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骨膜素诱导的胰腺再生

阅读：491发布：2020-05-12

专利汇可以提供骨膜素诱导的胰腺再生专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明披露了一种使用重组骨膜素蛋白来再生胰腺组织的方法、编码所述骨膜素的核酸以及包括所述骨膜素的药物组合物。本发明还教导了编码骨膜素同种型(panc)的核酸的分离。，下面是骨膜素诱导的胰腺再生专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种通过给予骨膜素来再生胰腺组织的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述骨膜素是具有图3中给出的序列、或具有由具有核苷酸序列panc的核苷酸编码的序列的重组骨膜素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述再生的胰腺组织包含β-细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，用于治疗胰岛素依赖性糖尿病。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，通过注射进行给药。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述注射是注射到腹膜内空间中、注射到循环系统中、或者直接注射到胰腺中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述给药是外科插入包含所述骨膜素的凝胶或基质。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述再生的组织释放胰岛素。
9.一种通过给予编码骨膜素蛋白的核苷酸序列来再生胰腺组织的方法。
10.一种编码骨膜素蛋白的核苷酸序列，所述序列包括：
panc；
与panc同源的核苷酸序列；或
与panc的补体杂交的核苷酸序列。
11.一种通过给予权利要求10所述的核苷酸序列来再生胰腺组织的方法。
12.一种具有由权利要求10所述的核苷酸序列编码的序列的肽。
13.一种通过给予权利要求12所述的肽来再生胰腺组织的方法。
14.一种载体，包括：
panc；
与panc同源的核苷酸序列；或
与panc的补体杂交的核苷酸序列。
15.一种宿主细胞，包括权利要求14所述的载体。
16.一种通过给予骨膜素、权利要求10所述的核苷酸序列、或权利要求12所述的肽来治疗、或预防糖尿病或外分泌胰腺功能不全的发作的方法。
17.骨膜素、权利要求10所述的核苷酸序列、或权利要求12所述的肽在治疗、或预防糖尿病或外分泌胰腺功能不全的发作中的应用。
18.骨膜素、权利要求10所述的核苷酸序列、或权利要求12所述的肽在制备用于治疗、或预防糖尿病或外分泌胰腺功能不全的发作的药物中的应用。
本发明如上所述。

说明书全文

骨膜素诱导的胰腺再生

技术领域

[0001] 本发明总体上涉及骨膜素在胰腺组织的再生中的应用。

背景技术

[0002] 胰腺产生消化酶，以及几种重要的激素，包括胰岛素、胰高血糖素和生长抑素。产生激素的细胞集中在构成胰腺的大约1％-2％的郎格罕氏岛(胰岛)内。在健康的胰腺中，响应于升高水平的血糖，郎格罕氏岛内的β-细胞产生胰岛素。存在许多起因于胰腺组织损失或导致胰腺组织损失的疾病。这些疾病包括糖尿病(1型和2型)以及胰腺外分泌功能不全。

[0003] 1型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)是一种自身免疫性障碍，其中身体的免疫系统攻击β-细胞、破坏它们或足以损伤它们使得产生很少或者不产生胰岛素。虽然胰岛素替代疗法、严格的饮食控制和小心的血糖监测能够限制与糖尿病相关的并发症，但替换或再生胰腺是合乎需要的。

[0004] 2型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病)是一种代谢障碍，其最初的特征在于胰岛素抗性，而最终的特征在于胰腺β-细胞不能使胰岛素的产生与胰岛素的需求相适应。

[0005] 由于缺少由胰腺产生的消化酶，胰腺外分泌功能不全(EPI)不能完全消化食物。EPI是从患有囊性纤维化和舒-戴二氏综合征(Shwachman-Diamond Syndrome)的人中发现的。其是由产生消化酶的胰腺细胞的进行性损失引起的。慢性胰腺炎是人类中EPI的最常见起因。消化酶的损失导致营养物质的消化不良和吸收不良。

[0006] 本领域中对开发用于再生胰腺组织的方法和药物存在需要。

[0007] 胰岛的外科手术移植还未被证实是有效的，但已知胰腺细胞具有再生的能力。已经研究了胰腺再生促进因子，例如HIP、INGAP、GLP-1、艾塞那肽-4(Exendin-4)(例如，WO2006/096565、US6,114,307、和USRE39299)。

[0008] 骨膜素(Periostin)是一种约90kDa的分泌蛋白，在骨组织的骨膜中优先表达。(Takeshita et al.(1993).Biochem.J，294：271-8；Horiuchi et al.(1999).J.Bone Miner.Res.，14：1239-49)。骨膜素包括NH2-末端分泌信号肽，接着是富含半胱氨酸的结构域，4个内部同源重复，和COOH-末端亲水结构域。在每个重复结构域中，两个区域是高度保守的。骨膜素已经在各种癌症中被识别，并且它的存在已被认为是癌症的标记和治疗靶标(Kanno et al.(2008)int.J.Cancer 122：1707-18)。骨膜素还已经表明由胰腺星状细胞分泌(PSC)的，并保存PSC纤维发生活性，同时在应力条件下支持胰腺肿瘤细胞生长(Erkan，et al.(2007)Gastroenterology 132：1447-64)。

发明内容

[0009] 在第一方面，本发明提供了一种通过给予骨膜素来再生胰腺组织的方法。再生的组织可以包括β-细胞。本发明的方法能够被用于治疗由胰腺组织损失引起的或导致胰腺组织损失的疾病，诸如1型糖尿病、2型糖尿病、和EPI。

[0010] 在另一方面，给予的可以是编码骨膜素蛋白的核苷酸序列。

[0011] 在另外的方面，本发明提供了一种编码骨膜素蛋白的核苷酸序列，该序列包括：序列panc(图1)；与序列panc同源的核苷酸序列；或与序列panc的补体杂交的核苷酸序列。

[0012] 对于本领域普通技术人员来说，在结合附图阅读了本发明的具体实施方式的以下描述后，本发明的其他方面和特征将变得显而易见。

附图说明

[0013] 现在，将仅通过举例的方式参照附图来描述本发明的实施方式，其中：

[0014] 图1A-图1C示出了由5个不同核苷酸序列编码的骨膜素蛋白的示意图。

[0015] 图1D示出了图1A-图1C中所示的编码骨膜素蛋白同种型的可变异部分的5个骨膜素核苷酸序列的核苷酸序列比对。

[0016] 图2示出了图1D的另一示图。

[0017] 图3示出了重组人骨膜素蛋白的氨基酸序列。

[0018] 图4A-图4B总结了15个实验，其中用链脲佐菌素和骨膜素(以不同浓度)处理，或者单独用链脲佐菌素处理成对的小鼠。在图4A中，菱形表示在骨膜素处理的小鼠中具有正常血糖水平的小鼠对，但是在未经骨膜素处理的小鼠中具有STZ诱导的糖尿病；三角形表示在用骨膜素处理和未经骨膜素处理的小鼠对中具有STZ诱导的糖尿病的小鼠对。

[0019] 图4B示出了来自图4A的用骨膜素处理的小鼠对的血糖水平(mmol/L)为40到60μg/kg体重之间。

[0020] 图5A示出了编码图1B所示的骨膜素蛋白的同种型的核苷酸序列。

[0021] 图5B示出了图1B所示的和由图5A所示的序列编码的骨膜素蛋白的同种型的氨基酸序列。

[0022] 图6示出了具有移植的胰腺星形细胞的胰腺的组织形态。图6A和图6C示出了在注射后3天和1周表达GFP的野生型供体细胞的浸润。图6A是图6B中的箭头所指的区域的放大图。图6D-图6F表明注射有间充质细胞的胰腺呈现出：(D)形成表达上皮钙粘附蛋白(E-Cadherin)和Ngn3的管状复合物；(E)表达GFP的细胞包围表达细胞角蛋白-7管状结构；以及(F)表达GFP的细胞不表达Pdx-1。

[0023] 图7示出了直接注射的骨膜素对胰腺再生和胰岛素表达的影响。图7A-图7G示出了：(A)注射骨膜素一周后，在注射部位附近发现Ngn3+细胞；(B)在细胞角蛋白-7+管状复合物结构中观察到胰岛素表达；(C)在注射盐水后没有检测到胰岛素表达；(D和E)注射四周后，在管状结构内和管状结构周围观察到胰岛素表达；(F)胰岛素+簇(cluster)包含表达胰高血糖素的细胞；(G)胰岛素+簇包含表达Ngn3的细胞。

具体实施方式

[0024] 总体上，本发明提供了一种利用骨膜素来再生胰腺组织的方法。在一种具体实施方式中，本发明提供了一种使用骨膜素来再生郎格罕氏岛内的各种胰腺细胞的方法。在另外的实施方式中，本发明提供了一种利用骨膜素来再生郎格罕氏岛内的β-细胞的方法。在另一实施方式中，本发明涵盖骨膜素的新同种型，包括编码该新同种型的核酸。

[0025] 骨膜素存在于各种同种型中。如本文所使用的，“同种型”被定义为“两种或多种来自其中不同的外显子已被去除的具有类似的但不完全相同的氨基酸序列并且由不同的基因或RNA转录物编码的功能上类似的蛋白质中的任一种”(Merriam-Webster′s Medical Dictionary OnLine)。

[0026] 如图1所示，编码骨膜素的核酸序列由保守的EMI结构域(约75个氨基酸的小的富含半胱氨酸的模块，在发现其存在于EMILIN家族的蛋白中后而被首次命名)和4个成束蛋白重复(fasciclin repeats)构成。羧基末端包括多个外显子。如何剪切除去(splice out)这些外显子的变化导致骨膜素的各种同种型。

[0027] 图1和图2示出了编码鼠类骨膜素的4个已知同种型的核苷酸序列。虽然这些序列是由从小鼠分离的核酸确定的，但可以认为其它哺乳动物物种也会包含基本上相似的骨膜素基因。同种型#1是骨膜素的最长的已知同种型，并且包括所有23个外显子(由核苷酸序列PN1编码，图2)。同种型#2(由核苷酸序列PN2编码，图2)是最先被鉴定的骨膜素蛋白的同种型，并且起初被命名为成骨细胞特异性因子2(Osteoblast Specific Factor-2，OSF-2)；它不包括外显子17。同种型#3最近被命名为骨膜素样因子(Periostin-Like-Factor，PLF)并且包括外显子17而不包括外显子21(由核苷酸序列PN3编码，图2)。同种型#4目前是最近公开的骨膜素同种型，并且其不包括外显子20和21(由核苷酸序列PN4编码，图2)。

[0028] 本发明涵盖作为骨膜素的第5个新的同种型，此处被称为PANC(由所有大写字母标识的蛋白)。PANC是胰腺再生期间最经常表达的骨膜素的同种型。PANC的尺寸类似于同种型#4，但是不包括外显子17和21，如通过直接测序所示出的。图1示出了编码PANC(SEQ ID No：1，图2)的核苷酸序列的可变部分和骨膜素的上述4个鼠类同种型的比对。因此，本发明涵盖panc的核酸序列(由所有小写字母标识的DNA)，和PANC蛋白，以及分离的panc核酸和PANC蛋白。

[0029] 图3示出了重组人骨膜素蛋白的氨基酸序列。图5A示出了编码由图1B所示的骨膜素蛋白的鼠类同种型的核苷酸序列(SEQ ID No：3)。图5B示出了图1B所示的并且由图5A所示的序列编码的骨膜素蛋白的鼠类同种型的氨基酸序列(SEQ ID No：2)。

[0030] 在1型糖尿病中，免疫系统攻击胰腺；因此，在一个方面，骨膜素分子可以与免疫抑制剂组合给予。

[0031] 定义：术语“治疗病症或疾病”在本发明的上下文中是指预防、阻止病症或疾病的发展或延缓病症或疾病的进展。

[0032] 术语“再生”在本发明的上下文中涵盖使细胞的数目增加(增殖)以及使干细胞分化成新细胞。胰腺组织的再生包括新胰腺细胞的增殖、星形细胞增殖的诱导、和/或管状复合物形成。

[0033] 骨膜素核酸分子：本发明的骨膜素核酸分子可以是cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA，并且可以是双链或单链的(即，正义链或反义链)。这些分子的链段也可以被认为在本发明的范围内，并且可以通过例如聚合酶链反应(PCR)产生或通过用一种或多种限制性内切酶处理来生成。核糖核酸(RNA)分子可以通过体外转录而产生。优选地，核酸分子编码在正常生理条件下是可溶的多肽，而与多肽的长度无关。

[0034] 本发明的核酸分子可以包含天然存在的序列，或者与那些天然存在的序列不同但由于遗传密码的简并而编码相同多肽的序列。此外，这些核酸分子不限于编码序列，例如，它们可以包括位于编码序列的上游或下游的非编码序列中的一些或全部。

[0035] 本发明的核酸分子可以由生物细胞合成(例如，通过基于亚磷酰胺的合成)或获自生物细胞，诸如哺乳动物的细胞。该核酸可以是人类、非人类灵长类(例如，猴子)、小鼠、大鼠、豚鼠、牛、羊、马、猪、兔、狗或猫的核酸。还涵盖了这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰。

[0036] 此外，本发明的分离的核酸分子涵盖未发现像这样的天然状态的链段。因此，本发明涵盖重组核酸分子(例如，编码结合到载体(例如，质粒或病毒载体)中或结合到异源细胞的基因组(或同源细胞的基因组，在不同于天然染色体位置的位置处的骨膜素的分离的核酸分子)。

[0037] 骨膜素家族基因或蛋白能够分别基于其与相关的骨膜素基因或蛋白的相似性而被识别。例如，该识别可基于序列同一性。本发明的特征在于分离的核酸分子，其至少50％(或55％，65％，75％，85％，95％，或98％)相同于：(a)panc的核苷酸序列(图2)；以及(b)包括panc的至少30(例如，至少50，100，150，150，200，250，300，350，400，500，700，900，1100，1400，1700，2000，2200，2250，2300或2310)个核苷酸的链段的核酸分子(图2)。

[0038] 两个序列之间的百分比同一性的确定利用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：58735877的数学算法来完成。将这样的算法结合于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215，403410的BLASTN和BLASTP程序中。BLAST核苷酸研究利用BLASTN程序来进行，得分＝100，字长＝12，以获得与编码骨膜素的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白研究利用BLASTP程序来进行，得分＝50，字长＝3，以获得与骨膜素多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙比对，如在Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：33893402中所描述的利用GappedBLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各自程序的缺省参数(例如，XBLAST和NBLAST)。

[0039] 也可以使用杂交作为两个核酸序列之间的同源性的度量。根据标准杂交技术，编码骨膜素的核酸序列，或其一部分可以被用作杂交探针。骨膜素探针与来自测试来源(例如，哺乳动物细胞)的DNA或RNA的杂交是测试来源中存在骨膜素DNA或RNA的指征。杂交条件对于本领域技术人员来说是已知的，并且可在Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.，6.3.16.3.6，1991中找到。适度的杂交条件被定义为相当于在30℃下在2×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在50℃下在1×SSC，0.1％SDS中洗涤。高度严格的条件被定义为相当于在45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在65℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤。

[0040] 本发明还涵盖：(a)包含任何前述骨膜素相关的编码序列和/或它们的补体(即，“反义”序列)的载体；(b)包含任何前述骨膜素相关的编码序列的表达载体，该序列可操作性地连接于编码序列的直接表达所需的任何转录/翻译调控元件；(c)编码除了骨膜素多肽之外的与骨膜素无关的序列的表达载体，诸如报告子、标记物、或融合于骨膜素的信号肽；以及(d)包含任何前述表达载体以及由此表达本发明的核酸分子的基因工程宿主细胞(参见下文)。

[0041] 重组核酸分子可以包含编码骨膜素或具有异源信号序列的骨膜素的序列。全长骨膜素多肽、或其片段可以被融合于这样的异源信号序列或另外的多肽。类似地，本发明的核酸分子能够编码骨膜素的成熟形式或包括促进分泌的外源性多肽的形式。

[0042] 上文中提及的以及下文中进一步描述的转录/翻译调控元件包括但不限于可诱导的和不可诱导的启动子、增强子、操纵基因(operator)和本领域技术人员已知并且驱动或以其他方式调控基因表达的其他元件。这样的调控元件包括但不限于巨细胞病毒hCMV即刻早期基因、SV40腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trt系统、TAC系统、TRC系统、噬菌体A的主要操纵基因和启动区、fd 外壳蛋白的调控区(control region)、3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子、和酵母α-交配因子(α-mating factor)的启动子。

[0043] 类似地，核酸可以形成编码另外的多肽序列的部分杂合基因，例如，起标记物或报告子作用的序列。标记物和报告基因的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰基转移酶r r(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基葡糖苷磷酸转移酶(neo，G418)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)、和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。与本发明的实践相关的许多标准程序一样，普通技术人员知晓其他有用的试剂，例如，能够起到标记物或报告子功能的其他序列。通常，杂合多肽包括第一部分和第二部分；第一部分是骨膜素多肽，而第二部分是例如上文中所述的报告子或Ig恒定区或Ig恒定区的一部分，例如，IgG2a重链的CH2和CH3结构域。其他的杂种可以包括促进纯化的抗原标签或His标签。

[0044] 可以用于本发明的目的的表达系统包括但不限于用包含本发明的核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA、或粘粒DNA表达载体转染的微生物，如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用包含本发明的核酸分子的重组酵母表达载体转染的酵母(例如，酵母菌属和毕赤酵母)；用包含本发明的核酸分子的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含骨膜素核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))感染或用包含骨膜素核苷酸序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转染的植物细胞系统；或包含含有衍生自哺乳动物细胞(例如，金属硫蛋白启动子)的基因组或衍生自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子和痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、VERO、HeLa、MDCK、WI38和NIH 3T3细胞)。直接获自哺乳动物和用质粒载体转染或用病毒载体感染的原代或次代细胞也可用作宿主细胞。

[0045] 于是，用本发明的表达载体转染或转导的细胞可以通过本领域中已知的方法被用于例如大规模或小规模地体外生产骨膜素多肽或其抗原片段。本质上，这样的方法涉及在使多肽或抗原片段的生产最大化的条件下培养细胞并且从细胞或培养基中将其分离出来。

[0046] 骨膜素蛋白/多肽：本发明的以及用于本发明的骨膜素蛋白/多肽包括具有和没有信号肽的骨膜素。它们还包括重组形式和同种型。

[0047] 骨膜素分子的氨基酸序列可以与骨膜素分子的野生型序列相同。还涵盖与骨膜素的野生型序列基本上相同的多肽。当应用于蛋白质时，术语“基本上同一(性)(substantial identity)”可以意指两个序列，当它们最佳比对时，例如通过使用缺省空位权重的GAP或BESTFIT程序，通常共有至少约70％的序列同一性，可替换地至少约80％、85％、90％、95％的序列同一性或更高。可替换地，多肽中的任一种可以包含诸如缺失、加入、或置换的突变。其所有要求是突变体骨膜素分子具有至少5％(例如，10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％、甚至更高)的野生型骨膜素分子结合于特异于野生型骨膜素的抗体的能力。

[0048] 对于氨基酸序列，不相同的氨基酸残基可由于保守氨基酸置换而不同。术语“保守置换”是指用另一个氨基酸来替代一个氨基酸，其中两个氨基酸是具有某些共同性质的氨基酸基团(组)的成员。确定单独的氨基酸之间的共同性质的有用途径是分析同源生物体的相应蛋白之间的氨基酸变化的归一化频率(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer.，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。根据这样的分析，组内的氨基酸优先彼此交换的氨基酸的组可以被确定，因此在它们对整个蛋白结构的影响方面彼此最为相似(Schulz，G.E.合R.H.Schirmer.，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。以这种方式限定的一组氨基酸基团的一个实例包括：(i)带电基团，由Glu和Asp、Lys、Arg和His构成，(ii)带正电荷的基团，由Lys、Arg和His构成，(iii)带负电荷的基团，由Glu和Asp构成，(iv)芳香基，由Phe、Tyr和Trp构成，(v)氮环基团，由His和Trp构成，(vi)大的脂肪族非极性基团，由Val、Leu和Ile构成，(vii)极性较小的基团，由Met和Cys构成，(viii)小的残基基团，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro构成，(ix)脂肪族基团，由Val、Leu、Ile、Met和Cys构成，以及(x)小的羟基基团，由Ser和Thr构成。

[0049] 多肽可以从天然来源(例如，血液，血清，血浆，诸如胰腺、肺、胎盘、或结肠组织的组织或细胞，或在癌性细胞或正常细胞中天然产生骨膜素多肽的任何细胞)纯化。骨膜素分子可以是人类、非人灵长类(例如，猴)、小鼠、大鼠、豚鼠、牛、羊、马、猪、兔、狗、或猫的那些分子。也可以通过标准化学方法来方便地合成更小的肽(长度小于100个氨基酸)。另外，多肽和肽均可以通过标准的体外重组DNA技术和使用编码适当的多肽或肽的核苷酸序列的体内基因转移(transgenesis)来生产。本领域技术人员公知的方法可以用来构建包含相关编码序列和适当的转录/翻译控制信号的表达载体。参见，例如，在Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版)[Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989] 和 Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology[Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，1989]中描述的技术。

[0050] 重组骨膜素可以用于本发明的方法中。在图3中提供了可用于本发明中的重组骨膜素的实例。

[0051] 本发明的蛋白和多肽还可以通过本领域已知技术由上文中讨论的核酸分子中的任一种来生产。

[0052] 本发明的多肽包括全长骨膜素的片段，其中这样的片段还能够再生胰腺组织。这样的多肽片段可以包含至少15个(或30、50、100或150个)骨膜素蛋白的保守氨基酸的序列。该多肽片段包含在不存在蛋白的其他部分的情况下具有生物学活性的骨膜素的一部分。如本领域中已知的，经常的情况是，可以从蛋白的末端去除相对少量的氨基酸而不破坏活性。

[0053] 多肽或多肽片段可以是较大的蛋白的部分，诸如与第二蛋白或多肽的基因融合。可替换地，该多肽或多肽片段可以例如借助于交联剂而与第二蛋白结合。

[0054] 骨膜素或其多肽部分可以通过与聚合物的共价结合而被化学修饰。例如，可以这样做以增加其循环半衰期。聚合物以及将它们连接于肽的方法示于美国专利号第4,766,106号、第4,179,337号、第4,495,285号和第4,609,546号中。聚合物的实例是聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下可溶于水并且具有通式：R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R可以是氢，或诸如烷基或链烷醇基之类的保护基团。该保护基团可以具有1至8个碳，并且可以是甲基。符号n是正整数，通常在1到1,000之间，并且可以在2到500之间。
PEG具有在1000到40,000之间的典型平均分子量，并且可以在2000到20,000之间，或在
3000到12,000之间。PEG可以具有至少一个羟基，并且可以具有末端羟基。

[0055] 药物配方和给药途径：包含骨膜素蛋白或其片段的药物组合物可以用于治疗胰腺功能不全。在另一方面，该药物组合物可以包含根据本发明的骨膜素核苷酸序列。

[0056] 本发明的组合物可以利用一种或多种药用载体以常规方式配制，例如口服、含服、鼻内、肠胃外(例如，静脉注射、肌肉注射或皮下注射)、局部或直肠给药或以适合于通过吸入剂给药的形式配制。该组合物可以直接被注射到胰腺、循环系统、或腹膜内空间中。给药可以是外科插入包含该组合物的凝胶或基质。

[0057] 当使用液体配方时，多肽或核酸可以以不同的浓度或使用不同的配制剂进行配制。例如，这些配制剂可以包括油、聚合物；维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂、或填充剂。碳水化合物包括糖或糖醇，诸如单糖、二糖、或多糖，或水溶性葡聚糖类。糖类或葡聚糖类可以包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、芽霉菌糖、糊精、α-和β-环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素、或它们的混合物。蔗糖是一个实例。糖醇被定义为具有-OH基团的C4至C8碳氢化合物，并且包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、丙三醇、和阿拉伯糖醇。甘露醇是一个实例。上文中提到的这些糖或糖醇可以单独使用或组合使用。对于用量没有固定的限制，只要该糖或糖醇可溶于含水型制剂即可。糖或糖醇浓度通常在1.0w/v％到7.0w/v％之间，并且可以在2.0w/v％到6.0w/v％之间。氨基酸包括卡尼汀、精氨酸和甜菜碱的左旋(L)形式；然而，可以加入其他氨基酸。聚合物包括平均分子量为2,000到3,000之间的聚乙烯砒咯烷酮(PVP)或平均分子量为3,000到5,000之间的聚乙二醇(PEG)。如果使用它们，则通常在冻干之前或重新配制(或复原，reconstitution)之后在组合物中使用缓冲剂以使溶液的pH变化最小。可以使用大多数任何生理缓冲剂，但柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、和谷氨酸盐缓冲液或它们的混合物是典型的缓冲剂。浓度可以为0.01到0.3摩尔。也可以向配方中加入表面活性剂。

[0058] 在制备液体药物组合物后，可以进行冻干以防止降解和保持无菌性。用于冻干液体组合物的方法对于本领域普通技术人员来说是已知的。，可在使用前用无菌稀释剂(例如，林格氏溶液、蒸馏水或无菌盐水)重新配制该组合物。重新配制后，优选使用本领域技术人员已知的方法将组合物给予受试者。

[0059] 如本文中使用的“药用赋形剂”是指可用于制备通常是安全、无毒并且不具有生物学性质或其他不期望性质的药物组合物的赋形剂，并且包括兽医应用以及人类药物应用可接受的赋形剂。如在说明书和权利要求书中所使用的“药用赋形剂”包括一种和多于一种这样的赋形剂。

[0060] 实施例

[0061] 外科手术。在所有外科手术中，在手术45分钟至1小时前，以0.05mg/kg的剂量皮下给予手术小鼠稀释的丁丙诺啡(0.03mg/ml)。用逐渐增加至5％的异氟烷在麻醉剂盒中诱导小鼠。通过Ohio Forane 蒸发器(诱导盒)和异氟烷蒸发器(面罩)来递送麻醉剂。麻醉完成后，将小鼠转移到具有1.5％的异氟烷面罩。剃掉手术区域的毛并且用Endure皂清洗，用无菌水冲洗并用葡萄糖酸氯己定溶液进行外科手术准备。BNP眼药膏点在动物眼睛中以防止它们在麻醉期间脱水。在手术前皮下给予1ml的无菌盐水。在手术期间，将小鼠保持在1.5％的异氟烷水平(如果有必要增加或减小)。完成手术后，将小鼠置于氧气中约
1分钟，然后看到它们一开始动就将它们放回到笼子中。

[0062] 为了除去胰腺组织，通过实施正中切口以进入腹腔。首先，使用10号手术刀片在腹部正中通过皮肤切开1至1.5cm的切口。使用镊子小心地将皮肤与腹壁分离以露出腹部的正中线。用鼠齿钳提起该正中线并且用剪刀通过体壁制作小于1cm的小切口。定位后用镊子通过切口提起脾胰叶(splenic pancreatic lobe)。用镊子和卷棉子(cotton applicator)通过轻柔剥离(abrasion)来移开整个脾叶以及胃和十二指肠胰叶的远端部分从而确保不损伤主静脉或动脉。如果观察到过度出血，则夹紧出血的部位几分钟以促进凝固。切除后，在十二指肠周围仅保留一小部分(约30％)胰腺。外科手术切除的胰腺为总胰腺的大约70％，如通过在初步研究期间称重切除的部分和剩余的部分所证实的。用外科缝合线(Johnson & Johnson)以两或三次间断缝合来闭合体壁。用两根或三根外科U形钉(Fisher)来闭合皮肤。外科手术完成后，将小鼠置于氧气中大约1分钟，然后看到它们一开始动就将它们放回到笼子中。每隔一天分析血糖水平，检查增加的葡萄糖的血糖水平。此外，在手术一周后，每天向小鼠皮下给予0.05mg/kg的丁丙诺啡。

[0063] 实施例1.利用重组骨膜素的胰腺再生

[0064] 为了说明骨膜素在胰腺再生中所起的作用，将重组骨膜素蛋白注射到胰腺中。将BioVendor(RD172045100)提供的重组骨膜素蛋白重悬浮于盐水中并用盐水以10ng/μl的浓度稀释。重组骨膜素蛋白(图3所示的671个氨基酸序列)是在C末端处截短的人骨膜素蛋白，并且是所有四种已知同种型共有的序列的代表。将10μl(100ng或5μg/kg)直接注射到胰腺中。如上面所概述的，通过用中正切口暴露胰腺并且用Hamilton注射器将10μl重组骨膜素溶液(50ng/μl)直接注射到胰腺中来实施直接注射。载体处理的动物接受相同量的在盐水中稀释的缓冲剂。在注射到胰腺中后，用缝合线来闭合体壁，并且用伤口夹来闭合皮肤，如在胰腺切除术之后进行的。在外科手术一周后，每天监测小鼠并且皮下给予0.05mg/kg丁丙诺啡。在外科手术后，以0.8mg/ml在饮用水中给予BrdU(Sigma)以连续地标记分裂细胞。

[0065] 在注射24小时后与盐水注射相比时，骨膜素诱导广泛的增殖。组织学研究表明该增殖在胰岛、胰腺管和腺细胞之外发生并且定位于表达波形蛋白的细胞。在再生期间，骨膜素位于包围细胞角蛋白7+、和Ecad+管状复合物的胰腺的再生尖端。这些复合物是胰腺增殖的来源，如通过Ki67免疫染色所示出的。相对于其他的(resting)胰腺骨膜素mRNA，在胰腺切除术3天后骨膜素mRNA增加接近10倍。这可与胎儿发育期间仅三倍的增加相比。

[0066] 骨膜素注射3天后，表达波形蛋白的细胞数目实质上增加。这种增加局限于具有管状复合物的区域，而在表达正常水平的波形蛋白的胰腺其他区域则不增加。然而，在骨膜素注射3天后，在表达波形蛋白的细胞内不再发生增殖，而在表达细胞角蛋白7的管状复合物中则发生增殖。管状复合物如在胰腺管、胰岛和腺细胞中一样表达上皮钙粘附蛋白，但表现出增殖增加，如由增加的Ki67免疫染色所示出的。管状复合物还表达胰腺先祖标记物Pdx-1和Ngn3。还在管状复合物之外而不是在紧邻管状复合物的区域中发现Ngn3+细胞。在管状复合物的远端区域中，不存在Ngn3+细胞的形成。

[0067] 在注射骨膜素1周后，基质(stroma)增加，如通过相对于注射了盐水胰腺的上皮钙粘附蛋白阴性细胞的积累所注意到的。虽然在骨膜素注射的胰腺中仅保留少数管状复合物，但是与注射盐水的对照相比增殖是广泛的。然而，现在增殖处于表达上皮钙粘附蛋白的细胞中，而不是只在管状复合物中。增殖在表达淀粉酶的腺细胞内发生，而在周围基质中不存在。周围基质呈现出BrdU的积累以及尺寸变化，其宽度在10μm至300μm之间变化。基质的最大积累仍包含一些上皮钙粘附蛋白阳性管状复合物，然而，它们没有骨膜素注射3天后那么多。对于小鼠而言，大于500μg/kg体重的剂量导致胰腺细胞的死亡增加，尤其是在分泌淀粉酶的外分泌细胞中。

[0068] 实施例2.使用腹膜内注射的胰腺再生。为了确定是否能够以更小侵袭性途径给予骨膜素而仍能够诱导胰腺再生，与直接注射到胰腺中不同，以50μg/kg体重腹膜内注射来注射重组蛋白(BioVendor；RD172045100)。骨膜素注射一周后，相对于注射盐水的对照，呈现出胰岛细胞摄取的BrdU增加。此外，与注射盐水的对照相比，如通过Ki67染色所示出的，胰岛中的增殖增加。利用注射有骨膜素或盐水的MIP-GFP小鼠的FACS分析观察到了分泌胰岛素的β-细胞的数量增加约2倍(n＝3)。与注射盐水的同胞崽对照相比，注射了骨膜素的小鼠表现出胰腺β-细胞的数目增加超过两倍。

[0069] 实施例3.利用重组骨膜素在STZ诱导的糖尿病中的胰腺再生。链脲霉素(STZ)选择性靶向并破坏哺乳动物体内的胰腺β-细胞。它可以被用来生产用于1型糖尿病的动物模型。为了在小鼠中诱导糖尿病，每隔一天腹膜内注射100mg/kg的STZ直到小鼠患上糖尿病，如在Gross(Gross，J.R.et al.(2002)Diabetes，51：2227-32)和在Craven(Craven，P.A.et al.(2001)Diabetes，50：2114-25)中描述的C57BL/6J背景中描述的。在首次STZ注射(第0天)后，每天获得血糖水平以确定小鼠的糖尿病状况。在一种可替换的方案中，通过持续5天每天向小鼠注射50mg/kg的STZ来诱导糖尿病，其中每隔一天分析血糖水平。用改善健康和寿命所需的胰岛素来治疗糖尿病小鼠。

[0070] 为了确定骨膜素是否能够防止STZ诱导的糖尿病，在STZ处理后在小鼠中注射重组骨膜素(BioVendor；RD172045100)。在如上所述的STZ注射后，以10mg/kg至90mg/kg小鼠体重的不同浓度向STZ处理的小鼠腹膜内(IP)注射重组骨膜素。每隔一天分析血糖水平。如果骨膜素处理的小鼠保持正常的血糖水平，而它们的非骨膜素处理的同胞仔对照小鼠患上糖尿病，则确定骨膜素能够防止STZ诱导的糖尿病。当注射有STZ和骨膜素时，15只动物中的11只能够保持正常血糖水平(图4)。改实验还建议在小鼠中IP注射的骨膜素的最佳剂量似乎在30-70mg/kg体重之间。在小鼠中IP注射的骨膜素的优选剂量似乎在40-60mg/kg体重之间。

[0071] 实施例4.编码骨膜素同种型PANC的DNA的分离。在液氮中对胰腺组织实施快速冷冻，并且用冷冻研钵和研杵进行快速研磨。在解冻之前，使经研磨的胰腺组织与1ml的TRIZOL试剂(Invitrogen cat#15596-018)混合。然后按照制造商的说明分离来自胰腺组织的RNA。

[0072] 按照制造商的说明使用RNA PCR Core Kit(Applied Biosystem cat#N808-0143)对RNA样品实施逆转录。试剂盒中提供的寡聚d(T)和随机六聚体引物用来引发逆转录(RT)反应以产生cDNA。

[0073] 用于扩增来自上面产生的cDNA的骨膜素的羧基末端的PCR反应包括以下试剂：5μl cDNA、50nM的正向PCR引物AAACTCCTCTATCCAGCAGA(SEQ ID NO：4)、50nM反向PCR引物AACGGCCTTCTCTTGATCGTCT(SEQ ID NO：5)、500nM dNTP、1mMMgCl2、5μl的10x反应缓冲液以及0.25μl TAQ聚合酶(Invitrogencat#10342-020)。将反应稀释至50μl。用于进行PCR反应的条件如下：25次循环(在95℃下60秒，在60℃下60秒，以及在72℃下60秒)。
然后在2％的琼脂糖凝胶上进行反应，并使用干净的手术刀从凝胶中切取在462bp处观察到的显著条带。使用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagencat#28706)并按照制造商的说明从凝胶中提取DNA片段。在凝胶提取后，在2个单独的反应中使用上述的正向和反向PCR引物对DNA片段进行测序。更具体地，使用Stemcore(OHRI，渥太华，ON)的Applied Biosystem3730DNA分析仪，利用2μM的引物对10ng的PCR模板进行测序。

[0074] 实施例5.注射的骨膜素的安全性。为了确定骨膜素是否可以被安全地给予，向小鼠注射重组蛋白(BioVendor；RD172045100)，从八周龄开始，对于六周中的每一周，通过以0、2、4或10μg/kg体重腹膜内注射一次。13周前没有检测到可见的肿瘤。每周监测每只小鼠的血糖水平。在下面的表1中示出了每组小鼠(每组6只)的平均血糖水平，单位是mM/L。标准偏差的范围为0.31到2.06mM/L。

[0075]

[0076] 表1

[0077] 实施例6.星形细胞表达骨膜素和介导胰腺再生。为了确定星形细胞在胰腺再生期间是否为骨膜素的细胞来源，从成人胰腺分离表达骨膜素的细胞的高度纯化的群。该表达骨膜素的细胞的纯化群这样分离：(1)在再生胰腺中，观察骨膜素在共表达波形蛋白和干细胞抗原-1(Sca1/Ly6A)的细胞中表达，以及(2)使用标准荧光化活细胞分选(FACS)实验方案从其余的胰腺分离表达Sca1的活细胞(使用结合荧光染料的Sca1特异性抗体；-
eBioscience 17-5981)。使用标准FACS实验方案来识别CD31 细胞(使用结合荧光染料的CD31特异性抗体；eBioscience 12-0112)从而除去也表达Sca1的内皮细胞。

[0078] 在具有10％胎牛血清的RPMI培养基中培养并扩增FACS纯化的Sca1+/CD31-细胞。+ - +
在培养物中，Sca1/CD31 细胞呈现出胰腺星形细胞的形态学特征和标记物(波形蛋白、平+ + + + - - -
滑肌肌动蛋白、结蛋白、巢蛋白、GFAP、细胞角蛋白-7、上皮钙粘附蛋白、淀粉酶和胰-
岛素 )。通过荧光素二(BETA-D-吡喃半乳糖苷)(fluorescein digalactoside，FDG)染色+
和流式细胞术来确定杂合骨膜素-LacZ等位基因的表达以将其限于Sca1 细胞。此外，标+ -
准定量PCR方案识别经培养的Sca1/CD31 细胞作为表达的骨膜素mRNA。这些结果表明胰腺星形细胞是胰腺再生过程中骨膜素的细胞来源。

[0079] 实施例7.间充质星形细胞诱导胰腺再生。将用慢病毒-GFP感染的Sca1+星形细胞直接注射到受体小鼠(1E4细胞/小鼠)的胰腺中。观察到野生型星形浸润受体胰腺并诱导管状复合物形成和Ngn3祖细胞以及表达Pdx1的胰岛细胞的生成。在注射后2周，在标准方案下用抗GFP抗体(InvitrogenA21311)进行染色显示，供体细胞散布在整个内分泌组织中。包含表达GFP的供体细胞的区域也包含表达Ngn3的管状复合物。管状复合物不包含作为细胞角蛋白-7或用GFP共定位的Pdx-1的供体细胞。

[0080] 图6示出了具有移植的胰腺星形细胞的胰腺的组织学特点。图6A和图6C分别示出了注射3天和1周后表达GFP的野生型供体细胞的浸润。图6A是图6B中的箭头所指的区域的放大图。图6A的比例尺是500μm，而图6B的比例尺是1mm。图6D-图6F表明注射有野生型细胞的胰腺呈现出：(D)形成表达上皮钙粘附蛋白和Ngn3的管状复合物；(E)包围细胞角蛋白-7的管状结构的表达GFP的细胞；以及(F)表达GFP但不表达Pdx-1的细胞。

[0081] 实施例8.骨膜素诱导的胰腺再生和胰岛素表达。为了确定骨膜素在STZ处理的糖尿病小鼠中是否能诱导胰腺再生，按照上述方案持续5天每天注射STZ。一周后，按照上述方案，将重组骨膜素直接注射到胰腺中(5mg/kg体重)。在骨膜素注射一周后，可以看到管状复合物形成和生成表达Ngn-3的祖细胞，以及胰腺管中的细胞内的胰岛素表达。在骨膜素注射4周后，使用标准组织学技术在胰腺管内和胰腺管周围的簇中发现胰岛素表达，其中胰腺管包含仍表达Ngn3的胰岛素阳性和胰高血糖素阳性细胞，这表明这些簇是不成熟的胰岛。

[0082] 图7A-图7G示出了：(A)注射骨膜素一周后，在注射路径附近发现Ngn3+细胞；(B)在细胞角蛋白-7+管状复合物结构中观察到胰岛素表达；(C)在盐水注射后没有检测到胰岛素表达；(D和E)注射4周后，在胰管结构中和胰管结构周围观察到胰岛素表达；(F)胰岛素+簇包含表达胰高血糖素的细胞；(G)胰岛素+簇包含表达Ngn3的细胞。

[0083] 在先前的描述中，为了解释的目的，为了完全理解本发明实施方式而阐述了许多细节。然而，对于本领域技术人员来说，为了实施本发明，很显然可以不需要这些具体细节。本发明的上述实施方式仅用于举例。在不背离仅由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以对具体实施方式进行替换、更改和变化。

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骨膜素诱导的胰腺再生

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