus pyogenes(group A))、无乳链球菌(B型)(Streptococcus agalactiae(group B))、牛链球菌(Streptococcus bovis)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、链霉菌属的成员(诸如吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus))、沙门氏菌属的成员(诸如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属的成员(诸如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、志贺氏菌属的成员、螺菌属的成员(诸如小螺菌(Spirillum minus))、密螺旋体属的成员(诸如梅毒密螺旋体(Treponema pallidum))、韦荣球菌属的成员、弧菌属的成员(诸如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)或创伤弧菌(Vibrio vulnificus))、耶尔森氏菌属的成员(诸如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)或假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis))和黄单胞菌属的成员(诸如嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia))。

[0101] 特别地，枯草杆菌在半固体表面形成结构性复合群落并在长期培养物的气液交界面处形成厚膜(López等，FEMS Microbiol.Rev.33：152(2009)；Aguilar等，Curr.Opin.Microbiol.10：638(2007)；Vlamakis 等，Genes Dev.22：945(2008)；Branda 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：11621(2001))。枯草杆菌生物薄膜由通过细胞外基质结合在一起的细胞长链所组成，所述细胞外基质由胞外多糖和淀粉体纤维所组成，所述淀粉体纤维包含蛋白质TasA(Branda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：11621(2001)；Branda等，Mol.Microbiol.59：1229(2006)；Romero等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2010，出版中))。由所述epsA-O操纵子(“eps操纵子”)编码的酶产生所述胞外多糖，并且所述yqxM-sipW-tasA操纵子(“yqxM操纵子”)的远启动子基因编码了所述TasA蛋白(Chu等，Mol.Microbiol.59：1216(2006))。

[0102] 根据本文所述，产生生物薄膜的细菌，如本文所述的菌种，可见于活体受试者、体外或表面。

[0103] 应用/制剂

[0104] 在计划将D-氨基酸施用于受试者的情况下，可将本文所述的D-氨基酸并入药物组合物。所述D-氨基酸可以以所述D-氨基酸的药学上可接受的盐类、酯类或衍生物的形式并入药物组合物。这些组合物一般包含D-氨基酸和药学上可接受载体。本文所使用的“药学上可接受载体”指的是可以与本文所述的D-氨基酸一同施用于受试者的载体，所述载体并不破坏其药理活性。药学上可接受载体包括，例如，溶剂、粘合剂、分散介质、涂层、防腐剂、着色剂、等渗及吸收延迟剂等，其与药物施用相容。也可将补充性活性化合物并入所述组合物。

[0105] 所述术语“药学上可接受的盐类”包括但不限于水溶性或水不溶盐类，诸如乙酸盐、安索酸盐(4，4-二氨基二苯乙烯-2，2-二磺酸盐)、苯磺酸盐、安息香酸盐、重碳酸盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化盐、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙、右旋樟脑磺酸、碳酸盐、氯化盐、柠檬酸盐、克拉维酸盐、二氢氯化盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴青霉素、氢溴酸盐、氢氯酸盐、羟萘甲酸盐、碘化盐、异硫代羟酸盐(isothionate)、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、溴甲烷、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡萄糖胺铵盐(N methylglucamine ammonium salt)、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐(1，1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐，einbonate)、泛酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、suramate、丹宁酸盐、酒石酸盐、氯茶碱盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、三乙基碘和戊酸盐。

[0106] 所述D-氨基酸还可以酯类或衍生物的形式使用。适当的酯类的实例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、异丁酸酯、戊酸酯、巴豆酸酯、安息香酸酯。一些药学上可接受的衍生物包含提高水溶性的化学基团。

[0107] 可使用的药学上可接受的载体的非限制性实例包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、PVA、部分水解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯-乙烯醇共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol))、交联的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、交联的部分水解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、交联的乙烯-乙酸乙烯酯-乙烯醇共聚物，聚(D，L)乳酸、聚L-乳酸、聚羟基乙酸、PGA、乳酸与羟基乙酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯、聚戊内酯、聚酸酐、聚己内酯与聚乙二醇共聚物、聚乳酸与聚乙二醇共聚物、聚乙二醇，及它们的组合和混合物。

[0108] 其它载体包括，例如，明胶水溶液、蛋白质水溶液、聚合物载体、交联剂或其组合。在其它情况下，所述载体是基质。在有一些情况下，所述载体包括水、药学上可接受的缓冲盐类、药学上可接受的缓冲溶液、药学上可接受的抗氧化剂、抗坏血酸、一种或多种低分子量的药学上可接受的多肽、包含约2至约10个氨基酸残基的肽、一种或多种药学上可接受的蛋白质、一种或多种药学上可接受的氨基酸，人必需氨基酸、一种或多种药学上可接受的碳水化合物、一种或多种药学上可接受的源自碳水化合物的物质，非还原性糖类、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖、甘露醇、麦芽糊精、糊精、环糊精、药学上可接受的螯合剂、EDTA、DTPA、二价金属离子螯合剂、三价金属离子螯合剂、谷胱甘肽、药学上可接受的非特异性血清白蛋白，和/或它们的组合。

[0109] 根据本领域的技术人员所了解，可配制包含D-氨基酸的药物组合物使之与预定施用途径相容。施用途径的非限制性实例包括例如肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、口腔(如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜、阴道或直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于渗透压调整的药物，诸如氯化钠或葡萄糖。可使用酸或碱调节pH，诸如盐酸或氢氧化钠。所述肠胃外制备物可被置入安瓿瓶、可抛式注射器或由塑料或玻璃制成的多剂量药瓶。

[0110] 适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在可水溶的情况下)或分散液，以及用于无菌可注射溶液和分散液的即时制备的无菌粉末。对于静脉内施用，适当的TM载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL (BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物可以是无菌的并且是达到便于可注射性的流体。其在生产和储存条件下应是稳定的，并且必须防腐以免于诸如细菌和真菌这样的微生物的污染活动。所述载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。可通过例如使用涂层如卵磷脂、通过在分散液的情况下对所需颗粒大小的维持以及通过表面活性剂的使用而维持所述适当的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂而实现预防微生物活动，所述抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在所述组合物中包含等渗剂是理想的，例如，糖类、多元醇类如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可通过在所述组合物中包含延缓吸收的药剂，例如包含单硬脂酸铝和明胶(参见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams & Wilkins，Gennaro编著(2006))而实现所述可注射组合物的延长吸收。

[0111] 根据需要，可通过将所需量的D-氨基酸与上文列举的成分中的一种或组合并入适当的溶剂中并继之以过滤消毒而制备无菌可注射溶液。通常通过将所述活性化合物并入包含基本分散介质和来自上文所列举的其它所需成分的无菌媒介物而制备分散液。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，制备方法包括但不限于真空干燥和冷冻干燥，其通过此前经过滤灭菌的溶液产生所述活性成分与任意其它所需成分的粉末。

[0112] 口腔组合物通常包含惰性溶剂或可口服载体。为进行口腔治疗性施用，可将D-氨基酸与赋形剂合并并且以片剂、丸剂、锭剂或胶囊如明胶胶囊的形式使用。还可使用流体载体制备口腔组合物以作为漱口液使用。药学上相容的粘合剂和/或辅助剂材料可作为所述组合物的一部分而包含在内。所述片剂、丸剂、胶囊或锭剂等可包含下列成分中的任意成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖，崩解剂，诸如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；增甜剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。

[0113] 对于通过吸入施用，可以以来自包含适当的推进剂如气体，诸如二氧化碳的加压容器或分配器或来自喷雾器的气雾喷剂的形式递送D-氨基酸。

[0114] 还可通过经粘膜或经皮手段进行全身施用。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于待穿透屏障的渗透剂。所述渗透剂在本领域中通常是已知的并且包括但不限于，例如，用于经粘膜施用的去污剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻喷雾或栓剂实现经粘膜施用。对于经皮施用，将所述活性化合物配制成本领域通常已知的药膏、软膏、凝胶或药霜。

[0115] 对于急性或慢性伤口的处理，可将D-氨基酸配制成为敷料、洗涤溶液、凝胶或人造组织。

[0116] 生物薄膜可在口腔表面(诸如牙齿、舌头、咽喉背部等)形成。这些生物薄膜可以与位于这些环境中的天然菌群的日常细菌活性相关联，但也可以与口腔相关疾病相关联，诸如牙周疾病(例如，齿龈炎或牙周炎)、口臭或龋齿。例如，牙周疾病的一种常见形式牙周炎，据信是由以生物薄膜形式存在于牙根表面的小群革兰氏阴性细菌所导致，特别是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus)和伴放线放线杆菌，后者最常见于青少年牙周炎的情况。可能参与牙周疾病的其它细菌包括牙密螺旋体(T.denticola)、齿垢密螺旋体(T.socranskii)、有核粒梭菌(F.nucleatum)以及中间普氏菌(P.intrmedia)、嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、粘性放线菌(A.viscosus)、远缘链球菌(S.sobrinus)、血液链球菌(S sanguis)、草绿色链球菌和变异链球菌。D-氨基酸在这些口腔表面的应用可抑制或预防细菌生物薄膜的形成。对这些口腔表面的应用通常应通过产品进行，所述产品在常规使用期间并不被主动地吞咽以用于全身施用，而是在所述口腔内停留足以实质上接触全部牙表面和/或口腔组织的时间。用于口腔表面的D-氨基酸可配制成口胶、膏体(诸如牙膏)，其可随后被直接应用于受试者体内的这样的表面的生物薄膜。膏体制剂可进一步包含磨料。D-氨基酸还可以以凝胶制剂或液体制剂的形式存在。例如，所述D-氨基酸可被配置成为漱口液，其可直接地接触受试者的口腔表面上的生物薄膜。此外，D-氨基酸可被配置成为用于治疗或预防口腔病状的聚合物薄膜或小片(例如，成为缓释制剂)。在一个实施方案中，本发明的D-氨基酸可被用于对牙周炎的附加抗微生物治疗并且以薄片的形式被直接应用于牙齿或牙齿之间。本发明的口腔护理组合物可以是多种形式，其包括治疗性洗液，特别是口腔洗液；牙科光洁剂，诸如牙膏、牙胶和牙粉；非磨蚀性凝胶；口腔喷剂；慕斯(mousse)；泡沫；口香糖、锭剂和薄荷糖；饮用水添加剂；牙科溶液和灌流液；以及牙具，诸如牙线和胶带。所述牙具可以是浸渍纤维，包括牙线或胶带、薄片、牙贴、牙膜和聚合物纤维。

[0117] 例如，口腔组合物可包含基于所述组合物总重的约0.01重量％至约15重量％的一种或多种D-氨基酸，例如0.01重量％至15重量％的一种或多种D-氨基酸，以及口腔耐受的辅助剂。口腔组合物的一个非限制性实例包含10重量％的山梨醇、10重量％的甘油、15重量％的乙醇、15重量％的丙二醇、0.5重量％的十二烷基硫酸钠、0.25重量％的椰油酰基甲基牛磺酸钠、0.25重量％的聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段共聚物、0.10重量％的胡椒薄荷调味剂、0.1至0.5重量％的一种或多种D-氨基酸以及48.6重量％的水。

[0118] 口腔组合物可以是，例如，凝胶、膏体、药霜或含水制备物(漱口液)的形式。所述口腔组合物还可包含释放有效抗龋齿形成的氟离子的化合物，例如无机氟盐，如氟化钠、钾、铵或钙，或有机氟盐，如氟化胺类，其以商品名OLAFLUOR为人所知。口腔组合物可进一步包含在本领域已知为“口腔可接受载体”的化合物，根据本文所使用其指的是口腔护理组合物中的常规添加剂，其包括但不限于，氟离子来源、抗牙垢或抗牙石剂、缓冲液、磨料如硅石、漂白剂如过氧化物来源、碱金属碳酸氢盐、增稠物质、保湿剂、水、表面活性剂、二氧化钛、调味系统、增甜剂、木糖醇、着色剂及其混合物。这些物质在本领域中为人所熟知，并且本领域的技术人员根据待制备组合物所需的物理、美感和性能特征易于对其选择。这些载体可以一般情况下占所述口腔组合物的约50重量％至约99重量％的水平被包含在内，优选地约70重量％至约98重量％，并且更为优选地约90重量％至约95重量％。待用载体的选择基本上由所述组合物被引入口腔的方式所决定。在一个优选的实施方案中，所述口腔组合物是牙科光洁剂形式，诸如牙膏、牙胶和牙粉。这些牙膏和牙胶的组分一般包含牙科磨料(约6％至约50％)、表面活性剂(约0.5％至约10％)、增稠剂(约0.1％至约5％)、保湿剂(约10％至约55％)、调味剂(约0.04％至约2％)、增甜剂(约0.1％至约3％)、着色剂(约0.01％至约0.5％)和水(约2％至约45％)中的一种或多种。这些牙膏或牙胶还可包含一种或多种抗龋齿剂(约0.05％至约0.3％，作为氟离子)和抗牙垢剂(约0.1％至约13％)。牙粉实质上只包含非液体组分。其它优选的口腔护理组合物是液体产品，包括漱口液或洗液、口腔喷剂、牙科溶液和灌流液。这些漱口液和口腔喷剂的组分一般包含水(约45％至约95％)、乙醇(约0％至约25％)、保湿剂(约0％至约50％)、表面活性剂(约0.01％至约7％)、调味剂(约0.04％至约2％)、增甜剂(约0.1％至约3％)和着色剂(约0.001％至约0.5％)中的一种或多种。这些漱口液和口腔喷剂还可包含一种或多种抗龋齿剂(约0.05％至约0.3％，作为氟离子)和抗牙垢剂(约0.1％至约3％)。
牙科溶液的组分通常包含水(约90％至约99％)、防腐剂(约0.01％至约0.5％)、增稠剂(约0％至约5％)、调味剂(约0.04％至约2％)、增甜剂(约0.1％至约3％)和表面活性剂(约0％至约5％)中的一种或多种。

[0119] 还可将包含D-氨基酸的药物组合物制备成用于直肠递送的栓剂形式(如，使用常用栓剂基质如可可油和其它甘油酯)或持留灌肠剂。

[0120] 在一些实施方案中，所述组合物实质上不包含去污剂。在一些情况下，去污剂可造成组合物的毒性。例如，所述组合物包含低于约30％、低于约20％、低于约10％、低于约5％、低于约1％、低于约0.5％、低于约0.25％、低于约0.1％、低于约0.05％、低于约0.025％、低于约0.01％、低于约0.005％、低于约0.0025％、低于约0.001％或更低的去污剂，例如低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、低于1％、低于0.5％、低于0.25％、低于0.1％、低于0.05％、低于0.025％、低于0.01％、低于0.005％、低于0.0025％、低于
0.001％的去污剂。

[0121] 可使用保护所述D-氨基酸免于从所述体内被快速消除的载体制备一些药物组合物，诸如受控释放制剂，其包括植入物和微胶囊化递送系统(例如，根据Tan等，Pharm.Res.24：2297-2308，2007中的描述)。可使用生物可降解的生物相容聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这些制剂的方法对于本领域的技术人员是明了的。所述材料也可商购(如，来自Alza Corp.，Mountain View，Calif.)。也可使用脂质体混悬液(包含靶向特定细胞的脂质体，其具有针对细胞表面抗原的单克隆抗体)作为药学上可接受的载体。其可根据本领域的技术人员所知的方法而制备，例如，根据美国专利第4,522,811号中的描述。

[0122] 将口腔或肠胃外组合物配制成为剂量单位形式以用于施用的简化和剂量的均一可能是有利的。本文所使用的剂量单位形式指的是适用为待治疗受试者的单位剂量的物理上的不连续单位；各单位包含结合于所需药物载体的预定量的活性化合物，其据计算产生所需疗效。

[0123] 可在细胞培养或实验动物中通过标准制药程序测定这些化合物的毒性和疗效，例如，用以测定LD50(所述群体的50％致死剂量)和ED50(所述群体的50％治疗有效剂量)。毒性效果和疗效之间的剂量比为治疗指数并且其可表示为LD50/ED50比率。虽然可使用表现出毒性副作用的化合物，但是应采取谨慎以设计将这些化合物靶定于患病组织的位置的递送系统，从而将对正常细胞的可能损害降至最低并且由此降低副作用。

[0124] 可将获自所述细胞培养分析和动物研究的数据用于配制一定范围的人用剂量。这些化合物的剂量通常处于一定范围的循环浓度之内，其包括所述ED50并且几乎不具毒性或无毒性。所述剂量可根据所应用的剂型和使用的施用途径而在该范围内变动。对于本文所述的方法中所使用的任意化合物，可通过细胞培养分析初步估测所述治疗有效剂量。在动物模型中可配制药剂以获得将所述IC50(即，获得症状的最大抑制半数的所述测试化合物浓度)包含在内的循环血浆浓度范围，所述范围根据细胞培养中的测定。这些信息可被用于更为精确地测定在人体内的可用剂量。可通过，例如，高效液相色谱测量血浆中的水平。本领域中已知制备和测试这些组合物的信息。(参见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams & Wilkins，Gennaro编著(2006)).[0125] 在一些情况下施用了约0.0005μM的D-氨基酸至约50μM的D-氨基酸，例如，约0.001μM的D-氨基酸至约25μM的D-氨基酸、约0.002μM的D-氨基酸至约10μM的D-氨基酸、约0.003μM的D-氨基酸至约5μM的D-氨基酸、约0.004μM的D-氨基酸至约
1μM的D-氨基酸、约0.005μM的D-氨基酸至约0.5μM的D-氨基酸、约0.01μM的D-氨基酸至约0.1μM的D-氨基酸、约0.02μM的D-氨基酸至约0.1μM的D-氨基酸，如，施用了0.005μM的D-氨基酸至50μM的D-氨基酸、0.001μM的D-氨基酸至25μM的D-氨基酸、0.002μM的D-氨基酸至10μM的D-氨基酸、0.003μM的D-氨基酸至5μM的D-氨基酸、0.004μM的D-氨基酸至1μM的D-氨基酸、0.005μM的D-氨基酸至0.5μM的D-氨基酸、0.01μM的D-氨基酸至0.1μM的D-氨基酸、0.02μM的D-氨基酸至0.1μM的D-氨基酸。优选的情况下以纳摩尔浓度施用D-氨基酸，例如，以约5nM、以约10nM、以约15nM、以约20nM、以约25nM、以约30nM、以约50nM或更高浓度，或更优选地以5nM、以10nM、以15nM、以20nM、以25nM、以30nM或以50nM的浓度。

[0126] 在其它情况下，D-氨基酸的治疗有效量或剂量可以是约0.001mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，例如，约0.01mg/kg体重至约50mg/kg体重、约0.025mg/kg体重至约
25mg/kg体重、约0.1mg/kg体重至约20mg/kg体重、约0.25mg/kg体重至约20mg/kg体重、约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重、约0.5mg/kg体重至约10mg/kg体重、约1mg/kg体重至约10mg/kg体重，或是约5mg/kg体重，优选地是0.001mg/kg体重至100mg/kg体重的范围，例如，0.01mg/kg体重至50mg/kg体重、0.025mg/kg体重至25mg/kg体重、0.1mg/kg体重至20mg/kg体重、0.25mg/kg体重至20mg/kg体重、0.5mg/kg体重至20mg/kg体重、0.5mg/kg体重至10mg/kg体重、1mg/kg体重至10mg/kg体重，或是5mg/kg体重。

[0127] 医师应当了解特定的因素可影响有效地治疗受试者所需的剂量，所述因素包括但不限于所述疾病或失调的严重程度、此前的治疗、所述受试者的基本健康和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，使用治疗有效量的D-氨基酸对受试者的治疗可包括单次治疗或一系列的治疗。在一个实例中，使用处于约0.06mg至约120mg范围内的D-氨基酸治疗受试者，每周一次持续约1至10周，或者持续2至8周、持续约3至7周或持续约4、5或6周，或优选地使用0.06mg至120mg的D-氨基酸，每周一次持续1至10周，或者持续2至8周、持续3至7周或持续4、5或6周。应当了解用于治疗的D-氨基酸的有效量可在特定治疗期间提高或降低。

[0128] 所述医药组合物可以与施用说明书一同被包含于容器、包装或分配器中。本领域的普通技术人员应当了解本文所述的医药组合物可被配制成为单次剂量药瓶。

[0129] 使用本文所述的治疗有效量的含D-氨基酸医药组合物对受试者的治疗可以是单次治疗、连续治疗或分成多次剂量的系列治疗。所述治疗可包括单次施用、在一年或多年间的连续施用或定期施用。在一些情况下可能需要持久的长期施用。通常以足以抑制或降低或消除本文所述的生物薄膜相关失调或病状的不良效果或症状的量施用各制剂。

[0130] D-氨基酸适合作为个人护理制备物中的抗生物薄膜活性物质，所述个人护理制备物例如洗发剂、洗浴添加剂、护发制备物、液体和固体肥皂(基于合成的表面活性剂和饱和和/或不饱和脂肪酸)、洗剂和乳霜、除臭剂、其它水溶液或醇溶液，如皮肤清洗溶液、除温织物、油或粉末。生物薄膜中可存在痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，其为痤疮中的主要微生物。因此，D-氨基酸特别地适用于个人护理组合物以用于控制痤疮。本发明因此还涉及个人护理制备物，其包含本文所述的一种或多种D-氨基酸以及美容上可容许的载体或辅助剂。

[0131] 本文所述的D-氨基酸还适用于向个人护理中使用的多种制剂提供抗生物薄膜特性。个人护理制备物可包含基于所述制备物总重的约0.01重量％至约15重量％的一种或多种D-氨基酸，例如，约0.1重量％至约10重量％或0.01重量％至15重量％一种或多种D-氨基酸，如0.1重量％至10重量％的一种或多种D-氨基酸，以及美容上可容许的辅助剂。根据所述个人护理制备物的形式，除一种或多种D-氨基酸之外这些制备物还可包含进一步的组分，例如螯合剂、着色剂、芳香油类、增稠或固化剂(稠度调节物)、润肤剂、UV吸收剂、护肤剂、抗氧化剂、改善所述机械特性的添加剂，诸如二羧酸和/或C14-C22脂肪酸的铝、锌、钙或镁盐，以及任选地包含防腐剂。

[0132] 在一个实施方案中，包含D-氨基酸的抗痤疮组合物可进一步包含至少一种抗微生物药物。所述抗微生物药物优选地是抗生素。所述抗生素可选自由妥布霉素(tobramycin)、克林霉素(clindamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、四环素、利福平(rifampin)、三氯生、氧氟沙星(oxfloxacin)、大环内酯类、青霉素、头孢菌素类、阿莫西林(amoxicillin)/克拉维酸盐(clavulante)、奎奴普丁(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)、阿莫西林(amoxicillin)/舒巴坦钠(sulbactum)、甲硝唑(metronidazole)、氟喹诺酮类(fluoroquinolone)、喹诺酮类(quinolone)、酮内酯类或氨基糖甙类所组成的组。本发明提供了用于控制痤疮的方法，其包括向患痤疮的受试者施用有效量的抗痤疮组合物，所述组合物包含一种或多种D-氨基酸，其中所述抗痤疮组合物中的D-氨基酸量足以预防、减少、抑制或除去生物薄膜。

[0133] 个人护理制备物可以是油包水或水包油的乳液、醇类或含醇制备物、离子或非离子两亲脂的囊泡分散液、凝胶、固体棒或气溶胶制备物的形式。作为油包水或水包油的乳液，所述美容上可容许的辅助剂优选地包含约5％至约50％的油相、约5％至约20％的乳化剂和约30％至90％的水，或5％至50％的油相、5％至20％的乳化剂和30％至90％的水。所述油相可包含适用于美容制剂的任意油类，例如一种或多种烃油、蜡、天然油、硅油、脂肪酸酯或脂肪醇。优选的单元醇或多元醇是乙醇、异丙醇、丙二醇、己二醇、甘油和山梨醇。

[0134] 本文所述的美容制剂被用于多种领域。这些制备物包括但不限于，例如：

[0135] —护肤制备物，如块状或液体肥皂、合成去污剂或洗膏形式的皮肤洗涤和清洁制备物，

[0136] —洗浴制备物，如液体(泡沫浴露、洗浴奶、淋浴制备物)或固体洗浴制备物，如浴皂和浴盐；

[0137] —护肤制备物，如皮肤乳液、复方乳液或润肤油；

[0138] —美容个人护理制备物，如日霜或粉霜、扑面粉(松散或压实)形式的面部化妆品，胭脂或霜膏化妆品，眼部护理制备物如眼影制备物、染眉油、眼线膏、眼霜或眼部修护霜；唇部护理制备物，如唇膏、唇彩、唇线笔，甲部护理制备物，诸如甲油、除甲油剂、甲硬化剂或去角质油；

[0139] —私密部位卫生制备物，如私密部位清洗乳液或私密部位喷剂；

[0140] —足部护理制备物，如足浴液、足部粉末、足霜或足部香膏、特别除臭剂和止汗剂或去茧制备物；

[0141] —光照保护制备物，诸如日光奶、乳液、霜剂或油，遮光物或热带用品、预晒制备物或晒后制备物；

[0142] —仿晒肤制备物，如仿晒霜；

[0143] —褪色制备物，如用于漂白皮肤的制备物或皮肤亮化制备物；

[0144] —驱虫剂，如驱虫油、乳液、喷剂或贴；

[0145] —除臭剂，诸如除臭喷剂、泵出式喷剂、除臭凝胶、除臭贴或滚搽式除臭剂；

[0146] —止汗剂，如止汗贴、止汗霜或滚搽式止汗剂；

[0147] —用于清洁或护理疤痕皮肤的制备物，如合成去污剂(固体或液体)、剥离或刮擦制备物或剥离贴；

[0148] —化学形式的除毛发制备物(脱毛)，如脱毛粉、液体脱毛制备物、霜剂或膏剂形式的脱毛制备物，凝胶形式或气溶胶泡沫形式的脱毛制备物；

[0149] —剃须制备物，如剃须皂、发泡剃须膏、无泡剃须膏、泡沫或凝胶、用于干燥剃须的须前制备物、须后水或须后乳液；

[0150] —芳香制备物，如香水(古龙水(eau de Cologne)、淡香水(eau de toilette)、香水(eau de parfum)、淡香水(parfum de toilette)、香水(perfume))、芳香油或香膏；

[0151] —牙科护理，假牙护理和口腔护理制备物，如牙膏、凝胶牙膏、牙粉、漱口液浓缩物、抗牙石漱口液、假牙清洗剂或假牙固定剂；

[0152] —美发处理制备物，如洗发剂和护发素形式的洗发制备物、护发制备物，如预处理制备物、整发液、定型膏、定型胶)、润发油、洗发液、护发液、深度护发液，发型制备物，如用于永久性卷发的卷发制备物(热卷发、温卷发、冷卷发)、直发制备物、液体发定型制备物、美发造型泡沫、造型喷剂，漂白制备物，如过氧化氢溶液、亮发洗发剂、漂白霜、漂白粉、漂白膏或漂白油，短时、半永久或永久染发剂，包含自发氧化染料的制备物或天然染发剂，如散沫花染剂或甘菊染剂。

[0153] 以下为可经制备以包含一种或多种D-氨基酸的制剂的非限制性实例。本领域中已知大量多种类似的制剂，所述制剂中可容易地以多种浓度并入一种或多种D-氨基酸。

[0154] 示例性的肥皂包含，例如，下列组合物：0.01重量％至5重量％的一种或多种D-氨基酸、0.3重量％至1重量％的二氧化钛、1至10重量％的硬脂酸，加肥皂基至100重量％，如牛脂酸或椰油脂肪酸的钠盐或甘油。

[0155] 示例性的洗发剂包含，例如，下列组合物：0.01重量％至5重量％的一种或多种D-氨基酸、12.0重量％的月桂醇聚醚-2-硫酸钠、4.0重量％的椰油酰胺丙基甜菜碱、3.0重量％的NaCl并且加水至100％。

[0156] 示例性的除臭剂包含，例如，下列组合物：0.01重量％至5重量％的一种或多种D-氨基酸、60重量％的乙醇、0.3重量％的芳香油且加水至100％。

[0157] 在一些情况下施用D-氨基酸医药组合物以在生物相关表面或底物上预防或减少生物薄膜形成。这些表面包括但不限于，呼吸道、肺、口腔、食道或阴道、耳内或眼睛表面以及尿路的上皮或粘膜表面。例如，生物薄膜可影响肺(诸如患有肺炎、囊性纤维化或COPD的受试者的肺)表面，诸如肺上皮细胞。

[0158] 在特定的实施方案中，所述表面是生物相关表面，其为有可能接触生物体液的表面，如受试者的液体组分，诸如血液、血清、痰液、泪腺分泌物、精液、尿液、阴道分泌物和组织样品等。所述生物相关表面可以是医疗器械、设备或植入物的组件。非限制性实例包括钳、镊、剪刀、皮肤钩、管材(气管内或胃肠道管材)、针头、牵引器、刮器、钻头、凿具、锉、锯、包括留置导管(诸如导尿管、血管导管、腹膜透析管、中心静脉导管)、导管组件(诸如针头、Leur-Lok接头、无针接头)在内的导管、整形器械、人造心脏瓣膜、假关节、发声假体、支架、分流器、起搏器、手术用针、呼吸机、通风设备和内窥镜。本发明尤为良好地适用于实质上降低适于长期植入的医疗器械表面的生物薄膜积累风险，其中所述医疗器械被用于保持植入约30天至约12个月或更久的相对较长时间，并且降低由于这些生物薄膜的覆盖和闭塞所导致的所述器械过早失效的可能性。但是，该覆盖可在较短时间(诸如30天或更短)后在医疗器械上发生，并且所述医疗器械也应被认为是用于长期植入的器械。例如，在特定的实施方案中，用于长期时间的医疗器械可被植入超过24小时的时间，诸如一周。

[0159] 在特定的情况下，可在植入/插入医疗器械、导管、支架或假体等或应用伤口敷料之前、期间或之后或对受试者施用D-氨基酸。在一些情况下，所述伤口敷料包含抗微生物剂，诸如银。植入前或植入后的处理可在所述植入之前或之后立即进行，或者植入前或植入后数小时进行，或在技术医师认为适当的时间进行。

[0160] 可通过任意已知方式将D-氨基酸应用于表面，诸如使用治疗量的D-氨基酸对所述表面进行覆盖、涂布、接触、结合、填充或加载。在特定的实例中，通过使用聚合物/D-氨基酸薄膜对所述表面喷洒、通过将所述表面浸入聚合物/D-氨基酸溶液或通过其它共价或非共价方法将D-氨基酸直接附着于表面。在其它的情况下，使用吸附所述D-氨基酸的物质(诸如水凝胶)涂布所述表面。

[0161] 所述组合物可以是涂层或薄膜。当作为薄膜或涂层的一部分被应用时，本文所述的一种或多种D-氨基酸可以是组合物的一部分，所述组合物还包含粘合剂。所述粘合剂可以是相容于本抗生物薄膜物质的任意聚合物或寡聚物。所述粘合剂在所述抗生物薄膜组合物制备前可以是聚合物或寡聚物形式，或者通过在制备期间或制备后的多聚化而形成，所述制备后多聚化包括在对所述底物应用之后的多聚化。在特定的应用中，诸如特定的涂布应用，在应用后对所述抗生物薄膜组合物的寡聚物或多聚物进行交联是理想的。本文所使用的术语“粘合剂”包括商业上被用于所述制药和个人护理行业中的物质，诸如二元醇类、油类、蜡和表面活性剂。使用公认安全(G.R.A.S.)的物质是优选的。

[0162] 当所述组合物是通过，例如，使用胶粘剂或包括压延和共挤压在内的熔融应用而被用于表面的热塑性薄膜时，所述粘合剂是用于制备所述薄膜的热塑性聚合物基质。当所述组合物是涂层时，其可作为液体溶液或混悬液、膏体、凝胶、油类而应用，或所述涂布组合物可以是固体，例如粉末涂层，其随后通过加热、UV照射或其它方法而固化。

[0163] 因为本发明的组合物可以是涂层或薄膜，所述粘合剂可以包含用于涂布制剂或薄膜制备物的任意聚合物。例如，所述粘合剂是热固性、热塑性、弹性体的、固有交联或交联的聚合物。热固性、热塑性、弹性体的、固有交联或交联的聚合物包括聚烯烃、聚酰胺、聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚酯、卤化乙烯聚合物如PVC、天然和合成橡胶、醇酸树脂、环氧树脂、不饱和聚酯、不饱和聚酰胺、聚酰亚胺、含硅和氨基甲酸酯聚合物、氟化聚合物、源自取代丙烯酸酯的可交联丙烯酸树脂，如源自环氧丙烯酸酯、聚氨酯丙烯酸酯或聚酯丙烯酸酯。所述聚合物还可以是前述化学品的混合物和共聚物。

[0164] 生物相容性涂布聚合物如聚[-烷氧基链烷酸酯-共-3-羟基烯酸酯](PHAE)聚酯 (poly[-alkoxyalkanoate-co-3-hydroxyalkenoate](PHAE)polyesters)，Geiger 等，Polymer Bulletin 52，65-70(2004)也可在本发明中作为粘合剂。醇酸树脂、聚酯、聚氨酯、环氧树脂、含硅酮聚合物、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、氟化聚合物和乙酸乙烯酯、乙烯醇和乙烯胺聚合物是有用于本发明的常见涂布粘合剂的非限制性实例。其它已知涂布粘合剂是本申请的一部分。

[0165] 可以使用，例如，三聚氰胺树脂、尿素树脂、异氰酸酯、异氰尿酸酯、聚异氰酸酯、环氧树脂、酐类、多元酸和胺在使用或不使用加速剂的情况下使涂层交联。本文所述的组合物可以是，例如，应用于表面的涂层，所述表面暴露于利于生物积累的条件。本文所述的一种或多种D-氨基酸在所述涂层中的存在可预防生物体对所述表面的附着。

[0166] 所述涂层可以是溶剂型或含水的。一般认为含水涂层更为环保。在一些实例中，所述涂层可以是本文所述的一种或多种D-氨基酸和粘合剂的含水分散液或是水基涂层或涂料。例如，所述涂层可包含一种或多种D-氨基酸与丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺聚合物或共聚物或聚[-烷氧基链烷酸酯-共-3-羟基烯酸酯]聚酯的含水分散液。

[0167] 在一些情况下，可通过任意常规方法将所述涂布组合物应用于表面，所述方法包括旋转式涂布、浸泡式涂布、喷雾式涂布、刮涂(draw down)或通过毛刷、滚筒或其它应用设备进行。可进行干燥或固化过程。

[0168] 涂层或薄膜厚度可根据所述应用而变，并且本领域的技术人员在进行有限的测试后可容易地对其测定。

[0169] 在一些情况下，本文所述的组合物可以是保护性压膜的形式。这样的膜可包含热固性、热塑性、弹性体的或交联的聚合物。这些聚合物的实例包括但不限于，聚烯烃、聚酰胺、聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚酯、卤化乙烯聚合物如PVC、天然和合成橡胶、醇酸树脂、环氧树脂、不饱和聚酯、不饱和聚酰胺、聚酰亚胺、氟化聚合物、含硅和氨基甲酸酯聚合物。所述聚合物还可以是前述化学品的混合物和共聚物。

[0170] 当本文所述的组合物是预制膜时，其可通过，例如，使用胶粘剂而应用于表面或共挤压至所述表面。其还可通过紧固器进行机械附着，所述紧固器可能需要使用密封剂或弥缝泥，其中还可有利地使用本发明的酯类。还可通过加热应用塑料膜，所述加热应用包括压延、熔融应用和收缩包装。

[0171] 考虑到本文所述的D-氨基酸应用的广阔范围，包含D-氨基酸的组合物可包括其它添加剂，诸如抗氧化剂、UV吸收剂、受阻胺、亚磷酸盐或膦酸盐、苯并呋喃-2-酮、硫代协同剂、聚酰胺稳定剂、硬脂酸金属盐、成核剂、填料、增强剂、润滑剂、乳化剂、染料、着色剂、分散剂、其它光学增亮剂、阻燃剂、抗静电剂、起泡剂以及类似物质，诸如下文所列的物质，或它们的混合物。

[0172] 由塑料制备的医疗器械可在成形期间，如模塑期间，并入D-氨基酸。受益于本方法的基于塑料的医疗器械包括但不限于，用于医疗领域的塑料部件，如敷贴材料、注射器、导管等、所谓“医疗器械”、手套和褥垫。这些塑料制品的示例为聚丙烯、聚乙烯、PVC、POM、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚酰胺、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯类以及甲基丙烯酸类、聚丁二烯、热塑性聚烯烃、离子型聚合物、不饱和聚酯和包括ABS、SAN和PC/ABS在内的聚合物树脂的混合物。

[0173] 特别是在低浓度下的所述D-氨基酸可完全在可摄食的应用中，诸如可能出现生物薄膜的可再利用的水瓶或自动饮水器中被安全地使用。可以使用包含本文所述的一种或多种D-氨基酸的制剂清洗这些水转运器械的表面，或在流经管道容器的水中引入低水平的一种或多种D-氨基酸。例如，可向这些水中引入约0.0001重量％或更低或最高达1重量％的一种或多种D-氨基酸，一般为低于约0.1重量％。考虑到本发明D-氨基酸的高活性，在多种情况下极少的量是有效的，并且在这些应用中可使用约0.000001％至约0.1％的浓度，例如约0.000001％至约0.01％、或约0.000001％至约0.001％，或0.000001％至0.1％、0.000001％至0.01％或0.000001％至0.001％的浓度。

[0174] 当用于涂层或薄膜时，可存在少量的一种或多种D-氨基酸以用于短期用途，例如，一次性使用、周期性或可抛式物品，特别是涉及可能的人体接触、夹板、导管、管材、牙科设备等的应用。通常在这些涂层或薄膜中可使用约0.001重量％或更低最高达约5重量％的一种或多种D-氨基酸，例如最高达约3重量％或约2重量％，优选地可使用0.001重量％或更低最高达5重量％、最高达3重量％或2重量％的一种或多种D-氨基酸。考虑到本发明D-氨基酸的高活性，在多种情况下极少的量是有效的，并且在涂布应用中可使用约0.0001重量％至约1重量％的浓度，例如约0.0001重量％至约0.5重量％或约0.0001重量％至约0.01重量％的浓度，或优选地使用0.0001重量％至1重量％、0.0001重量％至0.5重量％或0.0001重量％至0.01重量％的一种或多种D-氨基酸。

[0175] 为进行向成型塑料部件中的并入，可使用约0.00001重量％至约10重量％的一种或多种D-氨基酸，例如约0.0001重量％至约3重量％，例如可使用约0.001重量％最高达约1重量％的一种或多种D-氨基酸，或者可优选地使用0.00001重量％至10重量％、0.0001重量％至30.001重量％最高达1重量％的一种或多种D-氨基酸。在将所述D-氨基酸浸渍进入已制备成型的部件或纤维的表面的情况下，在所述表面存在的D-氨基酸的实际量可取决于所述底物材料、所述浸渍用组合物的制剂以及所述浸渍步骤中所用的温度和时间。考虑到本发明D-氨基酸的高活性，在多种情况下极少的量是有效的，并且在塑料制品中可使用约0.0001重量％至约1重量％的浓度，例如约0.0001重量％至约0.1重量％或约0.0001重量％至约0.01重量％的浓度，或优选地使用0.0001重量％至1重量％、0.0001重量％至0.1重量％或0.0001重量％至0.01重量％的一种或多种氨基酸。

[0176] 可使用本领域中广为接受的技术测量使用D-氨基酸进行处理而生物薄膜中引起的抑制或降低。这些技术使人能够通过测量所述粘附生物材料的染色而估测细菌附着、能够使用显微方法对微生物进行体内观测或在所述生物薄膜内检测反应于毒性药剂的细胞死亡。随着处理之后，可对于由所述生物薄膜所覆盖的表面面积、厚度和粘稠度(例如，所述生物薄膜的完整度)而减少所述生物薄膜。生物薄膜分析的非限制实例包括微滴度平板生物薄膜分析、基于荧光的生物薄膜分析、根据Walker等，Infect.Immun.73：3693-3701(2005)的静态生物薄膜分析、气液交界面分析、菌落生物薄膜分析和Kadouri Drip-Fed生物薄膜分析 (Merritt等，(2005)Current Protocols in Microbiology
1.B.1.1-1.B.1.17)。可将这些分析用于测量D-氨基酸破坏或抑制生物薄膜形成的活性(Lew 等，(2000)Curr.Med.Chem.7(6)：663-72；Werner 等，(2006)Brief Funct.Genomic Proteomic 5(1)：32-6)。

[0177] 在其它的情况下，可通过测量细菌生长而对处理进行分析或通过在生物样品中测量生物薄膜形成细菌的密度而对处理进行定量。生物样品的非限制实例包括血液、血清、痰液、泪腺分泌物、精液、尿液、阴道分泌物和组织样品。还可通过胸部X光或肺功能测试(PFT)(例如，肺活量测定或用力呼气量(FEV1))测量细菌生长的减少。

[0178] 在其它情况下，在生物样品中，诸如在上文所述的生物样品中，可通过检测产生生物薄膜的细菌的抗原的存在而测量产生生物薄膜的细菌的存在或生长。例如，可将针对肺炎链球菌组分的抗体用于在患有生物薄膜相关病状或失调的受试者体内分析移生/感染，诸如通过在生物样品中分析链球菌属抗原的存在而进行。这些抗体可根据本领域中广为接受的方法产生或可商购(例如，获自Abcam，Cambridge，MA；Cell Sciences Canton，MA；Novus Biologicals，Littleton，CO；或GeneTex，San Antonio，TX)。

[0179] 可使用本领域中广为接受的技术确定使用D-氨基酸治疗生物薄膜相关失调的适当疗法。例如，可将使用哺乳动物的动物模型用于估测使用D-氨基酸进行治疗的效力。非限制性实例包括植入聚合物珠粒，例如，用于大鼠中的加载以所述D-氨基酸的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠粒，并且对其预防生物薄膜的能力进行估测。大鼠中的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠粒以及兔中的导管已经被用作为金黄色葡萄球菌的生物薄膜形成的动物模型。参见，例如，Anguita-Alonzo等，ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY，2007年7月，第2594-2596页和Beenken等，JOURNAL OF BACTERIOLOGY，2004年7月，第4665-4684页，其全部通过引用结合在此。

[0180] 组合疗法

[0181] 生物薄膜被非常普遍地被理解为附着于活体或非活体表面的活体和死亡微生物，特别是细菌与其细胞外多聚物质(EPS基质)形式的代谢物如多糖的聚集物。通常对浮游细胞表现出显著的生长抑制或致死效能的抗生物薄膜物质的活性相对于在生物薄膜中组织化的微生物被严重降低，例如，由于所述活性物质向所述生物基质中的不完全穿透所导致。

[0182] 在一些情况下，为处理生物薄膜或预防生物薄膜的形成，可将D-氨基酸单独施用或将其与第二种药剂组合施用，例如生物杀灭剂、抗生素或抗微生物剂。可将抗生素与D-氨基酸进行先后地或同步地共施用。例如，可配制本文所述的任意组合物以包含一种或多种D-氨基酸和一种或多种第二药剂。

[0183] 所述抗生素可以是本领域的普通技术人员所知的可抑制细菌生长或对其杀灭的任意化合物。抗生素的可用的非限制实例包括林可酰胺类抗生素(lincosamide)(克林霉素(clindomycin))；氯霉素类；四环类(诸如四环素、金霉素、地美环素(Demeclocycline)、美他环素(Methacycline)、多西环素(Doxycycline)、米诺环素(Minocycline))；氨基糖甙美(诸如庆大霉素(Gentamicin)、妥布霉素、奈替米星(Netilmicin)、阿米卡星(Amikacin)、卡那霉素(Kanamycin)、链霉素、新霉素)；β-内酰胺(诸如青霉素、头孢菌素类(cephalosporin)、亚胺培南(Imipenem)、氨曲南(Aztreonam))；糖肽类抗生素(诸如万古霉素(vancomycin))；多肽类抗生素(诸如杆菌肽)；大环内酯类(红霉素)、两性霉素；磺胺类(诸如磺胺、磺胺甲噁唑、酞磺醋胺、磺胺嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺西汀(Sulfacytine)、磺胺多辛(Sulfadoxine)、磺胺米隆(Mafenide)、对氨基苯甲酸、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(Trimethoprim-Sulfamethoxazole))；乌洛托品(Methenamin)；呋喃妥因(Nitrofurantoin)；非那吡啶(Phenazopyridine)；甲氧苄啶(trimethoprim)；利福平(rifampicin)；甲硝唑(metronidazole)；头孢唑林类(cefazolin)；林可霉素(Lincomycin)；大观霉素；莫匹罗星类(mupirocin)；喹诺酮类(诸如萘啶酸(Nalidixic Acid)、西诺沙星(Cinoxacin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、环丙沙星、甲氟哌酸(Perfloxacin)、氧氟沙星、依诺沙星(Enoxacin)、氟罗沙星(Fleroxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin))；新生霉素类；多粘菌素类；短杆菌肽类以及抗假单胞菌药物(antipseudomonals)(诸如羧苄西林(Carbenicillin)、卡茚西林(Carbenicillin Indanyl)、替卡西林(Ticarcillin)、阿洛西林(Azlocillin)、美洛西林(Mezlocillin)、哌拉西林(Piperacillin))或其任意盐类或变体。这些抗生素可商购，例如获自Daiichi Sankyo，Inc.(Parsipanny，NJ)、Merck(Whitehouse Station，NJ)、Pfizer(New York，NY)、Glaxo Smith Kline(Research Triangle Park，NC)、Johnson & Johnson(New Brunswick，NJ)、AstraZeneca(Wilmington，DE)、Novartis(East Hanover，NJ)和Sanofi-Aventis(Bridgewater，NJ)。所使用抗生素应取决于细菌感染的类型。

[0184] 此外已知的生物杀灭剂包括双胍、氯己定、三氯生、二氧化氯等。

[0185] 抗微生物剂的可用实例包括但不限于，羟基吡啶硫酮类，特别是锌复合体(ZPT)；Octopirox ；二羟基甲基二甲基乙内酰脲(Glydant )；甲基氯异噻唑啉酮/甲基异噻唑啉酮(Kathon CG )；亚硫酸钠；亚硫酸氢钠；咪唑烷基脲(Germall 115 ，重氮烷基脲(Germaill II )；苯甲醇；2-溴-2-硝基-1，3-丙二醇(Bronopol )；福尔马林(Formalin)(甲醛)；碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(Polyphase P100 )；氯乙酰胺；甲胺；甲基二溴戊二腈(1，2-二溴-2，4-二氰基丁烷或Tektamer )；戊二醛；5-溴-5-硝基-1，3-二氧杂环己烷(Bronidox )；苯乙醇；邻苯基苯酚/邻苯基苯酚钠；羟甲基甘氨酸钠(Suttocide A )；聚亚甲氧基双环噁唑烷(Nuosept C )；二甲氧烷；硫柳汞；二氯苄醇；克菌丹(Captan)；氯苯甘醚(Chlorphenenesin)；双氯酚；氯代丁醇；甘油月桂酸酯；卤代二苯醚；2，4，4′-三氯-2′-羟基二苯醚(Triclosan 或TCS)；2，2′-二羟基-5，5′-二溴二苯醚；酚类化合物；苯酚；2-甲基苯酚；3-甲基苯酚；4-甲基苯酚；4-乙基苯酚；2，4-二甲基苯酚；2，5-二甲基苯酚；3，4-二甲基苯酚；2，6-二甲基苯酚；4-正丙基苯酚；4-正丁基苯酚；4-正戊基苯酚；4-叔戊基苯酚；4-正己基苯酚；4-正庚基苯酚；单烷基和多烷基及芳香基卤代酚；对氯苯酚；甲基对氯苯酚；乙基对氯苯酚；正丙基对氯苯酚；正丁基对氯苯酚；正戊基对氯苯酚；仲戊基对氯苯酚；环己基对氯苯酚；正庚基对氯苯酚；正辛基对氯苯酚；邻氯苯酚；甲基邻氯苯酚；乙基邻氯苯酚；正丙基邻氯苯酚；正丁基邻氯苯酚；正戊基邻氯苯酚；叔戊基邻氯苯酚；正己基邻氯苯酚；正庚基邻氯苯酚；邻苄基对氯苯酚；o-苄基(Benxyl)-间甲基对氯苯酚；o-苄基-m；间二甲基对氯苯酚；邻苯乙基对氯苯酚；邻苯乙基间甲基对氯苯酚；
3-甲基对氯苯酚；3，5-二甲基对氯苯酚；6-乙基-3-甲基对氯苯酚；6-正丙基-3-甲基对氯苯酚；6-异丙基-3-甲基对氯苯酚；2-乙基-3，5-二甲基对氯苯酚；6-仲丁基-3-甲基对氯苯酚；2-异丙基-3，5-二甲基对氯苯酚；6-二乙基甲基-3-甲基对氯苯酚；6-异丙基-2-乙基-3-甲基对氯苯酚；2-仲戊基-3，5-二甲基对氯苯酚；2-二乙基甲基-3，5-二甲基对氯苯酚；6-仲辛基-3-甲基对氯苯酚；对氯间甲酚：对溴苯酚；甲基对溴苯酚；乙基对溴苯酚；正丙基对溴苯酚；正丁基对溴苯酚；正戊基对溴苯酚；仲戊基对溴苯酚；正己基对溴苯酚；环己基对溴苯酚；邻溴苯酚；叔戊基邻溴苯酚；正己基邻溴苯酚；正丙基-间二甲基邻溴苯酚；2-苯基苯酚；4-氯-2-甲基苯酚；4-氯-3-甲基苯酚；4-氯-3，5-二甲基苯酚；2，4-二氯-3，5-二甲基苯酚；3，4，5，6-四溴-2-甲基苯酚；5-甲基-2-戊基苯酚；
4-异丙基-3-甲基苯酚；对氯间二甲酚(PCMX)；氯代百里酚；苯氧基乙醇；苯氧基异丙醇；
5-氯-2-羟基二基苯甲烷；间苯二酚及其衍生物；间苯二酚；甲基间苯二酚；乙基间苯二酚；正丙基间苯二酚；正丁基间苯二酚；正戊基间苯二酚；正己基间苯二酚；正庚基间苯二酚；正辛基间苯二酚；正壬基间苯二酚；苯基间苯二酚；苄基间苯二酚；苯乙基间苯二酚；
苯丙基间苯二酚；对氯苄基间苯二酚；5-氯-2，4-二羟基二苯基甲烷；4′-氯-2，4-二羟基二苯基甲烷；5-溴-2，4-二羟基二苯基甲烷；4′-溴-2，4-二羟基二苯基甲烷；双酚化合物；2，2′-亚甲基双(4-氯苯酚)；2，2′-亚甲基双(3，4，6-三氯苯酚)；2，2′-亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)；双(2-羟基-3，5-二氯苯基)硫醚；双(2-羟基-5-氯苄基)硫醚；苯甲酸酯(对羟基苯甲酸酯)；羟苯甲酯；羟苯丙酯；羟苯丁酯；羟苯乙酯；羟苯异丙酯；羟苯异丁酯；羟苯苄酯；羟苯甲酯钠；羟苯丙酯钠；卤化对称二苯脲；3，4，4′-三氯对称二苯脲(Triclocarban 或TCC)；3-三氟甲基-4，4′-二氯对称二苯脲；3，3′，4-三氯对称二苯脲；氯己定及其二葡萄糖酸盐；双乙酸盐和双盐酸盐；十一烯酸；噻菌灵(thiabendazole)、海克替啶(Hexetidine)；盐酸聚六亚甲基双胍(Cosmocil )；银化合物诸如有机银盐或无机银盐，包括其制剂如JM Acticare 在内的氯化银，以及微化银颗粒。

[0186] 生物薄膜相关失调

[0187] 使用D-氨基酸的方法和治疗包括对生物薄膜形成的抑制和预防，甚至是或特别是在不抑制生物生长的情况下进行，并且还包括对已然形成的生物薄膜的破坏。

[0188] 可通过对所述受试者施用有效量的减少生物薄膜形成的D-氨基酸而在受试者体内治疗生物薄膜相关失调。细菌生长的减少指示所述受试者体内生物薄膜产生的减少或抑制。

[0189] 在一些情况下，D-氨基酸可通过减弱形成生物薄膜的细菌对表面的附着或通过增加细菌死亡而抑制或减少生物薄膜形成。本治疗方法可有用于生物薄膜相关失调或病症、或与微生物生物薄膜形成有关的医疗器械相关的感染的治疗。

[0190] 生物薄膜相关失调的非限制性实例包括中耳炎、前列腺炎、膀胱炎、支气管扩张、细菌性心内膜炎、骨髓炎、龋齿、牙周疾病、感染性肾结石、痤疮、军团病、慢性阻塞性肺病(COPD)和囊性纤维化。在一个特定的实例中，患有囊性纤维化的受试者在肺和消化道中表现出生物薄膜的积累。患有COPD诸如肺气肿和慢性支气管炎的患者表现出呼吸道的特征炎症，其中通过该呼吸道并且随后离开肺的气流被长期地阻塞。

[0191] 生物薄膜相关失调还可涵盖源自植入或插入器械的感染、医疗器械相关感染诸如来自胆道支架的感染、整形植入物感染和导管相关的感染(肾脏、血管、腹膜)。感染还可源自皮肤和/或软组织的完整受损之处的位点。非限制性实例包括皮炎、外周血管疾病的溃疡、烧伤和严重外伤。例如，革兰氏阳性细菌诸如肺炎链球菌可在这些组织中导致机会性感染。肺炎链球菌感染烧伤位点的能力，例如，由于皮肤的破损、灼烧相关的免疫缺陷和抗生素的选择而受到加强。受试者

[0192] 在一些情况下对受试者进行了治疗。受试者可以是哺乳动物，其包括但不限于，灵长类动物(如猴，诸如食蟹猕猴、黑猩猩和人)。受试者可以是非人动物，诸如鸟(如鹌鹑、鸡或火鸡)、家畜(如牛、山羊、马或绵羊)、宠物(如猫、犬或豚鼠、大鼠或小鼠)或实验动物(如用于失调的动物模型)。非限制典型受试者可以是人类婴儿、青春期前的儿童、青少年、成人或老年/高龄成人。

[0193] 在一些情况下，需要治疗的受试者可以是患有本文所述的一种或多种感染或失调的受试者。在一些情况下，所述受试者处于在生物相关表面之上或之内发展出生物薄膜的危险下，或者已经发展出这样的生物薄膜。这样的风险中的受试者可以是使用D-氨基酸进行治疗的候选者，所述治疗用于抑制生物薄膜产生相关失调/病症的发展或发作，或用于预防生物薄膜相关失调或病症的一个或多个症状的复发、发作或发展。这样的受试者可以携带未成熟生物薄膜，其对于技术人员是临床上显著的或可检测的，但其尚未完全形成。存在发展生物薄膜风险的受试者也可以是计划进行留置器械植入的受试者，诸如医疗器械的植入。发展生物薄膜的风险也可以是由于发展生物薄膜相关疾病的倾向(诸如与囊性纤维化有关的通道转运体突变的存在)所导致。在这些受试者中，生物薄膜相关失调可处于早期阶段，例如，尚未检测出细菌感染和/或生物薄膜形成。

[0194] 在特定的实例中，可将本文所述的方法用于在囊性纤维化患者的呼吸道中预防生物薄膜形成。可在无呼吸道细菌感染或在检测到细菌感染的情况下治疗这样的患者。

[0195] 本发明在下列实施例中被进一步描述，其并非限制描述于权利要求中的本发明范围。室温指的是20-25℃范围中的温度。实施例

[0196] 材料与方法

[0197] 菌株和培养基。将枯草杆菌NCIB3610及其衍生株在37℃下生长于Luria-Bertani(LB)培养基中或在23℃下生长于MSgg培养基中(Branda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：11621(2001))。固体培养基包含1.5％的Bacto琼脂。在适当的情况下加入以下浓度的抗生素用于枯草杆菌的生长。10μg每ml的四环素以及5μg每ml的红霉素，500μg每ml的大观霉素。

[0198] 本研究中使用的菌株：

[0199] 所有枯草杆菌均为NCIB 3610的衍生株，所述NCIB 3610是形成强生物薄膜的野生型菌株(Branda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：11621(2001))；

[0200] 菌株FC5(PepsA-lacZ cat)(Chu等，Mol.Microbiol.59：1216(2006))；

[0201] 菌株FC122(PyqxM-lacZ spec)(Chu等，Mol.Microbiol.59：1216(2006))；

[0202] 菌株IKG55(ΔracX::specΔylmE::tetR)；

[0203] 菌株DR-30(tasA-mCherry cat)；

[0204] 菌株IKG40(yqxM2)；

[0205] 菌株IKG44(yqxM6)；

[0206] 菌株IKG50(yqxM2 tasA-mCherry)；

[0207] 菌株IKG51(yqxM6 tasA-mCherry)；

[0208] 来自Kolter实验室收藏的金黄色葡萄球菌SC01。

[0209] 菌株构建。使用标准方法构建菌株(J.Sambrook，D.W.Russell，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA，2001))。使用长侧生PCR突变发生以创建ΔracX::spec和ΔylmE::tetR(Wach，Yeast 12：259(1996))。通过DNA介导的感受态细胞转化将DNA引入菌株PY79衍生株(Gryczan等，J.Bacteriol.134：318(1978))。使用SPP1噬菌体介导的转导以将来自PY79衍生株的抗生素抗性连锁的突变引入NCIB3610(Yasbin等，J.Virol.14：1343(1974))。

[0210] 试剂。氨基酸获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。14C-D-酪氨酸和14C-L-脯氨酸获自American Radiolabeled Chemicals，Inc(St.Louis，MO)。

[0211] 菌落和薄膜形成。对于固体培养基上的菌落形成，首先在LB液体培养基中将细胞生长至指数生长期并将3μl培养物涂布于包含1.5％Bacto琼脂的固体MSgg培养基土。在23℃下孵育所述平板。对于液体培养基中的薄膜形成，将细胞生长至指数生长期并在12孔平板(VWR)中将6μl培养物与6ml的培养基混合。在23℃下孵育平板。使用SPOT照相机(Diagnostic Instruments，USA)拍摄菌落和薄膜图像。

[0212] 制备条件化培养基。将细胞在LB培养基中生长至指数生长期。将0.1ml培养基加入100ml MSgg培养基中并且在23℃下在500ml烧杯内进行无振荡培养。下一步，通过在8,000rpm下进行15分钟离心而收集薄膜和条件化培养基。除去所述条件化培养基(上清液)并通过0.22μm滤器进行过滤。在4℃下储存所述滤过物。为进一步的纯化，在C-18 Sep Pak柱筒(cartridge)上使用0％至100％甲醇以5％增幅逐步洗脱而对生物薄膜抑制活性进行级分分离。

[0213] 所述条件化培养基中对D-氨基酸的鉴定和定量。(A)氨基酸定量。在不同浓度(0.001-0.2mM)下制备Tyr、Leu、Met和Trp的标准溶液。使用分步梯度溶剂系统通过LC/MS分析这些溶液，所述分步梯度溶剂系统为包含0.1％的甲酸的0％至60％随后至100％的CH3CN(0-12-20分钟)(Thermo Scientific Hypercarb 4.6mm×100mm，5μm)，用以通过离子计数整合(ion count integration)获得各氨基酸浓度的校准曲线。以相同的方式通过LC/MS分析条件化培养基样品以测量全部4种手性氨基酸的总浓度。(B)D-氨基酸的鉴定。在SpeedVac干燥所述样品并且将其溶解于100μl的1N NaHCO3中。在丙酮中制备10mg/mL的L-FDAA(N-(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺)溶液并将50μl所述丙酮溶液加入1N NaHCO3中的所述样品内。在80℃下孵育所述反应混合物5分钟并且加入50μl的2N HCl以淬灭所述反应。使用梯度溶剂系统通过LC/MS分析所述衍生物，所述梯度溶剂系统为包含0.1％的甲酸的在30分钟内从10％升至100％的CH3CN(Agilent 1200系列HPLC/6130系列MS，Phenomenex Luna C18，4.6mm×100mm，5μm)。将L-FDAA氨基酸的保留时间与L-FDAA-可信标准氨基酸进行比较。

[0214] 结晶紫染色。结晶紫染色根据先前描述而进行(O’Toole等，Mol.Microbiol.30：295(1998))，区别在于所述细胞生长于6孔平板中。使用500μl 1.0％的结晶紫对孔染色，使用2ml双蒸水清洗两次并彻底干燥。

[0215] 荧光显微法。为进行荧光显微分析而收集了1ml培养物。使用PBS缓冲液洗涤所述细胞并且将其悬浮于50μl的PBS缓冲液中。使用多聚L-赖氨酸(Sigma)预处理盖玻片。使用Olympus工作站BX61 显微镜检视样品。使用自动软件程序SimplePCI拍摄图像并使用程序MetaMorph(Universal Imaging Corporation)对其分析。

[0216] 透射电子显微法和免疫标记。使用蒸馏水稀释样品并将其吸附于碳或Formvar/碳涂布网格。通过在真空蒸发器中进行的辉光放电而使所述网格表面在用前具亲水性。一旦所述标本被吸附于所述薄膜表面，将过量的样品在滤纸(Whatman#1)上拭去并且将所述网格浮于5μl染液(1-2％的乙酸铀水溶液)之上数分钟并随后拭去。干燥所述样品并在TMTM 280KV的加速电压下在Tecnai G Spirit BioTWIN显微镜中检视所述样品。使用AMT 2k CCD照相机拍摄图像。

[0217] 对于TasA的免疫定位，将处于镍网格上的稀释样品浮于由PBS中的1％脱脂奶粉和0.1％Tween 20所组成的封闭缓冲液中30分钟，使用处于封闭缓冲液中以1∶150稀释的抗TasA一级抗体进行2小时孵育，在PBST中洗涤，随后将其暴露于山羊抗兔20nm金二级抗体(Ted Pella，Inc.，Redding，CA)1小时并进行清洗。全部网格使用乙酸铀和柠檬酸铅进行染色，随后根据上文所述进行观察。

[0218] β-半乳糖苷酶活性分析。在水浴中在37℃下将细胞振荡培养于MSgg培养基中。在各时间点采集1ml培养物。根据先前描述测定β-半乳糖苷酶活性(Chai等，Mol.Microbiol.67：254(2008))。

[0219] 氨基酸向所述细胞壁内的并入。通过离心收集50ml的处于指数生长期中期的培养物中的细胞，并且使用0.05M的磷酸缓冲液(pH 7)洗涤并将其重悬浮于5ml的相同缓冲14 14
液中。使用10μCi/ml的 C-D-酪氨酸或 C-L-脯氨酸处理细胞并进一步在37℃下孵育
2小时。对全细胞和细胞壁部分的放射性进行监测，并且以一定间隔除去样品。为对进入全细胞的并入进行测量而收集了0.1ml的样品。为对进入细胞壁的并入进行测量而收集了
0.5ml的样品。通过离心收集所述细胞并将其重悬浮于包含0.1mg/ml溶菌酶的SM缓冲液中[0.5M蔗糖、20mM MgCl2和10mM磷酸钾，pH(6.8)]。随后将所述细胞在37℃下孵育10分钟。下一步，通过在5000rpm下离心10分钟除去所产生的原生质体，将所述细胞壁物质保留于上清液中。使用抗sigma A抗体通过免疫印迹分析证实所述细胞壁部分中不含蛋白质。
最后，向所述金细胞样品和所述细胞壁物质中加入10ml 5％的三氯乙酸并将其保持于冰上至少30分钟。将所述TCA不可溶物质收集于Millipore滤器(0.22μm孔径，Millipore)并且使用5％的TCA洗涤。对所述滤器进行空气干燥并将其置于闪烁瓶内，并且使用闪烁计数器测定TCA不可溶物的每分钟计数。

[0220] 实施例1.在枯草杆菌的生物薄膜形成中对D-氨基酸的筛选

[0221] 在生物薄膜诱导培养基中孵育3天后枯草杆菌在长期培养物的气液交界面处形成厚膜(图1A)。但是，在额外的3至5天孵育后，所述薄膜失去其结构完整性(图1-B)。为研究成熟生物薄膜是否产生引发生物薄膜解体的因子而分析了当将条件培养基的浓缩和部分纯化的提取物加入新鲜培养基中时其对薄膜形成的效果。为此目的，将来自8天程度的培养物的条件化培养基应用于C18 Sep Pak柱。随后将来自所述柱的浓缩洗脱液加入新鲜接种的培养物中。对应于来自等体积条件化培养基的物质的25％的浓缩洗脱液的量足以防止薄膜形成(图1C)。作为对照，据观察使用来自3天程度培养物的条件化培养基而制备的浓缩洗脱液的加入对薄膜形成几乎无影响或无影响(图1D)。通过以逐步方式使用渐增浓度的甲醇洗脱所述柱筒而实现对所述因子的进一步纯化。使用40％甲醇进行的洗脱产生了在抑制薄膜形成中具高度活性的洗脱份(图1E)。然而，这种物质对细胞生长几乎无影响或无影响。所述生物薄膜抑制活性对于在100℃下的2小时加热和蛋白酶K处理具抗性(图1F)。

[0222] 针对在液体和固体培养基中抑制枯草杆菌的生物薄膜形成而筛选了D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸(图2A、5、6)。图2A示出了向孵育三天的处于生物薄膜诱导培养基中的新鲜接种的培养物内加入D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)、L-酪氨酸(7mM)或L-亮氨酸(8.5mM)对薄膜形成的影响。同对应的L-氨基酸相比较，D-酪氨酸和D-亮氨酸均表现出对生物薄膜生长的显著抑制。类似地，图5示出了包含补充以D-色氨酸(0.5mM)、D-甲硫氨酸(2mM)、L-色氨酸(5mM)或L-甲硫氨酸(5mM)的MSgg培养基的孔，使用菌株NCIB3610对其进行接种并孵育3天。仅仅所述D-氨基酸在抑制生物薄膜形成中具有活性。

[0223] 图6示出了包含补充以D-酪氨酸(3μM)或D-亮氨酸(8.5mM)的固体MSgg培养基的平板，使用菌株NCIB3610对其进行接种并孵育4天。D-酪氨酸和D-亮氨酸均抑制生物薄膜形成。

[0224] 同对应的L-氨基酸相比较，D-甲硫氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-亮氨酸均表现出对生物薄膜生长的显著抑制。与之对比，其它氨基酸的对应L-异构体和D-异构体，诸如D-丙氨酸和D-苯丙氨酸，在枯草杆菌的生物薄膜抑制分析中不具效力。

[0225] 下一步，测定了预防生物薄膜形成所需要的最低浓度(MIC指的是最低抑制浓度)。根据图2B中所示，个别D-氨基酸在其活性上有所变化，D-酪氨酸最具效力。D-甲硫氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸具有约1mM的MIC，而D-酪氨酸具有约100nM的MIC。引人注意的是，全部4种D-氨基酸的等摩尔量混合物特别地强效，其具有＜10nM的MBIC。因此，D-氨基酸协同地发挥作用。所述D-氨基酸不仅预防生物薄膜的形成，而且破坏了已经存在的生物薄膜。图2C示出了3天程度的培养物，所述培养物中已被加入无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸(3μM)或D-酪氨酸、D-色氨酸、D-甲硫氨酸和D-亮氨酸的混合物(各2.5nM)，随后进行8小时的进一步孵育。D-酪氨酸或所述4种D-氨基酸的混合物的加入在8小时期间内导致了薄膜的明显分裂。

[0226] D-氨基酸通过氨基酸消旋酶而产生，其为将这些氨基酸的α-碳立体中心从L-转化为D-型的酶(Yoshimura等，J.Biosci.Bioeng.96：103(2003))。与所述生物薄膜抑制因子是D-氨基酸的设想相一致的基因证据是通过ylmE和racX突变体而获得的，所述基因的预期产物与已知的消旋酶表现出序列相似性。单独的ylmE或racX的菌株突变体在薄膜解体上表现出中度延迟(数据未示出)。图7示出了NCIB3610(WT)和ylmE和racX双缺失突变体菌株(IKG155)，其生长于12孔平板内并孵育5天。所述假定消旋酶的双突变体细胞所形成的薄膜在解体上显著地延迟，这暗示了消旋酶活性被特别降低的菌株也表现出降低的抗生物薄膜性抑制。此外，与来自野生型的条件化培养基相对比，来自所述双突变体的条件化培养基在抑制生物薄膜形成中无效。图2D示出了来自所述野生型或ylmE和racX双突变体菌株(IKG55)的8小时程度培养物的条件化培养基的Sep Pak C-18柱浓缩洗脱液的效果，其中所述双突变体表现出显著的生物薄膜建立。

[0227] 下一步，测定了D-氨基酸是否在生物薄膜成熟期间产生以及其是否以足以导致成熟生物薄膜解体的丰度产生。因此，进行了LC/MS，随后使用在薄膜形成后的早期和晚期所采集的条件化培养基进行的Nα-(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(L-FDAA)衍生化而对所述D-氨基酸进行了鉴定。所述结果显示，在第6天D-酪氨酸(6μM)、D-亮氨酸(23μM)和D-甲硫氨酸(5μM)在抑制生物薄膜形成所需的浓度或更高的浓度下存在，但是在第3天以＜10nM的浓度存在，例如，以不足以抑制生物薄膜形成的水平存在。

[0228] 与所述条件化培养基类似，D-氨基酸并不抑制细胞生长，它们也不抑制所述基质操纵子eps和yqxM的表达(图8-9)。图8示出了D-氨基酸对细胞生长的效果。在包含D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)或所述4种D-氨基酸混合物(各2.5nM)的MSgg培养基中振荡生长细胞。在D-氨基酸处理的培养物中的细胞生长实质上与所述未处理样品相同。图9A示出了菌株FC122(携带PyqxM-lacZ)对PyqxM-lacZ的表达，并且9B图示出了菌株FC5(携带PepsA-lacZ)对PepsA-lacZ的表达，所述菌株在包含D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)或所述4种D-氨基酸混合物(各2.5nM)的MSgg培养基中振荡生长。此外，所述经D-氨基酸处理的样品的yqxM和eps表达实质上与所述未处理样品相同。

[0229] 此前有报道，D-氨基酸被并入所述细胞壁的肽聚糖组分的肽联桥(peptide cross14
bridge)中。为对此进行证实，将细胞生长于诱导生物薄膜的培养基中并将其与 C-D-酪
14
氨酸或 C-L-脯氨酸(10μCi/ml)在37℃下孵育2h。图3A示出了放射性D-酪氨酸向所
14 14
述细胞壁中的并入。通过使用 C-D-酪氨酸显示D-酪氨酸(而非 C-L-脯氨酸)并入了所述细胞壁。结果以向细胞中的总并入(对于L-脯氨酸为360,000cpm/ml并且对于D-酪氨酸为46,000cpm/ml)的百分比的形式给出。

[0230] 为研究并入所述细胞壁的D-氨基酸是否将TasA纤维从与所述细胞的锚定中解离，检测了TasA与所述荧光报告蛋自mCherry的功能性融合蛋白的定位。图3B示出了来自包含功能性TasA-mCherry翻译融合蛋白的细胞的总荧光。通过在D-酪氨酸(6μM)存在或不存在的情况下在生物薄膜诱导培养基中伴以振荡而将所述细胞生长至生长停滞期。根据图3B所示，使用D-酪氨酸的处理对于TasA-mCherry总积累几乎无影响或无影响。当通过离心洗涤所述细胞，将其重悬浮并随后通过荧光显微法检视时，发现未处理的细胞(通常成簇存在)受到TasA-mCherry的强烈染色。与之对比，经D-酪氨酸处理的细胞(大多不成簇)仅显示出低水平的荧光。使用D-亮氨酸以及使用4种D-氨基酸等摩尔量混合物获得了类似的结果。还可使用金标记的抗TasA抗体通过透射电子显微法分析未修饰TasA蛋白的定位。图3D通过电子显微法示出了TasA纤维的细胞结合。不使用(图像1和2)或使用(图像3-6)D-酪氨酸(0.1mM)对24小时程度的培养物进行另外12小时的孵育。通过使用抗TasA抗体进行的免疫金标记对TasA纤维染色，并且根据实施例中所述通过透射电子显微法将其显现。所述细胞是eps操纵子的突变体(Δeps)，因为胞外多糖的缺乏显著地改善了TasA纤维的成像。实箭头标出了纤维簇；空箭头标出了单个纤维。所述尺度条为500nM。在图像2、4和6的放大部分中的尺度条为100nm。图像1和2示出了结合于细胞的纤维簇，图像3、4和6示出了与细胞解离的单个纤维和簇，并且图像3-5示出了几乎无或无纤维物质的细胞。TasA纤维被发现锚定于未处理薄膜的细胞(图3D，图像1和2)。与之对比，使用D-酪氨酸处理12小时的细胞由大部分未受到TasA纤维染色的细胞与未锚定于细胞的游离TasA纤维或纤维聚集物的混合物组成(图3D，图像3-6)。不期望受理论的束缚，D-酪氨酸处理生物薄膜的机制之一可能是诱导了细胞的纤维脱离。

[0231] 通过D-酪氨酸抗性突变体的分离获得了D-氨基酸通过破坏TasA纤维对所述细胞的锚定而发挥作用的基因证据。图4A示出了在包含或不包含D-酪氨酸的固体(顶部图像)或液体(底部图像)生物薄膜诱导培养基中生长3天的细胞。在包含D-酪氨酸(图4A)或D-亮氨酸(数据未示出)的固体培养基上的生长期间所形成的平菌落上自发地出现了起皱的突起。重要的是，在包含全部4种活性D-氨基酸的平板上未出现这些突起。当被纯化后，这些自发突变体在D-酪氨酸或D-亮氨酸存在的情况下产生了起皱的菌落和薄膜。分离出多种这样的突变体并且其中大多数突变体包含所述yqxM操纵子中或其附近的突变。对2种突变进行了详细地检测并且发现其为所述长度为759个碱基对的yaxM基因
3′末端附近的移框突变。yqxM2是在所述yqxM开放读码框的第728碱基对位置的一个G:C插入，并且yqxM6是在第568碱基对位置的一个A:T缺失(图4B)。图4B示出了YqxM的简写氨基酸序列。带下划线的是密码子所指定的残基，其中所述yqxM2和yqxM6移框突变在所述密码子处产生了所标明的序列变化。

[0232] 图3C通过荧光显微法示出了TasA-mCherry的细胞结合。根据说明通过在D-酪氨酸(6μM)存在或不存在(未处理)的情况下在生物薄膜诱导培养基中伴以振荡而将包含所述tasA-mCherry融合蛋白的野生型细胞和yqxM6(IKG51)突变体细胞生长至生长停滞期，在PBS中洗涤并且通过荧光显微法显现。荧光显微法显示yqxM2和yqxM6的存在使经D-酪氨酸处理的细胞回复了成簇化和TasA-mCherry对细胞的染色(图3C)。此前的研究已经显示YqxM为TasA与细胞的结合所需(Branda等，Mol.Microbiol.59：1229(2006))。不期望受理论的束缚，D-氨基酸的生物薄膜抑制效果可被YqxM的突变体所抵消的这一发现强化了D-氨基酸向所述细胞壁的并入的效果是破坏所述TasA纤维与所述细胞的锚定的观点。YqxM的C末端附近的结构域可能应对于D-酪氨酸或D-亮氨酸在细胞壁中的存在而引发TasA的释放。

[0233] 实施例2.在金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的生物薄膜形成中对D-氨基酸筛选[0234] 检测了D-氨基酸对其它细菌的生物薄膜形成的效果。所述病原性细菌金黄色葡萄球菌在塑料表面形成生物薄膜(Otto，Curr.Top.Microbiol.Immunol.322：207(2008))，其可通过洗去未结合细胞并且使用结晶紫对所述结合细胞进行染色而检测。图2E示出了已在37℃下在包含葡萄糖(0.5％)和NaCl(3％)的TSB培养基中生长于12孔聚苯乙烯平板内24小时的金黄色葡萄球菌(菌株SCO1)。另外向所述孔内加入了无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸(50μM)或D-氨基酸混合物(各15nM)。通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。图2E显示50μM浓度的D-酪氨酸和50nM浓度的混合D-氨基酸(D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸；各50nM)高度有效预防所述病原性细菌的生物薄膜形成。

[0235] 此外，图10显示10μM的D-酪氨酸有效预防绿脓杆菌的生物薄膜形成，而D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-甲硫氨酸的1μM等摩尔量混合物是有效的。图10示出了D-氨基酸对绿脓杆菌生物薄膜形成的抑制。在30℃下在12孔聚苯乙烯平板中将绿脓杆菌菌株P014在包含甘油(0.2％)和酪蛋白氨基酸(20μg/ml)的M63培养基中生长48小时。另外向所述孔内加入了无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸或所述D-氨基酸等摩尔量混合物。
通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。使用500μl 1.0％的结晶紫对孔染色，使用2ml双蒸水清洗两次并彻底干燥。

[0236] 实施例3.在对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌生物薄膜的抑制中具有活性的D-氨基酸混合物

[0237] 两种不同的混合物在对金黄色葡萄球菌生物薄膜的形成中非常具有活性。一种是D-酪氨酸、D-甲硫氨酸、D-亮氨酸和D-色氨酸的等摩尔量混合物。在全部受测的细菌菌株枯草杆菌、金黄色葡萄球菌(图11)和绿脓杆菌(图12)中，D-trp、D-met、D-tyr和D-leu的D-aa混合物在与单独氨基酸相比在显著更低的浓度下具有活性。对于表1中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是9
2×10cfu。对于表2中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard PA14，所述培养
9
基是M63并且所述细胞接种量是1.5×10cfu。使用所述结晶紫方法显现生物薄膜。所述数据在下文表1和2中示出：

[0238] 表1(图11的数据)

[0239]

[0240]

[0241] 表2(图12的数据)

[0242]

[0243]

[0244] D-酪氨酸、D-苯丙氨酸、D-脯氨酸的等摩尔混合物比上述混合物甚至更为有效。而且，所述混合物作为混合物与各个氨基酸单独相比更为有效(图13和14)。对于表3和
4中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细
9
胞接种量是2×10cfu。使用所述结晶紫方法显现生物薄膜。所述数据在表3和4中示出：

[0245] 表3(图13的数据)

[0246]

[0247] 表4(图14的数据)

[0248]

[0249]

[0250] 实施例4.对于金黄色葡萄球菌中的生物薄膜形成的替代性定量方法

[0251] 使用Gilson微量移液器完全除去浮游细胞，随后在纸巾上拍打。随后以黑色背景小心地拍摄所述生物薄膜平板的图像(图15和16)。对于表5和6中所报道的实验，所述9
生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是2×10cfu。
使用以黑色为背景的视图作为方法显现生物薄膜。所述数据在表5和6中示出：

[0252] 表5(图15的数据)

[0253]

[0254] 表6(图16的数据)

[0255]

[0256] 在表5和6中通过在PBS中的重悬浮而从上述平板中除去生物薄膜细胞，并且使用分光光度计测定它们的OD600(图17)。对于表7中所报道的实验，所述生物体/菌株是9
S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是2×10cfu。通过测量吸附细菌的OD600显现生物薄膜。所述数据在表7中示出：

[0257] 表7(图17的数据)

[0258]

[0259]

[0260] 实施例5.D-氨基酸对于金黄色葡萄球菌在环氧表面的生物薄膜形成的效果[0261] 为对开发D-氨基酸从不同表面的受控释放的方法的可能性进行检验，将环氧表面在D-氨基酸混合物中孵育24小时。将其完全地干燥并在使用金黄色葡萄球菌接种的新鲜的TSB培养基中孵育。对于表8和9中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是2×109cfu。使用以黑色为背景的视图显现生物薄膜。根据图18和19所示，D-aa混合物(如上文所述)在所述经浸泡底物上强烈地减少了金黄色葡萄球菌生物薄膜形成。所述数据在表8和9中示出：

[0262] 表8(图18的数据)

[0263]

[0264] 表9(图19的数据)

[0265]

[0266]

[0267] 此外，将Norland Optical Adhesive 61表面与D-酪氨酸、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸孵育24小时。将其完全地干燥并在使用金黄色葡萄球菌接种的新鲜的TSB培养基中孵育。所述D-aa混合物(但并非所述L-混合物)强烈地减少了金黄色葡萄球菌的生物薄膜形成。

[0268] 对于本实施例，聚合物底物通过UVO-114(Epoxy Technology)和Norland Optical Adhesive 61(Norland Products)UV可固化聚合物在聚二甲硅氧烷(SYLGARD 184，Dow Corning)中成型。

[0269] 实施例6.在绿脓杆菌中观测D-氨基酸对生物薄膜形成的效果的其它方法[0270] 与枯草杆菌类似，绿脓杆菌在限定培养基中形成复合结构。这些复合结构需要所述细胞外基质的适当形成和组装。D-酪氨酸(500μM)或D-色氨酸(500μM)的添加在绿脓杆菌中抑制限定培养基上的生物薄膜形成(图20)，而L-酪氨酸(500μM)和L-色氨酸的添加并不抑制。使用枯草杆菌获得了类似的结果。对于这些实验，所述生物体/菌株为9
P.a.Harvard PA14，所述培养基是M63并且所述细胞接种量是1.5×10cfu。

[0271] 在包含或不包含D-氨基酸的6孔平板上并且使用Syto-9染色观察生物薄膜形成的替代性方法如下：使用PBS洗涤绿脓杆菌生物薄膜2次并且将其在PBS中的5％戊二醛内固定至少1小时。随后使用PBS洗涤所述经固定的生物薄膜1次并将其在PBS中的0.1％v/vTriton X-100(PBST)内浸泡15分钟。使用冰冷PBST中的0.1nM SYTOX green(Invitrogen)替换所述溶液并在黑暗中轻柔地摇动至少15分钟。通过使用氙灯和K3 Leica滤镜的Leica DMRX复式显微镜捕获所述生物薄膜的荧光图像。根据图21所示，在D-酪氨酸存在下附着于所述生物薄膜平板底部的细胞数量存在强烈的下降。使用image J对附着的单细胞数量进行定量。与L-aa对照相比较，附着于使用D-aa浸泡的环氧表面的细胞数量的下降实质上更多。

[0272] 表10(图21的数据)

[0273]

[0274] 实施例7.D-氨基酸对于革兰氏阴性病原体的效果的估测

[0275] 为估测广谱抗生物薄膜活性的可能性，针对所述革兰氏阴性病原体奇异变形菌而测试了D-酪氨酸、D-苯丙氨酸和D-脯氨酸的强效等摩尔四重混合物。根据图22所示，所述D-aa混合物针对奇异变形菌具有活性。使用所述结晶紫方法显现表11中的生物薄膜。所述数据在表11中示出：

[0276] 表11(图22的数据)

[0277]

[0278]

[0279] 实施例8：D-氨基酸对于革兰氏阳性病原体的效果的估测

[0280] 为估测广谱抗生物薄膜活性的可能性，针对所述革兰氏阳性病原体变异链球菌而测试了D-酪氨酸、D-苯丙氨酸和D-脯氨酸的强效等摩尔四重混合物。根据图23所示，所述D-aa混合物针对变异链球菌具有活性。使用所述结晶紫方法显现表12中的生物薄膜。所述数据在表12中示出：

[0281] 表12(图23的数据)

[0282]

[0283] 涉及用于医疗器械的涂层的实施例

[0284] 实施例9：包含D-酪氨酸的涂层。

[0285] 将基于所述树脂固体重量的0.5重量％的D-酪氨酸并入双组分聚酯聚氨酯涂层，所述涂层基于可商购的聚酯多元醇和可商购的异氰尿酸酯。使用基于总树脂固体的0.015％二月桂酸二丁基锡催化所述涂布系统。

[0286] 通过刮涂于约4″×6″的透明玻片上直至约2mil(0.002″)的薄膜厚度而应用所述涂布制剂。

[0287] 在120℉(49℃)烘箱中将这些薄膜固化。

[0288] 实施例10：包含D-氨基酸混合物的聚合物

[0289] 根据美国专利第5,973,030号中的描述制备液体硅酮橡胶片。所述制剂中还包含0.01至1重量百分比的D-氨基酸混合物，其为1∶1∶1∶1比率的D-酪氨酸∶D-亮氨酸∶D-甲硫氨酸∶D-色氨酸。

[0290] 实施例11：包含D-氨基酸混合物的水基涂层

[0291] 以2mil的厚度将包含1重量百分比的D-氨基酸混合物的水基澄清丙烯酸工业涂布制剂涂布于玻片上，所述D-氨基酸混合物为1∶1∶1∶1比率的D-酪氨酸∶D-亮氨酸∶D-甲硫氨酸∶D-色氨酸。

[0292] 实施例12：包含D-氨基酸混合物的基于溶剂的涂层

[0293] 基于溶剂的聚氨酯涂层经制备而包含1重量百分比的D-氨基酸混合物，其为1∶1∶1∶1的D-酪氨酸∶D-亮氨酸∶D-甲硫氨酸∶D-色氨酸。将所述涂层以2mil的厚度应用于玻片上。

[0294] 实施例13：包含D-氨基酸混合物的UV可固化的水基涂层

[0295] 通过高速搅拌所述成分(见下表)而配制澄清的UV可固化水性工业涂层。

[0296]

[0297] 向所制备的制剂中加入比率为1∶1∶1∶1的D-酪氨酸∶D-亮氨酸∶D-甲硫氨酸∶D-色氨酸的D-氨基酸混合物，并在室温下以高切向速度(2000rpm)搅拌30分钟。出于比较目的，以相同的方式制备了不包含D-氨基酸的对照制剂。

[0298] 使用50μm狭缝涂布器(coater)将所述涂层应用于白色涂布的铝板上，在60℃下干燥10分钟并且使用两个中压汞汽灯(2×80W/cm)在5m/min下对其进行固化。

[0299] 实施例14：包含D-氨基酸混合物的基于溶剂的涂层

[0300] 根据以下程序制备了2种包装溶剂型聚氨酯涂层：

[0301] 将比率为1∶1∶1∶1的D-酪氨酸∶D-亮氨酸∶D-甲硫氨酸∶D-色氨酸的D-氨基酸混合物加入至所述粘合剂和溶剂中以作为漆浆(mill-base)制剂，并且将其在高切向速度下搅拌10分钟直至达到小于5μm的颗粒大小。

[0302] 漆浆制剂：

[0303]

[0304] 通过将组分A的成分混合并在最后于使用前加入组分B(参加下表)而制备所述涂布制剂。总制剂中的所述D-氨基酸的含量为0.1wt.％。

[0305]

[0306] 将各涂布制剂喷洒于白色涂布的铝板之上(于薄膜厚度：40μm)并且在80℃下干燥30分钟。

[0307] 涉及美容/个人护理制剂的实施例

[0308] 实施例15：油包水W/O典型制剂

[0309] 下列W/O乳液经制备而包含0.1％wt/wt的D-氨基酸混合物，其为1∶1∶1∶1比率的D-酪氨酸∶D-亮氨酸∶D-甲硫氨酸∶D-色氨酸。

[0310] W/O乳液：

[0311]

[0312]

[0313] 实施例16：水包油O/W典型制剂

[0314] 下列O/W乳液经制备而包含0.1％wt/wt的D-氨基酸混合物，其为1∶1∶1∶1比率的D-酪氨酸∶D-亮氨酸∶D-甲硫氨酸∶D-色氨酸。

[0315] O/W乳液

[0316]

[0317] 实施例17：金黄色葡萄球菌生物薄膜形成的体内抑制

[0318] 根据 Anguita-Alonso 等，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，51：2594(2007)中的描述进行了对D-氨基酸或两种或更多种D-氨基酸的组合的体内测试。

[0319] 实施例18：金黄色葡萄球菌生物薄膜形成的替代性体内抑制

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