新颖方法、多肽以及其用途
专利汇可以提供新颖方法、多肽以及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了产生具有丝 氨 酸蛋白酶活性的重组多肽的方法，通过这类方法可获得的多肽，以及所述多肽在医学、美容以及工业中的用途。详细地说，本发明提供了来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I的重组表达的突变体，这些突变体相对于从鳕鱼纯化的野生型胰蛋白酶展现改善的 稳定性 和/或催化特性。，下面是新颖方法、多肽以及其用途专利的具体信息内容。
1.一种产生具有丝氨酸蛋白酶活性的重组多肽的方法，其包括
(a)用编码包含融合至具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的N端的活化肽的酶原多肽的核酸分子转化微生物宿主细胞或其群体，
其中所述酶原多肽缺乏信号序列；
(b)将所述酶原多肽在所述宿主细胞中表达为包涵体；
(c)从所述宿主细胞纯化所述酶原多肽；以及
(d)通过暴露于蛋白酶，诸如胰蛋白酶活化所述酶原多肽，
其中步骤(c)包括从所述包涵体溶解所述酶原多肽并且将所述多肽再折叠成生物活性形式。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽展现胰蛋白酶活性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少70％序列一致性，例如至少80％、85％、
90％、95％、95％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列
16
I
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG
79
I
TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG
141
I
WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV
200
I
VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[SEQ ID NO:1]
或其展现抗微生物活性的片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽在位置25处不包含组氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3的氨基酸序列
16
I
IVGGYECTK SQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG
79
I
TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG
141
I
WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV
200
I
VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[SEQ ID NO:3]
或其展现抗微生物活性的片段。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽在位置160处不包含赖氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多
肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:4的氨基酸序列
16
I
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG
79
I
TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG
141
I
WGNTMSSVADGDKLQCLS PILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV
200
I
VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[SEQ ID NO:4]
或其展现抗微生物活性的片段。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的变体，其包含一个或多个选自由以下氨基酸位置组成的群组的突变氨基酸：
E21、H25、H29、V47、K49、D50、L63、H71、H72、R74、N76、T79、Y82、S85、S87、N98、I99、V121、M135、V138、M145、V148、D150、K154、L160、M175、S179、A183、L185、V212、Y217、P225、A229、V233、L234、V238、M242、N244和/或Y245，
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的变体，其包含一个或多个选自由以下组成的群组的突变氨基酸：
E21T、H25Y、H29(Y/N)、V47I、K49E、D50Q、L63I、H71D、H72N、R74(K/E)、N76(T/L)、T79(S/N)、Y82F、S85A、S87(K/R)、S89R、N98T、I99L、V121I、M135Q、V138I、M145(T/L/V/E/K)、V148G、D150S、K154(T/V)、L160(I/A)、M175(K/Q)、S179N、A183V、L185G、V212I、Y217(D/H/S)、P225Y、A229V、V233N、L234Y、V238I、M242I、N244S和/或Y245N，
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
10.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:2的变体，其包含一个或多个选自由以下氨基酸位置组成的群组的突变氨基酸：
E25、H29、H33、V49、K51、D52、L65、H72、H73、R75、N77、T80、Y83、S86、S88、N99、I100、V122、M134、V137、M144、V147、D149、K152、L158、M173、S177、A181、L184、V208、Y213、P221、A225、V229、L230、V234、M238、N240和/或Y241。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:2的变体，其包含一个或多个选自由以下组成的群组的突变氨基酸：
E25T、H29Y、H33(Y/N)、V49I、K51E、D52Q、L65I、H72D、H73N、R75(K/E)、N77(T/L)、T80(S/N)、Y83F、S86A、S88(K/R)、N99T、I100L、V122I、M134Q、V137I、M144(T/L/V/E/K)、V147G、D149S、K152(T/V)、L158(I/A)、M173(K/Q)、S177N、A181V、L184G、V208I、Y213(D/H/S)、P221Y、A225V、V229N、L230Y、V234I、M238I、N240S和/或Y241N。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：如表1或2中所定义的氨基酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQID NO:1的氨基酸：
(a)N244S、Y245N、S87K(“EZA-002”)；
(b)K154T(“EZA-003”)；
(c)K154L(“EZA-004”)；
(d)K154V(“EZA-005”)；
(e)K154E(“EZA-006”)；
(f)N98T(“EZA-007”)；
(g)I99L(“EZA-008”)；
(h)L185G、P225Y(“EZA-009”)；
(i)V212I(“EZA-0010”)；
(j)Y217D、M175K(“EZA-011”)；
(k)Y217H(“EZA-012”)；
(l)Y217S(“EZA-013”)；
(m)A229V(“EZA-014”)；
(n)H25Y(“EZA-015”)；
(o)H25N(“EZA-016”)；
(p)H29Y(“EZA-017”)；
(q)H71D(“EZA-018”)；
(r)H72N(“EZA-019”)；
(s)R74K(“EZA-020”)；
(t)R74E(“EZA-021”)；
(u)N76T(“EZA-022”)；
(v)N76L、Y82F(“EZA-023”)；
(w)T79S(“EZA-0024”)；
(x)T79N(“EZA-025”)；
(y)K49E、D50Q(“EZA-026”)；
(z)S87R(“EZA-027”)；
(aa)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；
(bb)S179N、V233N(“EZA-029”)；
(cc)M135Q(“EZA-030”)；
(dd)M145K、V148G(“EZA-031”)；
(ee)M175Q(“EZA-032”)；
(ff)L63I、S85A(“EZA-033”)；
(gg)L160I(“EZA-034”)；
(hh)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；
(ii)V121I(“EZA-036”)；
(jj)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；
(kk)V238I(“EZA-038”)；以及
(ll)L234Y(“EZA-039”)
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQID NO:1的氨基酸：
(a)H25N、N76T
(b)H25N、H29Y
(c)H25N、M135Q
(d)H29Y、T79N、M135Q
(e)I99L、V121I、L160I、Y217H
(f)V121I、L160I
(g)H72N、R74E、S87K
(h)H25N、M135Q、Y217H
(i)T79N、V121I、V212I
(j)H29Y、N76T、I99L、M135Q
(k)K49E、D50Q、N76L、Y82F、S179N、V233N
(l)M145K、V148G、N76L、Y82F、S179N、V233N
(m)H25N、N76T、S87K、K154T
(n)H25Q
(o)H25D
(p)H25S
(q)K24E、H25N
(r)Y97N
(s)N100D
(t)A120S、A122S
(u)M135E
(v)V204Q、A122S
(w)T79D
(x)R74D
(y)K49E
(z)K49S、D50Q
(aa)D50Q
(bb)Q178D
(cc)S87R
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：天然存在的丝氨酸蛋白酶的氨基酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述活化肽包含以下或由以下组成：
选自下列群组的氨基酸序列：
(a)MEEDK [SEQ ID NO:5]；
(b)MTEEDK [SEQ ID NO:6]；
(c)MFAEEDK [SEQ ID NO:7]；
(d)MVFAEEDK [SEQ ID NO:8]；
(e)MAFAEEDK [SEQ ID NO:9]；以及
(f)MGAVFAEEDK [SEQ ID NO:10]。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中所述编码胰蛋白酶原多肽的核酸分子处于适合于在大肠杆菌中使用的表达载体中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述表达载体是E3。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中所述宿主细胞是细菌宿主细胞(诸如大肠杆菌和假交替单胞菌)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在步骤(a)中所述宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞(诸如BL21(E3)、BL21(DE3)、BL21Star(DE3)、ArcticExpress(DE3)以及HMS174细胞)。
22.根据权利要求20所述的方法，其中在步骤(a)中所述宿主细胞是菌株
ArcticExpress(DE3)的大肠杆菌宿主细胞。
23.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中所述宿主细胞是酵母宿主细胞(诸如巴斯德毕赤酵母)。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中将所述多肽再折叠成生物活性形式包括使所述多肽与PBS/甘油缓冲液接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述PBS/甘油缓冲液是1xPBS，10％甘油，pH
7.4。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中无自体蛋白水解抑制剂存在(诸如苯甲脒)。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中大西洋鳕鱼胰蛋白酶用于活化所述酶原多肽。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中产生的所述活化多肽的比活性是至少20U/mg，例如至少30U/mg、40U/mg、50U/mg或至少60U/mg。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中产生的所述活化多肽的数量是至少0.1mg，例如至少0.5mg、1mg、2mg、3mg、5mg或10mg。
30.一种具有丝氨酸蛋白酶活性的分离多肽，其通过根据前述权利要求中任一项所述的方法可获得。
31.根据权利要求30所述的分离多肽，其中所述多肽展现胰蛋白酶活性。
32.根据权利要求30或31所述的分离多肽，其中所述多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少70％序列一致性，例如至少80％、85％、90％、95％、
95％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或其展现抗微生物活性的片段。
33.根据权利要求32所述的分离多肽，其中所述多肽在位置25处不包含组氨酸。
34.根据权利要求33所述的分离多肽，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其展现抗微生物活性的片段。
35.根据权利要求32所述的分离多肽，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽在位置
160处不包含赖氨酸。
36.根据权利要求35所述的分离多肽，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或其展现抗微生物活性的片段。
37.根据权利要求30至36中任一项所述的分离多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO:1的变体，其包含一个或多个选自由以下氨基酸位置组成的群组的突变氨基酸：
E21、H25、H29、V47、K49、D50、L63、H71、H72、R74、N76、T79、Y82、S85、S87、S89、N98、I99、V121、M135、V138、M145、V148、D150、K154、L160、M175、S179、A183、L185、V212、Y217、P225、A229、V233、L234、V238、M242、N244和/或Y245，
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
38.根据权利要求37所述的分离多肽，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的变体，其包含一个或多个选自由以下组成的群组的突变氨基酸：
E21T、H25Y、H29(Y/N)、V47I、K49E、D50Q、L63I、H71D、H72N、R74(K/E)、N76(T/L)、T79(S/N)、Y82F、S85A、S87(K/R)、S89R、N98T、I99L、V121I、M135Q、V138I、M145(T/L/V/E/K)、V148G、D150S、K154(T/V)、L160(I/A)、M175(K/Q)、S179N、A183V、L185G、V212I、Y217(D/H/S)、P225Y、A229V、V233N、L234Y、V238I、M242I、N244S和/或Y245N，
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
39.根据权利要求30至37中任一项所述的分离多肽，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:2的变体，其包含一个或多个选自由以下氨基酸位置组成的群组的突变氨基酸：
E25、H29、H33、V49、K51、D52、L65、H72、H73、R75、N77、T80、Y83、S86、S88、N99、I100、V122、M134、V137、M144、V147、D149、K152、L158、M173、S177、A181、L184、V208、Y213、P221、A225、V229、L230、V234、M238、N240和/或Y241。
40.根据权利要求39所述的分离多肽，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:2的变体，其包含一个或多个选自由以下组成的群组的突变氨基酸：
E25T、H29Y、H33(Y/N)、V49I、K51E、D52Q、L65I、H72D、H73N、R75(K/E)、N77(T/L)、T80(S/N)、Y83F、S86A、S88(K/R)、N99T、I100L、V122I、M134Q、V137I、M144(T/L/V/E/K)、V147G、D149S、K152(T/V)、L158(I/A)、M173(K/Q)、S177N、A181V、L184G、V208I、Y213(D/H/S)、P221Y、A225V、V229N、L230Y、V234I、M238I、N240S和/或Y241N。
41.根据权利要求30至40中任一项所述的分离多肽，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：如表1或2中所定义的氨基酸序列。
42.根据权利要求30至41中任一项所述的分离多肽，其包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：
(a)N244S、Y245N、S87K(“EZA-002”)；
(b)K154T(“EZA-003”)；
(c)K154L(“EZA-004”)；
(d)K154V(“EZA-005”)；
(e)K154E(“EZA-006”)；
(f)N98T(“EZA-007”)；
(g)I99L(“EZA-008”)；
(h)L185G、P225Y(“EZA-009”)；
(i)V212I(“EZA-0010”)；
(j)Y217D、M175K(“EZA-011”)；
(k)Y217H(“EZA-012”)；
(l)Y217S(“EZA-013”)；
(m)A229V(“EZA-014”)；
(n)H25Y(“EZA-015”)；
(o)H25N(“EZA-016”)；
(p)H29Y(“EZA-017”)；
(q)H71D(“EZA-018”)；
(r)H72N(“EZA-019”)；
(s)R74K(“EZA-020”)；
(t)R74E(“EZA-021”)；
(u)N76T(“EZA-022”)；
(v)N76L、Y82F(“EZA-023”)；
(w)T79S(“EZA-0024”)；
(x)T79N(“EZA-025”)；
(y)K49E、D50Q(“EZA-026”)；
(z)S87R(“EZA-027”)；
(aa)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；
(bb)S179N、V233N(“EZA-029”)；
(cc)M135Q(“EZA-030”)；
(dd)M145K、V148G(“EZA-031”)；
(ee)M175Q(“EZA-032”)；
(ff)L63I、S85A(“EZA-033”)；
(gg)L160I(“EZA-034”)；
(hh)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；
(ii)V121I(“EZA-036”)；
(jj)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；
(kk)V238I(“EZA-038”)；以及
(ll)L234Y(“EZA-039”)
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
43.根据权利要求30至42中任一项所述的分离多肽，其包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：
(a)H25N、N76T
(b)H25N、H29Y
(c)H25N、M135Q
(d)H29Y、T79N、M135Q
(e)I99L、V121I、L160I、Y217H
(f)V121I、L160I
(g)H72N、R74E、S87K
(h)H25N、M135Q、Y217H
(i)T79N、V121I、V212I
(j)H29Y、N76T、I99L、M135Q
(k)K49E、D50Q、N76L、Y82F、S179N、V233N
(l)M145K、V148G、N76L、Y82F、S179N、V233N
(m)H25N、N76T、S87K、K154T
(n)H25Q
(o)H25D
(p)H25S
(q)K24E、H25N
(r)Y97N
(s)N100D
(t)A120S、A122S
(u)M135E
(v)V204Q、A122S
(w)T79D
(x)R74D
(y)K49E
(z)K49S、D50Q
(aa)D50Q
(bb)Q178D
(cc)S87R
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
44.根据权利要求30所述的分离多肽，其中所述多肽包含以下或由以下组成：天然存在的丝氨酸蛋白酶的氨基酸。
45.根据权利要求44所述的分离多肽，其中所述多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸。
46.根据权利要求30至45中任一项所述的分离多肽，其相对于从大西洋鳕鱼(大西洋真鳕)分离的胰蛋白酶I展现改善的稳定性。
47.根据权利要求46所述的分离多肽，其中所述从大西洋鳕鱼分离的胰蛋白酶I具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
48.根据权利要求46或47所述的分离多肽，其相对于从大西洋鳕鱼分离的胰蛋白酶I的胰蛋白酶多肽展现改善的热稳定性。
49.根据权利要求48所述的分离多肽，其包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：
(a)K154E(“EZA-006”)；
(b)N98T(“EZA-007”)；
(c)I99L(“EZA-008”)；
(d)V212I(“EZA-0010”)；
(e)Y217D、M175K(“EZA-011”)；
(f)Y217H(“EZA-012”)；
(g)A229V(“EZA-014”)；
(h)H25Y(“EZA-015”)；
(i)H25N(“EZA-016”)；
(j)H72N(“EZA-019”)；
(k)R74E(“EZA-021”)；
(l)N76L、Y82F(“EZA-023”)；
(m)T79N(“EZA-025”)；
(n)K49E、D50Q(“EZA-026”)；
(o)S87R(“EZA-027”)；
(p)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；
(q)S179N、V233N(“EZA-029”)；
(r)M135Q(“EZA-030”)；
(s)M145K、V148G(“EZA-031”)；
(t)L63I、S85A(“EZA-033”)；
(u)L160I(“EZA-034”)；
(v)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；
(w)V121I(“EZA-036”)；
(x)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；以及
(y)L234Y(“EZA-039”)
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
50.根据权利要求30至49中任一项所述的分离多肽，其相对于从大西洋鳕鱼分离的胰蛋白酶I展现改善的自体蛋白水解稳定性。
51.根据权利要求50所述的分离多肽，其包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：
(a)I99L(“EZA-008”)；
(b)V212I(“EZA-0010”)；
(c)Y217D、M175K(“EZA-011”)；
(d)Y217H(“EZA-012”)；
(e)A229V(“EZA-014”)；
(f)H25Y(“EZA-015”)；
(g)H25N(“EZA-016”)；
(h)H29Y(“EZA-017”)；
(i)H72N(“EZA-019”)；
(j)R74E(“EZA-021”)；
(k)N76T(“EZA-022”)；
(l)N76L、Y82F(“EZA-023”)；
(m)T79S(“EZA-0024”)；
(n)T79N(“EZA-025”)；
(o)K49E、D50Q(“EZA-026”)；
(p)S87R(“EZA-027”)；
(q)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；
(r)S179N、V233N(“EZA-029”)；
(s)M135Q(“EZA-030”)；
(t)M145K、V148G(“EZA-031”)；
(u)L63I、S85A(“EZA-033”)；
(v)L160I(“EZA-034”)；
(w)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；
(x)V121I(“EZA-036”)；以及
(y)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
52.根据权利要求30至51中任一项所述的分离多肽，其相对于从大西洋鳕鱼分离的胰蛋白酶I展现改善的Kcat。
53.根据权利要求52所述的分离多肽，其包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：
(a)H25N(“EZA-016”)；
(b)H29Y(“EZA-017”)；
(c)H71D(“EZA-018”)；
(d)H72N(“EZA-019”)；
(e)N76T(“EZA-022”)；
(f)N76L、Y82F(“EZA-023”)；
(g)M145K、V148G(“EZA-031”)；
(h)M175Q(“EZA-032”)；
(i)L63I、S85A(“EZA-033”)；
(j)L160I(“EZA-034”)；
(k)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；
(l)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；以及
(m)V238I(“EZA-038”)，
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
54.根据权利要求30至53中任一项所述的分离多肽，其相对于从大西洋鳕鱼分离的胰蛋白酶I展现改善的Km。
55.根据权利要求54所述的分离多肽，其包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：
(a)K154T(“EZA-003”)；
(b)I99L(“EZA-008”)；
(c)V212I(“EZA-0010”)；
(d)Y217D、M175K(“EZA-011”)；
(e)Y217S(“EZA-013”)；
(f)A229V(“EZA-014”)；
(g)H25Y(“EZA-015”)；
(h)K49E、D50Q(“EZA-026”)；
(i)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；以及
(j)M135Q(“EZA-030”)，
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
56.根据权利要求30至55中任一项所述的分离多肽，其相对于从大西洋鳕鱼分离的胰蛋白酶I展现改善的特异性常数(Kcat/Km)。
57.根据权利要求56所述的分离多肽，其包含以下或由以下组成：具有下列定义的突变之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：
(a)K154T(“EZA-003”)；
(b)Y217D、M175K(“EZA-011”)；
(c)Y217S(“EZA-013”)；
(d)A229V(“EZA-014”)；以及
(e)M135Q(“EZA-030”)；
或其展现抗微生物活性的片段，
其中所述氨基酸编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK！’。
58.根据权利要求30至57中任一项所述的分离多肽，其是非糖基化的。
59.根据权利要求30至58中任一项所述的分离多肽，其包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
60.根据权利要求30至59中任一项所述的分离多肽，其包含一个或多个经过修饰或衍生的氨基酸。
61.根据权利要求60所述的分离多肽，其中所述一个或多个氨基酸通过聚乙二醇化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生。
62.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求30至61中任一项所述的多肽。
63.一种表达载体，其包含根据权利要求62所述的核酸分子。
64.根据权利要求63所述的表达载体，其适合于在大肠杆菌中使用。
65.一种微生物宿主细胞，其包含根据权利要求62所述的核酸分子或根据权利要求63或64所述的表达载体。
66.根据权利要求65所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞(诸如大肠杆菌和假交替单胞菌)。
67.根据权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞(诸如BL21(E3)、BL21(DE3)、BL21Star(DE3)、ArcticExpress(DE3)以及HMS174细胞)。
68.根据权利要求67所述的宿主细胞，其中在步骤(a)中所述宿主细胞是菌株
ArcticExpress(DE3)的大肠杆菌宿主细胞。
69.根据权利要求65所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母宿主细胞(诸如巴斯德毕赤酵母)。
70.一种治疗性组合物，其包含根据权利要求30至61中任一项所述的多肽连同医药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载剂、缓冲剂或佐剂。
71.根据权利要求70所述的治疗性组合物，其适合于经由选自由以下组成的群组的途径施用：经口、经鼻、经肺、经颊、局部、经眼、肠道外(静脉内、皮下、鞘内以及肌肉内)、经阴道以及经直肠。
72.根据权利要求70或71所述的治疗性组合物，其中所述多肽以适合于递送至口腔和/或口咽的粘膜的形式提供。
73.根据权利要求72所述的治疗性组合物，其中所述多肽在口腔喷雾、糖锭、香锭、口香糖或液体中提供。
74.根据权利要求73所述的治疗性组合物，其中所述多肽在口腔喷雾中提供。
75.根据权利要求30至61中任一项所述的多肽，其用于医学中。
76.根据权利要求30至61中任一项所述的多肽，其用于在受试者中治疗或预防选自由微生物感染、发炎以及创伤组成的群组的病症或病状。
77.根据权利要求76所述的供使用的多肽，其中所述病症或病状是微生物感染。
78.根据权利要求77所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染选自由细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染以及酵母感染组成的群组。
79.根据权利要求78所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是细菌感染。
80.根据权利要求79所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染包含生物膜的形成。
81.根据权利要求79或80所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是牙周病。
82.根据权利要求77所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是病毒感染。
83.根据权利要求82所述的供使用的多肽，其中所述病毒感染选自由普通感冒和流感组成的群组。
84.根据权利要求82所述的供使用的多肽，其中所述病毒感染由肠病毒(诸如人鼻病毒或柯萨奇A病毒)引起。
85.根据权利要求82所述的供使用的多肽，其中所述病毒感染由单纯疱疹病毒引起。
86.根据权利要求77所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是真菌感染。
87.根据权利要求86所述的供使用的多肽，其中所述真菌感染选自由脚癣(香港脚)和念珠菌病(鹅口疮)组成的群组。
88.根据权利要求76至87中任一项所述的供使用的多肽，其中所述受试者具有或易感免疫缺陷。
89.根据权利要求88所述的供使用的多肽，其中所述免疫缺陷是继发性或获得性免疫缺陷，例如，受试者正在接受免疫抑制剂疗法的治疗。
90.根据权利要求89所述的供使用的多肽，其中所述免疫缺陷是天然存在的，例如，所述免疫缺陷归因于原发性免疫缺陷、癌症(诸如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、慢性感染(诸如获得性免疫缺陷综合症或AIDS)、营养不良和/或老龄化。
91.根据权利要求76至90中任一项所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是口腔和/或口咽的微生物感染。
92.根据权利要求76至87中任一项所述的供使用的多肽，其中所述受试者是运动员(例如，马拉松选手)。
93.根据权利要求76所述的供使用的多肽，其中所述病症或病状是发炎性病症或病状。
94.根据权利要求93所述的供使用的多肽，其中所述发炎性病症或病状选自由以下组成的群组：疼痛、急性发炎、慢性发炎、关节炎、发炎关节、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、败血性关节炎、纤维肌痛、全身性红斑狼疮、静脉炎、腱炎、皮疹、牛皮癣、痤疮、湿疹、面部脂溢性湿疹，以及手部、面部或颈部湿疹。
95.根据权利要求76所述的供使用的多肽，其中所述病症或病状是创伤。
96.根据权利要求95所述的供使用的多肽，其中所述创伤选自急性外伤(包括烧伤)、局部溃疡、疤痕、瘢痕瘤、疖以及疣。
97.根据权利要求95或96所述的供使用的多肽，其中所述多肽用于清创(即，从其它方面健康的皮肤去除受感染、死亡或剥落的皮肤)和/或纤维蛋白凝块的去除。
98.根据权利要求76至97中任一项所述的供使用的多肽，其中所述多肽与一种或多种额外活性剂组合使用。
99.根据权利要求98所述的供使用的多肽，其中所述额外活性剂选自由以下组成的群组：抗微生物剂(包括抗生素、抗病毒剂以及抗真菌剂)、消炎剂(包括类固醇和非类固醇消炎剂)以及抗败血剂。
100.一种根据权利要求30至61中任一项所述的多肽的用途，其用于制备用以在受试者中治疗或预防选自由微生物感染、发炎以及创伤组成的群组的病症或病状的药物。
101.一种在受试者中治疗或预防选自由微生物感染、发炎以及创伤组成的群组的病症或病状的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求30至61中任一项所述的多肽施用于有需要的受试者。
102.一种根据权利要求30至61中任一项所述的多肽的用途，其在受试者中作为美容疗法。
103.根据权利要求102所述的用途，其中所述美容疗法将以下作用中的一者或多者提供给所述受试者：
(a)皮肤去角质(去除死亡和/或剥落的皮肤细胞)；
(b)保护免于皮肤中的胶原蛋白和弹性蛋白分解；
(c)粉刺溶解作用；
(d)减少或防止眉间(皱眉)纹；和/或
(e)促进头发生长。
104.一种受试者中的美容疗法的方法，其包括将有效量的根据权利要求30至61中任一项所述的多肽施用于受试者。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述美容疗法将以下作用中的一者或多者提供给所述受试者：
(a)皮肤去角质(去除死亡和/或剥落的皮肤细胞)；
(b)保护免于皮肤中的胶原蛋白和弹性蛋白分解；
(c)粉刺溶解作用；
(d)减少或防止眉间(皱眉)纹；和/或
(e)促进头发生长。
106.一种根据权利要求30至61中任一项所述的多肽的用途，其作为工业剂。
107.根据权利要求106所述的用途，其中所述工业剂是：
(a)织物处理剂；
(b)生物催化剂(例如，在医药品的有机合成中)；
(c)净化/消毒剂(例如，清洁剂)；
(d)环境生物修复剂(例如，为了减少污染)；
(e)分子生物剂；以及
(f)食物产品处理剂(例如，在乳品制造中)。
108.一种产生具有丝氨酸蛋白酶活性的重组多肽的方法，其实质上如本文中参考描述所定义。
109.一种分离多肽，其实质上如本文中参考描述所定义。
110.一种用于医学中的多肽，其实质上如本文中参考描述所定义。
111.一种多肽的用途，其实质上如本文中参考描述所定义。
新颖方法、多肽以及其用途
技术领域
背景技术
及于消化有关的过程中，但超过2％的人类基因组编码蛋白酶基因的事实表明蛋白酶起到
比单独的消化更加复杂的功能[3]。确实，蛋白酶已经显示涉及于从生长因子到受体的许多细胞组分的调控，以及包括免疫、补体级联和血液凝固的过程中[3]。除了涉及于内稳定过程中以外，增加或失调的蛋白酶活性已经经由其与肿瘤生长和侵入的关联而牵涉于癌症中
[4]。
经用于四个领域中：用经口施用的药剂管理胃肠病症，作为消炎剂，作为血栓溶解剂用于血栓栓塞病症，以及作为局部施用的药剂用于伤口清创[10]。自从1978年首次批准蛋白酶药
物(尿激酶，一种指定用于血栓溶解和导管清除的丝氨酸蛋白酶)以来，更多的11种药物已
经获美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration，FDA)批准用于治疗用途
[3]。这些药物中的大多数指定用于治疗血液病症并且包括血栓溶解剂：阿替普酶
(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)以及替奈普酶(tenecteplase)；和促凝血剂：因子IX、因子VIIa、凝血酶以及绷带中的局部凝血酶。其它获批准的蛋白酶治疗剂指定用于消化(胰脂肪酶)、肌肉痉挛以及作为药妆品(具有生物活性成分的美容产品预期具有医学或类药物
效益；肉毒杆菌毒素A和肉毒杆菌毒素B)[3]。
的相互作用是可能的，这是因为嗜冷蛋白酶的催化位点可以更容易地容纳底物[20]。然而，这种增加的灵活性常常伴随有稳定性的折中[21]。因此，与哺乳动物类似物成对比，嗜冷蛋白酶对热、低pH以及自体溶解的灭活更敏感[18、19、21-25]。
大规模生产可以使用重组技术获得。已经鉴别多种鱼酶和蛋白酶，克隆，并且在微生物中表达[36]。在产生用于治疗目的的其它蛋白酶中，非人类来源或产生宿主是优选的以使得潜
在的污染可以避免。因此广泛采用重组技术以产生获批准的哺乳动物(重组)治疗性蛋白
质，诸如凝血因子(来自重组中国仓鼠卵巢或幼仓鼠肾细胞)、血栓溶解剂(来自大肠杆菌
(Escherichia coli))或肉毒杆菌毒素(肉毒杆菌(Clostridium botulinum))[3]。因此，将似乎需要探索经由重组技术产生冷适应蛋白酶的可能性。在实验室中对此已经存在若干或
多或少成功的尝试。然而，重组冷适应酶的大规模生产与若干复杂因素相关，诸如冷适应酶的短半衰期和自体溶解活性，其使得生产在更标准化的工业条件和温度下有困难。
发明内容
当亲核氨基酸。丝氨酸蛋白酶活性可以是类胰凝乳蛋白酶(即，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及弹性蛋白酶)或类枯草杆菌蛋白酶。
加青鳕(黄线狭鳕(Theragra chalcogramma))的胰蛋白酶，和其突变形式(如下文详细描
述)。
内容以引用的方式并入本文中)。举例来说，参看GenBank入藏号ACO90397。
(Comp.Biochem.Physiol.B)》998:327-335，其公开内容以引用的方式并入本文中)。举例来说，参看GenBank入藏号CAA55242.1。
由单字母名称表示，对应于常规氨基酸的俗名。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50％一致性，更优选地与所述序列具有至少60％、70％或80％或85％或90％一致性，并且最优选地与所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、
98％或99％一致性的氨基酸序列。因此，在指定位置处的氨基酸可以缺失，被取代，或可以是一个或多个氨基酸的插入/添加位点。本领域的技术人员应了解，取代可以是保守的或非保守的。
(Adv.Appl.Math.)》(1991)12:337-357，其公开内容以引用的方式并入本文中)使用全局比对选项、计分矩阵BLOSUM62、开放空隙罚分-14、扩展空隙罚分-4作为参数来确定。或者，两个多肽之间的序列一致性百分比可以使用适合的计算机程序，例如威斯康星大学遗传计算
小组(University of Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序来确定，并且应了
解，一致性百分比是关于已经最佳比对序列的多肽来计算。
通过参考两个替代性编号系统定义)：
酸。然而，其通常将最初表达为在N端处具有活化序列的酶原多肽(参看下文)。
2EEK！)可以在来自阿拉斯加青鳕的胰蛋白酶中制得(例如，参看GenBank：BAH70476.3，其中活性胰蛋白酶的氨基酸序列在位置I20处开始，以使得H25对应于BAH70476.3中的H29，等
等)。
来自大西洋鳕鱼(大西洋真鳕)、大西洋和太平洋鲑鱼(例如，大西洋鲑和大麻哈鱼属)以及
阿拉斯加青鳕(黄线狭鳕)的胰蛋白酶。
200个或更多个相连氨基酸。
用本发明的表达方法产生，并且然后体外暴露于代表性微生物(诸如细菌菌株、病毒和/或
真菌菌株)以确定这些片段中的哪一者抑制(部分或完全)所述微生物的生长和/或增殖。
性多肽而产生。
of trypsinogen activation peptides)"《分子生物学与进化(Molecular biology and
evolution)》20.11(2003):1767-1777，其公开内容以引用的方式并入本文中)。应了解，活化肽可以是天然存在的活化肽或其突变型式。
以是大肠杆菌宿主细胞(诸如BL21(E3)、BL21(DE3)、BL21Star(DE3)、ArcticExpress(DE3)以及HMS174细胞)。
Green和Sambrook,2012,《分子克隆实验手册(MolecularCloning,A Laboratory
Manual)》,第四版,Cold Spring Harbor,New York，这个文献中的相关公开内容特此以引
用的方式并入)。
2005《,生物科学与生物工程杂志(J.Biosci.Bioeng.)》99(4):303-10以及Burgess,2009,
《酶学方法(Methods Enzymol.)》463:259-82，这些文献中的相关公开内容特此以引用的方式并入)。
参考两个替代性编号系统定义)：
酸。然而，其通常将表达为在N端处具有活化序列的酶原多肽(参看上文)。
2EEK！)可以在来自阿拉斯加青鳕的胰蛋白酶中制得(例如，参看GenBank：BAH70476.3，其中活性胰蛋白酶的氨基酸序列在位置I20处开始，以使得H25对应于BAH70476.3中的H29，等
等)。
来自大西洋鳕鱼(大西洋真鳕)、大西洋和太平洋鲑鱼(例如，大西洋鲑和大麻哈鱼属)以及
阿拉斯加青鳕(黄线狭鳕)的胰蛋白酶。举例来说，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含
SEQ ID NO:1的氨基酸或由SEQ ID NO:1的氨基酸组成。
存在的真核胰蛋白酶的氨基酸序列组成，但缺乏存在于在自然界中表达的蛋白质上的糖基
化部分。
(如上文关于本发明的第一个方面所论述)。
看EP 1 202 743 B，其相关公开内容以引用的方式并入本文中)的胰蛋白酶I展现改善的稳
定性。
白酶活性的保留来评估(参看下文的实施例)。
存8小时时丝氨酸蛋白酶活性的保留来评估(参看下文的实施例)。
2EEK！)：
善的催化活性。
由单字母名称表示，对应于常规氨基酸的俗名。
准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。举例来说：4-羟基脯氨酸可以代替脯氨酸；
5-羟基赖氨酸可以代替赖氨酸；3-甲基组氨酸可以代替组氨酸；高丝氨酸可以代替丝氨酸
并且鸟氨酸代替赖氨酸。衍生物还包括含有一个或多个添加或缺失的肽，只要维持必需的
活性即可。其它包括的修饰是酰胺化、氨基末端酰化(例如，乙酰化或硫代乙醇酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如，使用氨或甲胺)以及类似的末端修饰。
的伪肽。含有NH-CO键替代CO-NH肽键的逆反肽对蛋白水解的抗性大得多。或者，所述多肽可以是氨基酸残基中的一者或多者通过-y(CH2NH)-键代替常规酰胺键联连接的拟肽化合物。
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》75:2636和Thursell等,1983《, 生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》111:166，其以引用的方式并入本文中。
是形成无毒的酸加成盐，即，含有药理学上可接受的阴离子的盐的那些，这些盐尤其诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐以及双羟萘酸盐[即，1,1'-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸盐)]。
这类化合物形成无毒的碱盐的那些。这类无毒的碱盐包括(但不限于)来源于这类药理学上
可接受的阳离子的那些，尤其诸如碱金属阳离子(例如，钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，钙和镁)，铵或水溶性胺加成盐，诸如N-甲基葡糖胺(葡甲胺)，以及医药学上可接受的有机胺的低碳烷醇铵和其它碱盐。
以作补偿。优选地，冻干(冷冻干燥)的多肽当再水合时损失不大于约20％、或不大于约
25％、或不大于约30％、或不大于约35％、或不大于约40％、或不大于约45％、或不大于约
50％的其活性(冻干前)。
Publishing Company(1990)和《医药赋形剂手册(handbook of Pharmaceutical
Excipients)》,第3版,A.Kibbe编,Pharmaceutical Press(2000)，其公开内容以引用的方
式并入本文中)。
成的氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐以及乙酸盐。佐剂还可以是阳离子聚合物，诸如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰基透明质酸、壳聚糖、阳离子树状聚合物，阳离子合成聚合物，诸如聚(乙烯基咪唑)，以及阳离子多肽，诸如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸以及含有这些氨基酸的肽。
(由Enzymatica AB,Lund,Sweden)销售。
制(至少一部分)诸如细菌和病毒的微生物细胞被宿主上皮细胞(例如，口咽的)吸收的薄的
活性屏障而有助于本发明的多肽的治疗作用。
不溶性单层以及液晶存在。用于脂质体配方的适合脂质包括(但不限于)甘油单酯、甘油二
酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等等。适合的脂质还包括在极性头基中由聚(乙二醇)修饰用于延长血流循环时间的上述脂质。这类脂质体配方的制备可以在例如US 4,235,
871中找到，其公开内容以引用的方式并入本文中。
经广泛用作微球生产中的生物可降解聚合物。这类微球的制备可以在US 5,851,451中和EP
0 213 303中找到，其公开内容以引用的方式并入本文中。
胶原蛋白。
的标准医药技术实现。
剂，例如注射用水。即时注射溶液和悬浮液可以从先前所描述的种类的无菌粉末、颗粒以及片剂制备。
227EA3)、二氧化碳或其它适合的气体)。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性多肽的溶液或悬浮液，例如使用乙醇与推进剂的混合物作为溶剂，其可以另外含有润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。可以配制用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如，从明胶制得)以含有本发
明的化合物与适合的粉末基剂(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
与所需要的稀释剂联合产生所需治疗作用的活性组合物的预定数量。在制造本发明的组合
物的方法和用途中，提供治疗有效量的活性组分。如本领域中众所周知，治疗有效量可以由一般技术的医学或兽医工作者基于患者特征，诸如年龄、体重、性别、病状、并发症、其它疾病等等来确定。医药学上有效剂量的施用可以通过以个别的剂量单位或者数个较小的剂量
单位的形式单次施用以及通过以特定时间间隔多次施用细分的剂量来进行。或者，剂量可
以作为连续输注经过较长时段提供。
300μM与700μM之间、介于1μM与100μM之间、介于100μM与200μM之间、介于200μM与300μM之间、介于300μM与400μM之间、介于400μM与500μM之间，并且最优选地约500μM的活性剂。
(Crohn's disease)、白塞氏病(Behcet's Disease)、天疱疮以及溃疡性结肠炎)；以及
生)、T细胞缺陷以及联合B细胞和T细胞缺陷、吞噬细胞病症以及补体缺陷。这些病症的主要指示包括多重感染(尽管有积极的治疗)、不常见或机会性生物体的感染、无法成长或不良
生长以及阳性家族史。早期识别和诊断可以显著改变原发性免疫缺陷的过程并且对患者结
果具有正面影响。
削弱，这可以持续数小时至数天，促使其在那个时段期间易受微生物感染(尤其是感冒和流感)。
或三天或四天或五天或六天或七天或更多天)。
述的那些)组成的群组的病症或病状的药物。
法，这种方法包括施用有效量的根据本发明的第二个方面的多肽。
来说，在一个实施方案中，本发明提供了一种包含具有SEQID NO:3或4的氨基酸序列的胰蛋白酶多肽的口腔喷雾，其用于治疗或预防细菌或病毒感染。
许多替代、修改、添加和/或重排，并且本发明包括所有这类替代、修改、添加和/或重排。
小时、22℃持续16小时或18℃持续16小时的四种条件下进行EZA-034的表达优化。
18℃持续16小时的四种条件下进行EZA-034的表达优化。
量的图示，以及(D)在所测试的条件中EZA-034的计算表达水平的图示。
条件中EZA-034的计算表达水平的图示。低或高的OD指的是在IPTG诱导下的细胞密度，甘油补料的高OD等同于葡萄糖补料的高OD。
实施例
50mM Tris，8M脲，pH 8.0中，并且然后在4℃下透析至1×PBS，10％甘油，pH 7.4中过夜。
白酶多肽(R-Tryp)的活性。
以下公式计算活性：
0.7109cm的光程长度，103是mol/l至μmol/ml的转换。
90％的初始活性)。如(a)所描述测定活性(AAX)。
的差异。数种突变体与仅具有5％剩余活性的野生型胰蛋白酶相比表现改善的温度稳定性，并且数种突变体与野生型胰蛋白酶相比显示实质上改善的自体催化稳定性。
121GTTAGTGCGGCCCATTGCTA TAAAAGCGTG CTGCGTGTTC GCCTGGGCGA
ACATCACATT181CGTGTGAATG AAGGCACCGA ACAGTACATT AGCTCTAGTAGCGTTATCCG CCATCCGAAC
241TACTCTAGTT ACAACATCAACAACGATATC ATGCTGATCA AACTGACCAA ACCGGCGACG
301CTGAACCAGT ATGTGCACGC CGTTGCACTG CCGACCGAATGCGCAGCGGA TGCAACCATG
361TGTACCGTGA GCGGCTGGGGTAATACGATG AGCTCTGTTG CGGATGGCGA TAAACTGCAG
421TGCCTGTCTA TTCCGATTCT GAGTCATGCG GATTGTGCCA ACTCTTATCCGGGCATGATC
481ACGCAGAGCA TGTTTTGCGC CGGTTACCTGGAAGGCGGTA AAGATAGCTG CCAGGGTGAT
541TCTGGCGGTCCGGTGGTTTG TAACGGCGTT CTGCAGGGTG TGGTTAGCTG
GGGCTACGGT601TGTGCAGAAC GTGATCACCC GGGTGTCTAT GCTAAAGTCTGTGTGCTGTC GGGCTGGGTC
661CGTGATACGA TGGCGAACTA TTAA
5L发酵中EZA-034的表达优化。
化。种子培养物是3％。通过添加30％NH4OH或添加补料培养物控制pH为约6.8。根据所溶解的氧气水平控制空气流量从3L/min至9L/min。
共30分钟而裂解。在4℃下使包涵体以13,000rpm旋转减速30分钟并且如下洗涤：
钟。最后，将包涵体溶解于40ml的50mM Tris-HCl，8M脲，10mM DTT，pH 8.0中，并且在室温下孵育30分钟。在15℃下使样品以44,000rpm旋转30分钟。并且，上清液用于进一步纯化。
4mM DTT，pH 8.0(无热原)作为运作缓冲液来纯化总共100ml溶解的蛋白质(9.0mg/ml)，收
集1.8ml部分。SDS-PAGE用于分析纯化过程。
8.0)，EZA-034的浓度可以达到3mg/ml。
cold-active microbial proteases)《.微生物学关键评论(Crit Rev Microbiol)》.2012；
38:330-8。
ablation:preliminary report)《. 皮肤外科(Dermatol Surg)》.2005；31:139-47。
93。
92:1681-8。
coagula,and mucopus)《. 纽约医学杂志(NY Med J)》.1891；53:424-6。
.1953；11:372-9。
fistulae)《. 胸部发现(Dis Chest)》.1958；34:154-61。
《水产生物技术(Mar Biotechnol)》.2005；7:77-88。
apoptosis,utriculi size,and skin elasticity in the Rhino mouse)《.研究性皮肤病
学杂志(J Investig Dermatol)》.1997；109:370-6。
in necrotic leg ulcers)《. 欧洲临床药理学杂志(Eur JClin Pharmacol)》.1983；24:
623-8。
Appl Microbiol)》.2012；81:63-87。
staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends ontheir chemical
composition)《. 应用微生物学与生物技术(Appl MicrobiolBiotechnol)》.2007；75:125-
32。
biofilm formation in Staphylococcus aureus).《微生物感染(Microbes Infect)》
.2010；12:55-64。
the formation of multispecies biofilm)《. 生物淤积(Biofouling)》.2009；25:667-74。
activation may explain local flexibility)《. 生物化学与生物物理学学报(Biochim
Biophys Acta)》.2000；1543:1-10。
psychrophilicmetalloprotease reveal new insights into catalysis by cold-
adapted proteases)《. 蛋白质(Proteins)》.2003；50:636-47。
(Trends Biotechnol)》.2000；18:103-7。
thepoikilotherm Gadus morhua)《. 欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)》.1989；180:85-
94。
serine-type peptide hydrolases from antarctic krill,Euphausia superba)《.比较
生物化学与生理学B辑(Comp Biochem Physiol B)》.1985；82:607-19。
稳定性的表征(Characterization of cold-adapted Atlantic cod(Gadus morhua)
trypsin I-kinetic parameters,autolysis and thermal stability)《.比较生物化学与
生理学B辑：生物化学与分子生物学(Comp Biochem Physiol B:Biochem Mol Biol)》
.2010；155:186-94。
trypsins.Elucidating the molecular basis of cold-adaptation)《. 欧洲生物化学杂
志(Eur J Biochem)》.2000；267:1039-49。
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