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牙齿缺损部的修复方法及修复材料的制造方法

阅读：1027发布：2020-10-16

专利汇可以提供牙齿缺损部的修复方法及修复材料的制造方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于对口腔内的牙齿缺损部进行修复的修复材料的制造方法，其包括以下工序：不对第1细胞集合体和第2细胞集合体进行混合，而是使其密合后配置在支撑载体内部进行培养，形成经过重建的牙胚或牙齿，所述第1细胞集合体和第2细胞集合体分别由间质系细胞和上皮系细胞的任一方构成，所述间质系细胞和上皮系细胞的任意一方来源于牙胚；按照可使牙胚或牙齿的前端部为口腔内侧并埋设在所述缺损部内的方式，确认通过所述培养所形成的经过重建的牙胚或牙齿的方向性；确认了方向性的所述牙胚或牙齿在所述牙齿缺损部中作为用于获得缺损的牙齿的等价物的修复材料使用。一种包括将通过该制造方法获得的所述经过重建的牙胚或牙齿埋设在所述牙齿缺损部的牙齿缺损部的修复方法。，下面是牙齿缺损部的修复方法及修复材料的制造方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于对口腔内的牙齿缺损部进行修复的修复材料的制造方法，其包括以下工序：
不对第1细胞集合体和第2细胞集合体进行混合，而是使其密合后配置在支撑载体内部进行培养，形成经过重建的牙胚或牙齿，所述第1细胞集合体和第2细胞集合体分别由间质系细胞和上皮系细胞的任一方构成，所述间质系细胞和上皮系细胞的任意一方来源于牙胚，
按照使牙齿的前端部为口腔内侧并埋设在所述缺损部内的方式，确认通过所述培养所形成的所述经过重建的牙胚或牙齿的方向性；
确认了方向性的所述牙胚或牙齿在所述牙齿缺损部中用作用于获得缺损的牙齿的等价物的修复材料。
2.根据权利要求1所述的修复材料的制造方法，其中，
所述缺损的牙齿的等价物具备300～600KHN的牙釉质的努氏硬度及60～120KHN的牙本质的努氏硬度。
3.根据权利要求1或2所述的修复材料的制造方法，其中，
所述培养为器官培养，所述修复材料含有器官培养后的经过重建的牙胚或牙齿、和支撑载体。
4.根据权利要求1～3任一项所述的修复材料的制造方法，其中，
所述间质系细胞及上皮系细胞均来自于牙胚。
5.根据权利要求1～4任一项所述的修复材料的制造方法，其中，
所述第1细胞集合体及第2细胞集合体均为单一细胞集合体。
6.根据权利要求1～5任一项所述的修复材料的制造方法，其中，
所述支撑载体为选自胶原、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、弹性蛋白、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、细胞外基质混合物、聚乙醇酸即PGA、聚乳酸即PLA、乳酸/乙醇酸共聚物即PLGA、作为商品名的Cellmatrix、作为商品名的Mebiol Gel、作为商品名的Matrigel中的至少1种。
7.一种口腔内的牙齿缺损部的修复方法，其包括：
不对第1细胞集合体和第2细胞集合体进行混合，而是使其密合后配置在支撑载体内部进行培养，形成经过重建的牙胚或牙齿，所述第1细胞集合体和第2细胞集合体分别由间质系细胞和上皮系细胞的任一方构成，所述间质系细胞和上皮系细胞的任意一方来源于牙胚；
在所述牙齿缺损部中埋设所述经过重建的牙胚或牙齿。
8.根据权利要求7所述的牙齿缺损部的修复方法，其中，
所述间质系细胞及上皮系细胞均来自于牙胚。
9.根据权利要求7或8所述的牙齿缺损部的修复方法，其中，
所述第1细胞集合体及第2细胞集合体均为单一细胞集合体。
10.根据权利要求7～9任一项所述的牙齿缺损部的修复方法，其中，
所述支撑载体为选自胶原、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、弹性蛋白、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、细胞外基质混合物、聚乙醇酸即PGA、聚乳酸即PLA、乳酸/乙醇酸共聚物即PLGA、作为商品名的Cellmatrix、作为商品名的Mebiol Gel、作为商品名的Matrigel中的至少1种。

说明书全文

牙齿缺损部的修复方法及修复材料的制造方法

技术领域

[0001] 本发明涉及牙齿缺损部的修复方法及修复材料的制造方法。

背景技术

[0002] 牙齿是在最外层具有牙釉质、在其内层具有称作牙本质的硬组织、在牙本质的内侧具有产生牙本质的成牙本质细胞、进而在其中心部具有牙髓的器官。另外，牙齿有时会由于蛀蚀或牙周病等导致缺失，牙齿的有无会大大影响外观、食物的味觉，另外从维持健康、高品质的生活的观点出发，开发了各种牙齿的再生技术。

[0003] 例如，J.Dent.Res.，2002，Vol.81(10)，pp.695～700中公开了通过将分离自牙胚的上皮系细胞、间质系细胞等细胞与生物体吸收性载体一起移植到大鼠的腹腔内使齿样的组织再生。

[0004] 作为牙胚的再生方法，例如在特开2004-331557号公报中记载了在成纤维细胞生长因子等生物活性物质的存在下对分离自生物体的牙胚细胞进行培养。另外，特开2004-357567号公报提出了将分离自生物体的牙胚细胞及能够分化成这些细胞的细胞中的至少1种与含有纤维蛋白的载体一起进行培养，该公报中记载了含有纤维蛋白的载体使用牙胚的目标形状的载体、形成具有特有形态的“牙齿”。

[0005] 另外，国际公开第2006/129672号小册子公开了在分别将牙胚来源的上皮系细胞和间质系细胞制成细胞集合体的基础上，使细胞集合体之间密合在胶原凝胶的内部，一边保持该状态一边进行培养，从而制造具备牙齿特有的细胞配置的牙齿的技术。

[0006] 另一方面，国际公开第2003/101503号小册子公开了通过对牙胚细胞及这些可分化的细胞给予机械刺激进行培养而使牙胚再生的方法、以及将由此再生的牙胚移植到发生牙胚缺损或损伤的患者的颌骨的治疗方法。

[0007] 另外，特开2005-013261号公报中作为埋植在生物体内进行使用的植入材料，公开了使硅胶粒子附着在材料表面上的人工生物体材料。

[0008] 但是，目前指出利用当前植入治疗中的螺旋(screw)型钛等材料的人工牙根的埋植，除了具有抑制颌生长期的颌骨的生长的问题，还具有牙齿无法移动等问题。另外，为了具有与正常牙齿相同的功能，还有必要获得正常的咬合，但在使用了分离自生物体的细胞的上述技术中对于这种咬合并未充分地进行确认。另外，牙根膜内部的神经能够应答压迫等针对牙齿的侵害刺激，这在相对于食物的触觉等所谓知觉方面在生物学上是很重要的。为了具有与正常牙齿相同的功能，期待获得正常咬合、具有与正常牙齿相同的硬度；通过神经的侵入，对牙齿缺损部进行修复使得作为牙齿具有正常的刺激应答性。

发明内容

[0009] 因此，本发明的目的在于，提供用于修复牙齿缺损部以便具有与正常牙齿同等的硬度、获得正常咬合、具有与正常牙齿同等的刺激应答性的修复材料的制造方法及牙齿缺损部的修复方法。

[0010] 本发明还提供为了修复口腔内的牙齿缺损部而使用的修复材料的制造方法及牙齿缺损部的修复方法。

[0011] 本发明的第一方式在于提供用于修复口腔内的牙齿缺损部的修复材料的制造方法，其包括：不对第1细胞集合体和第2细胞集合体进行混合，而是使其密合后配置在支撑载体内部进行培养，形成经过重建的牙胚或牙齿，所述第1细胞集合体和第2细胞集合体分别由间质系细胞和上皮系细胞的任一方构成，所述间质系细胞和上皮系细胞的任意一方来源于牙胚；按照能够将牙齿的前端部作为口腔内侧进行埋设的方式，确认通过上述培养形成的上述经过重建的牙胚或牙齿的方向性，确认了方向性后的上述牙胚或牙齿在上述牙齿缺损部中作为用于获得缺损的牙齿的等价物的修复材料使用。

[0012] 本发明的第二方式在于提供口腔内的牙齿缺损部的修复方法，其包括：不对第1细胞集合体和第2细胞集合体进行混合，而是使其密合后配置在支撑载体内部进行培养，形成经过重建的牙胚或牙齿，所述第1细胞集合体和第2细胞集合体分别由间质系细胞和上皮系细胞的任一方构成，所述间质系细胞和上皮系细胞的任意一方来源于牙胚；在上述牙齿缺损部中埋设上述经过重建的牙胚或牙齿。附图说明

[0013] 图1A为本发明实施例2的分别在牙齿萌出期(左)、萌出后至咬合的时期(中央)及咬合后的时期(右)确认到的照片图像，表示倾斜45度对上颌移植部位进行拍摄后的外观。

[0014] 图1B为本发明实施例2的分别在牙齿萌出期(左)、萌出后至咬合的时期(中央)及咬合后的时期(右)确认到的照片图像，表示从垂直方向对上颌移植部位进行拍摄后的外观。

[0015] 图1C为本发明实施例2的分别在牙齿萌出期(左)、萌出后至咬合的时期(中央)及咬合后的时期(右)确认到的咬合图的照片图像。

[0016] 图1D为本发明实施例2的分别在牙齿萌出期(左)、萌出后至咬合的时期(中央)及咬合后的时期(右)确认到的外观CT照片图像。

[0017] 图1E为本发明实施例2的分别在牙齿萌出期(左)、萌出后至咬合的时期(中央)及咬合后的时期(右)确认到的截面CT照片图像(E)。

[0018] 图2A为表示本发明实施例2的已经萌出的牙齿的牙釉质的努氏硬度的曲线图。

[0019] 图2B为表示本发明实施例2的已经萌出的牙齿的牙本质的努氏硬度的曲线图。

[0020] 图3为本发明实施例2的刚要萌出前的再生齿的苏木素-伊红染色图像(20倍)。

[0021] 图4A为对本发明实施例2中施加矫正力时的牙根膜(B：压迫侧、C：牵引侧)的骨的骨重塑现象进行确认的苏木素-伊红染色图像(20倍)。

[0022] 图4B为图4A的压迫侧(黑框B)的放大图(200倍)。

[0023] 图4C为图4A的牵引侧(黑框C)的放大图(200倍)。

[0024] 图5A为表示本发明实施例2中矫正未刺激的延髓中的c-fos表达的免疫染色图像。100倍。

[0025] 图5B为表示本发明实施例2矫正刺激后第2小时的延髓中的c-fos表达的免疫染色图像。100倍。

[0026] 图5C为表示矫正刺激后第48小时的延髓中的c-fos表达的免疫染色图像。100倍。

[0027] 图5D为表示露髓处理后第2小时的延髓中的c-fos表达的免疫染色图像。100倍。

具体实施方式

[0028] 本发明的修复材料的制造方法为用于修复口腔内的牙齿缺损部的修复材料的制造方法，其包括以下工序：不对第1细胞集合体和第2细胞集合体进行混合，而是使其密合后配置在支撑载体内部进行培养，形成经过重建的牙胚或牙齿，所述第1细胞集合体和第2细胞集合体分别由间质系细胞和上皮系细胞的任一方构成，所述间质系细胞和上皮系细胞的任意一方来源于牙胚(以下为“重建牙胚形成工序”)；按照能够使牙齿前端部为口腔内侧进行埋设的方式，确认通过上述培养形成的上述经过重建的牙胚或牙齿的方向性(以下为方向确认工序)，确认了方向性的上述牙胚或牙齿在上述牙齿缺损部中作为用于获得缺损牙齿的等价物的修复材料使用。

[0029] 另外，本发明的牙齿缺损部的修复方法为口腔内的牙齿缺损部的修复方法，其包括以下工序：不对第1细胞集合体和第2细胞集合体进行混合，而是使其密合后配置在支撑载体内部进行培养，形成经过重建的牙胚或牙齿，所述第1细胞集合体和第2细胞集合体分别由间质系细胞和上皮系细胞的任一方构成，所述间质系细胞和上皮系细胞的任意一方来源于牙胚(以下为重建牙胚形成工序)；将上述经过重建的牙胚或牙齿埋设在上述牙齿缺损部中(以下为埋设工序)。

[0030] 在本发明的修复材料的制造方法及牙齿缺损部的修复方法中，将在重建牙胚形成工序中不对第1细胞块和第2细胞块进行混合而是使其密合后配置在支撑载体的内部进行培养所获得的重建牙胚或牙齿埋设在缺损部中，作为修复材料使用。当将该重建牙胚或牙齿作为修复材料埋设在缺损部时，从所埋设的部位萌出的牙齿的等价物示出与对咬牙相咬合的牙齿的长度和硬度，另外还可产生神经的侵入。因此，可以具有与周围牙齿同样的和正常牙齿同等的硬度、获得正常咬合、具有与正常牙齿同等的刺激应答性。

[0031] 本发明中“牙齿的等价物”等表述是用于指从所埋设的牙齿缺损部萌出时示出能够与对咬牙相咬合的长度和硬度的牙齿。

[0032] 需要说明的是，本发明的“重建牙胚形成工序”在修复材料的制造方法及牙齿缺损部的修复方法两者中均适用。

[0033] 另外，本说明中“工序”这一用语并非仅是独立的工序，即便是无法与其它工序明确地区分时，只要达成了本工序所期待的作用，则包含在本用语中。

[0034] 另外，本说明书中表示数值范围的表述包含其前后的数值。

[0035] 以下对本发明进行说明。

[0036] 本发明中，“牙齿”是内侧连续具备牙本质的层及外侧连续具备牙釉质的层的组织，是指具备具有牙冠、牙根的方向性的组织。牙齿的方向性可以通过牙冠、牙根的配置来确定。牙冠、牙根可以根据形状、组织染色等通过目视进行确认。牙冠是指具有牙釉质和牙本质的层结构的部分，牙根中不存在牙釉质的层。

[0037] 牙本质及牙釉质对于本领域技术人员而言可通过组织染色等在形态上容易地确定。另外，牙釉质可以通过成釉细胞的存在进行确定，成釉细胞的存在可以通过牙釉蛋白的有无进行确认。另一方面，牙本质可以通过成牙本质细胞的存在进行确定，成牙本质细胞的存在可以通过牙本质涎蛋白的有无进行确认。牙釉蛋白及牙本质涎蛋白的确认在该领域中可通过周知的方法容易地实施，例如可举出原位杂交、抗体染色等。

[0038] 另外，牙齿的方向性可以通过牙冠、牙根的配置来确定。牙冠、牙根可以根据形状、组织染色等通过目视进行确认。

[0039] 本发明中，“牙胚”及“齿芽”是特别言及根据发生阶段进行区别时所使用的表述。此时的“牙胚”是指决定将来牙齿的牙齿初期胚，是指在牙齿的发生阶段通常使用的蕾状期(Bud stage)至钟状期(Bell stage)的阶段，特别是未观察到作为牙齿硬组织的特征的牙本质、牙釉质的蓄积的组织。另一方面，“齿芽”是指本发明中使用的“牙胚”的阶段发展的、从作为牙齿硬组织的特征的牙本质、牙釉质开始蓄积的阶段至牙齿从牙肉中萌芽表现出一般作为牙齿的功能之前的阶段的组织。从牙胚向牙齿的发生经过蕾状期、帽状期、钟状前期及后期的各阶段而进行。这里，蕾状期中，上皮系细胞按照包裹间质系细胞的方式而凹陷。
当到达钟状前期及钟状后期时，上皮系细胞部分变为外侧的牙釉质，间质系细胞部分在内部形成牙本质。因此，通过上皮系细胞与间质系细胞的细胞间相互作用由牙胚形成牙齿。

[0040] 需要说明的是，本发明中“间质系细胞”是指间质组织来源的细胞，“上皮系细胞”是指上皮组织来源的细胞。

[0041] 另外，本发明中“牙周组织”是指主要形成牙齿的外层的牙槽骨及牙根膜。牙槽骨及牙根膜对于本领域技术人员而言可以通过组织染色等在形态上容易地确定。

[0042] 本发明的重建牙胚形成工序中，不对第1细胞集合体和第2细胞集合体进行混合，而是使其密合后配置在支撑载体内部进行培养，形成经过重建的牙胚，所述第1细胞集合体和第2细胞集合体分别由间质系细胞和上皮系细胞的任一方构成，所述间质系细胞和上皮系细胞的任意一方来源于牙胚。

[0043] 作为此重建牙胚形成工序，可以直接使用国际公开第2006/129672号所记载的方法。

[0044] 这里，第1细胞集合体及第2细胞集合体分别仅由间质系细胞构成、或者仅由上皮系细胞构成，各个细胞集合体实质上由这些中任一种细胞构成。“细胞集合体”是指细胞密集后的状态，可以是组织的状态，还可以是由单一细胞的状态制备成的细胞集合体(细胞凝集体)。另外，“实质上”是指尽量不含成为对象的细胞以外的物质。构成该细胞集合体的细胞的数量随动物的种类、支撑载体的种类、硬度和大小而不同，每个细胞集合体一般可1 8 3 8
以为10 ～10 个，优选为10 ～10 个。

[0045] 本制造方法中使用的间质系细胞及上皮系细胞，为了再现在生物体内的细胞配置，有效形成具有特有结构及方向性的牙齿，至少任意一方来源于牙胚即可，但为了确实可靠地形成牙齿，最优选间质系细胞及上皮系细胞均来源于牙胚。作为牙胚，从细胞的分化阶段的幼年性和均质性的观点出发，优选来自于蕾状期、来自于帽状期的牙胚。

[0046] 作为牙胚以外来源的间质系细胞，是来源于生物体内的其他间质组织的细胞，优选的可以举出不含血液细胞的骨髓细胞或间质系干细胞，更优选的可以举出口腔内间质系细胞或颌骨内部的骨髓细胞、头部神经嵴细胞来源的间质系细胞、可产生上述间质系细胞的间质祖细胞或其干细胞等。

[0047] 另外，作为牙胚以外来源的上皮系细胞，是来源于生物体内的其他上皮系组织的细胞，优选的可以举出皮肤或口腔内的粘膜或者牙肉的上皮系细胞，更优选的可以举出皮肤或粘膜等的可产生经分化的、例如角化的或角化不全的上皮系细胞的不成熟上皮系祖细胞，如非角化上皮系细胞或其干细胞等。

[0048] 牙胚及其他组织可以从哺乳动物的灵长类例如人、猴子等，有蹄类例如猪、牛、马等，小型哺乳类的啮齿类例如小鼠、大鼠、兔子等，其他的狗、猫等各种动物的颌骨等进行采集。牙胚及组织的采集直接使用通常在组织采集中所用的条件即可，在无菌状态下取出、保存在适当的保存液中即可。需要说明的是，作为人的牙胚，除了第3大臼齿的所谓智齿的牙胚之外，还可举出胎儿牙胚，从利用自身组织的观点出发，优选使用智齿牙胚。另外，在为小鼠时，优选使用胎龄10天～16天的牙胚。

[0049] 由该牙胚制备间质系细胞及上皮系细胞如下进行：首先将分离自周围组织的牙胚根据形状分为牙胚间质组织及牙胚上皮组织。此时，为了容易进行分离，可以使用酶。作为在这种用途中使用的酶，可以举出分散酶、胶原酶、胰蛋白酶等。

[0050] 间质系细胞及上皮系细胞可以分别由间质组织及上皮组织制备成单一细胞的状态。为了容易地分散成单一的细胞，可以使用分散酶、胶原酶、胰蛋白酶等酶。

[0051] 需要说明的是，关于间质系细胞及上皮系细胞，为了获得足够的细胞数，可分别经过预备培养。

[0052] 作为培养所使用的培养基，可以使用通常动物细胞的培养所使用的培养基，例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)等，还可以添加用于促进细胞增殖的血清，或者作为代替血清的物质，可以添加例如FGF、EGF、PDGF等细胞增殖因子或转铁蛋白等已知的血清成分。需要说明的是，添加血清时的浓度可以通过此时的培养状态进行适当改变，但通常可以为10％。细胞的培养使用通常的培养条件，例如使用在37℃的温度、5％CO2浓度的培养箱内的培养。另外，还可以是适当添加了链霉素等抗生素的条件。

[0053] 作为本发明中使用的支撑载体，只要能在内部培养细胞即可，优选为与上述培养基的混合物。作为这种支撑载体，可以举出胶原、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、弹性蛋白、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、细胞外基质混合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、Cellmatrix(商品名新田明胶株式会社制)、Mebiol Gel(商品名株式会社池田理化制)、Matrigel(商品名Becton Dickinson公司制)等或者它们的组合。这些支撑载体只要是在将细胞配置于内部时具有基本能够维持所配置的位置的程度的硬度即可，可以举出凝胶状、纤维状、固体状的载体。其中，从易于提供适当硬度或保持力的观点出发，更优选胶原、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、Cellmatrix、Mebiol Gel、Matrigel、细胞外基质混合物、弹性蛋白、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白或它们的组合，进一步优选胶原、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、细胞外基质混合物、Cellmatrix、Mebiol Gel、Matrigel或它们的组合。只要是这些支撑载体，则可以使构成各个细胞集合体的间质系细胞及上皮系细胞的细胞间及细胞集合体之间的相互作用良好。这里，能够维持细胞位置的硬度通常只要是能用作三维培养的硬度即可，即，在能够保持细胞配置的同时不会抑制增殖所导致的肥大化的硬度即可，可以容易地决定。

[0054] 需要说明的是，这里支撑载体只要是具有第1及第2细胞集合体能在载体内部发育的程度的厚度即可，可以根据目标组织的大小等适当设定。

[0055] 另外，支撑载体只要具备在细胞不会发生分散的情况下能够保持细胞的接触状态的保持力即可。这里所说的“接触状态”优选为在各细胞集合体中、在细胞集合体之间，为了确实可靠地使细胞相互作用而紧密(高密度)的状态，这种高密度的状态是指在为细胞凝集体时，例如可以以能够维持较仅是相互接触更强的密合状态的保持力来培养细胞。例如，在为胶原时，提供适于最终浓度2～3mg/ml的浓度、即基于JIS-K6503-1996的方法(作为利用直径12.7mm的柱塞按下4mm所需要的荷重进行测定)成为120g～250g凝胶强度的浓度下的使用的硬度。另外，对该凝胶强度并无限定，对于其他种类的支撑载体，只要是通过同样的评价方法为相同的强度，则优选用作本发明的支撑载体。另外，通过混合1种或多种支撑载体，还可获得硬度与目标凝胶强度相当的支撑载体。

[0056] 高密度的状态是指与构成组织时的密度为同等程度，例如在为细胞集合体时，在7 9
细胞配置时为5×10 ～1×10 个/ml，为了在不损害细胞活性的情况下确实可靠地使细胞
8 9 8 8
相互作用，优选为1×10 ～1×10 个/ml、最优选为2×10 ～8×10 个/ml的密度。为了将细胞集合体制备成这种细胞密度，优选利用离心使细胞凝集、沉淀，其原因在于可以在不损害细胞活性的情况下简单地进行高密度化。这种离心可以在与不损害细胞生存的300～
1200×g、优选500～1000×g离心力相对应的转速下进行3～10分钟。在低于300×g的离心下，细胞的沉淀变得不充分，细胞密度会降低，另一方面，在高于1200×g的离心下，有时会损伤细胞，因而均不优选。

[0057] 通过离心分离制备高密度细胞时，通常在进行细胞离心分离所使用的管等容器内制单细胞的悬浮液后进行离心分离，使作为沉淀物的细胞残留，尽量除去上清即可。

[0058] 在通过离心分离制成沉淀物时，直接将沉淀物配置在支撑载体的内部即可。此时，目标细胞以外的成分(例如培养液、缓冲液、支撑载体等)优选与细胞的容量等量或其以下，最优选不含目标细胞以外的成分。这种高密度的细胞集合体中，细胞紧密接触，使细胞间相互作用有效发挥。当将目标细胞以外的成分极少的细胞集合体配置在支撑载体内部时，由于支撑载体的固化等而进一步凝集，成为更为紧密的状态。

[0059] 另外，第1细胞集合体与第2细胞集合体的接触越紧密则越优选，特别优选将第2细胞集合体按压在第1细胞集合体上进行配置。另外，用不抑制培养液、酶透过的固形物将第1细胞集合体和第2细胞集合体的周围包裹，对于使细胞集合体之间的接触紧密也是有效的，在粘度不同的溶液中放入密度高的细胞悬浮液进行配置、直接将溶液固化，由于可以容易地达成细胞的接触保持，因此优选。此时，使第1细胞集合体为牙胚间质系细胞的单一细胞集合物、使第2细胞集合体为牙胚上皮组织时，优选使牙胚上皮组织的釉结接触于第1细胞集合体而进行配置，但并非限定于此。

[0060] 当支撑载体为凝胶状或者溶液状等时，在配置于支撑载体内部后还可设置将支撑载体固化的固化工序。支撑载体的固化还可直接使用通常使用的支撑载体的固化条件。例如，在支撑载体中使用胶原等可固化的化合物时，在通常适用的条件下，例如通过在培养温度下使其静置数分钟～数十分钟，可以进行固化。由此，在能够固定支撑载体内部的细胞间的结合的同时，能够变得很牢固。

[0061] 作为用于形成重建牙胚的培养期间，随配置于支撑载体内部的细胞数及细胞集合体的状态、培养的实施条件而不同，进而随动物种类而不同，一般来说优选为至少1天的培养期间，更优选为3天以上的培养期间。只要是通过该期间培养所获得的重建牙胚或牙齿，则即便埋设在缺损部中，也可作为功能性牙齿萌出。

[0062] 另外，通过延长该培养期间，重建牙胚的形成过程按照牙本质及牙釉质的蓄积、牙冠形成及牙根的形成而进行。因此，用于该重建牙胚形成的培养期间可根据实施条件、动物种类、重建牙胚的状态等进行适当调整，例如为后述的器官培养时，可第7天、根据情况也可第6天进入之后的埋设工序，或者根据重建牙胚的状态或其他培养方法可超过30日天、根据情况也可超过50天、超过100天或超过300天。

[0063] 支撑载体内部的培养可以是单独利用内包有第1及第2细胞集合体的支撑载体的培养，还可以是在其他动物细胞的存在下的培养。

[0064] 当使支撑载体内部的培养为仅利用支撑载体的培养时，可以是动物细胞的培养所使用的通常条件下的培养。这种培养一般可以直接使用在动物细胞下的培养条件，可以直接使用上述条件。另外，培养中可以添加哺乳动物来源的血清，还可添加对这些细胞的增殖或分化有效的已知的各种细胞因子。作为这种细胞因子，可以举出FGF、BMP等。

[0065] 另外，从组织或细胞集合体的气体交换或营养供给的观点以及在不与其他动物细胞相接触的情况下可全过程在体外进行制备的观点出发，优选使支撑载体内部的培养为器官培养。器官培养中，一般在适于动物细胞增殖的培养基上漂浮多孔性膜，在该膜上放置用支撑载体包埋的第1及第2细胞集合体进行培养。这里所使用的多孔性膜优选为具有多个0.3～5μm左右孔的膜，具体可以举出Cell Culture Insert(商品名)、Isopore Filter(商品名)。

[0066] 作为利用器官培养的培养期间，可以是1天～7天左右、优选为3～6天。

[0067] 当在其他动物细胞的存在下进行支撑载体内部的培养时，受到来自于动物细胞的各种细胞因子等的作用，可以在早期形成具有特有细胞配置的牙齿。这种在其它动物细胞的存在下的培养可以使用单一细胞或培养细胞通过生物体外的培养来进行。

[0068] 可用于该用途的动物可优选地举出哺乳动物例如人、猪、小鼠等，优选与牙胚组织为相同种类或者改变成免疫缺陷的其他种类。在使用生物体时，作为适合的生物体部位，为了尽量正常地产生动物细胞的器官或组织，可举出肾脏皮膜下、肠系膜、皮下移植等。在这种动物细胞存在下的培养期间与上述器官培养等一样，可根据细胞的来源、培养条件、移植用动物种类等适当调整。

[0069] 通过这种重建牙胚形成工序，可获得能具有作为内侧具有牙本质、外侧具有牙釉质的牙齿的特有细胞配置(结构)的牙胚或具有它们的牙齿。另外，优选还具备所谓牙齿的前端(牙冠)和牙根的方向性。

[0070] 另外，当使第1细胞集合体和第2细胞集合体均为单一细胞的集合体时，由于获得具有牙齿特有的细胞配置的多个牙齿所构成的牙齿集合体，因此优选。获得该牙齿集合体时，可以将各个牙齿从集合体中分离后使用。

[0071] 在本发明的修复材料的制造方法的方向确认工序中，按照可以使牙齿的前端部为口腔内侧并埋设于牙齿缺损部内的方式，确认通过上述重建牙胚形成工序获得的牙胚或牙齿的方向性。

[0072] 牙胚或牙齿的方向性是指用于埋设于牙齿缺损部的方向性，在观察到牙冠的形成时，将牙冠确认为口腔内侧；在未观察到牙冠的形成时，将牙冠相当部的上皮细胞层或重建牙胚的上皮细胞层确认为口腔内侧。或者，还可以将重建牙胚的上皮·间质系细胞层的开放部分确认为口腔内的相反侧。通过按照这里所确认的方向性将牙胚或牙齿配置于牙齿的缺损部，牙齿的前端部(牙冠)变成口腔内侧，在与周围牙齿相同的方向上齐整。

[0073] 通过该方向性确认工序确认了方向性的牙胚或牙齿，在上述牙齿缺损部中被用作用于获得缺损后的牙齿的等价物的修复材料。

[0074] 即，含有方向性确认后的牙胚或牙齿的修复材料，用于向牙齿缺损部中的埋设。修复材料中的牙胚或牙齿之后随时间的经过在缺损部内生长，作为牙齿的等价物萌出。虽然随修复材料中的牙胚或牙齿的状态或大小等而不同，但所萌出的牙齿等价物的前端部(牙尖)到达与周围牙齿的前端部基本相同的位置(咬合平面)，不会进一步延长。直至萌出、咬合的埋设期间随动物种类或所埋设的牙胚或者牙齿的状态而不同。

[0075] 萌出的牙齿等价物具备与生来的牙齿相同的硬度(硬度)。硬度为牙齿等价物的牙本质及牙釉质耐受挤压或磨损等所导致的变形的尺度，可利用努氏硬度的测定进行确认。成年小鼠的正常牙齿的牙釉质的努氏硬度为300～600KHN、优选为300～500KHN，正常牙本质的努氏硬度为60～120KHN，通过本发明获得的牙齿等价物显示该范围内的努氏硬度。由此发挥与正常牙齿相同的咀嚼功能。

[0076] 另外，所萌出的牙齿等价物除了具备牙釉质、牙本质之外，还具备牙髓、牙根膜，显示与正常牙齿相同的组织构成。由于牙齿具备牙根膜，因此也会发生神经的侵入，也会保持相对于压迫等对牙齿的侵害刺激的应答能力。这种组织构成除了利用目视进行确认之外，还可通过常规方法利用组织学解析、免疫学染色及基因表达等进行确认。

[0077] 如此通过本发明的修复材料的制造方法获得的修复材料，可以作为具备能够与对咬牙相咬合的牙齿的长度及硬度的牙齿等价物的原材料使用。

[0078] 另外，在本发明的牙齿缺损部的修复方法中的埋设工序中，将通过上述重建牙胚形成工序获得的牙胚或牙齿作为修复材料埋设在缺损部中。

[0079] 此时，作为牙胚或牙齿的埋设方向，与上述修复材料的制造方法的方向确认工序一样，当可观察到牙冠的形成时，优选按照使牙冠为口腔内侧的方式进行配置；当未观察到牙冠的形成时，优选按照使牙冠相当部的上皮细胞层或重建牙胚的上皮细胞层为口腔内侧的方式进行配置，或者优选按照使重建牙胚的上皮·间质细胞层的开放部分为口腔内的相反侧的方式进行配置。由此，牙齿等价物的前端部(牙冠)变为口腔内侧，可以在与周围牙齿相同的方向上齐整。

[0080] 缺损部的大小及深度通常只要是通过拔牙等设置在牙肉中的大小及深度即可，形状并无特别限定。再生的牙胚只要能够埋设，则可以通过缺损部位、成为对象的动物种类、目标牙齿的种类等适当调整。

[0081] 这种缺损部通常位于颌骨、口腔的牙槽骨等。另外，当由于牙齿缺失而牙槽骨量减少时，还可以对该缺损部位利用GTR法(guided tissue regeneration：组织再生诱导法)等用于植入埋设的临床上使用的公知方法进行骨的再生，增加骨量。在将牙胚或牙齿配置于孔部后，优选根据通常的处理进行缝合等。

[0082] 埋设后的牙胚之后随时间的经过在缺损部内部生长成牙齿，作为牙齿等价物萌出。与关于上述修复材料的制造方法所记载的事项同样，随埋设的牙胚的状态或大小等而不同，萌出的牙齿等价物的前端部(牙尖)到达与周围牙齿前端部基本相同的位置(咬合平面)，不会进一步延长。由此，可以达到能够与对咬牙相咬合的牙齿的长度。至萌出、咬合的埋设期间随动物种类或所埋设的牙胚或者牙齿的状态不同。

[0083] 萌出的牙齿等价物与关于上述修复材料的制造方法所记载的事项同样，具备与生来的牙齿相同的硬度(硬度)。硬度为承受得住由于牙齿等价物的牙本质及牙釉质进行挤压或擦过等所导致的变形的尺度，可利用努氏硬度的测定进行确认。成年小鼠的正常牙齿的牙釉质的努氏硬度为300～600KHN、优选为300～500KHN，正常牙本质的努氏硬度为60～120KHN，通过本发明获得的牙齿等价物显示该范围内的努氏硬度。由此发挥与正常牙齿相同的咀嚼功能。

[0084] 另外，所萌出的牙齿与关于上述修复材料的制造方法所记载的事项一样，除了具备牙釉质、牙本质之外，还具备牙髓、牙根膜，显示与正常牙齿相同的组织构成。由于牙齿具备牙根膜，因此也会发生神经的侵入，也会保持相对于压迫等对牙齿的侵害刺激的应答能力。这种组织构成除了利用目视进行确认之外，还可通过常规方法利用组织学解析、免疫学染色及基因表达等进行确认。

[0085] 本发明的牙齿的缺损部的修复方法，可以通过使用如上进行了重建的牙胚或牙齿对牙齿缺损部进行修复，按照具有与正常牙齿同等的硬度、获得正常咬合、具有与正常牙齿同等的刺激应答性的方式，对牙齿缺损部进行修复。其结果，在缺损部再生的牙齿等价物作为功能性牙齿发挥作用，可以长期维持修复状态。

[0086] 因而，由于可以维持生活品质，因此在审美领域中被良好地使用。另外，由于可以避免口腔内的牙齿缺损部的存在所导致的健康状态恶化，因此可以维持牛、马、猪等家畜或者狗、猫等宠物等人以外的哺乳动物的健康状态。

[0087] 【实施例】

[0088] 以下对本发明的实施例进行说明，但并非限定于此。实施例中的％只要没有特别限定，则为重量(质量)基准。

[0089] [实施例1]

[0090] (1)牙胚上皮系细胞和牙胚间质系细胞的制备

[0091] 为了进行牙齿的形成实施牙胚的再构建。作为该实验模型使用小鼠。

[0092] 在显微镜下利用常规方法从C57BL/6N小鼠(购自日本CLEA)的胎龄14.5天的2+ 2+
胚仔中摘取下颌臼齿牙胚组织。利用不含Ca ，Mg 的磷酸缓冲液(PBS(-))对下颌臼齿牙胚组织进行洗涤，利用在PBS(-)中添加了最终浓度达到1.2U/ml的Dispase II(Roche，Mannheim，Germany)的酶液，在室温下处理12.5分钟，之后利用添加了10％FCS(JRH Biosciences，Lenexa，KS)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)洗涤3次。进而，添加DNaseI溶液(Takara，Siga，Japan)直至最终浓度达到70U/ml，将牙胚组织分散，使用25G注射针(Terumo，Tokyo，Japan)采用外科方式将牙胚上皮组织和牙胚间质组织分离。

[0093] 关于牙胚上皮系细胞，利用PBS(-)对如上获得的牙胚上皮组织洗涤3次，利用在PBS(-)中溶解了最终浓度达到100U/ml的Collagenase I(Worthington，Lakewood，NJ)的酶液，在37℃下重复20分钟的处理2次。进而利用0.25％Trypsin(Sigma)-PBS(-)对通过离心分离而沉淀回收的细胞在37℃下处理5分钟。利用添加了10％FCS的DMEM洗涤细胞3次后，对细胞添加最终浓度70U/ml的DNase I溶液，通过移液获得单一的牙胚上皮系细胞。

[0094] 另一方面，关于牙胚间质系细胞，利用PBS(-)对牙胚间质组织洗涤3次，利用含有0.25％Trypsin(Sigma)、50U/ml的Collagenase I(Worthington)的PBS(-)进行处理。添加70U/ml的DNase I(Takara)，通过移液获得单一的牙胚间质系细胞。

[0095] (2)重建牙胚的制作

[0096] 接着，使用如上制备的牙胚上皮系细胞及牙胚间质系细胞进行了牙胚再构建。在涂布了硅润滑脂的1.5mL微管(Eppendorf，Hamburg，Germany)中放入用添加了10％FCS(JRH)的DMEM(Sigma)进行混悬的牙胚上皮系细胞或者牙胚间质系细胞，通过离心分离将细胞作为沉淀回收。尽量地除去离心后的培养液的上清，再次进行离心操作，一边用实体显微镜进行观察，一边使用GELoader Tip 0.5-20μL(eppendorf)将残存于细胞沉淀周围的培养液完全地除去。之后通过轻叩或移液将细胞分散，准备用于重建牙胚制作的细胞。

[0097] 在涂布了硅润滑脂的陪替氏培养皿中滴加30μL的Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin，Osaka，Japan)，制作胶原凝胶滴。使用0.1-10μL的移液器枪头(Quality Scientific plastics)在该溶液中上样0.2μL～0.3μL的上述牙胚上皮系细胞或牙胚4
间质系细胞，制作细胞凝集块(细胞数：约5×10 个/凝集块)。关于重建牙胚，按照与之前制作的牙胚间质系细胞的细胞凝集块相接的方式，利用相同的方法将牙胚上皮系细胞上样，制作细胞凝集块，使两者相互紧密接触而制作了重建牙胚。

[0098] 在凝胶中制作的重建牙胚，在CO2培养箱中静置10分钟，将Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)固形化，将细胞块与作为支撑载体的周围凝胶一起移至按照Cell Culture Insert(孔大小为0.4微米的PET膜；BD，Franklin Lakes，NJ)与添加了10％FCS(JRH)的DMEM(Sigma)相接的方式进行安装的培养容器的Cell Culture Insert的膜上，器官培养18～24小时。培养后，继续在Cell Culture Insert上的器官培养，解析牙齿的发生。

[0099] (3)单个分离的方法

[0100] 在器官培养第2～5天，在实体显微镜下使用注射针或镊子对产生了多个牙胚的重建牙胚以外科方式分离成单个牙胚。在涂布了硅润滑脂的陪替氏培养皿上滴加Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin，Osaka，Japan)30μL，制作胶原凝胶滴。在该溶液中放入上述单个分离牙胚，在CO2培养箱中静置10分钟，将Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)固形化，将单个分离牙胚与作为支撑载体的周围凝胶一起移至按照Cell Culture Insert(孔大小为0.4微米的PET膜；BD，Franklin Lakes，NJ)与添加了10％FCS(JRH)的DMEM(Sigma)相接的方式进行安装的培养容器的Cell Culture Insert的膜上，器官培养18～24小时。

[0101] (4)口腔内移植

[0102] 利用注射针或镊子从如上制作的单个分离牙胚以外科方式将周围的凝胶除去，不将单个分离牙胚移植到肾脏皮膜下、直接移植到7～10周龄C57BL/6的上颌第一臼齿(M1)部牙槽骨。通过本发明，在口腔内使单个的牙齿萌出，实现咀嚼等口腔功能。

[0103] [实施例2]

[0104] (1)单个分离牙胚的制作

[0105] 与实施例1(1)～(2)同样地进行器官培养，在器官培养第2～5天，在实体显微镜使用注射针和镊子对产生多个牙胚的重建牙胚以外科方式分离成单个牙胚。在为单个分离牙胚时，在涂布了硅润滑脂的陪替氏培养皿上滴加Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin，Osaka，Japan)30μL，制作了胶原凝胶滴。在该溶液中放入上述单个分离牙胚，在CO2培养箱中静置10分钟，将Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)固形化，将单个分离牙胚与作为支撑载体的周围凝胶一起移至按照Cell Culture Insert(孔大小为0.4微米的PET膜；BD，Franklin Lakes，NJ)与添加了10％FCS(JRH)的DMEM(Sigma)相接的方式进行安装的培养容器的Cell Culture Insert的膜上，器官培养5天，当形成多个重建牙胚时，以外科方式分离成单一的再生牙胚。培养后利用注射针和镊子将周围的凝胶以外科方式除去，移植至8周龄C57BL/6的上颌M1部牙槽骨。

[0106] (2)口腔内移植方法

[0107] 在口腔内移植的3天前，对利用二乙基醚进行了吸引麻醉的8周龄C57BL/6以相对于体重20g为240μl的比例腹腔注射含5mg/ml戊巴比妥钠的生理盐水。使用镊子对麻痹了痛觉的小鼠的上颌M1从上颌拔出M1牙，确认没有残根，利用脱脂棉擦拭喷出的血液进行止血。对食物摄取而言，每天给予粉碎成粉末状的饲养用饲料。饲养3周以上，权衡拔牙齿窝的治愈，制作了M1缺损的C57BL/6。

[0108] 利用二乙基醚对通过上述方法制作的M1缺损的C57BL/6进行吸引麻醉，以相对于体重20g为240μl的比例腹腔注射含5mg/ml戊巴比妥钠的生理盐水。使麻痹了痛觉的小鼠为仰卧位固定在解剖台上，以最大开口的状态使用橡胶或线将上下颌固定。使用手术刀切开上颌M1部牙槽骨顶部牙肉，随骨膜一起将其剥离，示出下颌骨。使用销钳(极细钻头)在M1相当部下颌骨上制作直径1mm的孔，注意上颌洞不要穿孔，移植单个分离牙胚。移植后，使用骨膜牙龈翻瓣术将创部关闭，使用带针的线进行缝合。为了调整移植的单个分离牙胚的方向，使用亚甲基蓝对单个分离牙胚的牙尖部进行标记，使标记与萌出方向一致进行移植。对进行了口腔内移植的8周龄C57BL/6每日给予粉碎成粉末状的饲养用饲料。

[0109] 以相对于体重20g为240μl的比例对通过上述方法移植了单个牙胚的C57BL/6腹腔注射含5mg/ml戊巴比妥钠的生理盐水。使麻痹了痛觉的小鼠为仰卧位，固定在解剖台上，以最大开口的状态使用橡胶将上下颌固定，观察处于萌出前、即将萌出前、刚萌出后、萌出中、到达咬合面的各个状态的再生牙齿和远心部的M2、M3和周围牙肉。将观察结果示于图1。图1A～图1E中，左图表示萌出期(萌出前开始至刚萌出后)、中央图表示萌出后至咬合的时期、右图表示咬合后的时期，各个的右端为再生的牙齿。

[0110] 在移植后从20天后经过50天时，由M1牙肉部可见再生牙齿的牙尖，萌出开始。再生牙齿随着时间的经过增加牙冠长度，最终到达咬合平面。到达咬合平面的再生牙齿与对咬牙发生牙尖吻合(参照图1A～图1C)。

[0111] 由这些结果可知，再生牙齿形成与正常牙齿同样稳定的咬合关系，具有咀嚼功能。

[0112] (3)MicroCT解析

[0113] 将含有移植了单个分離牙胚的上颌骨的头部摘下，利用4％多聚甲醛—磷酸缓冲液将整个头部固定12小时后，利用inspeXio SMX-90CT(岛津制作所公司制)进行CT拍摄。CT拍摄时的设定是使视野数为600、平均数为10、扫描数为1、图像为512×512、标度为50、切片厚度为1、没有BHC，进行拍摄。进行CT拍摄所获得的数据使用分析软件Imaris(Zeiss公司制)再次构建3维立体，制作显微CT的截面图像。

[0114] 由MicroCT解析的结果可知，如图1D及图1E所示，萌出过程的再生牙齿一边形成牙根一边在长轴方向上移动从牙槽骨顶萌出，到达咬合平面。在牙根部，相当于牙根膜的空隙存在于与牙槽骨之间，在牙齿的截面图中，与正常牙齿同样地存在牙髓腔，在根尖处根尖口开放。在咬合状态下，与对咬牙进行牙尖吻合。由这些结果可知，在萌出的过程中，再生牙齿与正常牙齿同样，在保持牙根膜、牙髓腔的同时在牙槽骨内在长轴方向上移动，到达咬合平面。

[0115] 另外，将同样地用4％多聚甲醛—磷酸缓冲液进行了固定的头部的上下颌M3露出，水平的角度以连接下颌M3和下颌M1的咬合面的平面为基准，上下的角度以从侧面观察下颌M1的近中颊侧牙尖和近中舌侧牙尖时各自的重叠方式为标准，利用常规方法对中心咬合位口腔内照片进行拍摄。

[0116] 结果可知，再生牙齿与下颌的M1的远中牙尖相咬合，与上颌的M2、M3一起确立了水平的咬合平面。由这些结果可知，萌出的再生牙齿确立了适于下颌颌位诱导的咬合平面。

[0117] (4)努氏硬度

[0118] 将实施例2(1)中产生在口腔内的单个牙齿摘出，在同一牙齿上对3点以上测定该牙齿的牙釉质和牙本质的硬度。

[0119] 测定利用在微小硬度试验机(HM-102三丰公司制)中安装了2个对角172°30′和130°的努氏硬度测定用方锥金刚石压头(19BAA061三丰公司制)的机器进行。对再生牙齿以负荷10g按压压头10秒钟，由由此产生的7.11:1的菱形压痕长边的长度计算硬度。再生牙齿使用牙科用树脂(UNIFAST III GC公司制)固定在金属板上。牙釉质在与地面相水平的部分上进行测定；牙本质为使用齿科技工用引擎(ULTIMATE 500NAKANISI公司制)与地面水平地进行切割、露出待测面进行测定。将努氏硬度测定的结果示于图2。

[0120] 如图2所示，正常牙齿的牙釉质的平均努氏硬度在3周龄时为341.083KHN、6周龄时为457.5KHN、9周龄时为436KHN，再生牙齿的牙釉质为469.81KHN的硬度(参照图2A)。正常牙齿的牙本质平均努氏硬度在3周龄时为66.87KHN、6周龄时为76.53KHN、9周龄时为
88.58KHN，再生牙齿的牙本质为81.83KHN的硬度(参照图2B)。如此，与牙釉质、牙本质一起，再生牙齿为具有适于正常咀嚼功能的硬度的牙齿。

[0121] (5)组织学的解析

[0122] 在移植后从约20天开始经过50天时，由M1牙肉部可见再生牙齿的牙尖，萌出开始。观察萌出状沉，摘取萌出前、即将萌出前、刚萌出后、萌出中、咬合面到达状态的上颌骨。利用4％多聚甲醛—磷酸缓冲液固定16小时后，利用22.5％的甲酸脱灰72小时，利用常规方法进行石蜡包埋，制作了10μm的切片。脱灰液为每2个上颌骨50ml，在脱灰第48小时更换了全部。为了进行组织学的解析，根据常规方法进行苏木素-伊红染色。

[0123] 图3表示即将萌出前的再生牙齿(图3中白箭头)。如图3所示，通过组织学的解析可见与具有牙釉质、牙本质、牙髓、牙根膜的正常牙齿相同的组织结构。对于各个组织而言，牙釉质的釉质柱呈放射状、牙本质中也可见牙本质细管。牙根膜具有足够的厚度，为可缓冲咀嚼压力的结构。经过萌出的再生牙齿在形成牙根的同时，在长轴方向上移动，从牙槽骨顶萌出，到达咬合平面，在此过程中保持了牙根膜，与牙周组织相调和。

[0124] (6)利用矫正力的骨的重塑解析

[0125] 牙齿借助牙根膜与周围的牙槽骨相结合，因此当对牙齿赋予矫正力时，机械应激通过牙根膜被传达至周围环境。在被矫正力压迫的牙根膜部位处进行利用牙槽骨的破骨细胞的吸收、在被牵引的牙根膜部位处进行利用成骨细胞的骨形成，稳定地维持牙齿与牙槽骨之间的空间距离。为了评价这种牙根膜的功能，对再生牙齿施加矫正力，为了确认在正常牙齿的移动中可见的压迫侧的破骨细胞的出现、牵引侧的成骨细胞的出现等骨的重塑，进行以下的解析。

[0126] 使用直径0.012英寸的镍钛合金丝(VIM-NT矫正用线球型Oral Care株式会社)，在一侧的合金丝端弯成环，按照环能够适于安装在上颌两侧切牙牙齿颈部的方式，成形了颊侧移动矫正用合金丝。以相对于体重20g为240μl的比例对通过上述方法移植了单个牙胚的C57BL/6腹腔注射含5mg/ml戊巴比妥钠的生理盐水。使麻痹了痛觉的小鼠为仰卧位，固定在解剖台上，以最大开口的状态使用橡胶或线将上下颌固定。使环的相反侧的合金丝端的长度为在安装时到达萌出牙齿的远心部的长度。使颊侧移动矫正用合金丝的环适合于对相反侧的合金丝端进行矫正的牙齿的颊侧牙齿颈部，安装在上颌两侧切牙牙齿颈部，使用UnifilFlow(光聚合用树脂GC公司制)进行粘接固定。使适合于颊侧牙齿颈部的合金丝端移动至舌侧牙齿颈部，活化矫正力，之后为了对牙根膜所引起的骨的重塑现象进行解析，在骨的重塑现象变得特别显著的矫正6天后，进行组织学解析。将结果示于图4A～图4C。

[0127] 为了解析再生牙齿牙根膜对机械应激的应答功能，对再生牙齿施加颊侧移动的矫正力，通过苏木素-伊红染色像对骨的重塑的组织图像进行观察。

[0128] 其结果，在颊侧可见牙根膜腔变得狭窄、牙根膜纤维发生压缩的牙根膜的压迫(参照图4A的黑框B和图4B)。另一方面，在相反侧的舌侧，可见牙根膜腔放大、牙根膜纤维发生紧张的牙根膜的牵引(参照图4A的黑框C和图4C)。另外，沿着牙根膜的牵引侧牙槽骨壁，可见一层细胞的排列，因而这表明出现形成骨的成骨细胞(参照图4C箭头的头部)。而且，在牵引侧的相反侧的压迫侧，在牙槽骨内可见细胞体含有多个核的多核巨细胞、可见窝状的骨吸收图像，说明破骨细胞(参照图4B箭头)的出现和骨的吸收。

[0129] 由这些结果可知，再生牙齿与正常牙齿一样通过矫正力等机械应激，牙根膜发生应答、引起骨的重塑现象。

[0130] (8)疼痛刺激的解析

[0131] 已知牙齿的压迫所导致的疼痛会由矫正等导致，特别是存在于牙根膜的神经充当媒介，延髓三叉神经脊束核尾侧亚核区域的神经细胞中c-Fos蛋白质的产生有所提高(Byers MR.et al.，Crit Rev Oral Biol Med 10，4-39，1999.Deguchi T.et al.J Dent Res82：677-681，2003.、Fujiyoshi，Y.et al.，Neuroscience Letters 283，205-208，2000.)。
另外，已知牙髓的露出所导致的疼痛会由露髓处理等引起，与矫正所导致的疼痛同样，特别是存在于牙髓的神经充当媒介，延髓三叉神经脊束核尾侧亚核区域的神经细胞中c-Fos蛋白质的产生有所提高(Byers MR.et al.，Crit Rev Oral Biol Med 10，4-39，1999.Deguchi T.et al.J Dent Res 82：677-681，2003.)。因此，为了对再生牙齿的神经功能进行解析，对小鼠的再生牙齿进行与矫正同样的压迫刺激、以及进行利用牙科用钻在牙本质上开孔的露髓处理，对在延髓三叉神经脊束核尾侧亚核区域上c-Fos蛋白质的表达是否提高进行解析。

[0132] 以相对于体重20g为200μl的比例对通过上述方法移植了单个牙胚的C57BL/6腹腔注射含5mg/ml戊巴比妥钠的生理盐水。使麻痹了痛觉的小鼠为仰卧位，固定在解剖台上。

[0133] 使用上述方法，在矫正力活化后2小时和48小时以及进行了露髓处理的2小时后，用4％多聚甲醛—磷酸缓冲液对C57BL/6进行灌流固定。用4％多聚甲醛—磷酸缓冲液对摘出的延髓固定16小时后，通过常规方法包埋在OCT化合物(Miles Inc.，Naperville，IL)中，利用切片机(Leica，Wetzlar，Germany)制作50μm的切片。制作的切片以c-fos(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.，Santa Cruz，Calfornia，USA)为1抗、Goat IgG fraction to rabbit IgG(CAPPEL，Aurora，Ohio，USA)为2抗、Rabbit peroxidase anti-Peroxidase(CAPPEL，Aurora，Ohio，USA)为3抗，进行免疫染色，比较在延髓的三叉神经核中的表达。

[0134] 除去OCT化合物后，使用0.3％过氧化氢水-80％甲醇在室温下培养1小时，将内在性的酶活性封闭。接着，使用封闭液(3％Goat Serum-TBS)在室温下封闭1小时后，在4℃下使1抗反应72小时。洗涤后，使用封闭液在室温下封闭1小时，在室温下使2抗反应
1小时。洗涤后，进一步使用封闭液在室温下封闭1小时，在室温下使3抗反应1小时。进行充分的洗涤，滴加DAB/NAS基质溶液(含0.08～0.1％硫酸镍铵的0.04％DAB-0.003％过氧化氢-TBS)使其显色。显色后的切片在充分洗涤后，使用甘油进行密封。使用正置显微镜(Axioimager，Zeiss公司制)进行观察。将结果示于图5。

[0135] 其结果，如图5A所示，在未对再生牙齿进行矫正也未进行露髓的C57BL/6的延髓三叉神经脊束核尾侧亚核区域，虽然未见c-Fos蛋白质的表达，但如图5B及图5C所示，在对再生牙齿进行了矫正的C57BL/6的延髓三叉神经脊束核尾侧亚核区域，在2小时后诱导了c-Fos蛋白质的高水平表达，如图5C所示，其表达维持至48小时后。另外，如图5D所示，对再生牙齿进行了露髓处理的C57BL/6的延髓三叉神经脊束核尾侧亚核区域，在2小时后诱导了c-Fos蛋白质的高水平表达。由这些结果可知，存在于牙根膜区域的神经纤维感受到对再生牙齿施与矫正所产生的压迫刺激时所产生的压迫刺激以及疼痛刺激，与正常牙齿同样，将该刺激传达到中枢。

[0136] 通过如此使用本发明的修复方法，可以按照具有与正常牙齿同等的硬度、正常地获得咬合、具有与正常牙齿同等的刺激应答性的方式，对牙齿缺损部进行修复。

[0137] 日本申请号第2008-211870号的公开通过参照将其全部纳入本说明书中。

[0138] 记载于本说明书中的全部文献、专利申请以及技术规格与具体且分别地通过参照纳入各个文献、专利申请和技术规格的情况同等程度地通过参照纳入本说明书。

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